JPH11123089A

JPH11123089A - 新規化合物

Info

Publication number: JPH11123089A
Application number: JP10210189A
Authority: JP
Inventors: Nicola Gail Wallis; ニコラ・ゲイル・ウォリス
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd; SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd; SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 1999-05-11
Also published as: CA2235433A1; EP0885965A3; EP0885965A2

Abstract

(57)【要約】【課題】化合物を抗生物質活性についてスクリーニン
グするために用いることができ、感染、機能障害および
疾患の発生病理にてその役割を決定するのに用いること
もできる因子の解明が望まれている。【解決手段】本発明は、上記課題を解決するのに用い
ることができる、配列番号２のアミノ酸を含むポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチドに対して少なく
とも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド、および
ヒスチジンキナーゼポリペプチドおよびヒスチジンキナ
ーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび
組換え技法により該ポリペプチドの製法を提供するもの
である。さらには、抗菌化合物についてスクリーニング
するのにヒスチジンキナーゼポリペプチドを利用する方
法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および、それらの製
造および使用、ならびにそれらの変種、アゴニストおよ
びアンタゴニスト、ならびにそれらの使用に関する。特
に、これらの点および他の点に関して、本発明は、ヒス
チジンキナーゼファミリー（以下、「ヒスチジンキナー
ゼ」と称する）の新規ポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドに関する。

【０００２】

【従来の技術】ストレプトコッカス属（Streptococci）
は医学的に重要な微生物属を形成しており、ヒトに，例
えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞
炎、膿胸および心内膜炎、特に例えば脳脊髄液の感染の
ごとき髄膜炎を包含する、いくつかの型の疾患を引き起
こすことが知られている。ストレプトコッカス属の単離
から１００年以上も経過しているため、ストレプトコッ
カス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）
は、より詳細な研究が為された微生物の一つである。例
えば、事実、ＤＮＡが遺伝物質であるという我々の初期
の理解の大部分は、この微生物を用いたGriffithならび
に、Avery、MacleodおよびMcCartyの研究にて断言され
た。エス・ニューモニアエに関する研究は膨大であるに
もかかわらず、この微生物の毒性に関しては多くの疑問
が残されている。抗生物質の開発のための標的としてス
トレプトコッカス属の遺伝子および遺伝子産物を用いる
のはとりわけ好ましいことである。ストレプトコッカス
・ニューモニアエ感染の頻度は、過去２０年において劇
的に増加している。これは、多抗生物質耐性菌の出現お
よび免疫系の弱いヒトの数の増加に起因している。標準
的な抗生物質のいくらかまたはすべてに対して耐性であ
るストレプトコッカス・ニューモニアエ株を単離するこ
とは、いまや珍しいことではない。これにより、この微
生物に対する新しい抗微生物剤および診断方法の両方が
必要とされている。

【０００３】例えば、莢膜ポリサッカライド、ペプチド
グリカン、ニューモリジン（pneumolysins）、ＰｓｐＡ
補体因子Ｈ結合コンポーネント、自己溶菌酵素、ノイラ
ミニダーゼ、ペプチド・パーミアーゼ、過酸化水素、Ｉ
ｇＡ１プロテアーゼなどの病原性と関連する特定のスト
レプトコッカス因子が同定されているが、リストは完全
ではない。さらに、哺乳動物宿主における感染および疾
患の進行の間のかかる遺伝子の一時的発現については、
ほとんど知られていない。感染の異なる段階、特に、感
染が確立する際に細菌が発現するらしい遺伝子のセット
を見出すことにより、病因を妨害できる新規な抗菌剤の
スクリーニングおよび解析のための重要な情報が提供さ
れる。より十分な公知のタンパク質の理解の提供に加
え、かかるアプローチは、以前に認識されていない標的
を同定するであろう。多くの２成分シグナルトランスダ
クションシステム（ＴＣＳＴＳ）が細菌において同定さ
れている（Stock, J. B., Ninfa, A. J. & Stock , A.
M. (1989) Microbiol. Rev. 53, 450-490)。これらは、
その周囲を監視し、その環境の変化に適応する細菌の能
力に関連している。これらの細菌のＴＣＳＴＳのいくつ
かは、宿主内での毒性および細菌性病原性に関連する。

【０００４】ヒスチジンキナーゼは、ヒスチジン残基で
自動リン酸化するＴＣＳＴＳの成分である。ついで、リ
ン酸基は関連する応答レギュレーターに移される。ヒス
チジンキナーゼは、5個の短い保存されたアミノ酸配列
を有する（Stock. J. B., Ninfa, A. J. & Stock, A.
M. (1989) Microbiol. Rev. 53, 450-490, Swanson, R.
V., Alex, L. A. & Simon, M. I. (1994) TIBS 19 485-
491）。これらは、リン酸化される、保存アスパラギン
残基が約１００残基後に続く、ヒスチジン残基である。
さらに１５ないし４５残基後に、ＤＸＧＸＧモチーフが
見られ、さらに１０−２０残基後にＦＸＸＦモチーフが
続く。さらに１０−２０残基には、他のグリシンモチー
フ、ＧＸＧが見られる。２個のグリシンモチーフは、ヌ
クレオチド結合に関与するものと考えられている。この
ヒスチジンキナーゼファミリーには、バシラス・サチリ
ス（Bacillus subtilis）由来のＰｈｏＲタンパク質が
包含される。ＰｈｏＲは、アルカリ・ホスファターゼの
産生に関与する遺伝子を制御するＴＣＳＴＳのヒスチジ
ンキナーゼである（Seki, T., Yoshikawa, H., Takahas
hi, H. & Saito, H., (1988) J. Bateriol. 170, 5935-
5938）。

【０００５】応答レギュレーターは、ＴＣＳＴＳの成分
である。これらのタンパク質は、ヒスチジンキナーゼか
らリン酸化され、一度リン酸化されると、しばしばＤＮ
Ａ結合ドメインの活性化を介して、応答に作用する。応
答レギュレーターは、約１００アミノ酸残基の保存Ｎ−
末端ドメインにより特徴付けられる。応答レギュレータ
ーのＮ−末端ドメインならびにＣｈｅＹ中の残基Ｄ１
２、Ｄ１３、Ｄ５７、Ｔ８７、Ｋ１０９（Matsumura,
P., Rydel, J. J., Linzmeier, R. & Vacante, D.(198
4) J. Bacteriol. 160, 36-41）に対応する、保持され
た5個の機能的に重要な残基は、保存された構造特性を
有する（Volz, K. (1993) Biochemistry 32,11741-1175
3）。サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhim
urium）（Stock, A. M., Mottonen, J. M., Stock, J.
B. & Schutt, C. E. (1989) Nature,337, 745-749）お
よびエシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Volz,
K. &Matsumura, P. (1991) J. Biol. Chem. 266, 15511
-15519）由来のＣｈｅＹの３次元構造およびエス・チフ
ィムリウム由来の窒素調節タンパク質ＣのＮ−末端ドメ
イン（Volkman, B. F., Nohaile, M. J., Amy, N. K.,
Kutsu, S. & Wemmer,D. E. (1995) Biochemistry, 34 1
413-1424）は、バシラス・サチリス由来のＳｐｏＯＦの
2次元構造（Feher, V. A., Zapf, J. W., Hoch, J. A.,
Dahlquist,F. W., Whiteley, J. M. & Cavanagh, J.
(1995) Protein Science, 4, 1801-1814）と同様、利用
可能である。これらの構造は、（ａ／ｂ）₅の折りたた
み（fold）を有する。いくつかの構造残基は、異なる応
答レギュレーター配列間、特に、β−シート疎水性コア
およびα−へリックス由来の部位中の疎水性残基で保存
されている。

【０００６】ＴＣＳＴＳにより調節されるプロセスに
は、毒性因子の生成、運動性、抗生物質耐性および細胞
複製がある。ＴＣＳＴＳタンパク質の阻害剤は、病因に
必要な因子の生成を妨げることにより、細菌が宿主の感
染を確立し維持することを妨げ、それにより、抗細菌治
療において有用性がある。明らかに、本発明の新規化合
物などの抗生物質活性について化合物をスクリーンする
のに有用である現今の利益を有する因子が必要とされて
いる。かかる因子はまた、感染、機能不全および疾患の
病因におけるそれらの役割を決定するのにも有用であ
る。感染、機能不全または疾患の防御、改善または治療
において役割を担う該因子およびそれらのアンタゴニス
トおよびアゴニストの同定および解析もまた必要とされ
ている。本発明のポリペプチドは、公知のバシラス・サ
チリス由来のＰｈｏＲタンパク質に相同的なアミノ酸配
列を有する。Swissprot Database Accession No. P2354
5参照。

【０００７】

【発明の要約】表1（配列番号２）に示されるアミノ酸
配列およびバシラス・サチリスのＰｈｏＲタンパク質な
どの公知のアミノ酸配列または他のタンパク質の配列間
の相同性により新規なヒスチジンキナーゼポリペプチド
であると同定されているポリペプチドを提供すること
が、本発明の一つの目的である。さらに、ヒスチジンキ
ナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特
に本明細書においてヒスチジンキナーゼと称するポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを提供することも
本発明の目的である。本発明の特に好ましい具体例にお
いて、ポリヌクレオチドは完全長遺伝子またはその変種
を含む表1（配列番号１）に示される配列を含むヒスチ
ジンキナーゼポリペプチドをコードする領域を含む。本
発明の別の特に好ましい具体例には、表1（配列番号
２）のアミノ酸配列またはその変種を含むストレプトコ
ッカス・ニューモニアエ由来の新規なヒスチジンキナー
ゼタンパク質がある。

【０００８】本発明の別の態様によれば、寄託株中に含
まれるストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９
９３株より発現可能な成熟ポリペプチドをコードする単
離された核酸分子が提供される。本発明のさらなる態様
として、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含む、ヒ
スチジンキナーゼ、特にストレプトコッカス・ニューモ
ニアエのヒスチジンキナーゼをコードする単離された核
酸分子が提供される。さらに本発明の具体例には、生物
学的に、診断的に、予防的に、臨床的にまたは治療的に
有用なそれらの変種、および、それらを含む組成物が含
まれる。本発明の他の態様によれば、本発明のポリヌク
レオチドの治療的または予防的目的、特に、遺伝学的免
疫化における使用が提供される。本発明の特に好ましい
具体例には、ヒスチジンキナーゼの自然に生じる対立遺
伝子変種およびそれによりコードされるポリペプチドが
ある。本発明の別の態様として、本明細書においてヒス
チジンキナーゼと称されるストレプトコッカス・ニュー
モニアエの新規ポリペプチド、ならびに、生物学的に、
診断的に、予防的に、臨床的にまたは治療的に有用なそ
れらの変種および同じ物を含む組成物が提供される。

【０００９】本発明の特に好ましい具体例には、ヒスチ
ジンキナーゼ遺伝子の自然に生じる対立遺伝子によりコ
ードされるヒスチジンキナーゼポリペプチドの変種があ
る。本発明の好ましい具体例において、上述したヒスチ
ジンキナーゼポリペプチドを製造する方法が提供され
る。本発明のさらに別の態様によれば、たとえば抗生物
質を含む抗細菌剤として有用な該ポリペプチドに対する
阻害剤が提供される。本発明の特定の好ましい具体例に
よれば、ヒスチジンキナーゼの発現の評価、たとえば、
中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿
胸および心内膜炎、特に例えば脳脊髄液の感染のごとき
髄膜炎などの疾患の治療、遺伝的変化のアッセイ、およ
び、細菌、特にストレプトコッカス・ニューモニアエ細
菌に対する免疫学的応答を引き起こすための生物へのヒ
スチジンキナーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチド
の投与のための製造物、組成物および方法が提供され
る。

【００１０】本発明のこの態様および他の態様の特定の
好ましい具体例によれば、ヒスチジンキナーゼポリヌク
レオチド配列と特にストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするポリヌクレオチドが提供される。本発明の
特定の好ましい具体例によれば、ヒスチジンキナーゼポ
リペプチドに対する抗体が提供される。本発明の他の具
体例において、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドと結合しまたはさもなければ相互作用し、その活
性を阻害または活性化する化合物を同定する方法であっ
て：本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドとス
クリーニングすべき化合物とを、化合物およびポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドの結合またはそれらの間の
相互作用を可能とする条件下で接触させ、化合物との結
合または相互作用を評価し（該結合または相互作用は、
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと化合物の結合ま
たは相互作用に応答する検出可能なシグナルを提供でき
る二番目の成分と関連している）：化合物とポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチドとの結合または相互作用によ
り生じるシグナルの存在または非存在を検出することに
より、化合物がポリペプチドまたはポリヌクレオチドと
結合しまたはさもなければ相互作用し、その活性を活性
化するかもしくは阻害するかどうかを調べることを含む
方法を提供する。

【００１１】本発明のさらに別の態様によれば、好まし
くは、静菌性または殺菌性のアゴニストおよびアンタゴ
ニストである、ヒスチジンキナーゼアゴニストおよびア
ンタゴニストが提供される。本発明のさらなる態様によ
れば、細胞または多細胞生物に投与するための、ヒスチ
ジンキナーゼポリヌクレオチドまたはヒスチジンキナー
ゼポリペプチドを含む組成物が提供される。以下の記載
を読むことおよび本発明の開示の他の部分を読むことに
より、開示される発明の精神および範囲内の様々な変更
および修飾が当業者に明らかとなるであろう。

【００１２】

【発明の詳説】

定義以下の説明は、本明細書において汎用される特定の用語
の理解を容易にするために示すものである。「宿主細
胞」は外来ポリヌクレオチド配列によりトランスフォー
メーションまたはトランスフェクションされた細胞であ
るか、またはトランスフォーメーションまたはトランス
フェクションすることのできる細胞である。

【００１３】「同一性」は、当該分野で公知であり、配
列の比較で調べられるような、２またはそれ以上のポリ
ペプチド配列あるいは２またはそれ以上のポリヌクレオ
チド配列の間の関係である。また、当該分野では、「同
一性」は、場合によっては、配列の鎖間の対合によって
調べられるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ド配列間の配列の関連性の度合を意味する。「同一性」
および「類似性」は、これに限定されるものではない
が、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., e
d., Oxford University Press, New York, 1988; Bioco
mputing: Informatics and Genome Projects, Smith,
D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Compute
r Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.
M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jer
sey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology,
von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequenc
e Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J.,
eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carill
o, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:
1073 (1988）に記載されるような公知の方法により容易
に算出することができる。同一性を調べる好ましい方法
は、試験される配列間の最大の対合を与えるように設計
される。同一性および類似性を決定するための方法は公
的に利用できるコンピュータープログラムに集成されて
いる。二つの配列間の同一性および類似性を調べるため
の好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプロ
グラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Res
earch 12（1）：387（1984））、BLASTP、BLASTNおよび
FASTA（Atschul, S. F.ら、J. Molec. Biol. 215：403
（1990））を包含するが、これらに限定されるものでは
ない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他
の供給源から公的に利用可能である（BLAST Manual,Alt
schul, S.ら、NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Alts
chul, S.ら、J. Mol.Biol., 215:403-410(1990))。一例
として、配列番号１の対照ヌクレオチド配列に対して少
なくとも、例えば９５％の「同一性」を有するヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチドは、そのポリヌクレ
オチド配列が配列番号１の対照ヌクレオチド配列のヌク
レオチド各１００個当たり５個までの点突然変異を含ん
でいてもよいことを除き、ポリヌクレオチドのヌクレオ
チド配列が対照配列と同一であることを意図とする。言
い換えれば、対照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％
同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
を得るためには、その対照配列におけるヌクレオチドの
５％までが欠失または別のヌクレオチドで置換されてい
てもよく、または対照配列における全ヌクレオチドの５
％までの数のヌクレオチドが対照配列中に挿入されてい
てもよい。対照配列のこれらの変異は、対照ヌクレオチ
ド配列の５’または３’末端位置で、またはそれら末端
位置の間のどこで起こってもよく、対照配列中のヌクレ
オチド間に個々に、または対照配列内の一またはそれ以
上の隣接する基において点在してもよい。同様に、配列
番号２の対照アミノ酸配列に対して少なくとも、例えば
９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプ
チドは、そのポリペプチド配列が配列番号２の対照アミ
ノ酸のアミノ酸各１００個当たり５個までのアミノ酸変
異を含んでいてもよいことを除き、そのポリペプチドの
アミノ酸配列が、対照配列と同一であることを意図とす
る。言い換えれば、対照アミノ酸配列に対して少なくと
も９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を得るためには、その対照配列におけるアミノ酸残基の
５％までが欠失または別のアミノ酸で置換されていても
よく、または対照配列における全アミノ酸残基の５％ま
での数のアミノ酸が対照配列中に挿入されていてもよ
い。対照配列のこれらの変化は対照アミノ酸配列のアミ
ノまたはカルボキシ末端位置で、またはそれら末端位置
の間のどこで起こってもよく、対照配列中の残基間に個
々に、または対照配列内の一またはそれ以上の隣接する
基において点在してもよい。

【００１４】「単離された」とは、「ヒトの手によ
り」、その天然の状態から変えられること、すなわち、
天然物の場合、その本来的な環境から変化または除去あ
るいは両方されたことを意味する。例えば、生体に天然
に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単
離された」ものではないが、その天然状態で共存する物
質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドは、本明細書で用いる用語としての「単離された」
ものである。

【００１５】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボ
ヌクレオチドのいずれをもいい、それらは非修飾ＲＮＡ
またはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであっ
てもよい。「ポリヌクレオチド」は、単鎖および二本鎖
ＤＮＡ、単鎖および二本鎖領域または単鎖、二本鎖およ
び三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単鎖および二本鎖
ＲＮＡ、単鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、
および単鎖またはより典型的には二本鎖または三本鎖領
域または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよ
いＤＮＡおよびＲＮＡを含有してなるハイブリッド分子
を包含するが、これに限定されない。加えて、本明細書
にて用いる「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮ
Ａ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる三本鎖
領域をいう。これらの領域の鎖は同じ分子からのもので
も、異なる分子からのものでもよい。該領域は、これら
分子の一またはそれ以上の全てを含んでもよいが、より
典型的には、分子の幾つかの領域のみを含む。三本ヘリ
ックス領域の分子の一つは、しばしば、オリゴヌクレオ
チドである。本明細書にて用いる場合、「ポリヌクレオ
チド（複数でも可）」なる用語は、一つまたはそれ以上
の修飾された塩基を含有する上記ＤＮＡまたはＲＮＡを
包含する。すなわち、安定性または他の理由で修飾され
た骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも該用語が本明細書
で意図するところの「ポリヌクレオチド（複数でも
可）」である。さらに、イノシンなどの通常でない塩
基、またはトリチル化された塩基などの修飾塩基を含む
ＤＮＡまたはＲＮＡ（２つの例だけを示す）も、その用
語を本明細書で用いる場合のポリヌクレオチドである。
多種の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされており、当業
者に公知のように多くの有用な目的に使用されている。
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」なる語は、ポリ
ヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的
に修飾された形態、ならびにウイルスおよび、例えば、
単純型細胞および複雑型細胞などの細胞に特徴的なＤＮ
ＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレ
オチド（複数でも可）」はしばしばオリゴヌクレオチド
（複数でも可）と称される比較的短いポリヌクレオチド
も包含する。

【００１６】「ポリペプチド（複数でも可）」は、ペプ
チド結合または修飾ペプチド結合で互いに結合した２つ
またはそれ以上のアミノ酸を含有してなるいずれのペプ
チドまたはタンパク質をもいう。「ポリペプチド（複数
でも可）」は、通常、ペプチド、オリゴペプチドまたは
オリゴマーと称される短い鎖、および一般にタンパク質
と称される長い鎖の両方をいう。ポリペプチドは、遺伝
子コードされている２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を
含有してもよい。「ポリペプチド（複数でも可）」は、
プロセッシングおよび他の翻訳後の修飾のごとき自然の
工程、または当該分野において周知の化学修飾技法のい
ずれかによって修飾されたものを包含する。かかる修飾
は、基本テキストにて、およびより詳細な研究論文に
て、ならびに膨大な研究文献にて詳しく記載されてお
り、それらは当業者に周知である。同じ型の修飾が、所
定のポリペプチド中、いくつかの部位で、同じまたは異
なる程度にて存在してもよいことは明らかであろう。ま
た、所定のペプチドは多くの型の修飾を有していてもよ
い。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまた
はカルボキシル末端を含め、ポリペプチドのどこででも
起こりうる。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−
リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分
の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の
共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチ
ジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスル
フィド結合形成、脱メチル化、共有交差結合の形成、シ
ステインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル
化、ガンマーカルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカ
ー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリス
トイル化、酸化、蛋白分解的プロセッシング、リン酸
化、プレニル化、ラセミ化、糖鎖形成、リピド付加、硫
酸化、グルタミン酸残基のガンマーカルボキシル化、ヒ
ドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレノイル
化、硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介の蛋白
質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化を包含する。
例えば、PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERT
IES, 2nd Ed., T. E.Creighton, W. H. Freeman and Co
mpany, New York (1993) および Wold, F., Posttransl
ational Protein Modifications: Perspectives and Pr
ospects, pgs.1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MO
DIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academ
ic Press, New York (1983); Seifter ら、Meth. Enzym
ol. 182:626-646 (1990) およびRattan ら、Protein Sy
nthesis: Posttranslational Modifications and Agin
g, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992)を参照の
こと。ポリペプチドは、分枝してもよく、分枝と共にま
たはなしで環状であってもよい。環状、分枝化および分
枝化環状ポリペプチドは、翻訳後の天然の工程の結果で
あり、同様に全く合成的な方法で合成できる。

【００１７】本明細書中で使用される「変種」なる語
は、各々、対照標準のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドと異なるが、本質的な特性を保持しているポリヌク
レオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチド
の典型的な変種は、別の対照標準のポリヌクレオチドと
ヌクレオチド配列において異なっている。変種のヌクレ
オチド配列における変化は、対照標準のポリヌクレオチ
ドによってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を
変化させてもよいしさせなくてもよい。ヌクレオチドの
変化は、後記するように、対照標準の配列によってコー
ドされたポリペプチドにおいて、アミノ酸置換、付加、
欠失、融合および末端切断をもたらしうる。ポリペプチ
ドの典型的な変種は、別の対照標準のポリペプチドとは
アミノ酸配列において異なっている。一般に、差異は、
対照標準のポリペプチドとその変種の配列が全体的に非
常に類似しており、多くの領域においては同一であるよ
うに限定される。変種および対照標準のポリペプチド
は、一またはそれ以上の置換、付加、欠失のいずれかの
組み合わせによって、アミノ酸配列において異なっても
よい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コー
ドによってコードされたものであってもなくてもよい。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は、対立遺
伝子変種のような自然に起こるものであってもよく、ま
たは自然に起こることが知られていない変種であっても
よい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの自然に起
こらない変種は、変異誘発法または直接合成あるいは当
業者に公知の他の組換え法によって作られてもよい。

【００１８】本発明は、以下にさらに詳しく記載するよ
うな新規なヒスチジンキナーゼポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドに関する。詳細には、本発明は、バシラス
・サチリス由来のＰｈｏＲポリペプチドにアミノ酸配列
の相同性により関連する、ストレプトコッカス・ニュー
モニアエの新規なヒスチジンキナーゼのポリペプチドお
よびポリヌクレオチドに関する。Swissprot Database A
ccession No. P23545参照。本発明は、本質的に、それ
ぞれ表１（配列番号１）および表１（配列番号２）に示
されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するヒスチ
ジンキナーゼ、および寄託株中のＤＮＡのヒスチジンキ
ナーゼヌクレオチド配列およびそれによりコードされる
アミノ酸配列に関する。

【００１９】表１ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列（Ａ）ストレプトコッカス・ニューモニアエのヒスチジンキナーゼポリヌクレオチド配列由来の配列（配列番号１） 5'- 1 AGATAGAGAA ACCGAGAGGA CAAACATGAA ACTAAAAAGT TATATTTTGG 51 TTGGATATAT TATTTCAACC CTCTTAACCA TTTTGGTTGT TTTTTGGGCT 101 GTTCAAAAAA TGCTGATTGC GAAAGGCGAG ATTTACTTTT TGCTTGGGAT 151 GACCATCGTT GCCAGCCTTG TCGGTGCTGG GATTAGTCTC TTTCTCCTAT 201 TGCCAGTCTT TACGTCGTTG GGCAAACTCA AGGAGCATGC CAAGCGGGTA 251 GCGGCCAAGG ATTTTCCTTC AAATTTGGAG GTTCAAGGTC CTGTAGAATT 301 TCAGCAATTA GGGCAAACTT TTAATGAGAT GTCCCATGAT TTGCAGGTAA 351 GCTTTGATTC CTTGGAAGAA AGCGAACGAG AAAAGGGCTT GATGATTGCC 401 CAGTTGTCGC ATGATATTAA GACCCCTATC ACTTCGATCC AAGCGACGGT 451 AGAAGGGATT TTGGATGGGA TTATCAAGGA GTCGGAGCAA GCTCATTATC 501 TAGCAACCAT TGGACGCCAG ACGGAGAGGC TCAATAAACT GGTTGAGGAG 551 TTGAATTTTT TGACCCTAAA CACAGCTAGA AATCAGGTGG AAACTACCAG 601 TAAAGACAGT ATTTTTCTGG ACAAGCTCTT AATTGAGTGC ATGAGTGAAT 651 TTCAGTTTTT GATTGAGCAG GAGAGAAGAG ATGTCCACTT GCAGGTAATC 701 CCAGAGTCTG CCCGGATTGA GGGAGATTAT GCTAAGCTTT CTCGTATCTT 751 GGTGAATCTG GTCGATAACG CTTTTAAATA TTCTGCTCCA GGAACCAAGC 801 TGGAAGTGGT GACTAAGCTG GAGAAGGGCC AGCTTTCAAT CAGTGTGACC 851 GATGAAGGGC AGGGCATTGC CCCAGAGGAT TTGGAAAATA TTTTCAAACG 901 CCTTTATCGT GTCGAAACTT CGCGTAACAT GAAGACAGGT GGTCATGGAT 951 TAGGACTTGC GATTGCGCGT GAATTGGCCC ATCAATTGGG TGGGGAAATC 1001 ACAGTCAGCA GCCAGTACGG TCTAGGAAGT ACCTTTACCC TCGTTCTCAA 1051 TCTCTCTGGT AGTGAAAATA AAGCCTAAAA CCCCTTTACA AATCCAG -3'

【００２０】（Ｂ）この表におけるポリヌクレオチド配列から推定されるヒスチジンキナーゼポリペプチド配列（配列番号２） NH₂- 1 MKLKSYILVG YIISTLLTIL VVFWAVQKML IAKGEIYFLL GMTIVASLVG 51 AGISLFLLLP VFTSLGKLKE HAKRVAAKDF PSNLEVQGPV EFQQLGQTFN 101 EMSHDLQVSF DSLEESEREK GLMIAQLSHD IKTPITSIQA TVEGILDGII 151 KESEQAHYLA TIGRQTERLN KLVEELNFLT LNTARNQVET TSKDSIFLDK 201 LLIECMSEFQ FLIEQERRDV HLQVIPESAR IEGDYAKLSR ILVNLVDNAF 251 KYSAPGTKLE VVTKLEKGQL SISVTDEGQG IAPEDLENIF KRLYRVETSR 301 NMKTGGHGLG LAIARELAHQ LGGEITVSSQ YGLGSTFTLV LNLSGSENKA-COOH

【００２１】（Ｃ）ポリヌクレオチド配列の具体化（配列番号１） X-(R1)n-1 AGATAGAGAA ACCGAGAGGA CAAACATGAA ACTAAAAAGT TATATTTTGG 51 TTGGATATAT TATTTCAACC CTCTTAACCA TTTTGGTTGT TTTTTGGGCT 101 GTTCAAAAAA TGCTGATTGC GAAAGGCGAG ATTTACTTTT TGCTTGGGAT 151 GACCATCGTT GCCAGCCTTG TCGGTGCTGG GATTAGTCTC TTTCTCCTAT 201 TGCCAGTCTT TACGTCGTTG GGCAAACTCA AGGAGCATGC CAAGCGGGTA 251 GCGGCCAAGG ATTTTCCTTC AAATTTGGAG GTTCAAGGTC CTGTAGAATT 301 TCAGCAATTA GGGCAAACTT TTAATGAGAT GTCCCATGAT TTGCAGGTAA 351 GCTTTGATTC CTTGGAAGAA AGCGAACGAG AAAAGGGCTT GATGATTGCC 401 CAGTTGTCGC ATGATATTAA GACCCCTATC ACTTCGATCC AAGCGACGGT 451 AGAAGGGATT TTGGATGGGA TTATCAAGGA GTCGGAGCAA GCTCATTATC 501 TAGCAACCAT TGGACGCCAG ACGGAGAGGC TCAATAAACT GGTTGAGGAG 551 TTGAATTTTT TGACCCTAAA CACAGCTAGA AATCAGGTGG AAACTACCAG 601 TAAAGACAGT ATTTTTCTGG ACAAGCTCTT AATTGAGTGC ATGAGTGAAT 651 TTCAGTTTTT GATTGAGCAG GAGAGAAGAG ATGTCCACTT GCAGGTAATC 701 CCAGAGTCTG CCCGGATTGA GGGAGATTAT GCTAAGCTTT CTCGTATCTT 751 GGTGAATCTG GTCGATAACG CTTTTAAATA TTCTGCTCCA GGAACCAAGC 801 TGGAAGTGGT GACTAAGCTG GAGAAGGGCC AGCTTTCAAT CAGTGTGACC 851 GATGAAGGGC AGGGCATTGC CCCAGAGGAT TTGGAAAATA TTTTCAAACG 901 CCTTTATCGT GTCGAAACTT CGCGTAACAT GAAGACAGGT GGTCATGGAT 951 TAGGACTTGC GATTGCGCGT GAATTGGCCC ATCAATTGGG TGGGGAAATC 1001 ACAGTCAGCA GCCAGTACGG TCTAGGAAGT ACCTTTACCC TCGTTCTCAA 1051 TCTCTCTGGT AGTGAAAATA AAGCCTAAAA CCCCTTTACA AATCCAG -(R2)n-Y

【００２２】（Ｄ）ポリペプチド配列の具体化（配列番号２） X-(R1)n-1 MKLKSYILVG YIISTLLTIL VVFWAVQKML IAKGEIYFLL GMTIVASLVG 51 AGISLFLLLP VFTSLGKLKE HAKRVAAKDF PSNLEVQGPV EFQQLGQTFN 101 EMSHDLQVSF DSLEESEREK GLMIAQLSHD IKTPITSIQA TVEGILDGII 151 KESEQAHYLA TIGRQTERLN KLVEELNFLT LNTARNQVET TSKDSIFLDK 201 LLIECMSEFQ FLIEQERRDV HLQVIPESAR IEGDYAKLSR ILVNLVDNAF 251 KYSAPGTKLE VVTKLEKGQL SISVTDEGQG IAPEDLENIF KRLYRVETSR 301 NMKTGGHGLG LAIARELAHQ LGGEITVSSQ YGLGSTFTLV LNLSGSENKA- (R2)n-Y

【００２３】寄託材料ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３株
を含む寄託株を、１９９６年４月１１日に、National C
ollections of Industrial and Marine Bacteria Ltd.
（本明細書にて「ＮＣＩＭＢ」という）、23 St. Macha
r Drive, Aberdeen, AB2 1RY Aberdeen, Scotlandに、
受託番号４０７９４として寄託した。寄託上、寄託株を
ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３と
称する。同様に１９９６年４月１７日にイー・コリ中の
ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３Ｄ
ＮＡライブラリをＮＣＩＭＢに寄託し、受託番号は４０
８００とされた。寄託上、ストレプトコッカス・ニュー
モニアエ０１００９９３である。そのストレプトコッカ
ス・ニューモニアエ寄託株を、本明細書中、「寄託株」
または「寄託株のＤＮＡ」と称する。

【００２４】寄託材料は完全長ヒスチジンキナーゼ遺伝
子を含有する。寄託株に含まれるポリヌクレオチドの配
列ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列は、本明細書における配列の記載とのいずれの
不一致に対しても支配的である。寄託は、特許手続きの
目的で微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条約の
条件下で行われている。特許が発行されると何ら制限ま
たは条件もなく、最終的に株は分譲される。寄託株は当
業者の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１
１２条のもとに要求されるような、寄託が実施可能要件
であることを承認するものではない。寄託材料を製造、
使用または販売するには、ライセンスが必要であるが、
そのようなライセンスはここで付与されるものではな
い。

【００２５】ポリペプチド本発明のポリペプチドは、表１（配列番号２）のポリペ
プチド（とりわけ成熟ポリペプチド）ならびに、特に、
ヒスチジンキナーゼの生物活性を有し、表1（配列番号
２）のポリペプチドまたはその該当部分と少なくとも７
０％の同一性、好ましくは表1（配列番号２）のポリペ
プチドに対して少なくとも８０％の同一性、より好まし
くは表1（配列番号２）のポリペプチドに対して少なく
とも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％
の同一性）、さらにより好ましくは表1（配列番号２）
のポリペプチドに対して少なくとも９５％の類似性（さ
らにより好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有す
るポリペプチドおよびフラグメントを包含し、さらに、
一般に、少なくとも３０個のアミノ酸、より好ましく
は、少なくとも５０個のアミノ酸を含むポリペプチドの
部分を有するかかるポリペプチドの部分も包含する。

【００２６】本発明はまた、表1（Ｄ）に示される式
（式中、アミノ末端においてＸは水素、およびカルボキ
シ末端においてＹは水素または金属、Ｒ₁およびＲ₂はア
ミノ酸残基、およびｎは１および１０００の間の整数で
ある）のポリペプチドを包含する。Ｒ基によって示され
るアミノ酸残基の伸長は、Ｒが１より大きいとき、ヘテ
ロポリマーまたはホモポリマーであってもよく、好まし
くはヘテロポリマーである。

【００２７】フラグメントは、その全体が、上記したポ
リペプチドのアミノ酸配列の全部ではないが、一部と同
じであるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドであ
る。ヒスチジンキナーゼポリペプチドと同様、フラグメ
ントは「独立している」であるか、またはそれらが一の
部分または領域、最も好ましくは単一の連続した領域、
単一のより大きなポリペプチドを形成するより大きなポ
リペプチドの中に含まれていてもよい。

【００２８】好ましいフラグメントは、例えば、アミノ
末端を含む連続した一連の残基またはカルボキシル末端
を含む連続した一連の残基の欠失あるいはアミノ末端を
含む残基とカルボキシル末端を含む残基の２つの連続し
た一連の残基の欠失を除く、表1（配列番号２）のアミ
ノ酸配列またはその変種の一部を有する切断ポリペプチ
ドを包含する。宿主細胞、特に、ストレプトコッカス・
ニューモニアエ中の本発明のポリペプチドの分解型も好
ましい。アルファヘリックスおよびアルファヘリックス
形成領域、ベータシートおよびベータシート形成領域、
ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成
領域、親水領域、疎水領域、アルファ両親媒性領域、ベ
ータ両親媒性領域、可変領域、界面形成領域、基質結合
領域、および高抗原指数領域を含んでなるフラグメント
のような、構造的または機能的属性によって特徴づけら
れるフラグメントもまた好ましいフラグメントである。

【００２９】類似活性または改良活性を有するもの、ま
たは望ましくない活性が減少したフラグメントを含め、
ヒスチジンキナーゼの活性を媒介するフラグメントであ
る生物学的に活性なフラグメントも好ましいフラグメン
トである。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性また
は免疫原性であるフラグメントも含まれる。特に好まし
いフラグメントは、ストレプトコッカス・ニューモニア
エの生存に必須な機能、または、個体、特にヒトにおい
て原因となる疾患を開始しまたは維持する能力を提供す
る酵素のレセプターまたはドメインを含むものである。
本発明のポリペプチドのフラグメントである変種は、ペ
プチド合成による関連する完全長ポリペプチドの製造に
適用できる：それゆえ、これらの変種は本発明の完全長
ポリペプチドを製造するための中間体として適用でき
る。

【００３０】ポリヌクレオチド本発明の別の態様は、表１（配列番号２）の推定アミノ
酸配列を有するヒスチジンキナーゼポリペプチドをコー
ドする完全長遺伝子を含む単離ポリヌクレオチド、それ
に密接に関連するポリヌクレオチドおよびそれらの変種
に関する。表１（配列番号１）に示すポリヌクレオチド
配列のような本明細書の情報を使用し、出発材料として
ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３細
胞を用いる細菌由来の染色体ＤＮＡフラグメントをクロ
ーニングし、配列決定し、つづいて完全長クローンを得
るような、標準的クローニングおよびスクリーニング方
法を使用して、ヒスチジンキナーゼポリペプチドをコー
ドする本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。
例えば、表１（配列番号１）に示す配列のような本発明
のポリヌクレオチド配列を得るには、典型的には、イー
・コリまたは他の適当な宿主中のストレプトコッカス・
ニューモニアエ０１００９９３の染色体ＤＮＡのクロー
ンのライブラリーを、部分配列から由来する放射標識し
たオリゴヌクレオチド、好ましくは１７倍量以上の長さ
のオリゴヌクレオチドでプローブする。ついで、該プロ
ーブと同じＤＮＡを有するクローンをストリンジェント
な条件を使用して区別できる。該オリジナル配列から設
計された配列決定プライマーで同定された個々のクロー
ンを配列決定することにより、該配列を両方の方向に伸
長し、完全長を決定することが可能である。都合よく
は、プラスミド・クローンから調製された変性二本鎖Ｄ
ＮＡを用いてかかる配列決定を行う。適当な技法は、Ma
niatis,T.，Fritsch,E.F.およびSambrookら、MOLECULAR
CLONING：ALABORATORY MANUAL，2nd Ed.；Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Hａｒbor, Ne
w York（1989）（特に、Screening By Hybridization
1.90および Sequencing Denatured Double-stranded DN
A Templates 13.70 を参照のこと）により記載されてい
る。例えば、表１（配列番号１）に示すポリヌクレオチ
ドは、ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９
９３に由来するＤＮＡライブラリー中で見いだしたもの
である。

【００３１】表１（配列番号１）に示すＤＮＡ配列は、
表１（配列番号２）に示すのとほぼ同数のアミノ酸残基
を有し、当該分野にて周知のアミノ酸残基の分子量を用
いて計算できる推定分子量を有するタンパク質をコード
するオープンリーディングフレームを有する。配列番号
１、ヌクレオチド番号２６から１０７５の間のポリヌク
レオチドは、配列番号２のポリペプチドをコードする。
終止コドンは、配列番号１のヌクレオチド番号１０７６
において始まる。

【００３２】本発明のヒスチジンキナーゼは、構造的
に、寄託株のヒスチジンキナーゼをコードするＤＮＡを
配列決定した結果に示されるように、ヒスチジンキナー
ゼファミリーの他のタンパク質に関連付けられる。その
タンパク質は、公知タンパク質の中でも、バシラス・サ
チリス由来のＰｈｏＲタンパク質に対して最大の相同性
を示す。表１（配列番号２）のヒスチジンキナーゼは、
バシラス・サチリス由来のＰｈｏＲポリペプチドのアミ
ノ酸配列とその全長にわたり約３２％の同一性およびそ
の全長にわたり約５１％の類似性を有する。

【００３３】本発明の配列はまた、表１（配列番号１）
のコーディング配列と、その全長にわたり同一であるポ
リヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は、成熟
ポリペプチドまたはそのフラグメント用のコーディング
配列自体ならびにリーダーまたは分泌配列、プレ、プロ
またはプレプロタンパク質配列をコードするコーディン
グ配列のような他のコーディング配列を有するリーディ
ング・フレーム中の成熟ポリペプチドまたはフラグメン
トのコーディング配列を提供する。ポリヌクレオチドは
また、例えば、転写配列、非翻訳配列、終止シグナル、
リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配列、イン
トロン、ポリアデニル化シグナルおよび別のアミノ酸を
コードする付加コード配列のような非コーディング５’
および３’配列を含む、非コーディング配列を含むが、
これに限定するものではない。例えば、融合ポリペプチ
ドの精製を促進するマーカー配列をコードすることがで
きる。本発明のある種の具体例において、マーカー配列
は、ｐＱＥベクター（Qiagen,Inc.）に入れて提供さ
れ、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1989）86：821
-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチド
であるか、またはＨＡタグである（Wilsoｎら，Cell，3
7:767(1984)）。本発明のポリヌクレオチドは、限定す
るものではないが、構造遺伝子および遺伝子の発現を調
節する本来的に結合している配列からなるポリヌクレオ
チドを包含する。

【００３４】本発明の好ましい具体例は、ヒスチジンキ
ナーゼポリペプチドをコードする表１の配列番号１に示
されるヌクレオチド２６ないし１０７５を含むポリヌク
レオチドである。本発明はまた、表１（Ｃ）に示される
式のポリヌクレオチド（式中、分子の５’末端において
Ｘは水素、および分子の３’末端においてＹが水素また
は金属、Ｒ₁およびＲ₂がいずれかの核酸残基、ｎが１お
よび１０００の間の整数を意味する）を含む。Ｒ基によ
って示されるアミノ酸残基の伸長は、Ｒが１より大きい
とき、ヘテロポリマーまたはホモポリマーであってもよ
く、好ましくはヘテロポリマーである。

【００３５】本明細書で使用する「ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド」なる用語は、本発明のポリペ
プチド、詳細には、細菌性ポリペプチド、より詳細に
は、表１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有す
るストレプトコッカス・ニューモニアエのヒスチジンキ
ナーゼのポリペプチドをコードする配列を含むポリヌク
レオチドを包含する。この用語はコードおよび／非コー
ド配列を含んでもよいさらなる領域と共に、該ポリペプ
チドをコードする単一の連続領域または非連続領域（例
えば、組み込まれたファージまたは挿入された配列また
はエデティング（editing）により中断されている）を
含むポリヌクレオチドを包含する。

【００３６】本発明はさらに、表１（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種をコードす
る、本明細書にて記載したポリヌクレオチドの変種に関
する。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントである
変種は、本発明の完全長ポリヌクレオチドを合成するの
に用いることもできる。さらに好ましい具体例は、数
個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２または１
個あるいは０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わ
せで置換、欠失または付加された表１（配列番号２）の
ヒスチジンキナーゼポリペプチドのアミノ酸配列を有す
る、ヒスチジンキナーゼ変種をコードするポリヌクレオ
チドである。これらのうち特に好ましくは、ヒスチジン
キナーゼの特性および活性を変化させないサイレント置
換、付加および欠失である。

【００３７】本発明のさらに好ましい具体例は、表１
（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有するヒスチジン
キナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに
対し完全長にわたって少なくとも７０％の同一性を有す
るポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオチド
に相補性のポリヌクレオチドである。また、最も好まし
いものは、寄託株のヒスチジンキナーゼポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに対し完全長にわたって少
なくとも８０％の同一性を有する領域を含むポリヌクレ
オチドおよびそれと相補性のポリヌクレオチドである。
この点で、その同じものと完全長にわたって少なくとも
９０％の同一性を有するポリヌクレオチドが特に好まし
く、中でも少なくとも９５％の同一性を有するものが特
に好ましい。さらには、少なくとも９５％の同一性を有
するものの中で少なくとも９７％の同一性を有するもの
がより好ましく、中でも少なくとも９８％および少なく
とも９９％の同一性を有するものが特に好ましく、少な
くとも９９％の同一性を有するものがより好ましい。好
ましい具体例は、表１（配列番号１）のＤＮＡによって
コードされている成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物
学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドである。

【００３８】さらに本発明は、本明細書にて上記した配
列にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関
する。この点において、本発明は特に、本明細書にて上
記したポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下で
ハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書で用いる場合、「ストリンジェントな条
件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件」という語は、ハイブリダイゼーションが、配列
間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の
同一性がある場合にのみ起こることを意味する。ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例とし
て、５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ
ＮaＣl、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ
リン酸ナトリウム（pＨ７.６）、５ｘデンハート（Denh
ardt’s）溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μ
ｇ／ｍｌ変性切断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中、
４２℃で一晩インキュベーションし、ついでそのフィル
ターを０.１ｘＳＳＣ（約６５℃）で洗浄することが挙
げられる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は公
知であり、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.
Y., (1989)、特に、第11章に例示されている。

【００３９】本発明は、実質的に、配列番号１に示した
ポリヌクレオチド配列の完全遺伝子を含む適当なライブ
ラリーを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下、配列番号１に示す該ポリヌクレオチド配列の配
列を有するプローブまたはそのフラグメントでスクリー
ニングし、該ＤＮＡ配列を単離することにより得ること
ができるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
を提供する。そのようなポリヌクレオチドを得るのに有
用なフラグメントには、例えば、本明細書に記載するプ
ローブおよびプライマーが包含される。

【００４０】本明細書において本発明のポリヌクレオチ
ドのアッセイについてさらに説明するように、例えば、
上記したような本発明のポリヌクレオチドを、ＲＮＡ、
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼー
ションプローブとして使用し、ヒスチジンキナーゼをコ
ードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離
し、ヒスチジンキナーゼ遺伝子に対して高い配列類似性
を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを
単離することができる。そのようなプローブは、一般
に、少なくとも１５塩基を含むであろう。好ましくは、
そのようなプローブは少なくとも３０塩基を有し、少な
くとも５０塩基を有してもよい。特に好ましいプローブ
は、少なくとも３０塩基を有し、５０以下の塩基を有す
る。例えば、ヒスチジンキナーゼ遺伝子のコーディング
領域は、表１に提供されるＤＮＡ配列を使用してスクリ
ーニングしてオリゴヌクレオチドプローブを合成するこ
とにより単離できる。ついで、本発明の遺伝子の配列と
相補性の配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを用
いてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラ
リーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメンバー
がプローブとハイブリダイズするか調べる。

【００４１】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、とりわけ、本明細書においてポリヌクレオチド
アッセイに関してさらに説明するように、疾患、特にヒ
トの疾患に対する治療および診断の発見のための研究試
薬および研究材料として用いることができる。配列番号
１および／または２の配列由来のオリゴヌクレオチドで
ある本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方
法に使用できるが、好ましくはＰＣＲに使用し、本明細
書で同定したポリヌクレオチドが全体として、または部
分的に感染組織中の細菌において転写されるか否か調べ
る。そのような配列はまた、病原体が達成した感染の段
階およびタイプの診断においても有用性がある。

【００４２】本発明はまた、成熟蛋白にさらなるアミノ
またはカルボキシ末端アミノ酸が加わるか、成熟ポリペ
プチドの内部にアミノ酸が加わった（例えば、成熟形態
が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）ポリペプチ
ドをコードしうるポリヌクレオチドを提供する。このよ
うな配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態へのタンパ
ク質のプロセッシングにおいて役割を果たし、タンパク
質を輸送し、タンパク質の半減期を長くしたり、短くし
たり、あるいはアッセイまたは生産のためのタンパク質
の操作を容易にすることができる。in vivoでよくある
ように、付加アミノ酸は細胞酵素により成熟タンパク質
からプロセッシングにより除かれる。一またはそれ以上
のプロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を有する
前駆体タンパク質は該ポリペプチドの不活性形でもよ
い。プロ配列がそのような不活性前駆体から除かれる
と、一般に活性化される。プロ配列の幾らかまたは全体
を、活性化の前に除去できる。一般に、そのような前駆
体はプロタンパク質と称される。

【００４３】総じて、本発明のポリヌクレオチドは成熟
タンパク質、リーダー配列の加わった成熟タンパク質
（プレタンパク質とも称される）、プレタンパク質のリ
ーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有す
る成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列と、一
般に、ポリペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセ
ッシング工程の間に除去される１またはそれ以上のプロ
配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタ
ンパク質をコードする。

【００４４】ベクター、宿主細胞、発現本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌ
クレオチドを含んでなるベクター、本発明のベクターで
遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術による本発
明のポリペプチドの製造に関する。さらに無細胞翻訳系
を用い、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用して
かかるタンパク質を製造することができる。組換え体産
生のために、宿主細胞を遺伝子操作し、発現系もしくは
それらの一部、または本発明のポリヌクレオチドを取り
込むことができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導
入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランス
ベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質
媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、
トランスダクション、スクレープ・ローディング、弾道
導入および感染のような、Davisら、BASIC METHODS IN
MOLECULＡＲ BIOLOGY（1986）およびSambrookら、MOLEC
ULＡＲ CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd Ed. Cold
Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,
N.Y.（1989）のごとき複数の標準的研究室マニュアルに
記載されている方法によって行うことができる。

【００４５】適当な宿主の代表例は、レンサ球菌（stre
ptococci）、ブドウ球菌（staphylococci）、エンテロ
コッカス（enterococci）大腸菌（E.coli）、ストレプ
トマイセス（streptomyces）および枯草菌（Bacillus s
ubtilis）細胞のごとき細菌細胞；酵母細胞およびアス
ペルギルス（Aspergillus）細胞のごとき真菌細胞；ド
ロソフィラ（Drosophila）Ｓ２およびスポドプテラ（Sp
odoptera）Ｓｆ９細胞のごとき昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯ
Ｓ、ＨeＬa、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３および
ボーウェス（Bowes）メラノーマ細胞のごとき動物細
胞；および植物細胞を包含する。

【００４６】本発明のポリペプチド産生のために非常に
多様な発現系を使用することができる。かかる系は、と
りわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、
例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因
子由来、酵母染色体因子由来、バキュロウイルス、ＳＶ
４０のごときパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、
アデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病
ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス由来の
ベクター、およびコスミドおよびファージミドなどのプ
ラスミドおよびバクテリオファージの遺伝因子由来のベ
クターのごとき、それらの組み合わせに由来するベクタ
ーを包含する。発現系構築物は、発現を制御ならびに引
き起こす調節領域を有していてもよい。一般に、宿主に
おいてポリヌクレオチドを維持、増幅または発現し、お
よび／またはポリペプチドを発現するのに適した系また
はベクターを、この点にて発現に使用してもよい。適当
なＤＮＡ配列を、例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLON
ING，A LABORATORY MANUAL（前掲）に示されている技術
のごとき、種々のよく知られた慣用的技術のいずれかに
よって、発現系に挿入してもよい。

【００４７】翻訳されたタンパク質を、小胞体内腔、周
辺腔または細胞外環境に分泌するために、適当な分泌シ
グナルを発現されるポリペプチドに挿入してもよい。こ
れらのシグナルは、ポリペプチドに固有のものであって
もよく、または異種のシグナルであってもよい。本発明
のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール
沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグ
ラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水
相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ
ーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含する、周知
の方法によって組換え細胞培養物から回収および精製で
きる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが
精製に使用される。ポリペプチドが単離および／または
精製の間に変性する場合、タンパク質を再生するための
周知の方法を用いて、活性コンホメーションを再生して
もよい。

【００４８】診断アッセイ本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のヒ
スチジンキナーゼポリヌクレオチドの使用にも関連す
る。真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるヒ
スチジンキナーゼの検出は、疾患の診断のための診断方
法を提供する。ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む生物に
感染した真核生物（本明細書において「個体」とも称す
る）、とりわけ哺乳動物、特にヒトを、種々の方法によ
り核酸レベルで検出できる。

【００４９】診断のための核酸は、感染した個体の細胞
および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚よ
り得ることができる。ゲノムＤＮＡは直接的に検出する
のに使用できるか、または分析に付す前にＰＣＲもしく
はその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅でき
る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも同じ方法にて使用できる。
増幅を用いて、個体中に存在する原核生物の種および株
を原核細胞遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけする
ことができる。対照配列の遺伝子型と比較した増幅生成
物の大きさの変化により、欠失および挿入を検出でき
る。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識したヒスチジンキ
ナーゼポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーション
することにより同定できる。完全に対合した配列は、Rn
ase消化により、または融解温度の差により、誤対合二
重らせんと区別できる。ＤＮＡ配列の差はまた、変性剤
と共にまたは無しでのゲル中のＤＮＡフラグメントの電
気泳動の移動度の変化により、または直接的なＤＮＡの
配列決定により検出できる。例えば、Myersら、Scienc
e, 230:1242（1985）を参照のこと。特異的な位置での
配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例え
ば、ＲＮaseおよびＳ１保護または化学的切断法によっ
ても明らかにすることができる。例えば、Cottonら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:4397-4401（1985）を
参照のこと。

【００５０】本発明の遺伝子の突然変異または多型性を
担持する細胞はまた、種々の技術により、ＤＮＡレベル
で、例えばセロタイピングすることにより検出できる。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出すること
ができる。ＲＴ−ＰＣＲを自動検出系、例えばＧeneＳc
an等と組み合わせて用いるのが特に好ましい。ＲＮＡま
たはｃＤＮＡもまた同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣ
Ｒに用いることができる。一例として、ヒスチジンキナ
ーゼをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用
いて突然変異を同定および分析することができる。代表
的なプライマーの例を表２に示す。

【００５１】表２ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー配列番号プライマー配列３ 5'-ATGAAACTAAAAAGTTATATTTTGG-3' ４ 5'-GGCTTTATTTTCACTACCAGAGAGA-3'

【００５２】本発明はさらに５’および／または３’末
端より１、２、３または４個のヌクレオチドが除去され
たこれらのプライマーを提供する。これらのプライマー
をとりわけ個体由来のサンプルから単離したヒスチジン
キナーゼＤＮＡを増幅するのに用いることもできる。該
プライマーを用いて、感染した個体から単離した遺伝子
を増幅してもよく、ついで、該遺伝子をＤＮＡ配列を調
べるための種々の技法に供することができる。このよう
に、ＤＮＡ配列における突然変異を検出し、これを用い
て感染を診断し、感染性物質をセロタイプまたは分類す
ることができる。

【００５３】本発明は、疾患、好ましくは細菌感染、よ
り好ましくはストレプトコッカス・ニューモニアエによ
る感染、および最も好ましくは中耳炎、結膜炎、肺炎、
菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、特に
例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎などの疾患の診断
方法であって、表１（配列番号１）の配列を有するポリ
ヌクレオチドの発現レベルの上昇を、個体由来のサンプ
ルから決定することを特徴とする方法を提供する。ヒス
チジンキナーゼポリヌクレオチドの発現の増加または低
下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野で周知
の方法である任意の方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−
ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノーザンブロッティングおよび
その他のハイブリダイゼーション法を用いて測定でき
る。

【００５４】加えて、正常対照組織サンプルと比較して
ヒスチジンキナーゼタンパク質の過剰発現を検出するた
めの本発明による診断アッセイを用いて、例えば感染の
存在を検出することができる。宿主由来のサンプル中の
ヒスチジンキナーゼタンパク質のレベルを決定するため
に用いることができるアッセイ技法は、当業者に周知で
ある。このようなアッセイ法は、ラジオイムノアッセ
イ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およ
びＥＬＩＳＡアッセイを包含する。

【００５５】抗体本発明のポリペプチドもしくはその変種、またはそれら
を発現する細胞は、このようなポリペプチドに免疫特異
的な抗体を産生する免疫原として用いることができる。
本明細書で用いる「抗体」は、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体および
ヒト化抗体、ならびにＦａｂ免疫グロブリン発現ライブ
ラリーの生成物を包含するＦａｂフラグメントを包含す
る。本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、ポリ
ペプチドまたはエピトープが付いたフラグメント、アナ
ログまたは細胞を、好ましくはヒト以外の動物に、慣用
的プロトコルを用いて投与することにより得ることがで
きる。モノクローナル抗体を調製する場合、連続的細胞
系培養により産生される抗体を提供する当業者周知の技
術を用いることができる。例えば、Kohler, G.およびMi
lstein, C.,Nature 256: 495-497（1975）；Kozborら、
Immunology Today, 4: 72（1983）；Coleら、Monoclona
l Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, In
c., pg.77-96（1985）に記載されるような種々の技法が
挙げられる。

【００５６】一本鎖抗体を製造するための技術（米国特
許第４９４６７７８号）を用いて、本発明のポリペプチ
ドに対する一本鎖抗体を産生することができる。また、
トランスジェニックマウスまたは他の生物、例えば他の
哺乳動物を用いて、ヒト化抗体を発現させることができ
る。別法として、ファージディスプレイ（phage displa
y）技法を利用して、抗−ヒスチジンキナーゼを保持す
ることについてスクリーニングしたヒト由来のリンパ球
のＰＣＲ増幅したｖ遺伝子のレパートリー由来の、また
は無処理のライブラリー由来のポリペプチドに対する結
合活性を有する抗体遺伝子を選択してもよい（McCaffer
ty, J.ら、Nature 348, 552-554（1990）；Marks, J.
ら、Biotechnology 10, 779-783(1992)）。これらの抗
体の親和性はチェインシャフリング（chain shufflin
g）により改善することもできる（Clackson,T. ら、Nat
ure 352, 624-628（1991））。二つの抗原結合ドメイン
が存在する場合、各ドメインは異なるエピトープに向け
ることができ、それを「二特異性」抗体と称する。前記
の抗体を用いてポリペプチドを発現するクローンを単離
または同定することができ、アフィニティークロマトグ
ラフィーにより該ポリペプチドを精製することができ
る。

【００５７】したがって、とりわけ、ヒスチジンキナー
ゼポリペプチドに対する抗体を用いて、感染、とりわけ
細菌感染、特に中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜
炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、特に例えば脳脊髄
液の感染のごとき髄膜炎などの疾患を治療することがで
きる。ポリペプチド変種は、本発明の特定の態様を形成
する、抗原的、エピトープ的または免疫学的に等価な変
種を包含する。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明のタンパク質またはポリペプチ
ドに対して誘起された場合、病原体および哺乳動物宿主
間での即時的な身体的相互作用を妨害する、ある種の抗
体により特異的に認識されるポリペプチドまたはその同
等物を包含する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な
誘導体」なる用語は、脊椎動物において抗体を誘起させ
るのに適した処方を用いた場合、抗体が病原体および哺
乳動物宿主間での即時的な身体的相互作用を妨害するよ
うに作用するペプチドまたはその等価物を包含する。

【００５８】抗原的、免疫学的に等価な誘導体、または
その融合タンパク質などのポリペプチドは、マウスまた
は他の動物、例えばラットもしくはニワトリを免疫する
ための抗原として使用される。融合タンパク質はポリペ
プチドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合する
ことにより、免疫原性キャリヤタンパク質、例えばウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リムペッ
ト・ヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin：ＫＬ
Ｈ）に結合させることができる。別法として、タンパク
質もしくはポリペプチド、またはその抗原的もしくは免
疫学的に等価なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗
原性ペプチドは、免疫原性を改良するのに十分な抗原性
を有しており、キャリヤを使用しなくてすむ。

【００５９】抗体またはその変種を修飾し、個体におけ
る免疫原性を減少させることが好ましい。例えば、個体
がヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒト化」さ
れており；例えばJones, P. ら、Nature 321, 522-525
（1986）またはTempestら、Biotechnology 9, 266-273
（1991）に記載されているように、ハイブリドーマ由来
の抗体の相補性決定領域がヒトモノクローナル抗体に移
植されている。本発明のポリヌクレオチドの遺伝学的免
疫における使用は、好ましくは、プラスミドＤＮＡの筋
肉への直接注射（Wolffら、Hum. Mol Genet 1:363（199
2）, Manthorpeら、Hum. Gene Ther. 4, 419（196
3））、特異的タンパク質キャリヤを複合させたＤＮＡ
の送達（Wuら、J Biol Chem. 264, 16985（1989））、
リン酸カルシウムを用いるＤＮＡ共沈（Benvenisty & R
eshef, PNAS USA, 83, 9551（1986））、種々の形態の
リポソーム中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243,
375（1989））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356, 152
（1992）, Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791（199
3））およびクローン化レトロウイルスベクターを用い
たインビボ感染（Seegerら、PNAS USA 81, 5849（198
4））などの適当な送達方法を用いる。

【００６０】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子また、本発明のポリペプチドを用いて、例
えば、細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、およ
び天然産物の混合物中の、小分子基質とリガンドとの結
合を評価することもできる。これらの基質およびリガン
ドは天然の基質およびリガンドでよく、または構造上も
しくは機能上の擬似物質でもよい。例えば、Coligan
ら、Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5
（1991）を参照のこと。

【００６１】本発明はまた、ヒスチジンキナーゼポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドの作用を活性化（アゴニ
スト）または遮断（アンタゴニスト）する化合物、特に
静菌性または殺菌性の化合物を同定するために化合物を
スクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方
法には、高処理手法が包含される。例えば、アゴニスト
またはアンタゴニストをスクリーニングするために、ヒ
スチジンキナーゼポリペプチドおよびかかるポリペプチ
ドの標識基質またはリガンドを含んでなる合成反応混合
物、膜、細胞エンベロープもしくは細胞壁のごとき細胞
コンパートメント、またはそれらのいずれかの調製物
を、ヒスチジンキナーゼアゴニストまたはアンタゴニス
トであるかもしれない候補分子の存在下または不在下で
インキュベーションする。候補分子がヒスチジンキナー
ゼポリペプチドに作動または拮抗する能力は、標識リガ
ンドの結合の低下またはかかる基質からの生成物の生成
低下に反映される。結合しても影響を及ぼさない分子、
すなわちヒスチジンキナーゼの効果を誘起しない分子
は、ほとんどの場合、良好なアンタゴニストであろう。
よく結合し、基質からの生成物の生成速度を高める分子
はアゴニストである。基質からの生成物の生成速度また
はレベルの検出はリポーターシステムを用いることによ
り増強できる。この点に関して有用なリポーターシステ
ムは、生成物に転換される比色標識基質、ヒスチジンキ
ナーゼポリヌクレオチドまたはポリペプチド活性の変化
に応答するリポーター遺伝子、および当該分野で公知の
結合アッセイを包含するが、これらに限定するものでは
ない。

【００６２】ヒスチジンキナーゼアンタゴニストのアッ
セイの別の例は、競争阻害アッセイに適した条件下で、
ヒスチジンキナーゼおよび潜在的なアンタゴニストを、
ヒスチジンキナーゼ結合分子、組換えヒスチジンキナー
ゼ結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質も
しくはリガンド擬似物質と混合する、競合アッセイであ
る。ヒスチジンキナーゼ分子を例えば放射活性または比
色化合物により標識し、結合分子に結合した、または生
成物に変換したヒスチジンキナーゼ分子の数を正確に決
定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価できる。

【００６３】潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドに結合し、それにより
その活性を阻害しまたは消滅させる小有機分子、ペプチ
ド、ポリペプチドおよび抗体を包含する。潜在的アンタ
ゴニストはまた、ヒスチジンキナーゼ誘発活性を誘導し
ない結合分子のような、結合分子の同一部位に結合し、
ヒスチジンキナーゼを結合より排除することによりヒス
チジンキナーゼの作用を妨げる、密接に関連したタンパ
ク質または抗体のような小有機分子、ペプチド、ポリペ
プチドであるかもしれない。

【００６４】潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチド
の結合部位に結合して占領し、それにより細胞性結合分
子への結合を防御して、正常な生物学的活性を防御する
小分子を包含する。小分子の例は、小有機分子、ペプチ
ド、ペプチド様分子を包含するが、これらに限定するも
のではない。その他の潜在的なアンタゴニストはアンチ
センス分子を包含する（これらの分子についての記載に
関しては、Okano, J.,Neurochem. 56:560（1991）；OLI
GODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE
EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988) を参
照のこと）。好ましい潜在的アンタゴニストは、ヒスチ
ジンキナーゼに関連する化合物およびその変種を包含す
る。

【００６５】本明細書で提供されるＤＮＡ配列は、各
々、抗細菌化合物の発見および開発に用いることができ
る。発現時に、コードされたタンパク質は、抗細菌薬物
をスクリーニングするための標的として用いることがで
きる。加えて、コードされたタンパク質もしくはShine-
Delgarnoまたは他の個々のｍＲＮＡの翻訳容易化配列の
アミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列を用いて、目的
とするコーディング配列の発現を調節するアンチセンス
配列を構築することができる。

【００６６】本発明は、本発明のポリペプチド、ポリヌ
クレオチドまたは阻害剤の使用であって、感染の続発症
に関与する、病因および哺乳動物宿主間の最初の物理的
相互作用を妨害するための使用を提供する。特に本発明
の分子を、：細菌、特にグラム陽性細菌の内在装置上の
哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質、または創傷部
の細胞外マトリックスタンパク質への付着の妨げ；例え
ば、哺乳動物性チロシンキナーゼのリン酸化の開始によ
る、ヒスチジンキナーゼタンパク質媒介の哺乳動物細胞
侵入の遮断（Rosenshineら、Infect. Immun.60: 2211(1
992))；哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質と組織
損傷を媒介する細菌性ヒスチジンキナーゼタンパク質と
の間の細菌付着の遮断；および、内在装置の埋め込みま
たはその他の手術以外により開始した感染における病因
の正常な進行の遮断に使用することができる。

【００６７】本発明は、ｉ）ヒスチジンキナーゼを応答
レギュレーターとともに薬剤の存在下でインキュベート
し、この相互作用を妨害する薬剤の能力を測定すること
を含む、ヒスチジンキナーゼと応答レギュレーターとの
相互作用を妨害する薬剤をスクリーニングするための薬
剤スクリーニング法；および／またはｉｉ）ヒスチジン
キナーゼを薬剤とともにインキュベートし、自己リン酸
化を妨害する薬剤の能力を測定することを含む、ヒスチ
ジンキナーゼの自己リン酸化能力を妨害する薬剤を同定
するための薬剤スクリーニング法を提供する。好ましく
は、応答レギュレーターは、ヒスチジンキナーゼの同種
の応答レギュレーターであるか、または、ヒスチジンキ
ナーゼが基質として用いることのできる他の応答レギュ
レーターであり、好ましくは、ストレプトコッカス・ニ
ューモニアエまたはバシラスなどの他の微生物由来であ
る。一般に、ヒスチジンキナーゼおよびその同種の応答
レギュレーターの遺伝子は、ともに染色体上の近くに見
出され、そのため、さらに染色体に沿って配列決定する
ことにより適当なヒスチジンキナーゼを容易に同定でき
る。本発明はまた、そうすることによって同定された阻
害剤に関する。本発明のアンタゴニストおよびアゴニス
トを用いて、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、
髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、特に例えば脳
脊髄液の感染のごとき髄膜炎などの疾患を阻害および治
療することができる。

【００６８】ワクチン本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物における免疫
学的応答を誘発する方法であって、抗体および／または
Ｔ細胞免疫応答を生成するのに適当なヒスチジンキナー
ゼ、またはそのフラグメントもしくは変種を個体に接種
し、該個体を感染、特に細菌感染、最も好ましくはスト
レプトコッカス・ニューモニアエ感染から防御すること
を含む方法に関する。またかかる免疫学的応答が細菌複
製を遅くする方法も提供する。本発明のさらにもう一つ
別の態様は、個体における免疫学的応答を誘発する方法
であって、in vivoでヒスチジンキナーゼまたはそのフ
ラグメントまたは変種を発現するために、該ヒスチジン
キナーゼまたはそのフラグメントまたは変種をコードす
る遺伝子をデリバリーし、例えば、サイトカイン産生Ｔ
細胞または細胞毒性Ｔ細胞を含め、抗体および／または
Ｔ細胞免疫応答を生じさせるように免疫学的応答を誘発
し、該個体にて疾患が既に確立されているか、否かにか
かわらず該個体を疾患から保護することを含む方法に関
する。遺伝子を投与する一の方法は、粒子等のコーティ
ングとして遺伝子を所望の細胞に投与することによるも
のである。このような核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、
修飾核酸またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドからなって
いてもよい。

【００６９】本発明のさらなる態様は、その中に免疫学
的応答を誘発する能力を有するか、または誘発している
宿主に導入されると、その宿主においてヒスチジンキナ
ーゼまたはそれからコードされるタンパク質に対する免
疫学的応答を誘発する免疫学的組成物であって、該ヒス
チジンキナーゼまたはそれからコードされるタンパク質
の抗原をコードし、発現するＤＮＡを含む組換えヒスチ
ジンキナーゼまたはそれからコードされるタンパク質か
らなる組成物に関する。免疫学的応答は、治療的および
予防的に使用でき、抗体免疫またはＣＴＬまたはＣＤ４
＋Ｔ細胞から生ずるような細胞性免疫から得ることがで
きる。

【００７０】ヒスチジンキナーゼまたはそのフラグメン
トは、それ自体抗体を産生しないが、第一タンパク質の
安定化ならびに免疫原性および保護特性を有するであろ
う融合タンパク質の産生能を有する補タンパク質（co−
Protein）と融合させることができる。このような融合
組換えタンパク質は、好ましくは、さらに、ヘモフィラ
ス・インフルエンザ（Hemophilus influenzae）由来の
リポプロテインＤ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）またはベータガラクトシダーゼのような
抗原性補タンパク質、タンパク質を可溶化し、その産生
および精製を容易にするような比較的大きい補タンパク
質を含む。さらに、補タンパク質は、免疫系の全身的な
刺激を与える上で、アジュバントとして作用できる。補
タンパク質は第一タンパク質のアミノまたはカルボキシ
末端のいずれかに結合してもよい。本発明は、本発明の
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび、Sato，Y.
ら，Science, 273: 352(1996) に記載されるような免疫
刺激ＤＮＡ配列を含む組成物、特にワクチン組成物およ
び方法を提供する。

【００７１】また、本発明は、ストレプトコッカス・ニ
ューモニアエ感染の動物モデルにおけるそのような遺伝
的免疫実験において使用したＤＮＡ構築物中で細菌細胞
表面タンパク質の非可変領域をコードすることが明らか
にされた記載のポリヌクレオチドまたはその特定のフラ
グメントを使用する方法も提供するもので、予防的また
は治療的免疫応答を起こさせることのできるタンパク質
エピトープの同定に特に有用である。この方法により、
動物、とりわけヒトにおける細菌感染、特にストレプト
コッカス・ニューモニアエ感染の予防剤または治療剤の
開発のために、動物の必要な器官から感染の抵抗または
除去に特に有用なモノクローナル抗体を産生させること
ができる。

【００７２】該ポリペプチドを宿主を免疫化するための
抗原として用い、例えば、損傷組織への細菌の付着を遮
断することにより、細菌の侵入を妨げる特異抗体を生じ
させることができる。組織損傷の例としては、例えば、
機械的、化学的または熱的損傷による、または内在装置
の埋め込みによる皮膚や結合組織の傷、あるいは口、乳
腺、子宮または膣のような粘膜における傷が挙げられ
る。

【００７３】本発明はまた、免疫原性組換えタンパク質
と、適当な担体を含むワクチン処方も包含する。タンパ
ク質は胃で分解されうるので、非経口的投与（例えば、
皮下、筋肉内、静脈内、皮内等の投与を包含する）が望
ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝
剤、抗菌剤、およびその処方を個体の体液、好ましくは
血液と等張にする溶質を含有してもよい、水性および非
水性滅菌注射溶液；懸濁化剤または増粘剤を含有しても
よい、水性および非水性滅菌懸濁液を包含する。処方
は、単位投与または複数投与用容器、例えば、密封され
たアンプルおよびバイアルにて提供され、使用直前に滅
菌液体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵す
ることができる。ワクチン処方はまた、水中油系のごと
き処方の免疫原性を高めるアジュバント系および当該分
野において知られている他の系を有してもよい。投与量
はワクチンの比活性に依存し、慣用的実験操作によって
容易に決定できる。本発明をある種のヒスチジンキナー
ゼタンパク質について記載したが、この記載は自然に起
こるタンパク質のフラグメントおよび組換えタンパク質
の免疫原性を実質的に変化させない付加、欠失、置換を
有する同様なタンパク質も包含することが理解されるで
あろう。

【００７４】組成物、キットおよび投与本発明はまた、上記したポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドあるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴニス
トを含む組成物に関する。本発明のポリペプチドは、対
象への投与に適した医薬担体のような細胞、組織または
器官用の非滅菌または滅菌担体と組み合わせて使用でき
る。かかる組成物は、例えば、媒体添加または治療上有
効量の本発明のポリペプチドと、医薬上許容される担体
または賦形剤を含む。かかる担体は、限定するものでは
ないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グ
リセロール、エタノールおよびその組み合わせを包含す
る。処方は投与方法に適していなければならない。本発
明は、さらには、上記した本発明の組成物の一またはそ
れ以上の成分を充填した、一またはそれ以上の容器を有
してなる診断および医薬用パックおよびキットに関す
る。

【００７５】本発明のポリペプチドおよび他の化合物
を、単独で、または、治療用化合物などの他の化合物と
組み合わせて用いてもよい。該医薬組成物は、例えば、
局所、経口、経肛門、経膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、
皮下、経鼻、経皮等を含む、いずれかの有効な、都合の
よい方法で投与される。治療および予防において、活性
成分は個体に注射用組成物、例えば、滅菌水性分散液、
好ましくは等張の水性分散液として投与される。また、
組成物は、例えば、軟膏、クリーム、ローション、眼軟
膏、点眼剤、点耳剤、洗口剤、含浸包帯および縫合糸な
らびにエアゾルの形態の局所用処方とすることができ、
適当な通常の添加剤、例えば、保存料、薬剤浸透を助け
る溶媒、軟膏やクリームにおけるエモリエント等を含む
ことができる。そのような局所用処方はまた、適合する
通常の担体、例えば、クリームまたは軟膏基剤、ローシ
ョン用のエタノールまたはオレイルアルコールも含有す
ることができる。このような担体は、処方全量に対して
約１〜約９８重量％、通常、約８０重量％まで含有でき
る。

【００７６】哺乳動物、特にヒトに投与するには、１日
の活性薬剤の用量は、０.０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／
ｋｇ、典型的には約１ｍｇ／ｋｇである。いずれにして
も、個体に最も適した実際の用量は医者により決定さ
れ、個体の年齢、体重および応答により変化する。上記
の用量は、平均的な場合の例示である。もちろん、より
高いまたは低い用量範囲が適当な個体もあり、それらも
本発明の範囲内である。内在装置には外科移植、補綴お
よびカテーテル、すなわち、個体の体内に導入され、そ
の位置に長時間止まる装置が包含される。例えば、その
ような装置としては、人工関節、心臓弁、ペースメーカ
ー、血管グラフト、血管カテーテル、脊髄液シャント、
尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（continuous ambulat
ory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カテーテルが挙
げられる。

【００７７】本発明の組成物は、内在装置の挿入の直前
に関連する細菌に対する全身的効果を達成するために注
射で投与できる。治療は、手術の後、装置が体内にある
間継続できる。加えて、組成物は、細菌の傷汚染、特
に、ストレプトコッカス・ニューモニアエの傷汚染を防
止するために、いずれの手術用の手術周辺カバーの拡張
にも使用できる。多くの整形外科医は、補綴関節を有す
るヒトは、菌血症を生じ得る歯の治療前に抗生物質によ
る予防を考慮すべきと考えている。後の重い感染は、重
篤な合併症となり、時に、補綴関節の損失および著しい
罹病率、致死率を伴う。したがって、該活性物質を、こ
の状況の予防的抗生物質の代替品として使用することに
まで拡張することができる。

【００７８】上記した治療に加えて、本発明の組成物
は、一般に、傷組織に露出したマトリックス・タンパク
質への細菌付着を予防するための傷治療剤、抗生物質予
防に代え、あるいは共に、歯の治療における予防的用途
に使用できる。別法として、本発明の組成物は挿入直前
に内在装置を浸すのに使用できる。該活性物質は、傷ま
たは内在装置を浸する場合、１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／
ｍｌの濃度で使用できる。ワクチン組成物は、都合よく
は、注射剤の形態である。通常のアジュバントを使用し
て免疫応答を促進できる。ワクチン用の適当な単位投与
量は抗体０.５〜５μｇ／ｋｇであり、この用量を、好
ましくは１〜３週間の間隔で１〜３回投与する。指示し
た用量範囲で、本発明の化合物では、その化合物の適当
な個体への投与を妨げる、有害な毒作用は何も観察され
ない。本明細書において示された各々の参考文献は、出
典明示によりその内容を本明細書中に含める。本願出願
が優先権を主張するいずれの特許出願においてもその内
容を出典明示によりその内容をその中に含まる。

【００７９】

【実施例】以下の実施例は、別に詳細に記載したこと以
外は、当業者に周知で慣用的な標準的な技法を用いて実
施する。実施例は例示であって、本発明を限定するもの
ではない。

【００８０】実施例１株の選択、ライブラリーの製
造および配列決定配列番号１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチド
は、イー・コリにおけるストレプトコッカス・ニューモ
ニアエの染色体ＤＮＡのクローンライブラリーより得
た。ある場合には、重複するストレプトコッカス・ニュ
ーモニアエＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクロ
ーンからの配列データを用いて、配列番号１の連続した
ＤＮＡ配列を構築した。ライブラリーは常套手段、例え
ば以下の方法１および２により製造してもよい。全細胞
ＤＮＡをストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００
９９３より、標準法に従って単離し、二つの方法のいず
れかによりサイズ分画する。

【００８１】方法１標準的方法に従ってサイズ分画するために、全細胞ＤＮ
Ａを注射針に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまで
の大きさのＤＮＡフラグメントをエキソヌクレアーゼお
よびＤＮＡポリメラーゼで処理することによって平滑末
端とし、ＥｃｏＲＩリンカーを付加する。フラグメント
を、ＥｃｏＲＩで切断したベクター、ラムダＺａｐＩＩ
に連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージ
ングし、次いでパッケージングしたライブラリーでイー
・コリを感染させる。ライブラリーを標準方法により増
幅させる。

【００８２】方法２全細胞ＤＮＡをライブラリーベクターにクローニングす
るための一連のフラグメントを得るのに適当な１つの制
限酵素（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓ
ｈｌ２３５Ｉ）またはその組み合わせで部分的に加水分
解し、かかるフラグメントを標準的方法に従ってサイズ
分画する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡに連結し、次い
でそのフラグメントをＥｃｏＲＩで切断したベクター、
ラムダＺａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラ
リーをパッケージングし、パッケージングしたライブラ
リーでイー・コリを感染させる。ライブラリーを標準方
法により増幅させる。

【００８３】

【配列表】

（１）一般的情報：（ｉ）出願人：ウォリス，ニコラ・ジー（ｉｉ）発明の名称：新規化合物（ｉｉｉ）配列の数：４（ｉｖ）連絡先：（Ａ）宛名：デチャート・プライス＆ローズ（Ｂ）通り名：４０００ベル・アトランティック・タワ
ー、１７１７アーク・ストリート（Ｃ）都市名：フィラデルフィア（Ｄ）州名：ペンシルバニア州（Ｅ）国名：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号：１９１０３−２７９３（ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム：（Ａ）媒体形態：ディスケット（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステム：ウィンドウズ９５（Ｄ）ソフトウェア：ウィンドウズ・バージョン２.０
ｂ用のＦａｓｔＳＥＱ（ｖｉ）現出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）先の出願データ（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（ｖｉｉｉ）代理人等の情報：（Ａ）氏名：フォルク，ステファン・ティ（Ｂ）登録番号：３６７９５（Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＭ１００２０（ｉｘ）テレコミュニケーションの情報：（Ａ）電話番号：２１５−９９４−２４８８（Ｂ）テレファックス番号：２１５−９９４−２２２２（Ｃ）テレックス：

【００８４】（２）配列番号１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０９７塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号１： AGATAGAGAA ACCGAGAGGA CAAACATGAA ACTAAAAAGT TATATTTTGG TTGGATATAT 60 TATTTCAACC CTCTTAACCA TTTTGGTTGT TTTTTGGGCT GTTCAAAAAA TGCTGATTGC 120 GAAAGGCGAG ATTTACTTTT TGCTTGGGAT GACCATCGTT GCCAGCCTTG TCGGTGCTGG 180 GATTAGTCTC TTTCTCCTAT TGCCAGTCTT TACGTCGTTG GGCAAACTCA AGGAGCATGC 240 CAAGCGGGTA GCGGCCAAGG ATTTTCCTTC AAATTTGGAG GTTCAAGGTC CTGTAGAATT 300 TCAGCAATTA GGGCAAACTT TTAATGAGAT GTCCCATGAT TTGCAGGTAA GCTTTGATTC 360 CTTGGAAGAA AGCGAACGAG AAAAGGGCTT GATGATTGCC CAGTTGTCGC ATGATATTAA 420 GACCCCTATC ACTTCGATCC AAGCGACGGT AGAAGGGATT TTGGATGGGA TTATCAAGGA 480 GTCGGAGCAA GCTCATTATC TAGCAACCAT TGGACGCCAG ACGGAGAGGC TCAATAAACT 540 GGTTGAGGAG TTGAATTTTT TGACCCTAAA CACAGCTAGA AATCAGGTGG AAACTACCAG 600 TAAAGACAGT ATTTTTCTGG ACAAGCTCTT AATTGAGTGC ATGAGTGAAT TTCAGTTTTT 660 GATTGAGCAG GAGAGAAGAG ATGTCCACTT GCAGGTAATC CCAGAGTCTG CCCGGATTGA 720 GGGAGATTAT GCTAAGCTTT CTCGTATCTT GGTGAATCTG GTCGATAACG CTTTTAAATA 780 TTCTGCTCCA GGAACCAAGC TGGAAGTGGT GACTAAGCTG GAGAAGGGCC AGCTTTCAAT 840 CAGTGTGACC GATGAAGGGC AGGGCATTGC CCCAGAGGAT TTGGAAAATA TTTTCAAACG 900 CCTTTATCGT GTCGAAACTT CGCGTAACAT GAAGACAGGT GGTCATGGAT TAGGACTTGC 960 GATTGCGCGT GAATTGGCCC ATCAATTGGG TGGGGAAATC ACAGTCAGCA GCCAGTACGG 1020 TCTAGGAAGT ACCTTTACCC TCGTTCTCAA TCTCTCTGGT AGTGAAAATA AAGCCTAAAA 1080 CCCCTTTACA AATCCAG 1097

【００８５】（２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３５０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Lys Leu Lys Ser Tyr Ile Leu Val Gly Tyr Ile Ile Ser Thr Leu 1 5 10 15 Leu Thr Ile Leu Val Val Phe Trp Ala Val Gln Lys Met Leu Ile Ala 20 25 30 Lys Gly Glu Ile Tyr Phe Leu Leu Gly Met Thr Ile Val Ala Ser Leu 35 40 45 Val Gly Ala Gly Ile Ser Leu Phe Leu Leu Leu Pro Val Phe Thr Ser 50 55 60 Leu Gly Lys Leu Lys Glu His Ala Lys Arg Val Ala Ala Lys Asp Phe 65 70 75 80 Pro Ser Asn Leu Glu Val Gln Gly Pro Val Glu Phe Gln Gln Leu Gly 85 90 95 Gln Thr Phe Asn Glu Met Ser His Asp Leu Gln Val Ser Phe Asp Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Ser Glu Arg Glu Lys Gly Leu Met Ile Ala Gln Leu Ser 115 120 125 His Asp Ile Lys Thr Pro Ile Thr Ser Ile Gln Ala Thr Val Glu Gly 130 135 140 Ile Leu Asp Gly Ile Ile Lys Glu Ser Glu Gln Ala His Tyr Leu Ala 145 150 155 160 Thr Ile Gly Arg Gln Thr Glu Arg Leu Asn Lys Leu Val Glu Glu Leu 165 170 175 Asn Phe Leu Thr Leu Asn Thr Ala Arg Asn Gln Val Glu Thr Thr Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Ile Phe Leu Asp Lys Leu Leu Ile Glu Cys Met Ser Glu 195 200 205 Phe Gln Phe Leu Ile Glu Gln Glu Arg Arg Asp Val His Leu Gln Val 210 215 220 Ile Pro Glu Ser Ala Arg Ile Glu Gly Asp Tyr Ala Lys Leu Ser Arg 225 230 235 240 Ile Leu Val Asn Leu Val Asp Asn Ala Phe Lys Tyr Ser Ala Pro Gly 245 250 255 Thr Lys Leu Glu Val Val Thr Lys Leu Glu Lys Gly Gln Leu Ser Ile 260 265 270 Ser Val Thr Asp Glu Gly Gln Gly Ile Ala Pro Glu Asp Leu Glu Asn 275 280 285 Ile Phe Lys Arg Leu Tyr Arg Val Glu Thr Ser Arg Asn Met Lys Thr 290 295 300 Gly Gly His Gly Leu Gly Leu Ala Ile Ala Arg Glu Leu Ala His Gln 305 310 315 320 Leu Gly Gly Glu Ile Thr Val Ser Ser Gln Tyr Gly Leu Gly Ser Thr 325 330 335 Phe Thr Leu Val Leu Asn Leu Ser Gly Ser Glu Asn Lys Ala 340 345 350

【００８６】（２）配列番号３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号３： ATGAAACTAA AAAGTTATAT TTTGG 25

【００８７】（２）配列番号４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号４： GGCTTTATTT TCACTACCAG AGAGA 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 48/00 ＡＤＺ 48/00 ＡＤＺＣ０７Ｋ 14/315 Ｃ０７Ｋ 14/315 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/53 33/569 Ｆ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/52 ＡＣＤ (71)出願人 595047190 スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニーＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍｐ．ｌ．ｃ. イギリス国ミドルセックス・ティーダブリュ８・９イーピー、ブレンフォード、ニュー・ホライズンズ・コート（番地の表示なし) (72)発明者ニコラ・ゲイル・ウォリスアメリカ合衆国19087ぺンシルベニア州ウェイン、シュガータウン・ロード219番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号２のアミノ酸を含むポリ
ペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少
なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド、（ｂ）寄託株のストレプトコッカス・ニューモニアエ中
に含まれるヒスチジンキナーゼ遺伝子により発現される
のと同じ成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレ
オチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリ
ヌクレオチド、（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７
０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
をコードしているポリヌクレオチド、（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
に対して相捕的なポリヌクレオチド、および、（ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
の少なくとも１５個の連続した塩基を含むポリヌクレオ
チドからなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を
含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】配列番号１に示される核酸配列を含む請
求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】配列番号１に示されるヌクレオチド２６
ないし１０７５を含む請求項２記載のポリヌクレオチ
ド。
【請求項６】配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペ
プチドをコードしている請求項２記載のポリヌクレオチ
ド。
【請求項７】請求項１記載のポリヌクレオチドを含む
ベクター。
【請求項８】請求項７記載のベクターを含む宿主細
胞。
【請求項９】請求項８記載の宿主細胞から該ＤＮＡに
よりコードされているポリペプチドを発現させることを
含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】ヒスチジンキナーゼのポリペプチドま
たはフラグメントを製造する方法であって、請求項８記
載の宿主細胞を該ポリペプチドまたはフラグメントの産
生に十分な条件下で培養することを含む方法。
【請求項１１】配列番号２のアミノ酸配列に対して少
なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポ
リペプチド。
【請求項１２】配列番号２に示されるアミノ酸配列を
含むポリペプチド。
【請求項１３】請求項１１記載のポリペプチドに対す
る抗体。
【請求項１４】請求項１１記載のポリペプチドの活性
または発現を阻害するアンタゴニスト。
【請求項１５】治療上有効量の請求項１１記載のポリ
ペプチドを個体に投与することを含む、ヒスチジンキナ
ーゼのポリペプチドを必要とする個体の治療方法。
【請求項１６】治療上有効量の請求項１４記載のアン
タゴニストを個体に投与することを含む、ヒスチジンキ
ナーゼのポリペプチドを阻害する必要のある個体の治療
方法。
【請求項１７】請求項１１記載のポリペプチドの発現
または活性に関連する疾患を診断する方法であって、（ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸配列を決定
し、および／または、（ｂ）個体由来のサンプル中における該ポリペプチドの
存在または量を解析することからなる方法。
【請求項１８】請求項１１記載のポリペプチドと相互
作用し、その活性を阻害または活性化する化合物の同定
方法であって、化合物とポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下
にて、ポリペプチドを含む組成物とスクリーニングすべ
き化合物とを接触させ、化合物の相互作用を評価し（該
相互作用は、、ポリペプチドと化合物の相互作用に応答
して検出可能シグナルを提供しうる第２の成分に関連し
ているものである）、ついで、化合物とポリペプチドとの相互作用により生じ
るシグナルの存在または不存在を検出することにより、
化合物がポリペプチドと相互作用し、その活性を活性化
するかまたは阻害するかどうかを調べることを含む方
法。
【請求項１９】哺乳動物における免疫学的応答を誘導
する方法であって、哺乳動物に、該動物を疾患から防御
する抗体および／またはＴ細胞免疫応答を産生するため
に十分な請求項１１記載のヒスチジンキナーゼのポリペ
プチド、またはそのフラグメントまたは変種を接種する
ことを含む方法。
【請求項２０】哺乳動物における免疫学的応答を誘導
する方法であって、請求項１１記載のヒスチジンキナー
ゼのポリペプチド、またはそのフラグメントまたは変種
を発現させるために、請求項１１記載のヒスチジンキナ
ーゼのポリペプチド、そのフラグメントもしくは変種の
発現を制御する核酸ベクターをインビボで送達して、該
動物を疾病から防御する抗体および／またはＴ細胞免疫
応答を産生させる免疫学的応答を誘導することを含む方
法。