JPH114697A

JPH114697A - 新規化合物

Info

Publication number: JPH114697A
Application number: JP10137336A
Authority: JP
Inventors: Nicola Gail Wallis; ニコラ・ゲイル・ウォリス
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd; SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd; SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1997-04-10
Filing date: 1998-04-10
Publication date: 1999-01-12
Also published as: US6127147A; CA2233524A1; EP0870831A1; US6498234B1

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒスチジンキナーゼポリペプチドおよびヒス
チジンキナーゼポリペプチドをコードしているＤＮＡ
（ＲＮＡ）、および組み換え法によるかかるポリペプチ
ドの製造方法、ならびに感染、詳細には細菌感染に対す
る防御のためのヒスチジンキナーゼポリペプチドの使用
方法を提供する。【解決手段】ヒスチジンキナーゼポリペプチドの配列
決定により決定されるアミノ酸配列との間の相同性によ
り、新規ヒスチジンキナーゼポリペプチドであると同定
されるポリペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】【発明の属する技術分野】

【０００１】本発明は、新規に同定されたポリヌクレオ
チドおよびポリペプチド、およびその製造および使用、
ならびにそれらの変種、アゴニストおよびアンタゴニス
トおよびそれらの使用に関する。詳細には、これらのお
よびその他の点に関して、本発明は本明細書で「ヒスチ
ジンキナーゼ」と称する、ヒスチジンキナーゼファミリ
ーの新規ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】スタフィロコッカスの遺伝子および遺伝
子産物を抗生物質開発の標的として用いることは特に好
ましいことである。スタフィロコッカスは微生物のなか
でも医学的に重要な属を構成している。それらは２つの
タイプの疾病、すなわち、侵入性および毒素発生性の疾
病を生じることが知られている。一般的には、侵入性感
染は、皮膚表面および深部組織の両方に影響する膿瘍形
成により特徴づけられている。エス・アウレウス（S.au
reus）は、癌患者における菌血症の２番目の主要病因で
ある。骨髄炎、敗血性関節炎、敗血性血栓静脈炎および
急性細菌性心内膜炎も比較的よく見られる。スタフィロ
コッカスの毒素発生特性により生じる少なくとも３つの
臨床的症状がある。これらの疾病発現は、組織侵入およ
び菌血症に対抗するものとしての外毒素の作用により生
じる。これらの状態は、スタフィロコッカスによる食品
汚染、熱傷皮膚症候群および毒素ショック症候群を包含
する。スタフィロコッカス・アウレウス感染の頻度は過
去２０年間に劇的に上昇した。これは多剤耐性株の出現
および免疫系の弱い人々の増加によるものとされてい
る。いくつかまたはすべての抗生物質に耐性のあるスタ
フィロコッカス・アウレウス株を単離することは、もは
や異常なことではない。このことは、新たな抗微生物剤
ならびにこのような生物に関する診断試験に対する必要
性を生じさせる。

【０００３】ヒスチジンキナーゼは、ヒスチジン残基を
自己リン酸化するＴＣＳＴＳの成分である。次いで、リ
ン酸基は同種応答レギュレーターに転移される。ヒスチ
ジンキナーゼは５つの保存されたアミノ酸配列を有する
（Stock, J. B., Ninfa, A.J. and Stock, A. M. (198
9) Microbiol. Rev. 53, 450-490, Swanson, R. V.,Ale
x, L. A. and Simon, M. I. (1994) TIBS 19 485-49
1）。これらはリン酸化されたヒスチジン残基であり、
その約１００残基後ろに保存されたアスパラギン残基が
続いている。さらに１５ないし４５残基後ろにＤＸＧＸ
Ｇモチーフが見いだされ、その１０ないし２０残基後に
ＦＸＸＦモチーフがある。さらに１０ないし２０残基行
ったところに別のグリシンモチーフＧＸＧが見いだされ
る。２つのグリシンモチーフはヌクレオチド結合に関与
していると考えられる。ヒスチジンキナーゼのこのファ
ミリーはサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typ
himurium）由来のＵｈｐＢ蛋白を包含し、それはヘキソ
ースリン酸の取り込みを調節するＴＣＳＴＳの一部分で
ある（Island, M. D., Wei, B. Y. and Kadner, R. J.
(1992) J. Bacteriol. 174, 2754-2762）。応答レギュ
レーターはＴＣＳＴＳの成分である。これらの蛋白はヒ
スチジンキナーゼによりリン酸化され、次いで、リン酸
化されると、しばしばＤＮＡ結合ドメインが活性化され
ることにより応答に影響する。応答レギュレーターは、
約１００個のアミノ酸の保存されたＮ末端ドメインによ
り特徴づけられる。応答レギュレーターのＮ末端ドメイ
ンならびに機能的に重要な保持された５個の残基（Ｃｈ
ｅＹ（Matsumura, P., Rydel, J.J., Linzmeier, R. an
d Vacante, D. (1984) J. Bacteriol. 160, 36-41）の
Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ５７、Ｔ８７、Ｋ１０９）は、保存
された構造上の特徴を有している（Volz, K. (1993) Bi
ochemistry 32, 11741-11753）。サルモネラ・チフィム
リウム由来（Stock, A. M., Mottonen, J. M., Stock,
J. B. and Schutt,C. E. (1989) Nature, 337, 745-74
9）およびエシェリシア・コリ（Escherichiacoli）由来
（Volz, K. and Matsumura, P. (1991) J. Biol. Chem.
266, 15511-15519）のＣｈｅＹの３次元構造ならびに
窒素調節蛋白ＣのＮ末端ドメイン（Volkman, B. F., No
haile, M. J., Amy, N. K., Kutsu, S. and Wemmer, D.
E. (1995) Biochemistry, 34 1413-1424）も、バチル
ス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来のＳｐｏＯ
Ｆの２次構造（Feher, V. A., Zapf, J. W., Hoch, J.
A., Dahlquist, F. W., Whiteley, J. M. and Cavanag
h, J. (1995) Protein Science 4, 1801-1814）と同様
に用いることができる。これらの構造は（ａ／ｂ）５フ
ォールドを有する。いくつかの構造上の残基は、異なる
応答レギュレーター配列間において保存されており、特
に、β−シート疎水性コアおよびα−ヘリックス由来の
部位中の疎水性残基が保存されている。ＴＣＳＴＳによ
り調節されるプロセスには、毒性因子の生成、致死性、
抗生物質耐性および細胞複製がある。ＴＣＳＴＳ蛋白の
阻害剤は、細菌が宿主感染を確立し、維持することを妨
害し、それゆえ、抗細菌治療において有用である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】明らかに、抗生物質活
性を求めて化合物をスクリーニングすることにおいて有
用な本発明新規化合物のごとき因子が必要である。感
染、機能障害および疾患の病因における役割を決定する
ためにも用いることができる因子が必要とされている。
また、感染、機能障害または疾患の予防、改善または抑
制に役割を果たすことができるこのような因子ならびに
アンタゴニストおよびアゴニストの同定および特徴づけ
も必要とされている。本発明ポリペプチドは、知られて
いるサルモネラ・チフィムリウム由来のＵｈｐＢ蛋白に
対してアミノ酸配列の相同性を有する。本願が優先権を
主張している各特許出願を参照によりその全体が本明細
書に記載されているものともなす。

【０００５】

【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明の目的は、図２［配列番号：２］に示すアミノ酸
配列ならびに既知アミノ酸配列およびエス・チフィムリ
ウム由来のＵｈｐＢ蛋白のごとき他の蛋白の配列の間の
相同性により、新規ヒスチジンキナーゼポリペプチドと
同定されるポリペプチドを提供することである。

【０００６】本発明のさらなる目的は、ヒスチジンキナ
ーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特に
本明細書においてヒスチジンキナーゼと称するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを提供することであ
る。本発明のとりわけ好ましい具体例において、ポリヌ
クレオチドは、図１［配列番号：１］に示す配列を含む
ヒスチジンキナーゼポリペプチド、またはその変種をコ
ードしている領域を含む。詳細には、本発明は、読み枠
（ヌクレオチド３８〜１１２６を含む）ならびにスタフ
ィロコッカス細菌により発現される対応ヒスチジンキナ
ーゼをコードしている配列を提供する。本発明の特に好
ましいもう１つの具体例において、図２［配列番号：
２］のアミノ酸配列を含むスタフィロコッカス・アウレ
ウス由来の新規ヒスチジンキナーゼ蛋白、またはその変
種がある。本発明のもう１つの態様によれば、ＮＣＩＭ
Ｂ受託番号４０７７１中に含まれるスタフィロコッカス
・アウレウスＷＣＵＨ２９株により発現可能な成熟ポリ
ペプチドをコードする単離核酸分子が提供される。本発
明のさらなる態様は、ヒスチジンキナーゼ、とりわけス
タフィロコッカス・アウレウスのヒスチジンキナーゼを
コードする、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等の単
離核酸分子が提供される。本発明のこの態様のさらなる
態様は、生物学的、診断学的、予防的、臨床的または治
療的に有用なそれらの変種、およびこれらを含んでなる
組成物である。

【０００７】本発明の別の態様によれば、治療的、予防
的目的の、とりわけ遺伝学的免疫のための本発明ポリヌ
クレオチドの使用が提供される。本発明のこの態様にお
けるとりわけ好ましい具体例は、ヒスチジンキナーゼの
自然発生対立遺伝子変種およびそれによりコードされる
ポリペプチドである。本発明のこの態様によれば、本明
細書においてヒスチジンキナーゼと称するスタフィロコ
ッカス・アウレウスの新規ポリペプチド、ならびに生物
学的、診断学的、予防的、臨床的または治療的に有用な
それらの変種、およびこれらを含んでなる組成物が提供
される。本発明のこの態様のとりわけ好ましい具体例
は、ヒスチジンキナーゼ遺伝子の自然発生対立遺伝子に
よりコードされるヒスチジンキナーゼポリペプチドの変
種である。本発明のこの態様における好ましい具体例に
おいて、前述のヒスチジンキナーゼポリペプチドの製造
方法が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、
例えば抗体等の抗菌物質として有用な、かかるポリペプ
チドに対する阻害物質が提供される。

【０００８】本発明のこの態様における１の好ましい態
様によれば、（ｉ）発現の評価、（ｉｉ）疾病の治療、
例えば、上部気道感染（例えば、中耳炎、細菌性気道
炎、急性喉頭蓋炎、甲状腺炎）、下部気道感染（例え
ば、蓄膿、肺の膿瘍）、心臓の感染（例えば、感染性心
内膜炎）、胃腸の感染（例えば、分泌性下痢、脾臓の膿
瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、脳の膿瘍）、
目の感染（眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔お
よび眼かの蜂巣炎、涙嚢炎）、腎臓および尿道感染（例
えば、精巣上体炎、腎内および腎周囲の膿瘍、毒性ショ
ック症候群）、皮膚感染（例えば、インペチゴ、毛包
炎、皮膚の膿瘍、蜂巣炎、傷の感染、細菌性筋炎）、骨
および関節の感染（例えば、敗血性関節炎、骨髄炎）の
ごとき疾病の治療、（ｉｉｉ）遺伝学的変種のアッセ
イ、ならびに（ｉｖ）生物にヒスチジンキナーゼポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドを投与して細菌（詳細に
はスタフィロコッカス・アウレウス細菌）に対する免疫
学的応答の生起のための製品、組成物および方法が提供
される。

【０００９】本発明のこの態様および他の態様における
１の好ましい具体例によれば、詳細には、厳密な条件で
ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチド配列にハイブリダ
イズするポリヌクレオチドが提供される。

【００１０】本発明のこの態様における１の好ましい具
体例において、ヒスチジンキナーゼポリペプチドに対す
る抗体が提供される。

【００１１】本発明の他の具体例において、本発明ポリ
ペプチドまたはポリヌクレオチドと結合し、あるいは相
互作用して、その活性を阻害または活性化する化合物の
同定方法であって、化合物とポリペプチドまたはポリヌ
クレオチドとの結合または他の相互作用を可能にする条
件下で本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをス
クリーニングすべき化合物と接触させて、化合物との結
合または他の相互作用を評価し（かかる結合または相互
作用は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと化合物
との結合または相互作用に応答した検出可能なシグナル
を生じさせうる第２の成分に関連したものである）、次
いで、化合物とポリペプチドまたはポリヌクレオチドと
の結合または相互作用により生じるシグナルの存在また
は不存在を検出することにより、化合物がポリペプチド
またはポリヌクレオチドに結合し、あるいは相互作用し
て、その活性を阻害または活性化するかどうかを決定す
ることを特徴とする方法が提供される。

【００１２】本発明のもう１つの態様によれば、好まし
くは静菌性または殺菌性でもあるヒスチジンキナーゼア
ゴニストおよびアンタゴニストがそれぞれ提供される。
本発明のさらなる態様において、細胞または多細胞生物
に投与するためのヒスチジンキナーゼポリヌクレオチド
またはヒスチジンキナーゼポリペプチドを含んでなる組
成物が提供される。開示した本発明の意図および範囲内
での種々の変更および修飾は、以下の記載および本明細
書のその他の部分の知見により、当業者に容易に明らか
となろう。

【００１３】用語集以下の定義は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。「宿主細胞」は外来ポリヌクレオチド配列により
形質転換もしくはトランスフェクションされた、または
形質転換もしくはトランスフェクションされうる細胞で
ある。

【００１４】「同一性」とは、当該分野において知られ
ているように、２個またはそれ以上のポリペプチド配列
間あるいは２個またはそれ以上のポリヌクレオチド配列
間の関係であり、配列を比較することにより決定され
る。当該分野において、「同一性」は、かかる配列間の
合致により決定されうるようなポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチド配列間の配列関連性の程度をいう。Comput
ational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford Uni
versity Press,New York,1988;Biocomputing:Informati
ons and Genome Projects, Smith,D.W.,ed.,Academic P
ress,New York,1993;Computer Analysis of Sequence D
ata,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Huma
n Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molec
ular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;お
よびSequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devere
ux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991;およびCa
rillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:107
3 (1988)に記載された方法（これらに限らない）を包含
する既知方法により、「同一性」を容易に計算すること
ができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試
験する配列間で最も良く適合するように設計される。同
一性および類似性を決定する方法は、公に入手できるコ
ンピュータープログラムに集成されている。二つの配列
間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュー
タープログラム法には、ＧＣＧプログラムパッケージ
（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387
（1984）、BLASTP、BLASTN、およびFASTA（Atschul,S.
F.ら、J.Molec.Biol（1990） 215:403））等があるが、
これらに限定するものではない。BLAST Xプログラムは
ＮＣＢＩおよび他のソースから公に利用可能である（BL
AST Manual,Altshul,S.,et al.,NCBI NLM NIH Bethesd
a, MD 20894;Altshul,S.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-4
10 (1990)）。よく知られたSmith Watermanアルゴリズ
ムを用いて同一性を決定してもよい。

【００１５】ポリペプチド配列の比較のための好ましい
パラメーターは以下のものを包含する：１）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J.Mol.Bio
l. 48:443-453 (1970) 比較マトリックス：Hentikoff and Hentikoff, Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919 (1992)からのBLOSSUM
62 ギャップペナルティー：１２ギャップ長ペナルティー：４これらのパラメーターに関して有用なプログラムは、Ge
netics Computer Group, Madison WI.から「ギャップ」
プログラムとして公に利用できる。上記パラメーターは
ポリペプチド比較のための省略時パラメーターである
（エンドギャップについてペナルティーを伴わない）。
ポリヌクレオチド比較のための好ましいパラメーターは
下記のものを包含する：１）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J.Mol.Bio
l. 48:443-453 (1970) 比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０ギャップペナルティー：５０ギャップ長ペナルティー：３これらのパラメーターに関して有用なプログラムは、Ge
netics Computer Group, Madison WI.から「ギャップ」
プログラムとして公に利用できる。上記パラメーターは
ポリヌクレオチド比較のための省略時パラメーターであ
る。

【００１６】ポリヌクレオチドおよびポリペプチドにつ
いての「同一性」に関する好ましい意味は、下記（１）
および（２）に示される。（１）さらにポリヌクレオチドの具体例は、配列番号：
１または３の対照配列に対して少なくとも５０、６０、
７０、８０、８５、９０、９５、９７または１００％の
同一性を有する単離ポリヌクレオチド配列を包含し、本
発明ポリヌクレオチド配列は配列番号：１または３の対
照配列と同一であってもよく、あるいは対照配列と比較
してある程度の数までのヌクレオチドの変化を有してい
てもよい。かかる変化は、少なくとも１個のヌクレオチ
ドの欠失、置換（トランジションおよびトランスバージ
ョンを包含）または挿入からなる群より選択され、該変
化は対照ヌクレオチド配列の５’または３’末端の位置
あるいはそれらの末端位置の間の位置において、対照配
列中のヌクレオチドにおいて個々にまたは散在して、あ
るいは対照配列中の１またはそれ以上の連続した群とし
て生じてもよい。配列番号：１または３中の全ヌクレオ
チド数と個々の同一性パーセント値（１００で割ったも
の）とをかけて、その積を配列番号：１または３中の全
ヌクレオチド数から差し引くことによりヌクレオチド変
化の数を決定する。これを下式により説明する：ｎ_n≦ｘ_n−（ｘ_n・ｙ）式中、ｎ_nはヌクレオチド変化の数であり、ｘ_nは配列番
号：１または配列番号：３中の全ヌクレオチド数であ
り、ｙは、例えば７０％なら０．７０、８０％なら０．
８０、８５％なら０．８５、９０％なら０．９０、９５
％なら０．９５、９７％なら０．９７、１００％なら
１．００であり、・は積の演算子であり、ｘ_nとｙとの
整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、
ｘ_nから差し引く。配列番号：２または４のポリペプチ
ドをコードしているポリヌクレオチド配列の変化は、好
ましくはコーディング配列中のナンセンス、ミスセンス
またはフレームシフト変異を引き起こす可能性があり、
それゆえ、かかる変化に随伴してポリヌクレオチドによ
りコードされているポリペプチドが変化する。例えば、
本発明ポリヌクレオチド配列は配列番号：２または４の
対照配列と同一であってもよく、すなわち、１００％同
一であってもよく、あるいは対照配列と比較してある程
度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい（その
場合、同一性％は１００％未満である）。かかる変化
は、少なくとも１個の核酸の欠失、置換（トランジショ
ンおよびトランスバージョンを包含）または挿入からな
る群より選択され、該変化は対照ポリヌクレオチド配列
の５’または３’末端の位置あるいはそれらの末端位置
の間の位置において、対照配列中の核酸において個々に
または散在して、あるいは対照配列中の１またはそれ以
上の連続した群として生じてもよい。配列番号：２また
は４中の全アミノ酸数と個々の同一性パーセント値（１
００で割ったもの）とをかけて、その積を配列番号：２
または４中の全アミノ酸数から差し引くことにより同一
性％値についての核酸変化数を決定する。これを下式に
より説明する：ｎ_n≦ｘ_n−（ｘ_n・ｙ）式中、ｎ_nはアミノ酸変化の数であり、ｘ_nは配列番号：
２または４中の全アミノ酸数であり、ｙは、例えば７０
％なら０．７０、８５％なら０．８５等であり、ｘ_nと
ｙとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とし
た後、ｘ_nから差し引く。

【００１７】（２）さらにポリペプチドの具体例は、配
列番号：２または４のポリペプチド対照配列に対して少
なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、
９７または１００％の同一性を有するポリペプチドを含
む単離ポリペプチドを包含し、該ポリペプチド配列は配
列番号：２の対照配列と同一であってもよく、あるいは
対照配列と比較してある程度の数までのアミノ酸の変化
を有していてもよい。かかる変化は、少なくとも１個の
アミノ酸の欠失、置換（保存的および非保存的置換を包
含）または挿入からなる群より選択され、該変化は対照
ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置
あるいはそれらの末端位置の間の位置において、対照配
列中のアミノ酸において個々にまたは散在して、あるい
は対照配列中の１またはそれ以上の連続した群として生
じてもよい。配列番号：２または４中の全アミノ酸数と
同一性パーセント値（１００で割ったもの）とをかけ
て、その積を配列番号：２中の全アミノ酸数から差し引
くことによりアミノ酸変化の数を決定する。これを下式
により説明する：ｎ_a≦ｘ_a−（ｘ_a・ｙ）式中、ｎ_aはアミノ酸変化数であり、ｘ_aは配列番号：２
または４中の全アミノ酸数であり、ｙは、例えば７０％
なら０．７０、８０％なら０．８０、８５％なら０．８
５、９０％なら０．９０、９５％なら０．９５、９７％
なら０．９７、１００％なら１．００であり、・は積の
演算子であり、ｘ_aとｙとの整数でない積は切り捨てに
より最も近い整数とした後、ｘ_aから差し引く。例え
ば、本発明ポリペプチド配列は配列番号：２または４の
対照配列と同一であってもよく、すなわち、１００％同
一であってもよく、あるいは対照配列と比較してある程
度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい（その
場合、同一性％は１００％未満である）。かかる変化
は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（保存的ま
たは非保存的置換を包含）または挿入からなる群より選
択され、該変化は対照ポリペプチド配列のアミノまたは
カルボキシ末端の位置あるいはそれらの末端位置の間の
位置において、対照配列中のアミノ酸において個々にま
たは散在して、あるいは対照配列中の１またはそれ以上
の連続した群として生じてもよい。配列番号：２または
４中の全アミノ酸数と個々の同一性パーセント値（１０
０で割ったもの）とをかけて、その積を配列番号：２ま
たは４中の全アミノ酸数から差し引くことにより同一性
％値についてのアミノ酸変化数を決定する。これを下式
により説明する：ｎ_a≦ｘ_a−（ｘ_a・ｙ）式中、ｎ_aはアミノ酸変化の数であり、ｘ_aは配列番号：
２または４中の全アミノ酸数であり、ｙは、例えば７０
％なら０．７０、８５％なら０．８５等であり、ｘ_aと
ｙとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とし
た後、ｘ_aから差し引く。

【００１８】「単離」とは、「人間の手により」天然の
状態から変化させられた、すなわち、それが天然に存在
する場合、元来の環境から変化もしくは除去、またはそ
の両方が行われたことを意味する。例えばポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドが、天然の状態で生存動物に存
在する場合は、「単離」されていないが、同一のポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドが、天然に共存する物質
から分離されている場合は、本明細書に用いる用語であ
る、「単離」がなされている。

【００１９】「ポリヌクレオチド」とは、修飾されてい
ないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡも
しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチ
ドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。
「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、
一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖
および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および
二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合
物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより通常には二本鎖も
しくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物
であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド
分子を意味するが、これに限定するものではない。さら
に、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもし
くはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領
域を意味する。そのような領域における鎖は同一の分子
または異なる分子からのものでよい。この領域は一つま
たはそれ以上の分子の全てを含み得るが、より典型的に
はいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領域
の分子の一つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一
つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有する、上述のＤ
ＮＡまたはＲＮＡ等を含む。このように、安定性または
その他の理由で修飾した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮ
Ａは、本明細書で意図する用語である「ポリヌクレオチ
ド」である。さらに、イノシン等の普通でない塩基また
はトリチル化塩基のごとき（２つの例のみ示す）修飾塩
基を含むＤＮＡまたはＲＮＡも（二つの例だけをを示
す）本明細書の用語、ポリヌクレオチドである。当業者
に既知の多くの有用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮ
Ａに、非常に多くの修飾がなされていることは、明らか
であろう。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」なる
用語は、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵素的
または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよ
び、例えば単純型細胞および複合型細胞等の細胞に特徴
的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポ
リヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称
する短いポリヌクレオチドを包含する。

【００２０】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または
修飾ペプチド結合により互いに結合している２個または
それ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたは蛋白を
意味する。「ポリペプチド」は、通常、例えばペプチ
ド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖、
および一般的に蛋白と称する長鎖の両方を意味する。ポ
リペプチドは、遺伝子によりコードされた２０種のアミ
ノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。「ポリペプチ
ド」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後修飾の
ような天然の工程により修飾されたものが含まれるが、
当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾される。こ
のような修飾は基礎的な参考書およびさらに詳細な論文
ならびに多数の研究文献にも詳しく記載されており、こ
れらは当業者に周知である。同一の型の修飾は、ポリペ
プチドのいくつかの部位において同一または異なる程度
で存在し得ることは理解されよう。また、ポリペプチド
は多くの型の修飾をも含み得る。修飾は、ペプチド骨
格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端
等のポリペプチドの任意の部位で起こりうる。修飾に
は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミ
ド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌク
レオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質ま
たは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール
の共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピ
ログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシ
ル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨ
ウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解的
プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グ
リコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガ
ンマ−カルボキシル化、水酸化およびＡＤＰリボシル
化、セレノイル化、アルギニル化のようなトランスファ
ーＲＮＡにより媒介される蛋白へのアミノ酸の添加、な
らびにユビキチネーションなどがある。例えばProteins
-Structure and Molecular Properties、第２版、T.E.C
reighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク（1
993）およびPosttranslational Covalent Modification
of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレス、
ニューヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslational Pr
otein Modifications ：Perspective and Prospects、1
〜12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646（199
0）およびヒスチジンキナーゼtanら、Protein Synthesi
s：Posttrans-lational Modifications and Aging，An
n.N.Y.Acad.Sci.663:48-62（1992）を参照されたい。ポ
リペプチドは分岐または環状でよく、分岐していてもい
なくてもよい。環状、分岐および分岐した環状ポリペプ
チドは、翻訳後の自然発生的プロセッシングの結果であ
り、同様に全く合成的な方法で合成できる。

【００２１】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、参照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、
以下に論じるように、参照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠損、融合およ
び末端切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別
の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的
に差異は、参照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体
的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるよう
に限定される。変種および対照ポリペプチドは、１また
はそれ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで起
こることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換また
は挿入したアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコード
されたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチド
またはポリペプチドの変種は例えば対立遺伝子変種のよ
うな自然発生的なものであってもよく、あるいは自然発
生することが知られていない変種であってもよい。ポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの非自然発生変種は、
突然変異技術、直接的合成、および当業者に既知のその
他の組換え技術により製造できる。

【００２２】発明の説明本発明は、後でより詳細に説明する、新規ヒスチジンキ
ナーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。
特に、本発明は、スタフィロコッカス・アウレウスの新
規ヒスチジンキナーゼ遺伝子のポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドに関し、そのアミノ酸配列はエス・チフィ
ムリウム由来のｈｐＢポリペプチドに対するアミノ酸配
列相同性により関連づけられる。特に本発明は、それぞ
れ図１［配列番号：１］および図２［配列番号：２］に
示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するヒス
チジンキナーゼに関し、さらにＮＣＩＭＢ寄託番号４０
７７１として寄託されたＤＮＡのヒスチジンキナーゼヌ
クレオチド配列ならびにおれによりコードされるアミノ
酸配列に関する。

【００２３】寄託物スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株を含む
寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・インダス
トリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド
（ＮＣＩＭＢ）、２３ストリート、マッカードライブ、
アベルディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランドに１９９
５年９月１１日寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１
が付与された。寄託したスタフィロコッカス・アウレウ
ス株を、本明細書では「寄託株」または「寄託株のＤＮ
Ａ」と称する。寄託物質はヒスチジンキナーゼＤＮＡ
の全長を含有し、寄託されたことにより、「ＮＣＩＭＢ
４０７７１」と称する。寄託物質に含まれるポリヌクレ
オチドならびにそれによりコードされるポリペプチド
は、本明細書の配列に関する任意の記載に矛盾する事象
において支配的である。寄託は、特許手続き上の微生物
寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件下でなさ
れている。特許が発行されると何らの制限または条件も
なく、最終的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜の
ためにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条のもとに
要求されるような、寄託が実施可能要件であることを承
認するものではない。寄託物を製造、使用または販売す
るためにはライセンスが必要であるが、そのようなライ
センスはここでは賦与されていない。

【００２４】ポリペプチド本発明ポリペプチドは図２［配列番号：２］のポリペプ
チド（詳細には、成熟ポリペプチド）、ならびにポリペ
プチドおよびフラグメント、詳細にはヒスチジンキナー
ゼの生物学的活性を有するものを包含し、さらに図２
［配列番号：２］のポリペプチドまたはその重要部分に
対して少なくとも７０％の同一性を有するもの、好まし
くは図２［配列番号：２］のポリペプチドに対して少な
くとも８０％の同一性を有するもの、より好ましくは図
２［配列番号：２］のポリペプチドに対して少なくとも
９０％の類似性を有するもの（より好ましくは、少なく
とも９０％の同一性を有し）、さらにより好ましくは図
２［配列番号：２］のポリペプチドに対して少なくとも
９５％の類似性を有するもの（さらにより好ましくは少
なくとも９５％の同一性を有する）を包含し、さらに通
常には少なくとも３０個、より好ましくは少なくとも５
０個のアミノ酸を含むかかるポリペプチドの部分を包含
する。配列番号：２の対照アミノ酸配列に対して少なく
とも例えば９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを例に挙げると、そのポリペプチド配列
が配列番号：２の対照アミノ酸配列のアミノ酸１００個
ごとに５個までのアミノ酸の変化を含みうることを除
き、そのポリペプチドのアミノ酸配列は対照配列と同一
である。言い換えると、対照アミノ酸配列に対して少な
くとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドを得るためには、対照配列中のアミノ酸の５％まで
が置換または他のアミノ酸と置換していてもよく、ある
いは対照配列中の全アミノ酸のうち５％までの数のアミ
ノ酸が対照配列中に挿入されたものであってもよい。対
照配列におけるこれらの変化は、対照アミノ酸配列のア
ミノまたはカルボキシ末端位置に存在してもよく、ある
いはそれらの末端間のいずれかの位置に存在してもよ
く、対照配列中に散在していてもよく、あるいは対照配
列内で１個またはそれ以上の一連の群をなしていてもよ
い。

【００２５】フラグメントは、前述のポリペプチドのア
ミノ酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であ
るアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ヒス
チジンキナーゼポリペプチドでは、フラグメントは「独
立して存在（free standing）」しているか、または一
部分もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内
に含まれていてもよく、最も好ましくは単一の連続した
領域として、より大型の単一ポリペプチドに含まれる。
好ましいフラグメントは、例えば、図２［配列番号：
２］のアミノ酸配列の一部分を有する末端切断されたポ
リペプチド、またはそれらの変種を包含し、例えば、ア
ミノ末端を含む一連の残基、またはカルボキシル末端を
含む一連の残基を包含する。宿主細胞、詳細にはスタフ
ィロコッカス・アウレウス中の本発明ポリペプチドの縮
重形態も好ましい。また、構造的または機能的属性によ
り特徴づけられたフラグメント、例えばアルファーヘリ
ックスおよびアルファーヘリックス形成領域、ベータシ
ートおよびベータシート形成領域、ターンおよびターン
形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、
疎水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性
領域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、および
高抗原性指標領域を含むフラグメントなども好ましい。

【００２６】ヒスチジンキナーゼ活性を媒介する生物学
的に活性なフラグメントもまた好ましく、類似の活性も
しくは改善された活性のある、または望ましくない活性
を減じたフラグメント等がある。動物、とりわけヒトに
おいて抗原的または免疫原的なフラグメントも包含され
る。スタフィロコッカス・アウレウスの生存に必須の機
能あるいは個体、特にヒトにおいて疾病を開始させある
いは維持する能力を付与する受容体または酵素ドメイン
を含むフラグメントが特に好ましい。本発明ポリペプチ
ドのフラグメントである変種を、ペプチド合成による対
応全長ポリペプチドの製造に使用してもよく、本発明全
長ポリペプチドの製造のための中間体としてこれらの変
種を使用してもよい。本発明ヒスチジンキナーゼは、図
４［配列番号：６］に開示するアミノ酸配列（図３［配
列番号：５］のポリヌクレオチドによりコードされる）
を有する応答レギュレーターと同種である。配列番号：
６のアミノ酸配列は翻訳された配列番号：５の読み枠で
あり、バチルス・ズブチリス由来のＤｅｇＵ応答レギュ
レーターに対して相同性を示す（同一性２８％）。本発
明は、この応答レギュレーターは本発明ヒスチジンキナ
ーゼのと同種であることを示す。この応答レギュレータ
ーは本発明の多くの化合物のスクリーニングアッセイに
おいて有用である。

【００２７】ポリヌクレオチド本発明の別の態様は、図２［配列番号：２］の推定アミ
ノ酸配列を有するヒスチジンキナーゼポリペプチドをコ
ードしている単離ポリヌクレオチド、およびそれに密接
に関連したポリヌクレオチド、およびそれらの変種に関
する。本明細書に提供される情報を用いて、例えば図１
［配列番号：１］に示すポリヌクレオチド配列のごとき
情報を用いて、ヒスチジンキナーゼポリペプチドをコー
ドする本発明のポリヌクレオチドを、出発物質スタフィ
ロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９細胞からの染色体
ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決定する
ために用いるような標準的なクローニングおよびスクリ
ーニングを用いて得ることができ、次いでクローン全長
を得ることができる。例えば、図１［配列番号：１］に
示す配列のごとき本発明ポリヌクレオチド配列を得るた
めに、イー・コリ（E.coli）またはいくつかの他の適切
な宿主におけるスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵ
Ｈ２９の染色体ＤＮＡのクローンの典型的なライブラリ
ーを、部分的配列に由来の、好ましくは１７量体または
それ以上の長さの放射性標識オリゴヌクレオチドにてプ
ローブする。プローブのＤＮＡに同一であるＤＮＡを担
持するクローンは厳密な条件を用いて区別できる。元の
配列から設計した配列決定プライマーを用いてこのよう
に同定した個々のクローンを配列決定することにより、
次に両方向で配列が伸長できるようになり、全遺伝子配
列を決定できる。このような配列決定は便宜的にプラス
ミドクローンから調製した変性二本鎖ＤＮＡを用いて実
施する。適切な技法については、Maniatis,T.、Fitsch,
F.F.およびSambrookら、Molecular Cloning，A Laborat
ory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハー
バー、ニューヨーク（1989）に記載されている。（Scre
ening By Hybridization1.90およびSequencing Denatur
ed Double-Stranded DNA Templates 13.70参照）。本発
明の典型例として、図１［配列番号：１］に示すポリヌ
クレオチドがスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ
２９由来のＤＮＡライブラリー中に見いだされた。図１
［配列番号：１］に示すＤＮＡ配列は、図２［配列番
号：２］に示すアミノ酸配列とほぼ同数のアミノ酸の蛋
白をコードしている読み枠を含み、当該分野においてよ
く知られたアミノ酸残基分子量を用いて蛋白の推定分子
量を計算することができる。寄託株のヒスチジンキナー
ゼをコードしているＤＮＡの配列決定結果により示され
るように、本発明ヒスチジンキナーゼはヒスチジンキナ
ーゼファミリーの他の蛋白に構造的に関連している。本
発明蛋白は、既知蛋白のなかでも、エス・チフィムリウ
ム由来のＵｈｐＢ蛋白に対して最大の相同性を示す。図
２［配列番号：２］のヒスチジンキナーゼは、エス・チ
フィムリウム由来のＵｈｐＢ蛋白に対して、その全長に
わたり約２３％の同一性を有し、約５５％の類似性を有
する。

【００２８】成熟ポリペプチドのコーディング配列また
はそれらのフラグメント、ならびにその他のコーディン
グ配列を有する読み枠中の成熟ポリペプチドのコーディ
ング配列またはそのフラグメント、例えばリーダーまた
は分泌配列、プレ、プロ、プレプロ蛋白配列をコードす
る配列も本発明により提供される。ポリヌクレオチド
は、例えば、転写された非翻訳配列、終止シグナル、リ
ボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配列、イント
ロン、ポリアデニル化シグナル等の転写非翻訳配列、お
よび付加アミノ酸をコードする付加コーディング配列等
の非コーディング５'および３'配列等の非コーディング
配列をも含有しうるが、これらに限定するのではない。
例えば、融合ポリペプチドの精製を促すマーカー配列を
コードすることもできる。本発明のある好ましい態様に
おいて、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（キアゲン・
インコーポレーティッド）に提供されるようなヘキサ−
ヒスチジンペプチド（Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,U
SA，86:821-824（1989）に記載される）またはＨＡタグ
（Wilsonら、Cell，37:767（1984））である。本発明の
ポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子および遺伝子発現
を調節する天然の配列をも含むが、これらに限定するも
のではない。

【００２９】上記した本明細書の用語「ポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポリペプ
チド配列を含むポリヌクレオチドを包含し、詳細には、
細菌のヒスチジンキナーゼ、より詳細にはヒスチジンキ
ナーゼ蛋白の配列決定により決定されるアミノ酸配列を
有するスタフィロコッカス・アウレウスのヒスチジンキ
ナーゼを包含する。該用語は、コーディング配列および
／または非コーディング配列を含んでいてもよいさらな
る領域を伴った、ポリペプチドをコードしている単一の
連続領域または不連続領域（例えば、組み込まれたファ
ージまたは配列の挿入または配列のスプライシングによ
り分断されたもの）を含むポリヌクレオチドを包含す
る。さらに本発明は、図２［配列番号：２］の推定アミ
ノ酸配列を有するポリペプチドの変種をコードする上記
ポリヌクレオチドの変種にも関する。本発明ポリヌクレ
オチドのフラグメントである変種を用いて本発明の全長
のポリヌクレオチドを合成してもよい。さらに特に好ま
しい具体例は、ヒスチジンキナーゼ蛋白の配列決定によ
り決定されるヒスチジンキナーゼポリペプチドのアミノ
酸配列を有する、ヒスチジンキナーゼ変種をコードして
いるポリヌクレオチドであり、その中には、いくつか、
少しの、５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、
１または０個のアミノ酸残基を置換、欠損または付加を
任意の組み合わせで施したアミノ酸配列を有する。中で
もとりわけ好ましいものは、ヒスチジンキナーゼの特性
および活性を変化させないサイレント置換、付加および
欠損である。

【００３０】本発明のさらに好ましい態様は、図２［配
列番号：２］に示すアミノ酸配列を有するヒスチジンキ
ナーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド
に対して、その全長にわたり少なくとも７０％の同一性
があるポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチ
ドに対して相補的なポリヌクレオチドである。あるいは
また、寄託株のスタフィロコッカス・アウレウスのＤＮ
Ａのヒスチジンキナーゼポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドに対してその全長にわたり少なくとも８０
％同一である領域を含むポリヌクレオチド、およびそれ
に対して相補的なポリヌクレオチドが最も非常に好まし
い。この点に関して、全長で少なくとも９０％同一であ
るポリヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも少なく
とも９５％の同一性を有するものが特に好ましく、さら
に少なくとも９５％の同一性を有するものの中でも少な
くとも９７％であるのがより好ましく、中でも少なくと
も９８％および少なくとも９９％であるのが特に好まし
く、さらに少なくとも９９％であるのがより好ましい。
一例として、配列番号：１の対照ヌクレオチド配列に対
して、例えば少なくとも９５％の同一性を有するヌクレ
オチド配列を有するポリヌクレオチドを挙げると、その
ポリヌクレオチド配列が配列番号：１の対照ヌクレオチ
ド配列のヌクレオチド１００個ごとに５個までのヌクレ
オチドの変化を含みうることを除き、そのポリヌクレオ
チドのヌクレオチド配列は対照配列と同一である。言い
換えると、対照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９
５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チドを得るためには、対照配列中の全ヌクレオチドのう
ち５％までの数のヌクレオチドが対照配列に挿入された
ものであってもよい。対照配列のこれらの変異は、対照
ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置に存在して
いてもよく、あるいはそれらの末端位置の間のいずれか
の位置に存在していてもく、対照配列のヌクレオチドに
散在していてもよく、あるいは対照配列内の１個または
それ以上の一連の群となっていてもよい。とりわけ好ま
しい態様は、図１［配列番号：１］のＤＮＡによりコー
ドされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能
または活性を保持するポリペプチドをコードしているポ
リヌクレオチドである。

【００３１】本発明はさらに本明細書上述の配列にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関
して、本発明は特に厳密な条件で本明細書上述のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密な
ハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同
一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％
である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味
する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例として
は、５０％ホルムアミド。５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭＮ
ａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハーツ溶液、
１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変成
し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２
℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０.
１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄するものである。ハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Samb
rookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第
２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク
（1989）、とりわけその第１１章に実例が示されてお
り、参照によりその全開示を本明細書に記載されている
ものとみなす。

【００３２】本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーシ
ョン条件で、配列番号：１に示すポリヌクレオチド配列
に関する完全遺伝子を含む適当なライブラリーを、配列
番号：１に示すポリヌクレオチド配列またはそのフラグ
メント配列を有するプローブでスクリーニングし、ＤＮ
Ａ配列を単離することにより得ることのできるポリヌク
レオチド配列を本質的に含むポリヌクレオチドをも提供
する。かかるポリヌクレオチドを得るために有用なフラ
グメントには、例えば本明細書の別の箇所において説明
するプローブおよびプライマー等がある。

【００３３】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明のポリヌ
クレオチドは、ヒスチジンキナーゼをコードするｃＤＮ
Ａ全長およびゲノムクローンを単離するため、およびヒ
スチジンキナーゼ遺伝子に高度な配列類似性を有するそ
の他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離す
るための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハ
イブリダイゼーションプローブとして使用することがで
きる。このようなプローブは通常少なくとも１５塩基を
含む。好ましくはこのようなプローブは少なくとも３０
塩基を有し、少なくとも５０塩基を有していてもよい。
とりわけ好ましいプローブは少なくとも３０塩基を有
し、５０塩基またはそれ以下である。例えばヒスチジン
キナーゼ遺伝子のコーディング領域は、配列番号：１に
示されるＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチドプロー
ブを合成してスクリーニングすることにより単離でき
る。次いで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有
する標識オリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
ＡまたはｍＲＮＡのライブラリーのスクリーニングに用
い、プローブがライブラリーのいずれのメンバーにハイ
ブリダイゼーションするのかを決定する。

【００３４】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、例えば、疾病とりわけヒトの疾病の治療法およ
び診断法の発見のために研究物質および材料として使用
でき、とりわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本
明細書でさらに論じる。配列番号：１および／または配
列番号：２の配列由来のオリゴヌクレオチドである本発
明ポリヌクレオチドを本明細書記載の方法に使用しても
よいが、好ましくはＰＣＲに使用して、本明細書で同定
したポリヌクレオチドの全体または一部が感染した組織
に転写されるかどうかを決定する。このような配列が、
病原体が達成した感染のステージおよび感染の型の診断
にも有用であることが理解される。

【００３５】また本発明は、付加アミノ酸もしくはカル
ボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペプチド中に存在
するアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドをコ
ードしうるポリヌクレオチドも提供する（例えば成熟形
態が１種以上のポリペプチド鎖を有する場合）。このよ
うな配列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセッシ
ングに役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半減
期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッセイもし
くは製造のための蛋白の操作を容易にすることができ
る。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞酵
素によりプロセッシングされ、成熟蛋白から取り除かれ
る。１またはそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態の
ポリペプチドを有する前駆蛋白は、ポリペプチドの不活
性形態でありうる。プロ配列が除去されると、通常には
このような不活性前駆体が活性化される。プロ配列のい
くつかまたはすべてを活性化の前に除去できる。通常、
このような前駆体はプロ蛋白と称される。要するに、本
発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配列を加
えた成熟蛋白（プレ蛋白と称することができる）、プレ
蛋白のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配
列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列およ
び１またはそれ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆
体であるプレプロ蛋白をコードでき、プロ配列は通常ポ
リペプチドの活性および成熟形態を生成するプロセッシ
ング段階で除去される。

【００３６】ベクター、宿主細胞、発現本発明はまた、
ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含
むベクター、本発明ベクターで遺伝子操作される宿主細
胞および組換え技法による本発明のポリペプチドの製造
にも関する。本発明ＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用
い、無細胞翻訳系を用いてこのような蛋白を製造でき
る。組換え体を製造するために、宿主細胞を遺伝子操作
して、発現系もしくはそれらの一部、または本発明のポ
リヌクレオチドを組み込むことができる。ポリヌクレオ
チドの宿主細胞への導入は、例えば、Davisら、Basic M
ethods in Molecular Biology（1986）；Sambrookら、M
olecular Cloning；A Laboratory Manual、第２版；コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク
（1989）のように、多くの標準的な実験マニュアルに記
載される方法により行うことができ、例えばリン酸カル
シウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン
媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイ
クロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェ
クション、エレクトロポレーション、トランスダクショ
ン、スクレープ負荷、バリスティック導入および感染等
がある。

【００３７】適当な宿主の代表的なものには、細菌細
胞、例えばストレプトコッカス属（Streptococci）、ス
タフィロコッカス属（staphylococci）、イー・コリ
（E.coli）、ストレプトミセス（Streptomyces）および
バチルス・ズブチリス（Bacillussubtiis）細胞；真菌
細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Asperg
illus）細胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Dro
sophila S2）およびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera S
f9）細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬ
ａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ
（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞等がある。

【００３８】本発明のポリペプチドを製造するために非
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワク
シナウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂
犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来の
ベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来す
るベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファー
ジの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミ
ドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は発現
を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよ
い。この点に関して、一般的には、宿主中にポリヌクレ
オチドを保持、伸長または発現するのに、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した任意の系またはベ
クターを発現に使用できる。周知のおよび通常的な種々
の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入
してもよく、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A
Laboratory Manual（上述）に記載されている。

【００３９】翻訳蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミッ
クスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当
な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的な
ものであってもく、あるいは異種性のシグナルでもよ
い。

【００４０】本発明のポリペプチドは周知の方法によ
り、組換え細胞培養物から回収および精製でき、その方
法には、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよび
レクチンクロマトグラフィー等がある。高品質液体クロ
マトグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポリ
ペプチドが単離および／または精製中に変性した場合、
再び活性なコンホーメーションにするために、蛋白再生
のための周知の技法を用いることができる。

【００４１】診断アッセイ本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のヒ
スチジンキナーゼポリヌクレオチドの使用にも関する。
真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるヒスチジ
ンキナーゼの検出は、疾患の診断のための診断法を提供
する。ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む生物に感染した
真核生物（本明細書において「個体」とも称する）とり
わけ哺乳動物、特にヒトを種々の方法によりＤＮＡレベ
ルで検出できる。診断用の核酸は、感染した個体の細胞
および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚よ
り得ることができる。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用し
てもよく、あるいは分析の前にＰＣＲもしくはその他の
増幅法を用いることにより酵素的に増幅できる。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡもまた同じ方法で用いることができる。
増幅法を用いると、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒ
トに存在する原核生物株を、原核生物遺伝子の遺伝子型
の分析により特徴づけすることができる。対照配列の遺
伝子型と比較した場合の増幅産物の大きさの変化によ
り、欠損および挿入を検出できる。点突然変異は、増幅
ＤＮＡを標識化ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチド配
列にハイブリダイズさせることにより同定できる。完全
に対合した配列はＲＮアーゼ消化により、または融解温
度の差により、誤対合二重らせんから区別できる。変性
剤含有または不含ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳
動の移動度の変化を検出することにより、または直接的
なＤＮＡの配列決定によりＤＮＡ配列の差を検出しても
よい。例えばMeyersら、Science，230:1242（1985）参
照。また、特異的な位置での配列の変化を、ヌクレアー
ゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護また
は化学的切断法によっても明らかにしてもよい。例えば
Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:4397-4401（1
985）参照。

【００４２】本発明の遺伝子の突然変異または多型性を
担持する細胞はまた、種々の技術により、ＤＮＡレベル
で、例えばセロタイピングすることにより検出できる。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出すること
ができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばGeneScan
等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡもを同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣ
Ｒに用いてもよい。例を挙げると、ヒスチジンキナーゼ
をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーは、突然
変異を同定および分析するのに用いることができる。代
表的なプライマーの例を下表１に示す。

【００４３】表１ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチドの増幅のためのプライマー配列番号プライマー配列３５’−ATGAAATTTT TAAAAGATAC TTCAATTGC−３’ ４５’−TGCTATTCCT CCTGTTGAGA TTTCAATGA−３’

【００４４】これらのプライマーを用いて、個体由来の
試料から単離されたヒスチジンキナーゼＤＮＡを増幅
してもよい。本発明はまた、５'および／または３'末端
から１、２、３または４個のヌクレオチド除去したプラ
イマーをも提供する。該プライマーを用いて、感染個体
から単離された遺伝子を増幅してもよく、次いで、該遺
伝子をＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供しても
よい。このように、ＤＮＡ配列における突然変異を検出
し、感染の診断および感染性物質のセロタイピングまた
は分類に使用することができる。

【００４５】本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感
染、より好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスに
よる感染、および最も好ましくは、上部気道感染（例え
ば、中耳炎、細菌性気道炎、急性喉頭蓋炎、甲状腺
炎）、下部気道感染（例えば、蓄膿、肺の膿瘍）、心臓
の感染（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸の感染（例え
ば、分泌性下痢、脾臓の膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感
染（例えば、脳の膿瘍）、目の感染（眼瞼炎、結膜炎、
角膜炎、眼内炎、前中隔および眼かの蜂巣炎、涙嚢
炎）、腎臓および尿道感染（例えば、精巣上体炎、腎内
および腎周囲の膿瘍、毒性ショック症候群）、皮膚感染
（例えば、インペチゴ、毛包炎、皮膚の膿瘍、蜂巣炎、
傷の感染、細菌性筋炎）、骨および関節の感染（例え
ば、敗血性関節炎、骨髄炎）のごとき疾病の診断方法を
提供し、該方法は、ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチ
ドの発現レベルの上昇を個体由来の試料から検出するこ
とを特徴とする。ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチド
の発現の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法
として当該分野でよく知られたいずれかの方法、例えば
増幅、ＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザン
ブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション
法を用いて測定できる。

【００４６】さらに、正常対照組織サンプルと比較し
て、ヒスチジンキナーゼ蛋白の過剰発現を検出するため
の本発明診断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検
出してもよい。宿主由来のサンプル中のヒスチジンキナ
ーゼ蛋白のレベルを決定するために用いることができる
アッセイ技法は、当業者に周知である。このようなアッ
セイ法には、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセ
イ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ
等がある。

【００４７】抗体本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞を免疫源として用いて、かかるポリ
ペプチドに免疫特異的な抗体を得ることができる。本明
細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリ
クローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒ
ト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントが包含され、さ
らに免疫グロブリン発現ライブラリーの産物等のＦａｂ
フラグメントも包含される。本発明のポリペプチドに対
して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープが付
いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくは
ヒトはでない動物に通常の実験法を用いて投与すること
により得ることができる。連続的細胞系培養により産生
される抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モ
ノクローナル抗体を調製することができる。実例として
は、Kohler，G.およびMilstein,C.，Nature，256:495-4
97（1975）；Kozborら、Immunology Today，4:72（198
3）；Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Ther
apy,Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985）に記載される
ような種々の技法がある。一本鎖抗体の産生のために記
載された技術（米国特許第４９４６７７８号）を適用し
て、本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体を得ること
ができる。また、トランスジェニックマウスまたはその
他の生物、例えばその他の哺乳動物を用いてヒト化抗体
等の抗体を発現させてもよい。

【００４８】別法として、ファージディスプレイ技法を
用いて、抗−ポリペプチドを有することにつきスクリー
ニングされたヒト・リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ遺伝
子のレパートリーまたは無処理のライブラリーから、ポ
リペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選別
することもできる（McCafferty,J.ら、Nature 348:552-
554（1990）；Marks,J.ら、Biotechnology 10:779-783
（1992））。これらの抗体の親和性はチェインシャフリ
ング（chain shuffling）により改善することもできる
（Clackson,T.ら、Nature 352:624-628（1991））。

【００４９】二つの抗原結合ドメインが存在する場合、
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。

【００５０】上記抗体を用いて、ポリペプチドを発現す
るクローンを単離または同定してもよく、上記抗体を親
和性クロマトグラフィーにより精製することができる。
従って、とりわけヒスチジンキナーゼに対する抗体を、
感染、とりわけ細菌感染、特に上部気道感染（例えば、
中耳炎、細菌性気道炎、急性喉頭蓋炎、甲状腺炎）、下
部気道感染（例えば、蓄膿、肺の膿瘍）、心臓の感染
（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸の感染（例えば、分
泌性下痢、脾臓の膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例
えば、脳の膿瘍）、目の感染（眼瞼炎、結膜炎、角膜
炎、眼内炎、前中隔および眼かの蜂巣炎、涙嚢炎）、腎
臓および尿道感染（例えば、精巣上体炎、腎内および腎
周囲の膿瘍、毒性ショック症候群）、皮膚感染（例え
ば、インペチゴ、毛包炎、皮膚の膿瘍、蜂巣炎、傷の感
染、細菌性筋炎）、骨および関節の感染（例えば、敗血
性関節炎、骨髄炎）のごとき疾病の治療に用いてもよ
い。

【００５１】ポリペプチド変種には抗原的、エピトープ
的または免疫学的に等価な変種等があり、本発明の特定
の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明により蛋白またはポリペプチド
に対して生成した場合、病原および哺乳動物宿主間での
即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗体により特
異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含
する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」な
る用語は、脊椎動物において抗体を産生させるのに適し
た処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間
での即時的な物理的相互作用を妨害するように作用する
ペプチドまたはその等価物を包含する。

【００５２】ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に
等価な誘導体、またはそれらの融合蛋白は、マウスまた
はその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫化
するための抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプ
チドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合するこ
とにより、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモ
シアニン（keyhole limpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結
合することができる。あるいはまた、蛋白もしくはポリ
ペプチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等
価なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチド
は、免疫原性を改良するための十分な抗原性を有してい
るので、キャリヤーを使用しなくてすむ。

【００５３】好ましくは、抗体またはそれらの変種を、
個体における免疫原性を減じるために修飾する。例え
ば、個体がヒトである場合、最も好ましくは、抗体は
「ヒト化」されており；この場合、ハイブリドーマ由来
の抗体の相補性決定領域がヒト・モノクローナル抗体に
移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-5
25（1986）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273
（1991）に記載されている。本発明のポリヌクレオチド
を遺伝学的免疫化において使用する場合、例えばプラス
ミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Gen
et.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419
（1963））、特異的蛋白キャリヤーとＤＮＡとの複合体
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リ
ン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshe
f、PNAS 83:9551（1986））、種々の形態のリポソーム
中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（198
9））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356:152（199
2）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791（1993））
およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたイン
ビボ感染（Seegerら、PNAS 81:5849（1984））等の適切
な送達方法を用いるのが好ましい。

【００５４】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子本発明ポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細胞標
品、化学ライブラリー、および天然産物混合物中におけ
る小型分子基質およびリガンドの結合を評価してもよ
い。これらの基質およびリガンドは天然基質およびリガ
ンドであってもよく、構造上または機能上の模倣物であ
ってもよい。例えば、Coligan et al.,Current Protoco
ls in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)参照。

【００５５】また本発明は、ヒスチジンキナーゼポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドの作用を増強（アゴニス
ト）または阻害（アンタゴニスト）する化合物を同定す
るための、化合物のスクリーニング方法をも提供する。
詳細には、静菌性および／または殺菌性であり、配列番
号：５の応答レギュレーターポリヌクレオチドまたは配
列番号：６の応答レギュレーターポリペプチドを含むア
ッセイにおいてこれらの効果を測定してもよい。スクリ
ーニング方法は高処理量のものを包含する。例えば、ア
ゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするた
めに、ヒスチジンキナーゼポリペプチドを含む、合成反
応混合物、膜、細胞表面膜もしくは細胞壁のごとき細胞
コンパートメント、またはそれらのいずれかの調製物、
およびこのようなポリペプチドの標識基質またはリガン
ドを、ヒスチジンキナーゼアゴニストまたはアンタゴニ
ストとなりうる候補分子の存在下または不在下でインキ
ュベーションする。候補分子がヒスチジンキナーゼポリ
ペプチドにアゴナイズまたは拮抗する能力は、標識化リ
ガンドの結合の低下またはこのような基質からの生成物
の産生の低下に反映される。結合しても影響を及ぼさな
い分子、すなわちヒスチジンキナーゼの効果を誘導しな
い分子は、最も良好なアンタゴニストである可能性があ
る。スクリーニング方法は、配列番号：５の応答レギュ
レーターポリヌクレオチドまたは配列番号：６の応答レ
ギュレーターポリペプチドを含むものであってもよい。
結合性が良好で、基質からの生成物の生成速度を高める
分子はアゴニストである。基質からの生成物の生成速度
またはレベルはリポーターシステムを用いることにより
強調できる。この点に関して有用なリポーターシステム
には、生成物に転換される比色測定用標識基質、ヒスチ
ジンキナーゼ活性の変化に反応するリポーター遺伝子、
および当該分野で周知の結合アッセイ等があるが、これ
らに限定するものではない。

【００５６】ヒスチジンキナーゼアンタゴニストのアッ
セイの他の例は競争アッセイであり、競争阻害アッセイ
に適した条件下で、ヒスチジンキナーゼおよび潜在的ア
ンタゴニストを、ヒスチジンキナーゼ結合分子、組換え
ヒスチジンキナーゼ結合分子、天然基質もしくはリガン
ド、または基質もしくはリガンド模倣物、または配列番
号：５の応答レギュレーターポリヌクレオチドまたは配
列番号：６の応答レギュレーターポリペプチドと混合す
る。例えば放射活性または比色測定用化合物によりヒス
チジンキナーゼを標識し、結合分子に結合した、または
生成物に変換されたヒスチジンキナーゼ分子の数を正確
に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価でき
る。本発明は、ｉ）配列番号：６の応答レギュレーター
のごとき応答レギュレーターとヒスチジンキナーゼとの
相互作用を妨害する薬剤を同定するために薬剤をスクリ
ーニングする方法であって、薬剤の存在下でヒスチジン
キナーゼを応答レギュレーターと接触させ、次いで、薬
剤がこの相互作用をブロックする能力を測定することを
特徴とする方法、ｉｉ）ヒスチジンキナーゼの自己リン
酸化能力を妨害する薬剤を同定するために薬剤をスクリ
ーニングする方法であって、ヒスチジンキナーゼを薬剤
と接触させ、次いで、薬剤が自己リン酸化を妨害する能
力を測定することを特徴とする方法を提供する。好まし
くは、応答レギュレーターは同種のヒスチジンキナーゼ
の応答レギュレーターであるか、またはヒスチジンキナ
ーゼ（好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス由来
のものであるが、別の微生物、例えばバチルス由来のも
のであってもよい）を基質として利用できる別の応答レ
ギュレーターである。

【００５７】また本発明は本発明により同定される阻害
剤にも関する。潜在的アンタゴニストには、本発明ポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、配列番号：
５の応答レギュレーターポリヌクレオチドまたは配列番
号：６の応答レギュレーターポリペプチドを包含）に結
合することによりその活性を阻害し消失させる小型有機
分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体などがある。
また、潜在的アンタゴニストは、密接に関連した蛋白ま
たは抗体のごとき小型有機分子、ペプチド、ポリペプチ
ドであってもよく、それらは結合分子の同じ部位に結合
するが、ヒスチジンキナーゼにより誘導される活性を誘
導せず、それゆえヒスチジンキナーゼを結合から排除す
ることによりヒスチジンキナーゼの作用を妨害する。潜
在的アンタゴニストには、ポリペプチドの結合部位に結
合し、およびそれを占領し、それにより細胞性結合分子
への結合を防御して、正常の生物学的活性を防御する小
型分子等がある。小型分子の例としては、小型有機分
子、ペプチド、ペプチド様分子等があるが、これらに限
定するものではない。その他の潜在的アンタゴニストに
はアンチセンス分子等がある（これらの分子についての
記載に関してはOkano,J.，Neurochem.56:560（1991）；
Oligodeoxy-nucleotides as Antisense Inhibitors of
Gene Expression，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フ
ロリダ州（1988）参照）。好ましい潜在的アンタゴニス
トには、ヒスチジンキナーゼ関連化合物およびヒスチジ
ンキナーゼ変種等がある。本発明で提供される各ＤＮＡ
配列を抗菌化合物の発見および開発に使用してもよい。
コードされている蛋白は、発現されると、抗菌剤のスク
リーニングの標的として使用できる。さらに、コードさ
れる蛋白のアミノ末端領域または個々のｍＲＮＡのシャ
イン−ダルガノ配列もしくは他の翻訳容易化配列をコー
ドしているＤＮＡ配列を用いてアンチセンス配列を構築
して目的コーディング配列の発現を調節することができ
る。

【００５８】特別な態様において、本発明は、感染の続
発症に関与する病因および哺乳動物宿主間の最初の物理
的相互作用を妨害するための本発明ポリペプチド、ポリ
ヌクレオチドまたは阻害物質の使用を提供する。とりわ
け本発明分子を、内在デバイス上の哺乳動物細胞外マト
リックス蛋白または傷における細胞外マトリックス蛋白
への細菌の付着、詳細にはグラム陽性細菌の付着を防止
するために；例えば哺乳動物チロシンキナーゼのホスホ
リレーションを開始することにより、ヒスチジンキナー
ゼ蛋白により媒介される哺乳動物細胞への侵入をブロッ
クするために（Rosenshine et al.,Infect.Immunol.60:
2211(1992)）；哺乳動物細胞外マトリックス蛋白と細菌
ヒスチジンキナーゼ蛋白との間の、組織ダメージを媒介
する細菌付着をブロックするために；内在デバイスの移
植または他の外科的方法以外により開始される、感染に
おける通常の病状の進行をブロックするために使用する
ことができる。

【００５９】本発明アンタゴニストおよびアゴニスト
を、例えば、感染、とりわけ細菌感染、特に上部気道感
染（例えば、中耳炎、細菌性気道炎、急性喉頭蓋炎、甲
状腺炎）、下部気道感染（例えば、蓄膿、肺の膿瘍）、
心臓の感染（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸の感染
（例えば、分泌性下痢、脾臓の膿瘍、腹膜後膿瘍）、Ｃ
ＮＳ感染（例えば、脳の膿瘍）、目の感染（眼瞼炎、結
膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔および眼かの蜂巣炎、涙
嚢炎）、腎臓および尿道感染（例えば、精巣上体炎、腎
内および腎周囲の膿瘍、毒性ショック症候群）、皮膚感
染（例えば、インペチゴ、毛包炎、皮膚の膿瘍、蜂巣
炎、傷の感染、細菌性筋炎）、骨および関節の感染（例
えば、敗血性関節炎、骨髄炎）のごとき疾病の抑制に用
いてもよい。

【００６０】ワクチン本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免
疫学的反応を誘起する方法に関し、該方法は、感染、詳
細には細菌感染、最も詳細にはスタフィロコッカス・ア
ウレウス感染から個体を防御する抗体を産生させるに十
分なヒスチジンキナーゼまたはそのフラグメントもしく
は変種を個体に接種することを特徴とする。また、かか
る免疫学的応答により細菌の複製を遅延させる方法も提
供される。本発明のさらにもう１つの態様は、個体にお
ける免疫学的応答の誘導方法に関し、該方法は、遺伝子
治療により、ヒスチジンキナーゼまたはそのフラグメン
トもしくは変種をコードしている遺伝子を送達して、ヒ
スチジンキナーゼまたはそのフラグメントもしくは変種
をインビボで発現させて免疫学的応答を誘導し（例え
ば、サイトカイン産生Ｔ細胞または細胞毒性Ｔ細胞を包
含する抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生じさせ
る）、すでに疾病が個体において確立されているかどう
かにかかわらず、該個体を疾病から防御する抗体を産生
させることを特徴とする。遺伝子を投与するための１経
路は、粒子上のコーティングとして所望細胞中に加速し
て導入することによる。かかる核酸ベクターは、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、修飾核酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリ
ッドを含んでいてもよい。

【００６１】本発明のさらなる態様は、免疫学的反応を
宿主内に誘導しうる、または誘導された宿主に導入した
場合、ヒスチジンキナーゼまたはそれによりコードされ
ている蛋白に対する免疫学的反応を該宿主に誘導しうる
免疫学的組成物に関し、その組成物は組換えヒスチジン
キナーゼまたはそれによりコードされている蛋白を含
み、ヒスチジンキナーゼまたはそれによりコードされて
いる蛋白に対する抗原をコードし発現するＤＮＡを含
む。免疫学的応答を治療的または予防的に用いてもよ
く、ＣＴＬまたはＣＤ４＋細胞から生じるような抗体免
疫または細胞免疫の形態であってもよい。

【００６２】ヒスチジンキナーゼまたはそれらのフラグ
メントを、それ自身は抗体を産生しないが、第１の蛋白
を安定化し、免疫原的および保護特性を有する融合蛋白
を産生する能力のある共存蛋白（co-protein）と融合さ
せてもよい。好ましくは、かかる融合組換え蛋白は、抗
原補蛋白、例えばヘモフィルス・インフルエンザエ（He
mophilus influenzae）由来のリポ蛋白Ｄ、グルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーター
ガラクトシダーゼのごとき共存蛋白、蛋白を可溶化して
それらの産生および精製を促進する比較的大きな共存蛋
白等を含む。さらに、共存蛋白は免疫系において普遍的
な刺激を提供するという意味で、アジュバントとして作
用することができる。共存蛋白は第１の蛋白のアミノま
たはカルボキシル末端のどちらかに結合できる。

【００６３】本発明は、本発明のポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドおよびSato Y.ら、Science 273:352(196
6)に記載されているような免疫刺激ＤＮＡ配列を含む組
成物、とりわけワクチン組成物、および方法を提供す
る。

【００６４】また、本発明は、スタフィロコッカス・ア
ウレウスに感染した動物モデルにおいて、かかる遺伝的
免疫化実験に用いられるＤＮＡ構築物中の細菌細胞表面
蛋白の不変領域をコードすることが示されている、説明
したポリヌクレオチドまたはとりわけそれらのフラグメ
ントを用いる方法を提供し、これらはとりわけ予防的ま
たは治療的免疫反応を刺激することができる蛋白エピト
ープを同定するのに有用である。この研究は、哺乳動
物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけスタフィロ
コッカス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の
開発のために、感染に抵抗し、あるいはこれを一掃する
のに成功した動物の必須器官から特に価値あるモノクロ
ーナル抗体をうまく調製することを可能にすると思われ
る。

【００６５】ポリペプチドを宿主接種用抗原として用い
て、例えば損傷組織への細菌の付着を阻害することによ
り細菌の侵入に対して防御する特異的抗体を得てもよ
い。組織損傷の例としては、例えば機械的、化学的もし
くは熱的ダメージにより、または内在デバイスの埋め込
みにより引き起こされた皮膚または結合組織の創傷、ま
たは粘膜、例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷等があ
る。

【００６６】また本発明は、適切な担体と一緒になった
免疫原性組換え蛋白を含有するワクチン処方を包含す
る。蛋白は胃で分解するので、非経口的に、例えば皮
下、筋肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好ま
しい。非経口投与に適した処方には、抗酸化剤、緩衝
液、静菌剤、および処方を個体の体液（好ましくは血
液）と等張にする溶質を含有していてもよい水性または
非水性滅菌注射液、および懸濁化剤または増粘剤を含有
していてもよい水性または非水性滅菌懸濁液等がある。
処方は１回投与または多回投与用容器、例えばシールし
たアンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に無
菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として
保存してもよい。ワクチン処方は処方の免疫原性を高め
るアジュバント系を含有していてもよく、例えば水中油
系または当該分野で周知のその他の系等がある。投与量
はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験法により
容易に決定できる。本発明を特定のヒスチジンキナーゼ
蛋白に関して説明したが、本発明は、天然に存在する蛋
白のフラグメント、ならびに実質的に組換え蛋白の免疫
原特性に影響しない付加、欠失または置換を伴った類似
の蛋白を包含することが理解されよう。

【００６７】組成物、キットおよび投与本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。本発明ポリペプチド、細胞、
組織もしくは生物に用いられる未滅菌もしくは滅菌済み
担体と混合して、例えば対象への投与に適した医薬的担
体と混合して用いることができる。このような組成物
は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポリ
ペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦形剤
を含む。このような担体には生理食塩水、緩衝化生理食
塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール
およびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定す
るものではない。処方は投与法に適したものにすべきで
ある。さらに本発明は、１またはそれ以上の上記本発明
組成物成分を充填した１またはそれ以上の容器を含んで
なる診断用および医薬用パックおよびキットにも関す
る。

【００６８】本発明ポリペプチドおよびその他の化合物
を、単独で、あるいは治療用化合物等のその他の化合物
と組み合わせて用いてもよい。いずれかの有効かつ利便
的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、経膣、静脈
内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚内の
経路で医薬組成物を投与してもよい。治療において、ま
たは予防薬として、活性物質を注射用組成物として、例
えば好ましくは等張の無菌水性分散物として個体に投与
できる。別法として、組成物を局所適用用、例えば軟
膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳液、
洗口剤、染み込ませた包帯および縫合用の糸、ならびに
エアロゾール等の形態に処方してもよく、適当な慣用的
な添加物、例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、
ならびに軟膏およびクリームには軟化剤を含有していて
もよい。かかる局所用処方は、適合した慣用的な担体、
例えばクリームまたは軟膏基剤、およびローションには
エタノールまたはオレイルアルコールを含有していても
よい。このような担体は重量で処方の約１％から約９８
％であってよく、より通常には重量で処方の約８０％ま
でとする。哺乳動物とりわけヒトに投与するために、活
性物質の１日あたりの投与量は、０.０１ｍｇ／ｋｇか
ら１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇで
ある。医者はあらゆる場合、個体に最も適した実際の投
与量を決定し、年齢、体重および特に個体の反応性に応
じて変化させる。上述の投与量は、平均的なケースの典
型例である。もちろん、高用量および低用量の範囲が適
合する個々の例もあり、かかる例は本発明の範囲内であ
る。

【００６９】内在デバイスには外科的インプラント、補
てつデバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体
に導入し、長時間その位置に存在するものである。この
ようなデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャ
ント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析（contin
uous ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カ
テーテル等がある。本発明の組成物を注射により投与
し、内在デバイスの挿入の直前に、関連細菌に対する全
身的な効果を得てもよい。手術後、デバイスが体内に存
在する期間中、処置を続けてもよい。さらに、外科的手
技中に広げるカバーに用いて、細菌性創傷感染、とりわ
けスタフィロコッカス・アウレウスの創傷感染を防御す
ることもできる。

【００７０】多くの整形外科医は、補てつ関節を有する
ヒトについては、菌血症を生じうる歯科的処置の前に抗
生物質予防法を考慮すべきであると考えている。遅延性
の重篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻な合
併症であり、有意性のある罹病率および死亡率を伴う。
従って、この場合、予防的な抗生物質に代わるものとし
て、活性物質の使用を拡張することが可能である。

【００７１】上述の治療に加え、一般的には本発明組成
物を一般的に創傷の治療薬として使用して、創傷組織に
曝露したマトリックス蛋白に細菌が付着するのを防いで
もよく、歯科治療においては抗生物質による予防法に代
えて、またはそれと組み合わせて予防的に使用してもよ
い。

【００７２】別法として、本発明の組成物を用いて挿入
直前の内在デバイスを浸してもよい。創傷または内在デ
バイスを浸すためには、活性物質は１μｇ／ｍｌから１
０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。ワクチン組成
物を便宜的に注射可能な形態にする。慣用的なアジュバ
ントを用いて免疫反応を高めてもよい。ワクチン化に適
した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、
このような投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するの
が好ましい。本発明化合物については、指示した投与量
範囲では、適切な個体への投与を妨げるような不利な毒
性効果は観察されない。上記抗体を診断試薬として用い
てヒスチジンキナーゼ蛋白を有する細菌の存在を検出し
てもよい。

【００７３】

【実施例】以下の実施例は、詳細に説明したこと以外
は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を用いて実施
する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を
限定するものではない。実施例１：菌株の選択、ライブラリーの製造および配列
決定配列番号：１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチ
ドを、イー・コリ中のスタフィロコッカス・アウレウス
の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーから得た。重
複するスタフィロコッカス・アウレウスのＤＮＡを含有
する２個またはそれ以上のクローンからの配列決定デー
タを用いて配列番号：１の連続したＤＮＡ配列を構築し
た場合もある。通常の方法、例えば以下の方法１および
２によりライブラリーを製造できる。全細胞ＤＮＡは、
スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９から、標
準法に準じて単離し、二つの方法のどちらかによりサイ
ズ分画する。

【００７４】方法１標準法に準じてサイズ分画化するために、全細胞ＤＮＡ
を注射針に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの
大きさのフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断されているベクターラムダＺａｐＩＩに
連結し、標準法によりライブラリーをパッケージング
し、次いでパッケージングしたライブラリーで大腸菌を
感染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。方法２全細胞性ＤＮＡは、ライブラリーベクター（例えば、Ｒ
ｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）にク
ローニングするための一連のフラグメントを適切に生じ
る１の制限酵素または制限酵素の組み合わせで部分的加
水分解し、かかるフラグメントを標準法に準じてサイズ
分画化する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグ
メントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断されているベ
クターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブ
ラリーをパッケージングし、次いでパッケージングした
ライブラリーで大腸菌を感染させる。ライブラリーを標
準法により増幅する。

【００７５】

【配列表】

【００７６】（１）一般的情報：（ｉ）出願人：Wallis, Nicola G. （ｉｉ）発明の名称：新規化合物（ｉｉｉ）配列の数：６（ｉｖ）連絡先：（Ａ）宛て名：Dechert, Price & Phoads （Ｂ）通り名：4000 Bell Atlantic Tower, 1717 Arch
Stre （Ｃ）都市名：フィラデルフィア（Ｄ）州名：ペンシルベニア（Ｅ）国名：アメリカ合衆国（Ｆ）ＺＩＰ：１９１０３−２７９３（ｖ）コンピューターリーダブルフォーム：（Ａ）媒体タイプ：ディスケット（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル（Ｃ）作動システム：Mindows 95 （Ｄ）ソフトウェア：FastSEQ for Windows バージョン
２．０ｂ（ｖｉ）現出願のデータ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）先の出願のデータ：（Ａ）出願番号：６０／０４３４８９（Ｂ）出願日：１９９７年４月１０日（ｖｉｉｉ）代理人等の情報：（Ａ）氏名：Falk, Stephen T （Ｂ）登録番号：３６７９５（Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＭ５００２５（ｉｘ）テレコミュニケーションの情報：（Ａ）電話番号：２１５−９９４−２４８８（Ｂ）ファックス番号：２１５−９９４−２２２２（Ｃ）テレックス：

【００７７】（２）配列番号：１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１１５０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：２本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： ATATTGTATT AGTCATTTTA AAAGGGCGGA ATAAAATATG AAATTTTTAA AAGATACTTC 60 AATTGCTGAA ATATCGTCTA TACTTTATCT GATTTTTCCT ATTGCCGGTA TATTTTTTAA 120 TGAAGTATAT GGTCCCAAAT GGTTGTATAT TATATCAGTC ATTGTCTTTT CGTTGTCGTA 180 TCTTATATTA GTTATAGTAA ATAATAGACT TAATACATTA ATGTTTTACA TTTTGTTGAT 240 TATTCATTAT TTTATTATTT GTTATTTTGT TTTCAGTGTA CATCCAATGC TAAGTTTGTT 300 TTTCTTTTAT AGTGCTTTTG CCGTTCCATT TACTTTTAAA AATAATGTTA AAAAAACGGC 360 AACTAATCTT TTCATACTAA CAATGATTAT ATGTACAATA ATAACGTACT TATTGTATAA 420 CAACTATTTT GTTGCAATGA TGGTTTATTA TGTCGTTATA TCGTTAATAA TGCTAGATAA 480 TTTTAAAAAA ATGAAAAACC GTGAATATCA AAAAGAAATA GCAGAAAAAA ATAGACATAT 540 TAATACATTA ATTGCTGAAC AAGAGCGACA TAGAATTGGT CAAGACTTAC ATGATACGTT 600 AGGGCATGTG TTTGCAAGTT TATCATTAAA ATCAGAATTA GCTTATAAAC TAATAGATAC 660 TGATGTAGAA AAAGTAAAAG CTGAATTATT AGCAATTAAT AAATTATCTC GTGAATCATT 720 GAACAAAGTT CGAGAAATTA TTGATGATGT AAAATTACCA TCATTTATTG AAGAGATTGA 780 TAGTATACGT AAAGTTTTAA AAGATGCTGA TATTGATTTT ACATTTGAAA ATAAAGAATT 840 AGCGCAAGTA TTAAGTCCTA CTAAACAATC TATGGTAGTT ATGATTACGC GTGAAGCGAT 900 AAATAATGTT ATTAAACATG CAAATGCTTC AAAAGTTCAT GGTAAATTAA AAACTGTAAA 960 CAATCATAAA TTACTGCTTA TGATTGAAGA TGATGGCAAA GGTATCGATA GTGATTGTGA 1020 GGTGAAAAGT ATTTCACAGC GTGTACAACA TTTAAATGGA ACTTTAGCAG TCGACTCAAC 1080 AAATGGAACT AAAATAATCA TTGAAATCTC AACAGGAGGA ATAGCATGAC ATCTTTAATT 1140 ATTGCAGAAG 1150

【００７８】（２）配列番号：２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３６３アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Met Lys Phe Leu Lys Asp Thr Ser Ile Ala Glu Ile Ser Ser Ile Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Ile Phe Pro Ile Ala Gly Ile Phe Phe Asn Glu Val Tyr Gly 20 25 30 Pro Lys Trp Leu Tyr Ile Ile Ser Val Ile Val Phe Ser Leu Ser Tyr 35 40 45 Leu Ile Leu Val Ile Val Asn Asn Arg Leu Asn Thr Leu Met Phe Tyr 50 55 60 Ile Leu Leu Ile Ile His Tyr Phe Ile Ile Cys Tyr Phe Val Phe Ser 65 70 75 80 Val His Pro Met Leu Ser Leu Phe Phe Phe Tyr Ser Ala Phe Ala Val 85 90 95 Pro Phe Thr Phe Lys Asn Asn Val Lys Lys Thr Ala Thr Asn Leu Phe 100 105 110 Ile Leu Thr Met Ile Ile Cys Thr Ile Ile Thr Tyr Leu Leu Tyr Asn 115 120 125 Asn Tyr Phe Val Ala Met Met Val Tyr Tyr Val Val Ile Ser Leu Ile 130 135 140 Met Leu Asp Asn Phe Lys Lys Met Lys Asn Arg Glu Tyr Gln Lys Glu 145 150 155 160 Ile Ala Glu Lys Asn Arg His Ile Asn Thr Leu Ile Ala Glu Gln Glu 165 170 175 Arg His Arg Ile Gly Gln Asp Leu His Asp Thr Leu Gly His Val Phe 180 185 190 Ala Ser Leu Ser Leu Lys Ser Glu Leu Ala Tyr Lys Leu Ile Asp Thr 195 200 205 Asp Val Glu Lys Val Lys Ala Glu Leu Leu Ala Ile Asn Lys Leu Ser 210 215 220 Arg Glu Ser Leu Asn Lys Val Arg Glu Ile Ile Asp Asp Val Lys Leu 225 230 235 240 Pro Ser Phe Ile Glu Glu Ile Asp Ser Ile Arg Lys Val Leu Lys Asp 245 250 255 Ala Asp Ile Asp Phe Thr Phe Glu Asn Lys Glu Leu Ala Gln Val Leu 260 265 270 Ser Pro Thr Lys Gln Ser Met Val Val Met Ile Thr Arg Glu Ala Ile 275 280 285 Asn Asn Val Ile Lys His Ala Asn Ala Ser Lys Val His Gly Lys Leu 290 295 300 Lys Thr Val Asn Asn His Lys Leu Leu Leu Met Ile Glu Asp Asp Gly 305 310 315 320 Lys Gly Ile Asp Ser Asp Cys Glu Val Lys Ser Ile Ser Gln Arg Val 325 330 335 Gln His Leu Asn Gly Thr Leu Ala Val Asp Ser Thr Asn Gly Thr Lys 340 345 350 Ile Ile Ile Glu Ile Ser Thr Gly Gly Ile Ala 355 360

【００７９】（２）配列番号：３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２９塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３： ATGAAATTTT TAAAAGATAC TTCAATTGC 29

【００８０】（２）配列番号：４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２９塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号：４： TGCTATTCCT CCTGTTGAGA TTTCAATGA 29

【００８１】（２）配列番号：５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：８５０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：２本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号：５： TTCCCTTTTT TGTTTGTATT TAGATCCAGC CTTTTTCATT TGCCTTTTTC CAAGCATCAA 60 AACGATTATC TGCAAATAAT TTATCAATTA TAACAGATGT ATAATTTCTA ACTGTTCCAT 120 CTGTCAAAAA TAATTTTTCA CTTATTTCTT TACTACTTAA ACCATTGCCA ATTTCCCTTA 180 ATACAATTTG TTCTTTGGGC GTTAATGGGT TTTTATCTAC AAAAAATGAA GTCATCAATG 240 TGGCGCTATA TTCTCTCTCT CCGTTATTTA CTTTATTAAT GGTTTCCACC AATTCTTCTA 300 TCGAACGTTC TTTTAAAACA TATGCATCCA CATCATTCAC AACTGCTTTT TCAAAGTATC 360 CCGGTCTTTT AAAAGTTGTT ACAATAATCA CTTTAATATT CAAATGCTTT TTTCTAATTT 420 CCGCTAAAAC TTCAAGTCCA GTCATGCCTG GCATTTCTAT ATCTAAAATA ACAACGTTAG 480 GATTATATTC TTCAATAAGT TTCATTGCAT CGAGACCATT ATCAGTATCT GCTAAAATTT 540 CAAAATCACC ATGTAGTTTA ATTAATTGAA CCATTGCCTG TCGTAACATA TTTTGATCTT 600 CTGCAATAAT TAAAGATGTC ATGCTATTCC TCCTGTTGAG ATTTCAATGA TTATTTTAGT 660 TCCATTTGTT GAGTCGACTG CTAAAGTTCC ATTTAAATGT TGTACACGCT GTGAAATACT 720 TTTCACCTCA CAATCACTAT CGATACCTTT GCCATCATCT TCAATCATAA GCAGTAATTT 780 ATGATTGTTT ACAGTTTTTA ATTTACCATG AACTTTTGAA GCATTTGCAT GTTTAATAAC 840 ATTATTTATC 850

【００８２】（２）配列番号：６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２００アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号：６： Met Thr Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asp Gln Asn Met Leu Arg Gln Ala 1 5 10 15 Met Val Gln Leu Ile Lys Leu His Gly Asp Phe Glu Ile Leu Ala Asp 20 25 30 Thr Asp Asn Gly Leu Asp Ala Met Lys Leu Ile Glu Glu Tyr Asn Pro 35 40 45 Asn Val Val Ile Leu Asp Ile Glu Met Pro Gly Met Thr Gly Leu Glu 50 55 60 Val Leu Ala Glu Ile Arg Lys Lys His Leu Asn Ile Lys Val Ile Ile 65 70 75 80 Val Thr Thr Phe Lys Arg Pro Gly Tyr Phe Glu Lys Ala Val Val Asn 85 90 95 Asp Val Asp Ala Tyr Val Leu Lys Glu Arg Ser Ile Glu Glu Leu Val 100 105 110 Glu Thr Ile Asn Lys Val Asn Asn Gly Glu Arg Glu Tyr Ser Ala Thr 115 120 125 Leu Met Thr Ser Phe Phe Val Asp Lys Asn Pro Leu Thr Pro Lys Glu 130 135 140 Gln Ile Val Leu Arg Glu Ile Gly Asn Gly Leu Ser Ser Lys Glu Ile 145 150 155 160 Ser Glu Lys Leu Phe Leu Thr Asp Gly Thr Val Arg Asn Tyr Thr Ser 165 170 175 Val Ile Ile Asp Lys Leu Phe Ala Asp Asn Arg Phe Asp Ala Trp Lys 180 185 190 Lys Ala Asn Glu Lys Gly Trp Ile 195 200

【図面の簡単な説明】

【図１】スタフィロコッカス・アウレウスのヒスチジ
ンキナーゼのポリヌクレオチド配列を示す［配列番号：
１］。

【図２】図１のポリヌクレオチド配列から推定される
スタフィロコッカス・アウレウスのヒスチジンキナーゼ
のアミノ酸配列を示す［配列番号：２］。

【図３】スタフィロコッカス・アウレウスのＵｈｐＢ
応答レギュレーターのポリヌクレオチド配列を示す［配
列番号：５］。

【図４】図３のポリヌクレオチド配列から推定される
スタフィロコッカス・アウレウスのＵｈｐＢ応答レギュ
レーターのアミノ酸配列を示す［配列番号：６］。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＥＤＣ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/48 ＺＣ１２Ｑ 1/48 Ｃ０７Ｋ 14/195 // Ｃ０７Ｋ 14/195 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ (71)出願人 595047190 スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニーＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍｐ．ｌ．ｃ. イギリス国ミドルセックス・ティーダブリュ８・９イーピー、ブレンフォード、ニュー・ホライズンズ・コート（番地の表示なし) (72)発明者ニコラ・ゲイル・ウォリスアメリカ合衆国19087ペンシルベニア州ウェイン、シュガータウン・ロード219番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号：２のアミノ酸１から
３６３までを含むポリペプチドをコードしているポリヌ
クレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有する
ポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的であ
るポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少な
くとも１５個の連続した塩基を含むポリヌクレオチド；
からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む
単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】ＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチ
ド。
【請求項３】ＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチ
ド。
【請求項４】配列番号：１に示すヌクレオチド１から
１１５０までを含む請求項２のポリヌクレオチド。
【請求項５】配列番号：１に示すヌクレオチド３８か
ら１１２６までを含む請求項２のポリヌクレオチド。
【請求項６】配列番号：２のアミノ酸１から３６３ま
でを含むポリペプチドをコードしている請求項２のポリ
ヌクレオチド。
【請求項７】（ａ）ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１中
に含まれるヒスチジンキナーゼ遺伝子により発現される
のと同じ成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレ
オチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリ
ヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的である
ポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の塩基を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるメンバーを含む単離ポリヌク
レオチド。
【請求項８】請求項２のＤＮＡを含むベクター。
【請求項９】請求項８のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】上記ＤＮＡによりコードされるポリペ
プチドを請求項９記載の宿主細胞から発現させることを
特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】ベクター中に含まれるｃＤＮＡにより
コードされるポリペプチドを細胞が発現するように請求
項８のベクターで細胞を形質転換またはトランスフェク
ションすることを特徴とする、ポリペプチドを発現する
細胞の製造方法。
【請求項１２】ヒスチジンキナーゼポリペプチドまた
はフラグメントの生成に十分な条件下で請求項９記載の
宿主を培養することを特徴とする、ヒスチジンキナーゼ
ポリペプチドまたはフラグメントの製造方法。
【請求項１３】配列番号：２のアミノ酸１から３６３
までに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列
を含むポリペプチド；
【請求項１４】配列番号：２に示すアミノ酸配列を含
むポリペプチド。
【請求項１５】請求項１３のポリペプチドに対する抗
体。
【請求項１６】請求項１３のポリペプチドの活性を阻
害するアンタゴニスト。
【請求項１７】治療上有効量の請求項１３のポリペプ
チドを個体に投与することを特徴とする、ヒスチジンキ
ナーゼを必要とする個体の治療方法。
【請求項１８】該ポリペプチドをコードしているＤＮ
Ａを個体に提供し、次いで、該ポリペプチドをインビボ
で発現させることにより、治療上有効量のポリペプチド
が投与されるものである請求項１７の方法。
【請求項１９】治療上有効量の請求項１６のアンタゴ
ニストを個体に投与することを特徴とする、ヒスチジン
キナーゼポリペプチドを阻害する必要のある個体の治療
方法。
【請求項２０】請求項１３のポリペプチドをコードし
ている核酸配列を決定することを特徴とする、請求項１
３のポリペプチドの発現に関連した疾病の診断方法。
【請求項２１】宿主由来の試料中の請求項１３のポリ
ペプチドの存在を分析することを特徴とする診断方法。
【請求項２２】請求項１３のポリペプチドと相互作用
し、その活性を阻害または活性化する化合物の同定方法
であって、化合物とポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下
で、スクリーニングすべき化合物にポリペプチドを接触
させて化合物の相互作用を評価すること（かかる相互作
用は、ポリペプチドと化合物との相互作用に応答して
「検出可能シグナルを生じることのできる第２の化合物
に関連したものである）、次いで、化合物と結合物質との相互作用により生じるシ
グナルの存在または不存在を検出することにより、化合
物がポリペプチドと相互作用し、その活性を活性化また
は阻害するかどうかを決定することを特徴とする方法。
【請求項２３】哺乳動物を疾病から防御する抗体およ
び／またはＴ細胞免疫応答を生じさせるに十分なヒスチ
ジンキナーゼ、またはそのフラグメントもしくは変種を
哺乳動物に接種することを特徴とする、哺乳動物におい
て免疫学的応答を誘導する方法。
【請求項２４】ヒスチジンキナーゼ、またはそのフラ
グメントもしくは変種の発現を指令する核酸ベクターを
送達して、インビボにおいてヒスチジンキナーゼ、また
はそのフラグメントもしくは変種を発現させて免疫学的
応答を誘導し、哺乳動物を疾病から防御するための抗体
および／またはＴ細胞免疫応答を生じさせることを特徴
とする、哺乳動物において免疫学的応答を誘導する方
法。
【請求項２５】ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチド
またはそれによりコードされる蛋白をコードし発現する
ＤＮＡを含んでなる免疫学的組成物であって、哺乳動物
中に導入された場合にヒスチジンキナーゼポリヌクレオ
チドまたはそれによりコードされる蛋白に対する免疫学
的応答を哺乳動物において誘導するものである組成物。
【請求項２６】厳密なハイブリダイゼーション条件下
で、配列番号：１に示すポリヌクレオチドまたはそのフ
ラグメントの配列を有するプローブを用いて配列番号：
１に示すポリヌクレオチド配列に関する完全な遺伝子を
含む適当なライブラリーをスクリーニングし、次いで、
ＤＮＡ配列を単離することにより得ることのできるＤＮ
Ａ配列を必須として含むポリヌクレオチド。