JP2002516868A - ｎｒｄＥ - Google Patents

ｎｒｄＥ

Info

Publication number
JP2002516868A
JP2002516868A JP2000551783A JP2000551783A JP2002516868A JP 2002516868 A JP2002516868 A JP 2002516868A JP 2000551783 A JP2000551783 A JP 2000551783A JP 2000551783 A JP2000551783 A JP 2000551783A JP 2002516868 A JP2002516868 A JP 2002516868A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
sequence
polynucleotide
seq
identity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2000551783A
Other languages
English (en)
Inventor
エドウィナ・アイ・ワイルディング
マイケル・ティ・ブラック
リサ・ケイ・シリング
アナ・エル・コスマトカ
デボラ・ディ・ジャワースキー
ワン・ミン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SmithKline Beecham Corp
Original Assignee
SmithKline Beecham Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SmithKline Beecham Corp filed Critical SmithKline Beecham Corp
Publication of JP2002516868A publication Critical patent/JP2002516868A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C07K14/3156—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci from Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

(57)【要約】 本発明はｎｒｄＥポリペプチドおよびｎｒｄＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびに組換え技法によりそのようなポリぺプチドを産生する方法を提供する。さらに、抗菌化合物をスクリーニングするのにｎｒｄＥポリペプチドを利用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、その製造
および使用、ならびにその変種、アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにそ
の使用に関する。特に、本発明は、ｎｒｄＥ（リボヌクレオチドジホスフェート
レダクターゼ） ファミリーのポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびにそれらの変種（以下
、「ｎｒｄＥ」、「ｎｒｄＥポリヌクレオチド」、および場合により「ｎｒｄＥ
ポリペプチド」と称する）に関する。
【０００２】 （背景技術） ストレプトコッカス属（Streptococci）は、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、
菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、胸腔蓄膿および心内膜炎、とりわけ、例えば髄液の
感染などの髄膜炎を含む、ヒトにおいていくつかの型の疾患を引き起こすことが
知られている医学的に重要な微生物属を形成している。その単離から１００年以
上が経過しているため、ストレプトコッカス・ニュモニエ（Streptococcus pneu
moniae）はより集中して研究されている微生物の一つである。例えば、ＤＮＡが
、事実、遺伝的物質であるという、初期の認識の多くは、この微生物を用いる、
Griffithの研究において、およびAvery、MacleodおよびMcCartyの研究において
推定された。エス・ニュモニエを用いる膨大な量の研究にも拘わらず、この微生
物の毒性に関する多くの問題がまだ残っている。抗生物質の開発のための標的と
して、ストレプトコッカス遺伝子および遺伝子産物を利用することが特に好まし
い。
【０００３】 ストレプトコッカス・ニュモニエ感染の頻度は過去２０〜３０年間に劇的に上
昇している。これは多重抗生物質耐性株の出現、および免疫系が低下した人口の
増加に起因している。いくつかのまたはすべての標準的な抗生物質に対して耐性
を有するストレプトコッカス・ニュモニエ株を単離することはもはやめずらしい
ことではない。この現象により、この生物に対する新しい抗菌剤、ワクチン、薬
物スクリーニング方法および診断試験に関して不適当な医薬上の要求があり、か
つ需要を形成している。
【０００４】 そのうえ、薬剤の発見方法は、現在のところ、「機能的遺伝学」、すなわち、
ハイスループットゲノムまたは遺伝子に基づく生物学を包含するため抜本的な改
革を受けている。この方法は、「位置的クローニング」に基づく初期のアプロー
チおよび他の方法に取って代わりつつある。機能的遺伝学は、現在利用可能な多
くの分子生物学的データベースならびに他のソースから問題となる可能性のある
遺伝子配列を同定するための種々の生物学的情報の手段に大きく依存している。
未だ、薬剤の発見の標的としての、さらなる遺伝子および他のポリヌクレオチド
配列ならびにそれらの関連ポリペプチドの同定および特徴づけをする必要がある
。
【０００５】 とりわけ、化合物を抗生物質活性についてスクリーニングするのに有用である
という利点を有する、本発明のｎｒｄＥ具体例のごときポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドに対する要望があることは明白である。かかる因子はまた、感染、
機能不全および疾患の発生病理における役割を決定するのに有用である。感染、
機能不全および疾患を予防、改善または治癒するための方法を見出すために、か
かる因子ならびにそのアンタゴニストおよびアゴニストを同定および特徴づけす
る必要もある。 本発明のある種のポリペプチドは、既知のｎｒｄＥ蛋白に対して有意なアミノ
酸配列相同性を有する。
【０００６】 （発明の開示） 本発明は、ｎｒｄＥ、詳細にはｎｒｄＥポリペプチドおよびｎｒｄＥポリヌク
レオチド、組み換え物質ならびにそれらの製造方法に関する。もう１つの態様に
おいて、本発明は、かかるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関
し、とりわけ、微生物による疾病の治療を包含する。さらなる態様において、本
発明は、本発明により提供される材料を用いるアゴニストおよびアンタゴニスト
の同定方法、ならびに同定された化合物を用いる微生物による感染およびかかる
感染に関連した症状の治療方法に関する。さらなる態様において、本発明は、微
生物による感染およびかかる感染に関連した症状の検出のための診断アッセイ、
例えば、ｎｒｄＥ発現または活性の検出のためのアッセイに関する。 開示された本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の説
明を読み、本開示の他の部分を読めば、当業者に容易に明らかになるであろう。
【０００７】 （発明を実施するための最良の形態） 以下により詳細に説明するように、本発明は、ｎｒｄＥポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドに関する。詳細には、本発明は、ｎｒｄＥポリペプチドに対する
アミノ酸配列相同性により関連づけられるストレプトコッカス・ニュモニエ（St
reptococcus pneumoniae）のｎｒｄＥのポリペプチドおよびポリヌクレオチドに
関する。特に、本発明は、それぞれ配列番号１および配列番号２として表１に示
されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するｎｒｄＥに関する。
【０００８】 表１ ｎｒｄＥポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列
【０００９】 （Ａ）ストレプトコッカス・ニュモニエのｎｒｄＥポリヌクレオチド配列［配列
番号１］ 5'-ATGGGATTAAAACATCTTGAAGACGTGACTTACTTCCGTCTTAATAACGA AATTAACCGTCCTGTTAATGGACAAATCATGCTTCATAAAGATAAGGAAG CCTTGGATGCTTTCTTTAAAGAAAATGTAGTTCCAAACACTATGGTTTTT GATTCAATCAAAGACAAAATCAATTACCTCATTGAACACAACTACATCGA AACAGCCTTTATCAAGAAATACCGTCCAGAGTTCTTGGAAGAATTGGCTC AATTTATCAAAGACCAAAACTTCCAATTCAAGTCATTCATGGCAGCTTAT AAATTTTACAATCAATATGCCTTAAAGACTAATGACGGTGAATACTATCT TGAAAATATGGAAGACCGTGTCTTCTTCAACGCCCTTTATTTCGCTGATG GGAATGAAGCTGTTGCAATCGATATTGCCAATGAAATCATCCACCAACGC TACCAACCTGCTACTCCTTCCTTCTTGAATGCTGGACGTGCTCGTCGTGG GGAGTTGGTATCTTGTTTCCTAATCCAAGTGACGGATGATATGAACTCTA TCGGACGTTCTATCAACTCAGCTCTTCAACTTTCACGTATTGGTGGTGGT GTGGGAATTACCCTCAGCAACCTTCGTGAAGCTGGTGCACCTATCAAAGG CTATGAAGGAGCTGCTTCAGGTGTCGTTCCTGTTATGAAGCTTTTTGAAG ACAGCTTCTCTTACTCCAACCAATTGGGGCAACGTCAAGGTGCCGGTGTT GTCTACCTCAACGTCTTTCACCCAGATATCATCGCTTTCCTTTCAACTAA GAAAGAAAACGCTGATGAAAAAGTACGTGTCAAGACTCTATCACTTGGTG TTGTAGTACCTGATAAATTCTACGAATTGGCTCGTAAAAATGAAGAAATG TACCTCTTCAGCCCTTACTCTGTAGAAAAAGAATACGGTGTGCCATTCAA TTACATCGACATTACTGAAAAATACGATGAATTGGTCGCAAATCCAAATA TTCGCAAGACAAAAATCAAGGCGCGGGATTTGGAAACTGAAATCTCTAAA TTGCAACAAGAGTCTGGCTATCCTTATGTAGTCAACATAGATACGGCTAA CCGTGCAAATCCTGTTGATGGAAAGATTATCATGAGTAACTTGTGTTCTG AGATTCTTCAAGTTCAAGAACCAAGCTTGATCAACGATGCTCAAGAATTC CTTCAAATGGGAACAGATGTTTCATGTAACCTGGGTTCAACCAACGTGGT TAACATGATGACTTCACCTGATTTTGGTCGTTCTATCCGTGCTATGGTTC GTGCCCTTACTTTCGTTACAGATAGTTCACATATCGTAGCTGTACCAACG ATTGACCATGGAAATAGCCAAGCCCACACCTTTGGTCTCGGTGCCATGGG ACTGCACAGCTACCTTGCCCAACAACTCATTGAATATGGTTCACCTGAGT CTGTTGAATTTACAAGCATCTACTTTATGCTTATGAACTACTGGACCTTG GTAGAGTCAAACAATATTGCGCGTGAACGTGGTATTACCTTCCACAACTT TGAAAAATCAGACTATGCTAACGGAAGTTACTTTGACAAGTATGTAACTG GTGAATTTGTTCCAACATCAGACCGTGTTAAAGAACTCTTCAAAAATGTC TTTATCCCTGGTGTTGCTGATTGGGCTGAACTTCGGGACAAGGTTCAAGA AGATGGTCTTTACCACCAAAATCGCCTTGCTGTAGCGCCAAATGGTTCTA TCAGCTATATCAACGACGTTTCTGCTTCTATCCACCCGATTACGCAACGT ATCGAAGAACGCCAAGAGAAGAAAATTGGTAAAATCTACTACCCTGCTGC TGGCTTGTCTACAGAAACCATTCCTTACTACACTTCTGCCTACGATATGG ATATGCGTAAAGTCATCGATGTTTACGCTGCTGCGACTGAACACGTGGAT CAAGGACTTTCACTCACCCTCTTCATGCGTAGTGACATTCCAAAAGGCCT TTACGAATGGAAGAGGGAAAATAAACAAACGACACGTGACTTGTCCATCC TTCGTAACTATGCCTTTAACAAGGGAATCAAGTCTATCTACTACGTCCGT ACCTTTACAGATGACGGTGGAGAAGTCGGCGCCAACCAATGTGAAAGCTG TGTGATTTAG-3'
【００１０】 （Ｂ）この表のポリヌクレオチド配列より推定されるストレプトコッカス・ニュ
モニエのｎｒｄＥポリペプチド配列［配列番号２］ NH2-MGLKHLEDVTYFRLNNEINRPVNGQIMLHKDKEALDAFFKENVVPNTMVF DSIKDKINYLIEHNYIETAFIKKYRPEFLEELAQFIKDQNFQFKSFMAAY KFYNQYALKTNDGEYYLENMEDRVFFNALYFADGNEAVAIDIANEIIHQR YQPATPSFLNAGRARRGELVSCFLIQVTDDMNSIGRSINSALQLSRIGGG VGITLSNLREAGAPIKGYEGAASGVVPVMKLFEDSFSYSNQLGQRQGAGV VYLNVFHPDIIAFLSTKKENADEKVRVKTLSLGVVVPDKFYELARKNEEM YLFSPYSVEKEYGVPFNYIDITEKYDELVANPNIRKTKIKARDLETEISK LQQESGYPYVVNIDTANRANPVDGKIIMSNLCSEILQVQEPSLINDAQEF LQMGTDVSCNLGSTNVVNMMTSPDFGRSIRAMVRALTFVTDSSHIVAVPT IDHGNSQAHTFGLGAMGLHSYLAQQLIEYGSPESVEFTSIYFMLMNYWTL VESNNIARERGITFHNFEKSDYANGSYFDKYVTGEFVPTSDRVKELFKNV FIPGVADWAELRDKVQEDGLYHQNRLAVAPNGSISYINDVSASIHPITQR IEERQEKKIGKIYYPAAGLSTETIPYYTSAYDMDMRKVIDVYAAATEHVD QGLSLTLFMRSDIPKGLYEWKRENKQTTRDLSILRNYAFNKGIKSIYYVR TFTDDGGEVGANQCESCVI-COOH
【００１１】 寄託材料 ストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３株を含む寄託株を、１９９６
年４月１１日に、スコットランド、ＡＢ２ １ＲＹ、アバディーン、マチャード
ライブ２３Ｓt.のナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド
・マリーン・バクテリア・リミテッド（本明細書にて「ＮＣＩＭＢ」という）に
、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７９４の下で寄託した。その寄託株は寄託の際にスト
レプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３と命名された。１９９６年４月１７
日に、イー・コリ中のストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３のＤＮＡ
ライブラリーをＮＣＩＭＢに寄託し、受託番号４０８００が付与された。ストレ
プトコッカス・ニュモニエ寄託株を、本明細書では「寄託株」または「寄託株の
ＤＮＡ」と称する。
【００１２】 寄託株は全長のｎｒｄＥ遺伝子を含んでいる。寄託株に含まれるポリヌクレオ
チドの配列ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本
明細書における配列の記載とのいずれの不一致においても支配的である。 寄託株の寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条
約の条件下で行われている。特許が発行されると何ら制限または条件もなく、最
終的に株は分譲される。寄託株は当業者の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ.
Ｓ.Ｃ.１１２条の下に要求されるような、寄託が実施可能要件であることを承認
するものではない。
【００１３】 寄託株、それに由来の化合物を製造、使用または販売するには、ライセンスが
必要であるが、そのようなライセンスはここで付与されるものではない。 本発明の一の態様は、寄託株に含まれるストレプトコッカス・ニュモニエ０１
００９９３株により発現可能な成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子を提
供することである。さらには、本発明は寄託株中のＤＮＡおよびＲＮＡのｎｒｄ
Ｅポリヌクレオチド配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を提供する
。また、本発明は寄託株より単離されたｎｒｄＥポリペプチド配列およびそれに
由来のポリヌクレオチド配列を提供する。
【００１４】 ポリペプチド 実質的に本発明のｎｒｄＥポリペプチドは系統発生論的に他のｎｒｄＥ（リボ
ヌクレオチドジホスフェートレダクターゼ）ファミリーの蛋白に関連している。 本発明の１の態様において、ストレプトコッカス・ニュモニエのポリペプチド
（本明細書ではｎｒｄＥおよびｎｒｄＥポリペプチドという）、ならびに生物学
的、診断上、予防上、臨床的または治療上有用なその変種、ならびにそれを含む
組成物が提供される。 本発明のとりわけ好ましい具体例は、ｎｒｄＥ遺伝子の自然発生対立遺伝子に
よりコードされるｎｒｄＥポリペプチドの変種である。
【００１５】 さらに本発明は下記のものである単離ポリペプチド： （ａ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列に対して少なく
とも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少
なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、最
も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一である
アミノ酸配列を含むかまたはそれよりなるポリペプチド； （ｂ）配列番号１の全長にわたって配列番号１に対して少なくとも７０％の同
一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％
の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少
なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一であるポリヌクレオチ
ド配列を含むかまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコードされるポ
リペプチド； （ｃ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列に対して少なく
とも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少
なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、最
も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一である
ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含むかまたはそれよりな
る単離ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、を提供する。
【００１６】 本発明のポリペプチドは、表１［配列番号２］のポリペプチド（とりわけ成熟
ポリペプチド）ならびにポリペプチドおよびフラグメント、詳細には、ｎｒｄＥ
の生物活性を有し、表１［配列番号１］のポリペプチドまたはその該当部分と少
なくとも７０％の同一性、好ましくは表１［配列番号２］のポリペプチドと少な
くとも８０％の同一性、より好ましくは表１［配列番号２］のポリペプチドと少
なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは表１［配列番号２］のポリペプ
チドと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドおよびフラグメントを包
含し、さらにかかるポリペプチドの部分も包含し、一般に、ポリペプチドのかか
る部分は少なくとも３０個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも５０個のア
ミノ酸を含む。
【００１７】 本発明はまた、 Ｘ−（Ｒ1）m−（Ｒ2）−（Ｒ3）n−Ｙ ［式中、アミノ末端のＸは水素または金属、または本明細書において修飾ポリペ
プチドについて説明された他の残基であり、カルボキシル末端のＹは水素または
金属、または本明細書において修飾ポリペプチドについて説明された他の残基で
あり、Ｒ1およびＲ3はいずれかのアミノ酸残基または修飾アミノ酸残基であり、
ｍは１〜１０００の整数または０であり、ｎは１〜１０００の整数または０であ
り、Ｒ2は本発明のアミノ酸配列、特に表１のアミノ酸配列またはそれらの修飾
形態を意味する］ で示されるポリペプチドを包含する。上記の式中、Ｒ2はアミノ末端残基がその
左側でＲ1に結合し、そのカルボキシ末端残基がその右側でＲ3に結合するように
方向づけられる。ｍおよび／またはｎが１より大きい場合、Ｒ1またはＲ3のいず
れかで表されるアミノ酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホモポリマーのいず
れであってもよく、ヘテロポリマーが好ましい。本発明の他の好ましい具体例は
、ｍが１ないし５０、１００または５００の間の整数であり、ｎが１ないし５０
、１００または５００の間の整数のものである。 本発明のポリペプチドがストレプトコッカス・ニュモニエ由来のものであるの
が最も好ましいが、同じ分類学上の属の他の生物由来のものであっても好ましい
。また本発明のポリペプチドは、例えば、同じ科または目から得られるものであ
ってもよい。
【００１８】 フラグメントは、その全体が上記したポリペプチドのアミノ酸配列の全部では
ないが、一部と同じであるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ｎｒ
ｄＥポリペプチドと同様、フラグメントは「独立している（free-standing）」
であるか、またはそれらが一の部分または領域、最も好ましくは単一の連続した
領域、単一のより大きなポリペプチドを形成するより大きなポリペプチドの中に
含まれていてもよい。 好ましいフラグメントは、例えば、表１［配列番号２］のアミノ酸配列または
、アミノ−および／またはカルボキシル−末端アミノ酸配列を含む連続した一連
の残基のような、その変種の一部を有する末端切断ポリペプチドを包含する。宿
主細胞、特に、ストレプトコッカス・ニュモニエにより、またはそこにおいて産
生される本発明のポリペプチドの分解型も好ましい。さらに、アルファヘリック
スおよびアルファヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形成領
域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水領域、疎
水領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、フレキシブル領域、表面
形成領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を含むフラグメントのような、
構造的または機能的属性によって特徴づけられるフラグメントもまた好ましいフ
ラグメントである。
【００１９】 さらに好ましいフラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列由来の少なくとも
１５、２０、３０、４０、５０または１００個の連続したアミノ酸を有するアミ
ノ酸配列を含む単離ポリペプチド、あるいは配列番号２のアミノ酸配列由来の末
端切断または欠失された少なくとも１５、２０、３０、４０、５０または１００
個の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを包含する
。 生物学的に活性なフラグメントも好ましいフラグメントである。生物学的に活
性なフラグメントは、類似活性または改良活性を有するもの、または望ましくな
い活性が減少したフラグメントを含め、ｎｒｄＥの活性を媒介するフラグメント
である。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性であるフラグメ
ントも含まれる。特に好ましいものは、ストレプトコッカス・ニュモニエの生存
に必須の機能または個体、特に、ヒトにおいて疾患を開始または疾病を維持する
能力を与える酵素群の受容体またはドメインからなるフラグメントである。
【００２０】 本発明のポリペプチドのフラグメントである変種は、ペプチド合成法により対
応する全長のポリペプチドの製造に使用することができる。したがって、これら
の変種は、本発明の全長ポリペプチドを製造するための中間体として使用できる
。 アミノ酸に関する標準的１文字および３文字表記に加えて、「Ｘ」または「Ｘ
ａａ」なる語もまた、本発明のあるポリペプチドを記載するのに用いられる。「
Ｘ」および「Ｘａａ」は、２０種の天然に存在するいずれかのアミノ酸がポリペ
プチド配列のそのように指定される位置にあってもよいことを意味する。
【００２１】 ポリヌクレオチド ｎｒｄＥポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、詳細には、本明細
書でｎｒｄＥと命名されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを提
供することが本発明の一の目的である。 本発明の特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、全長の遺伝子を
含む、表１（配列番号１）に示す配列を含むｎｒｄＥポリペプチド、またはその
変種をコードしている領域を含む。出願人らは、この全長の遺伝子は当該ポリペ
プチドを有する生物（例えば、ストレプトコッカス・ニュモニエ）の増殖および
／または生存に必須であると考える。
【００２２】 本発明のさらなる態様として、ｎｒｄＥポリペプチドおよびポリヌクレオチド
、詳細には、ストレプトコッカス・ニュモニエのｎｒｄＥポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドをコードおよび／または発現する単離核酸分子が提供され、核酸
分子としては、例えば、未プロセッシングＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、ｍＲＮＡ
、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、Ｂ−およびＺ−ＤＮＡが挙げられる。本発明のさら
なる具体例は、生物学的、診断上、予防上、臨床的または治療上有用なポリヌク
レオチドおよびポリペプチド、ならびにその変種、ならびにそれらを含む組成物
を包含する。 本発明のもう一つの態様は、表１［配列番号２］の推定アミノ酸配列を有する
ｎｒｄＥポリペプチドをコードする、少なくとも１つの全長遺伝子を含む、単離
ポリヌクレオチド、それに密接に関連するポリヌクレオチドおよびそれらの変種
に関する。 もう１つの特に好ましい本発明具体例において、表１（配列番号２）のアミノ
酸配列を含むかまたはそれよりなる、ストレプトコッカス・ニュモニエ由来のｎ
ｒｄＥポリペプチドまたはその変種が提供される。
【００２３】 表１［配列番号１］に示すポリヌクレオチド配列のような本明細書の情報を使
用し、出発材料としてストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３細胞を使
用し、細菌からの染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングし、配列決定し、つ
づいて全長クローンを得る標準的クローニングおよびスクリーニング法を使用し
て、ｎｒｄＥポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを得ることが
できる。例えば、表１［配列番号１］に示す配列のような本発明のポリヌクレオ
チド配列を得るには、典型的には、エシェリシア・コリまたは他の適当な宿主中
のストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３の染色体ＤＮＡのクローンの
ライブラリーを、部分配列から由来する放射標識したオリゴヌクレオチド、好ま
しくは１７量体またはそれより長いオリゴヌクレオチドでプローブする。ついで
、該プローブと同じＤＮＡを有するクローンを厳密なハイブリダイゼーション条
件を使用して区別できる。該オリジナルポリペプチドまたはポリヌクレオチド配
列から設計された配列決定プライマーとハイブリダイゼーションすることで同定
された個々のクローンを配列決定することにより、そのポリヌクレオチド配列を
両方の方向に伸長し、全長遺伝子配列を決定することが可能である。都合よくは
、プラスミド・クローンから調製された変性二本鎖ＤＮＡを用いてかかる配列決
定を行う。適当な技法は、Maniatis,T.，Fritsch,E.F.およびSambrookら、MOLEC
ULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laborator
y Press, Cold Spring Harbor, New York（１９８９）（特に、ハイブリダイゼ
ーションによるスクリーニング１.９０および変性二本鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定
１３.７０を参照のこと）により記載されている。直接ゲノムＤＮＡ配列決定を
行って全長の遺伝子配列を得てもよい。例えば、表１［配列番号１］に示すポリ
ヌクレオチドは、ストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３から由来する
ＤＮＡライブラリー中に見いだされたものである。
【００２４】 そのうえ、表１［配列番号１］のＤＮＡ配列は、表１［配列番号２］に示すの
とほぼ同数のアミノ酸残基を有し、当業者に周知のアミノ酸残基の分子量から計
算できる推定分子量を有する蛋白をコードするオープンリーディングフレームを
有する。配列番号１のヌクレオチド番号１と、ヌクレオチド番号２１５８で始ま
る停止コドンとの間の配列番号１のポリヌクレオチドが、配列番号２のポリペプ
チドをコードする。
【００２５】 さらなる態様において、本発明は、下記のポリヌクレオチドを含むかまたはそ
れらよりなる単離ポリヌクレオチドを提供する： （ａ）配列番号１の全長にわたって配列番号１に対して少なくとも７０％の同
一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％
の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより好まし
くは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一であるポリヌク
レオチド配列； （ｂ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列に対して少なく
とも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少
なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、さ
らにより好ましくは少なくとも９７〜９９％またはちょうど１００％の同一性を
有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列。
【００２６】 本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド（ストレプトコッカ
ス・ニュモニエ以外の種由来のホモログおよびオーソログを包含）を、厳密なハ
イブリダイゼーション条件において、配列番号１の配列またはそれらのフラグメ
ントを含むかまたはそれらよりなる標識または検出可能プローブを用いて適当な
ライブラリーをスクリーニングし、次いで、該ポリヌクレオチド配列を含む全長
遺伝子および／またはゲノムクローンを単離する工程を含む方法により得てもよ
い。
【００２７】 本発明は、表１［配列番号１］のコーディング配列（オープンリーディングフ
レーム）と、その全長にわたって同一であるポリヌクレオチド配列を提供する。
また、本発明は、成熟ポリペプチドまたはそのフラグメント用のコーディング配
列自体ならびにリーダーまたは分泌配列、プレ、プロまたはプレプロ蛋白配列を
コードするコーディング配列のような他のコーディング配列を有するリーディン
グ・フレーム中の成熟ポリペプチドまたはフラグメントのコーディング配列を提
供する。ポリヌクレオチドはまた、例えば、転写されるが翻訳されない配列、終
止シグナル（例えば、ｒｈｏ−依存的およびｒｈｏ−非依存的終止シグナル）、
リボソーム結合部位、Kozak配列、ｍＲＮＡを安定化する配列、イントロン、ポ
リアデニル化シグナルのごとき少なくとも１つの非コーディング５’および３’
配列を包含する非コーディング配列を含むが、これらに限定するものではない。
また、ポリヌクレオチド配列はさらなるアミノ酸をコードしているさらなるコー
ディング配列を含んでいてもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を促進する
マーカー配列をコードすることができる。本発明のある種の具体例において、マ
ーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen,Inc.）において提供され、Gentzら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA（１９８９）８６：８２１−８２４に記載されるような、
ヘキサ−ヒスチジンペプチドであるか、またはＨＡペプチドタグ（Wilsonら、Ce
ll，３７：７６７（１９８４））であり、ともにそれらに融合したポリペプチド
配列の精製において有用である。本発明のポリヌクレオチドは、限定するもので
はないが、構造遺伝子および遺伝子の発現を調節する、本来的に結合している配
列からなるポリヌクレオチドを包含する。
【００２８】 本発明の好ましい具体例は、表１の配列番号１に示されるヌクレオチド１から
ヌクレオチド２１５８のすぐ上流にあるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドを
含むヌクレオチドまでを有するポリヌクレオチドであり、それは共にｎｒｄＥポ
リペプチドをコードする。
【００２９】 本発明はまた、式： Ｘ−（Ｒ1）m−（Ｒ2）−（Ｒ3）n−Ｙ ［式中、分子の５’末端のＸは水素または金属、または修飾ヌクレオチド残基で
あるか、あるいはＹと一緒になって共有結合を形成し、分子の３’末端のＹは水
素または金属、または修飾ヌクレオチド残基であるか、あるいはＸと一緒になっ
て共有結合を形成し、Ｒ1およびＲ3は、各々、独立していずれかの核酸残基また
は修飾核酸残基であり、ｍは１〜３０００の整数または０であり、ｎは１〜３０
００の整数または０であり、Ｒ2は本発明の核酸配列または修飾核酸配列、特に
表１より選択される核酸配列またはその修飾核酸配列を意味する］ で示されるポリヌクレオチドからなるかまたは含むポリヌクレオチドを包含する
。上記した式のポリヌクレオチド中、Ｒ2は５’末端核酸残基がその左側でＲ1に
結合し、その３’末端核酸残基がその右側でＲ3に結合するように方向付けられ
る。ｍおよび／またはｎが１より大きい場合、Ｒ1および／またはＲ2のいずれか
で表される核酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホモポリマーのいずれであっ
てもよく、ヘテロポリマーが好ましい。好ましい具体例において、ＸおよびＹが
一緒になって共有結合を形成する場合、前記した式のポリヌクレオチドは閉じた
環状ポリヌクレオチドであり、それはその式が第２の鎖が相補性を有する第１の
鎖を示す二本鎖ポリヌクレオチドであり得る。もう一つ別の具体例において、ｍ
および／またはｎは１と１０００の間の整数である。他の好ましい本発明の具体
例は、ｍが１ないし５０、１００または５００の間の整数であり、ｎが１ないし
５０、１００または５００の間の整数である。
【００３０】 本発明のポリヌクレオチドはストレプトコッカス・ニュモニエ由来であるのが
最も好ましいが、分類学上同じ属の他の生物より得ることも好ましい。また、例
えば、本発明のポリヌクレオチドは、分類学上同じ科または目の生物から得ても
よい。 本明細書で使用する「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語
は、本発明のポリペプチド、特に、細菌性ポリペプチド、より詳細には、表１［
配列番号２］に示すアミノ酸配列を有するストレプトコッカス・ニュモニエ・ｎ
ｒｄＥのポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。こ
の用語はコードおよび／非コーディング配列を含んでもよいさらなる領域と共に
、該ポリペプチドをコードする単一の連続または非連続領域（例えば、組み込ま
れたファージ、組み込まれた挿入配列、組み込まれたベクター配列、組み込まれ
たトランスポゾン配列、またはＲＮＡエデティング（editing）もしくはゲノム
ＤＮＡ再組織化により中断されている）を含むポリヌクレオチドを包含する。 本発明はさらに、表１［配列番号２］の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドの変種をコードする、本明細書に記載したポリヌクレオチドの変種に関する。
本発明のポリヌクレオチドのフラグメントである変種は本発明の全長ポリヌクレ
オチドの合成に使用できる。
【００３１】 さらに好ましい具体例は、数個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２ま
たは１個あるいは０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、修飾、
欠失または付加された表１［配列番号２］のｎｒｄＥポリペプチドのアミノ酸配
列を有する、ｎｒｄＥ変種をコードするポリヌクレオチドである。特に好ましく
は、ｎｒｄＥポリペプチドの特性、活性を変化させないサイレント置換、付加お
よび欠失である。
【００３２】 本発明のさらに好ましい具体例は、表１［配列番号２］に示すアミノ酸配列を
有するｎｒｄＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全長にわたって少
なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレ
オチドに相補的なポリヌクレオチドである。また、最も好ましいものは、ｎｒｄ
Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと全長にわたって少なくとも８０
％の同一性を有する領域からなるポリヌクレオチドおよびそれと相補的なポリヌ
クレオチドである。この点で、その同じものと全長にわたって少なくとも９０％
の同一性を有するポリヌクレオチドが特に好ましく、中でも少なくとも９５％の
同一性を有するものが特に好ましい。さらには、少なくとも９５％の同一性を有
するものの中で少なくとも９７％の同一性を有するものがより好ましく、中でも
少なくとも９８％および少なくとも９９％の同一性を有するものが特に好ましい
。少なくとも９９％の同一性を有するものがより好ましい。
【００３３】 好ましい具体例は、表１［配列番号１］のＤＮＡによってコードされている成
熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドである。 本発明のある好ましい具体例によれば、特に厳密な条件下で、例えば表１のポ
リヌクレオチドのごときｎｒｄＥポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポ
リヌクレオチドが提供される。
【００３４】 さらに本発明は、本明細書にて上記したポリヌクレオチド配列にハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドに関する。この点において、本発明は特に、本明細書に
て上記したポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオ
チドに関する。本明細書で用いる場合、「厳密な条件」および「厳密なハイブリ
ダイゼーション条件」という語は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なく
とも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ起こること
を意味する。厳密なハイブリダイゼーション条件の一例として、５０％ホルムア
ミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮaＣl、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５
０ｍＭリン酸ナトリウム（pＨ７.６）、５ｘデンハート（Denhardt’s）溶液、
１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌ変性切断サケ精子ＤＮＡを含む溶
液中、４２℃で一夜インキュベーションし、ついでハイブリダイゼーション支持
体を０.１ｘＳＳＣ（約６５℃）で洗浄することが挙げられる。ハイブリダイゼ
ーションおよび洗浄条件は公知であり、Sambrookら、MOLECULAR CLONING：A LAB
ORATORY MANUAL，Second Edition，Cold Spring Harbor, N.Y.（１９８９）、特
に、第１１章に例示されている。本発明により提供されるポリヌクレオチド配列
に関して溶液ハイブリダイゼーションを用いてもよい。
【００３５】 本発明は、配列番号１に示したポリヌクレオチド配列の完全遺伝子を含む適当
なライブラリーを、厳密なハイブリダイゼーション条件下、配列番号１に示す該
ポリヌクレオチド配列の配列を有するプローブまたはそのフラグメントでスクリ
ーニングし、該ポリヌクレオチド配列を単離することにより得ることができるポ
リヌクレオチド配列を含むかまたはそれよりなるポリヌクレオチドを提供する。
そのようなポリヌクレオチドを得るのに有用なフラグメントには、例えば、本明
細書のいずれかの場所で十分に説明するプローブおよびプライマーが包含される
。
【００３６】 本明細書において本発明のポリヌクレオチドの分析についてさらに説明するよ
うに、例えば、上記したような本発明のポリヌクレオチドを、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用し、ｎ
ｒｄＥをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、ｎｒｄＥ遺伝
子に対して高い同一性、特に高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよ
びゲノムクローンを単離することができる。そのようなプローブは、一般に、少
なくとも１５ヌクレオチド残基または塩基対を含むであろう。好ましくは、その
ようなプローブは少なくとも３０塩基からなり、少なくとも５０ヌクレオチド残
基または塩基対を有してもよい。特に好ましいプローブは、少なくとも２０ヌク
レオチド残基または塩基対を有し、３０以下のヌクレオチド残基または塩基対を
有する。 ｎｒｄＥ遺伝子のコード領域は、表１（配列番号１）のＤＮＡ配列を使用して
スクリーニングしてオリゴヌクレオチド・プローブを合成することにより単離で
きる。ついで、本発明の遺伝子の配列と相補性の配列を有する標識したオリゴヌ
クレオチドを用いてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをス
クリーニングし、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリダイゼーシ
ョンするか決定する。
【００３７】 全長のＤＮＡを得るための、あるいは短いＤＮＡを伸長させるための利用可能
で当業者によく知られたいくつかの方法があり、例えば、ｃＤＮＡ末端の迅速増
幅（ＲＡＣＥ）（例えば、Frohmanら、PNAS USA ８５、８９９８−９００２（１
９８８）を参照のこと）に基づく方法がある。ＭarathonTM法（Clontech Labora
tories Inc.）に例示される当該方法の最近の変法は、例えば、より長いｃＤＮ
Ａの検索を有意に簡単にしている。MarathonTM法において、ｃＤＮＡは選択組織
から抽出されたｍＲＮＡから調製され、各末端に「アダプター」配列が連結され
る。次いで、遺伝子特異的かつアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマー
を用いて核酸増幅（ＰＣＲ）を行ってＤＮＡの「失われた」５’末端を増幅する
。次いで、「ネステッド」プライマー、すなわち、増幅生成物の範囲ににアニー
ルするように設計されたプライマー（典型的には、アダプター配列中のさらなる
３’にアニールするアダプター特異的プライマーならびに既知遺伝子配列中のさ
らなる５’にアニールする遺伝子特異的プライマー）を用いてＰＣＲ反応を繰り
返す。次いで、この反応の生成物をＤＮＡ配列決定により分析し、次いで、存在
しているＤＮＡに生成物を直接結合して完全配列を得ること、あるいは５’プラ
イマーの設計に関する新たな配列の情報を用いて別個の全長ＰＣＲを行うことに
より、全長のＤＮＡを構築する。
【００３８】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本明細書においてポリヌク
レオチド分析に関してさらに説明するように、例えば、疾患、特にヒトの疾患に
対する治療および診断の発見のための研究試薬および研究材料として用いること
ができる。 表１（配列番号１または２）の配列に由来するオリゴヌクレオチドである本発
明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法に使用できるが、好ましくはＰ
ＣＲに使用し、本明細書で同定したポリヌクレオチドが全体として、または部分
的に感染組織において細菌中で転写されるか否か測定する。そのような配列はま
た、病原体が達した感染の段階およびタイプの診断においても有用性がある。 また、本発明は、成熟蛋白に、さらなるアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸
が加わるか、成熟ポリペプチドの内部にアミノ酸が加わった（例えば、成熟形態
が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを提供する。このような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態への蛋
白のプロセッシングにおいて役割を果たし、蛋白を運び、蛋白の半減期を長くし
たり、短くしたり、あるいは分析または生産のための蛋白の取り扱いを容易にす
ることができる。インビボで一般的なように、該付加アミノ酸は細胞酵素により
成熟蛋白からプロセッシングにより除かれる。
【００３９】 本発明の各ポリヌクレオチドおよび全ポリヌクレオチドについて、それに相捕
的なポリヌクレオチドが提供される。これらの相捕的ポリヌクレオチドが、相捕
的である各ポリヌクレオチドに対して十分に相捕的であることが好ましい。 一またはそれ以上のプロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆
体蛋白は該ポリペプチドの不活性形でもよい。プロ配列がそのような不活性前駆
体から除かれると、一般に活性化される。プロ配列のいくらかまたは全体を、活
性化の前に除去できる。一般に、そのような前駆体はプロ蛋白と称される。 ヌクレオチドに関する標準記号Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕに加えて、また「Ｎ」なる
語を、本発明の特定のポリヌクレオチドを記載するのに用いることができる。「
Ｎ」は、隣接するヌクレオチド位置と一緒になって作用する場合、正確な読み枠
を読中で読まれる場合で、Ｎがそのような読み枠において未成熟終止コドンを形
成する効果を有する核酸でないことが好ましい場合を除き、４種のＤＮＡ塩基ま
たはＲＮＡ塩基のいずれかがＤＮＡまたはＲＮＡ配列のその指定位置にあること
を意味する。
【００４０】 要するに、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配列の加わった成
熟蛋白（プレ蛋白とも称される）、プレ蛋白のリーダー配列ではない１またはそ
れ以上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列と、一般に、
ポリペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセッシング工程の間に除去される
１またはそれ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコ
ードする。
【００４１】 ベクター、宿主細胞、発現系 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター
で遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術による本発明のポリペプチドの製
造に関する。さらに無細胞翻訳系を用い、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを
使用してかかる蛋白を製造することができる。 本発明の組み換えポリペプチドを、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞か
ら、当業者によく知られた方法により製造してもよい。したがって、さらなる態
様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現系、かかる発現系
で遺伝子操作された宿主細胞、ならびに組み換え法による本発明のポリペプチド
の製造に関する。
【００４２】 組換え体産生のために、宿主細胞を遺伝子操作し、発現系もしくはそれらの一
部、または本発明のポリヌクレオチドを取り込むことができる。ポリヌクレオチ
ドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−
デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジ
ェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション
、トランスダクション、スクレープ・ローディング、弾道導入および感染のよう
な、Davisら、BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY（１９８６）およびSambroo
kら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd Ed. Cold Spring Harbor
Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y.（１９８９）のごとき複数の標準
的研究室マニュアルに記載されている方法によって行うことができる。
【００４３】 適当な宿主の代表例は、レンサ球菌（streptococcus）、ブドウ球菌（staphyl
ococcus）、腸球菌（enterococcus）、大腸菌（E.coli）、ストレプトマイセス
（streptomyces）、シアノバクテリア（cyanpobacteria）、枯草菌（Bacillus s
ubtilis）およびストレプトコッカス・ニュモニエ（Streptococcus pneumoniae
）のごとき細菌細胞；酵母、クルベロミセス（Kluveromyces）、サッカロミセス
（Saccharomyces）の細胞のごとき真菌細胞、担子菌、カンジダ・アルビカンス
（Candida albicans）およびアスペルギルス（Aspergillus）；ドロソフィラ（D
rosophila）S2およびスポドプテラ（Spodoptera）Sf9細胞のごとき昆虫細胞；CH
O、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1およびボーウェス（Bowes）メラノー
マ細胞のごとき動物細胞；および裸子植物または被子植物のごとき植物細胞を包
含する。
【００４４】 本発明のポリペプチドを製造するために非常に多様な発現系を使用することが
できる。かかるベクターは、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来
のベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランス
ポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント
由来、バキュロウイルス、ＳＶ４０のごときパポバウイルス、ワクシニアウイル
ス、アデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイルス、ピコルナ
ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクター、およびコスミ
ドおよびファージミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝因子由
来のベクターのごとき、それらの組み合わせに由来するベクターを包含する。発
現系構築物は、発現を制御ならびに引き起こす調節領域を有していてもよい。一
般に、宿主においてポリヌクレオチドを維持、増幅または発現し、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した系またはベクターを、この点にて発現に使
用してもよい。適当なＤＮＡ配列を、例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING
，A LABORATORY MANUAL（前掲）に示されている技術のごとき、種々のよく知ら
れた慣用的技術のいずれかによって、発現系に挿入してもよい。
【００４５】 真核細胞の組み換え発現系において、翻訳された蛋白を小胞体内腔、周辺腔ま
たは細胞外環境に分泌するために、適当な分泌シグナルを発現されるポリペプチ
ドに挿入してもよい。これらのシグナルは、ポリペプチドに固有のものであって
もよく、または異種のシグナルであってもよい。 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、
アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ
ィーを包含する、よく知られた方法によって組換え細胞培養物から回収および精
製できる。最も好ましくは、高品質液体クロマトグラフィーが精製に使用される
。ポリペプチドが単離および／または精製の間に変性する場合、蛋白を再生する
ための周知方法を用いて、再び活性な立体配座とすることができる。
【００４６】 診断、予後、セロタイピングおよび変異アッセイ また本発明は、診断試薬として使用するための本発明のｎｒｄＥポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの使用にも関する。真核生物、とりわけ哺乳動物、特に
ヒトにおけるｎｒｄＥポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの検出は、
疾患の診断、疾病の段階の決定、または薬剤に対する感染生物の応答に関する診
断方法を提供するであろう。ｎｒｄＥ遺伝子または蛋白を含む生物に感染、また
は感染の可能性がある真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトを、種々のよく知
られた方法ならびに本明細書記載の方法により核酸レベルまたはアミノ酸レベル
で検出できる。
【００４７】 予後、診断または他の分析に供するポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、
感染していると思われる個体および／または感染した個体の身体材料から得られ
る。これらの源由来のポリヌクレオチド、特にＤＮＡまたはＲＮＡを検出に直接
用いてもよく、あるいは分析に付す前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いる
ことにより酵素的に増幅できる。ＲＮＡ（詳細にはｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡおよび
ゲノムＤＮＡも同じようして使用できる。増幅を用いると、個体に存在する感染
または定住生物の種および株を、該生物の選択されたポリヌクレオチドの遺伝子
型の分析により特徴付けることができる。関連する生物、好ましくは同じ属の異
なる種または同じ種の異なる系統より選択された対照配列の遺伝子型と比較した
増幅生成物の大きさの変化により、欠失および挿入を検出できる。点突然変異は
、増幅ＤＮＡを標識したｎｒｄＥポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる
ことにより同定できる。完全にまたは有意に対合した配列は、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａについての、各々、ＤＮaseまたはＲＮase消化により、または融解温度または
再生速度の差により、不完全にまたはより有意に誤対合した二重らせんと区別で
きる。ポリヌクレオチド配列の差はまた、対照配列と比較した場合の、ゲル中の
ポリヌクレオチドフラグメントの電気泳動の移動度の変化により、または直接的
なＤＮＡの配列決定により検出できる。これは変性剤と共にまたは無しで行うこ
とができる。ポリヌクレオチドの差異はまた、直接的ＤＮＡまあたはＲＮＡ配列
決定により検出することもできる。例えば、Myersら、Science，２３０：１２４
２（１９８５）を参照のこと。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアー
ゼ保護アッセイ、例えば、ＲＮase、Ｖ１およびＳ１保護または化学的切断法に
よっても明らかにすることができる。例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,
USA，８５：４３９７−４４０１（１９８５）を参照のこと。
【００４８】 もう１つの具体例において、ｎｒｄＥヌクレオチド配列またはそのフラグメン
トを含むオリゴヌクレオチドプローブの一群を構築して、例えば遺伝学的変異、
セロタイプ、分類学的分類または同定のための効果的なスクリーニングを行うこ
とができる。アレイ法は周知であり、適応範囲が広く、遺伝子発現、遺伝学的連
関、および遺伝学的変化を包含する分子遺伝学における種々の問題を解決するた
めに用いられる（例えば、Cheeら、Science ２７４：６１０（１９９６）を参照
のこと）。
【００４９】 よって、もう１つの態様において、本発明は、 （ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列
、またはそのフラグメント； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して相捕的なヌクレオチド配列； （ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプチド、または
そのフラグメント；あるいは （ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号２のポリペプ
チドに対する抗体 を含む診断キットに関する。 かかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が重要な成分を
含んでいてもよいことが理解されよう。かかるキットは、とりわけ疾病または疾
病に対する感受性についての診断において有用である。
【００５０】 また本発明は、診断試薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用にも関する
。疾病または発病に関連した本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１
のポリヌクレオチドの変異形態の検出は、ポリヌクレオチドの発現低下、発現過
剰または発現の変化により生じる疾病の診断、疾病経過の予後、疾病段階の決定
、または疾病に対する感受性の決定に加えて用いる診断用道具、またはかかる診
断等の決定のための道具を提供するであろう。かかるポリヌクレオチドにおける
変異を有する生物、特に感染生物を、本明細書記載のいずれかの場所で説明する
ような種々の方法によりポリヌクレオチドレベルで検出してもよい。 本発明のヌクレオチド配列は生物の染色体の同定にも価値がある。配列は特別
に標的化され、生物（詳細にはストレプトコッカス・ニュモニエ）の染色体上の
特定の位置とハイブリダイズしうる。本発明染色体に関連した配列のマッピング
は、それらの配列を病原性および／または生物の環境学的地位および／または生
物の薬剤耐性とを関連づけ、さらには生物に遺伝子を対応させることにおける重
要な工程でありうる。配列を正確な染色体位置にマッピングしたならば、染色体
上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデータと関連づけることができる。かか
るデータは、配列データベースにおいてオンラインで見いだされる。次いで、遺
伝学的方法、例えば、連関（物理的に近接した遺伝子の同時遺伝）の分析、ある
いはコンジュゲーション（conjugation）のごとき接合の研究により、同じ染色
体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との関係を同定する。
【００５１】 第１の表現型を有する生物と、異なる第２の表現型を有する生物との間のポリ
ヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列の相違を調べることもできる。第
１の表現型を有する生物のいくつかまたは全部に変異が観察されるが、第２の表
現型を有する生物には変異が観察されない場合、変異は第１の表現型の発生原因
である可能性がある。 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド中に変異または多型性
（対立遺伝子変異）を担持する生物由来の細胞を、例えばセロタイピングを可能
にするような種々の技術によりポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルで検
出できる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＲＮＡにおける変異を検出することが
できる。ＲＴ−ＰＣＲを自動検出系、例えばＧeneＳcan等と組み合わせて用いる
のが特に好ましい。ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡもまた同じ目的でＰＣ
Ｒに用いることができる。一例として、ｎｒｄＥポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドに相補的なＰＣＲプライマーを用いて変異を同定および分析するこ
とができる。典型的なプライマーの例を下表２に示す。
【００５２】 表２ ｎｒｄＥポリヌクレオチド増幅用プライマー 配列番号 プライマー配列 3 5'-ATGGGATTAAAACATCTTGA-3' 4 5'-CTAAATCACACAGCTTTCAC-3'
【００５３】 また本発明は、式： Ｘ−（Ｒ1）m−（Ｒ2）−（Ｒ3）n−Ｙ ［式中、分子の５’末端のＸは水素または金属、または修飾核酸残基であり、分
子の３’末端のＹは水素または金属、または修飾核酸残基であり、Ｒ1およびＲ3 は核酸残基または修飾ヌクレオチド残基であり、ｍは１〜２０の整数または０で
あり、ｎは１〜２０の整数または０であり、Ｒ2は本発明プライマー配列、特に
表２より選択されるプライマー配列を意味する］ で示されるポリヌクレオチドを包含する。上記した式のポリヌクレオチド中、Ｒ 2 は５’末端残基がその左側でＲ1に結合し、その３’末端残基がその右側でＲ3
に結合するように方向付けられる。ｍおよび／またはｎが１より大きい場合、い
ずれかのＲ基で表される核酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホモポリマーの
いずれであってもよく、好ましくは表１のポリヌクレオチドの領域に相捕的なヘ
テロポリマーである。好ましい具体例において、ｍおよび／またはｎは１ないし
１０の間の整数である。
【００５４】 さらに本発明は、５’および／または３’末端から１、２、３または４個のヌ
クレオチドが除去されたプライマーを提供する。特に、これらのプライマーを、
個体由来の試料、例えば身体材料から単離されたｎｒｄＥＤＮＡおよび／または
ＲＮＡの増幅に用いることができる。プライマーを用いて感染個体から単離され
たポリヌクレオチドを増幅して、そのポリヌクレオチドをポリヌクレオチド配列
研究のための種々の方法に供してもよい。このようにして、ポリヌクレオチド配
列中の変異を検出し、変異を用いて感染または感染段階もしくは経路を診断およ
び／または予後を行い、あるいは感染物のセロタイプおよび／または分類を行っ
てもよい。
【００５５】 本発明はさらに、疾患、好ましくは細菌感染、さらに好ましくはストレプトコ
ッカス・ニュモニエによる感染の診断方法であって、表１［配列番号１］の配列
を有するポリヌクレオチドの発現レベルの上昇を、個体由来のサンプル、例えば
、肉体物質から決定することを特徴とする方法を提供する。ｎｒｄＥポリヌクレ
オチドの発現の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野で
周知の方法である任意の方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮase保
護、ノーザンブロッティング、スペクトロメトリーおよびその他のハイブリダイ
ゼーション法を用いて測定できる。
【００５６】 加えて、正常対照組織サンプルと比較してｎｒｄＥポリペプチドの過剰発現を
検出するための本発明による診断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出す
ることができる。宿主由来のサンプル中のｎｒｄＥポリペプチドのレベルを決定
するために用いることができるアッセイ技法は、当業者に周知である。このよう
なアッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロ
ット分析、抗体サンドイッチアッセイ、抗体検出およびＥＬＩＳＡアッセイを包
含する。
【００５７】 ディファレンシャル発現（differential expression） 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、ディファレンシャルスクリ
ーニング法の試薬として用いてもよい。多くのディファレンシャルスクリーニン
グおよびディファレンシャルディスプレイ法が当該分野に存在し、本発明のポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドを用いることができる。例えば、ディファレン
シャルディスプレイ法はChuangら、J. Bacteriol. １７５：２０２６−２０３６
（１９９３）に記載されている。この方法は、ランダムプライムされたＲＴ−Ｐ
ＣＲを用いて存在するｍＲＮＡを同定することにより生物中で発現される遺伝子
を同定するものである。感染前および感染後の特徴を比較することにより、感染
の間にアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされる遺伝子を同
定し、ＲＴ−ＰＣＲ生成物を配列決定し、「未知」ＯＲＦにマッチさせることが
できる。
【００５８】 インビボ発現法（ＩＶＥＴ）はCamilliら、Proc. Natl. Acad Sci. USA ９１
：２６３４−２６３８（１９９４）に記載されている。ＩＶＥＴは、研究室での
培養物との比較を行って、感染における重要な役割に関与している、感染中にア
ップレギュレーションされる遺伝子を同定するものである。この方法により同定
されるＯＲＦは感染の確立および／または維持において重要な役割を有すると考
えられる。この方法において、標的生物のランダムな染色体フラグメントを、プ
ラスミドベクター中のプロモーター不含組換え遺伝子の上流にクローン化する。
側面にレソルバーゼ（resolvase）部位を付加した抗生物質耐性遺伝子を担持す
る標的生物中にこの構築物を導入する。抗生物質の存在下で増殖させると、レコ
ンビナーゼ（recombinase）遺伝子の転写の支持能を有するプラスミドベクター
中にクローン化されたこれらフラグメントが集団から除去され、それゆえ、抗生
物質耐性の消失が生じる。各抗生物質感受性細菌により担持される染色体フラグ
メントは感染の間に通常アップレギュレーションされる遺伝子のプロモーターま
たは当該遺伝子の一部を担持しているはずである。レコンビナーゼ遺伝子上流の
配列決定によりアップレギュレーションされる遺伝子の同定が可能となる。
【００５９】 ＲＴ−ＰＣＲを用いて遺伝子発現パターンを分析してもよい。本発明のポリヌ
クレオチドを用いるＲＴ−ＰＣＲ用に、メッセンジャーＲＮＡを細菌感染組織、
例えばネズミの感染後４８時間たった肺から単離し、次いで、ランダムヘキサヌ
クレオチドでプライムされたＲＮＡ試料の逆転写を行い、その後遺伝子特異的プ
ライマーペアーを用いてＰＣＲを行うことによって各ｍＲＮＡ量を評価する。得
られたＰＣＲ生成物の定量による特定のｍＲＮＡ種の存在および量の決定は、感
染組織中で転写された細菌遺伝子についての情報を提供する。遺伝子転写の分析
を感染の異なる時点において行って細菌による発病における遺伝子調節について
の詳細な知識を得て、いずれの遺伝子産物が抗細菌剤のスクリーニングのための
標的であるのかを明確に理解することができる。使用ＰＣＲプライマーの遺伝子
特異的な性質により、細菌ｍＲＮＡ調製物が常に哺乳動物ＲＮＡを含む必要があ
るとはいえないことが理解されよう。このことは、感染組織からの簡単かつ迅速
なＲＮＡの調製を可能にし、細菌中で非常に短命（半減期２分のオーダー）な細
菌ｍＲＮＡ種を得ることを可能にする。最適には、非常に短時間のうちに、ＴＲ
Ｉｚｏｌｅ（GIBCO-BRL）存在下で機械的に破砕し、次いで、ＴＲＩｚｏｌｅ試
薬およびＤＮＡａｓｅ処理を製造者の指示に従って行って夾雑ＤＮＡを除去する
ことにより、感染ネズミ肺組織から細菌ｍＲＮＡを調製する。好ましくは、適当
に標識された配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてノーザンをプロー
ブすることにより検出されるストレプトコッカス・ニュモニエの１６Ｓリボソー
ムＲＮＡが最大量となるような条件を見いだすことによってプロセスを最適化す
る。典型的には、５’色素標識プライマーをＰＣＲ反応において各ＰＣＲプライ
マーペアーに用い、最適にはＰＣＲ反応を８ないし２５サイクルで終了する。Ｐ
ＣＲ生成物を６％ポリアクリルアミドで分離し、GeneScanner（ＡＢＩにより製
造されている）を用いて検出し定量する。
【００６０】 グリッディング（gridding）およびポリヌクレオチド引き算 方法は、いわゆる「高密度ＤＮＡアレイ（high density array）」またはグリ
ッドを用いる遺伝子発現および同一性についての情報を得るためのものである。
例えば、M.Cheeら、Science ２７４：６１０−６１４（１９９６）およびその中
の引用文献を参照のこと。かかるグリッディングアッセイを用いて、発現配列タ
グ（ＥＳＴ）と呼ばれるある種の新規遺伝子配列が同定された（Adams et al.,
Science, 252:1651-1656 (1991)）。遺伝子産物に基づいて特定の遺伝子配列を
同定するための方法のバラエティーも記載されている。例えば、１９９１年５月
３０日公開国際特許出願ＷＯ９１／０７０８７参照。さらに、所望配列の増幅の
ための方法が記載されている。例えば、１９９１年１１月１４日公開の国際特許
出願ＷＯ９１／１７２７１参照。
【００６１】 本発明のポリヌクレオチドをポリヌクレオチドアレイの成分として、好ましく
は高密度アレイまたはグリッドとして用いてもよい。これらの高密度アレイは診
断および予後目的に特に有用である。例えば、異なる遺伝子、さらにはポリヌク
レオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含む各スポットのセットをプロービ
ング（身体試料から得たプローブを用いるハイブリダイゼーションまたは核酸増
幅を用いるプロービングのごとき）に使用して、個体中の特定のヌクレオチド配
列または関連配列の存在を決定してもよい。かかる存在は、病原体、特にストレ
プトコッカス・ニュモニエの存在を示す可能性があり、疾病または疾病経過の診
断および／または予後に有用である可能性がある。配列番号１のポリヌクレオチ
ド配列の多くの変種を含むグリッドが好ましい。また、配列番号２のポリペプチ
ド配列をコードしているポリヌクレオチド配列の多くの変種を含むものが好まし
い。
【００６２】 抗体 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドまたはそれらの変種、あるいは
それらを発現する細胞を、かかるポリペプチドまたはポリヌクレオチドそれぞれ
に対して免疫特異的な抗体を得るための免疫原として用いることができる。 １の好ましい本発明の具体例において、ｎｒｄＥポリペプチドまたはポリヌク
レオチドに対する抗体が提供される。 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して得られる抗体は、本発
明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドあるいはエピトープが付いた
いずれかまたは両方のフラグメント、いずれかまたは両方のアナログ、またはい
ずれかまたは両方を発現する細胞を、好ましくはヒト以外の動物に、慣用的プロ
トコルを用いて投与することにより得ることができる。モノクローナル抗体を調
製する場合、連続的細胞系培養により産生される抗体を提供する当該分野にて周
知の技術を用いることができる。例えば、Kohler, G.およびMilstein, C., Natu
re，２５６：４９５−４９７（１９７５）；Kozborら、Immunology Today, ４：
７２（１９８３）；Coleら、MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan
R Liss,Inc.、７７−９６頁（１９８５）に記載されるような種々の技法が挙げ
られる。
【００６３】 一本鎖抗体を製造するための技術（米国特許第４９４６７７８号）を用いて、
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する一本鎖抗体を産生するこ
とができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物、例えば他の哺乳
動物を用いて、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに免疫特異的なヒ
ト化抗体を発現させることができる。
【００６４】 別法として、ファージ提示（phage display）技法を利用して、抗‐ｎｒｄＥ
の保持に関してスクリーニングしたヒトのリンパ球のＰＣＲ増幅したｖ遺伝子の
レパートリー由来の、または無処理のライブラリー由来の、ポリペプチドに対す
る結合活性を有する抗体遺伝子を選択してもよい（McCafferty,Ｊ.ら、Nature
３４８：５５２−５５４（１９９０）；Marks,J.ら、Biotechnology １０：７７
９−７８３（１９９２））。これらの抗体の親和性はチェインシャフリング（ch
ain shuffling）により改善することもできる（Clackson,T.ら、Nature ３５２
：６２４−６２８（１９９１））。
【００６５】 前記の抗体を用いて本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現する
クローンを単離または同定することができ、アフィニティークロマトグラフィー
により該ポリペプチドを精製することができる。 従って、とりわけ、ｎｒｄＥポリペプチドまたはｎｒｄＥポリヌクレオチドに
対する抗体を用いて、感染、とりわけ細菌感染を治療することができる。 ポリペプチド変種は、本発明の特定の態様を形成する、抗原的、エピトープ的
または免疫学的に等価な変種を包含する。
【００６６】 ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に等価な誘導体、またはその融合蛋白
は、マウスまたは他の動物、例えばラットもしくはニワトリを免疫するための抗
原として使用される。融合蛋白はポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、
例えば抱合することにより、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）またはキーホール・リムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hae
mocyanin：ＫＬＨ）または破傷風トキソイドに結合させることができる。別法と
して、ポリペプチド、またはその抗原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチド
の多重コピーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原性を改良するのに十分な抗原
性を有しており、キャリヤを使用しなくてすむ。 好ましくは、抗体またはその変種を修飾して個体における免疫原性を減少させ
る。例えば、個体がヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒト化」されてお
り；例えばJones,P.ら、Nature ３２１：５２２−５２５（１９８６）またはTem
pestら、Biotechnology ９：２６６−２７３（１９９１）に記載されているよう
に、ハイブリドーマ由来の抗体の相補性決定領域がヒトモノクローナル抗体に移
植されている。 本発明の１の態様によれば、治療または予防目的、詳細には遺伝学的免疫化の
ための本発明のポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明の特に好ましい具
体例は、ｎｒｄＥポリヌクレオチドの自然発生対立遺伝子変種およびそれにより
コードされるポリペプチドである。
【００６７】 本発明のポリヌクレオチドの遺伝学的免疫における使用には、好ましくは、プ
ラスミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Genet １：３６３（１
９９２）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther. ４：４１９（１９６３））、特異的蛋
白キャリヤを複合させたＤＮＡの送達（Wuら、J.Biol Chem. ２６４：１６９８
５（１９８９））、リン酸カルシウムを用いるＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshe
f、PNAS USA ８３：９５５１（１９８６））、種々の形態のリポソーム中へのＤ
ＮＡ封入（Kanedaら、Science ２４３：３７５（１９８９））、微粒子爆撃（Ta
ngら、Nature ３５６：１５２（１９９２）；Eisenbraunら、ＤＮＡ Cell Biol
１２：７９１（１９９３））およびクローン化レトロウイルスベクターを用いた
インビボ感染（Seegerら、PNAS USA ８１：５８４９（１９８４））などの適当
な送達方法を用いる。
【００６８】 アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子 さらに、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、例えば、細
胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然産物の混合物中の、小分子
基質とリガンドとの結合を評価することもできる。これらの基質およびリガンド
は天然の基質およびリガンドでよく、または構造上もしくは機能上の模倣物でも
よい。例えば、Coliganら、Current Protocols in Immunology １（２）：第５
章（１９９１）を参照のこと。
【００６９】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは多くの生物学的機能に関与し
ており、該機能には多くの疾病状態、詳細には上記疾病が包含される。それゆえ
、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの機能を刺激または阻害する化合物を同
定するためのスクリーニング法を工夫することが望ましい。したがって、さらな
る態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドなら
びに関連ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの機能を刺激または阻害する化合
物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。一般的には、アゴニストま
たはアンタゴニストを上記疾病の治療および予防のために用いてもよい。種々の
源、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然産物の混合物か
ら化合物を同定できる。そのようにして同定されたかかるアゴニスト、アンタゴ
ニストまたは阻害剤は、天然または修飾基質、リガンド、受容体、酵素等であっ
てもよく、場合によってはｎｒｄＥポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ある
いはそれらの構造上または機能上の模倣物であってもよい（Coliganら、Current
Protocols in Immunology １（２）：第５章（１９９１）を参照のこと）。
【００７０】 スクリーニング法は、単に候補化合物のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
への、あるいはポリペプチドまたはポリヌクレオチドを有する細胞もしくは膜へ
の、あるいはポリペプチド含む融合蛋白への結合を、直接的または間接的に候補
化合物に結合した標識により測定するものであってもよい。別法として、スクリ
ーニング法は標識競争物質との競争を用いるものであってもよい。さらに、これ
らのスクリーニング法は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む細胞に適
した検出系を用いて、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性化または阻害
により生じるシグナルを候補化合物が発生させるかどうかを試験するものであっ
てもよい。一般的には、既知アゴニスト存在下で活性化の阻害剤をアッセイし、
次いで、候補化合物存在下でのアゴニストによる活性化の効果を観察する。構成
的に活性のあるポリペプチドおよび／または構成的に発現されるポリペプチドお
よびポリヌクレオチドを、アゴニストまたは阻害剤の効果を逆転させる物質を探
すスクリーニング法に用いてもよく、候補化合物がポリペプチドまたはポリヌク
レオチドの活性化を阻害するかどうかを試験することによる。さらに、スクリー
ニング法は、単に、候補化合物を本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
を含有する溶液と混合して混合物を作成し、混合物中のｎｒｄＥポリペプチドお
よび／またはポリヌクレオチド活性を測定し、次いで、混合物中のｎｒｄＥポリ
ペプチドおよび／またはポリヌクレオチド活性を標準に対して比較することを特
徴とする。Ｆｃ部分および上記ｎｒｄＥポリペプチドから作成されるような融合
蛋白を用いて高処理量アッセイを行って本発明のポリペプチドのアンタゴニスト
ならびに系統分類的および／または機能的に関連したポリペプチドを同定するこ
ともできる（D.Bennettら、J. Mol. Recognition, ８：５２−５８（１９９５）
；およびK.Johansonら、J. Biol. Chem. ２７０（１６）：９４５９−９４７１
（１９９５）を参照のこと）。
【００７１】 本発明のポリペプチドと結合および／または相互作用するポリヌクレオチド、
ポリペプチドおよび抗体を用いて、細胞中のｍＲＮＡおよび／またはポリペプチ
ドの精製に対する添加化合物の影響を検出するためのスクリーニング方法を組み
立ててもよい。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを構築して、モノクローナルおよび
ポリクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌または細胞結合レベルを、当該
分野において標準的な方法により測定してもよい。これにより、適当に操作され
た細胞または組織からのポリペプチドの生成を阻害または促進しうる作用剤（そ
れぞれ、アンタゴニストまたはアゴニストという）を見いだすことができる。
【００７２】 本発明はまた、ｎｒｄＥポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用、特に静
菌および／または殺菌性である化合物の作用を亢進（アゴニスト）または遮断（
アンタゴニスト）する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法を提
供する。スクリーニング方法にはハイスループット技術が包含される。例えば、
アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、ｎｒｄＥポリペ
プチドおよびかかるポリペプチドの標識基質またはリガンドを含む合成反応混合
物、膜、細胞エンベロープもしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、また
はそれらのいずれかの調製物を、ｎｒｄＥアゴニストまたはアンタゴニストであ
るかもしれない候補分子の存在下または不在下でインキュベートする。候補分子
がｎｒｄＥポリペプチドに作動または拮抗する能力は、標識リガンドの結合の低
下またはかかる基質からの生成物の生成低下に反映される。結合しても影響を及
ぼさない分子、すなわちｎｒｄＥポリペプチドの効果を誘起しない分子は、ほと
んどの場合、良好なアンタゴニストであろう。よく結合し、基質からの生成物の
生成速度を高め、シグナルトランスダクションを増大させ、あるいは化学チャン
ネル活性を増大させる分子はアゴニストである。基質からの生成物の生成速度、
シグナルトランスダクション、あるいは化学チャンネル活性のレベルの検出はリ
ポーターシステムを用いることにより強調できる。この点に関して有用なリポー
ターシステムは、生成物に転換される比色標識基質、ｎｒｄＥポリヌクレオチド
またはポリペプチド活性の変化に応答するリポーター遺伝子、および当該分野で
公知の結合アッセイを包含するが、これらに限定するものではない。
【００７３】 本発明のポリペプチドを用いて膜結合または可溶性受容体を同定してもよく、
かかるポリペプチドは当該分野において標準的な受容体結合法により同定される
。これらの方法は、リガンド結合およびクロスリンキングアッセイを包含するが
、これらに限らない。これらの方法において、ポリペプチドを放射性標識（例え
ば125Ｉ）、化学修飾（例えばビオチン化）または検出および精製に適したペプ
チド配列に融合され、推定上の受容体（例えば細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽
出物、身体材料）の源とともにインキュベーションする。他の方法は表面プラス
モン共鳴および分光学的法法を包含する。これらのスクリーニング方法を用いて
、ポリペプチドのその受容体への結合と競争するポリペプチドのアゴニストおよ
びアンタゴニストを同定してもよい。かかるアッセイを行うための標準的方法は
当該分野においてよく知られている。
【００７４】 蛍光タグを付した分子に関する蛍光分極値は回転相関時間（rotational corre
lation time）または回転速度（tumbling rate）に依存する。別のｎｒｄＥポリ
ペプチドもしくは他のポリペプチドと結合したｎｒｄＥポリペプチドのごとき蛋
白複合体であって蛍光標識分子を含むように標識されているものは、蛍光標識さ
れたモノマー蛋白よりも高い分極値を有するであろう。この方法を用いて、ポリ
ペプチド複合体を分裂させる小型分子を特徴づけるのが好ましい。 蛍光エネルギー転移を用いて、ｎｒｄＥポリペプチドダイマー、トリマー、テ
トラマー、または高次構造、あるいは別のポリペプチドに結合したｎｒｄＥポリ
ペプチドにより形成される構造の形成を妨害する小型分子を特徴づけてもよい。
ｎｒｄＥポリペプチドをドナーおよびアクセプター両方の蛍光発色団で標識する
ことができる。２種の標識種を混合し、ドナー蛍光発色団を励起したならば、ア
クセプターの蛍光を観察することにより蛍光エネルギー転移を検出することがで
きる。ダイマー化をブロックする化合物は蛍光エネルギー転移を阻害するであろ
う。
【００７５】 表面プラスモン共鳴を用いて、ｎｒｄＥポリペプチドの自己結合ならびにｎｒ
ｄＥポリペプチドと別のポリペプチドもしくは小型分子との結合に対する小型分
子の影響をモニターすることができる。低いサイト密度（site density）におい
てｎｒｄＥポリペプチドをセンサーチップにカップリングさせて、共有結合分子
がモノマー性となるようにすることができる。次いで、溶液蛋白をｎｒｄＥポリ
ペプチド被覆表面上に通し、局所屈折率の変化により生じる共鳴角の変化をモニ
ターすることにより特異的結合をリアルタイムで検出することができる。この方
法を用いて、ｎｒｄＥポリペプチドの自己結合ならびにｎｒｄＥポリペプチドと
別のポリペプチドもしくは小型分子との結合に関する反応速度および平衡結合定
数に対する小型分子の影響を特徴づけることができる。
【００７６】 シンチレーション近接アッセイを用いて、ｎｒｄＥポリペプチドと別のｎｒｄ
Ｅポリペプチドもしくは別の分子との結合の間の相互作用を特徴づけることがで
きる。ｎｒｄＥポリペプチドをシンチレーション充填ビーズにカップリングさせ
ることができる。放射性標識ｎｒｄＥポリペプチドの添加は結合を生じ、放射性
源分子はシンチレーション液に極めて近接した状態となる。よって、ｎｒｄＥポ
リペプチドの結合によりシグナルが放出され、ｎｒｄＥポリペプチドの自己結合
またはｎｒｄＥポリペプチドと別のポリペプチドもしくは小型分子との結合を妨
害する化合物はシグナルを減少させるであろう。
【００７７】 ＩＣＳバイオセンサーはＡＭＢＲＩ（Australian Membrane Biotechnology Re
search Institute）により記載されている。それらは高分子の自己結合をカップ
リングし、懸濁膜二重層中のガンマシジンにより促進されるイオンチャンネルを
閉鎖し、それゆえバイオセンサーのアドミッタンス（イン−ダンスと同様）の測
定可能な変化が起こる。このアプローチは６０回のアドミッタンス変化でも直線
性があり、理想的には、小型分子コンビナトリアルライブラリーの大規模な高処
理量スクリーニングに適する。
【００７８】 本発明の他の具体例において、本発明のポリペプチドおよびまたはポリヌクレ
オチドと結合あるいは相互作用して、その活性または発現を阻害または活性化す
る化合物を同定する方法であって、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチ
ドへの結合、あるいはポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと化合物と
の他の相互作用を可能にする条件下で本発明のポリペプチドおよび／またはポリ
ヌクレオチドをスクリーニングすべき化合物と接触させて、化合物との結合ある
いは他の相互作用を評価し（該方法において、好ましくは、かかる結合または相
互作用はポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと化合物との結合あるい
は相互作用に応答した検出可能シグナルを提供しうる第２の化合物に関連したも
のである）、次いで、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと化合物と
の結合あるいは相互作用から生じるシグナルの存在または不存在を検出すること
により、化合物がポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと結合あるいは
相互作用し、その活性または発現を活性化または阻害するかどうかを決定する方
法が提供される。
【００７９】 ｎｒｄＥアンタゴニストのアッセイのもう１つの例は、競争阻害アッセイに適
した条件下で、ｎｒｄＥおよび潜在的なアンタゴニストを、ｎｒｄＥ結合分子、
組換えｎｒｄＥ結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガ
ンド模倣物と混合する、競合アッセイである。ｎｒｄＥ分子を例えば放射活性ま
たは比色化合物により標識し、結合分子に結合した、あるいは生成物に変換した
ｎｒｄＥ分子の数を正確に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価でき
る。 潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペ
プチドと結合し、それによりその活性または発現を阻害し、消滅させる小型有機
分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を包含する。潜在的アンタゴニストは
また、ｎｒｄＥにより誘導される活性を誘導しない結合分子のような結合分子の
同一部位に結合し、ｎｒｄＥポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを結
合から排除することによりｎｒｄＥポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチ
ドの作用または発現を妨げる、密接に関連した蛋白または抗体のような小型有機
分子、ペプチド、ポリペプチドであってもよい。
【００８０】 潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチドの結合部位に結合してその部位を占
領し、それにより細胞性結合分子との結合を妨害して、正常な生物学的活性を妨
害する小型分子を包含する。小型分子の例は、小型有機分子、ペプチド、ペプチ
ド様分子を包含するが、これらに限定するものではない。その他の潜在的なアン
タゴニストはアンチセンス分子を包含する（これらの分子についての記載に関し
ては、Okano,J.，Neurochem. 56:560（1991）；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTI
SENSE INHIBTORS OF GENE EXPRESSION、ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリ
ダ州（１９８８）を参照のこと）。好ましい潜在的アンタゴニストは、ｎｒｄＥ
に関連する化合物およびその変種を包含する。 潜在的なポリペプチドアンタゴニストの他の例は抗体を包含し、あるいはいく
つかの場合には、ポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素等の密接に関連
したオリゴヌクレオチドまたは蛋白、あるいはリガンド、基質、受容体、酵素等
のフラグメント、あるいは本発明のポリペプチドに結合するが応答を誘発せず、
その結果ポリペプチドの活性を阻害することとなる小型分子を包含する。
【００８１】 ある種の本発明のポリペプチドは天然ｎｒｄＥポリペプチドの生物学的模倣物
、機能的模倣物である。これらの機能的模倣物を、とりわけ、ｎｒｄＥポリペプ
チドの活性に拮抗するように、あるいは本明細書にいずれかの場所に記載の様式
で抗原または免疫原として用いてもよい。本発明のポリペプチドの機能的模倣物
は末端切断ポリペプチドを包含するが、これに限らない。例えば、好ましい機能
的模倣物は、配列番号２に示すポリペプチドを含むポリペプチドであってアミノ
またはカルボキシ末端の２０、３０、４０、５０、６０、７０または８０個のア
ミノ酸を欠くポリペプチドを包含し、さらにこれらの末端切断配列の１つまたは
それ以上のものを含む融合蛋白を包含する。これらの機能的模倣物のそれぞれを
コードしているポリヌクレオチドを発現カセットとして用いて各模倣物ポリペプ
チドを発現させてもよい。これらのカセットが５’および３’制限部位を有して
いて所望の場合にカセットを一緒にして連結するための便利な手段となることが
好ましい。これらのカセットが当該分野で知られたまたは本明細書にいずれかの
場所に記載された遺伝子発現シグナルを含むことがさらに好ましい。
【００８２】 よって、もう１つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドおよび／
またはポリヌクレオチドに関するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容
体、基質、酵素等；あるいはかかるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチ
ドの生成を減少または促進する化合物を同定するためのスクリーニングキットに
関する。該キットは： （ａ）本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド； （ｂ）本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを発現する組み
換え細胞； （ｃ）本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを発現する細胞
膜；あるいは （ｄ）本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドに対する抗体 を含むものであり、好ましくは該ポリペプチドは配列番号２のものであり、好ま
しくは該ポリヌクレオチドは配列番号１のものである。 かかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は重要成分を含
有していてもよいことが理解されよう。
【００８３】 本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを、ポリペプチドおよ
び／またはポリヌクレオチドのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の構造
に基づく設計方法に用いてもよいことが、当業者に容易に理解されよう。該方法
は： （ａ）最初にポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、またはそれらの
複合体の３次元構造を決定し、 （ｂ）アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の反応部位、結合部位または
モチーフである可能性のある部位の３次元構造を推定し、 （ｃ）推定された反応部位、結合部位および／またはモチーフと結合または反
応すると予想される候補化合物を合成し、次いで （ｄ）候補化合物が実際にアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤であるか
どうかを試験する ことを含む。 これが繰り返しプロセスであり、自動およびコンピューター制御工程を用いて
この繰り返しプロセスを行ってもよいことが、さらに理解されよう。
【００８４】 さらなる態様において、本発明は、例えばｎｒｄＥポリペプチドおよび／また
はポリヌクレオチドの過剰発現、発現不足、上昇した活性、または低下した活性
に関連した疾病のごとき異常な状態の治療方法を提供する。 ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの発現および／または活性が過
剰な場合、いくつかの方法を用いることができる。１の方法は、ポリペプチドお
よび／またはポリヌクレオチドの機能および／または発現を阻害（例えば、リガ
ンド、基質、受容体、酵素等の結合をブロックすることにより、あるいは２次的
シグナルを阻害することにより）するに有効な量の上記阻害化合物（アンタゴニ
スト）を医薬上許容される担体とともに対象に投与し、そのことにより異常なな
症状を改善することを含む。もう１つの方法において、やはり内在性ポリペプチ
ドおよび／またはポリヌクレオチドと競争してリガンド、基質、受容体、酵素等
に結合することができる可溶性形態のポリペプチドを投与してもよい。かかる競
争物質の典型例はｎｒｄＥポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドのフラ
グメントを包含する。
【００８５】 さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメ
ントおよび種々のサブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の免疫グロブ
リンの重鎖または軽鎖の不変領域の種々の部分を含む、遺伝子工学により得られ
る可溶性融合蛋白に関する。好ましい免疫グロブリンはヒトＩｇＧ（詳細にはＩ
ｇＧ１）の重鎖の不変部分であり、融合はヒンジ領域で起こる。特定の具体例に
おいて、血液凝固因子Ｘａを用いて開裂できる開裂配列を導入することによりＦ
ｃ部分を簡単に除去することができる。さらにそのうえ、本発明は、遺伝子工学
によるこれらの融合蛋白の製造方法、ならびに薬剤スクリーニング、診断および
治療におけるそれらの使用に関する。本発明のさらなる態様はかかる融合蛋白を
コードしているポリヌクレオチドにも関する。融合蛋白法の例は国際特許出願Ｗ
Ｏ９４／２９４５８およびＷＯ９４／２２９１４に見いだされる。
【００８６】 さらにもう１つのアプローチにおいて、発現ブロッキング法を用いて内在性ｎ
ｒｄＥポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を阻害することができる。こ
のブロッキングは遺伝子発現のいずれの工程を標的としてもよいが、好ましくは
、転写および／または翻訳を標的とする。この種の既知方法の例は、体内で生じ
るかまたは別個に投与されるアンチセンス配列の使用を包含する（例えば、Olig
odeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press,
Bocca Raton, FL（１９８８）中O'Connor、J. Neurochem（１９９１）５６：５
６０を参照のこと）。別法として、遺伝子とともに三重らせんを形成するオリゴ
ヌクレオチドを提供してもよい。例えば、Leeら、Nucleic Acids Res（１９７９
）６：３０７３；Cooneyら、Science（１９８８）２４１：４５；Dervanら、Sci
ence（１９９１）２５１：１３６０を参照のこと。これらのオリゴヌクレオチド
はそれ自体投与することができ、あるいは重要部分のオリゴマーをインビボで発
現させることもできる。
【００８７】 本明細書で得られるポリヌクレオチド配列は、各々、抗菌化合物の発見および
開発に用いることができる。発現でコードされた蛋白は、抗菌薬物をスクリーニ
ングするための標的として用いることができる。加えて、コードされた蛋白のア
ミノ末端領域をコードするポリヌクレオチド配列あるいはシャイン・ダルガノま
たは他の個々のｍＲＮＡの翻訳容易化配列を用いて、目的とするコーディング配
列の発現を調節するアンチセンス配列を構築することができる。
【００８８】 本発明はまた、感染の続発症に関与する、病原体および哺乳動物宿主間の最初
の物理的相互作用を妨害するための、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド
、アゴニストまたはアンタゴニストの使用を提供する。特に本発明の分子は、細
菌、特にグラム陽性菌が内在装置上の哺乳動物細胞外マトリックス蛋白、または
創傷部の細胞外マトリックス蛋白に付着することを防御するために；例えば、哺
乳動物チロシンキナーゼのリン酸化を開始することによる、ｎｒｄＥ蛋白介在の
哺乳動物細胞侵入を遮断するために（Rosenshineら、Infect. Immun ６０：２２
１１（１９９２））；真核生物、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックス蛋白と
組織損傷を媒介する細菌性ｎｒｄＥ蛋白との間の細菌付着を遮断するために；内
在装置の埋め込みまたは他の外科的手技以外により開始した感染における病因の
通常の進行を遮断するために使用することができる。
【００８９】 本発明のさらに別の態様によれば、ｎｒｄＥのアゴニストおよびアンタゴニス
ト、好ましくは静菌性または殺菌性アゴニストおよびアンタゴニストが提供され
る。 本発明のアンタゴニストおよびアゴニストを用いて、例えば、疾患を阻害し、
治療することができる。 ヘリコバクター・ピロリ（Ｈelicobacter pylori）（本明細書中、エッチ・ピ
ロリともいう）菌は、胃癌、潰瘍、胃炎を発病している世界中の人々の３分の１
以上の胃に感染している（国際癌研究機関（International Agency for Researc
h on Cancer）（１９９４）Schistomoses，Liver Flukes and Helicobacter Pyl
ori（International Agency for Research on Cancer，Lyon，France；http：／
／www．uicc．ch／ecp／ecp２９０４．htm））。さらに、この国際癌研究機関は
、最近になって、ヘリコバクター・ピロリと胃腺癌の間の因果関係を認識し、そ
の細菌をグループＩ（限定的）発癌物質と分類した。本発明により提供されるま
たは当該分野にて知られているスクリーニング法を用いて見出される本発明の好
ましい抗菌化合物（ｎｒｄＥポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドのア
ゴニストおよびアンタゴニスト）、特に狭スペクトルの抗生物質は、ヘリコバク
ター・ピロリ感染の治療に有用である。このような治療はヘリコバクター・ピロ
リ誘発性癌、例えば胃腸癌の出現を減少させる。かかる治療はまた胃潰瘍および
胃炎も予防、阻害および／または治癒する。
【００９０】 ワクチン 生成物、組成物、ならびにｎｒｄＥ発現の評価、疾病の治療、遺伝学的変異の
アッセイ、および細菌、特にストレプトコッカス・ニュモニエ細菌に対する免疫
学的応答を生起させるためのｎｒｄＥポリペプチドおよび／またはポリヌクレオ
チドの生物への投与方法が本発明により提供される。 本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物における免疫学的応答を誘発する方
法であって、抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生成するのに適当なｎｒｄＥ
ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、またはそのフラグメントもしく
は変種を個体に接種し、該個体を感染、特に細菌感染、最も好ましくはストレプ
トコッカス・ニュモニエ感染から防御することを含む方法に関する。さらに、そ
のような免疫学的応答による細菌複製を遅らせる方法も提供する。本発明のさら
にもう一つ別の態様は、個体における免疫学的応答を誘発する方法であって、イ
ンビボでｎｒｄＥポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、またはそのフ
ラグメントまたは変種を発現するために、該ｎｒｄＥポリヌクレオチドおよび／
またはポリペプチド、またはそのフラグメントまたは変種の発現を指向する核酸
ベクター、配列またはリボザイムを該個体に送達し、例えば、サイトカイン産生
Ｔ細胞または細胞毒性Ｔ細胞を含め、抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生じ
させるように免疫学的応答を誘発し、該個体にて疾患が既に確立されているか否
かにかかわらず該個体、好ましくはヒトを疾患から保護することを含む方法に関
する。遺伝子を投与する一例は、粒子上のコーティングとして遺伝子を所望の細
胞に投与することによるものである。このような核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ
、リボザイム、修飾核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−蛋白複合体ま
たはＲＮＡ−蛋白複合体を含んでいてもよい。
【００９１】 本発明のさらなる態様は、その中に免疫学的応答を誘発する能力を有する個体
、好ましくはヒトに導入されると、その個体においてｎｒｄＥポリヌクレオチド
および／またはそれによりコードされるポリペプチドに対する免疫学的応答を誘
発する免疫学的組成物であって、組換えｎｒｄＥポリヌクレオチドおよび／また
はそれによりコードされるポリペプチドを含み、および／または該ｎｒｄＥポリ
ヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチド、または本発明の他のポリ
ペプチドの抗原をコードし、発現するＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む組成物
に関する。免疫学的応答は、治療的および予防的に使用でき、抗体免疫および／
またはＣＴＬまたはＣＤ４＋Ｔ細胞から生ずるような細胞性免疫から得ることが
できる。
【００９２】 ｎｒｄＥポリペプチドまたはそのフラグメントは、それ自体抗体を産生しても
しなくてもよいが、第１の蛋白の安定化ならびに抗原性および／または免疫原性
および保護特性を有するであろう融合または修飾蛋白の産生能を有する補蛋白（
co−Protein）と融合させることができる。このような融合組換え蛋白は、好ま
しくは、さらに、ヘモフィラス・インフルエンザ（Hemophilus influenzae）か
らのリポプロテインＤ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）また
はベータガラクトシダーゼのような抗原性補蛋白、蛋白を可溶化するか、または
その産生および精製を容易にするような比較的大きい補蛋白からなる。さらに、
補蛋白は、該蛋白を受ける生物の免疫系の全身的な刺激を与える上で、アジュバ
ントとして作用してもよい。補蛋白は第１の蛋白のアミノまたはカルボキシ末端
のいずれかに結合してもよい。 本発明は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび、Sato，Y.ら
，Science，２７３：３５２（１９９６）に記載されるような免疫刺激ＤＮＡ配
列からなる組成物、特にワクチン組成物および方法を提供する。
【００９３】 また、本発明は、ストレプトコッカス・ニュモニエ感染の動物モデルにおける
そのような遺伝的免疫実験において使用したポリヌクレオチド構築物中で細菌細
胞表面蛋白の非可変領域をコードすることが明らかにされた、記載されたポリヌ
クレオチドまたはその特定のフラグメントを使用する方法も提供する。そのよう
な実験は、予防的または治療的免疫応答を起こさせることのできる蛋白エピトー
プの同定に特に有用である。この方法により、動物、とりわけヒトにおける細菌
感染、特にストレプトコッカス・ニュモニエ感染の予防剤または治療剤の開発の
ために、動物の必須器官から感染の抵抗または除去に特に有用なモノクローナル
抗体を産生させることができると考えられる。 宿主を免疫するための抗原として本発明のポリペプチドを用い、例えば、損傷
組織への細菌の付着を遮断することにより、細菌の侵入を妨げる特異抗体を生じ
させることができる。組織損傷の例としては、例えば、機械的、化学的、熱的ま
たは放射損傷による、または内在装置の埋め込みによる皮膚や結合組織の傷、あ
るいは口、咽頭、乳腺、子宮または膣のような粘膜における傷が挙げられる。
【００９４】 本発明はまた、本発明の免疫原性組換えポリペプチドおよび／またはポリヌク
レオチドと適当な担体、例えば医薬上許容される担体とからなるワクチン処方も
包含する。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは胃で破壊されうるので、非経
口的投与（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、皮内等の投与を包含する）が望まし
い。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝剤、抗菌剤、およびその処方を
個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質を含有してもよい、水性および非
水性滅菌注射溶液；懸濁化剤または増粘剤を含有してもよい、水性および非水性
滅菌懸濁液を包含する。処方は、単位投与または複数投与用コンテナ、例えば、
密封されたアンプルおよびバイアルにて提供され、使用直前に滅菌液体担体を添
加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵することができる。ワクチン処方はまた、
水中油系のごとき処方の免疫原性を高めるアジュバント系および当該分野におい
て知られている他の系を有してもよい。投与量はワクチンの比活性に依存し、慣
用的実験操作によって容易に決定できる。 本発明をある種のｎｒｄＥポリペプチドおよびポリヌクレオチドについて記載
したが、この記載は天然のポリペプチドおよびポリヌクレオチドのフラグメント
、ならびに組換えポリペプチドまたはポリヌクレオチドの免疫原性を実質的に変
化させない付加、欠失または置換を有する同様なポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドも包含することが理解されるであろう。
【００９５】 組成物、キットおよび投与 本発明のさらなる態様において、単細胞または多細胞生物に投与される、ｎｒ
ｄＥポリヌクレオチドおよび／またはｎｒｄＥポリペプチドを含む組成物が提供
される。 本発明はまた、上記したポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドあるい
はそれらのアゴニストまたはアンタゴニストからなる組成物に関する。本発明の
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、個体への投与に適した医薬担体のよう
な細胞、組織または器官用の未滅菌または滅菌担体と組み合わせて使用できる。
かかる組成物は、例えば、媒体添加または治療上有効量の本発明のポリペプチド
および／またはポリヌクレオチドと、医薬上許容される担体または賦形剤を含む
。かかる担体は、限定するものではないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロー
ス、水、グリセロール、エタノールおよびその組み合わせを包含する。処方は投
与方法に適していなければならない。本発明は、さらには、上記した本発明の組
成物の一またはそれ以上の成分を充填した、一またはそれ以上のコンテナを含む
診断および医薬用パックおよびキットに関する。
【００９６】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび他の化合物を、単独で、また
は、治療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いてもよい。 該医薬組成物は、例えば、とりわけ、局所、経口、経肛門、経膣、静脈内、腹
腔内、筋肉内、皮下、経鼻、経皮経路による投与を含む、いずれかの有効な、都
合のよい方法で投与される。 治療および予防において、活性成分は個体に注射用組成物、例えば、好ましく
は等張の滅菌水性分散液として投与される。
【００９７】 また、組成物は、例えば、軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼剤、点
耳剤、洗口剤、含浸包帯および縫合糸ならびにエアゾルの形態の局所用処方とす
ることができ、適当な通常の添加剤、例えば、保存料、薬剤浸透を助ける溶媒、
軟膏やクリームにおけるエモリエント等を含むことができる。そのような局所用
処方はまた、適合する通常の担体、例えば、クリームまたは軟膏基剤、ローショ
ン用のエタノールまたはオレイルアルコールも含有することができる。このよう
な担体は、処方の約１〜９８重量％を構成してもよく、より一般的には、処方の
約８０重量％までを構成する。
【００９８】 さらなる態様において、本発明は、医薬上許容される担体または賦形剤を混合
された治療上有効量のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、例えば可
溶性形態の本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、アゴニスト
またはアンタゴニストペプチドまたは小型分子化合物を含む組成物が提供される
。かかる担体は、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセ
ロール、エタノール、およびそれらの混合物を包含するが、これらに限らない。
さらに本発明は、上記本発明組成物の１種またはそれ以上の成分を入れた１個ま
たはそれ以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。本発明のポリペプ
チド、ポリヌクレオチドおよび他の化合物を単独で、あるいは治療化合物のごと
き他の化合物と組み合わせて使用してもよい。 組成物を投与経路（例えば、全身投与または経口投与）に適合させる。医薬組
成物の全身投与の好ましい形態は、注射、典型的には静脈注射を包含する。皮下
、筋肉内または腹腔内のごとき他の注射経路を用いることもできる。全身投与の
ための別の手段は、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のごとき浸
透剤を用いる経粘膜または経皮投与を包含する。さらに、本発明のポリペプチド
または他の化合物が腸溶処方またはカプセル処方に処方できるならば、経口投与
も可能である。これらの化合物の投与は局所的なものであってもよく、膏薬、パ
スタ、ゲル等の形態であってもよい。
【００９９】 哺乳動物、特にヒトに投与するには、一日の活性薬剤の用量は、０.０１ｍｇ
／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、典型的には約１ｍｇ／ｋｇである。いずれにしても、
個体に最も適した実際の用量は顧問医により決定され、個体の年齢、体重および
応答により変化する。上記の用量は、平均的な場合の例示である。もちろん、よ
り高いまたは低い用量範囲が適当な個体もあり、それらも本発明の範囲内である
。 内在装置には外科移植、補綴およびカテーテル、すなわち、個体の体内に導入
され、その位置に長時間止まる装置が包含される。例えば、そのような装置とし
ては、人工関節、心臓弁、ペースメーカー、血管グラフト、血管カテーテル、脊
髄液シャント、尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（continuous ambulatory peri
toneal dialysis：ＣＡＰＤ）カテーテルが挙げられる。
【０１００】 本発明の組成物は、内在装置の挿入の直前に関連する細菌に対する全身的効果
を達成するために注射で投与できる。治療は、手術の後、装置が体内にある間継
続できる。加えて、組成物は、細菌の傷汚染、特に、ストレプトコッカス・ニュ
モニエの傷汚染を防止するために、いずれの手術用の手術周辺カバーの拡張にも
使用できる。 多くの整形外科医は、補綴関節を有するヒトは、菌血症を生じ得る歯の治療前
に抗生物質による予防を考慮すべきと考えている。後の重い感染は、重篤な合併
症となり、時に、補綴関節の損失および著しい罹病率、致死率を伴う。したがっ
て、該活性物質を、この状況の予防的抗生物質の代替品として使用することにま
で拡張することができる。
【０１０１】 上記した治療に加えて、本発明の組成物は、一般に、傷組織に露出したマトリ
ックス・蛋白への細菌付着を予防するための傷治療剤、抗生物質予防に代え、あ
るいは共に、歯の治療における予防的用途に使用できる。 別法として、本発明の組成物は挿入直前に内在装置を浸すのに使用できる。該
活性物質は、好ましくは、傷または内在装置を浸す場合、１μｇ／ｍｌ〜１０ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で使用できる。 便利には、ワクチン組成物は注射剤の形態である。通常のアジュバントを使用
して免疫応答を高めることができる。ワクチン用の適当な単位投与量は抗体０.
５〜５μｇ／ｋｇであり、この用量を、好ましくは１〜３週間の間隔で１〜３回
投与する。指示した用量範囲で、本発明の化合物では、その化合物の適当な個体
への投与を妨げる、有害な毒作用は何も観察されない。
【０１０２】 配列データベース、触知可能媒体中の配列、およびアルゴリズム ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、その２次元および３次元構造を
決定し、類似の相同性を有するさらなる配列を同定するための貴重な情報源を形
成する。配列をコンピューター読み込み可能媒体に保存し、次いで、既知の高分
子構造プログラムにおいて保存したデータを用いて、ＧＣＣのごときよく知られ
た既知検索ツールを用いてデータベースを検索することにより、これらのアプロ
ーチを最も容易に簡略化することができる。 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは検索分析に有用なデータベー
スならびに配列分析アルゴリズム中の成分として有用である。見出しのこのセク
ションならびにこのセクションに関連した請求項の用語「配列データベース、触
知可能媒体中の配列、およびアルゴリズム」「本発明のポリヌクレオチド」およ
び「本発明のポリヌクレオチド配列」は、本発明のポリヌクレオチドの検出可能
な化学的または物理的特性を意味し、触知可能媒体、例えば、コンピューター読
込み可能形態に還元または保存されていてもよいものである。例えば、クロマト
グラフィーのスキャンデータまたはピークのデータ、写真のデータまたはそこか
ら得られたスキャンデータ、コールドベース、および質量スペクトル分析データ
が挙げられる。データベースおよびアルゴリズムという見出しのこのセクション
ならびにそれに関連した請求項で用いる用語「本発明のポリペプチド」および「
本発明のポリペプチド配列」は、本発明のポリペプチドの検出可能な化学的また
は物理的特性を意味し、触知可能媒体に還元または保存されていてもよいもので
ある。例えば、クロマトグラフィーのスキャンデータまたはピークのデータ、写
真のデータまたはそこから得られたスキャンデータ、コールドベース、および質
量スペクトル分析データが挙げられる。
【０１０３】 本発明は、本発明のポリペプチド配列および／または本発明のポリヌクレオチ
ド配列を保存したコンピューター読み込み可能媒体を提供する。例えば、下記の
メンバーを含み、保存したコンピューター読み込み可能媒体が提供される：メン
バーは、本発明のポリヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド；本発明のポ
リペプチド配列の配列を含むポリペプチド；少なくとも１つの配列が本発明のポ
リヌクレオチド配列の配列を含むものであるポリヌクレオチド配列のセット；少
なくとも１つの配列が本発明のポリペプチド配列の配列を含むものであるポリヌ
ペプチド配列のセット；本発明のポリヌクレオチド配列の配列を含むポリヌクレ
オチド配列を表すデータセット；本発明のポリペプチド配列の配列を含むポリペ
プチド配列をコードしているポリヌクレオチド配列を表すデータセット；本発明
のポリヌクレオチド配列の配列を含むポリヌクレオチド；本発明のポリペプチド
配列の配列を含むポリペプチド；少なくとも１つの配列が本発明のポリヌクレオ
チド配列の配列を含むものであるポリヌクレオチド配列のセット；少なくとも１
つの配列が本発明のポリペプチド配列の配列を含むものであるポリペプチド配列
のセット；本発明のポリヌクレオチド配列の配列を含むポリヌクレオチド配列を
表すデータセット；本発明のポリペプチド配列の配列を含むポリペプチド配列を
コードしているポリヌクレオチド配列を示すデータセットである。コンピュータ
ー読み込み可能媒体は情報またはデータを保存するのに用いる物体のいずれの組
成物であってもよく、例えば、市販フロッピーディスク、テープ、チップ、ハー
ドドライブ、コンパクトディスク、およびビデオディスクを包含する。
【０１０４】 特徴配列または鎖、詳細には遺伝学的配列またはコードされた遺伝学的配列の
分析方法が本発明により提供される。配列分析のための好ましい方法は、例えば
、同一性および類似性の分析のごとき配列相同性分析、ＲＮＡ構造分析、配列ア
ッセンブリー、クラディスティック（cladistic）分析、配列モチーフ分析、読
み枠決定、核酸塩基コーリング（calling）、核酸塩基トリミング、および配列
決定クロマトグラムピーク分析の方法を包含する。 コンピューターによる方法は相同性の同定を行うために提供される。この方法
は、本発明のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列をコンピュータ
ー読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該ポリヌクレオチド配列を少なくとも
１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同定する工
程を含む。 コンピューターによる方法は相同性の同定を行うためにも提供され、該方法は
、本発明のポリペプチド配列を含むポリペプチド配列をコンピューター読み込み
可能媒体中に提供し、次いで、該ポリペプチド配列を少なくとも１つのポリヌク
レオチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同定する工程を含む。
【０１０５】 さらにコンピューターによる方法はポリヌクレオチドアッセンブリー用にも提
供され、該方法は、本発明のポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチ
ド配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該第１のポリヌ
クレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列との間の少なくとも１つの重複領
域をスクリーニングする工程を含む。 本発明のさらなる具体例は、相同性の同定を行うためのコンピューターによる
方法を提供し、該方法は、本発明のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ド配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該ポリヌクレオ
チド配列を少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較し
て相同性を同定する工程を含む。
【０１０６】 本発明のさらなる具体例は、相同性の同定を行うためのコンピューターによる
方法を提供し、該方法は、本発明のポリペプチド配列を含むポリペプチド配列を
コンピューター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該ポリペプチド配列を少
なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同
定する工程を含む。 本発明のさらなる具体例はポリヌクレオチドアッセンブリーのためのコンピュ
ーターによる方法を提供し、該方法は、本発明のポリヌクレオチド配列を含む第
１のポリヌクレオチド配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供し、次い
で、該第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列との間の少な
くとも１つの重複領域をスクリーニングする工程を含む。
【０１０７】 本発明のもう１つの好ましい具体例において、下記のものからなる群より選択
されるメンバーを保存したコンピューター読み込み可能媒体が提供される：メン
バーは、配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド；配列番号２の配列を含むポ
リペプチド；少なくとも１つの配列が配列番号１の配列を含むものであるポリヌ
クレオチド配列のセット；少なくとも１つの配列が配列番号２の配列を含むもの
であるポリペプチド配列のセット；配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド配
列を表すデータセット；配列番号２の配列を含むポリペプチド配列をコードして
いるポリヌクレオチド配列を表すデータセット；配列番号１の配列を含むポリヌ
クレオチド；配列番号２の配列を含むポリペプチド；少なくとも１つの配列が配
列番号１の配列を含むものであるポリヌクレオチド配列のセット；少なくとも１
つの配列が配列番号２の配列を含むものであるポリペプチド配列のセット；配列
番号１の配列を含むポリヌクレオチド配列を表すデータセット；配列番号２の配
列を含むポリペプチド配列をコードしているポリヌクレオチド配列を表すデータ
セットである。さらなる好ましい本発明の具体例は、相同性の同定を行うための
コンピューターによる方法を提供し、該方法は、配列番号１の配列を含むポリヌ
クレオチド配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該ポリ
ヌクレオチド配列を少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列
を比較して相同性を同定する工程を含む。
【０１０８】 さらなる好ましい本発明の具体例は、相同性の同定を行うためのコンピュータ
ーによる方法を提供し、配列番号２の配列を含むポリペプチド配列をコンピュー
ター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該ポリペプチド配列を少なくとも１
つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を比較して相同性を同定する工程
を含む。 さらなる好ましい本発明の具体例は、ポリヌクレオチドアッセンブリーのため
のコンピューターによる方法を提供し、該方法は、配列番号１の配列を含む第１
のポリヌクレオチド配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供し、次いで
、該第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列との間の少なく
とも１つの重複領域をスクリーニングする工程を含む。 本発明のさらなる具体例は、相同性の同定を行うためのコンピューターによる
方法を提供し、該方法は、配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド配列をコン
ピューター読み込み可能媒体中に提供し、該ポリヌクレオチド配列を少なくとも
１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同定する工
程を含む。
【０１０９】 本発明のさらなる具体例は、相同性の同定を行うためのコンピューターによる
方法を提供し、該方法は、配列番号２の配列を含むポリペプチド配列をコンピュ
ーター読み込み可能媒体中に提供し、該ポリペプチド配列を少なくとも１つのポ
リヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同定する工程を含む
。 本発明のさらなる具体例はポリヌクレオチドアッセンブリーのためのコンピュ
ーターによる方法を提供し、該方法は、配列番号１の配列を含む第１のポリヌク
レオチド配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該第１の
ポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列との間の少なくとも１つの
重複領域をスクリーニングする工程を含む。 本明細書において引用したすべての刊行物および引用文献（特許および特許出
願に限らない）は、たとえ、個々の刊行物または引用文献が具体的および個別的
に完全に記載されている場合に出典明示により本明細書の一部とするとされてい
ても、出典明示によりその内容を本明細書の一部とする。本願が優先権を主張す
るいずれの特許出願もまた出典明示により本明細書の一部とする。
【０１１０】 用語 本明細書中で頻繁に使用される特定の用語を、その理解を容易にするために以
下に定義する。 「抗体（複数でも可）」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、
キメラ、１本鎖、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントを包含し、さ
らにＦａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を包含する。 「抗原的に等価な誘導体（複数でも可）」は、特定の抗体により特異的に認識
されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはいずれかの等価物を包含し、該
特定の抗体は、本発明蛋白、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して生成
した場合に、病原体と哺乳動物宿主との間の身体的相互作用を妨害するものであ
る。 「二特異的（複数でも可）」とは、少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む
抗体を意味し、各ドメインは異なるエピトープに指向されている。 「肉体材料（複数でも可）」とは、個体または生物由来の材料を意味し、骨、
血液、血清、脳脊髄液、精液、唾液、筋肉、軟骨、器官組織、皮膚、尿、糞便ま
たは生検材料のごとき細胞、組織および排泄物等を包含するが、これらに限定さ
れるものではない。 「疾病（複数でも可）」は、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎
、静脈洞炎、胸腔蓄膿および心内膜炎、とりわけ、例えば髄液の感染などの髄膜
炎を含む、細菌による感染により引き起こされる疾病、またはかかる細菌による
感染に関連した疾病を意味する。
【０１１１】 「融合蛋白（複数でも可）」は、２種の、しばしば関係のない融合遺伝子また
はそのフラグメントによりコードされた蛋白をいう。一例において、ＥＰ−Ａ−
０４６４には、別のヒト蛋白またはその一部と一緒になった免疫グロブリン分子
の不変領域の種々の部分を含む融合蛋白が開示されている。多くの場合、免疫グ
ロブリンのＦｃ領域を融合蛋白の一部分として用いることは治療および診断にお
ける使用に有利であり、例えば、改善された薬物動態学的特性が得られる（例え
ば、ＥＰ−Ａ ０２３２２６２参照）。一方、いくつかの用途には、融合蛋白が
発現、検出および精製された後、Ｆｃ部分を欠失できることが望ましいであろう
。 「宿主細胞（複数でも可）」は外来性ポリヌクレオチド配列によって形質転換
またはトランスフェクションされた、あるいは形質転換またはトランスフェクシ
ョンされうる細胞である。
【０１１２】 「同一性」は、当該分野で公知であり、配列の比較で決定されるような、２ま
たはそれ以上のポリペプチド配列あるいは２またはそれ以上のポリヌクレオチド
配列の間の関係である。また、当該分野では、「同一性」は、場合によっては、
配列の鎖間の対合によって決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオ
チド配列間の配列の関連性の度合を意味する。「同一性」は、Computational Mo
lecular Biology，Lesk，A.M.編，Oxford University Press，New York，１９８
８；Biocomputing：Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編，Academ
ic Press，New York，１９９３；Computer Analysis of Sequence Data，Part I
，Griffin, A.M.およびGriffin, H.G.編，Humana Press，New Jersey，１９９４
；Sequence Analysis in Molecular Biology，Von Heinje,G．Academic Press，
１９８７；およびSequence Analysis Primer，Gribskov,M.およびDevereux, J.
編，M Stockton Press，New York，１９９１；およびCarllio,HおよびLipman,D.
，SIAM J.Applied Math., ４８：１０７３（１９８８）に記載されている方法（
これらに限らない）を含め、公知方法により容易に決定することができる。同一
性を決定する好ましい方法は、テストする配列間に最大の対合を与えるように設
計されている。そのうえ、同一性を測定する方法は公に入手できるコンピュータ
・プログラムに集成されている。２つの配列の間の同一性を測定する好ましいコ
ンピュータ・プログラム方法は、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devere
ux,J.ら，Nucleic Acids Research（１９８４）１２（１）：３８７）、BLASTP
、BLASTNおよびFASTA（Atschul,S. F.ら, J.Molec.Biol.（１９９０）２１５：
４０３−４１０）を包含するが、これに限らない。BLAST XプログラムはNCBIお
よび他の源（BLAST Manual，Altshul, S．ら，NCBI NLM NIH Bethesda，MD２０
８９４；Altschul,S．ら，J．Mol．Biol.，２１５：４０３−４１０（１９９０
））から公に入手できる。また、周知のスミス・ウォーターマン（Smith Waterm
an)アルゴリズムを用いて同一性を決定することもできる。
【０１１３】 ポリペプチド配列の比較のためのパラメーターは以下のものを包含する： １）アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch、J.Mol.Biol. ４８：４４３−４５
３（１９７０） 比較マトリックス：HentikoffおよびHentikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.８９
：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２ ギャップペナルティー：１２ ギャップ長ペナルティー：４ これらのパラメーターに関して有用なプログラムは、Genetics Computer Grou
p, Madison WI.から「ギャップ」プログラムとして公に利用できる。上記パラメ
ーターはペプチド比較のための省略時パラメーターである（エンドギャップにつ
いてペナルティーを伴わない）。 ポリヌクレオチド比較のためのパラメーターは下記のものを包含する： １）アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J.Mol.Biol. ４８：４４３−４５
３（１９７０） 比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：５０ ギャップ長ペナルティー：３ これらのパラメーターに関して有用なプログラムは、Genetics Computer Grou
p, Madison WI.から「ギャップ」プログラムとして公に利用できる。上記パラメ
ーターは核酸比較のための省略時パラメーターである。
【０１１４】 ポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての「同一性」に関する好ましい意
味は、下記（１）および（２）に示される。 （１）さらにポリヌクレオチドの具体例は、配列番号１の対照配列に対して少な
くとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または１００％の同一
性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列を包含し、そ
のポリヌクレオチド配列は配列番号１の対照配列と同一であってもよく、あるい
は対照配列と比較してある程度の数までのヌクレオチドの変化を有していてもよ
い。かかる変化は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、置換（トランジショ
ンおよびトランスバージョンを包含）または挿入からなる群より選択され、該変
化は対照ヌクレオチド配列の５’または３’末端の位置あるいはそれらの末端位
置の間の位置において、対照配列中のヌクレオチドにおいて個々にまたは散在し
て、あるいは対照配列中の１またはそれ以上の連続した群として生じてもよい。
配列番号１中の全ヌクレオチド数と個々の同一性パーセント値（１００で割った
もの）とをかけて、その積を配列番号１中の全ヌクレオチド数から差し引くこと
によりヌクレオチド変化の数を決定する。これを下式により説明する： ｎn≦ｘn−（ｘn・ｙ） 式中、ｎnはヌクレオチド変化の数であり、ｘnは配列番号１中の全ヌクレオチド
数であり、ｙは、例えば５０％ならば０.５であり、６０％ならば０.６であり、
７０％ならば０.７０であり、８０％ならば０.８０であり、８５％ならば０.８
５であり、９０％ならば０.９０であり、９５％ならば０.９５であり、９７％な
らば０.９７であり、１００％ならば１.００であり、・は積の演算子であり、ｘ n とｙとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、ｘnから差し引
く。配列番号２のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の変化は
、好ましくはコーディング配列中のナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフ
ト変異を引き起こす可能性があり、それゆえ、かかる変化に随伴してポリヌクレ
オチドによりコードされているポリペプチドが変化する。
【０１１５】 例えば、本発明のポリヌクレオチド配列は配列番号１の対照配列と同一であっ
てもよく、すなわち、１００％同一であってもよく、あるいは対照配列と比較し
てある程度の数までの核酸の変化を有していてもよい（その場合、同一性％は１
００％未満である）。かかる変化は、少なくとも１個の核酸の欠失、置換（トラ
ンジションおよびトランスバージョンを包含）または挿入からなる群より選択さ
れ、該変化は対照ポリヌクレオチド配列の５’または３’末端の位置あるいはそ
れらの末端位置の間の位置において、対照配列中の核酸において個々にまたは散
在して、あるいは対照配列中の１またはそれ以上の連続した群として生じてもよ
い。配列番号１中の全核酸数に個々の同一性を示す整数を１００で割った値をか
けて、その積を配列番号１中の全核酸数から差し引くことにより同一性％値につ
いての核酸変化数を決定する。あるいはこのことは下式により説明される： ｎn≦ｘn−（ｘn・ｙ） 式中、ｎnは核酸変化の数であり、ｘnは配列番号１中の全核酸数であり、ｙは、
例えば７０％ならば０.７０であり、８０％ならば０.８０であり、８５％ならば
０.８５等であり、・は積の演算子であり、ｘnとｙとの整数でない積は切り捨て
により最も近い整数とした後、ｘnから差し引く。
【０１１６】 （２）さらにポリペプチドの具体例は、配列番号２のポリペプチド対照配列に対
して少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または１００
％の同一性を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドを包含し、該ポリペプ
チド配列は配列番号２の対照配列と同一であってもよく、あるいは対照配列と比
較してある程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい。かかる変化は、
少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（保存的および非保存的置換を包含）ま
たは挿入からなる群より選択され、該変化は対照ポリペプチド配列のアミノまた
はカルボキシ末端の位置あるいはそれらの末端位置の間の位置において、対照配
列中のアミノ酸において個々にまたは散在して、あるいは対照配列中の１または
それ以上の連続した群として生じてもよい。配列番号２中の全アミノ酸数と同一
性を示す整数を１００で割った値とをかけて、その積を配列番号２中の全アミノ
酸数から差し引くことによりアミノ酸変化の数を決定する。これを下式により説
明する： ｎa≦ｘa−（ｘa・ｙ） 式中、ｎaはアミノ酸変化数であり、ｘaは配列番号２中の全アミノ酸数であり、
ｙは、例えば５０％ならば０.５であり、６０％ならば０.６であり、７０％なら
ば０.７０であり、８０％ならば０.８０であり、８５％ならば０.８５であり、
９０％ならば０.９０であり、９５％ならば０.９５であり、９７％ならば０.９
７であり、１００％ならば１.００であり、・は積の演算子であり、ｘaとｙとの
整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、ｘaから差し引く。
【０１１７】 例えば、本発明のポリペプチド配列は配列番号２の対照配列と同一であっても
よく、すなわち、１００％同一であってもよく、あるいは対照配列と比較してあ
る程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい（その場合、同一性％は１
００％未満である）。かかる変化は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（
保存的または非保存的置換を包含）または挿入からなる群より選択され、該変化
は対照ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置あるいはそれらの
末端位置の間の位置において、対照配列中のアミノ酸において個々にまたは散在
して、あるいは対照配列中の１またはそれ以上の連続した群として生じてもよい
。配列番号２中の全アミノ酸数に個々の同一性パーセント値（１００で割ったも
の）をかけて、その積を配列番号２中の全アミノ酸数から差し引くことにより同
一性％値についてのアミノ酸変化数を決定する。これを下式により説明する： ｎa≦ｘa−（ｘa・ｙ） 式中、ｎaはアミノ酸変化の数であり、ｘaは配列番号２中の全アミノ酸数であり
、ｙは、例えば７０％ならば０.７０であり、８０％ならば０.８０であり、８５
％ならば０.８５等であり、・は積の演算子であり、ｘaとｙとの整数でない積は
切り捨てにより最も近い整数とした後、ｘaから差し引く。
【０１１８】 「免疫学的に等価な誘導体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはい
ずれかの等価物を包含し、それらが脊椎動物において抗体を生成させるために適
当な処方中に用いられた場合に、抗体は病原体と哺乳動物宿主との間の即時的な
身体的相互作用を妨害するように作用する。 「免疫特異的」とは、他の関連ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、特に先
行技術のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対してよりも本発明のポリペプ
チドまたは本発明のポリヌクレオチドに対して実質的に大きなアフィニティーを
有する抗体の特性を意味する。 「個体（複数でも可）」とは多細胞真核生物を意味し、後生動物類、哺乳動物
、ヤギ類、ウシ類、類人猿、霊長類およびヒトを包含するが、これらに限らない
。
【０１１９】 「単離された」とは、「ヒトの手により」、その天然の状態から変えられるこ
と、すなわち、天然物の場合、その本来的な環境から変化または除去あるいは両
方されたことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態で共存する物質
から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書で用いる
用語としての「単離された」ものである。さらには、形質転換、遺伝的操作によ
り、または他のいずれかの方法により生物に導入されているポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは、まだ生物内にあり、その生物が生きているまたは死んでい
るとしても、「単離された」ものである。
【０１２０】 「生物（複数でも可）」は、（ｉ）Streptococcus、Staphylococcus、Bordete
lla、Corynebacterium、Mycobacterium、Neisseia、Haemophilus、Actinomyces
、Streptomyces、Nocardia、Enterobacter、Yersinia、Fancisella、Pasturella
、Moraxella、Acinetobacter、Erysipelothrix、Branhamella、Actinobacillus
、Streptobacillus、Listeria、Calymmatobacterium、Brucella、Bacillus、Clo
sterdium、Treponema、Escherichia、Salmonella、Kleibsiella、Vibrio、Prote
us、Erwinia、Borrelia、Leptospira、Spirillum、Campylobacter、Shigella、L
egionella、Pseudomonas、Aeromonas、Rickettsia、Chlamydia、Borreliaおよび
Mycoplasmaである属（これらに限らない）のメンバー、ならびにグループＡのSt
reptococcus、グループＢのStreptococcus、グループＣのStreptococcus、グル
ープＤのStreptococcus、グループＧのStreptococcus、Staphylococcus aureus
、Streptococcus pyrogenes、Streptococcus agalactiae、Streptococcus faeca
lis、Streptococcus faecium、Streptococcus durans、Neisseria gonorrheae、
Neisseria meningitidis、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidi
s、Corynebacterium diptheriae、Garnella vaginalis、Mycobacterium tubercu
losis、Mycobacterium bovis、Mycobacterium ulcerans、Mycobacterium leprae
、Actinomyces israelli、Listeria monocytogenes、Bordetella pretusis、Bor
detella parapretusis、Bordetella bronchiseptica、Esherichia coli、Shigel
la dysenteriae、Haemophilus influenzae、Haemophilus aegyptius、Haemophil
us parainfluenzae、Haemophilus ducreyi、Bordetella、Salmonella typhi、Ci
trobacter freundii、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Yersinia pestis
、Klebsiella pneumoniae、Serratia marcessens、Serratia liquefaciens、Vib
rio cholera、Shigella dysenterii、Shigella flexneri、Pseudomonas aerugin
osa、Franscisella tularensis、Brucella abortis、Bacillus anthracis、Baci
llus cereus、Clostridium perfringens、Clostridium tetani、Clostridium bu
tulinum、Treponema pallidum、Rickettsia rickettsiiおよびChlamydia tracho
mitisである種またはグループ（これらに限らない）のメンバーを包含する原核
生物、（ｉｉ）Archaebacter（これに限らない）を包含する古細菌、および（ｉ
ｉｉ）原生動物、真菌類、Saccharomyces、KluveromycesまたはCandida属（これ
らに限らない）のメンバー、およびSaccharomyces cerevisiae、Kluveromyces l
actisまたはCandida albicans種のメンバー（これらに限らない）を包含する単
細胞または糸状真核生物を意味する。
【０１２１】 「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、一般に、ポリリボヌクレオチドまた
はポリデオキシリボヌクレオチドのいずれをもいい、それらは非修飾ＲＮＡまた
はＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチ
ド」は、単鎖および二本鎖ＤＮＡ、単鎖および二本鎖領域または単鎖、二本鎖お
よび三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単鎖および二本鎖ＲＮＡ、単鎖および二
本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、および単鎖またはより典型的には二本鎖または
三本鎖領域または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよび
ＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するが、これに限定されない。さらに、本
明細書において用いる「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは
ＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる三本鎖領域をいう。これらの領域の鎖は同じ
分子からのものでも、異なる分子からのものでもよい。該領域は、これら分子の
一またはそれ以上のすべてを含んでもよいが、より典型的には、分子のいくつか
の領域のみを含む。三本螺旋領域の分子の一つは、しばしば、オリゴヌクレオチ
ドである。本明細書において用いる場合、「ポリヌクレオチド（複数でも可）」
なる用語はまた、一つまたはそれ以上の修飾された塩基を含有する上記ＤＮＡま
たはＲＮＡを包含する。すなわち、安定性または他の理由で修飾された骨格を有
するＤＮＡまたはＲＮＡも、該用語が本明細書で意図するところの「ポリヌクレ
オチド（複数でも可）」である。さらに、イノシンなどの通常でない塩基、また
はトリチル化された塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（２つの例だ
けを示す）も、その用語を本明細書で用いる場合のポリヌクレオチドである。多
種の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされており、当業者に公知のように多くの有
用な目的に使用されていることが理解されよう。本明細書で用いる「ポリヌクレ
オチド」なる語は、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的
に修飾された形態、ならびにウイルスおよび、例えば、単純型細胞および複雑型
細胞などの細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリ
ヌクレオチド（複数でも可）」はまた、しばしばオリゴヌクレオチド（複数でも
可）と称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【０１２２】 「ポリペプチド（複数でも可）」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合で
互いに結合した２つまたはそれ以上のアミノ酸を含むいずれのペプチドまたは蛋
白をもいう。「ポリペプチド（複数でも可）」は、通常、ペプチド、オリゴペプ
チドまたはオリゴマーと称される短い鎖、および一般に蛋白と称される長い鎖の
両方をいう。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされている２０個のアミノ酸
以外のアミノ酸を含有してもよい。「ポリペプチド（複数でも可）」は、プロセ
ッシングおよび他の翻訳後の修飾のごとき自然の工程、または化学修飾技法のい
ずれかによって修飾されたものを有する。かかる修飾は、基本テキストにて、お
よびより詳細な研究論文にて、ならびに膨大な研究文献にて詳しく記載されてお
り、それらは当業者に周知である。同じ型の修飾が、所定のポリペプチド中、い
くつかの部位で、同じまたは異なる程度にて存在してもよいことは明らかであろ
う。また、所定のペプチドは多くの型の修飾を有していてもよい。修飾は、ペプ
チド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチド
のどこででも起こりうる。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リ
ボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド
またはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホス
ホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱
メチル化、共有交差結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホ
ルミル化、ガンマーカルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨ
ード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解的プロセッシング、リン酸
化、プレニル化、ラセミ化、糖鎖形成、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基の
ガンマーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレノイ
ル化、硫酸化、アルギニル化のごとき転移ＲＮＡにより媒介される蛋白へのアミ
ノ酸付加、およびユビキチネーションを包含する。例えば、PROTEINS−STRUCTUR
E AND MOLECULAR PROPERTIES, 第２版，Ｔ.Ｅ.Ｃreighton，Ｗ.Ｈ.Ｆreeman and
Ｃompany，New York（１９９３）およびＷold,Ｆ.，POSTTRANSLATIONAL COVALE
NT MODIFICATION OF PROTEINS，Posttranslational Protein Modifications：Pe
rspectives and Prospects, １-１２頁，B.C.Johnson編，Academic Press，New
York（１９８３）；Seifterら,Meth Enzymol.（１９９０）１８２：６２６−６
４６、およびRattanら, Protein Synthesis：Posttranslational Modifications
and Aging，Ann N.Y. Acad Sci（１９９２）６６３：４８−６２を参照のこと
。ポリペプチドは、分枝してもよく、分枝を伴ったまたは伴わない環状であって
もよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセッシ
ングの結果であり、同様に全く合成的な方法で合成できる。
【０１２３】 「組み換え発現系（複数でも可）」は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの製造のために宿主細胞または宿主細胞溶解物中に導入または形質転換
された発現系またはその部分または本発明のポリヌクレオチドをいう。 「引き算セット（subtraction set）」は、本発明の少なくとも１のポリヌク
レオチドを含む１種またはそれ以上、しかし好ましくは１００種未満のポリヌク
レオチドである。
【０１２４】 本明細書中で使用される「変種（複数でも可）」なる語は、各々、対照標準の
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、本質的な特性を保持している
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変種
は、別の対照標準のポリヌクレオチドとヌクレオチド配列において異なっている
。変種のヌクレオチド配列における変化は、対照標準のポリヌクレオチドによっ
てコードされたポリペプチドのアミノ酸配列と変わっていてもよいし、または変
わっていなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、後述するように、対照標準の配
列によってコードされたポリペプチドにおいて、アミノ酸置換、付加、欠失、融
合および切断をもたらしうる。ポリペプチドの典型的な変種は、別の対照標準の
ポリペプチドとはアミノ酸配列において異なっている。一般に、差異は、対照標
準のポリペプチドとその変種の配列が全体的に非常に類似しており、多くの領域
においては同一であるように限定される。変種および対照標準のポリペプチドは
、一またはそれ以上の置換、付加、欠失のいずれかの組み合わせによって、アミ
ノ酸配列において異なってもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝
コードによってコードされたものであってもなくてもよい。また本発明は、本発
明の各ポリペプチドの変種、すなわち保存的アミノ酸置換により対照標準とは異
なっており、そのことにより残基が同様の特性を有する別の残基に置換されてい
るものを包含する。典型的なかかる置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌ
ｅ間；ＳｅｒおよびＴｈｒ間；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕ間；ＡｓｎおよびＧ
ｌｎ間；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ間；あるいは芳香族残基ＰｈｅおよびＴ
ｙｒ間のものである。数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個または
１個のアミノ酸がいずれかの組み合わせで置換、欠失、または付加されている変
種が特に好ましい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は、対立遺伝子
変種のような天然に存在するものであってもよく、または天然に存在することが
知られていない変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天
然に存在しない変種は、変異誘発法または直接合成あるいは当業者に公知の他の
組換え法によって作られてもよい。
【０１２５】 （実施例） 以下の実施例は、別に詳細に記載したこと以外は、当業者に周知で慣用的な標
準的な技法を用いて実施する。実施例は例示であって、本発明を限定するもので
はない。 実施例１ 株の選択、ライブラリーの製造および配列決定 表１（配列番号１）に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドは、エシェリ
シア・コリ中のストレプトコッカス・ニュモニエの染色体ＤＮＡのクローンライ
ブラリーより得た。重複するストレプトコッカス・ニュモニエＤＮＡを含有する
２個またはそれ以上のクローンからの配列データを用いて、配列番号１の連続し
たＤＮＡ配列を構築した。ライブラリーは常套手段、例えば以下の方法１および
２により製造してもよい。 全細胞ＤＮＡをストレプトコッカス・ニュモニエ０１００９９３より、標準法
に従って単離し、以下に示す二つの方法のいずれかによりサイズ分画する。
【０１２６】 方法１ 標準的方法に従ってサイズ分画するために、全細胞ＤＮＡをニードル（needle
）に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大きさのＤＮＡフラグメントを
エキソヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼで処理することによって末端切断
し、ＥｃｏＲＩリンカーを付加する。フラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断したベ
クター、ラムダＺａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケー
ジングし、次いでパッケージングしたライブラリーでエシェリシア・コリを感染
させる。ライブラリーを標準方法により増幅する。
【０１２７】 方法２ 全細胞ＤＮＡをライブラリーベクターにクローニングするための一連のフラグ
メントを得るのに適当な１つの制限酵素（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、Ａｌｕ
Ｉ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）またはその組み合わせで部分的に加水分解し、かかるフ
ラグメントを標準的方法に従ってサイズ分画する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡ
に連結し、次いでそのフラグメントをＥｃｏＲＩで切断したベクター、ラムダＺ
ａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、パッケ
ージングしたライブラリーでエシェリシア・コリを感染させる。ライブラリーを
標準方法により増幅する。
【０１２８】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 37/04 Ａ６１Ｐ 37/04 Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０Ｆ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ // Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 マイケル・ティ・ブラック アメリカ合衆国19425ペンシルベニア州チ ェスター・スプリングズ、ミルハウス・ウ ェイ502番 (72)発明者 リサ・ケイ・シリング アメリカ合衆国18940ペンシルベニア州ニ ュータウン、イースト・パーク・ロード６ 番 (72)発明者 アナ・エル・コスマトカ アメリカ合衆国18901ペンシルベニア州ド イルズタウン、ペブル・ヒル・ロード482 番 (72)発明者 デボラ・ディ・ジャワースキー アメリカ合衆国19382ペンシルベニア州ウ エスト・チェスター、スカイルズ・ブール バード1827番 (72)発明者 ワン・ミン アメリカ合衆国19422ペンシルベニア州ブ ルー・ベル、センテニアル・ドライブ302 番

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ｉ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配
    列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、または （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列である単離ポリペプチド；および （ｖｉ）配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌクレオチド
    によりコードされるポリペプチド からなる群より選択される単離ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 （ｉ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配
    列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌ
    クレオチド； （ｉｉ）配列番号２のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に対し
    てその全長にわたって少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｉｉｉ）配列番号１の全長にわたって配列番号１のヌクレオチド配列に対し
    て少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｉｖ）配列番号２のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む
    単離ポリヌクレオチド； （ｖ）配列番号１のポリヌクレオチドである単離ポリヌクレオチド； （ｖｉ）厳密なハイブリダイゼーション条件下で配列番号１の配列またはその
    フラグメントの配列を有する標識プローブを用いて適当なライブラリーをスクリ
    ーニングすることにより得ることのできる単離ポリヌクレオチド； （ｖｉｉ）ストレプトコッカス・ニュモニエ中に含まれるｎｒｄＥ遺伝子によ
    り発現される成熟ポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチド；および （ｖｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）ま
    たは（ｖｉｉ）の該単離ポリヌクレオチドに対して相捕的なポリヌクレオチド配
    列 からなる群より選択される単離ポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドに対して抗原性のある、あるいは免
    疫特異的な抗体。
  4. 【請求項４】 個体の治療方法であって、 （ｉ）（ａ）請求項１のポリペプチドに対する治療上有効量のアゴニストを個
    体に投与すること；または （ｂ）インビボで請求項１のポリペプチドの活性を生じるような形態の、請
    求項１のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌ
    クレオチドを個体に提供すること を含む、請求項１のポリペプチドの活性または発現の促進を必要とする個体の治
    療方法；あるいは （ｉｉ）（ａ）請求項１のポリペプチドに対する治療上有効量のアンタゴニス
    トを個体に投与すること；または （ｂ）請求項１のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の発
    現を阻害する核酸分子を個体に投与すること；または （ｃ）リガンド、基質、または受容体を求めて請求項１のポリペプチドと競
    争する治療上有効量のポリペプチドを個体に投与すること を含む、請求項１のポリペプチドの活性または発現の阻害を必要とする個体 の治療方法。
  5. 【請求項５】 個体における請求項１のポリペプチドの発現または活性に関
    連した、個体における疾病またはかかる疾病に対する感受性の診断または予後の
    方法であって、下記工程： （ａ）該個体のゲノム中の該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列
    における変異の存在または不存在を決定すること；または （ｂ）該個体由来の試料中の該ポリペプチドの発現の存在または量を分析する
    こと を含む方法。
  6. 【請求項６】 請求項１のポリペプチドの機能を活性化または阻害する化合
    物を同定するためのスクリーニング方法であって、 （ａ）候補化合物に直接または間接的に結合した標識を用いてポリペプチドま
    たはポリペプチドを有する細胞もしくは膜またはその融合蛋白への候補化合物の
    結合を測定すること； （ｂ）標識競争物質の存在下でポリペプチドまたはポリペプチドを有する細胞
    もしくは膜またはその融合蛋白への候補化合物の結合を測定すること； （ｃ）ポリペプチドを有する細胞もしくは細胞膜に適する検出系を用いて、候
    補化合物がポリペプチドの活性化または阻害により発生するシグナルを生じさせ
    るかどうかを試験すること； （ｄ）候補化合物と、請求項１のポリペプチドを含有する溶液とを混合して混
    合物を作成し、混合物中のポリペプチドの活性を測定し、次いで、混合物の活性
    を標準と比較すること； （ｅ）例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて細胞中で該ポリペプチドをコードし
    ているｍＲＮＡおよび該ポリペプチドの生成に対する候補化合物の影響を検出す
    ること、あるいは （ｆ）（１）化合物の相互作用を評価するために、化合物とポリペプチドとの
    間の相互作用を可能にする条件下でポリペプチドを含む組成物をスクリーニング
    すべき化合物と接触させ（かかる相互作用は、化合物とポリペプチドとの相互作
    用に応答した検出可能シグナルを生じることのできる第２の成分に関連したもの
    である）；次いで （２）化合物とポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルの存在または
    不存在を検出することにより、化合物がポリペプチドと相互作用し、その活性を
    活性化または阻害するかどうかを決定すること からなる群から選択される方法を含む方法。
  7. 【請求項７】 請求項１のポリペプチドの活性または発現についてのアゴニ
    ストまたはアンタゴニスト。
  8. 【請求項８】 適合する宿主中に存在する場合に、請求項１のポリペプチド
    を生成する能力のあるポリヌクレオチドを含む発現系。
  9. 【請求項９】 （ｉ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配
    列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、または （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列である単離ポリペプチド；および （ｖｉ）配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌクレオチド
    によりコードされるポリペプチド からなる群より選択されるポリペプチドを発現する、請求項８の発現系を含む宿
    主細胞またはその膜。
  10. 【請求項１０】 （ｉ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸
    配列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、または （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列である単離ポリペプチド；および （ｖｉ）配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌクレオチド
    によりコードされるポリペプチド からなる群より選択されるポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドの
    生成に十分な条件下で請求項９の宿主細胞を培養することを含む方法。
  11. 【請求項１１】 （ｉ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸
    配列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、または （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列である単離ポリペプチド；および （ｖｉ）配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌクレオチド
    によりコードされるポリペプチド からなる群より選択されるポリペプチドを発現する、請求項８の発現系を含む宿
    主細胞またはその膜の製造方法であって、適合宿主中に存在する場合に上記ポリ
    ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）を生成可能なポリヌクレ
    オチドを含む発現系で細胞を形質転換またはトランスフェクションして、適当な
    培養条件下で宿主細胞が上記ポリペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または
    （ｉｖ）を生成するようにすることを含む方法。
  12. 【請求項１２】 （ｉ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸
    配列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、または （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列である単離ポリペプチド；および （ｖｉ）配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌクレオチド
    によりコードされるポリペプチド からなる群より選択されるポリペプチドを発現する、請求項１１の方法により製
    造される宿主細胞またはその膜。
  13. 【請求項１３】 配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド；配列番号２の
    配列を含むポリペプチド；少なくとも１つの配列が配列番号１の配列を含むもの
    であるポリヌクレオチド配列のセット；少なくとも１つの配列が配列番号２の配
    列を含むものであるポリペプチド配列のセット；配列番号１の配列を含むポリヌ
    クレオチド配列を表すデータセット；配列番号２の配列を含むポリペプチド配列
    をコードしているポリヌクレオチド配列を表すデータセット；配列番号１の配列
    を含むポリヌクレオチド；配列番号２の配列を含むポリペプチド；少なくとも１
    つの配列が配列番号１の配列を含むものであるポリヌクレオチド配列のセット；
    少なくとも１つの配列が配列番号２の配列を含むものであるポリペプチド配列の
    セット；配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド配列を表すデータセット；配
    列番号２の配列を含むポリペプチド配列をコードしているポリヌクレオチド配列
    を表すデータセットからなる群より選択されるメンバーを保存したコンピュータ
    ー読み込み可能媒体。
  14. 【請求項１４】 相同性の同定を行うためのコンピューターによる方法であ
    って、 配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド配列をコンピューター読み込み可能媒
    体中に提供し、次いで、該ポリヌクレオチド配列を少なくとも１つのポリヌクレ
    オチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同定する工程を含む方法。
  15. 【請求項１５】 ポリクレオチドアッセンブリーのためのコンピューターに
    よる方法であって、配列番号１の配列を含む第１のポリヌクレオチド配列をコン
    ピューター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該第１のポリヌクレオチド配
    列と第２のポリヌクレオチド配列との間の少なくとも１つの重複領域をスクリー
    ニングする工程を含む方法。
JP2000551783A 1998-06-05 1999-06-03 ｎｒｄＥ Withdrawn JP2002516868A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/092,218 US6660520B2 (en) 1998-06-05 1998-06-05 Nrde
US09/092,218 1998-06-05
PCT/US1999/012301 WO1999062527A1 (en) 1998-06-05 1999-06-03 nrdE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002516868A true JP2002516868A (ja) 2002-06-11

Family

ID=22232207

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000551783A Withdrawn JP2002516868A (ja) 1998-06-05 1999-06-03 ｎｒｄＥ

Country Status (4)

Country Link
US (1) US6660520B2 (ja)
EP (1) EP1083910A4 (ja)
JP (1) JP2002516868A (ja)
WO (1) WO1999062527A1 (ja)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2284181A1 (en) * 2000-10-27 2011-02-16 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A and B
US20070053924A1 (en) * 2002-08-26 2007-03-08 Herve Tettelin Conserved and specific streptococcal genomes
PT1648500E (pt) 2003-07-31 2014-10-10 Novartis Vaccines & Diagnostic Composições imunogénicas para estreptococos piogenes
US8945589B2 (en) * 2003-09-15 2015-02-03 Novartis Vaccines And Diagnostics, Srl Immunogenic compositions for Streptococcus agalactiae
US20090317420A1 (en) * 2004-07-29 2009-12-24 Chiron Corporation Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae
WO2006042027A2 (en) * 2004-10-08 2006-04-20 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Immunogenic and therapeutic compositions for streptococcus pyogenes
WO2009030978A2 (en) * 2006-06-09 2009-03-12 Novartis Ag Conformers of bacterial adhesins
CA2668018A1 (en) * 2006-10-30 2008-09-12 Novartis Ag Immunogenic and therapeutic compositions for streptococcus pyogenes
CN101969992B (zh) 2007-09-12 2014-10-01 诺华股份有限公司 Gas57突变型抗原和gas57抗体
CA2709927C (en) * 2007-12-21 2017-05-16 Novartis Ag Mutant forms of streptolysin o

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1400592A1 (en) 1996-10-31 2004-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences

Also Published As

Publication number Publication date
EP1083910A4 (en) 2004-05-06
EP1083910A1 (en) 2001-03-21
US20020025516A1 (en) 2002-02-28
US6660520B2 (en) 2003-12-09
WO1999062527A1 (en) 1999-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2002516868A (ja) ｎｒｄＥ
JPH11187888A (ja) ｆｔｓＺ
JPH11146794A (ja) ｍｒａＹ
JP2002272484A (ja) ｄｅｘＢ
JP2002511245A (ja) ホスホグルコン酸脱水素酵素
JP2001515363A (ja) スタフィロコッカス・アウレウスのＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニン：Ｄ−グルタメートリガーゼ（ｍｕｒＤ）
JP2002503445A (ja) 新規ｐｔｈ
JPH11137262A (ja) 応答レギュレーター
JP2002527049A (ja) ｕｐｓ（ウンデカプレニル二リン酸シンターゼ）
JP2002522010A (ja) ｎｒｄＦ
JP2002300888A (ja) ＭｕｒＣ
JP2002512777A (ja) 新規なｐｙｒＨ
JP2001523114A (ja) スタフィロコッカス・アウレウス由来の３−ヒドロキシアシル−ｃｏａデヒドロゲナーゼ
JP2002524066A (ja) ｇｃｐ
JP2002525044A (ja) ｔｏｐＡ
JP2002516333A (ja) ｐｒｉＡ
JPH11137248A (ja) ＭｕｒＡ
JPH11235179A (ja) ｐｔｈ
JP2002540758A (ja) Ａｍａ
JP2000210093A (ja) ＧｉｄＡ１
JPH11178587A (ja) ヒスチジンキナーゼ
JPH11253176A (ja) ＭｕｒＦ
JP2002522059A (ja) ｎｒｄＥ
JP2002524055A (ja) ｒａｔＣ
JPH11178584A (ja) ｇｉｄＢ

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20060905