JP2002540758A - Ａｍａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ａｍａポリペプチドおよびａｍａポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、ならびに組み換え法によるかかるポリペプチドの製造方法を提供する。また、抗菌化合物をスクリーニングするためにａｍａポリペプチドを利用する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 ＡＭＡ 本願は、１９９７年１０月３日出願の米国仮出願第６０／０６１０７７号の利 益を主張する。 発明の分野 本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、その製造 および使用、ならびにその変種、アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにそ の使用に関する。特に、本発明は、アミノアシラーゼファミリーのポリヌクレオ チドおよびポリペプチドならびにそれらの変種（以下、「ａｍａ」、「ａｍａポ リヌクレオチド」、および場合により「ａｍａポリペプチド」と称する）に関す る。 発明の背景 スタフィロコッカス属（Staphylococci)の遺伝子および遺伝子産物を抗生物質 の開発に用いることは特に好ましい。スタフィロコッカス属は医学的に重要な微 生物属を形成している。それらは２つのタイプの疾病、すなわち、侵入的および 毒素生成的疾病を引き起こすことが知られている。一般的には、侵入的感染は皮 膚表面および深部組織の両方に影響する膿瘍形成により特徴づけられる。エス・ アウレウス（S.aureus）は癌患者における菌血症の第２の主要原因である。骨髄 炎、敗血性関節炎、敗血性の血栓性静脈炎および急性細菌性心内膜炎も比較的よ く見られる。スタフィロコッカス属の毒素生成的特性により生じる３つの臨床的 症状がある。これらの疾病の明らかな徴候は、組織侵入および菌血症に対立する ものとしてのエンドトキシンの作用により生じる。これらの症状は、スタフィロ コッカス食中毒、熱傷皮膚症候群およびトキシンショック症候群を包含する。 スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus)感染の頻度は過去 ２０〜３０年間に劇的に上昇している。これは多重抗生物質耐性株の出現、およ び免疫系が低下した人口の増加に起因している。いくつかのまたはすべての標準 的な抗生物質に対して耐性を有するスタフィロコッカス・アウレウス株を単離す ることはもはやめずらしいことではない。この現象がこの生物に対する新しい抗 菌剤、ワクチンおよび診断試験についての必要性を形成した。 そのうえ、薬剤の発見方法は、現在のところ、「機能的遺伝学」、すなわち、 高処理量のゲノムまたは遺伝子に基づく生物学を包含するので抜本的な改革を受 けている。このアプローチは、「位置的クローニング」に基づく初期のアプロー チおよび他の方法に取って代わりつつある。機能的遺伝学は、現在利用可能な多 くの分子生物学的データベースならびに他のソースから潜在的に興味ある遺伝子 配列を同定するための種々の道具に大きく依存している。薬剤の発見の標的とし ての、さらなる遺伝子および他のポリヌクレオチド配列ならびにそれらの関連ポ リペプチドの同定および特徴づけをする必要性があり続けている。 Ｎ−アシル−Ｌ−アミノ酸アミノヒドロラーゼは、Ｎ−アセチル化アミノ酸の アシル残基を特異的に開裂する。これらの酵素はコバルトイオンにより活性化さ れる金属ペプチダーゼであり、大きなぺプチダーゼファミリーＭ４０のメンバー であり、ＡＭＡ／ＨＩＰＯ／ＨＹＵＣファミリーのヒドロラーゼとして知られ、 細菌種および植物種の両方において見出されている（例えば、Sakanyan V,Desma rez L,Legrain C,Charlier D,Mett I,Kochikyan A,Savchenko A,Boyen A,Falmag ne P,Pierard A,& Glansdorff N.,1993）。バチルス・ステアロサーモフィルス （Bacillus stearothermophilus）由来の耐熱性アミノアシラーゼの遺伝子クロ ーニング、配列分析、精製、および特徴付けがなされている（Applied and Envi ronmental Microbiology 59: 3878-3888; Kempf B,Bremer E,1996）。バチルス ・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来の新規アミドヒドロラーゼ遺伝子のク ローニング、ＤＮＡ配列分析およびａｍｈＸのマップ上の位置決定がなされてい る（FEMS Microbiology Letters 141: 129-137）。インビボで発現される、ａｍ ａ様蛋白をコードしているスタフィロコッカス・アウレウスの遺伝子は、感 染においてこの蛋白の役割が存在することを意味する。 抗微生物活性に関して化合物をスクリーニングするために有用であるという利 点を有した、本発明のａｍａ具体例のごとき因子に対する要望があることは明白 である。かかる因子はまた、感染、機能不全および疾患の発生病理における役割 を決定するのに有用である。感染、機能不全および疾患を予防、改善または治癒 するための方法を見出すために、かかる因子ならびにそのアンタゴニストおよび アゴニストを同定および特徴づけする必要も明らかにある。 発明の概要 本発明は、ａｍａ、詳細にはａｍａポリペプチドおよびａｍａポリヌクレオチ ド、組み換え物質ならびにそれらの製造方法に関する。もう１つの態様において 、本発明は、かかるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関し、と りわけ、微生物による疾病の治療を包含する。さらなる態様において、本発明は 、本発明により提供される材料を用いるアゴニストおよびアンタゴニストの同定 方法、ならびに同定されたアゴニストまたはアンタゴニストを用いる微生物によ る感染およびかかる感染に関連した症状の治療方法に関する。さらなる態様にお いて、本発明は、微生物感染に関連した疾病およびかかる感染に関連した症状の 検出のための診断アッセイ、例えば、ａｍａ発現または活性の検出のためのアッ セイに関する。 開示された本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の説 明を読み、本開示の他の部分を読めば、当業者に容易に明らかになるであろう。 発明の説明 以下により詳細に説明するように、本発明は、ａｍａポリペプチドおよびポリ ヌクレオチドに関する。詳細には、本発明は、ｙｈａＡポリペプチドに対するア ミノ酸配列相同性により関連づけられるスタフィロコッカス・アウレウス（Stap hylococcus aureus）のａｍａのポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する 。特に、本発明は、それぞれ配列番号：１または３および配列番号：２また は４として表１に示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するａｍａに関 する。下記配列表において「ＤＮＡ」として示された配列は本発明の典型例であ る。なぜなら、当業者は、一般的にはリボポリヌクレオチドを包含するポリヌク レオチド中にかかる配列を使用することができることを認識するからである。 表１ ａｍａポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列 （Ａ）スタフィロコッカス・アウレウスのａｍａポリヌクレオチド配列［配列番 号１］ （Ｂ）この表のポリヌクレオチド配列により推定されるスタフィロコッカス・ア ウレウスのａｍａポリペプチド配列［配列番号２］ （Ｃ）スタフィロコッカス・アウレウスのａｍａのＯＲＦ配列［配列番号３］ （Ｄ）この表のポリヌクレオチドＯＲＦ配列から推定されるスタフィロコッカス ・アウレウスのａｍａポリペプチド配列［配列番号：４］ NH₂- 寄託材料 スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株を含む寄託株を、１９９６年 ４月１１日に、スコットランド、ＡＢ２ １ＲＹ、アバディーン、マチャードラ イブ２３Ｓt.のナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・ マリーン・バクテリア・リミテッド（本明細書にて「ＮＣＩＭＢ」という）に、 ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１の下で寄託した。その寄託株は寄託の際にスタフ ィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９と命名された。スタフィロコッカス・ア ウレウス寄託株を、本明細書では「寄託株」または「寄託株のＤＮＡ」と称する 。 寄託株は全長のａｍａ遺伝子を含んでいる。寄託株に含まれるポリヌクレオチ ドの配列ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明 細書における配列の記載とのいずれの不一致においても支配的である。 寄託株の寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条 約の条件下で行われている。特許が発行されると何ら制限または条件もなく、最 終的に株は分譲される。寄託株は当業者の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ. Ｓ.Ｃ.１１２条の下に要求されるような、寄託が実施可能要件であることを承認 するものではない。寄託株、それに由来の化合物を製造、使用または販売するに は、ライセンスが必要であるが、そのようなライセンスはここで付与されるもの ではない。 本発明の一の態様において、寄託株に含まれるスタフィロコッカス・アウレウ スＷＣＵＨ２９株により発現可能な成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子 が提供される。さらには、本発明は寄託株中のＤＮＡのａｍａヌクレオチド配列 およびそれによりコードされるアミノ酸配列を提供する。また、本発明は寄託株 より単離されたａｍａポリペプチド配列およびそれに由来のアミノ酸配列を提供 する。 ポリペプチド 実質的に本発明ａｍａポリペプチドは系統発生論的に他のアミノアシラーゼフ ァミリーの蛋白に関連している。 本発明の１の態様において、スタフィロコッカス・アウレウスのポリペプチド （本明細書ではａｍａおよびａｍａポリペプチドという）、ならびに生物学的、 診断上、予防上、臨床的または治療上有用なその変種、ならびにそれらを含む組 成物が提供される。 本発明のとりわけ好ましい具体例は、ａｍａ遺伝子の自然発生対立遺伝子によ りコードされるａｍａポリペプチドの変種である。 さらに本発明は下記のものである単離ポリペプチド： （ａ）配列番号：２の全長にわたって配列番号：２のアミノ酸配列に対して少 なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましく は少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性 、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一で あるアミノ酸配列を含むかまたはそれよりなるポリペプチド； （ｂ）配列番号：１の全長にわたって配列番号：１に対して少なくとも７０％ の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９ ０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましく は少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一であるポリヌクレ オチド配列を含むかまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコードされ るポリペプチド； （ｃ）配列番号：２の全長にわたって配列番号：２のアミノ酸配列に対して少 なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましく は少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性 、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一で あるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含むかまたはそれよ りなる単離ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド； （ｄ）配列番号：３の全長にわたって配列番号：１に対して少なくとも７０％ の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９ ０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましく は少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一であるポリヌクレ オチド配列を含むかまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコードされ るポリペプチド； （ｅ）配列番号：３の全長にわたって配列番号：３に対して少なくとも７０％ の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９ ０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましく は少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一であるポリヌクレ オチド配列を含むかまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコードされ るポリペプチド；あるいは （ｆ）配列番号：４の全長にわたって配列番号：４のアミノ酸配列に対して少 なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましく は少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性 、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一で あるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含むかまたはそれよ りなる単離ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド； （ｇ）配列番号：４の全長にわたって配列番号：２のアミノ酸配列に対して少 なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましく は少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性 、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一で あるアミノ酸配列を含むかまたはそれよりなるポリペプチド を提供する。 本発明のポリペプチドは、表１［配列番号２または４］のポリペプチド（とり わけ成熟ポリペプチド）ならびにポリペプチドおよびフラグメント、詳細には、 ａｍａの生物活性を有し、表１［配列番号１または３］のポリペプチドまたはそ の重要部分と少なくとも７０％の同一性、好ましくは表１［配列番号２または４ ］のポリペプチドと少なくとも８０％の同一性、より好ましくは表１［配列番号 ２または４］のポリペプチドと少なくとも９０％の類似性（より好ましくは、少 なくとも９０％の同一性）、さらにより好ましくは表１［配列番号２または４］ のポリペプチドと少なくとも９５％の類似性（より好ましくは少なくとも９５％ の同一性）を有するポリペプチドおよびフラグメントを包含し、さらにかかるポ リペプチドの部分も包含し、一般に、ポリペプチドのかかる部分は少なくとも３ ０個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも５０個のアミノ酸を含む。 本発明はまた、 Ｘ−（R₁）_m−（R₂）−（R₃）_n−Ｙ ［式中、アミノ末端のＸは水素または金属、または本明細書において修飾ポリペ プチドについて説明された他の残基であり、カルボキシル末端のＹは水素または 金属、または本明細書において修飾ポリペプチドについて説明された他の残基で あり、Ｒ₁およびＲ₃はいずれかのアミノ酸残基または修飾アミノ酸残基であり、 ｍは１〜１０００の整数または０であり、ｎは１〜１０００の整数または０であ り、Ｒ₂は本発明のアミノ酸配列、特に表１のアミノ酸配列またはそれらの修飾 形態を意味する］ で示されるポリぺプチドからなる、あるいはかかるポリペプチドを含むポリペプ チドを包含する。上記の式中、Ｒ₂は、アミノ末端残基がその左側にあってＲ₁に 共有結合し、そのカルボキシ末端残基がその右側にあってＲ₃に共有結合するよ うに方向づけられる。ｍおよび／またはｎが１より大きい場合、Ｒ₁またはＲ₃の いずれかでで表されるアミノ酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホモポリマー のいずれであってもよく、ヘテロポリマーが好ましい。本発明の他の好ましい具 体例は、ｍが１ないし５０、１００または５００の間の整数であり、ｎが１ない し５０、１００または５００の間の整数のものである。 本発明ポリペプチドがスタフィロコッカス・アウレウス由来のものであるのが 最も好ましいが、同じ分類学上の属の他の生物由来のものであっても好ましい。 また本発明ポリペプチドは、例えば、同じ科または目から得られるものであって もよい。 フラグメントは、その全体が上記したポリペプチドのアミノ酸配列の全部では ないが、一部と同じであるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。 ａｍａポリペプチドと同様、フラグメントは「独立している（free-standing） 」であるか、またはそれらが一の部分または領域、最も好ましくは単一の連続し た領域、単一のより大きなポリペプチドを形成するより大きなポリペプチドの中 に含まれていてもよい。 好ましいフラグメントは、例えば、表１［配列番号２または４］のアミノ酸配 列または、アミノ末端を含む連続した一連の残基またはカルボキシル末端を含む 連続した一連の残基のような、その変種の一部を有する末端切断ポリペプチドを 包含する。宿主細胞、特に、スタフィロコッカス・アウレウス中の本発明のポリ ペプチドの分解型も好ましい。さらに、アルファヘリックスおよびアルファヘリ ックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形成領域、ターンおよびター ン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水領域、疎水領域、アルファ両親 媒性領域、ベータ両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域、基質結合領 域、および高抗原指数領域を含むフラグメントのような、構造的または機能的属 性によって特徴づけられるフラグメントもまた好ましいフラグメントである。 さらに好ましいフラグメントは、配列番号：２のアミノ酸配列由来の少なくと も１５、２０、３０、４０、５０または１００個の連続したアミノ酸を有するア ミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、あるいは配列番号：２のアミノ酸配列由来 の末端切断または欠失された少なくとも１５、２０、３０、４０、５０または１ ００個の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを包含 する。 生物学的に活性なフラグメントも好ましいフラグメントである。生物学的に活 性なフラグメントは、類似活性または改良活性を有するもの、または望ましくな い活性が減少したフラグメントを含め、ａｍａの活性を媒介するフラグメントで ある。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性であるフラグメン トも含まれる。特に好ましいものは、スタフィロコッカス・アウレウスの生存に 必須の機能または個体、特に、ヒトにおいて疾患を開始または疾病を維持する能 力を与える酵素群の受容体またはドメインからなるフラグメントである。 本発明のポリペプチドのフラグメントである変種は、ペプチド合成法により対 応する全長のポリペプチドの製造に使用することができる。したがって、これら の変種は、本発明の全長ポリペプチドを製造するための中間体として使用できる 。 アミノ酸に関する標準的１文字および３文字表記に加えて、「Ｘ」または「Ｘ ａａ」なる語もまた、本発明のあるポリペプチドを記載するのに用いられる。「 Ｘ」および「Ｘａａ」は、２０種の天然に存在するいずれかのアミノ酸がポリペ プチド配列のそのように指定される位置にあってもよいことを意味する。 ポリヌクレオチド ａｍａポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、詳細には、本明細書 でａｍａと命名されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供す ることが本発明の１の目的である。 本発明の特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、全長の遺伝子を 含む、表１（配列番号：１または３）に示す配列を含むａｍａポリペプチド、ま たはその変種をコードしている領域を含む。出願人らは、この全長の遺伝子は当 該ポリペプチドを有する生物（例えば、スタフィロコッカス・アウレウス）の増 殖および／または生存に必須であると考える。 本発明のさらなる態様として、ａｍａポリペプチドおよびポリヌクレオチド、 詳細には、スタフィロコッカス・アウレウスのａｍａポリペプチドおよびポリヌ クレオチドをコードおよび／または発現する単離核酸分子が提供され、核酸分子 としては、例えば、未プロセッシングＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃ ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、Ｂ−およびＺ−ＤＮＡが挙げられる。本発明のさらなる 具体例は、生物学的、診断上、予防上、臨床的または治療上有用なポリヌクレオ チドおよびポリペプチド、ならびにその変種、ならびにそれらを含む組成物を 包含する。 本発明のもう一つの態様は、表１［配列番号２または４］の推定アミノ酸配列 を有するａｍａポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、それに密接に 関連するポリヌクレオチドおよびそれらの変種に関する。 もう１つの特に好ましい本発明具体例において、表１（配列番号：２または４ ）のアミノ酸配列を含むかまたはそれよりなる、スタフィロコッカス・アウレウ ス由来のａｍａポリペプチドが提供される。 表１［配列番号１または３］に示すポリヌクレオチド配列のような本明細書の 情報を使用し、出発材料としてスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９を 使用し、細菌からの染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングし、配列決定し、 つづいて全長クローンを得る標準的クローニングおよびスクリーニング法を使用 して、ａｍａポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを得ることが できる。例えば、表１［配列番号１または３］に示す配列のような本発明のポリ ヌクレオチド配列を得るには、典型的には、イー・コリ（E.coli）または他の適 当な宿主中のスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９の染色体ＤＮＡのク ローンのライブラリーを、部分配列から由来する放射標識したオリゴヌクレオチ ド、好ましくは１７量体またはそれより長いオリゴヌクレオチドでプローブする 。ついで、該プローブと同じＤＮＡを有するクローンを厳密な条件を使用して区 別できる。該オリジナル配列から設計された配列決定プライマーで同定された個 々のクローンを配列決定することにより、該配列を両方の方向に伸長し、全長を 決定することが可能である。都合よくは、プラスミドクローンから調製された変 性二本鎖ＤＮＡを用いてかかる配列決定を行う。適当な技法は、Maniatis,T.,Fr itsch,E.F.およびSambrookら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,2nd E d.;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989) （特に、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング１.９０および変性二本 鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定１３.７０を参照のこと）により記載されている。直接 ゲノムＤＮＡ配列決定を行って全長の遺伝子配列を得てもよい。例えば、表１［ 配列番号１または３］に示すポリヌクレオチドは、スタフィロコッカス・アウレ ウス ＷＣＵＨ２９から由来するＤＮＡライブラリー中に見いだされたものである。 そのうえ、表１［配列番号１または３］のＤＮＡ配列は、表１［配列番号２ま たは４］に示すのとほぼ同数のアミノ酸残基を有し、公知のアミノ酸残基の分子 量から計算できる推定分子量を有する蛋白をコードする読み枠を有する。配列番 号１のヌクレオチド番号１と、ヌクレオチド番号１１７７から始まる停止コドン との間の配列番号１のポリヌクレオチドが、配列番号２のポリペプチドをコード する。 さらなる態様において、本発明は、下記のポリヌクレオチドを含むかまたはそ れらよりなる単離ポリヌクレオチドを提供する： （ａ）配列番号：１の全長、あるいは配列番号：２をコードしている配列番号 ：１の当該部分の全長にわたって、配列番号：１に対して少なくとも７０％の同 一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％ の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより好まし くは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一であるポリヌク レオチド配列： （ｂ）配列番号：２の全長にわたって配列番号：２のアミノ酸配列に対して少 なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましく は少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性 、さらにより好ましくは少なくとも９７〜９９％またはちょうど１００％の同一 性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列；あるいは （ｃ）配列番号：３の全長にわたって配列番号：１に対して少なくとも７０％ の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９ ０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより好 ましくは少なくとも９７〜９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド 配列； （ｄ）配列番号：３の全長にわたって配列番号：３に対して少なくとも７０％ の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９ ０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより 好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く同一であるヌ クレオチド配列；または （ｅ）配列番号：４の全長にわたって配列番号：４のアミノ酸配列に対して少 なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましく は少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性 、さらにより好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するかまたは全く 同一であるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列。 本発明ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド（スタフィロコッカス ・アウレウス以外の種由来のホモログおよびオーソログを包含）を、厳密なハイ ブリダイゼーション条件において、配列番号：１もしくは３の配列またはそれら のフラグメントを含むかまたはそれらよりなる標識または検出可能プローブを用 いて適当なライブラリーをスクリーニングし、次いで、該ポリヌクレオチド配列 を含む全長遺伝子および／またはゲノムクローンを単離する工程を含む方法によ り得てもよい。 本発明は、表１［配列番号１または３］のコーディング配列と、その全長にわ たって同一であるポリヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は、成熟ポリ ペプチドまたはそのフラグメント用のコーディング配列自体ならびにリーダーま たは分泌配列、プレ、プロまたはプレプロ蛋白配列をコードするコーディング配 列のような他のコーディング配列を有するリーディング・フレーム中の成熟ポリ ペプチドまたはフラグメントのコーディング配列を提供する。ポリヌクレオチド はまた、例えば、転写されるが翻訳されない配列、終止シグナル（例えば、ｒｈ ｏ−依存的およびｒｈｏ−非依存的終止シグナル）、リボソーム結合部位、Koza k配列、ｍＲＮＡを安定化する配列、イントロン、ポリアデニル化シグナルのご とき少なくとも１つの非コーディング５’および３’配列を包含する非コーディ ング配列を含むが、これらに限定するものではない。また、ポリヌクレオチド配 列はさらなるアミノ酸をコードしているさらなるコーディング配列を含んでいて もよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するマーカー配列をコードする ことができる。本発明のある種の具体例において、マーカー配列は、ｐＱＥベク ター （Qiagen,Inc.）において提供され、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86 ：821-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであるか、または ＨＡタグ（Wilsonら、Cell,37:767(1984)）であり、ともにそれらに融合したポ リペプチド配列の精製において有用である。本発明ポリヌクレオチドは、限定す るものではないが、構造遺伝子および遺伝子の発現を調節する、本来的に結合し ている配列からなるポリヌクレオチドを包含する。 本発明の好ましい具体例は、表１の配列番号１に示されるヌクレオチド１から ヌクレオチド１１７７のすぐ上流にあるヌクレオチドまたはヌクレオチド１１７ ７を含むヌクレオチドまでからなるポリヌクレオチドであり、それは共にａｍａ ポリペプチドをコードする。 本発明はまた、式： Ｘ−（R₁）_m−（R₂）−（R₃）_n−Ｙ ［式中、分子の５’末端のＸは水素または金属、または修飾ヌクレオチド残基で あるか、あるいはＹと一緒になって共有結合を形成し、分子の３’末端のＹは水 素または金属、または修飾ヌクレオチド残基であるか、あるいはＸと一緒になっ て共有結合を形成し、Ｒ₁およびＲ₃は、各々、独立していずれかの核酸残基また は修飾核酸残基であり、ｍは１〜３０００の整数または０であり、ｎは１〜３０ ００の整数または０であり、Ｒ₂は本発明の核酸配列または修飾核酸配列、特に 表１より選択される核酸配列またはその修飾核酸配列を意味する］ で示されるポリヌクレオチドからなる、あるいはかかるポリヌクレオチドを含む ポリヌクレオチドを包含する。上記した式のポリヌクレオチド中、Ｒ₂は５’末 端残基がその左側にあってＲ₁に結合し、その３’末端残基がその右側にあって Ｒ₃に結合するように方向付けられる。ｍおよび／またはｎが１より大きい場合 、Ｒ₁および／またはＲ₂のいずれかで表される核酸残基の鎖は、ヘテロポリマー またはホモポリマーのいずれであってもよく、ヘテロポリマーが好ましい。好ま しい具体例において、ＸおよびＹが一緒になって共有結合を形成ずる場合、前記 した式のポリヌクレオチドは閉じた環状ポリヌクレオチドであり、それはその式 が第２の鎖が相補性を有する第１の鎖を示す二本鎖ポリヌクレオチドであり得る 。 もう一つ別の具体例において、ｍおよび／またはｎは１と１０００の間の整数で ある。他の好ましい本発明の具体例は、ｍが１ないし５０、１００または５００ の間の整数であり、ｎが１ないし５０、１００または５００の間の整数である。 本発明のポリヌクレオチドはスタフィロコッカス・アウレウス由来であるのが 最も好ましいが、分類学上同じ属の他の生物より得ることも好ましい。また、例 えば、分類学上同じ科または目から得てもよい。 本明細書で使用する「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語 は、本発明のポリペプチド、特に、細菌性ポリペプチド、より詳細には、表１［ 配列番号２または４］に示すアミノ酸配列を有するスタフィロコッカス・アウレ ウスのａｍａポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する 。この用語はコードおよび／非コーディング配列を含んでもよいさらなる領域と 共に、該ポリペプチドをコードする単一の連続または非連続領域（例えば、組み 込まれたファージ、挿入された配列、組み込まれたベクター配列、組み込まれた トランスポゾン配列、またはＲＮＡエデティング(editing)もしくはゲノムＤＮ Ａ再組織化により中断されている）を含むポリヌクレオチドを包含する。 本発明はさらに、表１［配列番号２または４］の推定アミノ酸配列を有するポ リペプチドの変種をコードする、本明細書に記載したポリヌクレオチドの変種に 関する。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントである変種は本発明の全長ポ リヌクレオチドの合成に使用できる。 さらに好ましい具体例は、数個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２ま たは１個あるいは０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、欠失ま たは付加された表１［配列番号２または４］のａｍａポリペプチドのアミノ酸配 列を有する、ａｍａ変種をコードするポリヌクレオチドである。特に好ましくは 、ａｍａポリペプチドの特性、活性を変化させないサイレント置換、付加および 欠失である。 本発明のさらに好ましい具体例は、表１［配列番号２または４］に示すアミノ 酸配列をを有するａｍａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全長にわ たって少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドおよびそのようなポ リヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。また、最も好ましいものは 、ａｍａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと全長にわたって少なくと も８０％の同一性を有する領域からなるポリヌクレオチドおよびそれと相補的な ポリヌクレオチドである。この点で、その同じものと全長にわたって少なくとも ９０％の同一性を有するポリヌクレオチドが特に好ましく、中でも少なくとも９ ５％の同一性を有するものが特に好ましい。さらには、少なくとも９５％の同一 性を有するものの中で少なくとも９７％の同一性を有するものがより好ましく、 中でも少なくとも９８％および少なくとも９９％の同一性を有するものが特に好 ましい。少なくとも９９％の同一性を有するものがより好ましい。 好ましい具体例は、表１［配列番号１または３］のＤＮＡによってコードされ ている成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリ ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。 本発明のある好ましい具体例によれば、特に厳密な条件下で、例えば表１のポ リヌクレオチドのごときａｍａポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーション するポリヌクレオチドが提供される。 さらに本発明は、本明細書にて上記した配列にハイブリダイゼーションするポ リヌクレオチドに関する。この点において、本発明は特に、本明細書にて上記し たポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオ チドに関する。本明細書で用いる場合、「厳密な条件」および「厳密なハイブリ ダイゼーション条件」という語は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なく とも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ起こること を意味する。厳密なハイブリダイゼーション条件の一例として、５０％ホルムア ルデヒド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮaＣl １５ｍＭ クエン酸三ナトリウム） 、５０ｍＭリン酸ナトリウム（pＨ７.６）、５ｘデンハート（Denhardt's）溶液 、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌ変性切断サケ精子ＤＮＡを含む 溶液中、４２℃で一夜インキュベーションし、ついでハイブリダイゼーション支 持体を０.１ｘＳＳＣ（約６５℃）で洗浄することが挙げられる。ハイブリダイ ゼーションおよび洗浄条件は公知であり、Sambrookら、MOLECULAR CLONING:A LA BORATORY MANUAL,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)、特に、第11章に例示 されている。本発明により提供されるポリヌクレオチド配列に関して溶液ハイブ リダイゼーションを用いてもよい。 本発明は、配列番号１または３に示したポリヌクレオチド配列の完全遺伝子を 含む適当なライブラリーを、厳密なハイブリダイゼーション条件下、配列番号１ または３に示す該ポリヌクレオチド配列の配列を有するプローブまたはそのフラ グメントでスクリーニングし、該ＤＮＡ配列を単離することにより得ることがで きるポリヌクレオチド配列を含むかまたはそれよりなるポリヌクレオチドを提供 する。そのようなポリヌクレオチドを得るのに有用なフラグメントには、例えば 、本明細書のいずれかの場所で十分に説明するプローブおよびプライマーが包含 される。 本明細書において本発明のポリヌクレオチドの分析についてさらに説明するよ うに、例えば、上記したような本発明のポリヌクレオチドを、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ およびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用し、ａ ｍａをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、ａｍａ遺伝子に 対して高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単 離することができる。そのようなプローブは、一般に、少なくとも１５個のヌク レオチド残基または塩基対を含むであろう。好ましくは、そのようなプローブは 少なくとも３０個のヌクレオチド残基または塩基対を有し、少なくとも５０個の ヌクレオチド残基または塩基対を有していてもよい。特に好ましいプローブは、 少なくとも２０個のヌクレオチド残基または塩基対を有し、３０個未満のヌクレ オチド残基または塩基対を有する。 例えば、ａｍａ遺伝子のコーディング領域は、表１（配列番号１または３）の ＤＮＡ配列を使用してスクリーニングしてオリゴヌクレオチド・プローブを合成 することにより単離できる。ついで、本発明の遺伝子の配列と相補性の配列を有 する標識したオリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮ Ａのライブラリーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメンバーがプローブ とハイブリダイゼーションするか決定する。 全長のＤＮＡを得るための、あるいは短いＤＮＡを伸長させるための利用可能 で当業者によく知られたいくつかの方法があり、例えば、ｃＤＮＡ末端の迅速増 幅（ＲＡＣＥ）（例えば、Frohman,et al.,PNAS USA 85,8998-9002,1988参照） に基づく方法がある。marathon^TM法（Clontech Laboratories Inc.）に例示され る当該方法の最近の変法は、例えば、より長いｃＤＮＡの検索を有意に簡単にし ている。Marathon^TM法において、ｃＤＮＡは選択組織から抽出されたｍＲＮＡか ら調製され、各末端に「アダプター」配列が連結される。次いで、遺伝子特異的 かつアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅(ＰＣＲ) を行ってＤＮＡの「失われた」５’末端を増幅する。次いで、「ネステッド」プ ライマー、すなわち、増幅生成物の範囲ににアニールするように設計されたプラ イマー（典型的には、アダプター配列中のさらなる３’にアニールするアダプタ ー特異的プライマー、およびさらに選択遺伝子配列中の５’にアニールする遺伝 子特異的プライマー）を用いてＰＣＲ反応を繰り返す。次いで、この反応の生成 物をＤＮＡ配列決定により分析し、次いで、存在しているＤＮＡに生成物を直接 結合して完全配列を得ること、あるいは５’プライマーの設計に関する新たな配 列の情報を用いて別個の全長ＰＣＲを行うことにより、全長のＤＮＡを構築する 。 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本明細書においてポリヌク レオチドアッセイに関してさらに説明するように、例えば、疾患、特にヒトの疾 患に対する治療および診断の発見のための研究試薬および研究材料として用いる ことができる。 表１（配列番号１または２または３または４）の配列に由来するオリゴヌクレ オチドである本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法に使用できる が、好ましくはＰＣＲに使用し、本明細書で同定したポリヌクレオチドが全体と して、または部分的に感染組織において細菌中で転写されるか否か測定する。そ のような配列はまた、病原体が達した感染の段階およびタイプの診断においても 有用性がある。 また、本発明は、成熟蛋白に、さらなるアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸 が加わるか、成熟ポリペプチドの内部にアミノ酸が加わった（例えば、成熟形態 が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）ポリペプチドをコードするポリヌク レオチドを提供する。このような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態への蛋 白のプロセッシングにおいて役割を果たし、蛋白を運び、蛋白の半減期を長くし たり、短くしたり、あるいは分析または生産のための蛋白の取り扱いを容易にす ることができる。インビボで一般的なように、該付加アミノ酸は細胞酵素により 成熟蛋白からプロセッシングにより除かれる。 本発明の各ポリヌクレオチドおよび全ポリヌクレオチドについて、それに相捕 的なポリヌクレオチドが提供される。これらの相捕的ポリヌクレオチドが、相捕 的である各ポリヌクレオチドに対して十分に相捕的であることが好ましい。 一またはそれ以上のプロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆 体蛋白は該ポリペプチドの不活性形でもよい。プロ配列がそのような不活性前駆 体から除かれると、一般に活性化される。プロ配列のいくらかまたは全体を、活 性化の前に除去できる。一般に、そのような前駆体はプロ蛋白と称される。 核酸塩基に関する標準記号Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕに加えて、また「Ｎ」なる語を 、本発明の特定のポリヌクレオチドを記載するのに用いることができる。「Ｎ」 は、隣接するヌクレオチド位置と一緒になって作用する場合、正確な読み枠を読 中で読まれる場合で、Ｎがそのような読み枠において未成熟終止コドンを形成す る効果を有する塩基でないことが好ましい場合を除き、４種のＤＮＡ塩基または ＲＮＡ塩基のいずれかがＤＮＡまたはＲＮＡ配列のその指定位置にあることを意 味する。 要するに、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配列の加わった成 熟蛋白（プレ蛋白とも称される）、プレ蛋白のリーダー配列ではない１またはそ れ以上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列と、一般に、 ポリペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセッシング工程の間に除去される １またはそれ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコ ードする。 ベクター、宿主細胞、発現系 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むベク ター、本発明のベクターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術による本 発明のポリペプチドの製造に関する。さらに無細胞翻訳系を用い、本発明のＤＮ Ａ構築物由来のＲＮＡを使用してかかる蛋白を製造することができる。 本発明の組み換えポリペプチドを、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞か ら、当業者によく知られた方法により製造してもよい。したがって、さらなる態 様において、本発明は、本発明ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む発現 系、かかる発現系で遺伝子操作された宿主細胞、ならびに組み換え法による本発 明ポリペプチドの製造に関する。 組換え体産生のために、宿主細胞を遺伝子操作し、発現系もしくはそれらの一 部、または本発明のポリヌクレオチドを取り込むことができる。ポリヌクレオチ ドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ− デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジ ェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション 、トランスダクション、スクレープ・ローディング、弾道導入および感染のよう な、Davisら、BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986)およびSambrookら、M OLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,2nd Ed.Cold Spring Harbor Laborato ry Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)のごとき複数の標準的研究室マニュア ルに記載されている方法によって行うことができる。 適当な宿主の代表例は、レンサ球菌(streptococcus)、ブドウ球菌(staphyloco ccus)、腸球菌(enterococcus)、大腸菌(E.coli)、ストレプトマイセス(streptom yces)、シアノバクテリア(cyanpobactoria)、枯草菌(Bacillussubtilis)および スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)のごとき細菌細胞； クルベロミセス(Kluveromyces)、サッカロミセス(Saccharomyces)のごとき酵母 細胞、担子菌、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)およびアスペルギル ス(Aspergillus)；ドロソフィラ(Drosophila)S2およびスポドプテラ(Spodoptera )Sf9細胞のごとき昆虫細胞；CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1およ びボーウェス(Bowes)メラノーマ細胞のごとき動物細胞；および裸子植物または 被子植物のごとき植物細胞を包含する。 本発明のポリペプチドを製造するために非常に多様な発現系を使用することが できる。かかるベクターは、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来 の系、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン 由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、 バキュロウイルス、ＳＶ４０のごときパポバウイルス、ワクシニアウイルス、ア デノウイルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイ ルスのようなウイルス由来のベクター、およびコスミドおよびファージミドなど のプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝因子由来のベクターのごとき、そ れらの組み合わせに由来するベクターを包含する。発現系構築物は、発現を制御 ならびに引き起こす調節領域を有していてもよい。一般に、宿主においてポリヌ クレオチドを維持、増幅または発現し、および／またはポリペプチドを発現する のに適した系またはベクターを、この点にて発現に使用してもよい。適当な（前 掲）に示されている技術のごとき、種々のよく知られた慣用的技術のいずれかに よって、発現系に挿入してもよい。 真核細胞の組み換え発現系において、翻訳された蛋白を小胞体内腔、周辺腔ま たは細胞外環境に分泌するために、適当な分泌シグナルを発現されるポリペプチ ドに挿入してもよい。これらのシグナルは、ポリペプチドに固有のものであって もよく、または異種のシグナルであってもよい。 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、 アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ ラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ ィーを包含する、よく知られた方法によって組換え細胞培養物から回収および精 製できる。最も好ましくは、高品質液体クロマトグラフィーが精製に使用される 。ポリペプチドが単離および／または精製の間に変性する場合、蛋白を再生する ための周知方法を用いて、再び活性な立体配座とすることができる。 診断、予後、セロタイピングおよび変異アッセイ また本発明は、診断試薬として使用するための本発明のａｍａポリヌクレオチ ドの使用にも関する。真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるａｍａポ リヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの検出は、疾患の診断、疾病の段階 の決定、または薬剤に対する感染生物の応答に関する診断方法を提供するであろ う。ａｍａ遺伝子または蛋白を含む生物に感染、または感染の可能性がある真核 生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトを、種々のよく知られた方法ならびに本明細 書記載の方法により核酸レベルまたはアミノ酸レベルで検出できる。 予後、診断または他の分析に供するポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、 感染していると思われる個体および／または感染した個体の身体材料から得られ る。これらの源由来のポリヌクレオチド、特にＤＮＡまたはＲＮＡを検出に直接 用いてもよく、あるいは分析に付す前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いる ことにより酵素的に増幅できる。ＲＮＡ（詳細にはｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡおよび ゲノムＤＮＡも同じようして使用できる。増幅を用いると、個体に存在する原核 生物の種および株を原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけすることが できる。対照配列の遺伝子型と比較した増幅生成物の大きさの変化により、欠失 および挿入を検出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識したａｍａポリヌク レオチド配列にハイブリダイゼーションさせることにより同定できる。完全に対 合した配列は、ＲＮase消化により、または融解温度の差により、誤対合二重ら せんと区別できる。ＤＮＡ配列の差はまた、変性剤を伴ったまたは変性剤を含ま ないゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動度の変化により、または直接 的なＤＮＡの配列決定により検出できる。例えば、Myersら、Science，230:1242 (1985)を参照のこと。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護ア ッセイ、例えば、ＲＮaseおよびＳ１保護または化学的切断法によっても明らか にすることができる。例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-44 01(1985)を参照のこと。ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えば、ＲＮａｓｅ、Ｖ１ およびＳ２保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定位置における配列の変 化を明らかにすることができる。例えば、Cotton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci., USA,85:4397-4401(1985)参照。 もう１つの具体例において、ａｍａヌクレオチド配列またはそのフラグメント を含むオリゴヌクレオチドプローブの一群を構築して、例えば遺伝学的変異、セ ロタイプ、分類学的分類または同定のための効果的なスクリーニングを行うこと ができる。アレイ法は適応範囲が広く、遺伝子発現、遺伝学的連関、および遺伝 学的変化を包含する分子遺伝学における種々の問題を解決するために用いられる （例えば、Chee et al.,Science,274:610(1996)参照）。 よって、もう１つの態様において、本発明は、 （ａ）本発明ポリヌクレオチド、好ましくは配列番号：１または３のヌクレオ チド配列、またはそのフラグメント； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して相捕的なヌクレオチド配列； （ｃ）本発明ポリペプチド、好ましくは配列番号：２または４のポリペプチド 、またはそのフラグメント；あるいは （ｄ）本発明ポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号：２または４の ポリペプチドに対する抗体 を含む診断キットに関する。 かかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が重要な成分を 含んでいてもよいことが理解されよう。かかるキットは、とりわけ疾病または疾 病に対する感受性についての診断において有用である。 また本発明は、診断試薬としての本発明ポリヌクレオチドの使用にも関する。 疾病または発病に関連した本発明ポリヌクレオチド、好ましくは配列番号：１ま たは３のポリヌクレオチドの変異形態の検出は、ポリヌクレオチドの発現低下、 発現過剰または発現の変化により生じる疾病の診断、疾病経過の予後、疾病段階 の決定、または疾病に対する感受性の決定に加えて用いる診断用道具、またはか かる診断等の決定のための道具を提供するであろう。かかるポリヌクレオチドに おける変異を有する生物、特に感染生物を、本明細書記載のいずれかの場所で説 明するような種々の方法によりポリヌクレオチドレベルで検出してもよい。 本発明ヌクレオチド配列は生物の染色体の同定にも価値がある。配列は特別に 標的化され、生物（詳細にはスタフィロコッカス・アウレウス）の染色体上の特 定の位置とハイブリダイゼーションしうる。本発明染色体に関連した配列のマッ ピングは、それらの配列を病原性および／または生物の環境学的地位および／ま たは生物の薬剤耐性とを関連づけ、さらには生物に遺伝子を対応させることにお ける重要な工程でありうる。配列を正確な染色体位置にマッピングしたならば、 染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデータと関連づけることができる 。かかるデータは、配列データベースにおいてオンラインで見いだされる。次い で、遺伝学的方法、例えば、連関（物理的に近接した遺伝子の同時遺伝）の分析 、あるいはコンジュゲーション(conjugation)のごとき接合の研究により、同じ 染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との関係を同定する。 第１の表現型を有する生物と、異なる第２の表現型を有する生物との間のポリ ヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列の相違を調べることもできる。第 １の表現型を有する生物のいくつかまたは全部に変異が観察されるが、第２の表 現型を有する生物には変異が観察されない場合、変異は第１の表現型の発生原因 である可能性がある。 種々の技法により、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド中 に変異または多型性（対立遺伝子変異）を担持する生物由来の細胞をポリヌクレ オチドまたはポリペプチドレベルで検出して、例えばセロタイピングを行うこと ができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＲＮＡにおける変異を検出することが できる。ＲＴ−ＰＣＲを自動検出系、例えばＧeneＳcan等と組み合わせて用いる のが特に好ましい。ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡもまた同じ目的でＰＣ ＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いることができる。一例として、ａｍａポリペプチド をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて変異を同定および分析す ることができる。典型的なプライマーの例を下表２に示す。 表２ ａｍａポリヌクレオチド増幅用プライマー また本発明は、式： Ｘ−（R₁）_m−（R₂）−（R₃）_n−Ｙ ［式中、分子の５’末端のＸは水素または金属、または修飾核酸残基であり、分 子の３’末端のＹは水素または金属、または修飾核酸残基であり、Ｒ₁およびＲ₃ は核酸残基または修飾ヌクレオチド残基であり、ｍは１〜２０の整数または０で あり、ｎは１〜２０の整数または０であり、Ｒ₂は本発明プライマー配列、特に 表２より選択されるプライマー配列を意味する］ で示されるポリヌクレオチドを包含する。上記した式のポリヌクレオチド中、Ｒ₂ は５’末端残基がその左側にあってＲ₁に結合し、その３’末端残基がその右側 にあってＲ₃に結合するように方向付けられる。ｍおよび／またはｎが１より大 きい場合、いずれかのＲ基で表される核酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホ モポリマーのいずれであってもよく、好ましくは表１のポリヌクレオチドの領域 に相捕的なヘテロポリマーである。好ましい具体例において、ｍおよび／または ｎは１ないし１０の間の整数である。 さらに本発明は、５’および／または３’末端から１、２、３または４個のヌ クレオチドが除去されたプライマーを提供する。特に、これらのプライマーを、 個体由来の試料、例えば身体材料から単離されたａｍａＤＮＡおよび／またはＲ ＮＡの増幅に用いることができる。プライマーを用いて感染個体から単離された ポリヌクレオチドを増幅して、ポリヌクレオチド配列研究のための種々の方法に 供してもよい。このようにして、ポリヌクレオチド配列中の変異を検出し、変異 を用いて感染または感染段階もしくは経路を診断および／または予後を行い、あ るいは感染物のセロタイプおよび／または分類を行ってもよい。 本発明はさらに、疾患、好ましくは細菌感染、さらに好ましくはスタフィロコ ッカス・アウレウスによる感染の診断方法であって、表１［配列番号１または３ ］の配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの上昇を、個体由来のサンプル から決定することを特徴とする方法を提供する。ａｍａポリヌクレオチドの発現 の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野で周知の方法で ある任意の方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノーザン ブ ロッティング、スペクトロメトリーおよびその他のハイブリダイゼーション法を 用いて測定できる。 さらに、正常対照組織サンプルと比較してａｍａポリペプチドの過剰発現を検 出するための本発明による診断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出する ことができる。宿主由来のサンプル中のａｍａポリペプチドのレベルを決定する ために用いることができるアッセイ技法は、当業者に周知である。このようなア ッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット 分析、抗体サンドイッチアッセイ、抗体検出およびＥＬＩＳＡアッセイを包含す る。 ディファレンシャル発現（differential expression） 本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、ディファレンシャルスクリー ニング法の試薬として用いてもよい。多くのディファレンシャルスクリーニング およびディファレンシャルディスプレイ法が当該分野に存在し、本発明ポリヌク レオチドおよびポリペプチドを用いることができる。例えば、ディファレンシャ ルディスプレイ法はChuang et al.,J.Bacteriol.175:2026-2036(1993)に記載さ れている。この方法は、ランダムプライムされたＲＴ−ＰＣＲを用いて存在する ｍＲＮＡを同定することにより生物中で発現される遺伝子を同定するものである 。感染前および感染後の特徴を比較することにより、感染の間にアップレギュレ ーションおよびダウンレギュレーションされる遺伝子を同定し、ＲＴ−ＰＣＲ生 成物を配列決定し、「未知」ＯＲＦにマッチさせることができる。 インビボ発現法（ＩＶＥＴ）はCamilli et al.,Proc.Natl.Acad Sci.USA 91:2 634-2638(1994)に記載されている。ＩＶＥＴは、研究室での培養物との比較を行 って、感染における重要な役割に関与している、感染中にアップレギュレーショ ンされる遺伝子を同定するものである。この方法により同定されるＯＲＦは感染 の確立および／または維持において重要な役割を有すると考えられる。この方法 において、標的生物のランダムな染色体フラグメントを、プラスミドベクター中 のプロモーター不含組み換え遺伝子の上流にクローン化する。レソルバーゼ(res olvase)部位に隣接した抗生物質耐性遺伝子を担持する標的細胞中にこの構築物 を導入する。抗生物質存在下での増殖は、レコンビナーゼ(recombinase)遺 伝子の転写を支持しうるプラスミドベクター中にクローン化されたフラグメント の集団から消失し、それゆえ、抗生物質耐性の消失を引き起こす。各抗生物質感 受性細菌により担持される染色体フラグメントは感染の間に通常アップレギュレ ーションされる遺伝子のプロモーターまたは当該遺伝子の一部を担持しているは ずである。レコンビナーゼ遺伝子上流の配列決定によりアップレギュレーション される遺伝子の同定が可能となる。 ＲＴ−ＰＣＲを用いて遺伝子発現パターンを分析してもよい。本発明ポリヌク レオチドを用いるＲＴ−ＰＣＲ用に、メッセンジャーＲＮＡを細菌感染組織、例 えばネズミの感染後４８時間たった肺から単離し、次いで、ランダムヘキサヌク レオチドでプラムされたＲＮＡ試料の逆転写を行い、その後遺伝子特異的プライ マーペアーを用いてＰＣＲを行うことによって各ｍＲＮＡ量を評価する。得られ たＰＣＲ生成物の定量による特定のｍＲＮＡ種の存在および量の決定は、感染組 織中で転写された細菌遺伝子についての情報を提供する。遺伝子転写の分析を感 染の異なる時点において行って細菌による発病における遺伝子調節についての詳 細な知識を得て、いずれの遺伝子産物が抗細菌剤のスクリーニングのための標的 であるのかを明確に理解することができる。使用ＰＣＲプライマーの遺伝子特異 的な性質により、細菌ｍＲＮＡ調製物が常に哺乳動物ＲＮＡを含む必要があると はいえないことが理解されよう。このことは、感染組織からの簡単かつ迅速なＲ ＮＡの調製を可能にし、細菌中で非常に短命（半減期２分のオーダー）な細菌ｍ ＲＮＡ種を得ることを可能にする。最適には、非常に短時間のうちに、ＴＲＩｚ ｏｌｅ(GIBCO-BRL)存在下で機械的に破砕し、次いで、ＴＲＩｚｏｌｅ試薬およ びＤＮＡａｓｅ処理を製造者の指示に従って行って夾雑ＤＮＡを除去することに より、感染ネズミ肺組織から細菌ｍＲＮＡを調製する。好ましくは、適当に標識 された配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてノーザンをプローブする ことにより検出されるスタフィロコッカス・アウレウスの１６ＳリボソームＲＮ Ａが最大量となるような条件を見いだすことによってプロセスを最適化する。典 型的には、５’色素標識プライマーをＰＣＲ反応において各ＰＣＲプライマーペ アーに用い、最適にはＰＣＲ反応を８ないし２５サイクルで終了する。 ＰＣＲ生成物を６％ポリアクリルアミドで分離し、GeneScanner（ＡＢＩにより 製造されている）を用いて検出し定量する。 グリッディング（gridding）およびポリヌクレオチド引き算 方法は、いわゆる「高密度ＤＮＡアレイ(high density array)」またはグリッ ドを用いる遺伝子発現および同一性についての情報を得るためのものである。例 えば、M.Chee et al.,Science,274:610-614(1996)およびその中の引用文献参照 。かかるグリッディングアッセイを用いて、発現配列タグ（ＥＳＴ）と呼ばれる ある種の新規遺伝子配列が同定された（Adams et a1.,Science,252:1651-1656(1 991)）。遺伝子産物に基づいて特定の遺伝子配列を同定するための方法のバラエ ティーも記載されている。例えば、１９９１年５月３０日公開国際特許出願ＷＯ ９１／０７０８７参照。さらに、所望配列の増幅のための方法が記載されている 。例えば、１９９１年１１月１４日公開の国際特許出願ＷＯ９１／１７２７１参 照。 本発明ポリヌクレオチドをポリヌクレオチドアレイの成分として、好ましくは 高密度アレイまたはグリッドとして用いてもよい。これらの高密度アレイは診断 および予後目的に特に有用である。例えば、異なる遺伝子、さらにはポリヌクレ オチドまたは本発明ポリヌクレオチドを含む各スポットのセットをプロービング （身体試料から得たプローブを用いるハイブリダイゼーションまたは核酸増幅を 用いるプロービングのごとき）に使用して、個体中の特定のヌクレオチド配列ま たは関連配列の存在を決定してもよい。かかる存在は、病原体、特にスタフィロ コッカス・アウレウスの存在を示す可能性があり、疾病または疾病経過の診断お よび／または予後に有用である可能性がある。配列番号：１または３のポリヌク レオチド配列の多くの変種を含むグリッドが好ましい。また、配列番号：２また は４のポリペプチド配列をコードしているポリヌクレオチド配列の多くの変種を 含むものが好ましい。 抗体 本発明ポリペプチドおよびポリヌクレオチドまたはそれらの変種、あるいはそ れらを発現する細胞を、かかるポリペプチドまたはポリヌクレオチドそれぞれに 対して免疫特異的な抗体を得るための免疫原として用いることができる。 １の好ましい本発明の具体例において、ａｍａポリペプチドまたはポリヌクレ オチドに対する抗体が提供される。 本発明のポリペプチドに対して得られる抗体は、ポリペプチドあるいはエピト ープが付いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくはヒト以外の動物 に、慣用的プロトコールを用いて投与することにより得ることができる。モノク ローナル抗体を調製する場合、連続的細胞系培養により産生される抗体を提供す る当該分野にて周知の技術を用いることができる。例えば、Kohler,G.およびMil stein,C.,Nature,256:495−497(1975)；Kozborら、Immunology Today,4:72(1983 )；Coleら、MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R Liss,Inc.、77 −96頁(1985)に記載されるような種々の技法が挙げられる。 一本鎖抗体を製造するための技術（米国特許第４９４６７７８号）を用いて、 本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生することができる。また、トラ ンスジェニックマウスまたは他の生物、例えば他の哺乳動物を用いて、ヒト化抗 体を発現させることができる。 別法として、ファージディスプレイ(phage display)技法を利用して、抗‐ａ ｍａの保持に関してスクリーニングしたヒトのリンパ球のＰＣＲ増幅したｖ遺伝 子のレパートリー由来の、または無処理のライブラリー由来の、ポリペプチドに 対する結合活性を有する抗体遺伝子を選択してもよい（McCafferty,J.ら、Natur e348:552-554(1990)；Marks,J.ら、Biotechnology 10:779-783(1992)）。これら の抗体の親和性はチェインシャフリング(chain shuffling)により改善すること もできる（Clackson,T.ら、Nature 352:624-628(1991)）。 前記の抗体を用いてポリペプチドを発現するクローンを単離または同定するこ とができ、アフィニティークロマトグラフィーにより該ポリペプチドを精製する ことができる。 従って、とりわけ、ａｍａポリペプチドまたはａｍａポリヌクレオチドに対す る抗体を用いて、感染、とりわけ細菌感染を治療することができる。 ポリペプチド変種は、本発明の特定の態様を形成する、抗原的、エピトープ的 または免疫学的に等価な変種を包含する。 ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に等価な誘導体、またはその融合蛋白 は、マウスまたは他の動物、例えばラットもしくはニワトリを免疫するための抗 原として使用される。融合蛋白はポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、 例えば抱合することにより、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アルブミン またはキーホール・リムペット・ヘモシアニンまたは破傷風トキソイドに結合さ せることができる。別法として、蛋白もしくはポリペプチド、またはその抗原的 もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原性ペプチド は、免疫原性を改良するのに十分な抗原性を有しており、キャリヤを使用しなく てすむ。 好ましくは、抗体またはその変種を修飾して個体における免疫原性を減少させ る。例えば、個体がヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒト化」されてお り；例えばJones,P.ら、Nature 321:522−525(1986)またはTempestら、Biotechn ology 9:266-273(1991)に記載されているように、ハイブリドーマ由来の抗体の 相補性決定領域がヒトモノクローナル抗体に移植されている。 本発明の１の態様によれば、治療または予防目的、詳細には遺伝学的免疫化の ための本発明ポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明の特に好ましい具体 例は、ａｍａポリヌクレオチドの自然発生対立遺伝子変種およびそれによりコー ドされるポリペプチドである。 本発明ポリヌクレオチドの遺伝学的免疫における使用には、好ましくは、プラ スミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Genet 1:363(1992)；Mant horpeら、Hum.Gene Ther. 4:419(1963)）、特異的蛋白キャリヤを複合させたＤ ＮＡの送達（Wuら、J.Biol Chem.264:16985(1989)）、リン酸カルシウムを用い るＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshef、PNAS USA 83:9551(1986)）、種々の形態 のリポソーム中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375(1989)）、微粒子 爆撃（Tangら、Nature356:152(1992)；Eisenbraunら、ＤＮＡ Cell Biol 12:791 (1993)）およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたインビボ感染（Seeg erら、PNAS USA 81:5849(1984)）などの適当なデリバリー方法を用 いる。 アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子 さらに、本発明ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、例えば、細胞 、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然産物の混合物中の、小分子基 質とリガンドとの結合を評価することもできる。これらの基質およびリガンドは 天然の基質およびリガンドでよく、または構造上もしくは機能上の模倣物でもよ い。例えば、Coliganら、Current Protocols in Immunology 1(2):第５章(1991) を参照のこと。 本発明ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは多くの生物学的機能の原因であ り、該機能には多くの疾病状態、詳細には上記疾病が包含される。それゆえ、ポ リペプチドまたはポリヌクレオチドの機能を刺激または阻害する化合物を同定す るためのスクリーニング法を工夫することが望ましい。したがって、さらなる態 様において、本発明は、本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドならびに関 連ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの機能を刺激または阻害する化合物を同 定するためのスクリーニング方法を提供する。一般的には、アゴニストまたはア ンタゴニストを上記疾病の治療および予防のために用いてもよい。種々の源、例 えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然産物の混合物から化合 物を同定できる。そのようにして同定されたかかるアゴニスト、アンタゴニスト または阻害剤は、天然または修飾基質、リガンド、受容体、酵素等であってもよ く、場合によってはａｍａポリペプチドおよびポリヌクレオチド、あるいはそれ らの構造上または機能上の模倣物であってもよい（Coligan et al.,Current Pro tocols in Immunology 1(2):Chapter 5(1991)参照）。 スクリーニング法は、単に化合物のポリペプチドまたはポリヌクレオチドへの 、あるいはポリペプチドまたはポリヌクレオチドを有する細胞もしくは膜への、 あるいはポリペプチド含む融合蛋白への結合を、直接的または間接的に候補化合 物に結合した標識により測定するものであってもよい。別法として、スクリーニ ング法は標識競争物質との競争を用いるものであってもよい。さらに、これらの スクリーニング法は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む細胞に適した 検 出系を用いて、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性化または阻害により 生じるシグナルを化合物が発生させるかどうかを試験するものであってもよい。 一般的には、既知アゴニスト存在下で活性化の阻害剤をアッセイし、次いで、候 補化合物存在下でのアゴニストによる活性化の効果を観察する。構成的に活性の あるポリペプチドおよび／または構成的に発現されるポリペプチドおよびポリヌ クレオチドを、アゴニストまたは阻害剤の効果を逆転させる物質を探すスクリー ニング法に用いてもよく、候補化合物がポリペプチドまたはポリヌクレオチドの 活性化を阻害するかどうかを試験することによる。さらに、スクリーニング法は 、単に、候補化合物を本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含有する溶 液と混合して混合物を作成し、混合物中のａｍａポリペプチドおよび／またはポ リヌクレオチド活性を測定し、次いで、混合物中のａｍａポリペプチドおよび／ またはポリヌクレオチド活性を標準に対して比較することを特徴とする。Ｆｃ部 分および上記ａｍａポリペプチドから作成されるような融合蛋白を用いて高処理 量アッセイを行って本発明ポリペプチドのアンタゴニストならびに系統分類的お よび／または機能的に関連したポリペプチドを同定することもできる（D.Bennet t et al.,J.Mol.Recognition,8:52-58(1955)；およびK.Johanson et al.,J.Biol .Chem.,270(16):9549-9471(1955)参照）。 本発明ポリペプチドと結合および／または相互作用するポリヌクレオチド、ポ リペプチドおよび抗体を用いて、細胞中のｍＲＮＡおよび／またはポリペプチド の精製に対する添加化合物の影響を検出するためのスクリーニング方法を組み立 ててもよい。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを構築して、モノクローナルおよびポ リクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌または細胞結合レベルを、当該分 野において標準的な方法により測定してもよい。これにより、適当に操作された 細胞または組織からのポリペプチドの生成を阻害または促進しうる作用剤（それ ぞれ、アンタゴニストまたはアゴニストという）を見いだすことができる。 本発明はまた、ａｍａポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用、特に静菌 および／または殺菌性である化合物の作用を亢進（アゴニスト）または遮断（ア ンタゴニスト）する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法を提供 する。スクリーニング方法には高処理量(high−throughput)技術が包含される。 例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、ａｍａ ポリペプチドおよびかかるポリペプチドの標識基質またはリガンドを含む合成反 応混合物、膜、細胞エンベロープもしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント 、またはそれらのいずれかの調製物を、ａｍａアゴニストまたはアンタゴニスト であるかもしれない候補分子の存在下または不在下でインキュベートする。候補 分子がａｍａポリペプチドに作動または拮抗する能力は、標識リガンドの結合の 低下またはかかる基質からの生成物の生成低下に反映される。結合しても影響を 及ぼさない分子、すなわちａｍａポリペプチドの効果を誘起しない分子は、ほと んどの場合、良好なアンタゴニストであろう。よく結合し、基質からの生成物の 生成速度を高め、シグナルトランスダクションを増大させ、あるいは化学チャン ネル活性を増大させる分子はアゴニストである。基質からの生成物の生成速度、 シグナルトランスダクション、あるいは化学チャンネル活性のレベルの検出はリ ポーターシステムを用いることにより強調できる。この点に関して有用なリポー ターシステムは、生成物に転換される発色基質、標識基質、ａｍａポリヌクレオ チドまたはポリペプチド活性の変化に応答するリポーター遺伝子、および当該分 野で公知の結合アッセイを包含するが、これらに限定するものではない。 本発明ポリペプチドを用いて膜結合または可溶性受容体を同定してもよく、か かるポリペプチドは当該分野において標準的な受容体結合法により同定される。 これらの方法、リガンド結合およびクロスリンキングアッセイを包含するが、こ れらに限らない。これらの方法において、ポリペプチドを放射性標識（例えば^{12 5} I）、化学修飾（例えばビオチン化）または検出および精製に適したペプチド配 列に融合され、推定上の受容体（例えば細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、 身体材料）の源とともにインキュベーションする。他の方法は表面プラスモン共 鳴および分光学的法法を包含する。これらのスクリーニング方法を用いて、ポリ ペプチドのその受容体への結合と競争するポリペプチドのアゴニストおよびアン タゴニストを同定してもよい。かかるアッセイを行うための標準的方法は当該分 野においてよく知られている。 蛍光タグを付した分子に関する蛍光分極値は回転相関時間（rotational corre lation time）または回転速度（tumbling rate）に依存する。別のａｍａポリペ プチドもしくは他のポリペプチドと結合したａｍａポリペプチドのごとき蛋白複 合体であって蛍光標識分子を含むように標識されているものは、蛍光標識された モノマー蛋白よりも高い分極値を有するであろう。この方法を用いて、ポリペプ チド複合体を分裂させる小型分子を特徴づけるのが好ましい。 蛍光エネルギー転移を用いて、ａｍａポリペプチドダイマー、トリマー、テト ラマー、または高次構造、あるいは別のポリペプチドに結合したａｍａポリペプ チドにより形成される構造の形成を妨害する小型分子を特徴づけてもよい。 ａｍａポリペプチドをドナーおよびアクセプター両方の蛍光発色団で標識するこ とができる。２種の標識種を混合し、ドナー蛍光発色団を励起したならば、アク セプターの蛍光を観察することにより蛍光エネルギー転移を検出することができ る。ダイマー化をブロックする化合物は蛍光エネルギー転移を阻害するであろう 。 表面プラスモン共鳴を用いて、ａｍａポリペプチドの自己結合ならびにａｍａ ポリペプチドと別のポリペプチドもしくは小型分子との結合に対する小型分子の 影響をモニターすることができる。低いサイト密度（site density）においてａ ｍａポリペプチドをセンサーチップにカップリングさせて、共有結合分子がモノ マー性となるようにすることができる。次いで、溶液蛋白をａｍａポリペプチド 被覆表面上に通し、局所屈折率の変化により生じる共鳴角の変化をモニターする ことにより特異的結合をリアルタイムで検出することができる。この方法を用い て、ａｍａポリペプチドの自己結合ならびにａｍａポリペプチドと別のポリペプ チドもしくは小型分子との結合に関する反応速度および平衡結合定数に対する小 型分子の影響を特徴づけることができる。 シンチレーション近接アッセイを用いて、ａｍａポリペプチドと別のａｍａポ リペプチドもしくは別の分子との結合の間の相互作用を特徴づけることができる 。ａｍａポリペプチドをシンチレーション充填ビーズにカップリングさせること ができる。放射性標識ａｍａポリペプチドの添加は結合を生じ、放射性源分子は シンチレーション液に極めて近接した状態となる。よって、ａｍａポリペプチド の 結合によりシグナルが放出され、ａｍａポリペプチドの自己結合またはａｍａポ リペプチドと別のポリペプチドもしくは小型分子との結合を妨害する化合物はシ グナルを減少させるであろう。 ＩＣＳバイオセンサーはＡＭＢＲＩ（Australian Membrane Biotechnology Re search Institute）により記載されている。それらは高分子の自己結合をカップ リングし、懸濁膜二重層中のガンマシジンにより促進されるイオンチャンネルを 閉鎖し、それゆえバイオセンサーのアドミッタンス（インピーダンスと同様）の 測定可能な変化が起こる。このアプローチは６０回のアドミッタンス変化でも直 線性があり、理想的には、小型分子コンビナトリアルライブラリーの大規模な高 処理量スクリーニングに適する。 本発明の他の具体例において、本発明ポリペプチドおよびまたはポリヌクレオ チドと結合あるいは相互作用して、その活性または発現を阻害または活性化する 化合物を同定する方法であって、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド への結合、あるいはポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと化合物との 他の相互作用を可能にする条件下で本発明ポリペプチドおよび／またはポリヌク レオチドをスクリーニングすべき化合物と接触させて、アゴニストとの結合ある いは他の相互作用を評価し（該方法において、好ましくは、かかる結合または相 互作用はポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと化合物との結合あるい は相互作用に応答した検出可能シグナルを提供しうる第２の化合物に関連したも のである）、次いで、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと化合物と の結合あるいは相互作用から生じるシグナルの存在または不存在を検出すること により、化合物がポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと結合あるいは 相互作用し、その活性または発現を活性化または阻害するかどうかを決定する方 法が提供される。 ａｍａアンタゴニストのアッセイのもう１つの例は、競争阻害アッセイに適し た条件下で、ａｍａおよび潜在的なアンタゴニストを、ａｍａ結合分子、組換え ａｍａ結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド模倣 物と混合する、競合アッセイである。ａｍａ分子を例えば放射活性または比色化 合物により標識し、結合分子に結合した、あるいは生成物に変換したａｍａ分子 の数を正確に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価できる。 潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペ プチドと結合し、それによりその活性を阻害し、消滅させる小型有機分子、ペプ チド、ポリペプチドおよび抗体を包含する。潜在的アンタゴニストはまた、ａｍ ａにより誘導される活性を誘導しない結合分子のような結合分子の同一部位に結 合し、ａｍａポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを結合から排除する ことによりａｍａポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの作用または発 現を妨げる、密接に関連した蛋白または抗体のような小型有機分子、ペプチド、 ポリペプチドであってもよい。 潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチドの結合部位に結合してその部位を占 領し、それにより細胞性結合分子との結合を妨害して、正常な生物学的活性を妨 害する小型分子を包含する。小型分子の例は、小型有機分子、ペプチド、ペプチ ド様分子を包含するが、これらに限定するものではない。その他の潜在的なアン タゴニストはアンチセンス分子を包含する（これらの分子についての記載に関し ては、Okano,J.,Neurochem.56:560(1991)；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENS E INHIBTORS OF GENE EXPRESSION、ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ州 (1988)を参照のこと）。好ましい潜在的アンタゴニストは、ａｍａに関連する化 合物およびその変種を包含する。 潜在的なポリペプチドアンタゴニストの他の例は抗体を包含し、あるいはいく つかの場合には、ポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素等の密接に関連 したオリゴヌクレオチドまたは蛋白、あるいはリガンド、基質、受容体、酵素等 のフラグメント、あるいは本発明ポリペプチドに結合するが応答を誘発せず、そ の結果ポリペプチドの活性を阻害することとなる小型分子を包含する。 ある種の本発明ポリペプチドは天然ａｍａポリペプチドの生物学的模倣物、機 能的模倣物である。これらの機能的模倣物を、とりわけ、ａｍａポリベプチドの 活性に拮抗するように、あるいは本明細書にいずれかの場所に記載の様式で抗原 または免疫原として用いてもよい。本発明ポリペプチドの機能的模倣物は末端切 断ポリペプチドを包含するが、これに限らない。例えば、好ましい機能的模倣物 は、配列番号：２に示すポリペプチドを含むポリペプチドであってアミノまたは カルボキシ末端の２０、３０、４０、５０、６０、７０または８０個のアミノ酸 を欠くポリペプチドを包含し、さらにこれらの末端切断配列の１つまたはそれ以 上のものを含む融合蛋白を包含する。これらの機能的模倣物のそれぞれをコード しているポリヌクレオチドを発現カセットとして用いて各模倣物ポリペプチドを 発現させてもよい。これらのカセットが５’および３’制限部位を有していて所 望の場合にカセットを一緒にして連結するための便利な手段となることが好まし い。これらのカセットが当該分野で知られたまたは本明細書にいずれかの場所に 記載された遺伝子発現シグナルを含むことがさらに好ましい。 よって、もう１つの態様において、本発明は、本発明ポリペプチドおよび／ま たはポリヌクレオチドに関するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体 、基質、酵素等；あるいはかかるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド の生成を減少または促進する化合物を同定するためのスクリーニングキットに関 する。該キットは： （ａ）本発明ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド； （ｂ）本発明ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを発現する組み換 え細胞； （ｃ）本発明ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを発現する細胞膜 ；あるいは （ｄ）本発明ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドに対する抗体 を含むものであり、好ましくは該ポリペプチドは配列番号：２のものであり、好 ましくは該ポリヌクレオチドは配列番号：１のものである。 かかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は重要成分を含 有していてもよいことが理解されよう。 本発明ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを、ポリペプチドおよび ／またはポリヌクレオチドのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の構造に 基づく設計方法に用いてもよいことが、当業者に容易に理解されよう。該方法は ： （ａ）最初にポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、またはそれらの 複合体の３次元構造を決定し、 （ｂ）アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の反応部位、結合部位または モチーフである可能性のある部位の３次元構造を推定し、 （ｃ）推定された反応部位、結合部位および／またはモチーフと結合または反 応すると予想される候補化合物を合成し、次いで （ｄ）候補化合物が実際にアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤であるか どうかを試験する ことを含む。 これが繰り返しプロセスであり、自動およびコンピューター制御工程を用いて この繰り返しプロセスを行ってもよいことが、さらに理解されよう。 さらなる態様において、本発明は、例えばａｍａポリペプチドおよび／または ポリヌクレオチドの過剰発現、発現不足、上昇した活性、または低下した活性に 関連した疾病のごとき異常な状態の治療方法を提供する。 ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの発現および／または活性が過 剰な場合、いくつかの方法を用いることができる。１の方法は、ポリペプチドお よび／またはポリヌクレオチドの機能および／または発現を阻害（例えば、リガ ンド、基質、受容体、酵素等の結合をブロックすることにより、あるいは２次的 シグナルを阻害することにより）するに有効な量の上記阻害化合物（アンタゴニ スト）を医薬上許容される担体とともに対象に投与し、そのことにより異常な症 状を改善することを含む。もう１つの方法において、やはり内在性ポリペプチド および／またはポリヌクレオチドと競争してリガンド、基質、受容体、酵素等に 結合することができる可溶性形態のポリペプチドを投与してもよい。かかる競争 物質の典型例はａｍａポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドのフラグメ ントを包含する。 さらなる態様において、本発明は、本発明ポリペプチドまたはそのフラグメン トおよび種々のサブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の免疫グロブリ ンの重鎖または軽鎖の不変領域の種々の部分を含む、遺伝子工学により得られる 可溶性融合蛋白に関する。好ましい免疫グロブリンはヒトＩｇＧ（詳細にはＩｇ Ｇ１）の重鎖の不変部分であり、融合はヒンジ領域で起こる。特定の具体例にお いて、血液凝固因子Ｘａを用いて開裂できる開裂配列を導入することによりＦｃ 部分を簡単に除去することができる。さらにそのうえ、本発明は、遺伝子工学に よるこれらの融合蛋白の製造方法、ならびに薬剤スクリーニング、診断および治 療におけるそれらの使用に関する。本発明のさらなる態様はかかる融合蛋白をコ ードしているポリヌクレオチドにも関する。融合蛋白法の例は国際特許出願ＷＯ ９４／２９４５８およびＷＯ９４／２２９１４に見いだされる。 さらにもう１つのアプローチにおいて、発現ブロッキング法を用いて内在性ａ ｍａポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を阻害することができる。この ブロッキングは遺伝子発現のいずれの工程を標的としてもよいが、好ましくは、 転写および／または翻訳を標的とする。この種の既知方法の例は、体内で生じる かまたは別個に投与されるアンチセンス配列の使用を包含する（例えば、Oligod eoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Press,Boc ca Raton,FL(1988)中O'Connor,J.Neurochem(1991)56:560参照）。別法として、 遺伝子とともに三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを提供してもよい。例 えば、Lee et al.,Nucleic Acids Res(1979)6:3073; Cooney et al.,Science(19 88)241:456; Dervan et al.,Science(1991)251:1360参照。これらのオリゴヌク レオチドはそれ自体投与することができ、あるいは重要部分のオリゴマーをイン ビボで発現させることもできる。 本明細書で得られるＤＮＡ配列は、各々、抗菌化合物の発見および開発に用い ることができる。発現でコードされた蛋白は、抗菌薬物をスクリーニングするた めの標的として用いることができる。加えて、コードされた蛋白のアミノ末端領 域をコードするＤＮＡ配列あるいはシャイン・ダルガノまたは他の個々のｍＲＮ Ａの翻訳容易化配列を用いて、目的とするコーディング配列の発現を調節するア ンチセンス配列を構築することができる。 本発明はまた、感染の続発症に関与する、病原体および哺乳動物宿主間の最初 の物理的相互作用を妨害するための、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド または阻害物質の使用を提供する。特に本発明の分子は、細菌、特にグラム陽性 菌が内在装置上の哺乳動物細胞外マトリックス蛋白、または創傷部の細胞外マト リックス蛋白に付着することを防御するために；哺乳動物細胞外マトリックス蛋 白と組織損傷を媒介する細菌ａｍａ蛋白との間の細菌付着を遮断するために；内 在装置の埋め込みまたは他の外科的手技以外により開始した感染における病因の 通常の進行を遮断するために使用することができる。 本発明のさらに別の態様によれば、ａｍａのアゴニストおよびアンタゴニスト 、好ましくは静菌性または殺菌性アゴニストおよびアンタゴニストが提供される 。 本発明のアンタゴニストおよびアゴニストを用いて、例えば、疾患を阻害し、 治療することができる。 ヘリコバクター・ピロリ（Ｈelicobacter pylori）（本明細書中、エッチ・ピ ロリともいう）菌は、胃癌、潰瘍、胃炎を発病している世界中の人々の３分の１ 以上の胃に感染している（国際癌研究機関（International Agency for Researc h on Cancer）（1994）Schistomoses,Liver Flukes and Helicobacter Pylori（ International Agency for Research on Cancer,Lyon,France；http:／／www.ui cc.ch／ecp／ecp2904.htm））。さらに、この国際癌研究機関は、最近になって 、ヘリコバクター・ピロリと胃腺癌の間の因果関係を認識し、その細菌をグルー プＩ（限定的）発癌物質と分類した。本発明により提供されるスクリーニング法 を用いて見出される本発明の好ましい抗菌化合物（ａｍａポリペプチドおよび／ またはポリヌクレオチドのアゴニストおよびアンタゴニスト）、特に広スペクト ルの抗生物質は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療に有用である。このような 治療はヘリコバクター・ピロリ誘発性癌、例えば胃腸癌の出現を減少させる。か かる治療はまた胃潰瘍および胃炎も治癒する。 ワクチン 生成物、組成物、ならびにａｍａ発現の評価、疾病の治療、遺伝学的変異のア ッセイ、および細菌、特にスタフィロコッカス・アウレウス細菌に対する免疫学 的応答を生起させるためのａｍａポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド の生物への投与方法が本発明により提供される。 本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物における免疫学的応答を誘発する方 法であって、抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生成するのに適当なａｍａポ リヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは 変種を個体に接種し、該個体を感染、特に細菌感染、最も好ましくはスタフィロ コッカス・アウレウス感染から防御することを含む方法に関する。さらに、その ような免疫学的応答による細菌複製を遅らせる方法も提供する。本発明のさらに もう一つ別の態様は、個体における免疫学的応答を誘発する方法であって、イン ビボでａｍａポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、またはそのフラグ メントまたは変種を発現するために、該ａｍａポリヌクレオチドおよび／または ポリペプチド、またはそのフラグメントまたは変種の発現を指向する核酸べクタ ーを該個体に送達し、例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞または細胞毒性Ｔ細胞を 含め、抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生じさせるように免疫学的応答を誘 発し、該個体にて疾患が既に確立されているか否かにかかわらず該個体を疾患か ら保護することを含む方法に関する。遺伝子を投与する一例は、粒子上のコーテ ィングとして遺伝子を所望の細胞に投与することによるものである。このような 核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、修飾核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブ リッド、ＤＮＡ−蛋白複合体またはＲＮＡ−蛋白複合体を含んでいてもよい。 本発明のさらなる態様は、その中に免疫学的応答を誘発する能力を有するか、 または誘発している個体に導入されると、その個体においてａｍａポリヌクレオ チドおよび／またはそれによりコードされるポリペプチドに対する免疫学的応答 を誘発する免疫学的組成物であって、該ａｍａポリヌクレオチドおよび／または それによりコードされるポリペプチド、または他の本発明ポリペプチドの抗原を コードし、発現するＤＮＡを含む組換えａｍａポリヌクレオチドおよび／または それによりコードされるポリペプチドを含む組成物に関する。免疫学的応答は、 治療的および予防的に使用でき、抗体免疫および／またはＣＴＬまたはＣＤ４＋ Ｔ細胞から生ずるような細胞性免疫から得ることができる。 ａｍａポリペプチドまたはそのフラグメントは、それ自体抗体を産生しないが 、第１の蛋白の安定化ならびに免疫原性および保護特性を有するであろう融合蛋 白 の産生能を有する補蛋白(co−Protein)と融合させることができる。このような 融合組換え蛋白は、好ましくは、さらに、ヘモフィラス・インフルエンザ(Hemop hilus influenzae)からのリポプロテインＤ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ ラーゼ（ＧＳＴ）またはベータガラクトシダーゼのような抗原性補蛋白、蛋白を 可溶化し、その産生および精製を容易にするような比較的大きい補蛋白からなる 。さらに、補蛋白は、免疫系の全身的な刺激を与える上で、アジュバントとして 作用してもよい。補蛋白は第１の蛋白のアミノまたはカルボキシ末端のいずれか に結合してもよい。 本発明は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび、Sato,Y.ら ，Science,273:352(1996)に記載されるような免疫刺激ＤＮＡ配列からなる組成 物、特にワクチン組成物および方法を提供する。 また、本発明は、スタフィロコッカス・アウレウス感染の動物モデルにおける そのような遺伝的免疫実験において使用したＤＮＡ構築物中で細菌細胞表面蛋白 の非可変領域をコードすることが明らかにされた、記載されたポリヌクレオチド またはその特定のフラグメントを使用する方法も提供する。そのような実験は、 予防的または治療的免疫応答を起こさせることのできる蛋白エピトープの同定に 特に有用である。この方法により、動物、とりわけヒトにおける細菌感染、特に スタフィロコッカス・アウレウス感染の予防剤または治療剤の開発のために、動 物の必須器官から感染の抵抗または除去に特に有用なモノクローナル抗体を産生 させることができると考えられる。 宿主を免疫するための抗原として本発明ポリペプチドを用い、例えば、損傷組 織への細菌の付着を遮断することにより、細菌の侵入を妨げる特異抗体を生じさ せることができる。組織損傷の例としては、例えば、機械的、化学的または熱的 損傷による、または内在装置の埋め込みによる皮膚や結合組織の傷、あるいは口 、乳腺、子宮または膣のような粘膜における傷が挙げられる。 本発明はまた、本発明の免疫原性組換えポリペプチドおよび／またはポリヌク レオチドと適当な担体とからなるワクチン処方も包含する。蛋白は胃で破壊され うるので、非経口的投与（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、皮内等の投与を包含 する）が望ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝剤、抗菌剤、お よびその処方を個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質を含有してもよい 、水性および非水性滅菌注射溶液；懸濁化剤または増粘剤を含有してもよい、水 性および非水性滅菌懸濁液を包含する。処方は、単位投与または複数投与用コン テナ、例えば、密封されたアンプルおよびバイアルにて提供され、使用直前に滅 菌液体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵することができる。ワクチ ン処方はまた、水中油系のごとき処方の免疫原性を高めるアジュバント系および 当該分野において知られている他の系を有してもよい。投与量はワクチンの比活 性に依存し、慣用的実験操作によって容易に決定できる。 本発明をある種のａｍａポリペプチドおよびポリヌクレオチドについて記載し たが、この記載は天然のポリペプチドおよびポリヌクレオチドのフラグメント、 ならびに組換えポリペプチドまたはポリヌクレオチドの免疫原性を実質的に変化 させない付加、欠失または置換を有する同様なポリペプチドおよびポリヌクレオ チドも包含することが理解されるであろう。 組成物、キットおよび投与 本発明のさらなる態様において、単細胞または多細胞生物に投与される、ａｍ ａポリヌクレオチドおよび／またはａｍａポリペプチドを含む組成物が提供され る。 本発明はまた、上記したポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドあるい はそれらのアゴニストまたはアンタゴニストからなる組成物に関する。本発明の ポリペプチドは、対象への投与に適した医薬担体のような細胞、組織または器官 用の未滅菌または滅菌担体と組み合わせて使用できる。かかる組成物は、例えば 、媒体添加または治療上有効量の本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌク レオチドと、医薬上許容される担体または賦形剤を含む。かかる担体は、限定す るものではないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、 エタノールおよびその組み合わせを包含する。処方は投与方法に適していなけれ ばならない。本発明は、さらには、上記した本発明組成物の一またはそれ以上の 成分を充填した、一またはそれ以上のコンテナを含む診断および医薬用パックお よ びキットに関する。 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび他の化合物を、単独で、また は、治療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いてもよい。 該医薬組成物は、例えば、とりわけ、局所、経口、経肛門、経膣、静脈内、腹 腔内、筋肉内、皮下、経鼻、経皮経路による投与を含む、いずれかの有効な、都 合のよい方法で投与される。 治療および予防において、活性成分は個体に注射用組成物、例えば、好ましく は等張の滅菌水性分散液として投与される。 また、組成物は、例えば、軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼剤、点 耳剤、マウスウォッシュ、含浸包帯および縫合糸ならびにエアゾルの形態の局所 用処方とすることができ、適当な通常の添加剤、例えば、保存料、薬剤浸透を助 ける溶媒、軟膏やクリームにおけるエモリエント等を含むことができる。そのよ うな局所用処方はまた、適合する通常の担体、例えば、クリームまたは軟膏基剤 、ローション用のエタノールまたはオレイルアルコールも含有することができる 。このような担体は、処方の約１〜９８重量％を構成してもよく、より一般的に は、処方の約８０重量％までを構成する。 さらなる態様において、本発明は、医薬上許容される担体または賦形剤を混合 された治療上有効量のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、例えば可 溶性形態の本発明ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、アゴニストま たはアンタゴニストペプチドまたは小型分子化合物を含む組成物が提供される。 かかる担体は、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロ ール、エタノール、およびそれらの混合物を包含するが、これらに限らない。さ らに本発明は、上記本発明組成物の１種またはそれ以上の成分を入れた１個また はそれ以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。本発明のポリペプチ ド、ポリヌクレオチドおよび他の化合物を単独で、あるいは治療化合物のごとき 他の化合物と組み合わせて使用してもよい。 組成物を投与経路（例えば、全身投与または経口投与）に適合させる。医薬組 成物の全身投与の好ましい形態は、注射、典型的には静脈注射を包含する。皮下 、 筋肉内または腹腔内のごとき他の注射経路を用いることもできる。全身投与のた めの別の手段は、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のごとき浸透 剤を用いる経粘膜または経皮投与を包含する。さらに、腸溶処方またはカプセル 処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。これらの化合物の投与 は局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の形態であってもよい。 哺乳動物、特にヒトに投与するには、一日の活性薬剤の用量は、０.０１ｍｇ ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、典型的には約１ｍｇ／ｋｇである。いずれにしても、 個体に最も適した実際の用量は医者により決定され、個体の年齢、体重および応 答により変化する。上記の用量は、平均的な場合の例示である。もちろん、より 高いまたは低い用量範囲が適当な個体もあり、それらも本発明の範囲内である。 内在装置には外科移植、補綴およびカテーテル、すなわち、個体の体内に導入 され、その位置に長時間止まる装置が包含される。例えば、そのような装置とし ては、人工関節、心臓弁、ペースメーカー、血管グラフト、血管カテーテル、脊 髄液シャント、尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（continuous ambulatory peri toneal dialysis:ＣＡＰＤ）カテーテルが挙げられる。 本発明の組成物は、内在装置の挿入の直前に関連する細菌に対する全身的効果 を達成するために注射で投与できる。治療は、手術の後、装置が体内にある間継 続できる。加えて、組成物は、細菌の傷汚染、特に、スタフィロコッカス・アウ レウスの傷汚染を防止するために、いずれの手術用の手術周辺カバーの拡張にも 使用できる。 多くの整形外科医は、補綴関節を有するヒトは、菌血症を生じ得る歯の治療前 に抗生物質による予防を考慮すべきと考えている。後の重い感染は、重篤な合併 症となり、時に、補綴関節の損失および著しい罹病率、致死率を伴う。したがっ て、該活性物質を、この状況の予防的抗生物質の代替品として使用することにま で拡張することができる。 上記した治療に加えて、本発明の組成物は、一般に、傷組織に露出したマトリ ックス・蛋白への細菌付着を予防するための傷治療剤、抗生物質予防に代え、あ るいは共に、歯の治療における予防的用途に使用できる。 別法として、本発明の組成物は挿入直前に内在装置を浸すのに使用できる。該 活性物質は、好ましくは、傷または内在装置を浸す場合、１μｇ／ｍｌ〜１０ｍ ｇ／ｍｌの濃度で使用できる。 便利には、ワクチン組成物は注射剤の形態である。通常のアジュバントを使用 して免疫応答を高めることができる。ワクチン用の適当な単位投与量は抗体０. ５〜５μｇ／ｋｇであり、この用量を、好ましくは１〜３週間の間隔で１〜３回 投与する。指示した用量範囲で、本発明の化合物では、その化合物の適当な個体 への投与を妨げる、有害な毒物学的作用は何も観察されない。 配列データベース、触知可能媒体中の配列、およびアルゴリズム ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、その２次元および３次元構造を 決定し、類似の相同性を有するさらなる配列を同定するための貴重な情報源を形 成する。配列をコンピューター読み込み可能媒体に保存し、次いで、既知の高分 子構造プログラムにおいて保存したデータを用いて、ＧＣＣのごときよく知られ た既知検索ツールを用いてデータベースを検索することにより、これらのアプロ ーチを最も容易に簡略化することができる。 本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは検索分析に有用なデータベース ならびに配列分析アルゴリズム中の成分として有用である。見出しのこのセクシ ョンならびにこのセクションに関連した請求項の用語「配列データベース、触知 可能媒体中の配列、およびアルゴリズム」「本発明ポリヌクレオチド」および「 本発明ポリヌクレオチド配列」は、本発明ポリヌクレオチドの検出可能な化学的 または物理的特性を意味し、触知可能媒体に還元または保存されていてもよいも のである。例えば、クロマトグラフィーのスキャンデータまたはピークのデータ 、写真のデータまたはそこから得られたスキャンデータ、コールドベース、およ び質量スペクトル分析データが挙げられる。データベースおよびアルゴリズムと いう見出しのこのセクションならびにそれに関連した請求項で用いる用語「本発 明ポリペプチド」および「本発明ポリペプチド配列」は、本発明ポリペプチドの 検出可能な化学的または物理的特性を意味し、触知可能媒体に還元または保存さ れていてもよいものである。例えば、クロマトグラフィーのスキャンデータまた は ピークのデータ、写真のデータまたはそこから得られたスキャンデータ、コール ドベース、および質量スペクトル分析データが挙げられる。 本発明は、本発明ポリペプチド配列および／または本発明ポリヌクレオチド配 列を保存したコンピューター読み込み可能媒体を提供する。例えば、下記のメン バーを含み、保存したコンピューター読み込み可能媒体が提供される：メンバー は、本発明ポリヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド；本発明ポリペプチ ド配列の配列を含むポリペプチド；少なくとも１つの配列が本発明ポリヌクレオ チド配列の配列を含むものであるポリヌクレオチド配列のセット；少なくとも１ つの配列が本発明ポリペプチド配列の配列を含むものであるポリヌペプチド配列 のセット；本発明ポリヌクレオチド配列の配列を含むポリヌクレオチド配列を表 すデータセット；本発明ポリペプチド配列の配列を含むポリペプチドをコードし ているポリヌクレオチド配列を表すデータセット；本発明ポリヌクレオチド配列 の配列を含むポリヌクレオチド；本発明ポリペプチド配列の配列を含むポリペプ チド；少なくとも１つの配列が本発明ポリヌクレオチド配列の配列を含むもので あるポリヌクレオチド配列のセット；少なくとも１つの配列が本発明ポリペプチ ド配列の配列を含むものであるポリペプチド配列のセット；本発明ポリヌクレオ チド配列の配列を含むポリヌクレオチド配列を表ずデータセット；本発明ポリペ プチド配列の配列を含むポリペプチド配列をコードしているポリヌクレオチド配 列を示すデータセットである。コンピューター読み込み可能媒体は情報またはデ ータを保存するのに用いる物体のいずれの組成物であってもよく、例えば、市販 フロッピーディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスク、 およびビデオディスクを包含する。 特徴配列または鎖、詳細には遺伝学的配列またはコードされた遺伝学的配列の 分析方法が本発明により提供される。配列分析のための好ましい方法は、例えば 、同一性および類似性の分析のごとき配列相同性分析、ＲＮＡ構造分析、配列ア ッセンブリー、クラディスティック(cladistic)分析、配列モチーフ分析、読み 枠決定、核酸塩基コーリング(calling)、核酸塩基トリミング、および配列決定 クロマトグラムピーク分析の方法を包含する。 相同性の同定を行うためのコンピューターによる方法が提供される。この方法 は、本発明ポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド配列をコンピュ ーター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該第１のポリヌクレオチド配列を 少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して相 同性を同定する工程を含む。 さらに、相同性の同定を行うためのコンピューターによる方法が提供され、該 方法は、本発明ポリペプチド配列を含む第１のポリペプチド配列をコンピュータ ー読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該第１のポリペプチド配列を少なくと も１つの第２のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同 定する工程を含む。 そのうえさらに、ポリヌクレオチドアッセンブリーのためのコンピューターに よる方法が提供され、該方法は、本発明ポリヌクレオチドを含む第１のポリヌク レオチド配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該第１の ポリヌクレオチド配列と少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドまたはポリペ プチド配列との間の少なくとも１つの重複領域をスクリーニングする工程を含む 。 そのうえさらに、ポリヌクレオチドアッセンブリーのためのコンピューターに よる方法が提供され、該方法は、本発明ポリペプチドを含む第１のポリペプチド 配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該第１のポリペプ チド配列と少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と の間の少なくとも１つの重複領域をスクリーニングする工程を含む。 本発明のもう１つの好ましい具体例において、下記のものからなる群より選択 されるメンバーを保存したコンピューター読み込み可能媒体が提供される：メン バーは、配列番号：１または３の配列を含むポリヌクレオチド；配列番号：２ま たは４の配列を含むポリペプチド；少なくとも１つの配列が配列番号：１または ３の配列を含むものであるポリヌクレオチド配列のセット；少なくとも１つの配 列が配列番号：２または４の配列を含むものであるポリペプチド配列のセット； 配列番号：１または３の配列を含むポリヌクレオチド配列を表すデータセット； 配列番号：２または４の配列を含むポリペプチド配列をコードしているポリヌク レオチド配列を表すデータセット；配列番号：１または３の配列を含むポリヌク レオチド；配列番号：２または４の配列を含むポリペプチド；少なくとも１つの 配列が配列番号：１または３の配列を含むものであるポリヌクレオチド配列のセ ット；少なくとも１つの配列が配列番号：２または４の配列を含むものであるポ リペプチド配列のセット；配列番号：１または３の配列を含むポリヌクレオチド 配列を表すデータセット；配列番号：２または４の配列を含むポリペプチド配列 をコードしているポリヌクレオチド配列を表すデータセット。さらなる好ましい 本発明の具体例は、相同性の同定を行うためのコンピューターによる方法を提供 し、該方法は、配列番号：１または３の配列を含むポリヌクレオチド配列をコン ピューター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該ポリヌクレオチド配列を少 なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を比較して相同性を同 定する工程を含む。 さらなる好ましい本発明の具体例は、相同性の同定を行うためのコンピュータ ーによる方法を提供し、配列番号：２または４の配列を含むポリペプチド配列を コンピューター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該ポリペプチド配列を少 なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同 定する工程を含む。 さらなる好ましい本発明の具体例は、ポリヌクレオチドアッセンブリーのため のコンピューターによる方法を提供し、該方法は、配列番号：１または３の配列 を含む第１のポリヌクレオチド配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供 し、次いで、該第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列との 間の少なくとも１つの重複領域をスクリーニングする工程を含む。 本発明のさらなる具体例は、相同性の同定を行うためのコンピューターによる 方法を提供し、該方法は、配列番号：１または３の配列を含むポリヌクレオチド 配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該ポリヌクレオチ ド配列を少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して 相同性を同定する工程を含む。 本明細書において引用したすべての文献（特許および特許出願に限らない）は 出典明示によりその内容を本明細書の一部とする。本願が優先権を主張するいず れの特許出願もまた出典明示により本明細書の一部とする。 用語 本明細書中で頻繁に使用される特定の用語を、その理解を容易にするために以 下に定義する。 「抗体（複数でも可）」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、 キメラ、１本鎖、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントを包含し、さ らにＦａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を包含する。 「抗原的に等価な誘導体（複数でも可）」は、特定の抗体により特異的に認識 されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはいずれかの等価物を包含し、該 特定の抗体は、本発明蛋白、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して生成 した場合に、病原体と哺乳動物宿主との間の身体的相互作用を妨害するものであ る。 「二特異的（複数でも可）」とは、少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む 抗体を意味し、各ドメインは異なるエピトープに指向されている。 「身体材料（複数でも可）」とは、個体または生物由来の材料を意味し、骨、 血液、血清、脳脊髄液、精液、唾液、筋肉、軟骨、器官組織、皮膚、尿、糞便ま たは生検材料のごとき細胞、組織および排泄物等を包含する。該生物は、個体に 感染、侵入、または棲息するものである。 「疾病（複数でも可）」は、例えば、上気道感染（例えば、中耳炎、細菌性気 管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心 臓感染（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸感染（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍 、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、大脳膿瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、 結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および尿管感 染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、 皮膚感染（例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎 ）、ならびに骨および関節感染（例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）を包含する 細菌に よる感染により引き起こされる疾病、またはかかる細菌による感染に関連した疾 病を意味する。 「融合蛋白（複数でも可）」は、２種の、しばしば関係のない融合遺伝子また はそのフラグメントによりコードされた蛋白をいう。一例において、ＥＰ−Ａ− ０４６４には、別のヒト蛋白またはその一部と一緒になった免疫グロブリン分子 の不変領域の種々の部分を含む融合蛋白が開示されている。多くの場合、免疫グ ロブリンのＦｃ領域を融合蛋白の一部分として用いることは治療および診断にお ける使用に有利であり、例えば、改善された薬物動態学的特性が得られる（例え ば、ＥＰ−Ａ ０２３２２６２参照）。一方、いくつかの用途には、融合蛋白が 発現、検出および精製された後、Ｆｃ部分を欠失できることが望ましいであろう 。 「宿主細胞（複数でも可）」は外来性ポリヌクレオチド配列によって形質転換 またはトランスフェクションされた、あるいは形質転換またはトランスフェクシ ョンされうる細胞である。 「同一性」は、当該分野で公知であり、配列の比較で決定されるような、２ま たはそれ以上のポリペプチド配列あるいは２またはそれ以上のポリヌクレオチド 配列の間の関係である。また、当該分野では、「同一性」は、場合によっては、 配列の鎖間の対合によって決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオ チド配列間の配列の関連性の度合を意味する。「同一性」は、Computational Mo lecular Biology,Lesk,A.M.編,Oxford University Press,New York,1988；Bioco mputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.およびG riffin,H.G.編,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecul ar Biology,Von Heinje,G.Academic Press,1987；およびSequence Analysis Pri mer,Gribskov,M.およびDevereux,J.編,M Stockton Press,New York,1991；およ びCarllio,HおよびLipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)に記載され ている方法（これらに限らない）を含め、公知方法により容易に決定することが できる。同一性を決定する好ましい方法は、テストする配列間に最大の対合を与 えるように設計されている。そのうえ、同一性を測定する方法は公に 入手できるコンピュータ・プログラムに集成されている。２つの配列の間の同一 性を測定する好ましいコンピュータ・プログラム方法は、例えば、ＧＣＧプログ ラムパッケージ（Devereux,J.ら,Nucleic Acids Research(1984)12(1):387）、B LASTP、BLASTNおよびFASTA（Atschul,S.F.ら,J.Molec.Biol.(1990)215:403−410 ）を包含するが、これに限らない。BLAST X プログラムはNCBIおよび他の源（BL AST Manual,Altshul,S.ら,NCBI NLM NIH Bethesda,MD20894；Altschul,S.ら,J.M ol.Biol.,215:403−410(1990)）から公に入手できる。また、周知のスミス・ウ ォーターマン(Smith Waterman)アルゴリズムを用いて同一性を決定することもで きる。 ポリペプチド配列の比較のための好ましいパラメーターは以下のものを包含す る： アルゴリズム：Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48: 443-453(1970) 比較マトリックス：Hentikoff and Hentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:1091 5-10919(1992)からのBLOSSUM62 ギャップペナルティー：１２ ギャップ長ペナルティー：４ これらのパラメーターに関して有用なプログラムは、Genetics Computer Grou p,Madison WI.から「ギャップ」プログラムとして公に利用できる。上記パラメ ーターはポリペプチド比較のための省略時パラメーターである（エンドギャップ についてペナルティーを伴わない）。 ポリヌクレオチド比較のための好ましいパラメーターは下記のものを包含する ： アルゴリズム：Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48: 443-453(1970) 比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：５０ ギャップ長ペナルティー：３ これらのパラメーターに関して有用なプログラムは、Genetics Computer Grou p,Madison WI.から「ギャップ」プログラムとして公に利用できる。上記パラメ ーターはポリヌクレオチド比較のための省略時パラメーターである。 ポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての「同一性」に関する好ましい 意味は、下記（１）および（２）に示される。 （１）さらにポリヌクレオチドの具体例は、配列番号：１の対照配列に対して少 なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または１００％の同 一性を有する単離ポリヌクレオチド配列を包含し、本発明ポリヌクレオチド配列 は配列番号：１の対照配列と同一であってもよく、あるいは対照配列と比較して ある程度の数までのヌクレオチドの変化を有していてもよい。かかる変化は、少 なくとも１個のヌクレオチドの欠失、置換（トランジションおよびトランスバー ジョンを包含）または挿入からなる群より選択され、該変化は対照ヌクレオチド 配列の５’または３’末端の位置あるいはそれらの末端位置の間の位置において 、対照配列中のヌクレオチドにおいて個々にまたは散在して、あるいは対照配列 中の１またはそれ以上の連続した群として生じてもよい。配列番号：１中の全ヌ クレオチド数と個々の同一性パーセント値（１００で割ったもの）とをかけて、 その積を配列番号：１中の全ヌクレオチド数から差し引くことによりヌクレオチ ド変化の数を決定する。これを下式により説明する： ｎ_n≦ｘ_n−（ｘ_n・ｙ） 式中、ｎ_nはヌクレオチド変化の数であり、ｘ_nは配列番号：１中の全ヌクレオチ ド数であり、ｙは、例えば７０％なら０．７０、８０％なら０．８０、８５％な ら０．８５、９０％なら０．９０、９５％なら０．９５、９７％なら０．９７、 １００％なら１．００であり、・は積の演算子であり、ｘ_nとｙとの整数でない 積は切り捨てにより最も近い整数とした後、ｘ_nから差し引く。配列番号：２の ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の変化は、好ましくはコー ディング配列中のナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異を引き起こ す可能性があり、それゆえ、かかる変化に随伴してポリヌクレオチドによりコー ドされているポリペプチドが変化する。 例えば、本発明ポリヌクレオチド配列は配列番号：１の対照配列と同一であっ てもよく、すなわち、１００％同一であってもよく、あるいは対照配列と比較し てある程度の数までの核酸の変化を有していてもよい（その場合、同一性％は １００％未満である）。かかる変化は、少なくとも１個の核酸の欠失、置換（ト ランジションおよびトランスバージョンを包含）または挿入からなる群より選択 され、該変化は対照ポリヌクレオチド配列の５’または３’末端の位置あるいは それらの末端位置の間の位置において、対照配列中の核酸において個々にまたは 散在して、あるいは対照配列中の１またはそれ以上の連続した群として生じても よい。配列番号：１中の全核酸数に個々の同一性を示す整数を１００で割った値 をかけて、その積を配列番号：１中の全核酸数から差し引くことにより同一性％ 値についての核酸変化数を決定する。あるいはこのことは下式により説明される ： ｎ_n≦ｘ_n−（ｘ_n・ｙ） 式中、ｎ_nは核酸変化の数であり、ｘ_nは配列番号：１中の全核酸数であり、ｙは 、例えば７０％なら０．７０、８５％なら０．８５等であり、ｘ_nとｙとの整数 でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、ｘ_nから差し引く。 （２）さらにポリペプチドの具体例は、配列番号：２のポリペプチド対照配列 に対して少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または１ ００％の同一性を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドを包含し、該ポリ ペプチド配列は配列番号：２の対照配列と同一であってもよく、あるいは対照配 列と比較してある程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい。かかる変 化は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（保存的および非保存的置換を包 含）または挿入からなる群より選択され、該変化は対照ポリペプチド配列のアミ ノまたはカルボキシ末端の位置あるいはそれらの末端位置の間の位置において、 対照配列中のアミノ酸において個々にまたは散在して、あるいは対照配列中の１ またはそれ以上の連続した群として生じてもよい。配列番号：２中の全アミノ酸 数と同一性を示す整数を１００で割った値とをかけて、その積を配列番号：２中 の全アミノ酸数から差し引くことによりアミノ酸変化の数を決定する。これを下 式により説明する： ｎ_a≦ｘ_a−（ｘ_a・ｙ） 式中、ｎ_aはアミノ酸変化数であり、ｘ_aは配列番号：２中の全アミノ酸数であり 、ｙは、例えば７０％なら０．７０、８０％なら０．８０、８５％なら０．８５ 、 ９０％なら０．９０、９５％なら０．９５、９７％なら０．９７、１００％なら １．００であり、・は積の演算子であり、ｘ_aとｙとの整数でない積は切り捨て により最も近い整数とした後、ｘ_aから差し引く。 例えば、本発明ポリペプチド配列は配列番号：２の対照配列と同一であっても よく、すなわち、１００％同一であってもよく、あるいは対照配列と比較してあ る程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい（その場合、同一性％は１ ００％未満である）。かかる変化は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（ 保存的または非保存的置換を包含）または挿入からなる群より選択され、該変化 は対照ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置あるいはそれらの 末端位置の間の位置において、対照配列中のアミノ酸において個々にまたは散在 して、あるいは対照配列中の１またはそれ以上の連続した群として生じてもよい 。配列番号：２中の全アミノ酸数に個々の同一性パーセント値（１００で割った もの）をかけて、その積を配列番号：２中の全アミノ酸数から差し引くことによ り同一性％値についてのアミノ酸変化数を決定する。これを下式により説明する ： ｎ_a≦ｘ_a−（ｘ_a・ｙ） 式中、ｎ_aはアミノ酸変化の数であり、ｘ_aは配列番号：２中の全アミノ酸数であ り、ｙは、例えば７０％なら０．７０、８５％なら０．８５等であり、ｘ_aとｙ との整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、ｘ_aから差し引く。 「免疫学的に等価な誘導体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはい ずれかの等価物を包含し、それらが脊椎動物において抗体を生成させるために適 当な処方中に用いられた場合に、抗体は病原体と哺乳動物宿主との間の即時的な 身体的相互作用を妨害するように作用する。 「免疫特異的」とは、他の関連ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、特に先 行技術のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対してよりも本発明ポリペプチ ドまたは本発明ポリヌクレオチドに対して実質的に大きなアフィニティーを有す る抗体の特性を意味する。 「個体（複数でも可）」とは多細胞真核生物を意味し、後生動物類、哺乳動物 、 ヤギ類、ウシ類、類人猿、霊長類およびヒトを包含するが、これらに限らない。 「単離された」とは、「ヒトの手により」、その天然の状態から変えられるこ と、すなわち、天然物の場合、その本来的な環境から変化または除去あるいは両 方されたことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌクレオチドまた はポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態で共存する物質 から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書で用いる 用語としての「単離された」ものである。さらには、形質転換、遺伝的操作によ り、または他のいずれかの方法により生物に導入されているポリヌクレオチドま たはポリペプチドは、まだ生物内にあり、その生物が生きているまたは死んでい るとしても、「単離された」ものである。 「生物（複数でも可）」は、(ｉ)Streptococcus、Staphylococcus、Bordetell a、Corynebacterium、Mycobacterium、Neisseia、Haemophilus、Actinomyces、s treptomyces、Nocardia、Enterobacter、Yersinia、Fancisella、Pasturella、M oraxella、Acinetobacter、Erysipelothrix、Branhamella、Actinobacillus、St reptobacillus、Listeria、Calymmatobacterium、Brucella、Bacillus、Closter dium、Treponema、Escherichia、Salmonella、Kleibsiella、Vibrio、Proteus、 Erwinia、Borrelia、Leptospira、Spirillum、Campylobacter、Shigella、Legio nella、Pseudomonas、Aeromonas、Rickettsia、Chlamydia、BorreliaおよびMyco plasmaである属（これらに限らない）のメンバー、ならびにグループＡのStrept ococcus、グループＢのStreptococcus、グループＣのStreptococcus、グループ Ｄのstreptococcus、グループＧのStreptococcus、Staphylococcus aureus、Str eptococcus pyrogenes、Streptococcus agalactiae、Streptococcus faecalis、 Streptococcus faecium、Streptococcus durans、Neisseria gonorrheae、Neiss eria meningitidis、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Co rynebacterium diptheriae、Garnella vaginalis、Mycobacterium tuberculosis 、Mycobacterium bovis、Mycobacterium ulcerans、Mycobacterium leprae、Act inomyces israelli、Listeria monocytogenes、Bordetella pretusis、Bordetel la parapretusis、Bordetella bronchiseptica、Esherichia coli、 Shigella dysenteriae、Haemophilus influenzae、Haemophilus aegyptius、Hae mophilus parainfluenzae、Haemophilus ducreyi、Bordetella、Salmonella typ hi、Citrobacter freundii、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Yersinia pestis、Klebsiella pneumoniae、Serratia marcessens、Vibrio cholera、Shig ella dysenterii、Shigella flexneri、Pseudomonas aeruginosa、Franscisella tularensis、Brucella abortis、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Clos tridium perfringens、Clostridium tetani、Clostridium butulinum、Treponem a pallidum、Rickettsia rickettsiiおよびChlamydia trachomitisである種また はグループ（これらに限らない）のメンバーを包含する原核生物、（ｉｉ）Arch aebacter（これに限らない）を包含する古細菌、および（ｉｉｉ）原生動物、真 菌類、Saccharomyces、KluveromycesまたはCandida属（これらに限らない）のメ ンバー、およびSaccharomyces cerevisiae、Kluveromyces lactisまたはCandida albicans種のメンバー（これらに限らない）を包含する単細胞または糸状真核 生物を意味する。 「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、一般に、ポリリボヌクレオチドまた はポリデオキシリボヌクレオチドのいずれをもいい、それらは非修飾ＲＮＡまた はＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチ ド」は、単鎖および二本鎖ＤＮＡ、単鎖および二本鎖領域または単鎖、二本鎖お よび三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単鎖および二本鎖ＲＮＡ、単鎖および二 本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、および単鎖またはより典型的には二本鎖または 三本鎖領域または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよび ＲＮＡを含含むハイブリッド分子を包含するが、これに限定されない。さらに、 本明細書において用いる「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるい はＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる三本鎖領域をいう。これらの領域の鎖は同 じ分子からのものでも、異なる分子からのものでもよい。該領域は、これら分子 の一またはそれ以上のすべてを含んでもよいが、より典型的には、分子のいくつ かの領域のみを含む。三本螺旋領域の分子の一つは、しばしば、オリゴヌクレオ チドである。本明細書において用いる場合、「ポリヌクレオチド(複数でも可)」 なる用語はまた、一つまたはそれ以上の修飾された塩基を含有する上記ＤＮＡま たはＲＮＡを包含する。すなわち、安定性または他の理由で修飾された骨格を有 するＤＮＡまたはＲＮＡも、該用語が本明細書で意図するところの「ポリヌクレ オチド（複数でも可）」である。さらに、イノシンなどの通常でない塩基、また はトリチル化された塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（２つの例だ けを示す）も、その用語を本明細書で用いる場合のポリヌクレオチドである。多 種の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされており、当業者に公知のように多くの有 用な目的に使用されていることが理解されよう。本明細書で用いる「ポリヌクレ オチド」なる語は、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的 に修飾された形態、ならびにウイルスおよび、例えば、単純型細胞および複雑型 細胞などの細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリ ヌクレオチド（複数でも可）」はまた、しばしばオリゴヌクレオチド（複数でも 可）と称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。 「ポリペプチド（複数でも可）」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合で 互いに結合した２つまたはそれ以上のアミノ酸を含含むいずれのペプチドまたは 蛋白をもいう。「ポリペプチド（複数でも可）」は、通常、ペプチド、オリゴペ プチドまたはオリゴマーと称される短い鎖、および一般に蛋白と称される長い鎖 の両方をいう。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされている２０個のアミノ 酸以外のアミノ酸を含有してもよい。「ポリペプチド（複数でも可）」は、プロ セッシングおよび他の翻訳後の修飾のごとき自然の工程、または化学修飾技法の いずれかによって修飾されたものを有する。かかる修飾は、基本テキストにて、 およびより詳細な研究論文にて、ならびに膨大な研究文献にて詳しく記載されて おり、それらは当業者に周知である。同じ型の修飾が、所定のポリペプチド中、 いくつかの部位で、同じまたは異なる程度にて存在してもよいことは明らかであ ろう。また、所定のペプチドは多くの型の修飾を有していてもよい。修飾は、ペ プチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチ ドのどこででも起こりうる。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ− リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチ ドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ スホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド結合形成、 脱メチル化、共有交差結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、 ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、 ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解的プロセッシング、リン 酸化、プレニル化、ラセミ化、糖鎖形成、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基 のガンマーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレノ イル化、硫酸化、アルギニル化のごとき転移ＲＮＡにより媒介される蛋白へのア ミノ酸付加、およびユビキチネーションを包含する。例えば、PROTEINS−STRUCT URE AND MOLECULAR PROPERTIES,第２版,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Compan y,New York(1993)およびWold,F.,POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,Posttranslational Protein Modifications：Perspectives and Pros pects,pgs.1−12,B.C.Johnson編,Academic Press,New York(1983)；Seifterら,M eth Enzymol.(1990)182:626−646、およびRattanら,Protein Synthesis:Posttra nslational Modifications and Aging,Ann N.Y.Acad Sci(1992)663:48-62を参照 のこと。ポリペプチドは、分枝してもよく、分枝を伴ったまたは伴わない環状で あってもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロ セッシングの結果であり、同様に全く合成的な方法で合成できる。 「組み換え発現系（複数でも可）」は、本発明ポリヌクレオチドおよびポリペ プチドの製造のために宿主細胞または宿主細胞溶解物中に導入または形質転換さ れた発現系またはその部分または本発明ポリヌクレオチドをいう。 「引き算セット(subtraction set)」は、本発明の少なくとも１のポリヌクレ オチドを含む１種またはそれ以上、しかし好ましくは１００種未満のポリヌクレ オチドである。 本明細書中で使用される「変種（複数でも可）」なる語は、各々、対照標準の ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、本質的な特性を保持している ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変種 は、別の対照標準のポリヌクレオチドとヌクレオチド配列において異なっている 。変種のヌクレオチド配列における変化は、対照標準のポリヌクレオチドによっ てコードされたポリペプチドのアミノ酸配列と変わっていてもよいし、または変 わっていなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、後述するように、対照標準の配 列によってコードされたポリペプチドにおいて、アミノ酸置換、付加、欠失、融 合および切断をもたらしうる。ポリペプチドの典型的な変種は、別の対照標準の ポリペプチドとはアミノ酸配列において異なっている。一般に、差異は、対照標 準のポリペプチドとその変種の配列が全体的に非常に類似しており、多くの領域 においては同一であるように限定される。変種および対照標準のポリペプチドは 、一またはそれ以上の置換、付加、欠失のいずれかの組み合わせによって、アミ ノ酸配列において異なってもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝 コードによってコードされたものであってもなくてもよい。また本発明は、本発 明の各ポリペプチドの変種、すなわち保存的アミノ酸置換により対照標準とは異 なっており、そのことにより残基が同様の特性を有する別の残基に置換されてい るものを包含する。典型的なかかる置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌ ｅ間；ＳｅｒおよびＴｈｒ間；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕ間；ＡｓｎおよびＧ ｌｎ間；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ間；あるいは芳香族残基ＰｈｅおよびＴ ｙｒ間のものである。数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個または １個のアミノ酸がいずれかの組み合わせで置換、欠失、または付加されている変 種が特に好ましい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は、対立遺伝子 変種のような天然に存在するものであってもよく、または天然に存在することが 知られていない変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天 然に存在しない変種は、変異誘発法または直接合成あるいは当業者に公知の他の 組換え法によって作られてもよい。 実施例 以下の実施例は、別に詳細に記載したこと以外は、当業者に周知で慣用的な標 準的な技法を用いて実施する。実施例は例示であって、本発明を限定するもので はない。 実施例１ 株の選択、ライブラリーの製造および配列決定 表１（配列番号１または３）に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドは、 エシェリシア・コリ中のスタフィロコッカス・アウレウスの染色体ＤＮＡのクロ ーンライブラリーより得た。重複するスタフィロコッカス・アウレウスＤＮＡを 含有する２個またはそれ以上のクローンからの配列データを用いて、配列番号１ の連続したＤＮＡ配列を構築した。ライブラリーは常套手段、例えば以下の方法 １および２により製造してもよい。 全細胞ＤＮＡをスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９より、標準法に 従って単離し、以下に示す二つの方法のいずれかによりサイズ分画する。 方法１ 標準的方法に従ってサイズ分画するために、全細胞ＤＮＡをニードル(needle) に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大きさのＤＮＡフラグメントをエ キソヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼで処理することによって末端切断し 、ＥｃｏＲＩリンカーを付加する。フラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断したベク ター、ラムダＺａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージ ングし、次いでパッケージングしたライブラリーでエシェリシア・コリを感染さ せる。ライブラリーを標準方法により増幅する。 方法２ 全細胞ＤＮＡをライブラリーベクターにクローニングするための一連のフラグ メントを得るのに適当な１つの制限酵素（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、Ａｌｕ Ｉ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）またはその組み合わせで部分的に加水分解し、かかるフ ラグメントを標準的方法に従ってサイズ分画する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡ に連結し、次いでそのフラグメントをＥｃｏＲＩで切断したベクター、ラムダＺ ａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、パッケ ージングしたライブラリーでエシェリシア・コリを感染させる。ライブラリーを 標準方法により増幅する。 実施例２ ａｍａの特徴づけ アミノアシラーゼ遺伝子発現の特徴づけ インビボにおける遺伝子発現 最近、感染中のグローバルな遺伝子発現に従う趣旨のいくつかの新規方法が記 載されている（Chuang,S.et al.,(1993); Mahan,M.J.et al.,Science 259:686-6 88(1993); Hensel,M.et al.,Science 269:400-403(1995)）。いままでのところ 、これらの新しい方法はグラム陰性病原体の感染について示されているが、グラ ム陽性病原体の感染については示されていない。その理由はおそらく、グローバ ルなトランスポソン突然変異法ならびにこれらの生物におけるこれらの方法に必 要な適当なベクターの開発が非常に遅れており、Chuang,S.et al.,J.Bacteriol. 175:2026-2036(1993)に記載の方法の場合、感染組織由来の哺乳動物ＲＮＡを含 まない適当量の細菌ＲＮＡを単離し、十分に高い特異的活性の標識を細菌ＲＮＡ に付けることが困難である。 本発明は、哺乳動物宿主の異なった感染段階での病原体における遺伝子発現を 調べるための新規方法を用いる。 本発明方法の使用は、感染中に転写される細菌遺伝子、および抗細菌療法にお いて有用な阻害剤の同定を本発明において可能にする。かかる遺伝子転写または 生成したｍＲＮＡのその後の翻訳または対応発現蛋白の機能に対する特異的阻害 剤は、抗細菌療法において有用であろう。 感染中のスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９からの遺伝子発現の決定 スタフィロコッカス・アウレウス感染４日目の鼠蹊部またはスタフィロコッカ ス・アウレウスによる腎孟腎炎感染７日目の腎臓からの壊死脂肪組織を効果的に 破壊し、酸フェノールおよび界面活性剤の存在下で処理して動物ＲＮＡおよび細 菌ＲＮＡの混合物を得る。組織を液体窒素中で素早く凍結し、凍結している間に 組織試料を処理することにより、細菌ｍＲＮＡ集団における変化を最小にする。 得られた全ＲＮＡはＤＮＡおよび蛋白不含(ＲＮＡｓｅおよびＤＮＡｓｅも不含) である。長い転写物を含む高収量の細菌ｍＲＮＡを得るための破壊および処理を 最適条件で行った後、得られたｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写を行い、構成的に 発現され、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９において低コピー数で あることが知られている細菌遺伝子のＯＲＦに特異的なプライマーを用いて増幅 を行う。この実施例ＩＩ、パートｂの態様は公表されたプロトコール（Cheng,et al.,Anal.Biochem.(1994)222:511-514）の修飾版である。 ａ）感染ネズミモデルからの、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＨＵ２９感 染組織の単離 ｉ）ネズミ大腿部感染モデルからの、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＨ Ｕ２９感染組織の単離。１０ｍｌの滅菌栄養ブロス(No2．Oxoid)に寒天培養プレ ートから単離されたスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９の個々のコロ ニーを接種する。培養物を好気的に（静置培養）３７℃で１６〜２０時間インキ ュベーションする。４週齢の各マウス（メス，体重１８〜２２ｇ，ＭＦ１株）に このスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９のブロス培養物０．５ｍｌ（ ブロスで希釈して約１０⁸ｃｆｕ／ｍｌとした）を右前足の大腿部（鼠蹊部）に 皮下注射することにより感染させる。感染後２４時間は、マウスを定期的にモニ ターすべきであり、その後、研究終了まで毎日モニターすべきである。全身感染 の徴候、すなわち、昏睡、逆立った毛、群れからの離脱を示す動物を詳細にモニ ターすべきであり、徴候が瀕死状態に至る場合には動物を即座に除去すべきであ る。 外部から目で見てわかる、傷害進展を示す徴候は感染２４〜４８時間後に現れ るであろう。動物の腹部の試験により、皮膚下の膿瘍の盛り上がった輪郭が示さ れるであろう。局所的な傷害は右の下大腿部にとどまるはずであるが、場合によ っては左の下大腿部および上に広がって胸部に至るかもしれない。場合によって は、膿瘍が皮膚層から破裂してくるかもしれない。このような場合、感染動物を 即座に除去し、可能ならば組織をサンプリングする。動物を除去しないと、膿瘍 を覆っている壊死皮膚組織が脱落し、腹部筋肉壁が露出するかもしれない。 感染から約９６時間後に、二酸化炭素による窒息を用いて動物を殺す。死亡と 組織処理／保存との間の時間を最短にするために、グループとしてではなく、個 々にマウスを殺すべきである。死亡したマウスを仰向けに置き、７０％アルコー ルで毛を横向けに拭く。左下大腿部から腹部へと、はさみを用いる最初の皮膚の 切開を行い、次いで、胸部を切る。腹部から右の下大腿部への切開により切開を 完了する。腹膜を貫通しないように注意すべきである。鉗子で皮膚を固定し、含 むから皮膚を静かに引っ張る。腹膜を覆っているが通常には筋肉シートを完全に は貫通していない、露出した膿瘍を切除するが、内蔵を傷つけないように注意す る。 液体窒素中での迅速凍結の前に、膿瘍／筋肉シートおよび他の感染組織を切片 化する必要があるかもしれない。切片化によりプラスチック製収集バイアル中で の保存が容易となる。 ｉｉ）ネズミの血液原性腎盂腎炎モデルからの、スタフィロコッカス・アウレ ウスＷＣＵＨ２９感染組織の単離。５ｍｌのトリプシン消化ソイブロス(ＴＳＢ) 中の単一コロニーからエス・アウレウスの一晩培養を開始し、３７℃で振盪しな がら増殖させた。ついで、培養物を滅菌リン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ）で ２回洗浄し、Ａ６００＝０．３まで希釈した。ツベルクリン注射筒に付けた３０ ｇの注射針を用いてこの懸濁液０．２ｍｌを尾の静脈に注射することによりオス のＣＤ−１マウス（体重１８〜２０ｇ）に感染させた。このやりかたで各マウス に約４ｘ１０⁷個の細菌を与える。疾病の徴候についてマウスをモニターし、通 常には４８時間以内に昏睡、逆立った毛、不活発といった徴候が現れ、瀕死と思 われる動物を実験終了前に安楽死させる。 感染７日後にすべての動物を二酸化炭素過剰投与により安楽死させる。動物を 仰向けに置き、エタノール、ついでＲＮＡＺａｐで拭き、さらに器具を同様に拭 く。腹部を切開し、腎臓を無菌的に切除し、４片に切断し、凍結バイアル中に入 れ、液体窒素中で即座に凍結する。 ｂ）感染組織試料からのスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９ ＲＮＡ の単離 ２ｍｌの凍結保存チューブ中の感染組織試料を液体窒素中から取り出して即座 に凍結組織を処理する。微生物学的安全キャビネット中で試料を１度に８片にま で破壊する。組織試料中の細菌を破壊するために、５０〜１００ｍｇの組織をシ リカ／セラミックマトリックス（BIO 101）の入ったFastRNAチューブに移す。即 座に１ｍｌの抽出試薬（FastRNA試薬，BIO 101）を添加して、試薬に対する試料 の割合を約１対２０とする。チューブを往復式振盪装置（FastPrep FP120，BIO 101）（５．５〜６にセット）で２０〜１２０秒間振盪する。粗ＲＮＡ標品をク ロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、DEPC処理水／イソプロパノール沈 殿溶液（BIO 101）で沈殿させる。必要ならば、ＲＮＡ標品をこのイソプロパノ ール溶液中、−８０℃で保存する。ＲＮＡをペレット化させ（１２０００ｇで１ ０分）、７５％（DEPC処理水中ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、５〜１０分風乾し 、ついで、DEPC処理水０．１ｍｌ中に再懸濁する。 ＲＴ−ＰＣＲにより長さ２ｋｂまでの細菌転写物を検出できるかどうかにより 、単離されたＲＮＡの品質を評価する（下記セクションに記載のごとく）。感染 組織からの細菌ＲＮＡの単離を示すために、ＲＮＡ試料を逆転写し、TaqManプロ ーブの存在下で定量的ＰＣＲを用いることにより構成的に発現される遺伝子の存 在を検出する（下記のごとく）。 ｃ）スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９由来のＲＮＡからのＤＮＡの 除去 最終体積５７マイクロリットルのバッファー中１０ユニットのＲＮＡａｓｅ不 含ＤＮＡａｓｅＩ（GeneHunter）を用い、３７℃で３０分処理することにより、 ５０マイクログラムのＲＮＡ試料からＤＮＡを除去する。 フェノール：クロロホルム抽出によりＤＮＡａｓｅを不活性化させ、除去する 。３Ｍ ＮａＯＡｃ ５マイクロリットルおよび１００％ ＥｔＯＨ ２００マイク ロリットルを用いてＲＮＡを沈殿させ、１２０００ｇで１０分間の遠心分離によ りペレット化させる。ＲＮＡをペレット化させ（１２０００ｇで１０分間）、７ ５％（DEPC処理水中ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、５〜１０分風乾し、１０〜２ ０マ イクロリットルのDEPC処理水中に再懸濁する。きれいにしたＲＮＡ試料を１：１ ０００に希釈後、ＲＮＡ収量をＯＤ２６０により定量する。必要ならば、ＲＮＡ を−８０℃で保存し、１週間以内に逆転写する。 ｄ）感染組織由来のＲＮＡ試料からのｃＤＮＡの調製 ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡの試料１０マイクロリットルを、製造者の指示に 従ってSuperScript Preamplification System for First Strand cDNA systhes is kit(Gibco BRL,Life Technologies)を用いて逆転写する。１ナノグラムのラ ンダムヘキサマーを用いて各反応を開始させる。SuperScriptII逆転写酵素を添 加しない対照も同様に反応させる。＋ＲＴおよび−ＲＴ双方の試料をＲＮａｓｅ Ｈで処理し、ついで、ＰＣＲ反応を行う。 ｅ）感染組織由来の細菌ＲＮＡの品質を調べるためのＰＣＲの使用 ペニシリン結合蛋白２（ＰＢＰ２）のように細菌細胞中で低コピー数であると 考えられる長い転写物を、上記のようにランダムプライマーを用いて逆転写し、 ＯＦＲ特異的プライマーを用いる下記ＰＣＲ法により増幅して、抽出および精製 を経て得られたｍＲＮＡの品質を、増幅された長さにより評価する。 ０．２ｍｌのチューブ中、下記成分（最終濃度）を添加することにより全体積 を５０μｌとして、氷上でＰＣＲ反応をセットアップする：AmpliTaq PCR Buffe r II(1X)、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．５μＭの順方向 プライマー、０．５μＭの逆方向プライマー、２μｌの逆転写されたＲＮＡ。PE GeneAmp PCR System 9600によりＰＣＲ反応を行う。９４℃で２分の最初の工程 、ついで、９４℃で３０秒、４２℃で３０秒、７２℃で３０秒を３５サイクル、 ついで、７２℃で７分の最終伸長を行う。 ｆ）細菌ｃＤＮＡ種の存在を調べるためのＰＣＲの使用 ＯＲＦ特異的順方向および逆方向プライマー各０．５マイクロＭを使用してＰ ＣＲ反応をセットアップする。 ２０マイクルリットルの部分試料中のＰＣＲ生成物を、１ないし１．５％１ｘ ＴＢＥアガロースゲルまたは１０％１ｘＴＢＥアイルアミドゲルを用いて電気泳 動することにより分離する。１００ｂｐのＤＮＡラダー（Gibco BRL,Life Techn ologies）と比較することによりサイズ評価を行う。別法として、標識ＰＣＲプ ライマー（例えば、５’末端を色素で標識したもの）を用いてＰＣＲ生成物を慣 用的に標識し、ＰＣＲ生成物の適当な部分試料をポリアクリルアミド配列決定用 ゲルで泳動し、適当なゲルスキャンニングシステム（例えば、Perkin Elmerによ り供給されるGeneScan TMソフトウェアを用いるABI Prism TM 377シーケンサー ）を用いてその存在および量を調べる。 ＲＴ／ＰＣＲ対照は、＋／−逆転写酵素反応物、１６Ｓ ｒＲＮＡプライマー 、または転写されていにスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９のゲノム 配列からＰＣＲ生成物を得るように設計されたＤＮＡ特異的プライマーペアーを 含んでいてもよい。 プライマーペアーの効率を試験するために、それらをスタフィロコッカス・ア ウレウスＷＣＵＨ２９の全ＤＮＡを用いるＤＮＡ ＰＣＲに使用する。ＰＣＲ反 応をセットアップし、ｃＤＮＡのかわりに約１マイクログラムのＤＮＡを用いて 上記のごとく３５サイクルのｐＣＲを行う。 ＤＮＡ ＰＣＲにおいてもＲＴ／ＰＣＲにおいても予想サイズの生成物を生じ ないプライマーペアーはＰＣＲ不適であり、そのようなものとして情報が得られ ない。ＤＮＡ ＰＣＲを用いた場合正しいサイズの生成物を生じるもののうち、 ２つのクラスがＲＴ／ＰＣＲにおいて識別される：１．インビボで複製的に転写 されない遺伝子はＲＴ／ＰＣＲにおいて生成物を生じないもの；２．インビボで 複製的に転写される遺伝子はＲＴ／ＰＣＲにおいて正しいサイズの生成物を生じ 、−ＲＴ対照におけるシグナル（存在する場合に）よりも強いシグナルを＋ＲＴ 試料において示すもの。 ｇ）細菌ｃＤＮＡ種の存在を調べるためのＰＣＲおよび蛍光発生プローブの使用 PE Applied Biosystems 7700 Sequence Detection Systemにおいて、５’およ び３’末端をそれぞれリポーターおよびクエンチャー色素で標識されたオリゴヌ クレオチドプローブ（FQプローブ）（２個のＰＣＲプライマー間にアニールする ）の存在下での標的配列の増幅により、特異的配列の検出を行う。プローブがプ ライマー間に結合した場合にのみ特異的生成物のみが検出されるであろう。ＰＣ Ｒ増幅が進行するにつれ、Ｔａｑポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性は、ま ず、リポーター色素をプローブから開裂する。リポーター色素がクエンチャー色 素から物理的に分離される際に発生するシグナルは、装備されたＣＣＤカメラを 用いてシグナルを測定することにより検出される。発生する各シグナルは開裂さ れた１つのプローブと等価であり、１本の標的鎖の増幅に対応する。 添付説明書に従ってPE Applied Biosystems TaqMan PCR Core Reagent Kitを 用いてＰＣＲ反応をセットアップして、最終体積４５マイクロリットルの各反応 系が５マイクロリットルの１０Ｘ ＰＣＲバッファーＩＩ、７マイクロリットル の２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５マイクロリットルの３００ｎＭ 順方向プライマー、 ５マイクロリットルの逆方向プライマー、５マイクロリットルの特異的ＦＱプロ ーブ、１マイクロリットルの１０ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＣＴＰ、１０ｍＭ ｄＧＴＰおよび２０ｍＭ ｄＵＴＰ、１３．２５マイクロリトルの蒸留水、０． ５マイクロリットルのAmpErase UNG、および０．２５マイクロリトルのAmpliTaq DNAポリメラーゼを含むようにする。 下記の温度サイクリング条件下で増幅を行う：５０℃に２分保持、９５℃に１ ０分保持、ついで、９５℃で１５秒、６０℃で１分を４０サイクル、ついで、試 料を回収するまで２５℃に保持。検出をリアルタイムで行う。反応終了時にデー タを集める。 これらの分析に基づいて、スタフィロコッカス・アウレウスのアミノアシラー ゼ遺伝子がインビボで転写されたことが見いだされた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (71)出願人 ブリガム・アンド・ウイメンズ・ホスピタ ル アメリカ合衆国マサチューセッツ州ボスト ン、ロングウッド・アベニュー350番 (71)出願人 バイラス・リサーチ・インスティテュート アメリカ合衆国マサチューセッツ州ケンブ リッジ、モールトン・ストリート61番 (72)発明者 パーマー，レスリー アメリカ合衆国19403ペンシルベニア州オ ーデュボン、イーグルビル・ロード2820番 (72)発明者 プラット，ジュリー・エム イギリス、エルイー18・１エヌピー、ウィ グストン・レイチェスター、ハイフィール ド・ドライブ77番 (72)発明者 ロネット，マイケル・エイ アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カ レッジビル、ビクトリア・サークル18番 (72)発明者 ホッジソン，ジョン・イー フランス、エフ―75020パリ、クール・ド ゥ・バンサンヌ35番 (72)発明者 ニコラス，リチャード・オー アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カ レッジビル、カーメン・ドライブ355番 (72)発明者 ビーティー，デイビッド・ティ アメリカ合衆国02131マサチューセッツ州 ボストン、ネポンセット・コート10番 (72)発明者 デレシーウィッツ，ロバート・エル アメリカ合衆国02115マサチューセッツ州 ボストン、ロングウッド・アベニュー181 番 (72)発明者 ロウ，エイドリアン アメリカ合衆国02146マサチューセッツ州 ブライトン、ストラスモア・ロード89番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ｉ）配列番号：２または４の全長にわたって配列番号：２または４のア ミノ酸配列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、また は （ｉｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列である単離ポリペプチド；お よび （ｖｉ）配列番号：１または３のポリヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌ クレオチドによりコードされるポリペプチド からなる群より選択される単離ポリペプチド。 ２．（ｉ）配列番号：２または４の全長にわたって配列番号：２または４のア ミノ酸配列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌ クレオチド； （ｉｉ）配列番号：２または４のポリペプチドをコードしているヌクレオチド 配列に対してその全長にわたって少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｉｉｉ）配列番号：１または３の全長にわたって配列番号：１または３のヌ クレオチド配列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｉｖ）配列番号：２または４のポリペプチドをコードしているヌクレオチド 配列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｖ）配列番号：１または３のポリヌクレオチドである単離ポリヌクレオチド 。 （ｖｉ）厳密なハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１または３の配列 またはそのフラグメントの配列を有する標識プローブを用いて適当なライブラリ ーをスクリーニングすることにより得ることのできる単離ポリヌクレオチド； （ｖｉｉ）スタフィロコッカス・アウレウス中に含まれるａｍａ遺伝子により 発現される成熟ポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチド；および （ｖｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）ま たは（ｖｉｉ）の該単離ポリヌクレオチドに対して相捕的なポリヌクレオチド配 列 からなる群より選択される単離ポリヌクレオチド。 ３．請求項１のポリペプチドに対して抗原性のある、あるいは免疫特異的な抗 体。 ４．個体の治療方法であって、 （ｉ）（ａ）請求項１のポリペプチドに対する治療上有効量のアゴニストを個 体に投与すること；または （ｂ）インビボで請求項１のポリペプチドの活性を生じるような形態の、請 求項１のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌ クレオチドを個体に提供すること を含む、請求項１のポリペプチドの活性または発現の促進を必要とする個体の治 療方法；あるいは （ｉｉ）（ａ）請求項１のポリペプチドに対する治療上有効量のアンタゴニス トを個体に投与すること；または （ｂ）請求項１のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の発 現を阻害する核酸分子を個体に投与すること；または （ｃ）リガンド、基質、または受容体を求めて請求項１のポリペプチドと競 争する治療上有効量のポリペプチドを個体に投与すること を含む、請求項１のポリペプチドの活性または発現の阻害を必要とする個体 の治療方法。 ５．個体における請求項１のポリペプチドの発現または活性に関連した、個体 における疾病またはかかる疾病に対する感受性の診断または予後の方法であって 、下記工程： （ａ）該個体のゲノム中の該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列 における変異の存在または不存在を決定すること；または （ｂ）該個体由来の試料中の該ポリペプチドの発現の存在または量を分析する こと を含む方法。 ６．請求項１のポリペプチドの機能を活性化または阻害する化合物を同定する ためのスクリーニング方法であって、 （ａ）候補化合物に直接または間接的に結合した標識を用いてポリペプチドま たはポリペプチドを有する細胞もしくは膜またはその融合蛋白への候補化合物の 結合を測定すること； （ｂ）標識競争物質の存在下でポリペプチドまたはポリペプチドを有する細胞 もしくは膜またはその融合蛋白への候補化合物の結合を測定すること； （ｃ）ポリペプチドを有する細胞もしくは細胞膜に適する検出系を用いて、候 補化合物がポリペプチドの活性化または阻害により発生するシグナルを生じさせ るかどうかを試験すること； （ｄ）候補化合物と、請求項１のポリペプチドを含有する溶液とを混合して混 合物を作成し、混合物中のポリペプチドの活性を測定し、次いで、混合物の活性 を標準と比較すること； （ｅ）例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて細胞中で該ポリペプチドをコードし ているｍＲＮＡおよび該ポリペプチドの生成に対する候補化合物の影響を検出す ること、あるいは （ｆ）（１）化合物の相互作用を評価するために、化合物とポリペプチドとの 間の相互作用を可能にする条件下でポリペプチドを含む組成物をスクリーニング すべき化合物と接触させ（かかる相互作用は、化合物とポリペプチドとの相互作 用に応答した検出可能シグナルを生じることのできる第２の成分に関連したもの である）；次いで （２）化合物とポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルの存在または 不存在を検出することにより、化合物がポリペプチドと相互作用し、その活性を 活性化または阻害するかどうかを決定すること からなる群から選択される方法を含む方法。 ７．請求項１のポリペプチドの活性または発現についてのアゴニストまたはア ンタゴニスト。 ８．適合する宿主中に存在する場合に、請求項１のポリペプチドを生成する能 力のあるポリヌクレオチドを含む発現系。 ９．（ｉ）配列番号：２または４の全長にわたって配列番号：２または４のア ミノ酸配列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、また は （ｉｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列である単離ポリペプチド；お よび （ｖｉ）配列番号：１または３のポリヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌ クレオチドによりコードされるポリペプチド からなる群より選択されるポリペプチドを発現する、請求項８の発現系を含む宿 主細胞またはその膜。 １０．（ｉ）配列番号：２または４の全長にわたって配列番号：２または４の アミノ酸配列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、また は （ｉｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列である単離ポリペプチド；お よび （ｖｉ）配列番号：１または３のポリヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌ クレオチドによりコードされるポリペプチド からなる群より選択されるポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドの 生成に十分な条件下で請求項９の宿主細胞を培養することを含む方法。 １１．（ｉ）配列番号：２または４の全長にわたって配列番号：２または４の アミノ酸配列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、また は （ｉｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列である単離ポリペプチド；お よび （ｖｉ）配列番号：１または３のポリヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌ クレオチドによりコードされるポリペプチド からなる群より選択されるポリペプチドを発現する、請求項８の発現系を含む宿 主細胞またはその膜の製造方法であって、適合宿主中に存在する場合に上記ポリ ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）を生成可能なポリヌクレ オチドを含む発現系で細胞を形質転換またはトランスフェクションして、適当な 培養条件下で宿主細胞が上記ポリペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または （ｉｖ）を生成するようにすることを含む方法。 １２．（ｉ）配列番号：２または４の全長にわたって配列番号：２または４の アミノ酸配列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、また は （ｉｉｉ）配列番号：２または４のアミノ酸配列である単離ポリペプチド；お よび （ｖｉ）配列番号：１または３のポリヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌ クレオチドによりコードされるポリペプチド からなる群より選択されるポリペプチドを発現する、請求項１１の方法により製 造される宿主細胞またはその膜。 １３．配列番号：１または３の配列を含むポリヌクレオチド；配列番号：２ま たは４の配列を含むポリペプチド；少なくとも１つの配列が配列番号：１または ３の配列を含むものであるポリヌクレオチド配列のセット；少なくとも１つの配 列が配列番号：２または４の配列を含むものであるポリペプチド配列のセット； 配列番号：１または３の配列を含むポリヌクレオチド配列を表すデータセット； 配列番号：２または４の配列を含むポリペプチド配列をコードしているポリヌク レオチド配列を表すデータセット；配列番号：１または３の配列を含むポリヌク レオチド；配列番号：２または４の配列を含むポリペプチド；少なくとも１つの 配列が配列番号：１または３の配列を含むものであるポリヌクレオチド配列のセ ット；少なくとも１つの配列が配列番号：２または４の配列を含むものであるポ リペプチド配列のセット；配列番号：１または３の配列を含むポリヌクレオチド 配列を表すデータセット；配列番号：２または４の配列を含むポリペプチド配列 をコードしているポリヌクレオチド配列を表すデータセットからなる群より選択 されるメンバーを保存したコンピューター読み込み可能媒体。 １４．相同性の同定を行うためのコンピューターによる方法であって、 配列番号：１または３の配列を含むポリヌクレオチド配列をコンピューター読み 込み可能媒体中に提供し、次いで、該ポリヌクレオチド配列を少なくとも１つの ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同定する工程を含 む方法。 １５．ポリクレオチドアッセンブリーのためのコンピューターによる方法であ って、配列番号：１または３の配列を含むポリヌクレオチド配列をコンピュータ ー読み込み可能媒体中に提供し、次いで、該ポリヌクレオチド配列と少なくとも １つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列とを比較する工程を含む方法。 １６．（ａ）配列番号：３の全長にわたって配列番号：３に対して少なくとも ７０％、８０％、９０％、９５％、９７％の同一性を有するヌクレオチド配列を 含む単離ポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：３のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：３のポリヌクレオチド；または （ｄ）配列番号：４の全長にわたって配列番号：４のアミノ酸配列に対して少 なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７〜９９％の同一性を有するポリ ペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド からなる群より選択される単離ポリヌクレオチド。 １７．（ａ）配列番号：４の全長にわたって配列番号：４のアミノ酸配列に対 して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７〜９９％の同一性を有す るアミノ酸配列を含むポリペプチド； （ｂ）配列番号：４の全長にわたって配列番号：４のアミノ酸配列に対して少 なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７〜９９％同一であるアミノ酸配 列を有するポリペプチド； （ｃ）配列番号：４のアミノ酸を含むポリペプチド； （ｄ）配列番号：４のポリペプチドであるポリペプチド （ｅ）配列番号：３に含まれる配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ るポリペプチド からなる群より選択されるポリペプチド。 １８．式： Ｘ−（R₁）_m−（R₂）−（R₃）_n−Ｙ ［式中、分子の５’末端のＸは水素または金属、または修飾ヌクレオチド残基で あるか、あるいはＹと一緒になって共有結合を形成し、分子の３’末端のＹは水 素または金属、または修飾ヌクレオチド残基であるか、あるいはＸと一緒になっ て共有結合を形成し、Ｒ₁およびＲ₃は、各々、独立していずれかの核酸残基また は修飾核酸残基であり、ｍは１〜３０００の整数または０であり、ｎは１〜３０ ００の整数または０であり、Ｒ₂は配列番号：１または３に示す核酸配列または 修飾核酸配列を意味する］ で示されるポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド。