ES2285709T3 - Fragmentos de polipeptidos capaces de competir con el antigeno i/ii de streptococcus mutans. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que tiene la capacidad de estimular una respuesta de células T y una o más de las propiedades siguientes: (i) la capacidad de adherirse a un diente de mamífero de forma competitiva con el antígeno I/II natural de Spreptococcus mutans (SA I/II), eliminando o disminuyendo de este modo la adhesión de S. mutans al diente; y (ii) la capacidad de estimular una respuesta de células B; y seleccionado de: (a) un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es según se muestra en una cualquiera de las SEQ ID nº 2 a 10 9 u 11, (b) un polipéptido cuya secuencia tiene al menos una identidad de secuencia del 60% a la de un polipéptido de (a); tal polipéptido retiene las propiedades biológicas que el polipéptido de (a) tiene en común con SA I/II; (c) un polipéptido que comprende una secuencia que difiere de la de un polipéptido de (a) por la sustitución, deleción o inserción de desde uno hasta diez aminoácidos; tal polipéptido retiene las propiedades biológicas que el polipéptido de(a) tiene en común con SA I/II; (d) un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID nº 3, 9 u 11 y comprende hasta 50 aminoácidos en total, o un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID nº 2, 5, 7 u 8 y comprende hasta 100 aminoácidos en total, o un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID nº 4 o 6 y comprende hasta 200 aminoácidos en total; tal polipéptido retiene las propiedades biológicas que el polipéptido de SEQ ID nº 2 a 9 u 11 tiene en común con SA I/II; y un polipéptido que comprende un polipéptido de (a) o (b), extendido en el C-terminal por una secuencia no silvestre que tiene cualquier secuencia aparte de la que es C-terminal de la secuencia del polipéptido de (a) en el SA I/II nativo y/o extendido en el N-terminal por una secuencia no silvestre que tiene cualquier secuencia aparte de la que es N-terminal de la secuencia del polipéptido de (a) en el SA I/II nativo; tal polipéptido retiene las propiedades biológicas que el polipéptido de (a) tiene encomún con SA I/II.

Description

Fragmentos de polipéptidos capaces de competir con el antígeno I/II de Streptococcus mutans.

Este invento se refiere a los fragmentos de los polipéptidos del antígeno I/II de Streptococcus mutans que son útiles para tratar y evitar las caries dentales.

Streptococcus mutans es el principal agente etiológico de las caries dentales, una enfermedad que afecta a los mamíferos, incluidos los humanos.

El antígeno I/II de S. mutans (SA I/II) es una proteína de la superficie celular con un peso molecular de aproximadamente 185 kDa. Se cree que comprende varios epítopos antigénicos y que es, al menos parcialmente, responsable de la adhesión de S. mutans a los dientes.

SA I/II está descrito en la patente británica nº 2.060.647, como lo están muchos anticuerpos de éste. Un fragmento putativo de 3,5 a 4,5 kDa de SA I/II, el "antígeno X", también se ha descrito en la patente europea nº 0 116 472. Véase también el documento EP-A-O 280.576 titulado "Vacuna sintética anti-caries".

Sin embargo, ahora ha quedado claro que el "antígeno X" no es en absoluto un fragmento de SA I/II. Más bien, es una proteína separada que simplemente copurifica con SA I/II. Se cree que está codificado por un gen separado.

Los anticuerpos de suero humano reconocen dos fragmentos grandes de SA I/II, un fragmento N-terminal (residuos 39 a 481) y un fragmento central de 40 kDa (residuos 816 a 1213). Dentro del fragmento central, el 80% de los sueros sometidos a ensayo reconocen elementos dentro de una región rica en prolinas (residuos 839 a 955) que comprende tres repeticiones en tándem, lo que sugiere que esta región incluye uno o más epítopos de células B. Según Munro et al (Infection and Immunity, vol 61, nº 11, noviembre 1993, pág. 4590-4598), se cree que el fragmento central (residuos 816-1213) comprende también uno o más lugares de adhesión que median la unión de S. mutans al diente. Evans et al también sugieren que dentro de los residuos 855-1161 se localizan epítopos protectores y asociados a la adhesión (J Dent Res., 71 (IADR Abstract 1753), 1992).

El objetivo del trabajo anteriormente mencionado ha sido el desarrollo de vacunas para inmunizar frente a las caries dentales. Sin embargo, la identificación precisa de los epítopos antigénicos dentro de SA I/II es un prerrequisito para diseñar vacunas sintéticas basadas en ello. De forma similar, la identificación precisa de los lugares de adhesión es esencial para el diseño de fármacos contra las caries dentales que dependen de la inhibición de la adhesión de S. mutans al diente.

No se han caracterizado epítopos antigénicos (epítopos de células T o células B) ni lugares de adhesión dentro de SA I/II, ni tampoco se ha sugerido la localización precisa de cualquiera de tales regiones. Además, no ha habido indicación de la localización de los epítopos de células T de S. mutans dado que el trabajo anteriormente mencionado se ha concentrado en la capacidad de S. mutans para adherirse a los dientes y generar una respuesta de células
B.

Los inventores han identificado muchos de los epítopos de células T, de los epítopos de células B y de los lugares de adhesión dentro de los residuos 803 a 1114 de SA I/II. Algunos de los epítopos de células T y células B se solapan o están contiguos entre ellos y/o con uno o más de los lugares de adhesión.

La presencia de muchos de los epítopos antigénicos de ambos tipos y de muchos de los lugares de adhesión dentro de la misma región de SA I/II podía no haberse predicho y el hallazgo de que algunos de los lugares de adhesión y epítopos se solapan o están contiguos entre ellos es particularmente sorprendente.

Estos hallazgos hacen posible diseñar vacunas sintéticas eficaces frente a las caries dentales, así como fármacos que engendran resistencia frente a la enfermedad o alivian los casos preexistentes de ella al evitar la adhesión de S. mutans al diente. Además, el hallazgo sorprendente de que algunos de los epítopos T antigénicos y de los lugares de adhesión se solapan o están contiguos hace posible diseñar fármacos bifuncionales que inmunizan contra las caries dentales, así como evitan la adhesión de S. mutans al diente.

En consecuencia, el invento presente proporciona un polipéptido que tiene la capacidad de estimular una respuesta de células T y una o más de las propiedades siguientes: (i) la capacidad de adherirse a un diente de mamífero de forma competitiva con el antígeno I/II natural de Streptococcus mutans (SA I/II), evitando de este modo, o disminuyendo, la adhesión de S. mutans al diente; y (ii) la capacidad de estimular una respuesta de células B; y se selecciona de:

(a)

un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es como se muestra en una cualquiera de las SEQ ID nº 2 a 9 u 11;

(b)

un polipéptido cuya secuencia tiene al menos un 60% de identidad de secuencia con la de un polipéptido de (a); tal polipéptido retiene las propiedades biológicas que el polipéptido de (a) tiene en común con SA I//II;

(c)

un polipéptido que comprende una secuencia que difiere de la de un polipéptido de (a) por la sustitución, deleción o inserción de desde uno hasta diez aminoácidos; tal polipéptido retiene las propiedades biológicas que el polipéptido de (a) tiene en común con SA I/II;

(d)

un polipéptido que comprende la secuencia de las SEQ ID nº 3, 9 u 11 y comprende hasta 50 aminoácidos en total o un polipéptido que comprende la secuencia de las EQ ID nº 2, 5, 7 u 8 y comprende hasta 100 aminoácidos en total, o un polipéptido que comprende la secuencia de las SEQ ID nº 4 o 6 y comprende hasta 200 aminoácidos en total; tal polipéptido retiene las propiedades biológicas que el polipéptido de las SEQ ID nº 2 a 9 u 11 tiene en común con SA I/II; y

(e)

un polipéptido que comprende un polipéptido de (a) o (b), extendido en el C-terminal por una secuencia no silvestre que tiene cualquier secuencia a excepción de la que es C-terminal de la secuencia del polipéptido de (a) en el SA I/II nativo, y/o extendida en el N-terminal por una secuencia no silvestre que tiene cualquier secuencia aparte de la que es N-terminal a la secuencia del polipéptido de (a) en el SA I/II nativo; tal polipéptido retiene las propiedades biológicas que el polipéptido de (a) tiene en común con SA I/II.

También se proporcionan secuencias de ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido del invento tras expresión en una célula hospedante procariota o eucariota.

También se proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica tras expresión para un polipéptido del invento en una célula hospedante procariota o eucariota.

También se proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico del invento unida operativamente a un promotor capaz de dirigir su expresión en una célula hospedante.

También se proporciona una célula aislada que alberga un vector del invento.

También se proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido del invento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, dicha composición es una composición de vacuna. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas del invento se formulan para aplicación tópica bucal.

También se proporciona un polipéptido del invento para uso en el tratamiento de las caries dentales.

También se proporciona un polipéptido del invento para uso en el tratamiento de las caries dentales o en la vacunación de un hospedante mamífero frente a las caries dentales por medio de la aplicación tópica bucal.

También se proporciona el uso de un polipéptido del invento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las caries dentales o en la vacunación de un hospedante mamífero frente a las caries dentales por medio de la aplicación tópica bucal.

Los polipéptidos preferidos del invento son polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos es la de una cualquiera de las SEQ ID nº 1 a 9 u 11. También preferido es un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es la de los aminoácidos 2 a 21 de la SEQ ID nº 9.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Representación del panel de 20meros solapantes empleados para mapear los epítopos de células T, de células B y de adhesión dentro de SA I/II.

Figura 2. Respuestas proliferativas a los péptidos sintéticos solapantes (20^{eros}) de SA I/II.

a) Media de S. I. (\pm d.t.; desviación típica) de las PBMC de 30 individuos. La media de c.p.m. con medio solo fue de 538 \pm 112.

b) Frecuencia de respuestas positivas (S.I. \geq 3,0; c.p.m. > 500).

Figura 3. Dependencia del MHC de clase II de las respuestas proliferativas frente a SA I/II.

Figura 4. Reconocimiento sérico de SA I/II y de los fragmentos polipeptídicos recombinantes. Se muestran las transferencias Western de 3 individuos (paneles a-c) junto al antisuero anti-SA I/II de conejo (panel d). Calle 1, SA I/II; calle 5, 984-1161 recombinante.

Figura 5. Reconocimiento de los péptidos sintéticos de SA I/II por parte del suero humano.

a) Se determinaron los títulos por ELISA en 22 individuos en péptidos seleccionados de SA I/II y en un péptido control irrelevante de SIVp27 (SIV). También se indican las frecuencias de unión de los sueros a los péptidos con un título > media + 2 DE del péptido control.

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Figura 6. Inhibición de la adhesión de S. mutans.

a) SA I/II y fragmento 984-1161 recombinante.

b) Péptidos sintéticos.

Figura 7. Respuesta proliferativa de los esplenocitos murinos tras inmunización con el 975-1044 recombinante (SEQ ID nº 8).

Figura 8. Inhibición competitiva de la unión a SA I/II por varios polipéptidos.

Figura 9. Dependencia de la inhibición competitiva de la unión a SA I/II en la concentración de dos péptidos.

Figura 10. Efectos de la sustitución de ciertos residuos en la inhibición competitiva.

Figura 11. Comparación de varios polipéptidos recombinantes con respecto a la unión.

Los polipéptidos del invento pueden tener la capacidad de adherirse a un diente de mamífero de forma competitiva con el antígeno I/II natural de Streptococcus mutans, impidiendo o disminuyendo la adhesión de S. mutans al diente. Se ha mostrado que algunos de los péptidos del invento inhiben la adhesión de S. mutans a un modelo de superficie dental (saliva humana total adsorbida a los pocillos de placas de microtitulación de poliestireno o a bolas de hidroxiapatita). De este modo, estos péptidos comprenden uno o más lugares de adhesión y se adherirán a un diente de mamífero de forma competitiva con el SA I/II natural. Por tanto, los péptidos que de acuerdo con el invento comprenden el lugar de adhesión impiden o disminuyen la adhesión de S. mutans al diente. Los péptidos del invento que comprenden uno o más epítopos de adhesión incluyen las SEQ ID nº 2 a 6, 8 y 9.

Los péptidos, de acuerdo con el invento, tienen la capacidad de estimular una respuesta de células T. Los inventores han mostrado que los residuos 803 a 854 y 925 a 1114 de SA I/II comprenden muchos de los epítopos de células T que son, al menos parcialmente, responsables de la respuesta de las células T estimuladas por la proteína intacta. Por tanto, los péptidos que de acuerdo con el invento comprenden uno o más de estos epítopos de células T estimulan una respuesta de las células T frente a la infección por S. mutans. Los péptidos del invento que estimulan una respuesta de las células T incluyen los mostrados en las SEQ ID nº 2 a 9 y 11.

Los péptidos del invento pueden estimular una respuesta de las células B. Los inventores han mostrado que los residuos 803 a 854 y 925 a 1114 de SA I/II comprenden muchos de los epítopos de células B y los polipéptidos que, de acuerdo con el invento, comprenden uno o más epítopos de células B estimulan una respuesta de las células B frente a la infección por S. mutans. Los péptidos del invento que comprenden uno o más epítopos de células B incluyen los mostrados en las SEQ ID nº 2 y 3 a 7.

Las secuencias de ácidos nucleicos del invento codifican polipéptidos del invento.

Las secuencias de ácidos nucleicos del invento presente son preferiblemente ADN, aunque pueden ser ARN. Será obvio para los expertos en la técnica que en las secuencias de ARN, según el invento, los residuos T mostrados en las SEQ ID nº 13 a 20 y 22 se reemplazarán por U. Las secuencias de ácidos nucleicos del invento estarán típicamente en forma aislada o sustancialmente aislada. Por ejemplo, hasta el 80%, hasta el 90%, hasta el 95% o hasta el 100% del material de ácido nucleico en una preparación de un ácido nucleico del invento será típicamente ácido nucleico de acuerdo con el invento.

Algunas secuencias de ácidos nucleicos preferidas del invento se muestran en las SEQ ID nº 13 a 20 y 22. Sin embargo, las secuencias de ácidos nucleicos del presente invento no están limitadas a estas secuencias. Más bien, las secuencias del invento incluyen secuencias que están estrechamente relacionadas con estas secuencias y que codifican un polipéptido que tiene al menos una de las propiedades biológicas del SA I/II natural. Estas secuencias pueden prepararse modificándolas de las SEQ ID nº 13 a 20 y 22 mediante cualquier método convencional o aislarse de cualquier organismo, o fabricarse sintéticamente. Tales modificaciones, aislamientos o síntesis pueden llevarse a cabo mediante cualquier método convencional, por ejemplo, por los métodos de Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989).

Por ejemplo, las secuencias del invento incluyen secuencias que son capaces de hibridar selectivamente con las de las SEQ ID nº 13 a 22 o con sus cadenas complementarias y que codifican un polipéptido que tiene una o más de las propiedades definidas anteriormente. Tales secuencias capaces de hibridar selectivamente con el ADN de las SEQ ID nº 13 a 20 y 22 serán generalmente al menos 70%, preferiblemente al menos 80% o 90% y, más preferiblemente, al menos 95% homólogas al ADN de una cualquiera de las SEQ ID nº 13 a 20 o 22 sobre una región de al menos 10, preferiblemente de al menos 20, 30, 40, 50 o más nucleótidos contiguos.

Tales secuencias que hibridan con las mostradas en las SEQ ID nº 13 a 20 y/o 22 serán típicamente de tamaño similar a éstas, aunque pueden ser más largas o más cortas. Sin embargo, si son más largas, pueden no codificar simplemente fragmentos grandes de la secuencia de aminoácidos del SA I/II nativo. También, las secuencias que hibridan a las de SEQ ID nº 13 a 20 o 22 deben hacerlo sobre al menos 50% de su longitud, por ejemplo hasta 60%, hasta 70%, hasta 80%, hasta 90%, hasta 95% o hasta 99% de su longitud.

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Tal hibridación puede llevarse a cabo bajo cualquier condición adecuada conocida en la técnica (véase Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989). Por ejemplo, si se requiere alta astringencia, condiciones adecuadas incluyen 0,2 x SSC a 60ºC. Si se requiere astringencia más baja, condiciones adecuadas incluyen 2 x SSC a 60ºC.

También incluidas dentro del alcance del invento están las secuencias que difieren de las definidas anteriormente debido a la degeneración del código genético y codifican los mismos polipéptidos que tienen una o más de las propiedades definidas arriba, específicamente el polipéptido de las SEQ ID nº 2 a 9 y 11 o un polipéptido relacionado con uno de estos polipéptidos de cualquiera de las maneras definidas a continuación.

De este modo, las secuencias de ácidos nucleicos del invento incluyen secuencias las cuales, a no ser por la degeneración del código genético, hibridarían con aquellas mostradas en las SEQ ID nº 13 a 20 o 22 o con sus cadenas complementarias. Sin embargo, tales secuencias pueden no codificar simplemente fragmentos grandes de las secuencias de aminoácidos del SA I/II nativo. También, sus secuencias deben ser tales que, a no ser por la degeneración del código genético, hibridarían con una secuencia como las mostradas en las SEQ ID nº 13 a 20 o 22 sobre al menos 50% de su longitud, por ejemplo hasta 60%, hasta 70%, hasta 80%, hasta 90%, hasta 95% o hasta 99% de su longitud.

Las secuencias de ácidos nucleicos del invento también incluyen las cadenas complementarias de las secuencias definidas anteriormente, por ejemplo, las cadenas complementarias de las secuencias de los ácidos nucleicos mostrados en las SEQ ID nº 13 a 20 o 22.

Las secuencias de ácidos nucleicos del invento tendrán preferiblemente al menos 50 bases de longitud, por ejemplo hasta 100, hasta 200, hasta 300, hasta 400, hasta 500 o hasta 600 bases.

Las secuencias de ácidos nucleicos del invento pueden extenderse en cualquiera o ambos de los extremos 5' y 3'. Tales extensiones pueden ser de cualquier longitud. Por ejemplo, una extensión puede comprender hasta 10, hasta 20, hasta 50, hasta 100, hasta 200 o hasta 500 o más ácidos nucleicos. Una extensión 5' puede tener cualquier secuencia aparte de la que está inmediatamente 5' a la secuencia del invento (o la secuencia nativa de la que se deriva) en el SA I/II nativo. Una extensión 3' puede tener cualquier secuencia aparte de la que está 3' a la secuencia de SEQ ID nº 13 en el SA I/II nativo. De este modo, las secuencias de ácido nucleico del invento pueden extenderse en cualquiera o ambos de los extremos 5' y 3' por cualquier secuencia no silvestre.

Los polipéptidos del invento se codifican por las secuencias descritas anteriormente. De este modo, los polipéptidos del invento no están limitados a los polipéptidos de las SEQ ID nº 2 a 9 y 11, aunque estas secuencias representan los polipéptidos preferidos. Más bien, los polipéptidos del invento también incluyen polipéptidos con secuencias estrechamente relacionadas con aquellas de las SEQ ID nº 2 a 9 u 11 que tienen una o más de las propiedades biológicas de SA I/II. Estas secuencias pueden prepararse por alteración de aquellas de las SEQ ID nº 2 a 9 y 11 por cualquier método convencional, o aislarse a partir de cualquier organismo o fabricarse sintéticamente. Tales alteraciones, aislamientos o síntesis pueden llevarse a cabo por cualquier método convencional, por ejemplo por los métodos de Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989). En particular, los polipéptidos relacionados con aquellos de las SEQ ID nº 2 a 9 y 11 pueden prepararse mediante secuencias de ADN modificadas, según se muestra en las SEQ ID nº 13 a 20 y 22, expresándolas por recombinación.

Los polipéptidos del invento pueden codificarse por secuencias de ácidos nucleicos que tienen menos de 100% de identidad de secuencia con las de las SEQ ID nº 13 a 20 y 22. De este modo, los polipéptidos del invento pueden incluir sustituciones, deleciones o inserciones que les distinguen de las SEQ ID nº 2 a 9 y 11, siempre y cuando éstas no destruyan la propiedad o propiedades biológicas que los polipéptidos tienen en común con SA I/II.

Una sustitución, deleción o inserción puede implicar convenientemente a uno o más aminoácidos, típicamente desde uno hasta cinco, de uno a diez o de uno a veinte aminoácidos, por ejemplo, una sustitución, deleción o inserción de uno, dos, tres, cuatro, cinco, ocho, diez, quince o veinte aminoácidos. Típicamente, un polipéptido del invento tiene al menos 60%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID nº 2 a 9 u 11.

En general, la naturaleza físico-química de la secuencia de las SEQ ID nº 2 a 9 u 11 debería preservarse en un polipéptido del invento. Tales secuencias serán generalmente similares en carga, hidrofobicidad y tamaño que las de SEQ ID nº 2 a 9 u 11. Ejemplos de sustituciones que no afectan mucho a la naturaleza físico-química de las secuencias de aminoácidos son aquellas en las que un aminoácido de uno de los grupos siguientes se sustituye por un aminoácido diferente del mismo grupo:

H, R y K

I, L, V y M

A, G, S y T

D, E, Q y N.

Sin embargo, puede ser deseable alterar la naturaleza físico-química de la secuencia de SEQ ID nº 1 a 11 para aumentar su eficacia terapéutica. Por ejemplo, muchos de los aminoácidos de los polipéptidos del invento son ácidos. Por ejemplo, los residuos 975 a 1044 (SEQ ID nº 8) son, en conjunto, de naturaleza ácida. Esta acidez se cree que facilita la unión a un diente de mamífero. De este modo, puede ser conveniente aumentar la acidez de los polipéptidos del invento por adición de residuos ácidos o por sustitución de residuos ácidos por no ácidos. Los residuos ácidos incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico.

Donde los polipéptidos del invento se sintetizan químicamente, los aminoácidos D (que no se encuentran en la naturaleza) pueden incorporarse dentro de la secuencia de aminoácidos en lugares donde no afectan a las propiedades biológicas de los polipéptidos, lo que reduce la susceptibilidad de los polipéptidos a la proteolisis por las proteasas del receptor.

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos del invento pueden extenderse en uno o ambos extremos por cualquier secuencia no silvestre.

De este modo, los polipéptidos del invento pueden extenderse en cualquiera o ambos extremos C- y N-terminal por una secuencia de aminoácidos de cualquier longitud. Por ejemplo, una extensión puede comprender hasta 5, hasta 10, hasta 20, hasta 50 o hasta 100 o 200 o más aminoácidos. Una extensión N-terminal puede tener cualquier secuencia aparte de la que está N-terminal a la secuencia del invento (o la secuencia nativa de la que se deriva) en el SA I/II nativo. Una extensión C-terminal puede tener cualquier secuencia aparte de la que está C-terminal en la secuencia del invento (o la secuencia nativa de la que se deriva) en el SA I/II nativo. De este modo, los polipéptidos del invento pueden extenderse en cualquiera o ambos de los extremos C- y N-terminal por cualquier secuencia no silvestre.

Los polipéptidos del invento pueden estar unidos a otros polipéptidos o proteínas que incrementan sus propiedades antigénicas. De este modo, los polipéptidos del invento pueden estar unidos a uno o más polipéptidos antigénicos. Estos polipéptidos antigénicos adicionales pueden derivarse de S. mutans o de otro organismo. Otros polipéptidos antigénicos posibles incluyen epítopos heterólogos de células T derivados de otras proteínas de S. mutans o de especies distintas a S. mutans. Los epítopos heterólogos de células B también pueden emplearse. Tales epítopos heterólogos de células T y/o células B pueden ser de cualquier longitud y los epítopos de hasta 5, hasta 10 o hasta 20 aminoácidos de longitud son particularmente preferidos. Estos polipéptidos antigénicos adicionales pueden estar unidos a los polipéptidos del invento químicamente. Alternativamente, una o más secuencias antigénicas adicionales pueden comprender una extensión a un polipéptido del invento.

Un polipéptido del invento puede someterse a una o más modificaciones químicas, tales como glicosilación, sulfatación, COOH-amidación o acilación. En particular, se prefieren los polipéptidos que están acetilados en el N-terminal y los polipéptidos que tienen grupos amida en el C-terminal. Los polipéptidos preferidos pueden tener una o más modificaciones de éstas. Por ejemplo, los péptidos particularmente preferidos pueden tener un grupo amida en el C-terminal y acetilación en el N-terminal.

Un polipéptido del invento puede formar parte de un polipéptido más grande que comprende múltiples copias de la secuencia de una o más de las SEQ ID nº 2 a 9 u 11 o una secuencia relacionada con ellas de cualquiera de las maneras definidas en esta memoria.

Los polipéptidos del invento comprenden típicamente al menos 15 aminoácidos, por ejemplo de 15 a 20, de 20 a 50, de 50 a 100 o de 100 a 200 o de 200 a 300 aminoácidos. Los polipéptidos preferidos incluyen los mostrados en las SEQ ID nº 2 a 9 y 11. También preferido es un polipéptido cuya secuencia es la de los aminoácidos 2 a 21 de la SEQ ID nº 9.

Los polipéptidos, de acuerdo con el invento, pueden estar purificados o sustancialmente purificados. Tal polipéptido en la forma sustancialmente purificada formará parte de una preparación en la que más del 90%, por ejemplo hasta 95%, hasta 98% o hasta 99% del material peptídico en la preparación es el de un polipéptido o polipéptidos de acuerdo con el invento.

Las secuencias de ácido nucleico y los polipéptidos del invento derivaron originalmente de S. mutans. Sin embargo, las secuencias de ácido nucleico y/o polipéptidos del invento pueden obtenerse también a partir de otros organismos, típicamente bacterias, especialmente otros estreptococos. Pueden obtenerse bien por técnicas de clonación convencionales o mediante sondas genómicas o de librerías de ADNc con secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento. Esto puede realizarse mediante cualquier método convencional, tal como los métodos de Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989).

Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el invento puede incluirse dentro de un vector, convenientemente un vector replicable, por ejemplo, un vector replicable de expresión.

Un vector replicable de expresión comprende un origen de replicación, de modo que el vector puede replicarse en una célula hospedante tal como una célula hospedante bacteriana. Un vector adecuado comprenderá también típicamente los elementos siguientes, normalmente en disposición 5' a 3': un promotor para dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico y opcionalmente un regulador del promotor, un codón de iniciación de la traducción y una secuencia de ácido nucleico, que según el invento codifica un polipéptido que tiene una o más de las propiedades biológicas de SA I/II. Un vector no replicable carece de un origen adecuado de replicación, mientras que un vector que no es de expresión carece de un promotor eficaz.

El vector también puede contener uno o más genes de marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina para identificar los transformantes bacterianos. Un gen marcador preferido en particular es el gen de resistencia a la kanamicina. Opcionalmente, el vector puede comprender también un intensificador del promotor. Si se desea expresar la secuencia de ácido nucleico del invento en una célula eucariota, el vector puede comprender también una señal de poliadenilación ligada operativamente 3' al ácido nucleico que codifica la proteína funcional. El vector también puede comprender un terminador transcripcional 3' a la secuencia que codifica el polipéptido del invento.

El vector puede comprender también una o más secuencias no codificantes 3' a la secuencia que codifica el polipéptido del invento. Éstas pueden ser de S. mutans (el organismo del cual se derivan las secuencias del invento), del organismo hospedante que va a transformarse con el vector o de otro organismo.

En un vector de expresión, la secuencia de ácido nucleico del invento está ligada operativamente a un promotor capaz de expresar la secuencia. "Ligado operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que el promotor y la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido del invento están en una relación que permite expresarse a la secuencia codificante bajo el control del promotor. De este modo, puede haber elementos tales como la secuencia 5' no codificante entre el promotor y la secuencia codificante. Estos elementos pueden ser nativos de S. mutans o del organismo del que deriva la secuencia del promotor o de ninguno de los dos organismos. Tales secuencias pueden incluirse en el vector si intensifican o no impiden el control correcto de la secuencia codificante por el promotor.

El vector puede ser de cualquier tipo. El vector puede estar en forma lineal o circular. Por ejemplo, el vector puede ser un vector plasmídico. Los expertos en la técnica serán capaces de preparar vectores adecuados que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos del invento, comenzando con vectores ampliamente disponibles que serán modificados mediante técnicas de ingeniería genética tales como las descritas por Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989). Los vectores de partida preferidos incluyen plásmidos que confieren resistencia a kanamicina y expresión directa del polipéptido del invento vía un promotor tac.

En un vector de expresión, cualquier promotor capaz de dirigir la expresión de una secuencia del invento en una célula hospedante puede estar ligado operativamente a la secuencia de ácido nucleico del invento. Promotores adecuados incluyen el promotor tac.

Tales vectores pueden emplearse para transfectar o transformar una célula hospedante. Dependiendo del tipo del vector, pueden emplearse como vectores de clonaje para amplificar secuencias de ADN según el invento o expresar este ADN en una célula hospedante.

Una realización adicional del invento proporciona células hospedantes que albergan vectores del invento, es decir, células transformadas o transfectadas con vectores para la replicación y/o expresión de secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento, que incluyen las secuencias mostradas en las SEQ ID nº 13 a 20 y 22. Las células se escogerán compatibles con el vector y pueden ser, por ejemplo, células bacterianas. Las células bacterianas transformadas o transfectadas, por ejemplo células de E. coli, serán particularmente útiles para amplificar las secuencias de ácidos nucleicos del invento, así como para expresarlas como polipéptidos.

Las células pueden transformarse o transfectarse mediante cualquier método adecuado, tal como los métodos descritos por Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989). Por ejemplo, los vectores que comprenden secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento pueden empaquetarse dentro de partículas virales infecciosas, tales como partículas retrovirales. Los constructos pueden introducirse, por ejemplo mediante electroporación, precipitación con fosfato cálcico, métodos biolísticos o por contacto de vectores de ácidos nucleicos desnudos con las células en solución.

En dichos vectores de ácidos nucleicos con los que las células hospedantes se transforman o transfectan, el ácido nucleico puede ser ADN o ARN, preferiblemente ADN.

Los vectores con los que las células hospedantes se transforman o transfectan pueden ser de cualquier tipo adecuado. Los vectores pueden ser capaces de efectuar la integración de las secuencias de ácido nucleico del invento dentro del genoma de la célula hospedante o pueden permanecer libres en el citoplasma. Por ejemplo, el vector empleado para transformación puede ser un vector de expresión, según se define en esta memoria.

El invento presente también se refiere a un procedimiento para producir polipéptidos de acuerdo con el invento. Tal procedimiento comprenderá típicamente transformar o transfectar células hospedantes con los vectores que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento y expresar la secuencia de ácido nucleico en estas células. En este caso, la secuencia de ácido nucleico estará ligada operativamente a un promotor capaz de dirigir su expresión en una célula hospedante. De forma deseable, tal promotor será un promotor "potente" capaz de alcanzar niveles de expresión elevados en la célula hospedante. Puede ser deseable sobreexpresar el polipéptido de acuerdo con el invento en la célula hospedante. Células hospedantes adecuadas para este propósito incluyen células de levadura y células bacterianas, por ejemplo células de E. coli, siendo una cepa de E. coli particularmente preferida la cepa BL 21 de E. coli K12. Sin embargo, otros sistemas de expresión pueden emplearse también, por ejemplo sistemas de baculovirus en los que el vector es un baculovirus que tiene en su genoma ácido nucleico que codifica un polipéptido del invento y la expresión ocurre cuando se permite al baculovirus infectar células de insecto.

El polipéptido del invento así producido puede recuperarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Opcionalmente, el polipéptido así recuperado puede purificarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, un método de acuerdo con Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual).

Los polipéptidos del invento también pueden sintetizarse químicamente empleando técnicas estándar de síntesis peptídica. Para los polipéptidos más cortos, la síntesis química puede ser preferible a la expresión recombinante. En particular, los péptidos de hasta 20 o hasta 40 aminoácidos de longitud pueden, de forma deseable, sintetizarse químicamente.

Las secuencias de ácidos nucleicos del invento pueden emplearse para preparar sondas y cebadores. Éstas serán útiles, por ejemplo, en el aislamiento de genes que tienen secuencias similares a las de la SEQ ID nº 24. Tales sondas y cebadores pueden ser de cualquier longitud, de forma deseable desde 10 hasta 100, por ejemplo desde 10 hasta 20, de 20 a 50 o de 50 a 100 bases de longitud.

El presente invento también se refiere a anticuerpos de los polipéptidos del invento. Estos anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Para los propósitos de este invento, el término "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpos completos que retienen su actividad de unión para un antígeno diana. Tales fragmentos incluyen los fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')_{2}, así como anticuerpos de cadena sencilla.

Los anticuerpos pueden producirse por cualquier método conocido en la técnica, tales como los métodos de Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989). Por ejemplo, pueden prepararse mediante técnicas convencionales de hibridomas o, en el caso de anticuerpos modificados o fragmentos, mediante tecnología de ADN recombinante, por ejemplo por expresión en un vector hospedante adecuado de un constructo de ADN que codifica el anticuerpo modificado o el fragmento ligado operativamente a un promotor. Las células hospedantes adecuadas incluyen células bacterianas (por ejemplo, E. coli), de levaduras, de insectos y de mamíferos. Los anticuerpos policlonales también pueden prepararse por medios convencionales que comprenden inocular un animal hospedante, por ejemplo una rata o un conejo, con un péptido del invento y recuperar el suero inmune.

El invento presente también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos del invento. Tres tipos de composiciones farmacéuticas son particularmente preferidas. En primer lugar, las composiciones que comprenden polipéptidos del invento que incluyen epítopos de células T y/o de células B pueden emplearse como vacunas contra las caries dentales. En segundo lugar, las composiciones que comprenden polipéptidos del invento que comprenden lugares de adhesión impedirán o disminuirán la adhesión de S. mutans al diente y pueden emplearse en el tratamiento de casos preexistentes de caries dentales. En tercer lugar, las composiciones que comprenden polipéptidos del invento que incluyen tanto uno o más epítopos antigénicos (células T o células B) y uno o más epítopos de adhesión pueden emplearse para efectuar vacunas contra las caries dentales al mismo tiempo que curan casos preexistentes de la enfermedad. Un efecto similar puede alcanzarse al incluir en una composición uno o más péptidos que comprenden uno o más epítopos antigénicos y uno o más péptidos que comprenden uno o más lugares de
adhesión.

Un conjunto de especies de mamíferos pueden vacunarse contra las caries dentales empleando los polipéptidos del invento. La vacunación en humanos es particularmente deseable.

Las composiciones del invento pueden administrarse a los mamíferos, incluidos humanos, por cualquier ruta apropiada. Las rutas adecuadas incluyen aplicación tópica bucal, administración oral por medio de comprimidos o cápsulas y administración parenteral, incluida la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica. Las rutas de administración preferidas son la aplicación tópica bucal y la inyección, típicamente la inyección subcutánea o intramuscular, con vistas a efectuar inmunización sistémica.

Según se indicó previamente, los polipéptidos de acuerdo con el invento pueden mezclarse también con otros antígenos de inmunogenicidad diferente.

Las composiciones del invento pueden administrarse solas al individuo o en un liposoma o asociadas con otras moléculas distribuidoras. La dosis eficaz depende de muchos factores, tales como si se usa una molécula distribuidora, la ruta de administración y el tamaño del mamífero vacunado. Las dosis típicas son de 0,1 a 100 mg del polipéptido del invento por dosis, por ejemplo 0,1 a 1 mg, y 1 a 5 mg, 5 a 10 mg y 10 a 100 mg por dosis. Se prefieren las dosis desde 1 hasta 5 mg.

Los calendarios posológicos variarán de acuerdo con, por ejemplo, la ruta de administración, la especie del receptor y la afección del receptor. Sin embargo, se preven dosis únicas y dosis múltiples repartidas durante un periodo de días, semanas o meses. Un régimen para la administración de una composición de la vacuna del invento a pacientes humanos jóvenes consistirá convenientemente en: 6 meses, 2 años, 5 años y 10 años, siendo la dosis inicial acompañada por adyuvante y siendo las dosis subsiguientes de aproximadamente ½ hasta ¼ el nivel del polipéptido en la dosis inicial. La frecuencia de administración puede, sin embargo, determinarse mediante monitorización de los niveles de anticuerpo en el paciente.

Donde los péptidos del invento se aplican tópicamente en la boca, un régimen de dosis preferido es aplicar uno o más polipéptidos del invento en dos o más ocasiones, por ejemplo de 2 a 10 ocasiones durante un periodo de unas pocas semanas, por ejemplo de una a seis semanas. Un régimen particularmente preferido de este tipo implica seis aplicaciones de un polipéptido del invento durante un periodo de tres semanas.

Las dosis típicas para cada aplicación tópica están en el intervalo de 0,1 a 100 mg, por ejemplo 0,1 a 1 mg, 1 a 10 mg y 10 a 100 mg. Se prefieren las dosis desde 1 hasta 5 mg para cada aplicación.

En tanto es posible administrar solos los polipéptidos del invento, es preferible presentarlos como formulaciones farmacéuticas. Las formulaciones del presente invento comprenden al menos un ingrediente activo, un polipéptido del invento, junto con uno o más vehículos apropiados del mismo y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos. El vehículo o vehículos deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no nocivos para los receptores del mismo, por ejemplo liposomas.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas y no acuosas de inyección, las cuales pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, antibióticos bactericidas y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes y liposomas y otros sistemas de micropartículas que están diseñados para dirigir el compuesto hacia los componentes de la sangre o hacia uno o más órganos.

En particular, los polipéptidos del invento pueden acoplarse a lípidos o carbohidratos. Esto aumenta su capacidad para adherirse a los dientes, bien prolongando la duración de la adhesión o aumentando su afinidad, o ambos. Esto es particularmente deseable para los polipéptidos más cortos del invento, los cuales comprenden hasta aproximadamente 40 aminoácidos.

De las formulaciones posibles, las soluciones estériles acuosas y no acuosas sin pirógeno son las preferidas. También se prefieren las formulaciones en las que los polipéptidos del invento están contenidos en liposomas. Las soluciones y suspensiones de inyección pueden prepararse extemporáneamente a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles de la clase de los previamente descritos.

Los métodos orales de administración pueden producir un efecto sistémico o local en la boca. Las preparaciones activas oralmente pueden formularse en cualquier vehículo adecuado, tal como un gel, pasta de dientes, enjuage bucal o chicle.

Debe entenderse que, además de los ingredientes particularmente mencionados con anterioridad, las formulaciones de este invento pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión.

En consecuencia, el presente invento se refiere a un método de vacunación de un hospedante mamífero contra las caries dentales o de tratamiento de las caries dentales; tal método comprende administrar al hospedante una cantidad eficaz de una composición farmacéutica según se describe anteriormente, por ejemplo una composición de vacuna.

Los anticuerpos, incluyendo los anticuerpos monoclonales, pueden formularse por inmunización pasiva según se indica anteriormente para la formulación de polipéptidos del invento. Las formulaciones preferidas para la inmunización pasiva incluyen formulaciones sólidas o líquidas tales como geles, pastas dentales, enjuagues bucales o chicles.

Un aspecto adicional del invento presente es una vacuna de ácido nucleico desnudo. En esta realización, la composición de la vacuna comprende un ácido nucleico, típicamente un ácido nucleico aislado, preferentemente ADN, más que un polipéptido. El ácido nucleico se inyecta en un hospedante mamífero y se expresa in vivo, generando un polipéptido del invento. Esto estimula una respuesta de células T, lo que conduce a inmunidad protectora frente a las caries dentales del mismo modo que la vacunación directa con un polipéptido del invento.

La vacunación con ácido nucleico desnudo puede llevarse a cabo con cualquier ácido nucleico de acuerdo con el invento, en tanto que codifique un polipéptido que estimule la respuesta de células T y/o células B. Los polipéptidos preferidos son los que se muestran en las SEQ ID nº 2 a 9 y 11. Éstos se incluirán típicamente dentro de un vector de expresión, según se define anteriormente. En tal vector de expresión, el ácido nucleico, de acuerdo con el invento, típicamente estará unido de forma operativa a un promotor capaz de dirigir su expresión en una célula hospedante de mamífero. Por ejemplo, los promotores de genes virales que se expresan en las células de mamífero tales como el promotor del gen inmediato temprano del citomegalovirus (CMV) son adecuados. También son adecuados los promotores de genes de mamíferos que se expresan en la mayoría o todos los tipos celulares de mamíferos, tales como los promotores de los "genes de mantenimiento celular" ("housekeeping genes"). Uno de estos promotores es el promotor de la p-hidroxi-metil-CoA-reductasa (HMG) (Gautier et al., Nucleic Acids Research, 17:8839, 1989).

Para la vacunación con ácido nucleico desnudo, se prefiere que la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el invento se incorpore dentro de un vector plasmídico, dado que se ha encontrado que el plásmido de ADN circular cerrado covalente (CCC) puede tomarse directamente por las células musculares y expresarse sin integrarse dentro del ADN genómico celular (Ascadi et al., The New Biologist, 3:71-81, 1991). La vacuna de ácido nucleico desnudo puede prepararse como cualquiera de los tipos de formulación mencionados anteriormente con respecto a las vacunas convencionales basadas en polipéptidos. Sin embargo, las preferidas son las formulaciones adecuadas para la inyección parenteral, especialmente para la inyección intramuscular. Las vacunas de ácido nucleico desnudo pueden administrarse de cualquiera de las formas mencionadas anteriormente con respecto a las vacunas convencionales basadas en polipéptidos, pero se prefiere la inyección intramuscular.

En consecuencia, el invento presente proporciona una composición de vacuna que comprende una secuencia de ácido nucleico o vector, según se describe anteriormente, y un vehículo aceptable.

Los siguientes ejemplos ilustran el invento.

Ejemplos Materiales y métodos

Materiales. Los aminoácidos Fmoc, el hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris (pirrolidino) fosfonio (PyBOP) y la resina Rink amida MBHA se adquirieron de Calbiochem-Novabiochem (RU) Ltd., (Nottingham, RU). La dimetilformamida, el ácido trifluoroacético, el dietil éter, el diclorometano y la piperidina se adquirieron de Romil Chemicals Ltd. (Loughborough, RU). La diisopropiletilamina fue de Aldrich Chemical Co. (Dorset, RU). Los oligonucleótidos se adquirieron de Oswel DNA Service (Universidad de Edimburgo, Edimburgo, RU).

Bacterias y condiciones de cultivo. La cepa de Guy de S. mutans (serotipo c) se cultivó en medio basal 10L suplementado, según se describe previamente (Russel et al., Arch Oral Biol., 2137, 1978; Russel et al., Infect Immun., 61:5490, 1980) a 37ºC durante 72 h para la preparación de SA I/II. Para el ensayo de adhesión, se cultivaron S. mutans en caldo de Todd-Hewitt (Laboratorios Difco, Detroit, Mich.). Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen Inc., Madison, Wis.), albergando pET15b, se cultivaron a 37ºC en caldo de Luria-Bertani suplementado con carbenicilina (50 \mug/ml) y la expresión de la proteína recombinante se indujo con isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido (1 mM).

Antígenos. SA I/II se preparó a partir de S. mutans (serotipo c, cepa de Guy), según se describe por Russel et al (Infect Immun., 28:486, 1980). Empleando el procedimiento de Munro et al (Infect Immun., 61:4590, 1993), la porción del gen que codifica los residuos 984-1161 se amplificó usando los cebadores oligonucleótidos:

(5') ATACATATGCCAACTGTTCATTTCCATTACTTT (SEQ ID nº 25) y

(3') GCCATTGTCGACTCATTCATTTTTATTAACCTTAGT (SEQ ID nº 26), clonado dentro de pET15b (modificado por la adición de un lugar Sal I) y expresado en E. coli.

Péptidos sintéticos. Las amidas peptídicas (20meros solapados por 10 residuos) se sintetizaron sobre resina Rink amida MBHA en bolsas de polipropileno poroso selladas mediante el procedimiento de síntesis múltiple simultánea de péptidos (Houghten, PNAS, 892:5131, 1985) empleando química Fmoc. PyBOP se empleó como agente acoplante y los aminoácidos Fmoc se activaron in situ por adición de diisopropiletilamina. Después de 20 ciclos de síntesis, la resina se lavó con dimetilformamida seguido de diclorometano y los péptidos se separaron por incubación en ácido trifluoroacético:etanoditiol:anisol:fenol:H_{2}O (82,5:2,5:5:5:5; v/v/v/p/v) durante 2 h a temperatura ambiente. Los péptidos se precipitaron por adición de 5 volúmenes de éter, se recuperaron por centrifugación y se lavaron tres veces con éter. Finalmente, los péptidos se disolvieron en agua y se liofilizaron. La escala de síntesis fue 50 \mumol. Las alícuotas de cada péptido se hidrolizaron en 6 M de HCl a 110ºC durante 24 h y las composiciones se determinaron empleando el analizador automático Beckman 121MB (Beckman Instruments Ltd., Bucks, RU). En cada caso la composición se adecuó a la predicha.

Anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales (MAb), L243 (anti-MHC de clase II) y W6/32 (anti-MHC de clase I), se produjeron a partir de cultivos de hibridomas obtenidos de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, Md, EE.UU.). El Dr. P. Shepherd (Departamento de Inmunología, UMDS, Guys Hospital, Londres, RU) suministró ID4, un control de isotipo (IgG2a) apareado de especificidad irrelevante. El antisuero anti-SA I/II de conejo se preparó según se describe previamente (Russel et al. Infect Immun., 28:486, 1980).

Ensayo linfoproliferativo. La sangre desfibrinada de voluntarios se separó sobre un gradiente de Ficoll. Los sueros se emplearon para los ensayos de anticuerpos (véase a continuación), mientras que las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, del inglés peripheral blood mononuclear cells) se lavaron y se resuspendieron en RPMI 1640 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, EE.UU.) suplementado con 2 mM de L-glutamina, penicilina (100 UI/ml), sulfato de estreptomicina (100 \mug/ml) y 10% de suero autólogo inactivado por calor. Se cultivaron las PBMC (10^{5} células/pocillo) en placas de fondo redondo de 96 pocillos (Costar, Cambridge, Mo, EE.UU.) en un volumen total de 200 \mul. Tres réplicas de cada cultivo se incubaron con tres concentraciones (1, 10 y 40 \mug/ml) de SA I/II, fragmentos recombinantes, control no recombinante o péptidos sintéticos. La incubación fue a 37ºC en una atmósfera humidificada con 5% de CO_{2} durante 6 días. Cada cultivo recibió 0,2 \muCi (7,4 kBq) de [^{3}H]-timidina (Amersham International, Bucks, RU) 6 h antes de la recogida. Los cultivos se recogieron sobre filtros de fibra de vidrio empleando un recolector Minimal Cell de Dynatech (Chantilly, VA, EE.UU.) y la incorporación de [^{3}H]-timidina se midió empleando el contador de líquido de centelleo LKB (Bromma, Suecia). La proliferación se expresó como índice de estimulación, que es la media de cuentas por minuto (c.p.m.) de antígeno estimulado dividido por los c.p.m. de los cultivos sin antígeno. La concanavalina A (10 \mug/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, EE.UU.) se empleó con cada cultivo como un control positivo, pero los resultados no se exponen.

La dependencia de MHC de las respuestas proliferativas a SA I/II se determinó cultivando las células con antígeno (10 \mug/ml), como arriba, en presencia de los MAb L235, W6/32 o ID4 a 1, 10 y 20 \mug/ml. Los cultivos se incubaron con [^{3}H]-timidina, se recogieron y la incorporación de [^{3}H]-timidina se determinó según se describe anteriormente.

ELISA para anticuerpos del suero. El reconocimiento por parte de los anticuerpos de los péptidos sintéticos se determinó mediante ELISA. Los péptidos (10 \mug/ml) en tampón fosfato salino (PBS, del inglés phosphate buffered saline) se adsorbieron a los pocillos de las placas de microtitulación de poliestireno (Dynatech) durante 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y los pocillos se trataron con 1,5% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA, del inglés bovine serum albumen) durante 1 h a temperatura ambiente para bloquear los lugares sin unir. Después del lavado, los péptidos unidos se incubaron con sueros diluidos en serie por duplicado. Los anticuerpos IgG unidos se determinaron por incubación con anti-Ig humana en cabra conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma Chemical Co.) y la subsiguiente reacción con fosfato de paranitrofenilo (Sigma Chemical Co.). Las placas se leyeron a 405 nm empleando un lector de microplacas modelo 450 (Bio-Rad). Después del escrutinio inicial, el ensayo se repitió al menos 3 veces con cada suero, empleando un set restringido de péptidos. SA I/II (2 \mug/ml) se incluyó en cada ensayo, como lo fue un péptido irrelevante, HQAAMQIIRDIINEEAADWD (SEQ ID nº 27), derivado a partir de la secuencia de SIV p27. Los resultados se expresan como la dilución más elevada que da una absorbancia \geq 0,2.

Transferencia Western. Las respuestas de los anticuerpos séricos también se sometieron a ensayo por transferencia Western empleando SA I/II, los polipéptidos recombinantes y una fracción control de E. coli BL21 que alberga pET15b no recombinante. Los antígenos purificados se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE), con geles de 10% de acrilamida, empleando un sistema de minigeles (Hoeffer Scientific Instruments, San Francisco, Co, EE.UU.). Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa con un transferidor semi-seco (Sartorius A. G., Gottingen, Alemania). Las tiras de nitrocelulosa se bloquearon con 5% (p/v) de leche desnatada en polvo, 2,5% (p/v) de BSA en tampón salino de Tris-HCl (pH 8,0) que contenía 0,05% (p/v) de Tween 20. Las tiras se incubaron posteriormente con sueros humanos (dilución 1 en 20) o con antisuero anti-SA I/II de conejo (dilución 10^{-4}) y el anticuerpo unido se visualizó empleando un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina con 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato y azul de nitrotetrazolio (Sigma Chemical Co.) como sustratos. Cada suero se sometió a ensayo tres veces y las respuestas se consideraron positivas si las bandas fueron visibles en al menos dos
ensayos.

Ensayo de adherencia bacteriana. La adherencia mediada por SA I/II de S. mutans (cepa de Guy) a la saliva se sometió a ensayo determinando la unión de bacterias marcadas con [^{3}H]-timidina a saliva adsorbida a los pocillos de microtitulación. La saliva humana fresca recogida a partir de un único donante se aclaró mediante centrifugación durante 10 min a 3.000 g, se inactivó por calor a 60ºC durante 30 min y, finalmente, se aclaró por centrifugación a 17.000 g durante 20 min. La saliva tratada se diluyó con un volumen igual de PBS y se adsorbió a los pocillos de una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos de fondo redondeado (Immulon 4; Dynatech) durante 2 h a temperatura ambiente. Después de recubrirlos, los pocillos se lavaron tres veces con PBS y los lugares sin unir se bloquearon por incubación con 1,5% (p/v) de BSA en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron entonces tres veces con 50 mM de KCl, 1 mM de CaCl_{2}, 38 mM de MgCl_{2}, 1 mM de KH_{2}PO_{4}, 1,2 mM de K_{2}PO_{4} (pH 7,2; tampón de adherencia). Las células de S. mutans de un cultivo de toda la noche en caldo de Todd-Hewitt se emplearon para inocular (1/10 de volumen) otro cultivo en caldo de Todd-Hewitt que contenía 100 \muCi (3,7 MBq) de [^{3}H]-timidina (Amersham International plc) por ml. Las células se recogieron en la fase logarítmica tardía (O.D. a 700 nm de aproximadamente 0,4), se sedimentaron por centrifugación a 1.000 g durante 10 min y se lavaron tres veces en tampón de adherencia. La suspensión final se agitó con 0,5 volúmenes de bolas de vidrio para fragmentar las cadenas de cocos, lo que se monitorizó microscópicamente (Munro et al., Infect Immun., 61:4590, 1993). Las células se resuspendieron hasta 5 x 10^{4} c.p.m. por 50 \mul y se añadió BSA hasta 1,5% (p/v). La actividad específica de las células de S. mutans lavadas se estimó en 1,3 x 10^{-3} c.p.m. por célula (Munro et al., Infect Immun., 61:4590, 1985). En la inhibición competitiva de la adherencia, los diversos péptidos sintéticos se añadieron a los pocillos (a concentraciones finales de 62,5-500 \muM) en 50 \mul de tampón de adherencia que contenía 1,5% (p/v) de BSA junto con 50 \mul de suspensión de S. mutans marcada radiactivamente. Las placas de microtitulación se incubaron a 37ºC durante 2 h con agitación suave y, posteriormente, se lavaron diez veces con tampón de adherencia. Las células de S. mutans unidas se eluyeron con 1% (p/v) de SDS y se transfirieron a filtros de fibra de vidrio empleando el recolector de células Micromate 196 (Canberra Packard, Berks, RU). Los filtros se contaron empleando el contador directo Matrix 96 (Canberra Packard). La unión de fondo se determinó sobre los pocillos a los que no se adsorbió saliva. El porcentaje de unión de S. mutans a la saliva se calculó mediante la fórmula [(c.p.m. de la prueba) - (c.p.m. del control)/c.p.m. totales] x 100. El porcentaje de inhibición de la adherencia se calculó como [(porcentaje de adherencia sin inhibidor - porcentaje de adherencia con inhibidor)/porcentaje de adherencia sin inhibidor] x 100. Para las proteínas, las determinaciones de la adhesión estreptocócica se realizaron por triplicado o cuadruplicado en cada concentración de proteína, mientras que para los péptidos se realizaron duplicados de las determinaciones. En cada caso el ensayo se llevó a cabo al menos tres
veces.

Estadística. La prueba de la t de Student se empleó para analizar los resultados.

Ejemplo 1

Preparación de un panel de péptidos sintéticos solapantes y análisis de sus propiedades Mapeo del epítopo de células T

Se preparó un panel de 32 péptidos sintéticos solapantes, expandidos sobre los residuos 803-1174 de SA I/II, según se describe anteriormente (véase la Figura 1). Las respuestas proliferativas de las PBMC de 30 individuos se determinó por estimulación con los péptidos (véase la Figura 2). Todos los individuos respondieron al menos a un péptido con un intervalo de banda de 1-8 péptidos y una media de 4,4 péptidos. De acuerdo con la frecuencia de respuesta de cada péptido (S.I. \geq 3,0; c.p.m. > 500) se identificaron 3 epítopos inmunodominantes; los péptidos 803-822, 975-994 y 985-1004, cada uno rindiendo frecuencias > 50% (Fig. 1). Dado que la mayoría de los individuos (13/15) que respondieron al péptido 975-994 también respondieron al péptido 985-1004, es probable que un único epítopo de células T esté presente dentro de los residuos 975-1004. También se identificaron epítopos menores de células T dentro de los péptidos 1005-1024, 1015-1034, 1085-1104 y 1115-1134 con frecuencias > 20% y algunos de los péptidos adyacentes pueden representar epítopos únicos de células T.

Restricción del MHC de las respuestas linfoproliferativas (véase la Figura 3 y la Tabla 2)

La restricción del HLA de la respuesta de células T se estudió primero por inhibición dependiente de la dosis con MAb al antígeno HLA de clase I y II (Fig. 2). La respuesta linfoproliferativa se inhibió en un 50% con 1 \mug del MAb de HLA de clase II (L243) y 10 \mug del MAb inhibieron el 100% de las respuestas (desde SI 10,0 \pm 3,2 hasta SI 1,5 \pm 0,4). Ni el MAb de HLA de clase I (W6/32) ni el isotipo control indujeron ninguna inhibición de la respuesta linfoproliferativa.

Se determinó el HLA-DR de 17 individuos y 6 de éstos fueron homocigotos. Las respuestas de los epítopos inmunodominantes y menores se estudiaron entonces en los 6 individuos homólogos para DR (Tabla 2). Sólo el péptido 975-994 pareció estar restringido por HLA-DR1. Los otros 6 péptidos estimularon los linfocitos de HLA-DR1, 2 (salvo AA 1085-1104) y DR6 (salvo AA 803-822). DR5 se restringió por el péptido 803-922, aunque este último estimuló los linfocitos con antígenos DR1, 2 y 3. Los linfocitos con antígeno DR3 o 4 respondieron a los péptidos 3 o 4. Los resultados sugieren que, salvo el péptido 975-994, los 6 péptidos restantes parecen ser promiscuos, dado que estimularon los linfocitos con antígenos 3 a 5 de HLA-DR.

TABLA 1 La relación entre HLA-DR1-6 y las respuestas de las células T a 7 péptidos sintéticos

1

Mapeo del epítopo de células B (véase la Figura 4)

El reconocimiento de los fragmentos recombinantes se evaluó por transferencia Western. Las transferencias representativas obtenidas con sueros de 3 individuos se muestran en la Fig. 3, junto con un control positivo que emplea antisuero anti-SA I/II de conejo. En el panel a, SA I/II y 984-1161 se reconocieron de manera potente. El antisuero anti-SA I/II de conejo empleado como control positivo (panel d) reconoció el 984-1161 recombinante. También se analizó el polipéptido recombinante correspondiente a los residuos 984-1161. Todos los individuos reconocieron SA I/II. Los epítopos de células B se mapearon mediante ELISA empleando el panel de péptidos sintéticos. El panel de péptidos se escrutó con sueros de 22 individuos, y 8 péptidos reconocidos por más de un individuo junto con un péptido que no fue reconocido se seleccionaron para análisis posteriores (Fig. 5). Todos los individuos reconocieron SA I/II, siendo la media de log_{2} del título de 7,6 \pm 1,2. Los títulos frente a los péptidos fueron más bajos, siendo sólo el del péptido 824-843 (media del log_{2} del título de 4,7 \pm 1,1) significativamente mayor que el título frente al péptido control SIV p27 (t = 7,28, p < 0,01). La proporción de títulos significativos (> media + 2 desviaciones estándar) también se calculó (Fig. 5) y sólo el péptido 824-843 mostró frecuencia elevada (18/22). De hecho, un epítopo inmunodominante de células B está presente dentro del péptido 824-843, posiblemente compartido con el péptido solapante 834-853, mientras que los péptidos 925-944, 1035-1054 y 1085-1104 contituyen epítopos menores de células B. A pesar de la elevada frecuencia de respuestas al polipéptido recombinante 984-1161 descrito anteriormente, se observó una frecuencia muy baja de respuestas a péptidos dentro de esta región.

Las muestras de saliva de los sujetos se cultivaron para determinar los niveles de S.mutans. Se detectó S. mutans en el 66% de los individuos (intervalo de 10^{3}-10^{5} unidades formadoras de colonias/ml). No hubo correlación entre los niveles de S. mutans y el reconocimiento de epítopos particulares o el título frente a SA I/II.

Mapeo del epítopo de adhesión

La adherencia de S. mutans a los pocillos de microtitulación recubiertos de saliva (un modelo de la superficie del diente) se determinó con S. mutans marcada con [^{3}H]-timidina. La proporción de bacterias adheridas estuvo en el intervalo de 1-5%. En ausencia de saliva, la proporción de bacterias adheridas fue < 0,1%.

En una serie de ensayos de inhibición competitiva, el panel de péptidos sintéticos se sometió a ensayo para inhibir la adhesión de S. mutans a los pocillos de microtitulación recubiertos de saliva. Los péptidos 1005-1024, 1025-1044 y 1085-1104 inhibieron firmemente la adhesión, siendo la inhibición máxima \geq 90% a concentraciones de 500 \muM (Fig. 6). Los péptidos adyacentes 1015-1034 y 1095-1114 mostraron una inhibición más variable y menor y pueden formar parte de los epítopos de adhesión.

Ejemplo 2

Construcción de un vector de expresión y expresión de un polipéptido recombinante del invento (SEQ ID nº 8)

Empleando los cebadores oligonucleotídicos TAT CAT ATG CAA GAT CTT CCA ACA CCT CCA TCT ATA (5') (SED ID nº 29) y GTC GAC TCA TAC CAA GAC AAA GGA AGT TGT (3') (SEQ ID nº 30) se amplificó la parte del gen de SA I/II que codifica los residuos 975-1044 (SEQ ID nº 8) mediante la reacción en cadena de la polimerasa. El fragmento amplificado del gen (con los lugares de las enzimas de restricción Nde I y Sal I introducidos) se clonó empleando el sistema de clonaje Ta y se sublonó dentro del plásmido pET15b. El polipéptido recombinante se expresó en E. coli BL21 (DE3).

Ejemplo 3

Estimulación de una respuesta de células T in vitro por el polipéptido recombinante (SEQ ID nº 8)

Los linfocitos de sangre periférica de voluntarios humanos se prepararon como se describe anteriormente. Las células se incubaron con el polipéptido recombinante purificado 975-1044 a concentraciones de 40, 10 y 1 \mug/ml. Las células se incubaron también con una fracción proteica preparada del mismo modo a partir de E. coli que no albergaba el plásmido recombinante. Se determinaron las respuestas proliferativas de 17 individuos. El índice de estimulación media (\pm d.t.) fue 11,6 \pm 2,3 comparado con 2,4 \pm 0,3 para el control. La frecuencia de individuos respondedores (es decir, aquellos con índice de estimulación \geq control + 2 DE) fue de 15/17.

Ejemplo 4

Inmunización de ratones con el polipéptido recombinante (SEQ ID nº 8) (véase la Figura 7)

i) Los grupos de ratones (3-4 por grupo) se inmunizaron con 975-1044 (SEQ ID nº 8) por dos vías:

a)

intraperitonealmente, con 50 \mug de polipéptido en adyuvante incompleto de Freund, con un refuerzo tras 4 semanas (también 50 \mug en adyuvante incompleto de Freund e intraperitonealmente).

b)

subcutáneamente. Una inmunización única con 50 \mug de polipéptido en adyuvante incompleto de Freund.

ii) Los nódulos linfáticos de drenaje se eliminaron 10 a 14 días después de la inmunización, se agruparon y homogeneizaron para dar una única suspensión celular en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato, 50 mM de 2-mercaptoetanol, 100 u/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, 100 mM de HEPES y 5% de suero bovino fetal. Las células (2 x 10^{5}/pocillo) se cultivaron con antígeno y la proliferación se midió por la incorporación de [^{3}H]-timidina, según se describe anteriormente. Los antígenos fueron polipéptidos recombinantes de SA I/II, péptidos expandiéndose sobre los residuos 975-1044 y una fracción proteica control de E. coli sin plásmido recombinante.

Como en la Figura 7, todas las cepas de ratón respondieron a SA I/II y al polipéptido recombinante 975-1044 (SEQ ID nº 8). Las respuestas positivas a los péptidos fueron las de índice de estimulación \geq 3,0 (c.p.m. > 500). Los ratones SJL respondieron al péptido 985-1044 y los ratones DBA/a respondieron a los péptidos 975-995 y 985-1044. Para los ratones BALB/c, no se observaron respuestas significativas a los péptidos, aunque la respuesta al péptido 985-1044 fue superior que las respuestas al resto de péptidos.

iii) Reconocimiento de anticuerpos (véase la Tabla 2)

Los sueros de ratones inmunizados intraperitonealmente con el polipéptido 975-1044 reconocieron células intactas de S. mutans, SA I/II intacto y 975-1044 recombinante. También reconocieron los péptidos 995-1014 y 1025-1044. El título para cada cepa fue como se muestra en la Tabla 2, la cual muestra log_{2} de los títulos donde la dilución inicial fue de 1 en 50 (título = 1).

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TABLA 2 Reconocimiento de anticuerpos de S. mutans, SA I/II y péptidos

2

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Ejemplo 5

Análisis de la interacción entre el antígeno estreptocócico I/II y el receptor salivar empleando BIAcore Objetivos

En este estudio los autores han empleado resonancia en un plasmón de superficie (spr, del inglés surface plasmon resonance) para analizar la interacción entre el SA I/II purificado y la saliva humana total o el receptor salivar purificado. Además, los autores han investigado la dependencia de calcio de la unión, han identificado aminoácidos individuales que pueden estar implicados en la unión y han determinado la afinidad de la interacción entre SA I/II y el receptor salivar.

Métodos Materiales

SA I/II y los polipéptidos recombinantes se prepararon según se describe anteriormente. El receptor salivar se preparó por adsorción de la saliva total con células intactas de S. mutans (Lee et al., Infect Immun., 57:3306-3313, 1989). Las células se lavaron con KPBS (2,7 mM de KCl, 137 mM de NaCl en 1,5 mM de KH_{2}PO_{4}, 6,5 mM de Na_{2}HPO_{4}, pH 7,2) y el material adsorbido se eluyó con 1 mM de EDTA en KPBS. El análisis del material purificado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de sodio dodecil sulfato indicó la presencia de componentes de Pm > 200.000 y aproximadamente 40.000. Los péptidos se prepararon mediante el procedimiento de síntesis múltiple simultánea de péptidos (Houghten, Proc Natl Acad Sci USA, 82:5131-5135, 1985), como anteriormente. Además, se sintetizó una serie de péptidos correspondientes a los residuos 1025-1044 en los que cada residuo a su vez se sustituyó por alanina.

Análisis de unión

SA I/II o el receptor salivar purificados se inmovilizaron sobre una superficie sensora de chip a una concentración de 100 \mug/ml en 10 mM de formato sódico pH 3,5, empleando el kit acoplador de amina (Pharmacia Biosensor).

i. Estudios de inhibición

La unión de SA I/II inmovilizado a los receptores en la saliva total se determinó en ausencia y en presencia de inhibidores (a varias concentraciones). Se analizó la inhibición por los péptidos alanina-sustituidos a una concentración peptídica de 50 \muM. El tampón de migración fue HEPES tamponado salino (HBS, del inglés HEPES buffered saline) y la superficie se regeneró con 100 mM de HCl.

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ii. Unión directa

El receptor salivar purificado se inmovilizó sobre el chip sensor y se determinó la unión de SA I/II o de los fragmentos de los polipéptidos recombinantes purificados.

Resultados i. Dependencia del calcio

En determinaciones separadas con saliva total, la unión a SA I/II inmovilizado varió desde aproximadamente 250 unidades de resonancia (UR) hasta 800 UR. En presencia de EDTA, la unión se inhibió con inhibición máxima de 95% a una concentración de 10 mM de EDTA. Los ensayos de unión subsiguientes se realizaron en presencia de 5 mM de calcio.

ii. Inhibición de la unión

SA I/II o los fragmentos de los polipéptidos recombinantes purificados 1 (residuos 39-481), 2 (residuos 475-824), 3 (residuos 816-1213), 4 (residuos 1155-1538) y 984-1161 recombinante se añadieron a la fase fluida de la saliva como inhibidores competitivos a concentraciones que fluctuaban desde 0-20 \muM. SA I/II inhibió la unión más eficazmente, con aproximadamente un 90% de inhibición a una concentración de 6 \muM (Fig. 8). De los fragmentos recombinantes, sólo el fragmento 3 y r984-1161 inhibieron la unión a los receptores salivares de forma más significativa que el control (albúmina sérica bovina) con inhibición máxima de 65% y 50%, respectivamente (Fig.8).

Un panel de péptidos sintéticos (20meros solapantes en 10) que se expandían a lo largo de los residuos 803-1174 se sometieron a ensayo para determinar la actividad inhibitoria. El péptido 1025-1044 fue el inhibidor más eficaz, aunque se precisaron concentraciones 10-20 veces más elevadas que para los polipéptidos (Fig. 9). Un panel de péptidos en los que cada uno de los residuos 1025-1044 a su vez se sustituyó por alanina (alanina se sustituyó por serina donde estaba ésta de forma natural) se sometió a ensayo para actividad inhibitoria. La sustitución de Glu (1037) abolió firmemente la inhibición mediada por el péptido (Fig. 10). De forma similar, la sustitución de Gln 1025, Thr 1039, Phe 1041, Val 1042, Leu 1043 y Val 1044 redujo la inhibición de la unión que era mediada por el péptido 1025-1044.

iii. Unión directa

Para estos análisis, el receptor salivar purificado se inmovilizó sobre el sensor del chip y se determinó la unión a la fase fluida de SA I//II o a los polipéptidos recombinantes. A una concentración de aproximadamente 5 \muM, tanto SA I/II como SA I/II recombinante se unieron al receptor salivar en el intervalo 500-600 UR (Fig. 11). La unión de los polipéptidos recombinantes se determinó a una concentración de aproximadamente 20 \muM y la unión más alta se obtuvo con el fragmento 3 (1.256 UR) (Fig. 11). La unión de otros fragmentos, aunque significativamente mayor que el control de miosina, no fue mayor que el control de albúmina sérica bovina y, de este modo, no parece ser específica. La adición de EDTA (10 \muM) en este ensayo inhibió por completo la unión de la fase fluida de SA I/II.

Las constantes de afinidad y velocidad para la interacción adhesina-receptor se determinaron para SA I/II, SA I/II recombinante y fragmento 3 (Tabla 3). Los valores indican una afinidad de interacción baja con una constante de velocidad de asociación baja y una relativamente rápida constante de disociación.

Conclusiones

Estos análisis confirman que los residuos 816-1213 de SA I/II forman una región aglutinante de adhesión y que dentro de esta región, el péptido 1015-1044 forma un epítopo de adhesión. Los autores ahora han extendido estos hallazgos al identificar residuos específicos que pueden ser esenciales para la unión al receptor salivar, específicamente los residuos 1025, 1037, 1039 y 1041-1045. La unión es sensible a EDTA y, bajo las condiciones del ensayo, es de afinidad relativamente baja.

TABLA 3

3

Información de las secuencias

Como resultado de los experimentos detallados anteriormente, las secuencias siguientes se han identificado como de particular interés.

(i)

Residuos 925 a 1114 (SEQ ID nº 1). Esta secuencia comprende las secuencias (iv) y (v) posteriores e incluye 2 series de epítopos solapantes de células T, células B y de adhesión, un epítopo adicional de células B, un epítopo adicional de células T y un lugar de adhesión.

SEQ ID nº 1:

4

Su secuencia de ADN es (SEQ ID nº 12):

5

(ii)

Residuos 1005 a 1044 (SEQ ID nº 2). Ésta comprende un epítopo de células T solapando dos lugares de adhesión.

SEQ ID nº 2:

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6

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Su secuencia de ADN es (SEQ ID nº 13):

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7

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(iii)

Residuos 1085 a 1104 (SEQ ID nº 3). Aquí, un epítopo de células T, un epítopo de células B y un lugar de adhesión se solapan.

SEQ ID nº 3:

100

Su secuencia de ADN es (SEQ ID nº 14):

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8

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(iv)

Residuos 1005 a 1114 (SEQ ID nº 4). Ésta comprende las secuencias (ii) y (iii) anteriores y, por tanto, incluye dos secuencias en las que un epítopo de células B, un epítopo de células T y un lugar de adhesión se solapan.

SEQ ID nº 4:

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9

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Su secuencia de ADN es (SEQ ID nº 15):

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10

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(v)

Residuos 925 a 1004 (SEQ ID nº 5). Ésta comprende un epítopo de células B, un epítopo inmunodominante de células T y un lugar de adhesión.

SEQ ID nº 5:

11

Su secuencia de ADN es (SEQ ID nº 16):

12

(vi)

Residuos 925 a 1054 (SEQ ID nº 6). Ésta comprende la secuencia (v) anterior, junto a un lugar de adhesión adyacente adicional y un epítopo de células B solapante adicional.

SEQ ID nº 6:

13

Su secuencia de ADN es (SEQ ID nº 17):

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14

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(vii)

Residuos 803-854 (SEQ ID nº 7). Ésta comprende un epítopo principal de células T y un epítopo inmunodominante adyacente de células B.

SEQ ID nº 7:

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15

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Su secuencia de ADN es (SEQ ID nº 18):

16

(viii)

Residuos 975 a 1044 (SEQ ID nº 8). Ésta comprende un epítopo de células T, un epítopo de células B y un lugar de adhesión.

SEQ ID nº 8:

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101

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Su secuencia de ADN es (SEQ ID nº 19):

17

(ix)

Residuos 1024 a 1044 (SEQ ID nº 9). Ésta comprende un epítopo de células T solapando con un lugar de adhesión.

SEQ ID nº 9:

102

Su secuencia de ADN es (SEQ ID nº 20):

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18

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(x)

Residuos 803 a 1114 (SEQ ID nº 10). Ésta comprende las secuencias (i) y (vii) anteriores y algún intrón. Los residuos 803 a 1114 comprenden 2 series de epítopos solapantes de células T, células B y de adhesión, un epítopo adicional de células T y un lugar de adhesión adicional y un epítopo inmunodominante de células B y un epítopo mayor de células T.

SEQ ID nº 10:

19

Su secuencia de ADN es (SEQ ID nº 21):

20

(xi)

Residuos 975 a 1004 (SEQ ID nº 11), que comprenden un epítopo de células T.

SEQ ID nº 11:

103

Su secuencia de ADN es (SEQ ID nº 22):

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21

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La secuencia de aminoácidos de SA I/II es como sigue, comenzando por el residuo nº 1 (SEQ ID nº 23):

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22

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Su secuencia de ADN es como sigue (SEQ ID nº 24):

23

24

25

Claims (17)

1. Un polipéptido que tiene la capacidad de estimular una respuesta de células T y una o más de las propiedades siguientes: (i) la capacidad de adherirse a un diente de mamífero de forma competitiva con el antígeno I/II natural de Spreptococcus mutans (SA I/II), eliminando o disminuyendo de este modo la adhesión de S. mutans al diente; y (ii) la capacidad de estimular una respuesta de células B; y seleccionado de:

(a)

un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es según se muestra en una cualquiera de las SEQ ID nº 2 a 9 u 11,

(b)

un polipéptido cuya secuencia tiene al menos una identidad de secuencia del 60% a la de un polipéptido de (a); tal polipéptido retiene las propiedades biológicas que el polipéptido de (a) tiene en común con SA I/II;

(c)

un polipéptido que comprende una secuencia que difiere de la de un polipéptido de (a) por la sustitución, deleción o inserción de desde uno hasta diez aminoácidos; tal polipéptido retiene las propiedades biológicas que el polipéptido de (a) tiene en común con SA I/II;

(d)

un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID nº 3, 9 u 11 y comprende hasta 50 aminoácidos en total, o un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID nº 2, 5, 7 u 8 y comprende hasta 100 aminoácidos en total, o un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID nº 4 o 6 y comprende hasta 200 aminoácidos en total; tal polipéptido retiene las propiedades biológicas que el polipéptido de SEQ ID nº 2 a 9 u 11 tiene en común con SA I/II; y

(e)

un polipéptido que comprende un polipéptido de (a) o (b), extendido en el C-terminal por una secuencia no silvestre que tiene cualquier secuencia aparte de la que es C-terminal de la secuencia del polipéptido de (a) en el SA I/II nativo y/o extendido en el N-terminal por una secuencia no silvestre que tiene cualquier secuencia aparte de la que es N-terminal de la secuencia del polipéptido de (a) en el SA I/II nativo; tal polipéptido retiene las propiedades biológicas que el polipéptido de (a) tiene en común con SA I/II.

2. Un polipéptido, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que, en la parte (b), el nivel de identidad de la secuencia es al menos 80%, al menos 90% o al menos 95%.

3. Un polipéptido, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que, en la parte (c), hay una sustitución, deleción o inserción de desde uno hasta cinco aminoácidos.

4. Un polipéptido, de acuerdo con la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos es la de una cualquiera de las SEQ ID nº 2 a 9 u 11.

5. Un polipéptido, de acuerdo con la reivindicación 4, cuya secuencia de aminoácidos es la de la SEQ ID nº 9.

6. Un polipéptido, de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, pero que difiere de aquellos por la deleción de un aminoácido.

7. Un polipéptido, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, cuya secuencia de aminoácidos es la de los aminoácidos 2 a 21 de la SEQ ID nº 9.

8. Un polipéptido, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el cual está glicosilado o sulfatado; o tiene un grupo amida C-terminal y/o acetilación en N-terminal.

9. Una secuencia de ácido nucleico que codifica tras expresión en una célula hospedante procariota o eucariota para un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico, de acuerdo con la reivindicación 9, unida operativamente a un promotor capaz de dirigir su expresión en una célula hospedante.

11. Una célula aislada que alberga un vector de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Una composición, de acuerdo con la reivindicación 12, que es una composición de vacuna.

14. Una composición, de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, que se formula para la aplicación tópica bucal.

15. Un polipéptido, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para uso en el tratamiento de las caries dentales.

16. Un polipéptido, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para uso en el tratamiento de las caries dentales o en la vacunación de un hospedante mamífero frente a las caries dentales por medio de aplicación tópica bucal.

17. Uso de un polipéptido, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las caries dentales, o en una vacunación de un hospedante mamífero frente a las caries dentales por medio de aplicación tópica bucal.