ES2302385T3 - Uso de epitopo(s) borrelicida(s) de la proteina c de superficie externa de borrelia burgdorferi como vacuna. - Google Patents
Uso de epitopo(s) borrelicida(s) de la proteina c de superficie externa de borrelia burgdorferi como vacuna. Download PDFInfo
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Abstract
Un fragmento polipeptídico inmunogénico aislado de OspC de Borrelia burgdorferi consistente en un epítopo de OspC de la secuencia aminoacídica como se muestra en los residuos 145 a 194 de la SEC ID Nº 2.
Description
Usos de epítopos(s) borrelicida(s)
de la proteína C de superficie externa de Borrelia
burgdorferi como vacuna.
Esta solicitud reivindica prioridad de la
solicitud provisional nº de serie 60/094.955, presentada el 31 de
julio de 1998.
Las citas bibliográficas completas de las
referencias designadas en la presente invención mediante un número
entre paréntesis pueden encontrarse en la sección de bibliografía,
inmediatamente anterior a las reivindicaciones.
Esta invención se refiere a composiciones y
métodos útiles para la prevención, el tratamiento y el diagnóstico
temprano de la enfermedad de Lyme en seres humanos y otros animales.
Más particularmente, esta invención se refiere a polipéptidos de
proteína de superficie externa (Osp) que son capaces de desencadenar
en un paciente la formación de una respuesta inmunitaria específica
que es eficaz para diagnosticar, predecir una erradicación exitosa
de la infección o proteger frente a enfermedad de Lyme en un
hospedador mamífero. Esta invención se refiere también a un método
de examen para detectar actividad de anticuerpo borrelicida
anti-Osp, a kits de diagnóstico que comprenden el
fragmento DraI-SmaI de ADN de OspC y a vacunas del
mismo junto con o sin un portador de vacuna.
La enfermedad de Lyme (borreliosis de Lyme) se
propaga por la picadura de una garrapata infectada, y es la
infección portada por garrapatas más frecuentemente reseñada en
Europa y América del Norte (1). Este trastorno multisistémico ha
causado una morbilidad significativa en todo el mundo.
La enfermedad de Lyme está causada por la
espiroqueta Borrelia burgdorferi (B.b.), que se transmite
principalmente durante la alimentación con sangre de garrapatas
Ixodes ssp. Inicialmente, las espiroquetas infectan la piel
y, en la mayoría de los casos tempranos, causan una lesión de
eritema migratorio (2). Los aquejados pueden no enfermar durante
semanas, y pueden no aparecer síntomas del sistema nervioso (dolores
de cabeza, vértigos, problemas de audición, hormigueo y problemas
de concentración) durante semanas o meses. Es ahora conocido que la
infección puede propagarse al sistema nervioso o articulaciones, y
el riesgo de complicaciones neurológicas o articulares aumenta
cuanto más tiempo permanece sin tratar la enfermedad. La infección
puede ser asintomática o tener una serie de presentaciones
clínicas, dependiendo de los tejidos afectados, la duración de la
infección, factores del hospedador tales como la vulnerabilidad del
sistema inmunitario y factores inmunogenéticos que podrían
predisponer a un paciente al desarrollo de ciertas
complicaciones.
El tratamiento de pacientes sintomáticos es
actualmente con una serie de antibióticos, por ejemplo,
tetraciclinas, penicilina y cefalosporinas, pero los estudios
muestran resultados variados. Si se deja sin tratar, las bacterias
pueden propagarse al sistema nervioso central, corazón, cerebro o
articulaciones, causando artritis, infecciones cardiacas y
problemas neurológicos, y en raros casos la muerte
(3-6).
Tras la infección con Borrelia, las
células B del cuerpo empiezan a producir anticuerpos que reconocen
al organismo extraño. Hay al menos dos tipos funcionales de
anticuerpos producidos en respuesta a una infección por
Borrelia. Una respuesta es una respuesta de
unión/opsonización (recubrimiento) no específica que "marca"
el antígeno y puede dar como resultado la ingestión de B.b.
por células fagocíticas. Estos anticuerpos no específicos se
producen contra proteínas comunes entre varias especies bacterianas
(a saber, proteínas de 41 kDa de muchos flagelos bacterianos). Por
tanto, estos anticuerpos reconocerán y se unirán a antígenos
similares en otras bacterias. Debido a esto, los ensayos de
diagnóstico que detectan estos anticuerpos de unión/opsonización no
específica son generalmente no específicos.
Una segunda respuesta de anticuerpo funcional es
la producción de anticuerpos borrelicidas (letales) que reconocen
específicamente epítopos en algunas proteínas individuales de
organismos B.b. Después de la unión de estos anticuerpos a
organismos B.b., el complemento interacciona con los
anticuerpos formando un complejo de ataque a membrana que mata el
organismo B.b. sin necesidad de captura por células
fagocíticas. Esta respuesta de anticuerpo borrelicida altamente
específica es a menudo detectable en las primeras 2 semanas de
infección. La detección e inducción exitosas de anticuerpos
borrelicidas está ganando importancia en el arsenal terapéutico de
diagnóstico y prevención de la enfermedad de Lyme.
Poco después del descubrimiento de la
borreliosis de Lyme, los investigadores determinaron que la
vacunación de animales experimentales con B.b. entera
proporcionaba protección frente a la exposición a la infección (7,
8). Estudios adicionales establecieron el papel de la protección
mediada por anticuerpo y confirmaron la capacidad de la vacunación
con B.b. de inducir anticuerpos que proporcionan protección
frente a infección por B.b. (9-11). Hasta la
fecha, la vacunación de animales con Osp de B.b.,
especialmente OspA (12-14), OspB (12, 14) y OspC
(14-16), ha proporcionado protección frente a la
infección con la espiroqueta de Lyme. Se ha mostrado que la
protección después de vacunación con OspA y OspB es debida a la
inducción de anticuerpos borrelicidas que matan específicamente los
organismos B.b. (13, 14, 17-24). En
contraposición, los anticuerpos borrelicidas
anti-OspC no se han detectado después de la
vacunación (14-16) y los investigadores han
postulado que la protección después de vacunación con OspC es
debida a otros mecanismos (16).
La mayoría de los esfuerzos hasta la fecha se
han centrado en desarrollar una vacuna de OspA principalmente
debido a las grandes cantidades de OspA expresadas en la superficie
de muchos aislamientos de laboratorio de B.b. Hasta la
fecha, la mayoría de las espiroquetas de Borrelia han tenido
superficies externas constituidas principalmente por OspA. Por lo
tanto, se ha creído que inducir anticuerpos borrelicidas contra
OspA proporcionaría protección frente a las espiroquetas. SmithKline
Beecham (Filadelfia, Pen.) y Pasteur Merieux Connaught (Lyon,
Francia) han desarrollado vacunas basadas en la generación de
anticuerpos borrelicidas contra OspA. La vacuna de SmithKline
Beecham se ha aprobado para uso genérico, y la vacuna de Pasteur
Merieux Connaught está actualmente evaluándose por la Food and Drug
Administration de EE.UU. Como cabría esperar, se ha mostrado que
las vacunas de OspA son eficaces en modelos animales cuando los
animales se han expuesto a la infección con aguja. Además, la
vacunación con OspA ha proporcionado protección frente a garrapatas
infectadas por B.b. Sin embargo, la protección frente a una
exposición a garrapata ha dependido de la presencia de altos
niveles de anticuerpos borrelicidas anti-OspA.
Schwan et al. (28) demostraron recientemente que las
espiroquetas en garrapatas infectadas regulan negativamente la OspA
en su superficie durante la ingestión de un alimento sanguíneo. Por
tanto, las vacunas de OspA deben inducir altos títulos de
anticuerpos borrelicidas anti-OspA para destruir
las espiroquetas en el intestino medio de garrapatas infectadas
antes de que regulen negativamente la OspA. Por lo tanto, la
duración de los altos títulos de anticuerpos borrelicidas
anti-OspA es un determinante crítico de la eficacia
a largo plazo de una vacuna de OspA.
Los solicitantes demostraron recientemente la
incapacidad de una vacunación comercial de OspA de mantener niveles
adecuados de anticuerpos borrelicidas anti-OspA en
seres humanos (23). Es también improbable que aparezca una
respuesta anamnésica suficientemente rápida para eliminar los
organismos B.b. de las garrapatas infectadas. En su apoyo,
se ha documentado la infección por B.b. en seres humanos y
perros vacunados con OspA (26, 27). Estos resultados destacan la
necesitad de evaluar otros componentes de vacuna de borreliosis de
Lyme.
Además, la enfermedad de Lyme se diagnostica
habitualmente detectando anticuerpos en la sangre o el fluido
cerebroespinal, pero los ensayos más habitualmente utilizados a
menudo son inexactos. Los resultados falsos negativos, y más
habitualmente falsos positivos, siguen entorpeciendo el
serodiagnóstico de enfermedad de Lyme. Se han desarrollado varios
esquemas que utilizan ensayos de diagnóstico convencionales para
detectar más exactamente la enfermedad de Lyme. Desgraciadamente,
han aparecido pocas mejoras y el diagnóstico erróneo sigue causando
efectos económicos y sanitarios significativos. Además, la reciente
aprobación de una vacuna de enfermedad de Lyme de OspA confundirá
adicionalmente los ensayos de diagnóstico convencionales. Por tanto,
sigue necesitándose un ensayo sensible y específico de enfermedad
de Lyme que pueda ponerse ampliamente a disposición en forma de un
kit comercial y pueda discriminar entre individuos vacunados y
pacientes con enfermedad de Lyme.
La detección de anticuerpos borrelicidas puede
resolver también este problema. Se ha mostrado que los anticuerpos
borrelicidas sirven como base para un ensayo de serodiagnóstico
sensible y altamente específico (17, 25-27). De
hecho, se ha desarrollado previamente, patentado (37) y está
comercialmente disponible un ensayo de diagnóstico para enfermedad
de Lyme que detecta esta respuesta de anticuerpo. Este ensayo se
basa en la detección de anticuerpos borrelicidas altamente
específicos que se inducen por varias Osp de B.b. poco
después de la infección. Es importante observar que si se inducen
niveles suficientemente altos de anticuerpos borrelicidas por la
vacunación, el vacunado está protegido. Sin embargo, si un individuo
es infectado antes de que estén presentes anticuerpos borrelicidas,
la persona puede tener enfermedad de Lyme a pesar de la presencia
eventual de altas concentraciones de anticuerpos borrelicidas. Este
ensayo proporciona un enfoque alternativo más sensible y específico
para confirmar la enfermedad de Lyme. Además, el anticuerpo
detectado por el ensayo de anticuerpo borrelicida no se
correlaciona con el anticuerpo detectado por ensayos convencionales.
En estudios en hámster, se redujo la detección de anticuerpos
borrelicidas con la eliminación de B.b. del hospedador (43).
En contraposición, las respuestas de anticuerpo detectadas por
ensayos convencionales permanecen elevadas o siguen aumentando.
Estos resultados sugieren que el ensayo de anticuerpo borrelicida es
un indicador pronóstico para la eliminación de la espiroqueta.
Callister et al. (30) mostraron
recientemente la capacidad de aumentar la sensibilidad del ensayo de
anticuerpo borrelicida manteniendo su exquisita especificidad
mediante el uso de un antígeno de ensayo (B.b. 50772) que no
contiene OspA ni OspB en la superficie. Los solicitantes proponen
que la sensibilidad aumentada con B.b. 50772 es debida a la
detección de anticuerpos borrelicidas contra OspC u otras Osp. Estos
resultados aumentan en gran medida la utilidad del procedimiento de
ensayo de anticuerpo borrelicida dado a conocer en la patente de
EE.UU. 5.385.826 de Schell et al., que se incorpora a la
presente memoria en su totalidad.
Además, varios investigadores han demostrado la
capacidad de la vacunación con OspC de proteger a animales de
laboratorio frente a exposición a la infección con aguja
(14-15) e infección natural (16). Una investigación
reciente mostró también que la transferencia pasiva de sueros
inmunes a OspC podría resolver artritis, carditis e infección por
B.b. (44). Estos resultados demuestran que la vacunación con
OspC puede ser más eficaz que las vacunaciones con OspA. Sin
embargo, puesto que no se han detectado altas concentraciones de
anticuerpos borrelicidas anti-OspC en suero inmune
(14-16), se ha especulado que son mecanismos
adicionales los responsables de la protección mediada por OspC
(16). No saber el mecanismo hace mucho más difícil buscar una vacuna
de enfermedad de Lyme de OspC. Además, la búsqueda de OspC como
candidato de vacuna de borreliosis de Lyme está dificultada porque
la OspC parece ser más heterogénea inmunológica y genéticamente que
la OspA (35-37), causando que los investigadores
especulen que el desarrollo de una vacuna integral de OspC no sería
económicamente factible. Sin embargo, Schwan et al. (28)
mostraron recientemente que se sintetizan rápidamente cantidades
relativamente grandes de OspC por B.b. poco después de la
unión de garrapatas infectadas a hospedadores mamíferos y que OspA
ya no se expresa a altas concentraciones en la superficie de
B.b.
Se ha reseñado recientemente que los organismos
B.b. regulan positivamente la OspC, y regulan negativamente
a la vez la OspA, poco antes de la inoculación de espiroqueta por
garrapata en el hospedador (31, 32). Esto explica porqué los
anticuerpos anti-OspC están entre las primeras
respuestas de anticuerpo detectadas en pacientes con borreliosis de
Lyme temprana. En respuesta, varios investigadores han intentado o
están intentando desarrollar ensayos de immunosorción ligados a
enzima (ELISA) utilizando proteínas OspC recombinantes enteras
(38-42). Estos ensayos diagnósticos han sido
razonablemente sensibles, pero les ha seguido faltando
especificidad. Además, las respuestas de anticuerpo
anti-OspC detectadas por estos ensayos pueden
permanecer elevadas o seguir aumentando incluso después de la
eliminación de B.b. del hospedador. Es particularmente
importante la tendencia de OspC a reaccionar de forma cruzada con
anticuerpos en sueros de pacientes con otras enfermedades tales
como citomegalovirus (CMV) o virus de Epstein-Barr
(EBV) y dar una reacción falsa positiva. Debido a esta falta
significativa de especificidad y la falta de potencial de
pronóstico, las ELISA de OspC siguen siendo significativamente
menos que ideales.
El documento WO 97/42221 da a conocer un método
de diagnóstico que utiliza fragmentos C-terminales
cortos de proteína OspC derivada de Borrelia burgdorferi sensu
lato. Se mostró que los cuatro aminoácidos aminoterminales
Pro-Lys-Lys-Pro eran
esenciales en la reactividad inmunitaria entre sueros de pacientes
que padecen borreliosis temprana y diversos derivados de OspC, y se
mostró que para que sea eficaz como agente de diagnóstico, deben
estar presentes residuos aminoacídicos consecutivos dados. Por lo
tanto, un agente inmunológico comprendía un homólogo de al menos
cinco residuos aminoacídicos de longitud de un fragmento idéntico a
los 10 aminoácidos C-terminales de OspC. Se dan a
conocer también vacunas que utilizan los péptidos cortos, así como
métodos para su preparación.
Según un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona un fragmento polipeptídico inmunogénico
aislado como se especifica en la reivindicación 1.
El polipéptido aislado puede consistir en los
residuos 145 a 194 de la SEC ID Nº 2.
Según un segundo aspecto de la presente
invención, se proporciona una molécula de ADN aislada como se
especifica en la reivindicación 3.
Preferiblemente, la molécula de ADN aislada
comprende un sitio de reconocimiento de DraI en su
terminación 5' y un sitio de reconocimiento de SmaI en su
terminación 3', o consiste en una secuencia de pares de bases
nucleotídicas como se muestra en los nucleótidos
433-582 de la SEC ID Nº 1.
Según un tercer aspecto de la presente
invención, se proporciona un vector de expresión como se especifica
en la reivindicación 6.
Según un cuarto aspecto de la presente
invención, se proporciona una composición farmacéutica como se
especifica en la reivindicación 7.
La composición farmacéutica puede comprender un
portador y/o coadyuvante farmacéuticamente adecuado.
Según un quinto aspecto de la presente
invención, se proporciona el uso de un polipéptido aislado como se
especifica en la reivindicación 11.
Según un sexto aspecto de la presente invención,
se proporciona un método para detectar infección por Borrelia
como se especifica en la reivindicación 12.
Preferiblemente, el método incluye detectar la
presencia de conjugación utilizando un ensayo de inmunosorción
ligado a enzima.
Según un séptimo aspecto de la presente
invención, se proporciona un kit como se especifica en la
reivindicación 14.
Ventajosamente, el polipéptido de esta invención
no es confundido por vacunaciones previas contra la enfermedad de
Lyme. La detección de anticuerpos borrelicidas
anti-OspC contra el fragmento Dra es útil para el
diagnóstico de la enfermedad de Lyme en pacientes de cualquier
parte del mundo y también para vacunación contra enfermedad de Lyme
causada por Borrelia sp. Hay 3 especies mayoritarias de
espiroquetas de la enfermedad de Lyme ahora conocidas: B.b., B.
gariniii y B. afzelii. Los inventores han detectado
anticuerpos borrelicidas anti-OspC en pacientes de
Eslovenia infectados por B. afzelii. Detectaron estos
anticuerpos borrelicidas anti-OspC utilizando
B.b. 50772, el mismo aislamiento utilizado para detectar una
respuesta en pacientes infectados por B.b. Por tanto, el
fragmento Dra de OspC parece estar conservado en todas las especies
de Borrelia.
Una ELISA basada en el fragmento Dra es un
ensayo complementario excelente para el ensayo de anticuerpo
borrelicida. Lo más importante, una ELISA basada en el fragmento
Dra se fabrica fácilmente en forma de un kit comercial y discrimina
entre pacientes vacunados con enfermedad de Lyme temprana.
Un ensayo que detecte anticuerpos borrelicidas
contra el(los) epítopo(s) borrelicida(s) de
OspA y OspB, además de OspC, proporcionaría una reactividad cruzada
reducida, una especificidad aumentada, una mayor exactitud y menos
diagnósticos falsos positivos. La detección de anticuerpos
borrelicidas anti-OspC da ventajosamente un
diagnóstico temprano, lo que los no pueden hacer los anticuerpos
borrelicidas anti-OspA y anti-OspB.
Sin embargo, la identificación del (de los) epítopo(s)
borrelicida(s) de OspB y OspA es también una adición valiosa
a un ensayo de diagnóstico.
La inclusión de epítopos borrelicidas de OspA y
OspB con el fragmento Dra de OspC proporciona también una vacuna de
borreliosis de Lyme más integral.
Aparecerán más completamente objetos y ventajas
adicionales a partir de la siguiente descripción detallada de la
realización preferida de la invención, realizada junto con las
tablas y dibujos adjuntos.
La Fig. 1 es un mapa de restricción del plásmido
pX3-33. El cuadro sombreado representa el área que
contiene el gen ospC de
S-1-10 de B.b.
La Fig. 2 es un diagrama esquemático de las
etapas utilizadas para crear el plásmido
pX2-22-Dra que codifica la proteína
de fusión OspC-fragmento Dra.
La Fig. 3 es un mapa de restricción del plásmido
pX2-22-Dra. El cuadro sombreado
representa el área que contiene el gen del fragmento Dra de
ospC de S-1-10 de
B.b.
La Fig. 4 es la secuencia de ADN y aminoacídica
codificada de la proteína de fusión del fragmento Dra. El área
recuadrada es la secuencia de ADN y aminoacídica predicha única del
fragmento Dra de OspC de S-1-10 de
B.b. Véase también la SEC ID Nº 1.
La presente invención está dirigida al
descubrimiento y la caracterización del (de los) epítopo(s)
de OspC que es (son) responsable(s) de inducir anticuerpos
borrelicidas poco después de la infección por B.b. Este
determinante antigénico proporciona un antígeno de diagnóstico
superior que detecta la infección por enfermedad de Lyme temprana,
predice la erradicación exitosa del organismo del hospedador y
discriminan entre individuos con enfermedad de Lyme e individuos
que se han vacunado con una vacuna OspA de enfermedad de Lyme.
Además, el (los) epítopo(s) borrelicida(s) de OspC es
(son) útil(es) como vacuna contra la infección por
B.b., y los anticuerpos borrelicidas generados contra el
epítopo de OspC son útiles como terapia para resolver una infección
y enfermedad por B.b. establecida.
Los inventores han descubierto anticuerpos
borrelicidas anti-OspC. El descubrimiento de
anticuerpos en sueros de enfermedad de Lyme que matan
específicamente B.b. 50772 (a continuación), un aislamiento
de garrapata que no tiene los genes para preparar OspA ni OspB,
condujo a los inventores a especular que la proteína de superficie
era OspC y que se estaba generando una respuesta de anticuerpo
borrelicida altamente específica ante esta proteína.
En un estudio anterior, Schwan et al.
(28) encontraron que cuando una garrapata se alimenta de un ser
humano, la ingestión de sangre desencadena que el organismo
B.b. regule negativamente OspA y OspB y regule positivamente
OspC. Los solicitantes especularon por lo tanto que probablemente
esto tiene algo que ver con la capacidad de la espiroqueta de pasar
de la garrapata al ser humano. La hipótesis era que la espiroqueta
debe necesitar OspC para sobrevivir en un nuevo hospedador. Por lo
tanto, se teorizó que si la espiroqueta cancela OspA y OspB, lo que
dispone a OspC en su superficie, los anticuerpos
anti-OspC pueden ser más eficaces para prevenir la
infección por B.b.
Si OspC induce verdaderamente una respuesta de
anticuerpo borrelicida de B.b. temprana, entonces se deduce
que la detección de esta respuesta de anticuerpo altamente
específica puede utilizarse para detectar la enfermedad de Lyme más
exactamente y para monitorizar la eliminación del organismo después
de terapia que con otros ensayos de diagnóstico que no detectan
anticuerpos borrelicidas anti-OspC.
Llevando esto un paso más adelante, los
solicitantes descubrieron que el(los) epítopos(s)
borrelicida(s) está(n) localizado(s) en un pequeño
fragmento de la proteína OspC. El gen de la proteína OspC tiene una
longitud total de aproximadamente 600 pares de bases (pb). El ADN
que codifica el fragmento borrelicida es de aproximadamente 151 pb.
El fragmento es único de Borrelia. Con referencia al ejemplo
2, se muestra en la Fig. 4 la secuencia de ADN del fragmento
DraI-SmaI del gen ospC (fragmento Dra de OspC).
Se muestra también en la Fig. 4 la secuencia aminoacídica
codificada de esta proteína de fusión de OspC truncada.
El fragmento se denomina el fragmento Dra
principalmente debido a que DraI es la enzima de restricción
utilizada para cortar la secuencia de ADN en un conjunto particular
de bases que representa el sitio de reconocimiento de la enzima. Al
utilizar la porción del gen ospC que contiene
epítopo(s) borrelicida(s), se potencia la
especificidad y el potencial de pronóstico del ensayo de diagnóstico
sin una pérdida significativa de sensibilidad.
El fragmento Dra de la proteína OspC es también
un componente de vacuna más viable en comparación con la proteína
OspC completa. Al eliminar el resto de la proteína OspC, se
minimizan los problemas de vacunación debido a que las otras partes
de la proteína no están presentes, limitando así los efectos
secundarios de la vacunación y haciendo más fácil inducir, mantener
y monitorizar la respuesta de anticuerpo protector eficaz. Además,
la respuesta inmunitaria puede elevarse fácilmente frente a sólo la
porción protectora de la proteína OspC combinando el fragmento Dra
con un coadyuvante tal como toxoide del tétanos u otros coadyuvantes
de vacuna que causan que la respuesta inmunitaria sea elevada. El
fragmento Dra de OspC puede sintetizarse también de novo
utilizando química de péptidos en disolución o en fase sólida
convencionales.
El uso del ensayo de anticuerpo borrelicida para
monitorizar los niveles de anticuerpos borrelicidas
anti-OspA ha proporcionado un conocimiento
importante de la eficacia de las vacunas de borreliosis de Lyme de
OspA actuales (13, 21, 23). De hecho, los ensayos de anticuerpo
borrelicida son ahora la marca distintiva para monitorizar la
capacidad de vacunas de enfermedad de Lyme de OspA de proporcionar
protección. La vacunación de jerbos y ratones de laboratorio con
OspC conduce también a una protección completa frente a exposición a
la infección experimental y/o infección portada por garrapata con
aislamientos de B.b. homólogos. Además, al contrario que la
vacunación con OspA, la vacunación con OspC puede dar como resultado
también la eliminación de espiroquetas y la resolución de los
síntomas aunque se administre después de infección por B.b.
Por tanto, una vacuna de Osp sería una adición valiosa a los
esfuerzos por mejorar el impacto de la enfermedad de Lyme.
Como se afirmó anteriormente, los investigadores
no han encontrado anteriormente pruebas de que las vacunas de OspC
proporcionen protección induciendo anticuerpos borrelicidas. Otros
investigadores no han detectado anticuerpos borrelicidas
anti-OspC después de la vacunación a pesar de la
capacidad de la vacunación de OspC de inducir protección. Sin
embargo, los resultados de los inventores confirman que la OspC
induce realmente anticuerpos borrelicidas y otros investigadores se
darán cuenta rápidamente de que eran incapaces de detectar
anticuerpos borrelicidas anti-OspC lo más
probablemente debido a que utilizaban un organismo B.b. para
ensayo que no expresaba OspC en la superficie.
Actualmente, ninguna vacuna utiliza
un(os) epítopo(s) borrelicida(s)
aislado(s). La presente invención describe el uso
de(l) epítopo(s) borrelicida(s) de OspC como
ensayo de diagnóstico y como vacuna contra la enfermedad de
Lyme.
Como composición farmacéutica, la presente
invención incluye un portador farmacéuticamente aceptable y una
cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido Dra de OspC de esta
invención. Por "cantidad terapéuticamente eficaz", se quiere
indicar la cantidad de polipéptido o anticuerpo que, cuando se
administra a un animal, desencadena una respuesta inmunitaria que
es eficaz para prevenir o reducir la gravedad, durante cierto
periodo de tiempo, de la infección por B.b.
La administración del polipéptido de esta
invención al animal puede conseguirse mediante una variedad de
procedimientos estándar. Preferiblemente, si se utiliza un
polipéptido, se administrará con un coadyuvante farmacéuticamente
aceptable tal como coadyuvante de Freund completo o incompleto, RIBI
(dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes).
Dichos coadyuvantes pueden proteger al polipéptido de la dispersión
rápida al capturarlo en un depósito local, o pueden contener
sustancias que estimulen al hospedador a secretar factores que son
quimiotácticos de macrófagos y otros componentes del sistema
inmunitario. Preferiblemente, si se está administrando un
polipéptido, el esquema de inmunización implicará dos o más
administraciones del polipéptido, distribuidas durante varias
semanas.
La composición farmacéutica puede utilizarse
para tratar o prevenir la enfermedad de Lyme en diversos animales,
incluyendo seres humanos. La composición farmacéutica puede estar en
una variedad de formas convencionales tales como comprimidos,
píldoras, polvos, líquidos o suspensiones, cápsulas, supositorios,
disoluciones inyectables e infusibles, todas bien conocidas en la
técnica. La forma preferida depende del modo de administración y la
aplicación profiláctica pretendidos. Sin embargo, en la mayoría de
las aplicaciones la vía de administración preferida es parenteral,
y lo más preferiblemente intramuscular.
La invención da a conocer también el uso de un
polipéptido aislado consistente en los residuos 145 a 194 de la SEC
ID Nº 2 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de
infección por Borrelia.
La presente invención proporciona un kit para
diagnosticar infección por Borrelia en mamíferos, incluyendo
seres humanos. El kit comprende un polipéptido aislado que tiene una
secuencia aminoacídica como se muestra en los residuos 145 a 194 de
la SEC ID Nº 2, dispuesto en un envase adecuado para él, e
instrucciones para uso del kit.
Para ilustrar más completamente la presente
invención, se proporcionan los siguientes ejemplos. Los ejemplos,
que hacen referencia a las figuras adjuntas, son sólo con fines de
ilustración para ayudar a una comprensión más completa de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Este ejemplo demuestra la capacidad de OspC de
B.b. de inducir altos niveles de anticuerpos borrelicidas
cuando se administra poco después de infección por B.b.
Organismos: Se aisló el aislamiento 297
de B.b. sensu stricto (depositado en la American Type
Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia
20110 con el número de acceso ATCC 53899) de fluido espinal humano.
Se obtuvo el aislamiento 50772 de B.b. sensu stricto
(depositado en la American Type Culture Collection el 30 de julio
de 1999 según los términos del Tratado de Budapest), aislado
originalmente de una garrapata I. scapularis, de John F.
Anderson (Connecticut Agricultural Experimental Station, New Haven,
Connecticut). La espiroqueta carece del operón OspA/B y por tanto no
expresa OspA ni OspB (25). Se diluyeron en serie 10 veces las
suspensiones originales de espiroquetas en medio
Barbour-Stoenner-Kelly (BSK) capaz
de soportar el crecimiento de un solo organismo (46). Después, se
hicieron pasadas de la población resultante de espiroquetas 10
veces en medio BSK reciente a 30ºC o 35ºC, se dispensó en alícuotas
de 200 \mul a tubos de tapa a rosca de 1,5 ml (Sarstedt, Newton,
Carolina del Norte) y se almacenó a -70ºC hasta el uso. Se utilizó
E. coli JM109 (Promega Corp., Madison, Wisconsin) en todos
los experimentos de clonación.
Animales. Se albergaron 10 ratones
C3H/HeJ hembra de 10 semanas (Jackson Laboratories, Bar Harbor,
Maine) tres por jaula a temperatura ambiente. Estaban disponibles a
voluntad alimento y agua.
Sueros. Se obtuvieron sueros de
borreliosis de Lyme de pacientes del Gundersen Lutheran Medical
Center, La Crosse, Wisconsin. Diez muestras de sueros de
borreliosis de Lyme eran de individuos con lesiones de eritema
migratorio únicas o múltiples documentadas clínicamente. Dos de
estas muestras de sueros eran de pacientes con cultivos dérmicos de
piel positivos de B.b. Se utilizó suero de un individuo no
expuesto a B.b. sensu lato como control de suero
normal. Se ensayó esta muestra de suero por 516 laboratorios
participantes en la National Lyme Proficiency Survey patrocinada
por el Wisconsin Laboratory of Hygiene y el College of American
Pathologists, y se reseñó como negativo en anticuerpos frente a
B.b. (31).
Transferencia Western. Se realizó la
transferencia Western como se describe anteriormente (17).
Brevemente, se hirvieron células B.b. 50772 en tampón de
muestra durante 5 min y se cargaron 150 \mug de proteína total en
un gel de poliacrilamida al 12%-0,1% de SDS (gel de apilamiento de
poliacrilamida al 4% sin peine). Se determinaron las
concentraciones de proteína con el kit de determinación de proteína
Bio-Rad siguiendo las instrucciones del fabricante
(Bio-Rad Inc., Richmond, California). Se procesaron
simultáneamente dos geles en una unidad de electroforesis (SE600,
Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, California) a 55 mA
durante 3 horas con el sistema tampón de Laemmli (32). Después de la
electroforesis, se transfirieron las proteínas a nitrocelulosa
durante 3 horas a 300 mA en las condiciones descritas por Towbin
et al. (33). Se cortó la nitrocelulosa en tiras y se bloqueó
con disolución tamponada con fosfato (PBS)-0,3% de
detergente Tween 20 durante 30 min a 22ºC. Se incubaron las tiras
durante 1 hora a 22ºC con suero humano diluido 1:100 y se lavaron 3
veces con PBS-0,05% de detergente Tween 20. Se
añadieron IgM o IgG (cadenas pesada o ligera; Organon Teknika
Cappel, Malvern, Pensilvania) anti-humanas marcadas
con peroxidasa de rábano picante y se incubaron las tiras durante
30 min a 22ºC. Después de la incubación, se lavaron las tiras y se
revelaron (sistema de sustrato peroxidasa de membrana TMB;
Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland).
Clonación y amplificación del gen
ospC . Se aisló ADN enriquecido en plásmido del
aislamiento S-1-10 de B.b.
sensu stricto (13). Se utilizó el ADN como molde para la
amplificación del gen ospC utilizando el kit GeneAmp (Perkin
Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut) (34). Se utilizaron cebadores a
una concentración final de 1,0 \muM a una concentración de
MgCl_{2} 1,5 mM. Los parámetros de ciclado térmico fueron 95ºC
durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos de lo siguiente: 1) 95ºC
durante 30 s, 2) 50ºC durante 30 s, 3) 72ºC durante 90 s. Se
realizó la extensión final a 72ºC durante 7 min para extender
totalmente cualquier cadena de ADN truncada. Se utilizaron el
cebador aminoterminal C1
(5'-CGTGGATCCATGAAAAAGAATACATTAAGTGCGATA-3')
y el cebador carboxiterminal C2
(5'-AATTCCCGGGTTAAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC-3')
para amplificación. El subrayado indica las regiones reconocidas por
los cebadores. Se purificó el ADN amplificado utilizando GeneClean
(Bio101, La Jolla, California). Después de digestión con SmaI
y BamHI (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland), se ligaron los
fragmentos de ADN purificados en el vector PinPoint
pXa-3 (Promega Corp., Madison, Wisconsin) con ADN
ligasa T4 (Gibco BRL, Rockville, Maryland). Se utilizó la mezcla de
ligamiento para transformar E. coli JM109 competentes. Se
sembraron E. coli transformadas en medio 2xTY que contenía
ampicilina (100 \mug por ml, Sigma Chemical Co., St. Louis,
Misuri) y se incubaron durante 24 horas a 37ºC. Se detectaron
colonias que expresaban OspC mediante análisis de transferencia
Western utilizando un conjugado de
estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (Gibco
BRL) y un suero de enfermedad de Lyme temprana que contenía
anticuerpos anti-OspC.
Se determinó la secuencia de ADN del gen
ospC mediante secuenciación bicatenaria (TaqTrack, Promega,
Madison, Wisconsin). El análisis y las búsquedas BLAST se
realizaron utilizando el sistema de software GCG (GCG, Madison,
Wisconsin). El gen ospC de
S-1-10 de B.b. sensu
stricto era similar (78,5%) al B31 de B.b. sensu
stricto (35). Además, la secuencia nucleotídica de OspC
de S-1-10 difería en 3 bases (98% de
homología) con B.b. sensu stricto (36).
Purificación de OspC recombinante: Se
cultivaron E. coli que contenían el gen ospC en 100 ml
de caldo 2xTY que contenía ampicilina durante 12 h a 37ºC. Se
diluyó el cultivo 1:10 con caldo 2xTY y se incubó durante 1 h
adicional. Se añadió
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(concentración final 0,1 mM, Sigma) al cultivo y se incubó durante
4 h adicionales. Se centrifugó la suspensión a 10.000 x g durante 15
min a 4ºC, se resuspendió en tampón de purificación (Tris 50 mM (pH
8,0), NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, 0,1% de Triton X-100) y
se lisó con un sonicador (modelo W350; Branson Sonic Power Co.,
Danbury, Connecticut). Se centrifugó la E. coli sonicada a
10.000 x g durante 15 min y se pasó el sobrenadante por una columna
que contenía resina SoftLink (Promega, Madison, Wisconsin) a una
velocidad de 0,5 ml por min a 4ºC. Se lavó después la columna con 5
volúmenes de columna de tampón de purificación. Se eluyó la OspC
con biotina 5 mM (Sigma) y se analizaron las fracciones recuperadas
por
PAGE-SDS.
PAGE-SDS.
ELISA de OspC: Se diluyó OspC
recombinante a 750 ng/ml en tampón de recubrimiento
(Na_{2}CO_{3} 0,015 M, NaHCO_{3} 0,035 M, pH 9,6) y se
añadieron cantidades de 100 \mul a pocillos de microtitulación de
fondo plano individuales (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA). Se
incubaron las placas de microtitulación a 35ºC durante 4 horas,
seguido de una incubación durante una noche a 4ºC. Después de la
incubación, se lavaron las placas tres veces con disolución salina
tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2) que contenía 0,05% de detergente
Tween 20, se sellaron y se almacenaron a 4ºC. Antes de utilizar, se
bloquearon las placas con PBS-0,05% de detergente
Tween 20 que contenía 1% de seroalbúmina bovina durante 30 min a
22ºC, se lavaron dos veces con PBS-0,05% de
detergente Tween 20 y se añadieron 100 \mul de diluciones en serie
2x de suero normal o de borreliosis de Lyme en PBS a los pocillos
individuales. Se incubaron las placas durante 1 hora a 22ºC, seguido
de 3 lavados con PBS-0,05% de detergente Tween 20.
Se añadieron 100 \mul de anticuerpo IgM
anti-humana conjugada con peroxidasa de rábano
picante (Organon Teknika Cappel) diluido 1:3000 en
PBS-0,05% de detergente Tween 20 y se incubaron las
placas a 22ºC durante 1 h. Después de la incubación, se añadieron
100 \mul de fosfato de o-fenilendiamina (0,4
mg/ml, Sigma) a cada pocillo y se incubaron a 22ºC durante 30 min.
Se detuvieron las reacciones mediante la adición de 100 \mul de
H_{2}SO_{4} 1 N y se determinaron inmediatamente las
absorbancias a 490 nm (modelo EL307, Bio-Tek
Instruments, Inc., Winooski, Vermont). Se consideró positivo un
valor de DO > 0,200 por encima del control de suero
normal.
normal.
Detección de anticuerpos borrelicidas: Se
realizó el ensayo de anticuerpo borrelicida por citometría de flujo
según Callister et al. (29, 30). Brevemente, se descongeló
una alícuota congelada de 200 \mul de aislamiento 50772 o 297 de
B.b., se inoculó en 6 ml de medio BSK reciente y se incubaron
los cultivos durante 72 horas a 35ºC. Después de la incubación, se
determinó la concentración de espiroquetas utilizando una cámara de
conteo Petroff-Hausser y se diluyó en medio BSK
reciente a una concentración de 10^{6} organismos por ml. Se
diluyeron las muestras de suero 1:20 en medio BSK reciente y se
esterilizaron mediante pasada a través de un filtro de
microcentrífuga de 0,2 \mum (Costar, Cambridge, Massachusetts). Se
transfirió una alícuota de 100 \mul a un tubo de microcentrífuga
con tapa a rosca de 1,5 ml (Sarstedt) y se inactivó térmicamente el
suero diluido a 56ºC durante 10 min. Después de la inactivación
térmica, se añadieron una alícuota de 100 \mul de B.b.
50772 y 15 \mul de suero de conejillo de indias estéril (200, 50%
de unidades de complemento hemolítico por ml, Sigma) a los sueros
diluidos. Después de agitación suave, se incubaron las suspensiones
de ensayo durante 16-24 horas a 35ºC.
Después de la incubación, se diluyeron 1:5 100
\mul de las suspensiones de ensayo con PBS (0,01 mol/l, pH 7,2)
que contenían naranja de acridina (concentración final 5,4 x
10^{9} mol/l). Se detectaron los anticuerpos borrelicidas con un
citómetro de flujo de láser único FACScan
(Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San
José, California). Se adquirieron resultados durante 1 a 2 minutos
con el caudal fijado en bajo (12 \mul/min) y se analizaron con el
software de investigación FACScan Lysys II. Se utilizaron los
parámetros de dispersión lateral e intensidad de fluorescencia para
distinguir a B.b. de BSK y partículas de complemento. Se
controlaron las espiroquetas durante la adquisición de datos y se
amplificaron logarítmicamente las señales de fluorescencia y se
convirtieron en una escala lineal. Un aumento \geq13% de la
intensidad de fluorescencia comparada con los controles de suero
normales fue considerado positivo (30). Todos los ensayos se
realizaron por duplicado o triplicado.
Vacunación de ratones y recuperación de
sueros anti-OspC. Se vacunaron por vía
intramuscular ratones con 75 \mug de OspC purificada en 100
\mul de coadyuvante completo de Freund (Sigma). Posteriormente, se
revacunaron los ratones con cantidades de 75 \mug de OspC en 100
\mul de coadyuvante incompleto de Freund (Sigma) a las 2 y 4
semanas después de la vacunación primaria. Dos semanas después de la
segunda revacunación, se recogió sangre mediante punción
intracardiaca. Se dejó coagular la sangre y se separó el suero por
centrifugación a 3.500 rpm durante 5 min. Se retiró el suero y se
almacenó en cantidades de 50 \mul a -70ºC hasta el uso.
Ensayo de inmunofluorescencia por citometría
de flujo. Se diluyeron en serie muestras de suero de ratón que
contenían anticuerpos anti-OspC en medio BSK (1:20 a
1:40960). Se añadieron 100 \mul de medio BSK que contenía
10^{5} organismos B.b. 297 o 50772 vivos a cada dilución.
Se agitaron suavemente con vórtex las suspensiones y se incubaron a
35ºC durante 30 min. Después de la incubación, se añadieron a cada
ensayo 10 \mul de anticuerpos IgG de cabra
anti-ratón conjugados con isotiocianato de
fluoresceína (FITC) (ICN/Cappel, Aurora, Ohio) diluidos 1:20 en PBS
estéril (pH 7,2). Se agitaron suavemente con vórtex los ensayos y se
incubaron a 35ºC durante 30 min adicionales. Después de la
incubación, se combinaron alícuotas de 100 \mul de cada suspensión
con 400 \mul de PBS esterilizado por filtración a 0,22 \mum. Se
analizaron después estas suspensiones utilizando un citómetro de
flujo
FACScan.
FACScan.
\newpage
Neutralización de la actividad
borrelicida. Se determinó la actividad borrelicida de las
muestras de suero después de la retirada de los anticuerpos IgM o
IgG como se describe anteriormente (17). Brevemente, se añadieron
125 \mul de IgM o IgG de cabra anti-humana
dializada (cadena pesada y ligera; Kallestad Diagnostics, Chaska,
Minnesota) a 25 \mul de suero normal o de borreliosis de Lyme y se
incubó la mezcla durante 2 horas a 37ºC. Después de la
centrifugación a 5.000 x g durante 10 min (Surespin, Helena
Laboratories, Beaumont, Tejas), se diluyó el sobrenadante 2 veces
con medio BSK reciente, se esterilizó mediante pasada a través de un
filtro de microcentrífuga de 0,2 \mum (Costar) y se ensayó la
actividad borrelicida. Se determinó la actividad borrelicida de
sueros normales y con borreliosis de Lyme sin tratamiento con
anti-IgM ni anti-IgG después de
añadir 125 \mul de PBS (pH 7,2).
Adsorción de sueros de borreliosis de Lyme
con OspC. Se realizó la adsorción de anticuerpos
anti-OspC de sueros de borreliosis de Lyme
utilizando una modificación de un procedimiento descrito
anteriormente (17). Se lavó resina de avidina tetramérica TetraLink
(Promega) con PBS y se cargó 1 ml de volumen en una columna. Se
pasaron por la columna 3 \mug de OspC biotinilada dializada en 1
ml de volumen y se monitorizó la absorbancia (DO) a 280 nm para
confirmar la unión de OspC a la columna. Se pasó después una muestra
de 1 ml de cada uno de los 10 sueros de borreliosis de Lyme humana
diluidos 10 veces con PBS (pH 7,2) por la columna 10 a 15 veces a
4ºC para retirar los anticuerpos anti-OspC. La
retirada de los anticuerpos anti-OspC se confirmó
por transferencia
Western.
Western.
Este estudio mostró que la vacunación de ratones
con OspC inducía altas concentraciones de anticuerpos borrelicidas
anti-OspC y condujo a esfuerzos aumentados (en los
siguientes ejemplos) por evaluar la capacidad de OspC de
proporcionar protección frente a la infección por B.b.,
debido a que proporciona un mecanismo inmunitario plausible que
explica la capacidad de una vacunación con OspC de proteger frente a
o curar la enfermedad de Lyme. Además, se descubrió que pueden
detectarse fácilmente grandes cantidades de anticuerpos borrelicidas
anti-OspC en suero de pacientes de todo EE.UU.
cuando se utiliza un solo organismo, B.b. 50772, como
antígeno de ensayo, lo que indica también que (el) los
epítopo(s) borrelicida(s) anti-OspC
puede(n) estar conservado(s). Por tanto, la
heterogeneidad de OspC no impedirá los esfuerzos por desarrollar una
vacuna de OspC integral.
Estos descubrimientos están en contraposición
directa con otras observaciones publicadas. En informes previos, la
detección dependía de la presencia de altos niveles de OspC en la
superficie de B.b. Estos anticuerpos borrelicidas
anti-OspC se detectaban sólo cuando se utilizaba el
aislamiento 50772 de B.b., que expresa altos niveles de OspC
en la superficie.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Este ejemplo demuestra que los epítopos
borrelicidas de OspC están localizados en la región del fragmento
Dra.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
a
Se aisló ADN enriquecido en plásmido del
aislamiento S-1-10 de B.b.
sensu stricto utilizando técnicas estándar (13). Se utilizó
después el ADN como molde para la amplificación del gen ospC
mediante el protocolo GeneAmp (Perkin Elmer Cetus, Norwalk,
Connecticut) utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (34).
Se utilizaron los cebadores a una concentración final 1,0 \muM
con una concentración de MgCl_{2} 1,5 mM. Los parámetros de
ciclado térmico fueron 95ºC durante 5 min, seguido de 35 ciclos de
lo siguiente: 1) 95ºC durante 30 s, 2) 50ºC durante 30 s, 3) 72ºC
durante 90 s. La extensión final se realizó a 72ºC durante 7 min
para extender completamente cualquier cadena de ADN truncada. Se
utilizaron el cebador aminoterminal C1
(5'-CGTGGATCCATGAAAAAGAATACA
TTAAGTGCGATA-3') y el cebador carboxiterminal C2 (5'-AATTCCCGGGTTAAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC-3') para amplificación. Se purificó el ADN amplificado utilizando GeneClean (Bio101, La Jolla, California). Después de la digestión con SmaI y BamHI (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland), se ligaron los fragmentos de ADN purificados en el vector PinPoint pXa-3 (Promega Corp, Madison, Wisconsin). Se ligaron el inserto y el plásmido con ADN ligasa T4 (Bethesda Research Laboratories) y se utilizó la mezcla de ligamiento para transformar E. coli JM109 competentes. Posteriormente, se sembraron los organismos en medio de levadura triptona (TY) 2x que contenía ampicilina (100 \mug/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, Misuri) y se incubaron durante 24 horas a 37ºC. Se detectaron colonias que expresaban la proteína de fusión OspC mediante análisis de transferencia Western utilizando un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Bethesda Research Labortories) y un suero de enfermedad de Lyme temprana que contenía anticuerpos anti-OspC. Se le da a este plásmido la designación pX3-22 y se ilustra en la
Fig. 1.
TTAAGTGCGATA-3') y el cebador carboxiterminal C2 (5'-AATTCCCGGGTTAAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC-3') para amplificación. Se purificó el ADN amplificado utilizando GeneClean (Bio101, La Jolla, California). Después de la digestión con SmaI y BamHI (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland), se ligaron los fragmentos de ADN purificados en el vector PinPoint pXa-3 (Promega Corp, Madison, Wisconsin). Se ligaron el inserto y el plásmido con ADN ligasa T4 (Bethesda Research Laboratories) y se utilizó la mezcla de ligamiento para transformar E. coli JM109 competentes. Posteriormente, se sembraron los organismos en medio de levadura triptona (TY) 2x que contenía ampicilina (100 \mug/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, Misuri) y se incubaron durante 24 horas a 37ºC. Se detectaron colonias que expresaban la proteína de fusión OspC mediante análisis de transferencia Western utilizando un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Bethesda Research Labortories) y un suero de enfermedad de Lyme temprana que contenía anticuerpos anti-OspC. Se le da a este plásmido la designación pX3-22 y se ilustra en la
Fig. 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
b
Para preparar un fragmento carboxiterminal de la
proteína OspC, se digirió el plásmido pX3-22 con
las enzimas de restricción BamHI y SmaI (Gibco). Se
digirió después el fragmento BamHI-SmaI de \sim0,6
kb que contenía el gen ospC con la enzima de restricción
DraI (Gibco) como se ilustra en la Fig. 2. Esta digestión dio
como resultado un fragmento BamHI-DraI de \sim0,4
kb que codifica el extremo aminoterminal de la proteína OspC y un
fragmento DraI-SmaI de \sim0,2 kb que codifica el
extremo carboxiterminal. Se ligó este fragmento
DraI-SmaI con el vector PinPoint
pXa-2 digerido con SmaI (Promega Corporation,
Madison, WI) para conservar el marco de lectura apropiado de la
proteína truncada resultante. Se utilizó la mezcla de ligamiento
para transformar E. coli JM109 competentes. Se realizaron
digestiones de restricción para identificar un clon con la
orientación apropiada de inserción del fragmento del gen
ospC. Se designó este plásmido
pX2-22-Dra y se ilustra en la Fig.
3.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
c
Se determinó la secuencia de ADN de
pX2-22-Dra mediante secuenciación
bicatenaria. Se utilizaron el cebador C2 (véase la etapa a del
ejemplo 2), construido para amplificación, y el cebador de
secuenciación PinPoint (Promega). Se muestra en la Fig. 4 la
secuencia del fragmento DraI-SmaI del gen ospC
(fragmento Dra de Ospc). Se muestra también en la Fig. 4 la
secuencia aminoacídica predicha de esta proteína de fusión de OspC
truncada.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
d
Se cultivaron organismos E. coli
transformados que contenían pX3-22 y
pX-22-Dra en 100 ml de caldo 2xTY
que contenía ampicilina durante 12 horas a 37ºC. Se diluyó el
cultivo 1:10 con caldo 2xTY y se incubó durante 1 hora adicional.
Se añadió
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(concentración final 0,1 mM, Sigma) al cultivo y se incubó durante
4 horas adicionales. Se centrifugó después la suspensión de
bacterias (10.000 x g durante 15 min a 4ºC), se resuspendió en
tampón de purificación (tampón Tris 50 mM (pH 8,0), NaCl 50 mM,
EDTA 2 mM, 0,1% de TRITON X-100) y se lisó con 5
pulsos de 30s con un sonicador (modelo W350, Branson Sonic Power
Co., Danbury, Connecticut). Se centrifugaron los organismos E.
coli sonicados a 10.000 x g durante 15 min para retirar el
material insoluble y se pasó el sobrenadante por una columna de
resina SoftLink (Promega) a una velocidad de 0,5 ml por min a 4ºC.
Se lavó después la columna con 5 volúmenes de columna de tampón de
purificación. Se eluyó la proteína de fusión del fragmento Dra de
OspC unido a columna utilizando tampón de purificación que contiene
biotina 5 mM (Sigma). Se analizaron las fracciones mediante
electroforesis en gel de
poliacrilamida-dodecilsulfato de
sodio.
sodio.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
e
Se realizó la adsorción de anticuerpos
anti-OspC o fragmento Dra de sueros de borreliosis
de Lyme utilizando una modificación del procedimiento descrito
anteriormente (17). Se lavó resina de avidina tetramérica Tetralink
(Promega) con PBS y se cargó 1 ml de volumen en una columna. Se
pasaron después por la columna 3 \mug de OspC entera biotinilada
dializada (proteína de fusión de pX3-22) o el
fragmento Dra de OspC (proteína de fusión de
pX2-22-Dra) en un volumen de 1 ml y
se monitorizó la absorbancia a 280 nm para confirmar la unión de
proteína a la columna. Se pasó después por la columna 10 a 15 veces
una muestra de 1 ml de cada suero diluido 10 veces con PBS (pH 7,2)
para retirar los anticuerpos anti-OspC o
anti-fragmento Dra.
Utilizando los materiales y métodos de los
ejemplos 1 y 2, se ensayaron inicialmente 7 muestras de sueros de
enfermedad de Lyme temprana que contenían altos títulos de
anticuerpos borrelicidas anti-OspC y se confirmó
que los anticuerpos antiborrelicidas lo eran contra una región
específica de la proteína OspC dentro del fragmento Dra descrito en
la presente memoria.
Se unieron las proteínas de fusión de OspC o
fragmento Dra a perlas de agarosa y se prepararon columnas de
inmunoafinidad separadas. Se pasaron sueros de enfermedad de Lyme
por las columnas para retirar los anticuerpos
anti-OspC o anti-fragmento Dra
mediante adsorción en las proteínas de fusión de OspC o fragmento de
Dra, respectivamente. Se determinó la actividad borrelicida frente
a B.b. 50772 antes y después de la retirada de los
anticuerpos. La retirada de los anticuerpos
anti-OspC y anti-fragmento Dra de
sueros de enfermedad de Lyme temprana causó una anulación casi
completa de la actividad borrelicida como se ilustra en la Tabla
1.
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\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 1 muestra el título de anticuerpo
borrelicida de sueros de Lyme temprana después de la retirada de
los anticuerpos contra la proteína de fusión de OspC entera o el
fragmento Dra de OspC. Con referencia a la Tabla 1, puede
observarse que los anticuerpos borrelicidas lo eran contra la región
específica de la proteína OspC localizada en el fragmento Dra.
Estos resultados demuestran que los anticuerpos borrelicidas
anti-OspC están casi completamente inducidos por
epítopo(s) localizado(s) en la región del fragmento
Dra de OspC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Este ejemplo demuestra que los anticuerpos
anti-OspC que son específicos de la región del
fragmento Dra de OspC pueden detectarse mediante ELISA.
ELISA del fragmento Dra. Se diluyó el
fragmento Dra de OspC purificado a 750 ng/ml en tampón de
recubrimiento (Na_{2}CO_{3} 0,015 M, NaHCO_{3} 0,035 M, pH
9,6) y se añadió a pocillos de microtitulación de unión amino de
superficie de N-oxisuccinimida de fondo plano. Se incubaron
las placas ELISA a 35ºC durante 4 horas, seguido de una incubación
durante una noche a 4ºC. Después de la incubación, se lavaron las
placas 3 veces con PBS que contenía 0,05% de detergente Tween 20,
se sellaron y se almacenaron a 4ºC. Antes de utilizar, se
bloquearon las placas con PBS-0,05% de detergente
Tween 20 que contenía 1% de seroalbúmina bovina durante 30 min a
temperatura ambiente. Se lavaron las placas dos veces con
PBS-0,05% de detergente Tween 20 y se añadieron 100
\mul de diluciones en serie 2x en PBS a los pocillos de
microtitulación individuales. Se incubaron las placas durante 1
hora a 22ºC seguido de 3 lavados con PBS-0,05% de
detergente Tween 20. Se diluyó 1:3.000 ó 1:5.000 anticuerpo IgM o
IgG anti-humana conjugada con peroxidasa de rábano
picante (Organon Teknika Cappel, Malvern, Pensilvania) en
PBS-0,05% de detergente Tween 20. Se añadieron
alícuotas (100 \mul) del conjugado a los pocillos y se incubaron
a 22ºC durante 1 hora. Posteriormente, se añadieron 100 \mul de
fosfato de o-fenilendiamina (Sigma) y se incubaron
las placas a 22ºC durante 30 min. Se detuvieron las reacciones
añadiendo 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1 N y se determinaron las
absorbancias a
490 nm.
490 nm.
Se determinó si los anticuerpos
anti-fragmento Dra presentes en las 7 muestras de
sueros de enfermedad de Lyme temprana podían detectarse fácilmente
utilizando una ELISA de IgM o IgG de fragmento Dra. Se prepararon
placas ELISA de fragmento Dra y se utilizaron para medir la cantidad
de anticuerpo específico de Dra detectado cuando se diluían los
sueros 1:200 con PBS (pH 7,2) que contenía 0,5% de detergente Tween
20. Esta es una dilución utilizada habitualmente por laboratorios
de diagnóstico cuando se realizan ensayos ELISA. Fueron detectables
niveles significativos de anticuerpos IgM
anti-fragmento Dra en las 7 muestras de sueros de
enfermedad de Lyme temprana como se ilustra en la Tabla 2. La ELISA
de IgG detectó también anticuerpos anti-fragmento
Dra en 3 (42%) de las 7 muestras de sueros tempranos. La Tabla 2
ilustra la reactividad ELISA de IgM de Ospc (proteína entera) y
fragmento Dra utilizando sueros de enfermedad de Lyme temprana (n=
7) que contienen anticuerpos borrelicidas anti-OspC
y anti-Dra. La Tabla 2 muestra que una ELISA del
fragmento Dra podía detectar anticuerpos
anti-fragmento Dra en los sueros de enfermedad de
Lyme temprana a una absorbancia de 0,200 y una dilución de
1:200.
1:200.
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\vskip1.000000\baselineskip
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Ejemplo
4
Se diseñó este ejemplo para demostrar la
especificidad de una ELISA de OspC de B.b. y una ELISA de
fragmento Dra para detectar la enfermedad de Lyme
Se determinó si la ELISA de fragmento Dra era
más específica que la ELISA de OspC examinando sueros normales y
sueros de pacientes con infecciones por EBV y CMV. Se ensayaron
también muestras de sueros que contenían factor reumatoide y
muestras de sueros de pacientes con sífilis debido a que estos tipos
de sueros son también conocidos por reaccionar fuertemente con
ensayos de enfermedad de Lyme convencionales. Además, se ensayaron
muestras de sueros de individuos vacunados anteriormente con una
vacuna de enfermedad de Lyme de OspA. Ambas ELISA no estaban
afectadas por la vacunación previa contra la enfermedad de Lyme.
Fueron positivos números pequeños similares de muestras de suero
normal, sueros que contenían el factor reumatoide y sueros
sifilíticos utilizando ELISA de IgM de OspC o de fragmento Dra. Sin
embargo, la ELISA de OspC era a menudo falsamente positiva
utilizando sueros de pacientes con otras enfermedades, incluyendo
EBV y CMV, principalmente cuando se ensayaba con IgM. Esto no es
sorprendente, puesto que los anticuerpos IgM están presentes en
altas concentraciones durante la enfermedad de Lyme temprana. Los
anticuerpos IgG no aparecen normalmente hasta las etapas tardías de
la enfermedad. En contraposición, la ELISA de IgM de fragmento Dra
era significativamente menos reactiva utilizando sueros de
pacientes con CMV y EBV. Se hace referencia a la Tabla 3 siguiente.
Por tanto, la ELISA de fragmento Dra era significativamente más
específica que la ELISA que contenía la proteína OspC completa.
La Tabla 3 muestra los ELISA de IgM de OspC
(proteína completa) y de fragmento Dra frente a sueros reactivos
cruzados con enfermedad de Lyme (dilución de suero 1:200). Con
referencia a la Tabla 3, la ELISA de fragmento Dra era
significativamente más específica que la ELISA de OspC.
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Ejemplo
5
Se diseñó este ejemplo para mostrar que la ELISA
de OspC y fragmento Dra tenían sensibilidades similares. Se comparó
la sensibilidad de la ELISA de fragmento Dra con la ELISA de OspC
examinando 20 muestras de sueros de pacientes con enfermedad de
Lyme definida en cultivo. Estos sueros contenían también niveles
variables de anticuerpos borrelicidas anti-OspC.
Las ELISA de OspC y fragmento Dra tenían una sensibilidad similar.
Las ELISA de OspC y fragmento Dra detectaron anticuerpos IgM
(absorbancia \geq 0,200) en 12 (60%) y 10 (50%) de los 20 sueros
de enfermedad de Lyme temprana, respectivamente, como se ilustra en
la Tabla 4.
Además, la capacidad de detectar anticuerpos
anti-OspC o anti-fragmento Dra se
correlacionaba estrechamente con la actividad borrelicida
anti-B.b. Con pocas excepciones, se detectaron altas
concentraciones de anticuerpos IgM anti-OspC o
anti-fragmentos Dra en sueros de enfermedad de Lyme
temprana que contenían también altas concentraciones de anticuerpos
borrelicidas. Cuando la actividad borrelicida era baja, ambas ELISA
eran más a menudo negativas. Esto no era inesperado, puesto que se
ha mostrado que el ensayo de anticuerpo borrelicida es
aproximadamente 3 veces más sensible que una ELISA comercial
(30).
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Ejemplo
6
Se está trabajando actualmente para mejorar la
sensibilidad de la ELISA de fragmento Dra reduciendo las diluciones
del suero ensayado. Esto debería ser fácilmente posible debido a la
naturaleza altamente específica de la respuesta del anticuerpo de
fragmento Dra. Se prevé que los refinamientos de los procedimientos
de ensayo ELISA de fragmento Dra (por ejemplo, dilución de suero,
concentración de antígeno/pocillo) aumentarán significativamente la
sensibilidad a niveles más estrechamente relacionados con la
sensibilidad de la detección de anticuerpo borrelicida
anti-B.b.
50772.
50772.
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Ejemplo
7
Este ejemplo confirma la capacidad de pronóstico
de la ELISA de fragmento Dra. Se ensayaron múltiples muestras de
sueros de dos pacientes de enfermedad de Lyme temprana utilizando
ELISA de fragmento Dra. Se recogieron muestras de suero antes,
durante y después del tratamiento con agentes antimicrobianos. Se
monitorizó la actividad borrelicida anti-50772 con
ELISA de fragmento Dra. En el paciente 1, fueron detectables
anticuerpos anti-OspC 5 días después de la
infección y 6 y 11 días después de iniciar el tratamiento
antibiótico. Fueron detectables anticuerpos borrelicidas
anti-50772 y anti-fragmento Dra 5
días después de la infección y 6 días después del tratamiento, pero
no fueron ya detectables después de 11 días. De forma similar,
fueron detectables anticuerpos anti-OspC 7 días
después de la infección y 10 y 24 días después del tratamiento
antibiótico en el suero del paciente 2. Sin embargo, los
anticuerpos borrelicidas y anticuerpos
anti-fragmento Dra fueron sólo detectables antes
del tratamiento antibiótico. Estos resultados demuestran la
capacidad de la ELISA de fragmento Dra de correlacionarse con
infección por B.b. Por tanto, la ELISA de fragmento Dra es
también útil como "ensayo de curación".
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Ejemplo
8
La capacidad de la OspC de inducir anticuerpos
borrelicidas ha posibilitado la identificación del (de los)
epíto-
po(s) responsable(s) de inducir la actividad. Debido a que la protección después de la vacunación con OspA depende de la inducción y el mantenimiento de altos niveles de anticuerpos borrelicidas anti-OspA, la protección o eliminación de B.b. de individuos infectados dependerá también de la inducción de anticuerpos borrelicidas anti-OspC. Debido a que los anticuerpos borrelicidas anti-OspC pueden retirarse de sueros de enfermedad de Lyme temprana mediante adsorción al fragmento Dra, la vacunación con el fragmento Dra debe inducir también anticuerpos borrelicidas. Los ratones vacunados con OspC recombinante producen de hecho anticuerpos borrelicidas.
po(s) responsable(s) de inducir la actividad. Debido a que la protección después de la vacunación con OspA depende de la inducción y el mantenimiento de altos niveles de anticuerpos borrelicidas anti-OspA, la protección o eliminación de B.b. de individuos infectados dependerá también de la inducción de anticuerpos borrelicidas anti-OspC. Debido a que los anticuerpos borrelicidas anti-OspC pueden retirarse de sueros de enfermedad de Lyme temprana mediante adsorción al fragmento Dra, la vacunación con el fragmento Dra debe inducir también anticuerpos borrelicidas. Los ratones vacunados con OspC recombinante producen de hecho anticuerpos borrelicidas.
Utilizando los métodos del ejemplo 1, se
vacunaron ratones con B.b. 50772 y se determinó el nivel de
anticuerpos borrelicidas a diversos intervalos temporales después
de la vacunación. Fue detectable actividad borrelicida 14 días
después de la vacunación inicial y alcanzó el máximo después de 56
días, como se muestra en la Tabla 5.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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En un experimento relacionado, se retiraron
anticuerpos anti-fragmento Dra mediante adsorción a
proteína de fusión anti-fragmento Dra. Se midieron
entonces los niveles de anticuerpo borrelicida antes y después de la
adsorción y retirada de anticuerpos anti-fragmento
Dra. La actividad borrelicida se redujo de 1:2.560 a 1:640 después
de retirar los anticuerpos anti-fragmento Dra. Por
tanto, la vacunación con el fragmento Dra inducirá anticuerpos
borrelicidas protectores.
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Ejemplo
9
Se diseña el ejemplo para mostrar que el
fragmento Dra es mejor candidato a vacuna que la proteína OspC
entera. Se vacunan animales con OspC y se recoge suero con altas
niveles de actividad borrelicida. Se divide el suero y se elimina
la actividad borrelicida de una muestra mediante la retirada de
anticuerpos anti-fragmento Dra. Se administra
entonces pasivamente a animales que contienen o no contienen
anticuerpos borrelicidas (fragmento anti-Dra), para
separar grupos de animales receptores, antes de exponerles a la
infección por B.b. y a diversos intervalos después de la
infección. El suero que contiene anticuerpos borrelicidas
anti-fragmento Dra protegerá frente a y eliminará
organismos y síntomas clínicos después de la infección. En
contraposición, se espera que el suero anti-OspC
sin anticuerpos borrelicidas sea ineficaz para prevenir o curar la
infección. Por tanto, hay una prueba definitiva de la utilidad del
fragmento Dra como componente importante de vacuna de la enfermedad
de
Lyme.
Lyme.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
La enfermedad de Lyme causa también una
considerable morbilidad y cierta mortalidad entre perros y gatos.
Hay similitudes entre la enfermedad en seres humanos y perros,
incluyendo la migración de las espiroquetas a articulaciones y el
desarrollo de artritis de Lyme (45). De forma interesante,
Straubinger et al. (27) reseñaron recientemente que, al
contrario que los seres humanos, los perros infectados naturalmente
no producen anticuerpos borrelici-
das.
das.
Sin embargo, los inventores han demostrado
recientemente que los perros infectados naturalmente sí que
desarrollan altas concentraciones de anticuerpos borrelicidas. Han
infectado naturalmente 15 perros Beagle de 12-24
semanas exentos de patógenos disponiendo 6 garrapatas Ixodus
scapularis hembra y 6 macho en los animales y dejando que se
alimenten hasta saciedad. Aproximadamente un 44% de las garrapatas
estaban infectadas por B.b. Fueron detectables altas
concentraciones de anticuerpos borrelicidas anti-B.b. 50772
en 8 (53%) de los 15 perros 1 semana después de disponer la
garrapata. Se hace referencia a la Tabla 6.
De 2 a 9 semanas después de la infección, \geq
86% de los perros tenían altas concentraciones de anticuerpos
borrelicidas en su suero. Además, un 83% de los perros infectados
desarrollaron señales y síntomas clínicos (cojera) asociados a
enfermedad de Lyme y se recuperaron organismos B.b. de la
piel y articulaciones de >90% de los animales. Se retiraron
también los anticuerpos anti-OspC y
anti-fragmento Dra de 3 sueros de perro con altos
títulos de anticuerpos borrelicidas anti-B.b. 50772. La
retirada de estos anticuerpos dio como resultado la anulación casi
completa de la actividad borrelicida. Estos descubrimientos son casi
idénticos a los resultados utilizando sueros humanos. Por tanto, es
probable que el fragmento de Dra de OspC sea útil para animales de
compañía del mismo modo que se describe anteriormente para seres
humanos.
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<110> Callister, Steven M.
\hskip1cmLovrich, Steven D.
\hskip1cmSchell, Ronald F.
\hskip1cmJobe, Dean A.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Composiciones y métodos que utilizan
epítopo(s) borrelicida(s) de la proteína C de
superficie externa (OspC) de Borrelia burgdorferi para el
diagnóstico y la prevención de enfermedad de Lyme
\vskip0.400000\baselineskip
<130> OspC de B. burgdorferi
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/094.955
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
31-7-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (433)...(582)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADN única del fragmento
Dra de OspC de S-1-10 de B.
burgdorferi
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(582)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 194
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
Claims (14)
1. Un fragmento polipeptídico inmunogénico
aislado de OspC de Borrelia burgdorferi consistente en un
epítopo de OspC de la secuencia aminoacídica como se muestra en los
residuos 145 a 194 de la SEC ID Nº 2.
2. Un polipéptido aislado según la
reivindicación 1 consistente en los residuos 145 a 194 de la SEC ID
Nº 2.
3. Una molécula de ADN aislada que codifica un
polipéptido según la reivindicación 2.
4. Una molécula de ADN aislada según la
reivindicación 3, que comprende adicionalmente un sitio de
reconocimiento de DraI en su terminación 5' y un sitio de
reconocimiento de SmaI en su terminación 3'.
5. Una molécula de ADN aislada según la
reivindicación 3 consistente en una secuencia de pares de bases
nucleotídicas como se muestra en los nucleótidos
433-582 de la SEC ID Nº 1.
6. Un vector de expresión que comprende un ADN
aislado que codifica un polipéptido consistente en una secuencia
aminoacídica como se muestra en los residuos 145 a 194 de la SEC ID
Nº 2.
7. Una composición farmacéutica para vacunar
contra y para tratar infección por Borrelia en mamíferos,
incluyendo seres humanos, comprendiendo la composición una cantidad
de un polipéptido aislado consistente en una secuencia aminoacídica
como se muestra en los residuos 145 a 194 de la SEC ID Nº 2, siendo
la cantidad eficaz para prevenir o para tratar infección por
Borrelia en mamíferos.
8. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 7, que comprende adicionalmente un portador
farmacéuticamente adecuado.
9. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 7 u 8, que comprende adicionalmente un
coadyuvante.
10. Un polipéptido aislado que consiste en la
secuencia aminoacídica como se muestra en los residuos 145 a 194 de
la SEC ID Nº 2 para uso en un método de tratamiento del cuerpo
humano o animal mediante cirugía, terapia o diagnóstico.
11. El uso de un polipéptido aislado consistente
en la secuencia aminoacídica como se muestra en los residuos 145 a
194 de la SEC ID Nº 2 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de infección por Borrelia.
12. Un método para detectar infección por
Borrelia en mamíferos, incluyendo seres humanos, que
comprende:
a) poner en contacto un fluido corporal de un
hospedador mamífero sospechoso de padecer infección por
Borrelia con un polipéptido aislado consistente en la
secuencia aminoacídica mostrada en los residuos 145 a 194 de la SEC
ID Nº 2, y después
b) determinar si el polipéptido aislado se
conjuga con anticuerpos presentes en el fluido corporal del
hospedador mamífero, con lo que la presencia de conjugación indica
la presencia de infección por Borrelia en el hospedador.
13. Un método según la reivindicación 12, en el
que en la etapa b) se detecta la presencia de conjugación
utilizando un ensayo de inmunosorción ligado a enzima.
14. Un kit para diagnosticar infección por
Borrelia en mamíferos, incluyendo seres humanos,
comprendiendo el kit un polipéptido aislado consistente en la
secuencia aminoacídica mostrada en los residuos 145 a 194 de la SEC
ID Nº 2, dispuesto en un envase adecuado para él, e instrucciones
para uso del kit.
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