JPH11285390A - 新規アルコールデヒドロゲナーゼ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドお
よびアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドをコード
しているＤＮＡ（ＲＮＡ）、および組み換え法によるか
かるポリペプチドの製造方法、ならびに感染、詳細には
細菌感染に対する防御のためのアルコールデヒドロゲナ
ーゼポリペプチドの使用方法を提供する。 【解決手段】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して少
なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド、ならびに配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペ
プチドコードしているポリヌクレオチドに対して少なく
とも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド。
よびアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドをコード
しているＤＮＡ（ＲＮＡ）、および組み換え法によるか
かるポリペプチドの製造方法、ならびに感染、詳細には
細菌感染に対する防御のためのアルコールデヒドロゲナ
ーゼポリペプチドの使用方法を提供する。 【解決手段】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して少
なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド、ならびに配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペ
プチドコードしているポリヌクレオチドに対して少なく
とも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにそれら
の製造および使用、ならびにそれらの変種、アゴニスト
およびアンタゴニスト、そしてそれらの使用に関する。
詳細には、これらの点および他の点に関して、本発明
は、デヒドロゲナーゼファミリーの新規ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチド（以下、「アルコールデヒドロゲ
ナーゼ」という）に関する。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにそれら
の製造および使用、ならびにそれらの変種、アゴニスト
およびアンタゴニスト、そしてそれらの使用に関する。
詳細には、これらの点および他の点に関して、本発明
は、デヒドロゲナーゼファミリーの新規ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチド（以下、「アルコールデヒドロゲ
ナーゼ」という）に関する。
【０００２】
【従来の技術】ストレプトコッカス属（Streptococci）
は医学的に重要な微生物属を形成しており、ヒトにおい
て、例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静
脈洞炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には例えば脳脊
髄液の感染のごとき髄膜炎を包含する、いくつかの型の
疾患を引き起こすことが知られている。ストレプトコッ
カス属の単離から１００年以上も経過しているため、ス
トレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pn
eumoniae）は、より詳細な研究がなされた微生物の一つ
である。例えば、事実、ＤＮＡが遺伝物質であるという
初期の見解の大部分は、この微生物を用いたGriffithな
らびに、Avery、MacleodおよびMcCartyの研究において
述べられた。ストレプトコッカス・ニューモニアエに関
する研究は膨大であるにも関わらず、この微生物の毒性
に関しては多くの疑問が残されている。抗生物質の開発
のための標的としてストレプトコッカス属の遺伝子およ
び遺伝子産物を用いるのはとりわけ好ましいことであ
る。
は医学的に重要な微生物属を形成しており、ヒトにおい
て、例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静
脈洞炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には例えば脳脊
髄液の感染のごとき髄膜炎を包含する、いくつかの型の
疾患を引き起こすことが知られている。ストレプトコッ
カス属の単離から１００年以上も経過しているため、ス
トレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pn
eumoniae）は、より詳細な研究がなされた微生物の一つ
である。例えば、事実、ＤＮＡが遺伝物質であるという
初期の見解の大部分は、この微生物を用いたGriffithな
らびに、Avery、MacleodおよびMcCartyの研究において
述べられた。ストレプトコッカス・ニューモニアエに関
する研究は膨大であるにも関わらず、この微生物の毒性
に関しては多くの疑問が残されている。抗生物質の開発
のための標的としてストレプトコッカス属の遺伝子およ
び遺伝子産物を用いるのはとりわけ好ましいことであ
る。
【０００３】ストレプトコッカス・ニューモニアエ感染
の頻度は過去２０年間に劇的に上昇している。これは多
重抗生物質耐性株の出現、および免疫系が低下した人の
集団の増加に起因している。いくつかのまたは全ての標
準的な抗生物質に対して耐性を有するストレプトコッカ
ス・ニューモニアエ株を単離することはもはやめずらし
いことではない。この現象がこの生物に対する新しい抗
菌剤、ワクチンおよび診断試験についての必要性を形成
した。
の頻度は過去２０年間に劇的に上昇している。これは多
重抗生物質耐性株の出現、および免疫系が低下した人の
集団の増加に起因している。いくつかのまたは全ての標
準的な抗生物質に対して耐性を有するストレプトコッカ
ス・ニューモニアエ株を単離することはもはやめずらし
いことではない。この現象がこの生物に対する新しい抗
菌剤、ワクチンおよび診断試験についての必要性を形成
した。
【０００４】病原性に関連したある種のストレプトコッ
カスの因子、例えば、きょう膜多糖、ペプチドグリカ
ン、ニューモリシン、ＰｓｐＡ補体因子Ｈ結合成分、オ
ートリシン、ノイラミニダーゼ、ペプチドパーメアー
ゼ、過酸化水素、ＩｇＡ１プロテアーゼが同定されてい
るが、それらがすべてではない。さらに、哺乳動物宿主
における感染および疾病の進行中におけるかかる遺伝子
の一時的発現に関してはほとんどわかっていない。細菌
は感染の異なる段階、詳細には感染が確立された時に発
現される可能性がある細菌の遺伝子のセットを発見する
ことは、発症を妨害しうる新規抗微生物剤のスクリーニ
ングおよび特徴づけに関する重要な情報を提供する。か
かるアプローチは、既知蛋白についてのより十分な理解
を提供することのほかに、従来認識されていなかった標
的を同定するであろう。デヒドロゲナーゼ酵素は、アミ
ノ酸生合成および分解、ＴＣＡ回路、脂肪酸酸化および
生合成を包含する多くの酸化−還元反応に関与してい
る。約２００種またはそれ以上のピリジン結合デヒドロ
ゲナーゼが知られており、それらはＮＡＤまたはＮＡＤ
Ｐを補酵素として用いる。ＮＡＤまたはＮＡＤＰの酵素
による還元を、少なくとも３つの便利に測定される特徴
のいずれかにより測定することができる。還元後、両補
酵素はそれらの吸収スペクトルを酸化型の２６０ｎｍか
ら還元型の３４０ｎｍへと変化させる。さらに、還元に
よりプロトンの放出が起こり、それをｐＨの変化として
測定することができる。別法として、蛍光測定により反
応を追跡することもできる。ＦＡＤをコファクターとし
て用いる他のデヒドロゲナーゼも存在する。これらの酵
素は細菌の代謝において重要な役割を果たしており、そ
れゆえ、これらの蛋白の阻害剤は、細菌が宿主感染を確
立し維持することを妨害し、それゆえ、抗細菌療法にお
いて有用である。
カスの因子、例えば、きょう膜多糖、ペプチドグリカ
ン、ニューモリシン、ＰｓｐＡ補体因子Ｈ結合成分、オ
ートリシン、ノイラミニダーゼ、ペプチドパーメアー
ゼ、過酸化水素、ＩｇＡ１プロテアーゼが同定されてい
るが、それらがすべてではない。さらに、哺乳動物宿主
における感染および疾病の進行中におけるかかる遺伝子
の一時的発現に関してはほとんどわかっていない。細菌
は感染の異なる段階、詳細には感染が確立された時に発
現される可能性がある細菌の遺伝子のセットを発見する
ことは、発症を妨害しうる新規抗微生物剤のスクリーニ
ングおよび特徴づけに関する重要な情報を提供する。か
かるアプローチは、既知蛋白についてのより十分な理解
を提供することのほかに、従来認識されていなかった標
的を同定するであろう。デヒドロゲナーゼ酵素は、アミ
ノ酸生合成および分解、ＴＣＡ回路、脂肪酸酸化および
生合成を包含する多くの酸化−還元反応に関与してい
る。約２００種またはそれ以上のピリジン結合デヒドロ
ゲナーゼが知られており、それらはＮＡＤまたはＮＡＤ
Ｐを補酵素として用いる。ＮＡＤまたはＮＡＤＰの酵素
による還元を、少なくとも３つの便利に測定される特徴
のいずれかにより測定することができる。還元後、両補
酵素はそれらの吸収スペクトルを酸化型の２６０ｎｍか
ら還元型の３４０ｎｍへと変化させる。さらに、還元に
よりプロトンの放出が起こり、それをｐＨの変化として
測定することができる。別法として、蛍光測定により反
応を追跡することもできる。ＦＡＤをコファクターとし
て用いる他のデヒドロゲナーゼも存在する。これらの酵
素は細菌の代謝において重要な役割を果たしており、そ
れゆえ、これらの蛋白の阻害剤は、細菌が宿主感染を確
立し維持することを妨害し、それゆえ、抗細菌療法にお
いて有用である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】明らかに、抗生物質活
性に関して化合物をスクリーニングするのに有用である
という目下の利益を有する、本発明新規化合物のごとき
因子に対する必要性がある。かかる因子は、感染、機能
不全および疾病の発生におけるそれらの役割を調べるの
にも有用である。感染、機能不全または疾病の予防、改
善または修正において役割を果たしうる、かかる因子な
らびにそれらのアンタゴニストおよびアゴニストに対す
る必要性もある。
性に関して化合物をスクリーニングするのに有用である
という目下の利益を有する、本発明新規化合物のごとき
因子に対する必要性がある。かかる因子は、感染、機能
不全および疾病の発生におけるそれらの役割を調べるの
にも有用である。感染、機能不全または疾病の予防、改
善または修正において役割を果たしうる、かかる因子な
らびにそれらのアンタゴニストおよびアゴニストに対す
る必要性もある。
【０００６】本発明ポリペプチドは、イー・コリ（E. c
oli）のアルコールデヒドロゲナーゼ蛋白に対するアミ
ノ酸配列相同性を有する。
oli）のアルコールデヒドロゲナーゼ蛋白に対するアミ
ノ酸配列相同性を有する。
【０００７】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
表１（配列番号：２）に示すアミノ酸配列および既知ア
ミノ酸配列またはイー・コリのアルコールデヒドロゲナ
ーゼ蛋白のごとき他の蛋白の配列の間の相同性により、
新規アルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドであると
同定されたポリペプチド提供することが本発明の目的で
ある。アルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドをコー
ドしているポリヌクレオチド、詳細には本明細書でアル
コールデヒドロゲナーゼと命名されたポリペプチドをコ
ードしているポリヌクレオチドを提供することが本発明
のさらなる目的である。本発明の特に好ましい具体例に
おいて、ポリヌクレオチドは、表１（配列番号：１）に
示す配列を含むアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチ
ドをコードする領域を含み、全長遺伝子またはその変種
が包含される。本発明のもう１つの特に好ましい具体例
において、表１（配列番号：２）のアミノ酸配列を含む
ストレプトコッカス・ニューモニアエ由来の新規アルコ
ールデヒドロゲナーゼ蛋白、またはその変種がある。本
発明のもう１つの態様によれば、寄託株に含まれるスト
レプトコッカス・ニューモニアエ0100993株により発現
可能な成熟ポリペプチドをコードしている単離核酸分子
が提供される。
表１（配列番号：２）に示すアミノ酸配列および既知ア
ミノ酸配列またはイー・コリのアルコールデヒドロゲナ
ーゼ蛋白のごとき他の蛋白の配列の間の相同性により、
新規アルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドであると
同定されたポリペプチド提供することが本発明の目的で
ある。アルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドをコー
ドしているポリヌクレオチド、詳細には本明細書でアル
コールデヒドロゲナーゼと命名されたポリペプチドをコ
ードしているポリヌクレオチドを提供することが本発明
のさらなる目的である。本発明の特に好ましい具体例に
おいて、ポリヌクレオチドは、表１（配列番号：１）に
示す配列を含むアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチ
ドをコードする領域を含み、全長遺伝子またはその変種
が包含される。本発明のもう１つの特に好ましい具体例
において、表１（配列番号：２）のアミノ酸配列を含む
ストレプトコッカス・ニューモニアエ由来の新規アルコ
ールデヒドロゲナーゼ蛋白、またはその変種がある。本
発明のもう１つの態様によれば、寄託株に含まれるスト
レプトコッカス・ニューモニアエ0100993株により発現
可能な成熟ポリペプチドをコードしている単離核酸分子
が提供される。
【０００８】本発明のさらなる態様は、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ、詳細にはストレプトコッカス・ニューモ
ニアエのアルコールデヒドロゲナーゼをコードしている
単離核酸分子が提供され、それにはｍＲＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡが包含される。本発明のさらなる具体
例は、生物学的、診断学的、予防的、臨床的もしくは治
療的に有用なその変種、およびそれらを含む組成物を包
含する。本発明のもう１つの態様によれば、治療または
予防を目的とした、特に遺伝学的免疫を目的とした、本
発明ポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明の特
に好ましい具体例には、アルコールデヒドロゲナーゼの
天然に存在する対立遺伝子変種およびそれによりコード
されるポリペプチドがある。
ドロゲナーゼ、詳細にはストレプトコッカス・ニューモ
ニアエのアルコールデヒドロゲナーゼをコードしている
単離核酸分子が提供され、それにはｍＲＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡが包含される。本発明のさらなる具体
例は、生物学的、診断学的、予防的、臨床的もしくは治
療的に有用なその変種、およびそれらを含む組成物を包
含する。本発明のもう１つの態様によれば、治療または
予防を目的とした、特に遺伝学的免疫を目的とした、本
発明ポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明の特
に好ましい具体例には、アルコールデヒドロゲナーゼの
天然に存在する対立遺伝子変種およびそれによりコード
されるポリペプチドがある。
【０００９】本発明のもう１つの態様において、本明細
書においてアルコールデヒドロゲナーゼと称されるスト
レプトコッカス・ニューモニアエの新規ポリペプチド、
ならびに生物学的、診断学的、予防的、臨床的もしくは
治療的に有用なそのフラグメント、変種および誘導体、
および前記したフラグメントおよびアナログの変種およ
び誘導体、およびそれらを含む組成物が提供される。本
発明の特に好ましい具体例には、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子の天然に存在する対立遺伝子によりコード
されるアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドの変種
がある。本発明の好ましい具体例において、上記アルコ
ールデヒドロゲナーゼポリペプチドの製造方法がある。
本発明のさらに別の態様によれば、例えば、抗体を含
め、抗細菌剤として有用なかかるポリペプチドの阻害剤
が提供される。
書においてアルコールデヒドロゲナーゼと称されるスト
レプトコッカス・ニューモニアエの新規ポリペプチド、
ならびに生物学的、診断学的、予防的、臨床的もしくは
治療的に有用なそのフラグメント、変種および誘導体、
および前記したフラグメントおよびアナログの変種およ
び誘導体、およびそれらを含む組成物が提供される。本
発明の特に好ましい具体例には、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子の天然に存在する対立遺伝子によりコード
されるアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドの変種
がある。本発明の好ましい具体例において、上記アルコ
ールデヒドロゲナーゼポリペプチドの製造方法がある。
本発明のさらに別の態様によれば、例えば、抗体を含
め、抗細菌剤として有用なかかるポリペプチドの阻害剤
が提供される。
【００１０】本発明の特定の好ましい具体例によれば、
アルコールデヒドロゲナーゼ発現の評価、疾病の治療、
例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞
炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液
の感染のごとき髄膜炎の治療、遺伝学的変異のアッセ
イ、ならびに細菌、特にストレプトコッカス・ニューモ
ニアエ細菌に対する免疫学的応答を生起するための生物
へのアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドの投与のための、製品、組成物および方
法が提供される。
アルコールデヒドロゲナーゼ発現の評価、疾病の治療、
例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞
炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液
の感染のごとき髄膜炎の治療、遺伝学的変異のアッセ
イ、ならびに細菌、特にストレプトコッカス・ニューモ
ニアエ細菌に対する免疫学的応答を生起するための生物
へのアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドの投与のための、製品、組成物および方
法が提供される。
【００１１】本発明のこのおよび他の態様の特定の好ま
しい具体例によれば、特に、厳密な条件下でアルコール
デヒドロゲナーゼポリヌクレオチド配列にハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチドが提供される。本発明
の特定の好ましい具体例において、アルコールデヒドロ
ゲナーゼポリペプチドに対する抗体が提供される。本発
明の他の具体例において、本発明ポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドの結合、あるいは相互作用して、それら
の活性を阻害または活性化する化合物の同定方法が提供
され、該方法は、化合物とポリペプチドまたはポリヌク
レオチドとの間の結合あるいは他の相互作用を可能にす
る条件下で、本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ドをスクリーニングすべき化合物と接触させて、化合物
との結合あるいは他の相互作用を評価し（かかる結合ま
たは相互作用は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド
と化合物との結合あるいは相互作用に応答して検出可能
なシグナルを提供することのできる第２の化合物に関連
している）、次いで、化合物とポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドとの結合または相互作用から生じるシグナ
ルの存在または不存在を検出することにより、化合物が
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合あるいは相
互作用して、それらの活性を活性化または阻害するかど
うかを決定することを含む。本発明のさらにもう１つの
態様によれば、アルコールデヒドロゲナーゼのアゴニス
トおよびアンタゴニスト、好ましくは静細菌性または殺
細菌性アゴニストおよびアンタゴニストが提供される。
本発明のさらなる態様において、単細胞または多細胞生
物に投与するための、アルコールデヒドロゲナーゼポリ
ヌクレオチドまたはアルコールデヒドロゲナーゼポリペ
プチドを含む組成物が提供される。開示した本発明の精
神および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の記
載を読むこと、および本明細書のその他の部分を読むこ
とにより、当業者に容易に明らかとなろう。
しい具体例によれば、特に、厳密な条件下でアルコール
デヒドロゲナーゼポリヌクレオチド配列にハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチドが提供される。本発明
の特定の好ましい具体例において、アルコールデヒドロ
ゲナーゼポリペプチドに対する抗体が提供される。本発
明の他の具体例において、本発明ポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドの結合、あるいは相互作用して、それら
の活性を阻害または活性化する化合物の同定方法が提供
され、該方法は、化合物とポリペプチドまたはポリヌク
レオチドとの間の結合あるいは他の相互作用を可能にす
る条件下で、本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ドをスクリーニングすべき化合物と接触させて、化合物
との結合あるいは他の相互作用を評価し（かかる結合ま
たは相互作用は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド
と化合物との結合あるいは相互作用に応答して検出可能
なシグナルを提供することのできる第２の化合物に関連
している）、次いで、化合物とポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドとの結合または相互作用から生じるシグナ
ルの存在または不存在を検出することにより、化合物が
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合あるいは相
互作用して、それらの活性を活性化または阻害するかど
うかを決定することを含む。本発明のさらにもう１つの
態様によれば、アルコールデヒドロゲナーゼのアゴニス
トおよびアンタゴニスト、好ましくは静細菌性または殺
細菌性アゴニストおよびアンタゴニストが提供される。
本発明のさらなる態様において、単細胞または多細胞生
物に投与するための、アルコールデヒドロゲナーゼポリ
ヌクレオチドまたはアルコールデヒドロゲナーゼポリペ
プチドを含む組成物が提供される。開示した本発明の精
神および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の記
載を読むこと、および本明細書のその他の部分を読むこ
とにより、当業者に容易に明らかとなろう。
【００１２】用語 以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配列によ
り形質転換もしくはトランスフェクションされた、また
は形質転換またはトランスフェクションすることのでき
る細胞である。
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配列によ
り形質転換もしくはトランスフェクションされた、また
は形質転換またはトランスフェクションすることのでき
る細胞である。
【００１３】当該分野にて周知であるように「同一性」
は、配列を比較して測定されるような、二つまたはそれ
以上のポリペプチド配列間または二つまたはそれ以上の
ポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野におい
て、「同一性」とはまた、時には、かかる配列の２つの
鎖の間の合致により決定されるような２つのポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチド配列間の関連性の程度をも意
味する。「同一性」および「類似性」はともに既知方法
により容易に算出できる（Computational Molecular Bi
ology，Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシテ
ィー・プレス、ニューヨーク、1988年；Biocomputing：
Informatics and Genome Projects，Smith,D.W.編、ア
カデミック・プレス、ニューヨーク、1993年；Computer
Analysisof Sequence Data，パートＩ，Griffin,A.M.
およびGriffin,H.G.編、ヒューマナ・プレス、ニュージ
ャージー、1994年；Sequence Analysis in Molecular B
iology，von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1987
年；およびSequence Analysis Primer，Gribskov,M.お
よびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレス、ニュー
ヨーク、1991年;およびCarillo,H.,およびLipman,D.,SI
AM J., Applied Math., 48:1073(1988)があるがこれら
に限らない）。同一性を決定するための好ましい方法
は、試験する２つの配列間で最も良く適合するように設
計される。同一性および類似性を測定する方法は、公に
利用できるコンピュータープログラムに集成されてい
る。二つの配列間の同一性および類似性を測定する好ま
しいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラム
パッケージ（Devereux,J.ら、NucleicAcids Research 1
2(1):387（1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Atsch
ul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215：403（1990）））を包含
するが、これらに限定されるものではない。一例とし
て、配列番号：１の対照ヌクレオチド配列に対して、例
えば少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチドを挙げると、そのポリヌク
レオチド配列が配列番号：１の対照ヌクレオチド酸配列
のヌクレオチド１００個ごとに５個までのヌクレオチド
の変化を含みうることを除き、そのポリヌクレオチドの
ヌクレオチド配列は対照配列と同一である。言い換える
と、対照酸配列に対して少なくとも９５％同一であるヌ
クレオチド配列を有するポリペプチドを得るためには、
対照配列中の５％までのヌクレオチドが欠失または別の
ヌクレオチドと置換されていてもよく、あるいは対照配
列中の全ヌクレオチドのうち５％までの数のヌクレオチ
ドが対照配列に挿入されたものであってもよい。対照配
列のこれらの変異は、対照ヌクレオチド配列の５’また
は３’末端位置に存在していてもよく、あるいはそれら
の末端位置の間のいずれかの位置に存在していてもく、
対照配列のヌクレオチドに散在していてもよく、あるい
は対照配列内の１個またはそれ以上の一連の群となって
いてもよい。同様に、配列番号：２の対照アミノ酸配列
に対して少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを例に挙げると、そのポ
リペプチド配列が配列番号：２の対照アミノ酸配列のア
ミノ酸１００個ごとに５個までのアミノ酸の変化を含み
うることを除き、そのポリペプチドのアミノ酸配列は対
照配列と同一である。言い換えると、対照アミノ酸配列
に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有
するポリペプチドを得るためには、対照配列中のアミノ
酸の５％までが欠失または他のアミノ酸と置換していて
もよく、あるいは対照配列中の全アミノ酸のうち５％ま
での数のアミノ酸が対照配列中に挿入されたものであっ
てもよい。対照配列におけるこれらの変化は、対照アミ
ノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置に存在して
もよく、あるいはそれらの末端間のいずれかの位置に存
在してもよく、対照配列中に散在していてもよく、ある
いは対照配列内で１個またはそれ以上の一連の群をなし
ていてもよい。
は、配列を比較して測定されるような、二つまたはそれ
以上のポリペプチド配列間または二つまたはそれ以上の
ポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野におい
て、「同一性」とはまた、時には、かかる配列の２つの
鎖の間の合致により決定されるような２つのポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチド配列間の関連性の程度をも意
味する。「同一性」および「類似性」はともに既知方法
により容易に算出できる（Computational Molecular Bi
ology，Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシテ
ィー・プレス、ニューヨーク、1988年；Biocomputing：
Informatics and Genome Projects，Smith,D.W.編、ア
カデミック・プレス、ニューヨーク、1993年；Computer
Analysisof Sequence Data，パートＩ，Griffin,A.M.
およびGriffin,H.G.編、ヒューマナ・プレス、ニュージ
ャージー、1994年；Sequence Analysis in Molecular B
iology，von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1987
年；およびSequence Analysis Primer，Gribskov,M.お
よびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレス、ニュー
ヨーク、1991年;およびCarillo,H.,およびLipman,D.,SI
AM J., Applied Math., 48:1073(1988)があるがこれら
に限らない）。同一性を決定するための好ましい方法
は、試験する２つの配列間で最も良く適合するように設
計される。同一性および類似性を測定する方法は、公に
利用できるコンピュータープログラムに集成されてい
る。二つの配列間の同一性および類似性を測定する好ま
しいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラム
パッケージ（Devereux,J.ら、NucleicAcids Research 1
2(1):387（1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Atsch
ul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215：403（1990）））を包含
するが、これらに限定されるものではない。一例とし
て、配列番号：１の対照ヌクレオチド配列に対して、例
えば少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチドを挙げると、そのポリヌク
レオチド配列が配列番号：１の対照ヌクレオチド酸配列
のヌクレオチド１００個ごとに５個までのヌクレオチド
の変化を含みうることを除き、そのポリヌクレオチドの
ヌクレオチド配列は対照配列と同一である。言い換える
と、対照酸配列に対して少なくとも９５％同一であるヌ
クレオチド配列を有するポリペプチドを得るためには、
対照配列中の５％までのヌクレオチドが欠失または別の
ヌクレオチドと置換されていてもよく、あるいは対照配
列中の全ヌクレオチドのうち５％までの数のヌクレオチ
ドが対照配列に挿入されたものであってもよい。対照配
列のこれらの変異は、対照ヌクレオチド配列の５’また
は３’末端位置に存在していてもよく、あるいはそれら
の末端位置の間のいずれかの位置に存在していてもく、
対照配列のヌクレオチドに散在していてもよく、あるい
は対照配列内の１個またはそれ以上の一連の群となって
いてもよい。同様に、配列番号：２の対照アミノ酸配列
に対して少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを例に挙げると、そのポ
リペプチド配列が配列番号：２の対照アミノ酸配列のア
ミノ酸１００個ごとに５個までのアミノ酸の変化を含み
うることを除き、そのポリペプチドのアミノ酸配列は対
照配列と同一である。言い換えると、対照アミノ酸配列
に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有
するポリペプチドを得るためには、対照配列中のアミノ
酸の５％までが欠失または他のアミノ酸と置換していて
もよく、あるいは対照配列中の全アミノ酸のうち５％ま
での数のアミノ酸が対照配列中に挿入されたものであっ
てもよい。対照配列におけるこれらの変化は、対照アミ
ノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置に存在して
もよく、あるいはそれらの末端間のいずれかの位置に存
在してもよく、対照配列中に散在していてもよく、ある
いは対照配列内で１個またはそれ以上の一連の群をなし
ていてもよい。
【００１４】「単離」とは、「人の手によって」天然の
状態から変化させられた、すなわち、天然物の場合、そ
の本来の環境から変化または除去あるいはその両方が行
われたことを意味する。例えば、天然において生体に存
在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単
離」されていないが、その天然状態で共存する物質から
分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、本明細書に用いる用語としての「単離」がなされて
いる。
状態から変化させられた、すなわち、天然物の場合、そ
の本来の環境から変化または除去あるいはその両方が行
われたことを意味する。例えば、天然において生体に存
在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単
離」されていないが、その天然状態で共存する物質から
分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、本明細書に用いる用語としての「単離」がなされて
いる。
【００１５】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、ポリ
リボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド
をも意味する。従って、「ポリヌクレオチド」は、とり
わけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領
域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混
合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならび
に一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本
鎖もしくはより典型的には二本鎖もしくは三本鎖、また
は一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮ
ＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するがこ
れらに限らない。加えて、本明細書で用いる「ポリヌク
レオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤ
ＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。かかる領域に
おける鎖は同一の分子または異なる分子由来のものでよ
い。この領域はこれらの分子の一つまたはそれ以上の全
てを含んでいてもよいが、より典型的にはいくつかの分
子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つ
は、オリゴヌクレオチドであることがしばしばである。
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」なる用語
は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有する、前
記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。このように、安
定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡま
たはＲＮＡも、本明細書が意図するろところの「ポリヌ
クレオチド」である。さらに、イノシン等の普通でない
塩基、またはトリチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡ
またはＲＮＡ（二つの例だけを示す）も、本明細書での
用語ポリペプチドである。当業者に既知の多くの有用な
目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多くの修
飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリヌク
レオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポリヌ
クレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的に
修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型細胞
および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡおよび
ＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」
は、しばしば、オリゴヌクレオチド（複数でも可）と称
される短鎖ポリヌクレオチドを包含する。
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、ポリ
リボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド
をも意味する。従って、「ポリヌクレオチド」は、とり
わけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領
域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混
合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならび
に一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本
鎖もしくはより典型的には二本鎖もしくは三本鎖、また
は一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮ
ＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するがこ
れらに限らない。加えて、本明細書で用いる「ポリヌク
レオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤ
ＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。かかる領域に
おける鎖は同一の分子または異なる分子由来のものでよ
い。この領域はこれらの分子の一つまたはそれ以上の全
てを含んでいてもよいが、より典型的にはいくつかの分
子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つ
は、オリゴヌクレオチドであることがしばしばである。
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」なる用語
は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有する、前
記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。このように、安
定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡま
たはＲＮＡも、本明細書が意図するろところの「ポリヌ
クレオチド」である。さらに、イノシン等の普通でない
塩基、またはトリチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡ
またはＲＮＡ（二つの例だけを示す）も、本明細書での
用語ポリペプチドである。当業者に既知の多くの有用な
目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多くの修
飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリヌク
レオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポリヌ
クレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的に
修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型細胞
および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡおよび
ＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」
は、しばしば、オリゴヌクレオチド（複数でも可）と称
される短鎖ポリヌクレオチドを包含する。
【００１６】本明細書で用いる「ポリペプチド」は、ペ
プチド結合により直鎖で互いに結合している２個または
それ以上のアミノ酸を含むペプチドまたは蛋白をいうの
に用いる。「ポリペプチド」は、当該分野で通常例えば
ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称され
る短鎖、および多くの型があり、当該分野で一般的に蛋
白と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、遺
伝子によりコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ
酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、プロセッ
シングおよび他の翻訳後修飾のような自然の工程によ
り、ならびに化学修飾によるものを包含する。かかる修
飾は基礎的なテキストおよびさらに詳細な論文ならびに
多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当
業者に周知である。同じタイプの修飾がポリペプチド中
にいくつかの部位に同程度または種々の程度で存在して
もよいことが理解されるであろう。修飾は、ペプチド骨
格、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシ末
端を包含するポリペプチドのいずれの場所にあってもよ
い。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、Ａ
ＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘ
ム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ
スホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、
ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋形
成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル
化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアン
カー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、蛋白加水分解プロセッシング、リン
酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、
アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介の蛋白へのアミノ酸
付加、およびユビキチネーションがある。例えば、Prot
eins-Structure and Molecular Properties、第2版、T.
E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク
（1993）に記載されている。例えば、Posttranslationa
l Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson
編、アカデミック・プレス、ニューヨーク（1983）のWo
ld,F., Posttranslational Protein Modifications：Pe
rspective and Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.
Enzymol. 182:626-646（1990）およびRattanら、Protei
n Synthesis：Posttranslational Modifications and A
ging，Ann. N. Y. Acad. Sci. 663:48-62（1992）参
照。ポリペプチドは分枝状あるいは分枝ありまたはなし
の環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝状か
つ環状のポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから生
じるものであってもよく、同様に全く合成的な方法によ
り製造されるものであってもよい。
プチド結合により直鎖で互いに結合している２個または
それ以上のアミノ酸を含むペプチドまたは蛋白をいうの
に用いる。「ポリペプチド」は、当該分野で通常例えば
ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称され
る短鎖、および多くの型があり、当該分野で一般的に蛋
白と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、遺
伝子によりコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ
酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、プロセッ
シングおよび他の翻訳後修飾のような自然の工程によ
り、ならびに化学修飾によるものを包含する。かかる修
飾は基礎的なテキストおよびさらに詳細な論文ならびに
多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当
業者に周知である。同じタイプの修飾がポリペプチド中
にいくつかの部位に同程度または種々の程度で存在して
もよいことが理解されるであろう。修飾は、ペプチド骨
格、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシ末
端を包含するポリペプチドのいずれの場所にあってもよ
い。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、Ａ
ＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘ
ム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ
スホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、
ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋形
成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル
化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアン
カー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、蛋白加水分解プロセッシング、リン
酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、
アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介の蛋白へのアミノ酸
付加、およびユビキチネーションがある。例えば、Prot
eins-Structure and Molecular Properties、第2版、T.
E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク
（1993）に記載されている。例えば、Posttranslationa
l Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson
編、アカデミック・プレス、ニューヨーク（1983）のWo
ld,F., Posttranslational Protein Modifications：Pe
rspective and Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.
Enzymol. 182:626-646（1990）およびRattanら、Protei
n Synthesis：Posttranslational Modifications and A
ging，Ann. N. Y. Acad. Sci. 663:48-62（1992）参
照。ポリペプチドは分枝状あるいは分枝ありまたはなし
の環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝状か
つ環状のポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから生
じるものであってもよく、同様に全く合成的な方法によ
り製造されるものであってもよい。
【００１７】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の変化は、対照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。以下に論じるように、ヌクレオチ
ドの変化は結果的に、対照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合およ
び末端切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別
の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的
には、差異は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、
全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一なもの
に限られる。変種および対照ポリペプチドは、１または
それ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせで起こ
ることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換または
挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コードによりコー
ドされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドの変種は、例えば対立遺伝子変種
のような自然発生的なものでもよく、または自然発生す
ることが知られていない変種でもよい。ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの非自然発生変種は、突然変異技
術または直接的合成、および当業者に知られた他の組み
換え法により製造できる。
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の変化は、対照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。以下に論じるように、ヌクレオチ
ドの変化は結果的に、対照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合およ
び末端切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別
の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的
には、差異は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、
全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一なもの
に限られる。変種および対照ポリペプチドは、１または
それ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせで起こ
ることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換または
挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コードによりコー
ドされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドの変種は、例えば対立遺伝子変種
のような自然発生的なものでもよく、または自然発生す
ることが知られていない変種でもよい。ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの非自然発生変種は、突然変異技
術または直接的合成、および当業者に知られた他の組み
換え法により製造できる。
【００１８】本発明は、とりわけ、以下に非常に詳細に
説明する、新規アルコールデヒドロゲナーゼポリペプチ
ドおよびポリヌクレオチドに関する。詳細には、本発明
は、イー・コリのアルコールデヒドロゲナーゼポリペプ
チドに対するアミノ酸配列相同性により関連付けられ
る、ストレプトコッカス・ニューモニアエの新規アルコ
ールデヒドロゲナーゼのポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドに関する。Genebank受託番号Ｕ７５４８３参照。
特に本発明は、それぞれ表１（配列番号：１）および表
１（配列番号：２）に示すヌクレオチド配列およびアミ
ノ酸配列を有するアルコールデヒドロゲナーゼに関し、
さらに寄託株中のＤＮＡのアルコールデヒドロゲナーゼ
ヌクレオチド配列およびそれによりコードされるアミノ
酸配列に関する。
説明する、新規アルコールデヒドロゲナーゼポリペプチ
ドおよびポリヌクレオチドに関する。詳細には、本発明
は、イー・コリのアルコールデヒドロゲナーゼポリペプ
チドに対するアミノ酸配列相同性により関連付けられ
る、ストレプトコッカス・ニューモニアエの新規アルコ
ールデヒドロゲナーゼのポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドに関する。Genebank受託番号Ｕ７５４８３参照。
特に本発明は、それぞれ表１（配列番号：１）および表
１（配列番号：２）に示すヌクレオチド配列およびアミ
ノ酸配列を有するアルコールデヒドロゲナーゼに関し、
さらに寄託株中のＤＮＡのアルコールデヒドロゲナーゼ
ヌクレオチド配列およびそれによりコードされるアミノ
酸配列に関する。
【００１９】 表１ アルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列 (A) ストレプトコッカス・ニューモニアエのアルコールデヒドロゲ ナーゼポリヌクレオチド配列由来の配列 [配列番号：1]. 5'-1 ATGATTAATC AAATTTATCA ACTAACTAAG CCTAAGTTTA TCAATGTCAA 51 ATATCAGGAA GAGGCTATTG ACCAAGAGAA TCATATCCTT ATCCGTCCCA 101 ACTACATGGC TGTCTGTCAT GCGGATCAGC GTTACTATCA GGGAAAACGT 151 GATCCCAAGA TTTTGAATAA AAAGCTTCCA ATGGCAATGA TTCACGAGTC 201 ATGTGGAACC GTCATTTCTG ACCCGACCGG AACCTACGAG GTTGGTCAAA 251 AAGTTGTCAT GATTCCCAAT CAGTCTCCTA TGCAGAGTGA TGAAGAATTC 301 TATGAAAACT ACATGACAGG GACCCATTTC TTGTCTAGTG GATTTGATGG 351 CTTTATGAGA GAGTTTGTTT CTCTCCCTAA AGATCGTGTG GTGGCTTATG 401 ATGCTATTGA AGATACGGTT GCAGCCATTA CAGAGTTTGT CAGTGTGGGC 451 ATGCACGCTA TGAATCGTCT ATTGACTCTT GCTCATAGCA AGCGGGAGCG 501 GATCGCCGTT ATTGGAGATG GGAGTTTAGC TTTTGTGGTT GCCAATATTA 551 TCAACTATAC TTTGCCAGAA GCAGAGATTG TGGTTATTGG TCGTCATTGG 601 GAAAAGTTGG AACTCTTCTC ATTTGCCAAA GAATGCTATA TTACGGATAA 651 TATTCCTGAA GATTTGGCCT TTGACCATGC TTTTGAATGT TGTGGTGGTG 701 ATGGTACTGG ACCAGCTATT AATGACTTGA TTCGCTACAT TCGTCCTCAG 751 GGAACGATTC TCATGATGGG AGTTAGCGAA TATAAAGTCA ATCTCAATAC 801 TCGCGATGCC TTAGAAAAGG GCTTGATTTT GGTTGGGTCA TCTCGTTCTG 851 GTCGCATTGA TTTTGAAAAT GCTATCCAAA TGATGGAAGT CAAGAAATTT 901 GCCAATCGTC TTAAAAATAT CCTTTATCTA GAAGAACCTG TAAGAGAAAT 951 TAAAGATATT CATCGTGTCT TTGCAACCGA TTTAAACACA GCCTTTAAAA 1001 CAGTGTTTAA GTGGGAAGTA TAA -3'
【００２０】 (B) この表中のポリヌクレオチド配列から推定されるアルコールデ ヒドロゲナーゼポリペプチド配列 [配列番号：2]. NH2-1 MINQIYQLTK PKFINVKYQE EAIDQENHIL IRPNYMAVCH ADQRYYQGKR 51 DPKILNKKLP MAMIHESCGT VISDPTGTYE VGQKVVMIPN QSPMQSDEEF 101 YENYMTGTHF LSSGFDGFMR EFVSLPKDRV VAYDAIEDTV AAITEFVSVG 151 MHAMNRLLTL AHSKRERIAV IGDGSLAFVV ANIINYTLPE AEIVVIGRHW 201 EKLELFSFAK ECYITDNIPE DLAFDHAFEC CGGDGTGPAI NDLIRYIRPQ 251 GTILMMGVSE YKVNLNTRDA LEKGLILVGS SRSGRIDFEN AIQMMEVKKF 301 ANRLKNILYL EEPVREIKDI HRVFATDLNT AFKTVFKWEV -COOH
【００２１】 (C) ポリヌクレオチド配列の具体例 [配列番号：1]. X-(R1)n-1 ATGATTAATC AAATTTATCA ACTAACTAAG CCTAAGTTTA TCAATGTCAA 51 ATATCAGGAA GAGGCTATTG ACCAAGAGAA TCATATCCTT ATCCGTCCCA 101 ACTACATGGC TGTCTGTCAT GCGGATCAGC GTTACTATCA GGGAAAACGT 151 GATCCCAAGA TTTTGAATAA AAAGCTTCCA ATGGCAATGA TTCACGAGTC 201 ATGTGGAACC GTCATTTCTG ACCCGACCGG AACCTACGAG GTTGGTCAAA 251 AAGTTGTCAT GATTCCCAAT CAGTCTCCTA TGCAGAGTGA TGAAGAATTC 301 TATGAAAACT ACATGACAGG GACCCATTTC TTGTCTAGTG GATTTGATGG 351 CTTTATGAGA GAGTTTGTTT CTCTCCCTAA AGATCGTGTG GTGGCTTATG 401 ATGCTATTGA AGATACGGTT GCAGCCATTA CAGAGTTTGT CAGTGTGGGC 451 ATGCACGCTA TGAATCGTCT ATTGACTCTT GCTCATAGCA AGCGGGAGCG 501 GATCGCCGTT ATTGGAGATG GGAGTTTAGC TTTTGTGGTT GCCAATATTA 551 TCAACTATAC TTTGCCAGAA GCAGAGATTG TGGTTATTGG TCGTCATTGG 601 GAAAAGTTGG AACTCTTCTC ATTTGCCAAA GAATGCTATA TTACGGATAA 651 TATTCCTGAA GATTTGGCCT TTGACCATGC TTTTGAATGT TGTGGTGGTG 701 ATGGTACTGG ACCAGCTATT AATGACTTGA TTCGCTACAT TCGTCCTCAG 751 GGAACGATTC TCATGATGGG AGTTAGCGAA TATAAAGTCA ATCTCAATAC 801 TCGCGATGCC TTAGAAAAGG GCTTGATTTT GGTTGGGTCA TCTCGTTCTG 851 GTCGCATTGA TTTTGAAAAT GCTATCCAAA TGATGGAAGT CAAGAAATTT 901 GCCAATCGTC TTAAAAATAT CCTTTATCTA GAAGAACCTG TAAGAGAAAT 951 TAAAGATATT CATCGTGTCT TTGCAACCGA TTTAAACACA GCCTTTAAAA 1001 CAGTGTTTAA GTGGGAAGTA -(R2)n-Y
【００２２】 (D) ポリペプチド配列の具体例 [配列番号：2]. X-(R1)n-1 MINQIYQLTK PKFINVKYQE EAIDQENHIL IRPNYMAVCH ADQRYYQGKR 51 DPKILNKKLP MAMIHESCGT VISDPTGTYE VGQKVVMIPN QSPMQSDEEF 101 YENYMTGTHF LSSGFDGFMR EFVSLPKDRV VAYDAIEDTV AAITEFVSVG 151 MHAMNRLLTL AHSKRERIAV IGDGSLAFVV ANIINYTLPE AEIVVIGRHW 201 EKLELFSFAK ECYITDNIPE DLAFDHAFEC CGGDGTGPAI NDLIRYIRPQ 251 GTILMMGVSE YKVNLNTRDA LEKGLILVGS SRSGRIDFEN AIQMMEVKKF 301 ANRLKNILYL EEPVREIKDI HRVFATDLNT AFKTVFKWEV -(R2)n-Y
【００２３】寄託物質 ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0100993株を含有
する寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・イン
ダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッ
ド（ＮＣＩＭＢという）、２３ストリート、マッカード
ライブ、アベルディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランド
に１９９６年４月１１日寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４
０７９４が付与された。寄託したことにより、寄託株を
ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0100993株とい
う。１９９６年４月１７日に、イー・コリ（E. coli）
中のストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993ＤＮ
ＡライブラリーをＮＣＩＭＢに同様に寄託し、受託番号
４０８００を付与された。ストレプトコッカス・ニュー
モニアエ株寄託物を、本明細書では「寄託株」または
「寄託株のＤＮＡ」という。
する寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・イン
ダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッ
ド（ＮＣＩＭＢという）、２３ストリート、マッカード
ライブ、アベルディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランド
に１９９６年４月１１日寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４
０７９４が付与された。寄託したことにより、寄託株を
ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0100993株とい
う。１９９６年４月１７日に、イー・コリ（E. coli）
中のストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993ＤＮ
ＡライブラリーをＮＣＩＭＢに同様に寄託し、受託番号
４０８００を付与された。ストレプトコッカス・ニュー
モニアエ株寄託物を、本明細書では「寄託株」または
「寄託株のＤＮＡ」という。
【００２４】寄託株は全長のアルコールデヒドロゲナー
ゼ遺伝子を含んでいる。寄託株中に含まれるポリヌクレ
オチド配列ならびにそれによりコードされるポリペプチ
ドのアミノ酸配列は、本明細書の配列に関する任意の記
載に矛盾する事象において支配的である。
ゼ遺伝子を含んでいる。寄託株中に含まれるポリヌクレ
オチド配列ならびにそれによりコードされるポリペプチ
ドのアミノ酸配列は、本明細書の配列に関する任意の記
載に矛盾する事象において支配的である。
【００２５】寄託株の寄託は、特許手続き上の微生物寄
託の国際承認に関するブダペスト条約の条件下でなされ
ている。特許が発行されると何らの制限または条件もな
く、最終的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のた
めにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条のもとに要
求されるような、寄託が実施可能要件であることを承認
するものではない。寄託物を製造、使用または販売する
ためにはライセンスが必要であるが、そのようなライセ
ンスはここでは賦与されていない。
託の国際承認に関するブダペスト条約の条件下でなされ
ている。特許が発行されると何らの制限または条件もな
く、最終的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のた
めにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条のもとに要
求されるような、寄託が実施可能要件であることを承認
するものではない。寄託物を製造、使用または販売する
ためにはライセンスが必要であるが、そのようなライセ
ンスはここでは賦与されていない。
【００２６】ポリペプチド 本発明ポリペプチドは表１［配列番号：２］のポリペプ
チド（詳細には、成熟ポリペプチド）ならびにポリペプ
チドおよびフラグメント、詳細にはアルコールデヒドロ
ゲナーゼの生物学的活性を有するものを包含し、さらに
表１［配列番号：２］のポリペプチドまたはその重要部
分に対して少なくとも７０％、好ましくは表１［配列番
号：２］のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同
一性を有するポリペプチドおよびフラグメント、より好
ましくは表１［配列番号：２］のポリペプチドに対して
少なくとも９０％の類似性を有し（より好ましくは、少
なくとも９０％の同一性を有し）、さらにより好ましく
は表１［配列番号：２］のポリペプチドに対して少なく
とも９５％の類似性を有する（さらにより好ましくは少
なくとも９５％の同一性を有する）ポリペプチドおよび
フラグメント、さらに通常には少なくとも３０個、より
好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含むかかるポ
リペプチドの部分を包含する。
チド（詳細には、成熟ポリペプチド）ならびにポリペプ
チドおよびフラグメント、詳細にはアルコールデヒドロ
ゲナーゼの生物学的活性を有するものを包含し、さらに
表１［配列番号：２］のポリペプチドまたはその重要部
分に対して少なくとも７０％、好ましくは表１［配列番
号：２］のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同
一性を有するポリペプチドおよびフラグメント、より好
ましくは表１［配列番号：２］のポリペプチドに対して
少なくとも９０％の類似性を有し（より好ましくは、少
なくとも９０％の同一性を有し）、さらにより好ましく
は表１［配列番号：２］のポリペプチドに対して少なく
とも９５％の類似性を有する（さらにより好ましくは少
なくとも９５％の同一性を有する）ポリペプチドおよび
フラグメント、さらに通常には少なくとも３０個、より
好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含むかかるポ
リペプチドの部分を包含する。
【００２７】また本発明は表１（Ｄ）に示す式のポリペ
プチドを包含し、式中のアミノ末端においてＸは水素で
あり、カルボキシル末端においてＹは水素または金属で
あり、Ｒ１およびＲ２はアミノ酸残基、ｎは１ないし１
０００の整数である。いずれかのＲ基（Ｒは１個よりも
多い）により示されるアミノ酸残基の伸長部分はヘテロ
ポリマーであってもホモポリマーであってもよく、好ま
しくはヘテロポリマーである。
プチドを包含し、式中のアミノ末端においてＸは水素で
あり、カルボキシル末端においてＹは水素または金属で
あり、Ｒ１およびＲ２はアミノ酸残基、ｎは１ないし１
０００の整数である。いずれかのＲ基（Ｒは１個よりも
多い）により示されるアミノ酸残基の伸長部分はヘテロ
ポリマーであってもホモポリマーであってもよく、好ま
しくはヘテロポリマーである。
【００２８】フラグメントは、前述のポリペプチドのア
ミノ酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であ
るアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。アル
コールデヒドロゲナーゼポリペプチドについては、フラ
グメントは「独立して存在（free standing）」してい
るか、または一部分もしくは領域を形成することによ
り、大型のポリペプチド内に含まれていてもよく、最も
好ましくは単一の連続した領域、すなわち大型の単一ポ
リペプチドとして含まれる。好ましいフラグメントは、
表１［配列番号：２］のアミノ酸配列の一部分を有する
末端切断されたポリペプチド、またはそれらの変種を包
含するが、その例としてはアミノ末端を含む一連の残基
を切断、またはカルボキシル末端を含む一連の残基を切
断したものがある。宿主、とりわけストレプトコッカス
・ニューモニアエにおける、本発明のポリペプチドの分
解形態もまた好ましい。また、構造的または機能的属性
により特徴づけられたフラグメント、例えばアルファー
ヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域、ベー
タシートおよびベータシート形成領域、ターンおよびタ
ーン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領
域、疎水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親
媒性領域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、お
よび高抗原性指標領域を含むフラグメントなども好まし
い。アルコールデヒドロゲナーゼ活性を媒介し、あるい
は活性を改善し、望ましくない活性を減じられたフラグ
メントである生物学的に活性のあるフラグメントも好ま
しい。動物、とりわけヒトにおいて抗原的または免疫原
的なフラグメントもまた含まれる。個体、特にヒトにお
けるストレプトコッカス・ニューモニアエの生存に必須
の機能、あるいは疾病を開始または維持する能力を付与
する酵素の受容体またはドメインを含むフラグメントが
特に好ましい。本発明ポリペプチドのフラグメントであ
る変種を、ペプチド合成による対応全長ポリペプチドの
製造に使用してもよく、それゆえ、これらの変種を全長
のポリペプチド製造のための中間体として用いてもよ
い。本発明ポリヌクレオチドのフラグメントである変種
を用いて本発明の全長のポリヌクレオチドを合成しても
よい。
ミノ酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であ
るアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。アル
コールデヒドロゲナーゼポリペプチドについては、フラ
グメントは「独立して存在（free standing）」してい
るか、または一部分もしくは領域を形成することによ
り、大型のポリペプチド内に含まれていてもよく、最も
好ましくは単一の連続した領域、すなわち大型の単一ポ
リペプチドとして含まれる。好ましいフラグメントは、
表１［配列番号：２］のアミノ酸配列の一部分を有する
末端切断されたポリペプチド、またはそれらの変種を包
含するが、その例としてはアミノ末端を含む一連の残基
を切断、またはカルボキシル末端を含む一連の残基を切
断したものがある。宿主、とりわけストレプトコッカス
・ニューモニアエにおける、本発明のポリペプチドの分
解形態もまた好ましい。また、構造的または機能的属性
により特徴づけられたフラグメント、例えばアルファー
ヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域、ベー
タシートおよびベータシート形成領域、ターンおよびタ
ーン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領
域、疎水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親
媒性領域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、お
よび高抗原性指標領域を含むフラグメントなども好まし
い。アルコールデヒドロゲナーゼ活性を媒介し、あるい
は活性を改善し、望ましくない活性を減じられたフラグ
メントである生物学的に活性のあるフラグメントも好ま
しい。動物、とりわけヒトにおいて抗原的または免疫原
的なフラグメントもまた含まれる。個体、特にヒトにお
けるストレプトコッカス・ニューモニアエの生存に必須
の機能、あるいは疾病を開始または維持する能力を付与
する酵素の受容体またはドメインを含むフラグメントが
特に好ましい。本発明ポリペプチドのフラグメントであ
る変種を、ペプチド合成による対応全長ポリペプチドの
製造に使用してもよく、それゆえ、これらの変種を全長
のポリペプチド製造のための中間体として用いてもよ
い。本発明ポリヌクレオチドのフラグメントである変種
を用いて本発明の全長のポリヌクレオチドを合成しても
よい。
【００２９】ポリヌクレオチド 本発明の別の態様は単離ポリヌクレオチドに関するもの
であり、それには表１［配列番号：２］の推定アミノ酸
配列を有するアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチド
をコードする全長遺伝子およびそれに密接に関連するポ
リヌクレオチドおよびそれらの変種が包含される。本明
細書に提供される情報を用いて、例えば表１［配列番
号：１］に示すポリヌクレオチド配列を用い、出発物質
ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0100993細胞から
の染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列
決定するために用いるような標準的なクローニングおよ
びスクリーニングを用いて、アルコールデヒドロゲナー
ゼポリペプチドをコードしている本発明ポリヌクレオチ
ドを得て、次いで、全長のクローンを得てもよい。例え
ば、本発明ポリヌクレオチド配列、例えば表１［配列番
号：１］に示す配列を得るために、イー・コリ（E.col
i）またはいくつかの他の適切な宿主におけるストレプ
トコッカス・ニューモニアエ 0100993の染色体ＤＮＡの
クローンの典型的なライブラリーを、部分的配列に由来
する、好ましくは１７量体またはそれ以上の長さの放射
性標識化オリゴヌクレオチドにてプローブする。プロー
ブのＤＮＡに同一であるＤＮＡを担持するクローンは厳
密な条件を用いて区別できる。元の配列から設計した配
列決定プライマーを用いてこのように同定した個々のク
ローンを配列決定することにより、両方向で配列が伸長
できるようになり、全遺伝子配列を決定できる。このよ
うな配列決定は便宜的にプラスミドクローンから調製し
た変性二本鎖ＤＮＡを用いて実施する。適切な技法につ
いては、Maniatis,T.、Fitsch,F.F.およびSambrookら、
Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第２版；コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク
（1989）に記載されている（Screening By Hybridizati
on 1.90およびSequencing Denatured Double-Stranded
DNA Templates 13.70参照）。本発明の典型例におい
て、表１［配列番号：１］に示すポリヌクレオチドが、
ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0100993由来のＤ
ＮＡライブラリー中に見いだされた。
であり、それには表１［配列番号：２］の推定アミノ酸
配列を有するアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチド
をコードする全長遺伝子およびそれに密接に関連するポ
リヌクレオチドおよびそれらの変種が包含される。本明
細書に提供される情報を用いて、例えば表１［配列番
号：１］に示すポリヌクレオチド配列を用い、出発物質
ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0100993細胞から
の染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列
決定するために用いるような標準的なクローニングおよ
びスクリーニングを用いて、アルコールデヒドロゲナー
ゼポリペプチドをコードしている本発明ポリヌクレオチ
ドを得て、次いで、全長のクローンを得てもよい。例え
ば、本発明ポリヌクレオチド配列、例えば表１［配列番
号：１］に示す配列を得るために、イー・コリ（E.col
i）またはいくつかの他の適切な宿主におけるストレプ
トコッカス・ニューモニアエ 0100993の染色体ＤＮＡの
クローンの典型的なライブラリーを、部分的配列に由来
する、好ましくは１７量体またはそれ以上の長さの放射
性標識化オリゴヌクレオチドにてプローブする。プロー
ブのＤＮＡに同一であるＤＮＡを担持するクローンは厳
密な条件を用いて区別できる。元の配列から設計した配
列決定プライマーを用いてこのように同定した個々のク
ローンを配列決定することにより、両方向で配列が伸長
できるようになり、全遺伝子配列を決定できる。このよ
うな配列決定は便宜的にプラスミドクローンから調製し
た変性二本鎖ＤＮＡを用いて実施する。適切な技法につ
いては、Maniatis,T.、Fitsch,F.F.およびSambrookら、
Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第２版；コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク
（1989）に記載されている（Screening By Hybridizati
on 1.90およびSequencing Denatured Double-Stranded
DNA Templates 13.70参照）。本発明の典型例におい
て、表１［配列番号：１］に示すポリヌクレオチドが、
ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0100993由来のＤ
ＮＡライブラリー中に見いだされた。
【００３０】表１［配列番号：１］に示すＤＮＡ配列
は、表１［配列番号：２］に示すアミノ酸残基数とほぼ
同数のアミノ酸からなる蛋白をコードしている読み枠を
含んでおり、蛋白の推定分子量は、当該分野でよく知ら
れたアミノ酸の分子量を用いて算出できる。ヌクレオチ
ド番号１から１０２０の間の配列番号：１のポリヌクレ
オチドは配列番号：２のポリペプチドをコードする。停
止コドンは配列番号：１のヌクレオチド番号１０２１か
ら開始する。本発明アルコールデヒドロゲナーゼ蛋白
は、寄託株のアルコールデヒドロゲナーゼをコードして
いるＤＮＡの配列決定結果により示されるように、デヒ
ドロゲナーゼファミリーの他の蛋白に構造的に関連して
いる。本発明蛋白は、知られた蛋白の中でもイー・コリ
のアルコールデヒドロゲナーゼ蛋白（SWISS-PROT受託番
号３９４００）に対して最大の相同性を示す。表１［配
列番号：２］のアルコールデヒドロゲナーゼ蛋白は、イ
ー・コリのアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドの
アミノ酸配列に対して、その全長にわたり約２２％の同
一性、そしてその全長にわたり約５７％の類似性を示
す。
は、表１［配列番号：２］に示すアミノ酸残基数とほぼ
同数のアミノ酸からなる蛋白をコードしている読み枠を
含んでおり、蛋白の推定分子量は、当該分野でよく知ら
れたアミノ酸の分子量を用いて算出できる。ヌクレオチ
ド番号１から１０２０の間の配列番号：１のポリヌクレ
オチドは配列番号：２のポリペプチドをコードする。停
止コドンは配列番号：１のヌクレオチド番号１０２１か
ら開始する。本発明アルコールデヒドロゲナーゼ蛋白
は、寄託株のアルコールデヒドロゲナーゼをコードして
いるＤＮＡの配列決定結果により示されるように、デヒ
ドロゲナーゼファミリーの他の蛋白に構造的に関連して
いる。本発明蛋白は、知られた蛋白の中でもイー・コリ
のアルコールデヒドロゲナーゼ蛋白（SWISS-PROT受託番
号３９４００）に対して最大の相同性を示す。表１［配
列番号：２］のアルコールデヒドロゲナーゼ蛋白は、イ
ー・コリのアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドの
アミノ酸配列に対して、その全長にわたり約２２％の同
一性、そしてその全長にわたり約５７％の類似性を示
す。
【００３１】本発明は、表１［配列番号：１］のコーデ
ィング配列に対して全長にわたり同一であるポリヌクレ
オチド配列を提供する。成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列またはそれらのフラグメント、ならびにその他の
コーディング配列を有する読み枠中の成熟ポリペプチド
のコーディング配列またはそのフラグメント、例えばリ
ーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プレプロ蛋白配列
をコードする配列も本発明により提供される。ポリヌク
レオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、終止シグ
ナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配
列、イントロン、ポリアデニル化シグナル等の転写非翻
訳配列、および付加アミノ酸をコードする付加コーディ
ング配列等の非コーディング５'および３'配列等の非コ
ーディング配列をも含有しうるが、これらに限定するの
ではない。例えば、融合ポリペプチドの精製を促すマー
カー配列をコードすることもできる。本発明のある好ま
しい態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター
（Qiagen, Inc.）中に提供されるようなヘキサ−ヒスチ
ジンペプチド（Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci., US
A， 86:821-824（1989）に記載される）またはＨＡタグ
（Wilsonら、Cell，37:767（1984））である。本発明の
ポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子および遺伝子発現
を調節する天然の配列をも含むが、これらに限定するも
のではない。
ィング配列に対して全長にわたり同一であるポリヌクレ
オチド配列を提供する。成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列またはそれらのフラグメント、ならびにその他の
コーディング配列を有する読み枠中の成熟ポリペプチド
のコーディング配列またはそのフラグメント、例えばリ
ーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プレプロ蛋白配列
をコードする配列も本発明により提供される。ポリヌク
レオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、終止シグ
ナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配
列、イントロン、ポリアデニル化シグナル等の転写非翻
訳配列、および付加アミノ酸をコードする付加コーディ
ング配列等の非コーディング５'および３'配列等の非コ
ーディング配列をも含有しうるが、これらに限定するの
ではない。例えば、融合ポリペプチドの精製を促すマー
カー配列をコードすることもできる。本発明のある好ま
しい態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター
（Qiagen, Inc.）中に提供されるようなヘキサ−ヒスチ
ジンペプチド（Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci., US
A， 86:821-824（1989）に記載される）またはＨＡタグ
（Wilsonら、Cell，37:767（1984））である。本発明の
ポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子および遺伝子発現
を調節する天然の配列をも含むが、これらに限定するも
のではない。
【００３２】本発明の好ましい具体例は、アルコールデ
ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードいしている、表１
の配列番号：１に示すヌクレオチド１から１０２０まで
を含むポリヌクレオチドである。
ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードいしている、表１
の配列番号：１に示すヌクレオチド１から１０２０まで
を含むポリヌクレオチドである。
【００３３】また本発明は、表１（Ｃ）に示す式のポリ
ヌクレオチドを包含し、式中の５’においてＸは水素で
あり、３’末端においてＹは水素または金属であり、Ｒ
１およびＲ２は核酸残基、ｎは１ないし１０００の整数
である。いずれかのＲ基（Ｒは１個よりも多い）により
示される核酸残基の伸長部分はヘテロポリマーであって
もホモポリマーであってもよく、好ましくはヘテロポリ
マーである。
ヌクレオチドを包含し、式中の５’においてＸは水素で
あり、３’末端においてＹは水素または金属であり、Ｒ
１およびＲ２は核酸残基、ｎは１ないし１０００の整数
である。いずれかのＲ基（Ｒは１個よりも多い）により
示される核酸残基の伸長部分はヘテロポリマーであって
もホモポリマーであってもよく、好ましくはヘテロポリ
マーである。
【００３４】上記した本明細書の用語「ポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポリペプ
チド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包
含し、詳細には、細菌のポリペプチド、より詳細には表
１［配列番号：２］に示すアミノ酸配列を有するストレ
プトコッカス・ニューモニアエのアルコールデヒドロゲ
ナーゼのポリペプチドを包含する。該用語は、コーディ
ング配列および／または非コーディング配列を含んでい
てもよいさらなる領域を伴った、ポリペプチドをコード
している単一の連続領域または不連続領域（例えば、組
み込まれたファージまたは配列の挿入または配列の編集
により分断されたもの）を含むポリヌクレオチドを包含
する。さらに本発明は、表１［配列番号：２］の推定ア
ミノ酸配列を有するポリペプチドの変種をコードする上
記ポリヌクレオチドの変種にも関する。本発明ポリヌク
レオチドのフラグメントである変種を用いて本発明の全
長ポリヌクレオチドを合成してもよい。
コードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポリペプ
チド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包
含し、詳細には、細菌のポリペプチド、より詳細には表
１［配列番号：２］に示すアミノ酸配列を有するストレ
プトコッカス・ニューモニアエのアルコールデヒドロゲ
ナーゼのポリペプチドを包含する。該用語は、コーディ
ング配列および／または非コーディング配列を含んでい
てもよいさらなる領域を伴った、ポリペプチドをコード
している単一の連続領域または不連続領域（例えば、組
み込まれたファージまたは配列の挿入または配列の編集
により分断されたもの）を含むポリヌクレオチドを包含
する。さらに本発明は、表１［配列番号：２］の推定ア
ミノ酸配列を有するポリペプチドの変種をコードする上
記ポリヌクレオチドの変種にも関する。本発明ポリヌク
レオチドのフラグメントである変種を用いて本発明の全
長ポリヌクレオチドを合成してもよい。
【００３５】さらに特に好ましい具体例は、表１［配列
番号：２］のアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチド
のアミノ酸配列を有するアルコールデヒドロゲナーゼ変
種をコードするポリヌクレオチドであり、その中には、
いくつか、少しの、５ないし１０、１ないし５、１ない
し３、２、１または０個のアミノ酸残基を置換、欠失ま
たは付加を任意の組み合わせで施したアミノ酸配列を有
する。中でもとりわけ好ましいものは、アルコールデヒ
ドロゲナーゼの特性および活性を変化させないサイレン
ト置換、付加および欠失である。
番号：２］のアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチド
のアミノ酸配列を有するアルコールデヒドロゲナーゼ変
種をコードするポリヌクレオチドであり、その中には、
いくつか、少しの、５ないし１０、１ないし５、１ない
し３、２、１または０個のアミノ酸残基を置換、欠失ま
たは付加を任意の組み合わせで施したアミノ酸配列を有
する。中でもとりわけ好ましいものは、アルコールデヒ
ドロゲナーゼの特性および活性を変化させないサイレン
ト置換、付加および欠失である。
【００３６】本発明のさらに好ましい具体例は、表１
［配列番号：２］に示すアミノ酸配列を有するアルコー
ルデヒドロゲナーゼポリペプチドをコードしているポリ
ヌクレオチドに対して、その全長にわたり少なくとも７
０％の同一性があるポリヌクレオチド、およびかかるポ
リヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドであ
る。あるいはまた、寄託株のアルコールデヒドロゲナー
ゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対
してその全長にわたり少なくとも８０％同一である領域
を含むポリヌクレオチド、およびそれに対して相補的な
ポリヌクレオチドが最も非常に好ましい。この点に関し
て、全長で少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチ
ドがとりわけ好ましく、中でも少なくとも９５％の同一
性を有するものが特に好ましく、さらに少なくとも９５
％の同一性を有するものの中でも少なくとも９７％であ
るのがより好ましく、中でも少なくとも９８％および少
なくとも９９％であるのが特に好ましく、さらに少なく
とも９９％であるのがより好ましい。特に好ましい具体
例は、表１［配列番号：１］のＤＮＡによりコードされ
る成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または
活性を保持するポリペプチドをコードしているポリヌク
レオチドである。
［配列番号：２］に示すアミノ酸配列を有するアルコー
ルデヒドロゲナーゼポリペプチドをコードしているポリ
ヌクレオチドに対して、その全長にわたり少なくとも７
０％の同一性があるポリヌクレオチド、およびかかるポ
リヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドであ
る。あるいはまた、寄託株のアルコールデヒドロゲナー
ゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対
してその全長にわたり少なくとも８０％同一である領域
を含むポリヌクレオチド、およびそれに対して相補的な
ポリヌクレオチドが最も非常に好ましい。この点に関し
て、全長で少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチ
ドがとりわけ好ましく、中でも少なくとも９５％の同一
性を有するものが特に好ましく、さらに少なくとも９５
％の同一性を有するものの中でも少なくとも９７％であ
るのがより好ましく、中でも少なくとも９８％および少
なくとも９９％であるのが特に好ましく、さらに少なく
とも９９％であるのがより好ましい。特に好ましい具体
例は、表１［配列番号：１］のＤＮＡによりコードされ
る成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または
活性を保持するポリペプチドをコードしているポリヌク
レオチドである。
【００３７】本発明はさらに本明細書上述の配列にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関
して、本発明は特に厳密な条件で本明細書上述のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密な
ハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同
一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％
である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味
する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例として
は、５０％ホルムアミド。５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５ｘデンハーツ溶液、
１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性
し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２
℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０.
１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄するものである。ハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Samb
rookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第
２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク
（1989）、とりわけその第１１章に実例が示されてい
る。
ブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関
して、本発明は特に厳密な条件で本明細書上述のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密な
ハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同
一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％
である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味
する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例として
は、５０％ホルムアミド。５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５ｘデンハーツ溶液、
１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性
し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２
℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０.
１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄するものである。ハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Samb
rookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第
２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク
（1989）、とりわけその第１１章に実例が示されてい
る。
【００３８】本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーシ
ョン条件で、配列番号：１に示すポリヌクレオチド配列
に関する完全遺伝子を含む適当なライブラリーを、配列
番号：１に示す上記ポリヌクレオチド配列またはそのフ
ラグメントの配列を有するプローブでスクリーニング
し、ＤＮＡ配列を単離することにより得ることのできる
ポリヌクレオチド配列を本質的に含むポリヌクレオチド
をも提供する。かかるポリヌクレオチドを得るために有
用なフラグメントには、例えば本明細書の別の箇所にお
いて説明するプローブおよびプライマー等がある。
ョン条件で、配列番号：１に示すポリヌクレオチド配列
に関する完全遺伝子を含む適当なライブラリーを、配列
番号：１に示す上記ポリヌクレオチド配列またはそのフ
ラグメントの配列を有するプローブでスクリーニング
し、ＤＮＡ配列を単離することにより得ることのできる
ポリヌクレオチド配列を本質的に含むポリヌクレオチド
をも提供する。かかるポリヌクレオチドを得るために有
用なフラグメントには、例えば本明細書の別の箇所にお
いて説明するプローブおよびプライマー等がある。
【００３９】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明のポリヌ
クレオチドを、アルコールデヒドロゲナーゼをコードす
るｃＤＮＡ全長およびゲノムクローンを単離するため
の、およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に高度な
配列類似性を有するその他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲ
ノムクローンを単離するための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよ
びゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブと
して使用することができる。このようなプローブは通常
少なくとも１５塩基を含む。好ましくはこのようなプロ
ーブは少なくとも３０塩基を有し、少なくとも５０塩基
を有していてもよい。とりわけ好ましいプローブは少な
くとも３０塩基を有し、５０塩基またはそれ以下であ
る。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のコー
ディング領域は、配列番号：１に示すＤＮＡ配列を用い
てオリゴヌクレオチドプローブを合成してスクリーニン
グすることにより単離できる。次いで、本発明の遺伝子
の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチド
を、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラ
リーのスクリーニングに用い、プローブがライブラリー
のいずれのメンバーにハイブリダイゼーションするのか
を決定する。
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明のポリヌ
クレオチドを、アルコールデヒドロゲナーゼをコードす
るｃＤＮＡ全長およびゲノムクローンを単離するため
の、およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に高度な
配列類似性を有するその他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲ
ノムクローンを単離するための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよ
びゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブと
して使用することができる。このようなプローブは通常
少なくとも１５塩基を含む。好ましくはこのようなプロ
ーブは少なくとも３０塩基を有し、少なくとも５０塩基
を有していてもよい。とりわけ好ましいプローブは少な
くとも３０塩基を有し、５０塩基またはそれ以下であ
る。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のコー
ディング領域は、配列番号：１に示すＤＮＡ配列を用い
てオリゴヌクレオチドプローブを合成してスクリーニン
グすることにより単離できる。次いで、本発明の遺伝子
の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチド
を、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラ
リーのスクリーニングに用い、プローブがライブラリー
のいずれのメンバーにハイブリダイゼーションするのか
を決定する。
【００４０】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、例えば、疾病とりわけヒトの疾病の治療法およ
び診断法の発見のための研究試薬および材料として使用
でき、とりわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本
明細書でさらに論じる。配列番号：１および／または２
の配列由来のオリゴヌクレオチドである本発明ポリヌク
レオチドを本明細書記載の方法に使用してもよいが、好
ましくはＰＣＲに使用して、本明細書で同定したポリヌ
クレオチドの全体または一部が感染した組織に転写され
るかどうかを決定する。かかる配列が、病原体が達成し
た感染段階および感染型の診断にも有用であることが理
解される。
チドは、例えば、疾病とりわけヒトの疾病の治療法およ
び診断法の発見のための研究試薬および材料として使用
でき、とりわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本
明細書でさらに論じる。配列番号：１および／または２
の配列由来のオリゴヌクレオチドである本発明ポリヌク
レオチドを本明細書記載の方法に使用してもよいが、好
ましくはＰＣＲに使用して、本明細書で同定したポリヌ
クレオチドの全体または一部が感染した組織に転写され
るかどうかを決定する。かかる配列が、病原体が達成し
た感染段階および感染型の診断にも有用であることが理
解される。
【００４１】また本発明は、さらなるアミノもしくはカ
ルボキシル末端アミノ酸、または成熟ポリペプチドに内
在するアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドを
コードできるポリヌクレオチドも提供する（例えば成熟
形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）。この
ような配列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセッ
シングに役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半
減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッセイも
しくは製造のための蛋白の操作を容易にすることができ
る。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞性
酵素によりプロセッシングされ、成熟蛋白から取り除か
れる。１またはそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態
のポリペプチドを有する前駆蛋白は、ポリペプチドの不
活性形態でありうる。プロ配列が除去されると、通常に
はこのような不活性前駆体が活性化される。プロ配列の
いくつかまたはすべてを活性化の前に除去できる。通
常、このような前駆体はプロ蛋白と称される。要する
に、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配
列を加えた成熟蛋白（プレ蛋白と称することができ
る）、プレ蛋白のリーダー配列ではない１またはそれ以
上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダ
ー配列および１またはそれ以上のプロ配列を有するプロ
蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコードしていてもよ
く、プロ配列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態
を生成するプロセッシング段階で除去される。
ルボキシル末端アミノ酸、または成熟ポリペプチドに内
在するアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドを
コードできるポリヌクレオチドも提供する（例えば成熟
形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）。この
ような配列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセッ
シングに役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半
減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッセイも
しくは製造のための蛋白の操作を容易にすることができ
る。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞性
酵素によりプロセッシングされ、成熟蛋白から取り除か
れる。１またはそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態
のポリペプチドを有する前駆蛋白は、ポリペプチドの不
活性形態でありうる。プロ配列が除去されると、通常に
はこのような不活性前駆体が活性化される。プロ配列の
いくつかまたはすべてを活性化の前に除去できる。通
常、このような前駆体はプロ蛋白と称される。要する
に、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配
列を加えた成熟蛋白（プレ蛋白と称することができ
る）、プレ蛋白のリーダー配列ではない１またはそれ以
上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダ
ー配列および１またはそれ以上のプロ配列を有するプロ
蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコードしていてもよ
く、プロ配列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態
を生成するプロセッシング段階で除去される。
【００４２】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝子操
作される宿主細胞および組換え技法による本発明のポリ
ペプチドの製造にも関する。本発明ＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを用い、無細胞翻訳系を用いてこのような蛋
白を製造できる。組換え体を製造するために、宿主細胞
を遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、また
は本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。
ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davi
sら、Basic Methods in Molecular Biology（1986）；S
ambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manua
l、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク（1989）のように、多くの標準的な実験マニ
ュアルに記載される方法により行うことができ、例えば
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ
キストラン媒介トランスフェクション、トランスベクシ
ョン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介ト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、トラン
スダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入お
よび感染等がある。
クレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝子操
作される宿主細胞および組換え技法による本発明のポリ
ペプチドの製造にも関する。本発明ＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを用い、無細胞翻訳系を用いてこのような蛋
白を製造できる。組換え体を製造するために、宿主細胞
を遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、また
は本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。
ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davi
sら、Basic Methods in Molecular Biology（1986）；S
ambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manua
l、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク（1989）のように、多くの標準的な実験マニ
ュアルに記載される方法により行うことができ、例えば
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ
キストラン媒介トランスフェクション、トランスベクシ
ョン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介ト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、トラン
スダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入お
よび感染等がある。
【００４３】適当な宿主の代表的なものには、細菌細
胞、例えばストレプトコッカス属（Streptococci）、ス
タフィロコッカス属（Staphylococci）、エンテロコッ
カス属（Enterococci）、イー・コリ（E.coli）、スト
レプトミセス（Streptomyces）およびバチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtiis）細胞；真菌細胞、例えば酵母
細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆
虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Drosophila S2）お
よびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）細胞；動物
細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３
Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Bows）黒色腫細
胞；ならびに植物細胞等がある。
胞、例えばストレプトコッカス属（Streptococci）、ス
タフィロコッカス属（Staphylococci）、エンテロコッ
カス属（Enterococci）、イー・コリ（E.coli）、スト
レプトミセス（Streptomyces）およびバチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtiis）細胞；真菌細胞、例えば酵母
細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆
虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Drosophila S2）お
よびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）細胞；動物
細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３
Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Bows）黒色腫細
胞；ならびに植物細胞等がある。
【００４４】本発明のポリペプチドを製造するために非
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来
するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファ
ージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコス
ミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は発
現を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよ
い。この点に関して、一般的には、宿主中にポリヌクレ
オチドを保持、伸長または発現するのに、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した任意の系またはベ
クターを発現に使用できる。周知のおよび通常的な種々
の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入
してもよく、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A
Laboratory Manual（上述）に記載されている。
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来
するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファ
ージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコス
ミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は発
現を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよ
い。この点に関して、一般的には、宿主中にポリヌクレ
オチドを保持、伸長または発現するのに、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した任意の系またはベ
クターを発現に使用できる。周知のおよび通常的な種々
の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入
してもよく、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A
Laboratory Manual（上述）に記載されている。
【００４５】翻訳蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミッ
クスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当
な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的な
ものであってもく、あるいは異種性のシグナルでもよ
い。
クスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当
な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的な
ものであってもく、あるいは異種性のシグナルでもよ
い。
【００４６】本発明のポリペプチドは周知の方法によ
り、組換え細胞培養物から回収および精製でき、その方
法には、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよび
レクチンクロマトグラフィー等がある。高速液体クロマ
トグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポリペ
プチドが単離および／または精製中に変性した場合、再
び活性なコンホーメーションにするために、蛋白再生の
ための周知の技法を用いることができる。
り、組換え細胞培養物から回収および精製でき、その方
法には、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよび
レクチンクロマトグラフィー等がある。高速液体クロマ
トグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポリペ
プチドが単離および／または精製中に変性した場合、再
び活性なコンホーメーションにするために、蛋白再生の
ための周知の技法を用いることができる。
【００４７】診断アッセイ 本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のア
ルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチドの使用にも
関する。真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトにおける
アルコールデヒドロゲナーゼの検出は、疾患の診断のた
めの診断法を提供する。アルコールデヒドロゲナーゼ遺
伝子を含む生物に感染または感染のおそれのある真核生
物（本明細書において「個体」とも称する）とりわけ哺
乳動物、特にヒトを種々の方法によりＤＮＡレベルで検
出できる。診断用の核酸は、感染した個体の細胞および
組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚より得る
ことができる。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用してもよ
く、あるいは分析の前にＰＣＲもしくはその他の増幅法
を用いることにより酵素的に増幅できる。ＲＮＡまたは
ｃＤＮＡもまた同じ方法で用いることができる。増幅法
を用いると、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトに存
在する原核生物株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析
により特徴づけすることができる。対照配列の遺伝子型
と比較した場合の増幅産物の大きさの変化により、欠失
および挿入を検出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを
標識化アルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチド配
列にハイブリダイズさせることにより同定できる。完全
に対合した配列はＲＮアーゼ消化により、または融解温
度の差により、誤対合二重らせんから区別できる。変性
剤含有または不含ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳
動の移動度の変化を検出することにより、または直接的
なＤＮＡの配列決定により、ＤＮＡ配列の差を検出して
もよい。例えばMeyersら、Science，230:1242（1985）
参照。また、特異的な位置での配列の変化を、ヌクレア
ーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護ま
たは化学的切断法によって明らかにしてもよい。例えば
Cottonら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA， 85:4397-44
01 （1985）参照。
ルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチドの使用にも
関する。真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトにおける
アルコールデヒドロゲナーゼの検出は、疾患の診断のた
めの診断法を提供する。アルコールデヒドロゲナーゼ遺
伝子を含む生物に感染または感染のおそれのある真核生
物（本明細書において「個体」とも称する）とりわけ哺
乳動物、特にヒトを種々の方法によりＤＮＡレベルで検
出できる。診断用の核酸は、感染した個体の細胞および
組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚より得る
ことができる。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用してもよ
く、あるいは分析の前にＰＣＲもしくはその他の増幅法
を用いることにより酵素的に増幅できる。ＲＮＡまたは
ｃＤＮＡもまた同じ方法で用いることができる。増幅法
を用いると、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトに存
在する原核生物株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析
により特徴づけすることができる。対照配列の遺伝子型
と比較した場合の増幅産物の大きさの変化により、欠失
および挿入を検出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを
標識化アルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチド配
列にハイブリダイズさせることにより同定できる。完全
に対合した配列はＲＮアーゼ消化により、または融解温
度の差により、誤対合二重らせんから区別できる。変性
剤含有または不含ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳
動の移動度の変化を検出することにより、または直接的
なＤＮＡの配列決定により、ＤＮＡ配列の差を検出して
もよい。例えばMeyersら、Science，230:1242（1985）
参照。また、特異的な位置での配列の変化を、ヌクレア
ーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護ま
たは化学的切断法によって明らかにしてもよい。例えば
Cottonら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA， 85:4397-44
01 （1985）参照。
【００４８】本発明の遺伝子の突然変異または多型性を
担持する細胞を、種々の技術により、ＤＮＡレベルで、
例えばセロタイピングすることにより検出してもよい。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出すること
ができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばGeneScan
等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡを同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ
に用いてもよい。例を挙げると、アルコールデヒドロゲ
ナーゼをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマー
は、突然変異を同定および分析するのに用いることがで
きる。典型的なプライマーの例を下表２に示す。
担持する細胞を、種々の技術により、ＤＮＡレベルで、
例えばセロタイピングすることにより検出してもよい。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出すること
ができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばGeneScan
等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡを同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ
に用いてもよい。例を挙げると、アルコールデヒドロゲ
ナーゼをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマー
は、突然変異を同定および分析するのに用いることがで
きる。典型的なプライマーの例を下表２に示す。
【００４９】表２ アルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチド増幅用プ
ライマー 配列番号： プライマー配列 3 5'ATACGGTTGCAGCCATTACAGAGT -3' 4 5'AAAATCAATGCGACCAGAACGAGA -3'
ライマー 配列番号： プライマー配列 3 5'ATACGGTTGCAGCCATTACAGAGT -3' 4 5'AAAATCAATGCGACCAGAACGAGA -3'
【００５０】本発明はまた、５'および／または３'末端
から１、２、３または４個のヌクレオチド除去したプラ
イマーをも提供する。該プライマーを用いて、感染個体
から単離された遺伝子を増幅してもよく、次いで、該遺
伝子をＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供しても
よい。このように、ＤＮＡ配列における突然変異を検出
し、感染の診断および感染性物質のセロタイピングおよ
び／または分類に使用することができる。
から１、２、３または４個のヌクレオチド除去したプラ
イマーをも提供する。該プライマーを用いて、感染個体
から単離された遺伝子を増幅してもよく、次いで、該遺
伝子をＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供しても
よい。このように、ＤＮＡ配列における突然変異を検出
し、感染の診断および感染性物質のセロタイピングおよ
び／または分類に使用することができる。
【００５１】本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感
染、より好ましくはストレプトコッカス・ニューモニア
エによる感染、および最も好ましくは、中耳炎、結膜
炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内
膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜
炎のような疾病の診断方法を提供し、該方法は、表１
［配列番号：１］の配列を有するポリヌクレオチドのの
発現レベルの上昇を個体由来の試料から検出することを
特徴とする。アルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオ
チドの発現の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定
量法として当該分野でよく知られたいずれかの方法、例
えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノ
ーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼー
ション法を用いて測定できる。
染、より好ましくはストレプトコッカス・ニューモニア
エによる感染、および最も好ましくは、中耳炎、結膜
炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内
膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜
炎のような疾病の診断方法を提供し、該方法は、表１
［配列番号：１］の配列を有するポリヌクレオチドのの
発現レベルの上昇を個体由来の試料から検出することを
特徴とする。アルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオ
チドの発現の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定
量法として当該分野でよく知られたいずれかの方法、例
えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノ
ーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼー
ション法を用いて測定できる。
【００５２】さらに、正常対照組織サンプルと比較し
て、アルコールデヒドロゲナーゼ蛋白の過剰発現を検出
するための本発明診断アッセイを用いて、例えば感染の
存在を検出してもよい。宿主由来のサンプル中のアルコ
ールデヒドロゲナーゼ蛋白のレベルを決定するために用
いることができるアッセイ技法は、当業者に周知であ
る。かかるアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、競
争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩ
ＳＡアッセイ等がある。
て、アルコールデヒドロゲナーゼ蛋白の過剰発現を検出
するための本発明診断アッセイを用いて、例えば感染の
存在を検出してもよい。宿主由来のサンプル中のアルコ
ールデヒドロゲナーゼ蛋白のレベルを決定するために用
いることができるアッセイ技法は、当業者に周知であ
る。かかるアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、競
争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩ
ＳＡアッセイ等がある。
【００５３】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞を免疫源として用いて、かかるポリ
ペプチドに免疫特異的な抗体を得ることができる。本明
細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリ
クローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒ
ト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントが包含され、さ
らに免疫グロブリン発現ライブラリーの産物等のＦａｂ
フラグメントも包含される。本発明のポリペプチドに対
して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープが付
いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくは
ヒトはでない動物に通常の実験法を用いて投与すること
により得ることができる。連続的細胞系培養により産生
される抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モ
ノクローナル抗体を調製することができる。例として
は、Kohler， G.およびMilstein, C.，Nature， 256:49
5-497 （1975）； Kozborら、Immunology Today， 4:72
（1983）；Coleら、Monoclonal Antibodies and Cance
r Therapy, Alan R Liss, Inc.、77-96頁（1985）に記
載されるような種々の技法がある。一本鎖抗体の産生の
ために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）
を適用して、本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体を
得ることができる。また、トランスジェニックマウスま
たはその他の生物、例えばその他の哺乳動物を用いてヒ
ト化抗体等の抗体を発現させてもよい。
れらを発現する細胞を免疫源として用いて、かかるポリ
ペプチドに免疫特異的な抗体を得ることができる。本明
細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリ
クローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒ
ト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントが包含され、さ
らに免疫グロブリン発現ライブラリーの産物等のＦａｂ
フラグメントも包含される。本発明のポリペプチドに対
して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープが付
いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくは
ヒトはでない動物に通常の実験法を用いて投与すること
により得ることができる。連続的細胞系培養により産生
される抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モ
ノクローナル抗体を調製することができる。例として
は、Kohler， G.およびMilstein, C.，Nature， 256:49
5-497 （1975）； Kozborら、Immunology Today， 4:72
（1983）；Coleら、Monoclonal Antibodies and Cance
r Therapy, Alan R Liss, Inc.、77-96頁（1985）に記
載されるような種々の技法がある。一本鎖抗体の産生の
ために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）
を適用して、本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体を
得ることができる。また、トランスジェニックマウスま
たはその他の生物、例えばその他の哺乳動物を用いてヒ
ト化抗体等の抗体を発現させてもよい。
【００５４】別法として、ファージディスプレイ技法を
用いて、抗−ポリペプチドを有することにつきスクリー
ニングされたヒト・リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ遺伝
子のレパートリーから、抗−アルコールデヒドロゲナー
ゼを有することについてスクリーニングされたヒトか
ら、あるいは無処理のライブラリーから、ポリペプチド
に対する結合活性を有する抗体遺伝子を選別することも
できる（McCafferty, J.ら、Nature 348:552-554 （199
0）； Marks, J.ら、Biotechnology 10:779-783（199
2））。これらの抗体の親和性はチェインシャフリング
（chain shuffling）により改善することもできる（Cla
ckson, T.ら、Nature 352:624-628 （1991））。
用いて、抗−ポリペプチドを有することにつきスクリー
ニングされたヒト・リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ遺伝
子のレパートリーから、抗−アルコールデヒドロゲナー
ゼを有することについてスクリーニングされたヒトか
ら、あるいは無処理のライブラリーから、ポリペプチド
に対する結合活性を有する抗体遺伝子を選別することも
できる（McCafferty, J.ら、Nature 348:552-554 （199
0）； Marks, J.ら、Biotechnology 10:779-783（199
2））。これらの抗体の親和性はチェインシャフリング
（chain shuffling）により改善することもできる（Cla
ckson, T.ら、Nature 352:624-628 （1991））。
【００５５】二つの抗原結合ドメインが存在する場合、
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。
【００５６】上記抗体を用いてポリペプチドを発現する
クローンを単離または同定してもよく、上記抗体を親和
性クロマトグラフィーにより精製することができる。従
って、とりわけアルコールデヒドロゲナーゼに対する抗
体を、感染、とりわけ細菌感染、特に中耳炎、結膜炎、
肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜
炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎
のような疾病の治療に用いてもよい。
クローンを単離または同定してもよく、上記抗体を親和
性クロマトグラフィーにより精製することができる。従
って、とりわけアルコールデヒドロゲナーゼに対する抗
体を、感染、とりわけ細菌感染、特に中耳炎、結膜炎、
肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜
炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎
のような疾病の治療に用いてもよい。
【００５７】ポリペプチド変種には抗原的、エピトープ
的または免疫学的に等価な変種等があり、本発明の特定
の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明により蛋白またはポリペプチド
に対して生成した場合、病原および哺乳動物宿主間での
即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗体により特
異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含
する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」な
る用語は、脊椎動物において抗体を産生させるのに適し
た処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間
での即時的な物理的相互作用を妨害するように作用する
ペプチドまたはその等価物を包含する。
的または免疫学的に等価な変種等があり、本発明の特定
の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明により蛋白またはポリペプチド
に対して生成した場合、病原および哺乳動物宿主間での
即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗体により特
異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含
する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」な
る用語は、脊椎動物において抗体を産生させるのに適し
た処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間
での即時的な物理的相互作用を妨害するように作用する
ペプチドまたはその等価物を包含する。
【００５８】ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に
等価な誘導体、またはそれらの融合蛋白は、マウスまた
はその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫す
るための抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプチ
ドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合すること
により、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモシ
アニン（keyholelimpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結合
することができる。あるいはまた、蛋白もしくはポリペ
プチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等価
なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチド
は、免疫原性を改良するための十分な抗原性を有してい
るので、キャリヤーを使用しなくてすむ。
等価な誘導体、またはそれらの融合蛋白は、マウスまた
はその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫す
るための抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプチ
ドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合すること
により、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモシ
アニン（keyholelimpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結合
することができる。あるいはまた、蛋白もしくはポリペ
プチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等価
なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチド
は、免疫原性を改良するための十分な抗原性を有してい
るので、キャリヤーを使用しなくてすむ。
【００５９】好ましくは、抗体またはそれらの変種を、
個体における免疫原性を減じるために修飾する。例え
ば、個体がヒトである場合、最も好ましくは、抗体は
「ヒト化」されており；この場合、ハイブリドーマ由来
の抗体の相補性決定領域がヒト・モノクローナル抗体に
移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-5
25（1986）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273
（1991）に記載されている。本発明のポリヌクレオチド
を遺伝学的免疫において使用する場合、例えばプラスミ
ドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Gene
t.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419
（1963））、特異的蛋白キャリヤーとＤＮＡとの複合体
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リ
ン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshe
f、PNAS 83:9551（1986））、種々の形態のリポソーム
中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（198
9））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356:152（199
2）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791（1993））
およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたイン
ビボ感染（Seegerら、PNAS 81:5849（1984））等の適切
な送達方法を用いるのが好ましい。
個体における免疫原性を減じるために修飾する。例え
ば、個体がヒトである場合、最も好ましくは、抗体は
「ヒト化」されており；この場合、ハイブリドーマ由来
の抗体の相補性決定領域がヒト・モノクローナル抗体に
移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-5
25（1986）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273
（1991）に記載されている。本発明のポリヌクレオチド
を遺伝学的免疫において使用する場合、例えばプラスミ
ドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Gene
t.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419
（1963））、特異的蛋白キャリヤーとＤＮＡとの複合体
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リ
ン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshe
f、PNAS 83:9551（1986））、種々の形態のリポソーム
中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（198
9））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356:152（199
2）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791（1993））
およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたイン
ビボ感染（Seegerら、PNAS 81:5849（1984））等の適切
な送達方法を用いるのが好ましい。
【００６０】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明ポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細胞標
品、化学ライブラリー、および天然産物混合物中におけ
る小型分子基質およびリガンドの結合を評価してもよ
い。これらの基質およびリガンドは天然基質およびリガ
ンドであってもよく、構造上または機能上の模倣物であ
ってもよい。例えば、Coligan et al.,Current Protoco
ls in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)参照。
イおよび分子 本発明ポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細胞標
品、化学ライブラリー、および天然産物混合物中におけ
る小型分子基質およびリガンドの結合を評価してもよ
い。これらの基質およびリガンドは天然基質およびリガ
ンドであってもよく、構造上または機能上の模倣物であ
ってもよい。例えば、Coligan et al.,Current Protoco
ls in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)参照。
【００６１】また本発明は、アルコールデヒドロゲナー
ゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を増強
（アゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）する化合
物、詳細には、静菌性および／または殺菌性化合物を同
定するための、化合物のスクリーニング方法をも提供す
る。該スクリーニング方法は高処理量の方法である。例
えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニン
グするために、合成反応混合物、膜、細胞エンベロープ
もしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、または
アルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドおよび標識基
質もしくはかかるポリペプチドのリガンドを含むそれら
の調合物を、アルコールデヒドロゲナーゼゴニストまた
はアンタゴニストである可能性のある候補化合物の不存
在下または存在下でインキュベーションする。候補分子
がアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドにアゴナイ
ズまたはアンタゴナイズする能力は、標識化リガンドの
結合の低下またはこのような基質からの生成物の産生の
低下に反映される。結合しても影響を及ぼさない分子、
すなわちアルコールデヒドロゲナーゼの効果を誘導しな
い分子は、最も良好なアンタゴニストである可能性があ
る。結合性が良好で、基質からの生成物の生成速度を高
める分子はアゴニストである。基質からの生成物の生成
速度またはレベルはリポーターシステムを用いることに
より強調できる。この点に関して有用なリポーターシス
テムには、生成物に転換される比色測定用標識化基質、
アルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチドまたはポ
リペプチド活性の変化に応答するリポーター遺伝子、お
よび当該分野で周知の結合アッセイ等があるが、これら
に限定するものではない。
ゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を増強
（アゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）する化合
物、詳細には、静菌性および／または殺菌性化合物を同
定するための、化合物のスクリーニング方法をも提供す
る。該スクリーニング方法は高処理量の方法である。例
えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニン
グするために、合成反応混合物、膜、細胞エンベロープ
もしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、または
アルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドおよび標識基
質もしくはかかるポリペプチドのリガンドを含むそれら
の調合物を、アルコールデヒドロゲナーゼゴニストまた
はアンタゴニストである可能性のある候補化合物の不存
在下または存在下でインキュベーションする。候補分子
がアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドにアゴナイ
ズまたはアンタゴナイズする能力は、標識化リガンドの
結合の低下またはこのような基質からの生成物の産生の
低下に反映される。結合しても影響を及ぼさない分子、
すなわちアルコールデヒドロゲナーゼの効果を誘導しな
い分子は、最も良好なアンタゴニストである可能性があ
る。結合性が良好で、基質からの生成物の生成速度を高
める分子はアゴニストである。基質からの生成物の生成
速度またはレベルはリポーターシステムを用いることに
より強調できる。この点に関して有用なリポーターシス
テムには、生成物に転換される比色測定用標識化基質、
アルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチドまたはポ
リペプチド活性の変化に応答するリポーター遺伝子、お
よび当該分野で周知の結合アッセイ等があるが、これら
に限定するものではない。
【００６２】アルコールデヒドロゲナーゼンタゴニスト
のアッセイのもう１つの例は競争アッセイであり、競争
阻害アッセイに適した条件下で、アルコールデヒドロゲ
ナーゼおよび潜在的アンタゴニストを、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ結合分子、組換えアルコールデヒドロゲナ
ーゼ結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質
もしくはリガンド模倣物と混合する。例えば放射活性ま
たは比色測定用化合物によりアルコールデヒドロゲナー
ゼを標識し、結合分子に結合した、または生成物に変換
されたアルコールデヒドロゲナーゼ分子の数を正確に決
定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価できる。
のアッセイのもう１つの例は競争アッセイであり、競争
阻害アッセイに適した条件下で、アルコールデヒドロゲ
ナーゼおよび潜在的アンタゴニストを、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ結合分子、組換えアルコールデヒドロゲナ
ーゼ結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質
もしくはリガンド模倣物と混合する。例えば放射活性ま
たは比色測定用化合物によりアルコールデヒドロゲナー
ゼを標識し、結合分子に結合した、または生成物に変換
されたアルコールデヒドロゲナーゼ分子の数を正確に決
定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価できる。
【００６３】潜在的アンタゴニストには、本発明ポリペ
プチドに結合し、そのことによりその活性を阻害し消失
させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗
体などがある。また、潜在的アンタゴニストは、密接に
関連した蛋白または抗体のごとき小型有機分子、ペプチ
ド、ポリペプチドであってもよく、それらは結合分子の
同じ部位に結合するが、アルコールデヒドロゲナーゼに
より誘導される活性を誘導せず、それゆえアルコールデ
ヒドロゲナーゼを結合から排除することによりアルコー
ルデヒドロゲナーゼの作用を妨害する。潜在的アンタゴ
ニストには、ポリペプチドの結合部位に結合し、および
それを占領し、それにより細胞性結合分子への結合を妨
害して、正常の生物学的活性を妨害する小型分子等があ
る。小型分子の例としては、小型有機分子、ペプチド、
ペプチド様分子等があるが、これらに限定するものでは
ない。その他の潜在的アンタゴニストにはアンチセンス
分子等がある（これらの分子についての記載に関しては
Okano,J.，Neurochem.56:560（1991）；Oligodeoxy-nuc
leotides as Antisense Inhibitors of Gene Expressio
n，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ州（198
8）参照）。好ましい潜在的アンタゴニストには、アル
コールデヒドロゲナーゼ関連化合物およびアルコールデ
ヒドロゲナーゼ変種等がある。
プチドに結合し、そのことによりその活性を阻害し消失
させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗
体などがある。また、潜在的アンタゴニストは、密接に
関連した蛋白または抗体のごとき小型有機分子、ペプチ
ド、ポリペプチドであってもよく、それらは結合分子の
同じ部位に結合するが、アルコールデヒドロゲナーゼに
より誘導される活性を誘導せず、それゆえアルコールデ
ヒドロゲナーゼを結合から排除することによりアルコー
ルデヒドロゲナーゼの作用を妨害する。潜在的アンタゴ
ニストには、ポリペプチドの結合部位に結合し、および
それを占領し、それにより細胞性結合分子への結合を妨
害して、正常の生物学的活性を妨害する小型分子等があ
る。小型分子の例としては、小型有機分子、ペプチド、
ペプチド様分子等があるが、これらに限定するものでは
ない。その他の潜在的アンタゴニストにはアンチセンス
分子等がある（これらの分子についての記載に関しては
Okano,J.，Neurochem.56:560（1991）；Oligodeoxy-nuc
leotides as Antisense Inhibitors of Gene Expressio
n，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ州（198
8）参照）。好ましい潜在的アンタゴニストには、アル
コールデヒドロゲナーゼ関連化合物およびアルコールデ
ヒドロゲナーゼ変種等がある。
【００６４】本明細書に示す各ＤＮＡ配列を、抗細菌化
合物の発見および開発に使用してもよい。コードされて
いる蛋白は、発現した場合、抗細菌剤のスクリーニング
のための標的として使用されうる。さらに、コードされ
ている蛋白のアミノ末端領域または各ｍＲＮＡのシャイ
ン−ダルガノ配列または他の翻訳容易化配列をコードし
ているＤＮＡ配列を用いてアンチセンス配列を構築し、
目的コーディング配列の発現を制御することもできる。
合物の発見および開発に使用してもよい。コードされて
いる蛋白は、発現した場合、抗細菌剤のスクリーニング
のための標的として使用されうる。さらに、コードされ
ている蛋白のアミノ末端領域または各ｍＲＮＡのシャイ
ン−ダルガノ配列または他の翻訳容易化配列をコードし
ているＤＮＡ配列を用いてアンチセンス配列を構築し、
目的コーディング配列の発現を制御することもできる。
【００６５】本発明は、感染の続発症に関与する病因お
よび哺乳動物宿主間の最初の物理的相互作用を妨害する
ための本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻
害物質の使用を提供する。とりわけ本発明分子を、内在
デバイス上の哺乳動物細胞外マトリックス蛋白または傷
における細胞外マトリックス蛋白への細菌の付着、詳細
にはグラム陽性細菌の付着の防止；例えば、哺乳動物チ
ロシンキナーゼのホスホリレーションを開始することに
よる、アルコールデヒドロゲナーゼ蛋白により媒介され
る哺乳動物細胞への侵入のブロック（Rosenshine et a
l., Infect. Immunol. 60: 2211 (1992)）；哺乳動物細
胞外マトリックス蛋白と細菌アルコールデヒドロゲナー
ゼ蛋白との間の、組織ダメージを媒介する細菌付着のブ
ロック；内在デバイスの移植または他の外科的方法以外
により開始される、感染における通常の病状の進行のブ
ロックに使用することができる。
よび哺乳動物宿主間の最初の物理的相互作用を妨害する
ための本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻
害物質の使用を提供する。とりわけ本発明分子を、内在
デバイス上の哺乳動物細胞外マトリックス蛋白または傷
における細胞外マトリックス蛋白への細菌の付着、詳細
にはグラム陽性細菌の付着の防止；例えば、哺乳動物チ
ロシンキナーゼのホスホリレーションを開始することに
よる、アルコールデヒドロゲナーゼ蛋白により媒介され
る哺乳動物細胞への侵入のブロック（Rosenshine et a
l., Infect. Immunol. 60: 2211 (1992)）；哺乳動物細
胞外マトリックス蛋白と細菌アルコールデヒドロゲナー
ゼ蛋白との間の、組織ダメージを媒介する細菌付着のブ
ロック；内在デバイスの移植または他の外科的方法以外
により開始される、感染における通常の病状の進行のブ
ロックに使用することができる。
【００６６】本発明アンタゴニストおよびアゴニスト
を、例えば、感染、とりわけ細菌感染、特に中耳炎、結
膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心
内膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄
膜炎のような疾病の抑制および治療に用いてもよい。
を、例えば、感染、とりわけ細菌感染、特に中耳炎、結
膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心
内膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄
膜炎のような疾病の抑制および治療に用いてもよい。
【００６７】ヘリコバクター・ピロリ（Ｈelicobacter
pylori）（本明細書中、エッチ・ピロリともいう）菌
は、胃癌、潰瘍、胃炎を発病している世界中の人々の３
分の１以上の胃に感染している（国際癌研究機関（Inte
rnational Agency for Research on Cancer）（1994）S
chistomoses，Liver Flukes and Helicobacter Pylori
（International Agency for Research on Cancer，Lyo
n，France；http：／／www．uicc．ch／ecp／ecp2904．
htm））。さらに、この国際癌研究機関は、最近になっ
て、ヘリコバクター・ピロリと胃腺癌の間の因果関係を
認識し、その細菌をグループＩ（限定的）発癌物質と分
類した。本発明により提供されるスクリーニング法を用
いて見出される本発明の好ましい抗菌化合物（ヒスチジ
ンキナーゼポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチ
ドのアゴニストおよびアンタゴニスト）、特に広スペク
トルの抗生物質は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療
に有用である。このような治療はヘリコバクター・ピロ
リ誘発性癌、例えば胃腸癌の出現を減少させる。かかる
治療はまた胃潰瘍および胃炎も治癒する。
pylori）（本明細書中、エッチ・ピロリともいう）菌
は、胃癌、潰瘍、胃炎を発病している世界中の人々の３
分の１以上の胃に感染している（国際癌研究機関（Inte
rnational Agency for Research on Cancer）（1994）S
chistomoses，Liver Flukes and Helicobacter Pylori
（International Agency for Research on Cancer，Lyo
n，France；http：／／www．uicc．ch／ecp／ecp2904．
htm））。さらに、この国際癌研究機関は、最近になっ
て、ヘリコバクター・ピロリと胃腺癌の間の因果関係を
認識し、その細菌をグループＩ（限定的）発癌物質と分
類した。本発明により提供されるスクリーニング法を用
いて見出される本発明の好ましい抗菌化合物（ヒスチジ
ンキナーゼポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチ
ドのアゴニストおよびアンタゴニスト）、特に広スペク
トルの抗生物質は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療
に有用である。このような治療はヘリコバクター・ピロ
リ誘発性癌、例えば胃腸癌の出現を減少させる。かかる
治療はまた胃潰瘍および胃炎も治癒する。
【００６８】ワクチン 本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免
疫学的反応を誘導する方法に関し、該方法は、感染、詳
細には細菌感染、最も詳細にはストレプトコッカス・ニ
ューモニアエ感染から個体を防御するための抗体および
／またはＴ細胞免疫応答を生じさせるに十分なアルコー
ルデヒドロゲナーゼまたはそのフラグメントもしくは変
種を個体に接種することを特徴とする。かかる免疫学的
応答が細菌の複製を遅らせる方法も提供される。本発明
のさらにもう１つの態様は、個体における免疫学的応答
の誘導方法に関し、該方法は、疾病が個体においてすで
に確立されているか否かにかかわらず、インビボでアル
コールデヒドロゲナーゼ、またはそのフラグメントもし
くは変種を発現させるためにアルコールデヒドロゲナー
ゼまたはそのフラグメントもしくは変種の発現を指令す
る核酸ベクターをかかる個体に送達して、例えば、抗体
および／またはＴ細胞免疫応答（例えば、サイトカイン
産生Ｔ細胞または細胞毒性Ｔ細胞）を生じさせる免疫学
的応答を誘導して、該個体を疾病から防御する抗体を産
生させることを特徴とする。迅速に遺伝子を所望細胞中
に投与する方法としては、粒子上にコーディングするこ
と等がある。 かかる核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、また
はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含んでいてもよい。
疫学的反応を誘導する方法に関し、該方法は、感染、詳
細には細菌感染、最も詳細にはストレプトコッカス・ニ
ューモニアエ感染から個体を防御するための抗体および
／またはＴ細胞免疫応答を生じさせるに十分なアルコー
ルデヒドロゲナーゼまたはそのフラグメントもしくは変
種を個体に接種することを特徴とする。かかる免疫学的
応答が細菌の複製を遅らせる方法も提供される。本発明
のさらにもう１つの態様は、個体における免疫学的応答
の誘導方法に関し、該方法は、疾病が個体においてすで
に確立されているか否かにかかわらず、インビボでアル
コールデヒドロゲナーゼ、またはそのフラグメントもし
くは変種を発現させるためにアルコールデヒドロゲナー
ゼまたはそのフラグメントもしくは変種の発現を指令す
る核酸ベクターをかかる個体に送達して、例えば、抗体
および／またはＴ細胞免疫応答（例えば、サイトカイン
産生Ｔ細胞または細胞毒性Ｔ細胞）を生じさせる免疫学
的応答を誘導して、該個体を疾病から防御する抗体を産
生させることを特徴とする。迅速に遺伝子を所望細胞中
に投与する方法としては、粒子上にコーディングするこ
と等がある。 かかる核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、また
はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含んでいてもよい。
【００６９】本発明のさらなる態様は、免疫学的反応を
宿主内に誘導できる、または誘導されたた宿主に導入し
た場合、アルコールデヒドロゲナーゼまたはそれにより
コードされている蛋白に対する免疫学的反応を該宿主に
誘導する免疫学的組成物に関し、その組成物は組換えア
ルコールデヒドロゲナーゼまたはそれによりコードされ
ている蛋白を含み、アルコールデヒドロゲナーゼまたは
それによりコードされている蛋白に対する抗原をコード
し発現するＤＮＡを含む。免疫学的応答を治療的または
予防的に用いてもよく、また免疫学的応答はＣＴＬまた
はＣＤ４＋Ｔ細胞から生じるような抗体免疫または細胞
性免疫の形態であってもよい。
宿主内に誘導できる、または誘導されたた宿主に導入し
た場合、アルコールデヒドロゲナーゼまたはそれにより
コードされている蛋白に対する免疫学的反応を該宿主に
誘導する免疫学的組成物に関し、その組成物は組換えア
ルコールデヒドロゲナーゼまたはそれによりコードされ
ている蛋白を含み、アルコールデヒドロゲナーゼまたは
それによりコードされている蛋白に対する抗原をコード
し発現するＤＮＡを含む。免疫学的応答を治療的または
予防的に用いてもよく、また免疫学的応答はＣＴＬまた
はＣＤ４＋Ｔ細胞から生じるような抗体免疫または細胞
性免疫の形態であってもよい。
【００７０】アルコールデヒドロゲナーゼポリペプチド
またはそれらのフラグメントを、それ自身は抗体を産生
しないが、第１の蛋白を安定化し、免疫原的および保護
特性を有する融合蛋白を産生する能力のある共存蛋白
（co-protein）と融合させてもよい。好ましくは、かか
る融合組換え蛋白は、抗原補蛋白、例えばヘモフィルス
・インフルエンザエ（Hemophilus influenzae）由来の
リポ蛋白Ｄ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシダーゼのごとき共
存蛋白、蛋白を可溶化してそれらの産生および精製を促
進する比較的大きな共存蛋白等を含む。さらに、共存蛋
白は免疫系において普遍的な刺激を提供するという意味
で、アジュバントとして作用することができる。共存蛋
白は第１の蛋白のアミノまたはカルボキシいずれの末端
に結合していてもよい。
またはそれらのフラグメントを、それ自身は抗体を産生
しないが、第１の蛋白を安定化し、免疫原的および保護
特性を有する融合蛋白を産生する能力のある共存蛋白
（co-protein）と融合させてもよい。好ましくは、かか
る融合組換え蛋白は、抗原補蛋白、例えばヘモフィルス
・インフルエンザエ（Hemophilus influenzae）由来の
リポ蛋白Ｄ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシダーゼのごとき共
存蛋白、蛋白を可溶化してそれらの産生および精製を促
進する比較的大きな共存蛋白等を含む。さらに、共存蛋
白は免疫系において普遍的な刺激を提供するという意味
で、アジュバントとして作用することができる。共存蛋
白は第１の蛋白のアミノまたはカルボキシいずれの末端
に結合していてもよい。
【００７１】本発明は、本発明のポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドおよびSato Y.ら、Science 273:352 (19
66)に記載されているような免疫刺激ＤＮＡ配列を含む
組成物、とりわけワクチン組成物、および方法を提供す
る。
リヌクレオチドおよびSato Y.ら、Science 273:352 (19
66)に記載されているような免疫刺激ＤＮＡ配列を含む
組成物、とりわけワクチン組成物、および方法を提供す
る。
【００７２】また、本発明は、ストレプトコッカス・ニ
ューモニアエに感染した動物モデルにおいて、かかる遺
伝的免疫化実験に用られるＤＮＡ構築物中の細菌細胞表
面蛋白の不変領域をコードすることが示されている、説
明したポリヌクレオチドまたはとりわけそれらのフラグ
メントを用いる方法を提供し、これらはとりわけ予防的
または治療的免疫反応を刺激することができる蛋白エピ
トープを同定するのに有用である。この研究は、哺乳動
物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけストレプト
コッカス・ニューモニアエ感染の予防薬または治療的処
置の開発のために、感染に抵抗しこれを一掃するのに成
功した動物の必須器官から特に価値あるモノクローナル
抗体をうまく調製することを可能にすると思われる。
ューモニアエに感染した動物モデルにおいて、かかる遺
伝的免疫化実験に用られるＤＮＡ構築物中の細菌細胞表
面蛋白の不変領域をコードすることが示されている、説
明したポリヌクレオチドまたはとりわけそれらのフラグ
メントを用いる方法を提供し、これらはとりわけ予防的
または治療的免疫反応を刺激することができる蛋白エピ
トープを同定するのに有用である。この研究は、哺乳動
物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけストレプト
コッカス・ニューモニアエ感染の予防薬または治療的処
置の開発のために、感染に抵抗しこれを一掃するのに成
功した動物の必須器官から特に価値あるモノクローナル
抗体をうまく調製することを可能にすると思われる。
【００７３】ポリペプチドを宿主接種用抗原として用い
て、例えば損傷組織への細菌の付着を阻害することによ
り細菌の侵入に対して防御する特異的抗体を得てもよ
い。組織損傷の例としては、例えば機械的、化学的もし
くは熱的ダメージにより、または内在デバイスの埋め込
みにより引き起こされた皮膚または結合組織の創傷、ま
たは粘膜、例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷等があ
る。
て、例えば損傷組織への細菌の付着を阻害することによ
り細菌の侵入に対して防御する特異的抗体を得てもよ
い。組織損傷の例としては、例えば機械的、化学的もし
くは熱的ダメージにより、または内在デバイスの埋め込
みにより引き起こされた皮膚または結合組織の創傷、ま
たは粘膜、例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷等があ
る。
【００７４】また本発明は、適切な担体と一緒になった
免疫原性組換え蛋白を含有するワクチン処方を包含す
る。蛋白は胃で分解されうるので、非経口的に、例えば
皮下、筋肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好
ましい。非経口投与に適した処方には、抗酸化剤、緩衝
液、静細菌剤、および処方を個体の体液（好ましくは血
液）と等張にする溶質を含有していてもよい水性または
非水性滅菌注射液、および懸濁化剤または増粘剤を含有
していてもよい水性または非水性滅菌懸濁液等がある。
処方は１回投与または多回投与用容器、例えばシールし
たアンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に滅
菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として
保存してもよい。ワクチン処方は処方の免疫原性を高め
るアジュバント系を含有していてもよく、例えば水中油
系または当該分野で周知のその他の系等がある。投与量
はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験法により
容易に決定できる。
免疫原性組換え蛋白を含有するワクチン処方を包含す
る。蛋白は胃で分解されうるので、非経口的に、例えば
皮下、筋肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好
ましい。非経口投与に適した処方には、抗酸化剤、緩衝
液、静細菌剤、および処方を個体の体液（好ましくは血
液）と等張にする溶質を含有していてもよい水性または
非水性滅菌注射液、および懸濁化剤または増粘剤を含有
していてもよい水性または非水性滅菌懸濁液等がある。
処方は１回投与または多回投与用容器、例えばシールし
たアンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に滅
菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として
保存してもよい。ワクチン処方は処方の免疫原性を高め
るアジュバント系を含有していてもよく、例えば水中油
系または当該分野で周知のその他の系等がある。投与量
はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験法により
容易に決定できる。
【００７５】本発明を特定のアルコールデヒドロゲナー
ゼ蛋白に関して説明したが、本発明は天然に存在する蛋
白および、実質的に組換え蛋白の免疫原特性に影響しな
い付加、欠失または置換を施した類似の蛋白のフラグメ
ントを包含することが理解されよう。
ゼ蛋白に関して説明したが、本発明は天然に存在する蛋
白および、実質的に組換え蛋白の免疫原特性に影響しな
い付加、欠失または置換を施した類似の蛋白のフラグメ
ントを包含することが理解されよう。
【００７６】組成物、キットおよび投与 本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニス
トを含む組成物にも関する。本発明ポリペプチドを、細
胞、組織もしくは生物に用いられる未滅菌もしくは滅菌
済み担体と混合して、例えば対象への投与に適した医薬
的担体と混合して用いることができる。このような組成
物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポ
リペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦形
剤を含む。このような担体には生理食塩水、緩衝化生理
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定
するものではない。処方は投与法に適したものにすべき
である。さらに本発明は、１またはそれ以上の上記本発
明組成物成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む
診断用および医薬用パックおよびキットにも関する。
チド、またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニス
トを含む組成物にも関する。本発明ポリペプチドを、細
胞、組織もしくは生物に用いられる未滅菌もしくは滅菌
済み担体と混合して、例えば対象への投与に適した医薬
的担体と混合して用いることができる。このような組成
物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポ
リペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦形
剤を含む。このような担体には生理食塩水、緩衝化生理
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定
するものではない。処方は投与法に適したものにすべき
である。さらに本発明は、１またはそれ以上の上記本発
明組成物成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む
診断用および医薬用パックおよびキットにも関する。
【００７７】本発明ポリペプチドおよびその他の化合物
を、単独で、あるいは治療用化合物等のその他の化合物
と組み合わせて用いてもよい。いずれかの有効かつ利便
的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、経膣、静脈
内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚内の
経路で医薬組成物を投与してもよい。治療において、ま
たは予防薬として、活性物質を注射用組成物として、例
えば好ましくは等張の滅菌水性分散物として個体に投与
できる。別法として、組成物を局所適用用、例えば軟
膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳液、
洗口剤、含浸包帯および縫合用の糸、ならびにエアロゾ
ール等の形態に処方してもよく、適当な慣用的な添加
物、例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならび
に軟膏およびクリームには軟化剤を含有していてもよ
い。かかる局所用処方は、適合した慣用的な担体、例え
ばクリームまたは軟膏基剤、およびローションにはエタ
ノールまたはオレイルアルコールを含有していてもよ
い。このような担体は重量で処方の約１％から約９８％
であってよく、より通常には重量で処方の約８０％まで
とする。哺乳動物とりわけヒトに投与するために、活性
物質の１日あたりの投与量は、０.０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はあらゆる場合、個体に最も適した実際の投与
量を決定し、年齢、体重および特に個体の反応性に応じ
て変化させる。上述の投与量は、平均的なケースの典型
例である。もちろん、高用量および低用量の範囲が適合
する個々の例もあり、かかる例は本発明の範囲内であ
る。
を、単独で、あるいは治療用化合物等のその他の化合物
と組み合わせて用いてもよい。いずれかの有効かつ利便
的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、経膣、静脈
内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚内の
経路で医薬組成物を投与してもよい。治療において、ま
たは予防薬として、活性物質を注射用組成物として、例
えば好ましくは等張の滅菌水性分散物として個体に投与
できる。別法として、組成物を局所適用用、例えば軟
膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳液、
洗口剤、含浸包帯および縫合用の糸、ならびにエアロゾ
ール等の形態に処方してもよく、適当な慣用的な添加
物、例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならび
に軟膏およびクリームには軟化剤を含有していてもよ
い。かかる局所用処方は、適合した慣用的な担体、例え
ばクリームまたは軟膏基剤、およびローションにはエタ
ノールまたはオレイルアルコールを含有していてもよ
い。このような担体は重量で処方の約１％から約９８％
であってよく、より通常には重量で処方の約８０％まで
とする。哺乳動物とりわけヒトに投与するために、活性
物質の１日あたりの投与量は、０.０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はあらゆる場合、個体に最も適した実際の投与
量を決定し、年齢、体重および特に個体の反応性に応じ
て変化させる。上述の投与量は、平均的なケースの典型
例である。もちろん、高用量および低用量の範囲が適合
する個々の例もあり、かかる例は本発明の範囲内であ
る。
【００７８】内在デバイスには外科的インプラント、補
てつデバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体
に導入し、長時間その位置に存在するものである。この
ようなデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャ
ント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析（contin
uous ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カ
テーテル等がある。本発明の組成物を注射により投与
し、内在デバイスの挿入の直前に、関連細菌に対する全
身的な効果を得てもよい。手術後、デバイスが体内に存
在する期間中、処置を続けてもよい。さらに、外科的手
技中に広げるカバーに用いて、細菌性創傷感染、とりわ
けストレプトコッカス・ニューモニアエの創傷感染を防
御することもできる。
てつデバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体
に導入し、長時間その位置に存在するものである。この
ようなデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャ
ント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析（contin
uous ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カ
テーテル等がある。本発明の組成物を注射により投与
し、内在デバイスの挿入の直前に、関連細菌に対する全
身的な効果を得てもよい。手術後、デバイスが体内に存
在する期間中、処置を続けてもよい。さらに、外科的手
技中に広げるカバーに用いて、細菌性創傷感染、とりわ
けストレプトコッカス・ニューモニアエの創傷感染を防
御することもできる。
【００７９】多くの整形外科医は、補てつ関節を有する
ヒトについては、菌血症を生じうる歯科的処置の前に抗
生物質予防法を考慮すべきであると考えている。遅延性
の重篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻な合
併症であり、有意性のある罹病率および死亡率を伴う。
それゆえ、この状況において、予防的な抗生物質に代わ
るものとして、活性物質の使用を拡張することが可能で
ある。
ヒトについては、菌血症を生じうる歯科的処置の前に抗
生物質予防法を考慮すべきであると考えている。遅延性
の重篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻な合
併症であり、有意性のある罹病率および死亡率を伴う。
それゆえ、この状況において、予防的な抗生物質に代わ
るものとして、活性物質の使用を拡張することが可能で
ある。
【００８０】上述の治療に加え、一般的には本発明組成
物を創傷の治療薬として使用して、創傷組織において曝
露されたマトリックス蛋白に細菌が付着するのを防いで
もよく、歯科治療においては抗生物質による予防法に代
えて、またはそれと組み合わせて予防的に使用してもよ
い。
物を創傷の治療薬として使用して、創傷組織において曝
露されたマトリックス蛋白に細菌が付着するのを防いで
もよく、歯科治療においては抗生物質による予防法に代
えて、またはそれと組み合わせて予防的に使用してもよ
い。
【００８１】別法として、本発明の組成物を用いて挿入
直前の内在デバイスを浸してもよい。創傷または内在デ
バイスを浸すためには、活性物質は１μｇ／ｍｌから１
０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。ワクチン組成
物を便宜的に注射可能な形態にする。慣用的なアジュバ
ントを用いて免疫反応を高めてもよい。ワクチン化に適
した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、
このような投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するの
が好ましい。本発明化合物については、指示した投与量
範囲では、適切な個体への投与を妨げるような不利な毒
性効果は観察されない。本明細書に開示した各文献を、
参照によりその全体が本明細書に記載されているものと
みなす。本願が優先権を主張しているいずれの特許出願
も、参照によりその全体が本明細書に記載されているも
のとみなす。
直前の内在デバイスを浸してもよい。創傷または内在デ
バイスを浸すためには、活性物質は１μｇ／ｍｌから１
０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。ワクチン組成
物を便宜的に注射可能な形態にする。慣用的なアジュバ
ントを用いて免疫反応を高めてもよい。ワクチン化に適
した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、
このような投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するの
が好ましい。本発明化合物については、指示した投与量
範囲では、適切な個体への投与を妨げるような不利な毒
性効果は観察されない。本明細書に開示した各文献を、
参照によりその全体が本明細書に記載されているものと
みなす。本願が優先権を主張しているいずれの特許出願
も、参照によりその全体が本明細書に記載されているも
のとみなす。
【００８２】
【実施例】以下の実施例は、詳細に説明したこと以外
は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を用いて実施
する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を
限定するものではない。 実施例１：菌株の選択、ライブラリーの製造および配列
決定 配列番号：１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチ
ドを、イー・コリ（E.coli）中のストレプトコッカス・
ニューモニアエの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリ
ーから得た。重複するストレプトコッカス・ニューモニ
アエのＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローン
からの配列決定データを用いて配列番号：１の隣接ＤＮ
Ａ配列を構築した場合もある。通常の方法、例えば以下
の方法１および２によりライブラリーを製造できる。全
細胞ＤＮＡは、ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0
100993から、標準法に準じて単離し、二つの方法のどち
らかによりサイズ分画する。
は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を用いて実施
する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を
限定するものではない。 実施例１：菌株の選択、ライブラリーの製造および配列
決定 配列番号：１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチ
ドを、イー・コリ（E.coli）中のストレプトコッカス・
ニューモニアエの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリ
ーから得た。重複するストレプトコッカス・ニューモニ
アエのＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローン
からの配列決定データを用いて配列番号：１の隣接ＤＮ
Ａ配列を構築した場合もある。通常の方法、例えば以下
の方法１および２によりライブラリーを製造できる。全
細胞ＤＮＡは、ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0
100993から、標準法に準じて単離し、二つの方法のどち
らかによりサイズ分画する。
【００８３】方法１ 標準法に準じてサイズ分画化するために、全細胞ＤＮＡ
を注射針に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの
大きさのフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断されているベクターラムダＺａｐＩＩに
連結し、標準法によりライブラリーをパッケージング
し、次いでパッケージングしたライブラリーでE. coli
を感染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。
を注射針に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの
大きさのフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断されているベクターラムダＺａｐＩＩに
連結し、標準法によりライブラリーをパッケージング
し、次いでパッケージングしたライブラリーでE. coli
を感染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。
【００８４】方法２ 全細胞ＤＮＡは、ライブラリーベクター（例えば、Ｒｓ
ａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）にクロ
ーニングするための一連のフラグメントを適切に生じる
１の制限酵素または制限酵素の組み合わせで部分的加水
分解し、かかるフラグメントを標準法に準じてサイズ分
画化する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメ
ントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断されているベク
ターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブラ
リーをパッケージングし、次いでパッケージングしたラ
イブラリーでE. coliを感染させる。ライブラリーを標
準法により増幅する。
ａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）にクロ
ーニングするための一連のフラグメントを適切に生じる
１の制限酵素または制限酵素の組み合わせで部分的加水
分解し、かかるフラグメントを標準法に準じてサイズ分
画化する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメ
ントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断されているベク
ターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブラ
リーをパッケージングし、次いでパッケージングしたラ
イブラリーでE. coliを感染させる。ライブラリーを標
準法により増幅する。
【００８５】実施例２ ストレプトコッカス・ニューモ
ニアエ由来の遺伝子の感染の間における発現の決定 マウスのストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００
９９３での気道感染４８時間目の切除肺を効果的に破砕
し、カオトロピック剤およびＲＮＡａｓｅ阻害剤の存在
下で処理して動物および細菌のＲＮＡ混合物を得る。安
定な調合物および高収率の細菌ＲＮＡを得るための破砕
および処理の最適条件は、その後のノーザンブロット上
におけるストレプトコッカス・ニューモニアエ １６Ｓ
ＲＮＡに特異的な放射性標識オリゴヌクレオチドとのハ
イブリダイゼーションの使用にも用いる。得られたＲＮ
ＡについてのＲＮＡａｓｅ不含、ＤＮＡａｓｅ不含、Ｄ
ＮＡおよび蛋白不含の調合物は、ストレプトコッカス・
ニューモニアエ０１００９９３の各遺伝子の配列から設
計されたユニークなプライマーペアーを用いる逆転写Ｐ
ＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に適する。
ニアエ由来の遺伝子の感染の間における発現の決定 マウスのストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００
９９３での気道感染４８時間目の切除肺を効果的に破砕
し、カオトロピック剤およびＲＮＡａｓｅ阻害剤の存在
下で処理して動物および細菌のＲＮＡ混合物を得る。安
定な調合物および高収率の細菌ＲＮＡを得るための破砕
および処理の最適条件は、その後のノーザンブロット上
におけるストレプトコッカス・ニューモニアエ １６Ｓ
ＲＮＡに特異的な放射性標識オリゴヌクレオチドとのハ
イブリダイゼーションの使用にも用いる。得られたＲＮ
ＡについてのＲＮＡａｓｅ不含、ＤＮＡａｓｅ不含、Ｄ
ＮＡおよび蛋白不含の調合物は、ストレプトコッカス・
ニューモニアエ０１００９９３の各遺伝子の配列から設
計されたユニークなプライマーペアーを用いる逆転写Ｐ
ＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に適する。
【００８６】ａ）感染（肺）のマウス動物モデルからの
ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３感
染組織の単離 ウマ血液プレートまたはＡＧＣＨ培地のいずれかで、３
７℃、５％ ＣＯ2で一晩ストレプトコッカス・ニューモ
ニアエ０１００９９３を増殖させる。次いで、細菌を集
め、リン酸塩緩衝化セイライン中に再懸濁してＡ600を
約０．４とする。イソフルオランでマウスを麻酔し、５
０ｍｌの細菌懸濁液（約２ｘ１０5個）をピペットマン
を用いて鼻腔内投与する。マウスを回復させ、エサおよ
び水を自由に取らせる。４８時間後、過剰量の二酸化炭
素によりマウスを安楽死させ、肺を無菌的に切除し、液
体窒素中で素早く凍結する。
ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３感
染組織の単離 ウマ血液プレートまたはＡＧＣＨ培地のいずれかで、３
７℃、５％ ＣＯ2で一晩ストレプトコッカス・ニューモ
ニアエ０１００９９３を増殖させる。次いで、細菌を集
め、リン酸塩緩衝化セイライン中に再懸濁してＡ600を
約０．４とする。イソフルオランでマウスを麻酔し、５
０ｍｌの細菌懸濁液（約２ｘ１０5個）をピペットマン
を用いて鼻腔内投与する。マウスを回復させ、エサおよ
び水を自由に取らせる。４８時間後、過剰量の二酸化炭
素によりマウスを安楽死させ、肺を無菌的に切除し、液
体窒素中で素早く凍結する。
【００８７】ｂ）感染組織試料からストレプトコッカス
・ニューモニアエ０１００９９３の単離 ２ｍｌの凍結保存チューブ中の感染組織試料を−８０℃
の貯蔵庫からドライアイス−エタノール浴中に取り出
す。微生物安全キャビネット中で試料を破砕し、残った
試料をドライアイス−エタノール浴中で保存する。組織
試料中の細菌を破砕するために、５０〜１００ｍｇの組
織をシリカ／セラミックマトリックス（BIO 101）を入
れたFastRNAチューブに移す。すぐに抽出試薬（FastRNA
試薬，BIO 101）１ｍｌを添加して試料対試薬の比を約
１対２０とする。６０００ｒｐｍの往復震盪機（FastPr
ep FR120, BIO 101）で２０〜１２０秒チューブを振盪
する。粗ＲＮＡ調合物をクロロホルム／イソアミルアル
コールで抽出し、ＤＥＰＣ−処理イソプロパン−ル沈殿
溶液（Bio 101）で沈殿させる。必要ならば、−８０℃
においてＲＮＡ調合物をこのイソプロパノール溶液中に
保存する。ＲＮＡをペレット化し（１２０００ｇ、１０
分）、７５％（ＤＥＰＣ−処理水中ｖ／ｖ）エタノール
で洗浄し、５〜１０分風乾し、次いで、ＤＥＰＣ処理水
０．１ｍｌに再懸濁し、その後、５５℃で５〜１０分置
く。最後に、氷上に少なくとも１分置き、２００ユニッ
トのＲｎａｓｉｎ（Promega）を添加する。ＲＮＡ調合
物は−８０℃で１カ月まで保存される。長期保存には、
プロトコールの洗浄段階における７５％エタノール中の
ＲＮＡ沈殿は−２０℃で少なくとも１年保存できる。１
％アガロースゲル上に試料を泳動することにより単離Ｒ
ＮＡの品質を評価する。臭化エチジウム染色した１ｘＴ
ＢＥゲルを用いて収集全ＲＮＡを可視化する。感染組織
からの細菌ＲＮＡの単離を示すために、１ｘＭＯＰＳ、
２．２Ｍホルムアルデヒドゲルで泳動を行い、Hybond-N
（Amersham）に減圧ブロッティングする。次いで、ブロ
ットを、ストレプトコッカス・ニューモニアの１６Ｓ
ｒＲＮＡに特異的な32Ｐ標識オリゴヌクレオチドプロー
ブ（５’AACTGAGACT GGCTTTAAGAGATTA３’［配列番号：
５］）とハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイ
ゼーションしているバンドのサイズを、インビボ増殖し
たストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９か
ら単離された対照ＲＮＡのものとノーザンブロットにお
いて比較する。全ＲＮＡ試料中において正しいサイズの
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡバンドが検出でき、ＴＢＥゲル上
で可視化した場合、哺乳動物ＲＮＡの分解が示される。
・ニューモニアエ０１００９９３の単離 ２ｍｌの凍結保存チューブ中の感染組織試料を−８０℃
の貯蔵庫からドライアイス−エタノール浴中に取り出
す。微生物安全キャビネット中で試料を破砕し、残った
試料をドライアイス−エタノール浴中で保存する。組織
試料中の細菌を破砕するために、５０〜１００ｍｇの組
織をシリカ／セラミックマトリックス（BIO 101）を入
れたFastRNAチューブに移す。すぐに抽出試薬（FastRNA
試薬，BIO 101）１ｍｌを添加して試料対試薬の比を約
１対２０とする。６０００ｒｐｍの往復震盪機（FastPr
ep FR120, BIO 101）で２０〜１２０秒チューブを振盪
する。粗ＲＮＡ調合物をクロロホルム／イソアミルアル
コールで抽出し、ＤＥＰＣ−処理イソプロパン−ル沈殿
溶液（Bio 101）で沈殿させる。必要ならば、−８０℃
においてＲＮＡ調合物をこのイソプロパノール溶液中に
保存する。ＲＮＡをペレット化し（１２０００ｇ、１０
分）、７５％（ＤＥＰＣ−処理水中ｖ／ｖ）エタノール
で洗浄し、５〜１０分風乾し、次いで、ＤＥＰＣ処理水
０．１ｍｌに再懸濁し、その後、５５℃で５〜１０分置
く。最後に、氷上に少なくとも１分置き、２００ユニッ
トのＲｎａｓｉｎ（Promega）を添加する。ＲＮＡ調合
物は−８０℃で１カ月まで保存される。長期保存には、
プロトコールの洗浄段階における７５％エタノール中の
ＲＮＡ沈殿は−２０℃で少なくとも１年保存できる。１
％アガロースゲル上に試料を泳動することにより単離Ｒ
ＮＡの品質を評価する。臭化エチジウム染色した１ｘＴ
ＢＥゲルを用いて収集全ＲＮＡを可視化する。感染組織
からの細菌ＲＮＡの単離を示すために、１ｘＭＯＰＳ、
２．２Ｍホルムアルデヒドゲルで泳動を行い、Hybond-N
（Amersham）に減圧ブロッティングする。次いで、ブロ
ットを、ストレプトコッカス・ニューモニアの１６Ｓ
ｒＲＮＡに特異的な32Ｐ標識オリゴヌクレオチドプロー
ブ（５’AACTGAGACT GGCTTTAAGAGATTA３’［配列番号：
５］）とハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイ
ゼーションしているバンドのサイズを、インビボ増殖し
たストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９か
ら単離された対照ＲＮＡのものとノーザンブロットにお
いて比較する。全ＲＮＡ試料中において正しいサイズの
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡバンドが検出でき、ＴＢＥゲル上
で可視化した場合、哺乳動物ＲＮＡの分解が示される。
【００８８】ｃ）ストレプトコッカス・ニューモニアエ
由来のＲＮＡからのＤＮＡの除去 最終体積５７μｌのバッファー中で２０ユニットのＲＮ
Ａａｓｅ不含ＤＮＡａｓｅＩ（GenHunter）を用いて３
７℃で３０分処理することにより、５０マイクログラム
のＲＮＡ試料からＤＮＡを除去した。製造者のプロトコ
ールに従ってTRIzol LS試薬（Gibco BRL, Life Technol
ogies）によりＤＮＡａｓｅを不活性化し除去した。Ｄ
ＮＡａｓｅ処理したＲＮＡを上記Ｒｎａｓｉｎを添加し
たＤＰＥＣ処理水１００マイクロリットル中に再懸濁し
た。
由来のＲＮＡからのＤＮＡの除去 最終体積５７μｌのバッファー中で２０ユニットのＲＮ
Ａａｓｅ不含ＤＮＡａｓｅＩ（GenHunter）を用いて３
７℃で３０分処理することにより、５０マイクログラム
のＲＮＡ試料からＤＮＡを除去した。製造者のプロトコ
ールに従ってTRIzol LS試薬（Gibco BRL, Life Technol
ogies）によりＤＮＡａｓｅを不活性化し除去した。Ｄ
ＮＡａｓｅ処理したＲＮＡを上記Ｒｎａｓｉｎを添加し
たＤＰＥＣ処理水１００マイクロリットル中に再懸濁し
た。
【００８９】ｄ）感染組織由来のＲＮＡ試料からのｃＤ
ＮＡの調製 製造者の指示に従って、ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡの
試料３マイクログラムを、First Strand cDNA合成キッ
ト用のSuperScript Preamplification System（Gibco B
RL, Life Technologies）を用いて逆転写する。１５０
ナノグラムのランダムヘキサマーを用いて各反応を開始
する。SuperScriptII逆転写酵素を添加しない対照も反
応させる。＋／−ＲＴ双方の試料をＲＮａｓｅＨで処理
し、次いで、ＰＣＲ反応に供する。
ＮＡの調製 製造者の指示に従って、ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡの
試料３マイクログラムを、First Strand cDNA合成キッ
ト用のSuperScript Preamplification System（Gibco B
RL, Life Technologies）を用いて逆転写する。１５０
ナノグラムのランダムヘキサマーを用いて各反応を開始
する。SuperScriptII逆転写酵素を添加しない対照も反
応させる。＋／−ＲＴ双方の試料をＲＮａｓｅＨで処理
し、次いで、ＰＣＲ反応に供する。
【００９０】ｅ）細菌ｃＤＮＡ種の存在を調べるための
ＰＣＲの使用 下記成分を添加することにより氷上で０．２ｍｌのチュ
ーブにおいてＰＣＲ反応物をセットアップする：４３マ
イクロリットルのPCR Master Mix（Advanced Biotechno
logies Ltd.）；１マイクロリットルのＰＣＲプライマ
ー（最適には、１８〜２５塩基対の長さで、類似のアニ
ーリング温度を有するように設計されたもの）（各プラ
イマーは初発濃度１０ｍＭ）；および５マイクロリット
ルのｃＤＮＡ。Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600
においてＰＣＲ反応を行った：９４℃で２分、次いでそ
れぞれ９４℃、５０℃そして７２℃で３０秒を５０サイ
クル、その後７２℃で７分、次いで、保持温度２０℃と
する（最適には、ＰＣＲ生成物の出現または欠乏を決定
するためのサイクル数は３０〜５０回、ＲＴ反応からの
初発ｃＤＮＡ量の評価を行う場合には、最適には８〜３
０サイクル）。次いで、１０マイクロリットルの部分試
料を１％ ＴＢＥゲルで泳動し、臭化エチジウム染色す
る。ＰＣＲ生成物については、存在するならば、１００
ｂｐのＤＮＡラダー（Gibco BRL, Life Technologies）
との比較によりサイズを評価する。別法として、便利に
は、標識ＰＣＲプライマー（例えば、５’末端を標識し
たもの）を用いてＰＣＲ生成物を標識し、ＰＣＲ生成物
の適当な部分試料をポリアクリルアミドゲルで泳動し、
適当なゲルスキャンニングシステム（例えば、Perkin E
lmerにより提供されるGeneScanTMソフトウェアを用いた
ABI PrismTM 377 Sequencer）を用いてその存在および
量を調べる。ＲＴ／ＰＣＲ対照は＋／−逆転写酵素反応
物、非転写ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１０
０９９３ゲノム配列からＰＣＲ生成物を生じるように設
計された１６Ｓ ｒＲＮＡプライマーもしくはＤＮＡ特
異的プライマーペアーを含んでいてもよい。プライマー
ペアーの効率を試験するために、それらをストレプトコ
ッカス・ニューモニアエ０１００９９３全ＤＮＡを用い
るＤＮＡ ＰＣＲに使用する。ＰＣＲ反応をセットアッ
プし、ｃＤＮＡの代わりに約１マイクログラムのＤＮＡ
を用いて上記のごとく反応を行う。ＤＮＡ ＰＣＲまた
はＰＴ／ＰＣＲのいずれにおいても予想サイズの生成物
を生じないプライマーペアーはＰＣＲ反応できず、その
ようなものとしては不均一である。ＤＮＡ ＰＣＲで正
しいサイズの生成物を生じるものは２つのクラスに分類
される：１．インビボで転写されない遺伝子であって、
ＲＴ／ＰＣＲにおいて生成物を生じる再現性がないも
の；および２．インビボで転写される遺伝子であって、
ＲＴ／ＰＣＲにおいて正しいサイズの生成物を再現性を
もって生じ、＋ＲＴ試料において−ＲＴ対照におけるシ
グナル（生じた場合には）よりも強力なシグナルを生じ
るもの。
ＰＣＲの使用 下記成分を添加することにより氷上で０．２ｍｌのチュ
ーブにおいてＰＣＲ反応物をセットアップする：４３マ
イクロリットルのPCR Master Mix（Advanced Biotechno
logies Ltd.）；１マイクロリットルのＰＣＲプライマ
ー（最適には、１８〜２５塩基対の長さで、類似のアニ
ーリング温度を有するように設計されたもの）（各プラ
イマーは初発濃度１０ｍＭ）；および５マイクロリット
ルのｃＤＮＡ。Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600
においてＰＣＲ反応を行った：９４℃で２分、次いでそ
れぞれ９４℃、５０℃そして７２℃で３０秒を５０サイ
クル、その後７２℃で７分、次いで、保持温度２０℃と
する（最適には、ＰＣＲ生成物の出現または欠乏を決定
するためのサイクル数は３０〜５０回、ＲＴ反応からの
初発ｃＤＮＡ量の評価を行う場合には、最適には８〜３
０サイクル）。次いで、１０マイクロリットルの部分試
料を１％ ＴＢＥゲルで泳動し、臭化エチジウム染色す
る。ＰＣＲ生成物については、存在するならば、１００
ｂｐのＤＮＡラダー（Gibco BRL, Life Technologies）
との比較によりサイズを評価する。別法として、便利に
は、標識ＰＣＲプライマー（例えば、５’末端を標識し
たもの）を用いてＰＣＲ生成物を標識し、ＰＣＲ生成物
の適当な部分試料をポリアクリルアミドゲルで泳動し、
適当なゲルスキャンニングシステム（例えば、Perkin E
lmerにより提供されるGeneScanTMソフトウェアを用いた
ABI PrismTM 377 Sequencer）を用いてその存在および
量を調べる。ＲＴ／ＰＣＲ対照は＋／−逆転写酵素反応
物、非転写ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１０
０９９３ゲノム配列からＰＣＲ生成物を生じるように設
計された１６Ｓ ｒＲＮＡプライマーもしくはＤＮＡ特
異的プライマーペアーを含んでいてもよい。プライマー
ペアーの効率を試験するために、それらをストレプトコ
ッカス・ニューモニアエ０１００９９３全ＤＮＡを用い
るＤＮＡ ＰＣＲに使用する。ＰＣＲ反応をセットアッ
プし、ｃＤＮＡの代わりに約１マイクログラムのＤＮＡ
を用いて上記のごとく反応を行う。ＤＮＡ ＰＣＲまた
はＰＴ／ＰＣＲのいずれにおいても予想サイズの生成物
を生じないプライマーペアーはＰＣＲ反応できず、その
ようなものとしては不均一である。ＤＮＡ ＰＣＲで正
しいサイズの生成物を生じるものは２つのクラスに分類
される：１．インビボで転写されない遺伝子であって、
ＲＴ／ＰＣＲにおいて生成物を生じる再現性がないも
の；および２．インビボで転写される遺伝子であって、
ＲＴ／ＰＣＲにおいて正しいサイズの生成物を再現性を
もって生じ、＋ＲＴ試料において−ＲＴ対照におけるシ
グナル（生じた場合には）よりも強力なシグナルを生じ
るもの。
【００９１】
【配列表】 （１）一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：SmithKline Beecham Corporation （Ｂ）通り名：One Franklin Plaza （Ｃ）都市名：Philadelphia （Ｄ）州名：PA （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９１０３ （ｉｉ）発明の名称：新規アルコールデヒドロゲナーゼ （ｉｉｉ）配列の数：５ （ｉｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）作動システム：ＤＯＳ （Ｄ）Windows用FastSEQバージョン２．０ｂ （ｖ）現出願データ： （Ａ）出願番号：
【００９２】 （２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０２３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： ATGATTAATC AAATTTATCA ACTAACTAAG CCTAAGTTTA TCAATGTCAA ATATCAGGAA 60 GAGGCTATTG ACCAAGAGAA TCATATCCTT ATCCGTCCCA ACTACATGGC TGTCTGTCAT 120 GCGGATCAGC GTTACTATCA GGGAAAACGT GATCCCAAGA TTTTGAATAA AAAGCTTCCA 180 ATGGCAATGA TTCACGAGTC ATGTGGAACC GTCATTTCTG ACCCGACCGG AACCTACGAG 240 GTTGGTCAAA AAGTTGTCAT GATTCCCAAT CAGTCTCCTA TGCAGAGTGA TGAAGAATTC 300 TATGAAAACT ACATGACAGG GACCCATTTC TTGTCTAGTG GATTTGATGG CTTTATGAGA 360 GAGTTTGTTT CTCTCCCTAA AGATCGTGTG GTGGCTTATG ATGCTATTGA AGATACGGTT 420 GCAGCCATTA CAGAGTTTGT CAGTGTGGGC ATGCACGCTA TGAATCGTCT ATTGACTCTT 480 GCTCATAGCA AGCGGGAGCG GATCGCCGTT ATTGGAGATG GGAGTTTAGC TTTTGTGGTT 540 GCCAATATTA TCAACTATAC TTTGCCAGAA GCAGAGATTG TGGTTATTGG TCGTCATTGG 600 GAAAAGTTGG AACTCTTCTC ATTTGCCAAA GAATGCTATA TTACGGATAA TATTCCTGAA 660 GATTTGGCCT TTGACCATGC TTTTGAATGT TGTGGTGGTG ATGGTACTGG ACCAGCTATT 720 AATGACTTGA TTCGCTACAT TCGTCCTCAG GGAACGATTC TCATGATGGG AGTTAGCGAA 780 TATAAAGTCA ATCTCAATAC TCGCGATGCC TTAGAAAAGG GCTTGATTTT GGTTGGGTCA 840 TCTCGTTCTG GTCGCATTGA TTTTGAAAAT GCTATCCAAA TGATGGAAGT CAAGAAATTT 900 GCCAATCGTC TTAAAAATAT CCTTTATCTA GAAGAACCTG TAAGAGAAAT TAAAGATATT 960 CATCGTGTCT TTGCAACCGA TTTAAACACA GCCTTTAAAA CAGTGTTTAA GTGGGAAGTA 1020 TAA 1023
【００９３】 （２）配列番号：２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３４０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Met Ile Asn Gln Ile Tyr Gln Leu Thr Lys Pro Lys Phe Ile Asn Val 1 5 10 15 Lys Tyr Gln Glu Glu Ala Ile Asp Gln Glu Asn His Ile Leu Ile Arg 20 25 30 Pro Asn Tyr Met Ala Val Cys His Ala Asp Gln Arg Tyr Tyr Gln Gly 35 40 45 Lys Arg Asp Pro Lys Ile Leu Asn Lys Lys Leu Pro Met Ala Met Ile 50 55 60 His Glu Ser Cys Gly Thr Val Ile Ser Asp Pro Thr Gly Thr Tyr Glu 65 70 75 80 Val Gly Gln Lys Val Val Met Ile Pro Asn Gln Ser Pro Met Gln Ser 85 90 95 Asp Glu Glu Phe Tyr Glu Asn Tyr Met Thr Gly Thr His Phe Leu Ser 100 105 110 Ser Gly Phe Asp Gly Phe Met Arg Glu Phe Val Ser Leu Pro Lys Asp 115 120 125 Arg Val Val Ala Tyr Asp Ala Ile Glu Asp Thr Val Ala Ala Ile Thr 130 135 140 Glu Phe Val Ser Val Gly Met His Ala Met Asn Arg Leu Leu Thr Leu 145 150 155 160 Ala His Ser Lys Arg Glu Arg Ile Ala Val Ile Gly Asp Gly Ser Leu 165 170 175 Ala Phe Val Val Ala Asn Ile Ile Asn Tyr Thr Leu Pro Glu Ala Glu 180 185 190 Ile Val Val Ile Gly Arg His Trp Glu Lys Leu Glu Leu Phe Ser Phe 195 200 205 Ala Lys Glu Cys Tyr Ile Thr Asp Asn Ile Pro Glu Asp Leu Ala Phe 210 215 220 Asp His Ala Phe Glu Cys Cys Gly Gly Asp Gly Thr Gly Pro Ala Ile 225 230 235 240 Asn Asp Leu Ile Arg Tyr Ile Arg Pro Gln Gly Thr Ile Leu Met Met 245 250 255 Gly Val Ser Glu Tyr Lys Val Asn Leu Asn Thr Arg Asp Ala Leu Glu 260 265 270 Lys Gly Leu Ile Leu Val Gly Ser Ser Arg Ser Gly Arg Ile Asp Phe 275 280 285 Glu Asn Ala Ile Gln Met Met Glu Val Lys Lys Phe Ala Asn Arg Leu 290 295 300 Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Val Arg Glu Ile Lys Asp Ile 305 310 315 320 His Arg Val Phe Ala Thr Asp Leu Asn Thr Ala Phe Lys Thr Val Phe 325 330 335 Lys Trp Glu Val 340
【００９４】 （２）配列番号：３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３： ATACGGTTGC AGCCATTACA GAGT 24
【００９５】 （２）配列番号：４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４： AAAATCAATG CGACCAGAAC GAGA 24
【００９６】 （２）配列番号：５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５： AACTGAGACT GGCTTTAAGA GATTA 25
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３１ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３１Ｃ 38/44 39/09 39/09 39/395 Ｄ 39/395 Ｒ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｅ Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｐ 33/50 Ｔ 33/566 33/566 33/68 33/68 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/50 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 ジェイムズ・レイモンド・ブラウン アメリカ合衆国19312ペンシルベニア州バ ーウィン、ロビンズ・レイン９番
Claims (20)
- 【請求項１】（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドコードしているポリヌクレオチドに対して少
なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）寄託株のストレプトコッカス・ニューモニアエ中
に含まれるアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子により発
現されるのと同じ成熟ポリペプチドをコードしているポ
リヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有
するポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも
７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
ードしているポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
に対して相捕的であるポリヌクレオチド；および （ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
の少なくとも１５個の連続した塩基を含むポリヌクレオ
チドからなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を
含む単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチ
ド。 - 【請求項３】 ＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチ
ド。 - 【請求項４】 配列番号１に示す核酸配列を含む請求項
２のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 配列番号１に示すヌクレオチド１から１
０２０までを含む請求項２のポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドをコードしている請求項２のポリヌクレオチ
ド。 - 【請求項７】 請求項１のポリヌクレオチドを含むベク
ター。 - 【請求項８】 請求項７のベクターを含む宿主細胞。
- 【請求項９】 請求項８の宿主細胞から上記ＤＮＡによ
りコードされているポリペプチドを発現させることを含
む、ポリペプチドの製造方法。 - 【請求項１０】 アルコールデヒドロゲナーゼポリペプ
チドまたはフラグメントの製造方法であって、該ポリペ
プチドまたはフラグメントの生成に十分な条件下で請求
項８の宿主を培養することを含む方法。 - 【請求項１１】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して
少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペ
プチド。 - 【請求項１２】 配列番号：２に示すアミノ酸配列を含
むポリペプチド。 - 【請求項１３】 請求項１１のポリペプチドに対する抗
体。 - 【請求項１４】 請求項１１のポリペプチドの活性また
は発現を阻害するアンタゴニスト。 - 【請求項１５】 治療上有効量の請求項１１のポリペプ
チドを個体に投与することを含む、アルコールデヒドロ
ゲナーゼポリペプチドを必要とする個体の治療方法。 - 【請求項１６】 治療上有効量の請求項１４のアンタゴ
ニストを個体に投与することを含む、アルコールデヒド
ロゲナーゼポリペプチドの阻害を必要とする個体の治療
方法。 - 【請求項１７】 個体における請求項１１のポリペプチ
ドの発現または活性に関連した疾病の診断方法であっ
て、 （ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸配列を決定
すること、および／または（ｂ）個体由来の試料中の該
ポリペプチドの存在または量について分析することを含
む方法。 - 【請求項１８】 請求項１１のポリペプチドと相互作用
して、その活性を阻害または活性化する化合物の同定方
法であって、 化合物とポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条
件下で、ポリペプチドとスクリーニングすべき化合物と
を接触させて化合物の相互作用を評価し（かかる相互作
用はポリペプチドと化合物との相互作用に応答した検出
可能シグナルを提供しうる第２の成分に関連したもので
ある）、 次いで、化合物とポリペプチドとの相互作用により生じ
るシグナルの存在または不存在を検出することにより、
化合物がポリペプチドと相互作用して、その活性を活性
化または阻害するかどうかを決定することを含む方法。 - 【請求項１９】 哺乳動物における免疫学的応答を誘導
する方法であって、抗体および／またはＴ細胞免疫応答
を生じさせて動物を疾病から防御するに十分な請求項１
１のアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはそ
のフラグメントもしくは変種を哺乳動物に接種すること
を含む方法。 - 【請求項２０】 哺乳動物における免疫学的応答を誘導
する方法であって、アルコールデヒドロゲナーゼポリペ
プチドまたはそのフラグメントもしくは変種をインビボ
で発現させて、抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生
じさせる免疫学的応答を誘導して該動物を疾病から防御
するするために、請求項１１のアルコールデヒドロゲナ
ーゼポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変種
の発現を指令する核酸ベクターを送達することを含む方
法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US93753097A | 1997-09-25 | 1997-09-25 | |
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|---|---|
| JPH11285390A true JPH11285390A (ja) | 1999-10-19 |
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|---|---|---|---|
| JP10309357A Withdrawn JPH11285390A (ja) | 1997-09-25 | 1998-09-25 | 新規アルコールデヒドロゲナーゼ |
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| JP (1) | JPH11285390A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| KR20030056628A (ko) * | 2001-12-28 | 2003-07-04 | 학교법인 성균관대학 | 폐렴구균 알코올 탈수소효소를 이용한 폐렴구균의 동정방법 |
| JP2021525528A (ja) * | 2018-05-31 | 2021-09-27 | 康碼（上海）生物科技有限公司Ｋａｎｇｍａ−Ｈｅａｌｔｈｃｏｄｅ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ | Ａｄｈタンパク質ファミリー変異体およびその使用 |
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-
1998
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- 1998-09-25 JP JP10309357A patent/JPH11285390A/ja not_active Withdrawn
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| KR20030056628A (ko) * | 2001-12-28 | 2003-07-04 | 학교법인 성균관대학 | 폐렴구균 알코올 탈수소효소를 이용한 폐렴구균의 동정방법 |
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