ES2298246T3

ES2298246T3 - Constructos recombinantes de borrelia burgdorferi.

Info

Publication number: ES2298246T3
Application number: ES01959607T
Authority: ES
Inventors: Benjamin J. Luft; John J. Dunn
Original assignee: Brookhaven Science Associates LLC; Research Foundation of the State University of New York
Current assignee: Brookhaven Science Associates LLC; Research Foundation of the State University of New York
Priority date: 2000-08-18
Filing date: 2001-08-07
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2021-08-07
Also published as: AU2001281145A1; DE60131858T2; ATE380870T1; WO2002016422A3; EP1311682B1; WO2002016422A2; DK1311682T3; PT1311682E; DE60131858D1; EP1311682A2

Abstract

Una proteína quimérica sin lipidar que comprende al menos un primer y un segundo polipéptido, en la que el primer polipéptido comprende OspC de Borrelia burgdorferi y en la que el segundo polipéptido comprende OspA de Borrelia burgdorferi, de forma que: (a) el polipéptido de OspC comprende el extremo N-terminal de la proteína, en el que el polipéptido de OspC se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 19 al residuo de aminoácido 211, el residuo de aminoácido 19 al 204, y el residuo de aminoácido 19 al 213, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspC de la ID SEC Nº: 30; y (b) el polipéptido de OspA: (i) se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 18 al 273, y el residuo de aminoácido 132 al 273, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspA de la ID SEC Nº: 7; o (ii) es un polipéptido quimérico que comprende polipéptidos de OspA de al menos dos cepas diferentes de Borreliaburgdorferi.

Description

Constructos recombinantes de Borrelia burgdorferi.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Lyme (borreliosis de Lyme) es la enfermedad infecciosa transmitida por garrapatas más habitual en Norteamérica y Europa, y se ha hallado en Rusia, Japón, China y Australia. La enfermedad de Lyme comienza en el sitio de una picadura de garrapata que produce una infección primaria, y durante el curso de la infección se produce la propagación del organismo a sitios secundarios. El agente causal bacteriano de esta enfermedad es la espiroqueta Borrelia burgdorferi, que se aisló y cultivó por primera vez en 1982 (Burgdorferi, W.A. et al., Science 216: 1317-1319 (1982); Steere, A.R. et al., N. Engl. J. Med. 308: 733-740 (1983)). Con ese descubrimiento, se pudo atribuir a la infección por B. burgdorferi una amplia diversidad de síndromes clínicos descritos en la bibliografía europea y americana desde comienzos del siglo XX (Afzelius, A., Acta Derm. Venereol. 2: 120-125 (1921); Bannwarth, A., Arch. Psychiatr. Nervenkrankh. 117: 161-185 (1944); Garin, C. y A. Bujadouz, J. Med. Lyon 71: 765-767 (1922); Herxheimer, K. y K. Hartmann, Arch. Dermatol. Syphilol. 61: 57-76, 255-300 (1902)).

Se han descrito tres genoespecies patógenas de Borrelia, B. burgdorferi sensu stricto (B. burgdorferi o B.b.s.s.), B. afzelii y B. garinii (Baranton, G., et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 42:378-383 (1992)). Estas son miembros de un complejo de especies, B. burgdorferi sensu lato, que consiste en al menos 10 genoespecies diferentes (Piken, R.N., et al., J. Invest. Dermatol., 110:211-214 (1998); Postic, D., et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 44:743-752 (1994); Valsangiacomo, C.T., et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 47:1-10 (1997)). Se cree que las tres genoespecies, B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii y B. garinii, son patógenas, y todas se hallan en Europa. Sin embargo, en Norteamérica, B. burgdorferi sensu stricto es la única genoespecie patógena identificada. Cada una de estas tres genoespecies está asociada a diferentes manifestaciones clínicas (Van Dam, A.P. et al., Clin. Infect. Dis. 17:708-717 (1993)). Esto implica que las diferencias entre las genoespecies pueden desempeñar un papel importante en la amplia diversidad de manifestaciones clínicas observadas en la enfermedad de Lyme.

OspA es una lipoproteína básica de aproximadamente 31 kd que está codificada en un plásmido lineal grande junto con OspB, una lipoproteína básica de aproximadamente 34 kd (Szczepanski, A. y J.L. Benach, Microbiol. Rev. 55:21 (1991)). El análisis de aislamientos de B. burgdorferi obtenidos de Norteamérica y Europa ha demostrado que OspA tiene variabilidad antigénica, y que se pueden definir serológicamente y genotípicamente varios grupos distintos (Wilske, B., et al., World J. Microbiol. 7: 130 (1991)). Otras proteínas de Borrelia muestran una variabilidad antigénica similar. Sorprendentemente, la respuesta inmunitaria hacia estas proteínas de la superficie externa suele darse de forma tardía en la enfermedad, si es que se da (Craft, J.E. et al., J. Clin Invest. 78: 934-939 (1986); Dattwyler, R.J. y B.J. Luft, Rheum. Clin. North Am. 15: 727-734 (1989)). Además, los pacientes infectados de forma aguda y crónica con B. burgdorferi responden de manera variable a los diferentes antígenos, que incluyen OspA, OspB, OspC, OspD, p39, p41 y p93.

Cuando una garrapata infectada comienza a alimentarse de un mamífero, se induce la síntesis de otra proteína de la superficie externa, la proteína C de la superficie externa u OspC (Schwan, T.G., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 2:2909-2913 (1995)). Así, en la infección temprana, OspC es la principal proteína de la membrana externa expresada por la espiroqueta (Fung, B.P., et al., Infect. Immun. 62:3213-3221 (1994); Padula, S.J., et al., J. Clin. Microbiol., 32:1733-1738 (1994)). Aunque se ha demostrado que OspC tiene una exposición superficial limitada (Cox, D.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7973-7978 (1996); Mathiesen, M.M., et al., Infect. Immun. 66:4073-4079 (1998)), OspC es un inmunógeno potente. La inmunización con OspC protege contra la infección por Borrelia transmitida por garrapatas (Gilmore Jr., R.D., Infect. Immun. 64:2234-2239 (1999)). Sin embargo, debido a que OspC es sumamente variable en su secuencia, la protección se limita a la cepa de Borrelia burgdorferi que expresa el mismo alelo de OspC. La exposición a aislamientos heterólogos, que expresan otros alelos de ospC, da como resultado la infección (Probert, W.S., et al., J. Infect. D., 175:400-405 (1997)). OspC es un locus genético muy diverso (Jauris-Heipke, S., et al., Med. Microbiol. Immunol. 182:37-50 (1993)), como demuestra el hecho de que Livey et al. halló treinta y cuatro alelos de OspC en setenta y seis aislamientos de B. burgdorferi sensu lato (Livey, I., et al., Mol. Microbiol. 18:257-269 (1995)).

Actualmente, la enfermedad de Lyme se trata con una diversidad de antibióticos, p.ej., tetraciclinas, penicilina y cefalosporinas. Sin embargo, tal tratamiento no siempre es eficaz para eliminar la infección. El tratamiento se retrasa a menudo debido a un diagnóstico inadecuado con el efecto adverso de la progresión de la infección hasta un estado crónico, en el que el tratamiento con antibióticos a menudo es inútil. Uno de los factores que contribuyen al tratamiento retrasado es la carencia de herramientas diagnósticas eficaces.

Se han intentado realizar vacunas contra la borreliosis de Lyme. Los ratones inmunizados con una forma recombinante de OspA están protegidos contra la exposición a la misma cepa de B. burgdorferi de la que se obtuvo la proteína (Fikrig, E., et al., Science 250: 553-556 (1990)). Además, se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales (MAbs) anti-OspA transferidos de forma pasiva son protectores en ratones, y la vacunación con una proteína recombinante indujo una inmunidad protectora contra la infección posterior con la cepa homóloga de B. burgdorferi (Simon, M.M., et al., J. Infect. Dis. 164: 123 (1991)). Además, ha habido dos ensayos independientes de vacunas de primera generación para la prevención de la enfermedad de Lyme que han estudiado la eficacia y la seguridad de una vacuna basada en una proteína A de la superficie externa (OspA) recombinante (Sigal, L.H. et al., N. Engl. J. Med 339:216-222, 1998; Steere, A.C. et al., N. Engl. J. Med. 339:209-215, (1998)). Sin embargo, una vacuna que consista en OspA recombinante puede requerir inmunizaciones de refuerzo frecuentes. Una preocupación adicional de las vacunas basadas en OspA es la identificación reciente de un dominio de OspA autorreactivo putativo con un grado elevado de similitud hacia una región del antígeno 1 asociado a la función de leucocitos humanos (hLFA-1) (Gross, D.M. et al., Science, 281: 703-706 (1998)).

Se ha observado que la inmunización con una única proteína de una cepa particular de Borrelia a menudo no confiere resistencia a esa cepa en todos los individuos (Fikrig, E. et al., J. Immunol. 7: 2256-1160 (1992)). Existe una variación considerable manifestada en OspA, OspB y OspC, así como en p93, lo que incluye las regiones que confieren antigenicidad. Por lo tanto, el grado y la frecuencia de la protección de la vacunación con una proteína de una única cepa depende de la respuesta del sistema inmunitario a la variación particular, así como de la frecuencia de la variación genética en B. burgdorferi. En el caso de las vacunas dirigidas contra OspA, la vacuna es típicamente eficaz solamente contra las cepas de Borrelia que expresan OspA que es homóloga respecto de la OspA de la que derivó la vacuna.

Otra limitación de las vacunas actuales contra la enfermedad de Lyme con OspA es que se dirigen contra un antígeno que se expresa de forma predominante en el vector de garrapata. De hecho, los informes recientes han indicado que Borrelia burgdorferi en las garrapatas infectadas altera su expresión de superficie incrementando la expresión de OspC durante la ingestión de sangre (Schwan, T.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 2909-2913 (1995)). Así, parece que la infección natural con B. burgdorferi no provoca una respuesta de anticuerpos hacia OspA, tal como lo hace contra OspC.

Dada la heterogeneidad de los determinantes antigénicos presentes en las proteínas de Borrelia, existe la necesidad de una vacuna y una herramienta diagnóstica que puedan proporcionar inmunogenicidad hacia diversas cepas y/o genoespecies de Borrelia burgdorferi, así como hacia más epítopos dentro de una cepa o genoespecie. También existe la necesidad de vacunas y herramientas diagnósticas que detecten las respuestas de anticuerpos contra objetivos inmunoprotectores que se expresan en las diferentes fases del ciclo vital de Borrelia burgdorferi. Esto permitiría el diagnóstico y/o la vacunación contra todas o la mayoría de formas de Borrelia que provocan la enfermedad sistémica.

El documento WO-A-9512676 es de los mismos inventores que esta invención, y describe proteínas quiméricas anteriores de polipéptidos de Borrelia.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a proteínas quiméricas de Borrelia que incluyen dos o más polipéptidos antigénicos de Borrelia que no se dan de forma natural (en la naturaleza) en la misma proteína en Borrelia, así como a los ácidos nucleicos que codifican tales proteínas quiméricas. Las proteínas de las que derivan los polipéptidos antigénicos pueden ser de la misma cepa o genoespecie de Borrelia, de diferentes cepas o genoespecies, o de combinaciones de proteínas de las mismas o de diferentes cepas o genoespecies. Las proteínas quiméricas particulares, y las secuencias nucleotídicas que las codifican, se exponen en las Figs. 30-37 y 55-72.

Las proteínas quiméricas de la presente invención proporcionan polipéptidos antigénicos de una diversidad de cepas y/o proteínas de Borrelia dentro de una única proteína. Tales proteínas son particularmente útiles en ensayos inmunodiagnósticos para detectar la presencia de anticuerpos hacia Borrelia nativa en individuos potencialmente infectados, así como para medir la reactividad de las células T, y se pueden usar, por lo tanto, como reactivos inmunodiagnósticos. Estas proteínas quiméricas son útiles también en la generación de respuestas inmunitarias (tales como la producción de anticuerpos) contra las proteínas expresadas por Borrelia burgdorferi. Las proteínas quiméricas de la presente invención son útiles además como inmunógenos de vacunas contra la infección por Borrelia.

En una realización de la presente invención, las proteínas quiméricas están constituidas por fragmentos de polipéptidos de las cepas de Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme. Los fragmentos de polipéptidos que constituyen la proteína quimérica son de la proteína A de la superficie externa (OspA) y de la proteína C de la superficie externa (OspC), que tienen la estructura general de OspC unida por medio de un enlace peptídico al extremo N-terminal de OspA. La presente invención abarca proteínas quiméricas sin lipidar. La porción de polipéptido de OspC no incluye una señal de lipidación.

La porción de OspA del polipéptido quimérico puede comprender ella misma porciones de OspA de dos o más cepas de Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme como se describen aquí, y se proporcionan, por ejemplo, en las Figs. 23-29 y 43-46. En otra realización, el polipéptido de OspA comprende porciones de OspA de dos o más genoespecies de Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme, por ejemplo, en las que las genoespecies se definen como Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii y Borrelia garinii. De esta manera, los fragmentos de polipéptidos de OspC y OspA que constituyen la proteína quimérica pueden ser de la misma cepa o genoespecie de Borrelia, de diferentes cepas o genoespecies de Borrelia, o de combinaciones de proteínas de la misma y de diferentes cepas o genoespecies de Borrelia.

La presente invención se dirige además a ácidos nucleicos que codifican una proteína quimérica de Borrelia. La composición comprende un ácido nucleico que codifica una proteína quimérica de al menos dos polipéptidos, en la que el primer polipéptido comprende OspC de Borrelia burgdorferi, y el segundo polipéptido comprende OspA de Borrelia burgdorferi, de forma que OspC está en dirección 5' de OspA. Los fragmentos de ácido nucleico de OspC y OspA que constituyen la proteína quimérica pueden ser de la misma cepa o genoespecie de Borrelia, de diferentes cepas o genoespecies de Borrelia, o de combinaciones de proteínas que son de la misma y/o de diferentes cepas o genoespecies de Borrelia.

La presente invención se dirige además a vectores de expresión que comprenden un ADN aislado que codifica una proteína quimérica de Borrelia. En una realización, la composición incluye un vector de expresión que comprende un ADN aislado que codifica una proteína quimérica OspC/OspA como se describe aquí. La presente invención también abarca células hospedadoras que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína quimérica OspC/OspA como se describe aquí.

La presente invención se dirige además a métodos para producir los polipéptidos quiméricos de Borrelia descritos aquí. En una realización, el método para producir una proteína quimérica de Borrelia comprende seleccionar una secuencia polinucleotídica que codifica OspC o una porción antigénica suya, seleccionar una secuencia polinucleotídica que codifica OspA o una porción antigénica suya, y ligar estas secuencias polinucleotídicas entre sí.

La presente invención se puede usar además en métodos para administrar los polipéptidos quiméricos de Borrelia descritos aquí. El método puede comprender administrar la proteína quimérica en un vehículo fisiológicamente aceptable a un individuo. Como resultado de la administración de la proteína quimérica, el individuo desarrolla al menos cierta respuesta inmunitaria hacia la proteína quimérica, p.ej., el individuo genera una respuesta inmunitaria humoral, en la que el individuo produce anticuerpos que reconocen al menos una porción de dicho polipéptido quimérico.

La presente invención se puede usar además en métodos para administrar ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos quiméricos descritos aquí. El método comprende administrar el ácido nucleico en un vehículo fisiológicamente aceptable a un individuo. Como resultado de la administración del ácido nucleico, el individuo expresa la proteína quimérica al menos de forma transitoria y desarrolla al menos cierta respuesta inmunitaria hacia la proteína quimérica codificada por el ácido nucleico, p.ej., el individuo genera una respuesta inmunitaria humoral, en la que el individuo produce anticuerpos que reconocen al menos una parte del polipéptido quimérico producido a partir del ácido nucleico.

La invención también abarca métodos para usar las proteínas quiméricas descritas aquí en un ensayo diagnóstico. Como se describe aquí, el método se puede usar para detectar la presencia de anticuerpos específicos de OspA y/o OspC en una muestra, p.ej., una muestra de interés del hospedador. El método comprende poner en contacto una muestra, p.ej. una muestra de interés del hospedador, con la proteína quimérica en condiciones en las que los anticuerpos, si están presentes en la muestra del hospedador, se unen a la proteína quimérica, por lo que forman complejos antígeno-anticuerpo. Los complejos antígeno-anticuerpo se detectan después. De esta manera, las proteínas quiméricas de la presente invención se pueden usar para detectar una respuesta inmunitaria hacia Borrelia que provoca la enfermedad de Lyme.

La presente invención se dirige además a equipos diagnósticos que comprenden los polipéptidos quiméricos descritos aquí. El equipo comprende una proteína quimérica OspC/OspA de Borrelia burgdorferi. El equipo también incluye reactivos para detectar los complejos anticuerpo-antígeno que se forman entre la proteína quimérica OspC/OspA y los anticuerpos que están presentes en una muestra, p.ej., una muestra del hospedador suministrada por el usuario.

La presente invención se dirige además a composiciones farmacéuticas que se pueden usar para vacunar y/o tratar la infección por Borrelia en un animal o humano. La composición farmacéutica se puede administrar junto con un vehículo fisiológicamente aceptable y/o excipientes y/o adyuvantes adecuados.

La presente invención se puede usar además en métodos para inmunizar un animal o humano contra la enfermedad de Lyme. En una realización particular, el método comprende administrar una proteína quimérica OspC/OspA de Borrelia. La proteína quimérica se puede administrar junto con un vehículo fisiológicamente aceptable, un excipiente adecuado y/o un adyuvante adecuado, a un animal o humano de forma que el animal o el humano desarrolla una respuesta inmunitaria hacia al menos uno de los polipéptidos de OspC y/o OspA de la composición.

Al incorporar fragmentos de polipéptidos de múltiples proteínas de Borrelia burgdorferi, la presente invención proporciona una composición que tiene una gran utilidad para vacunas y equipos diagnósticos. Como resultado de la presente invención, existen herramientas diagnósticas y vacunas que comprenden antígenos de OspA y OspC de diversas cepas y/o genoespecies de Borrelia burgdorferi en una única proteína. Ya que OspA se expresa principalmente en el vector de garrapata, y OspC se incrementa en respuesta a la alimentación de una garrapata infectada en un mamífero, esto posibilita una herramienta diagnóstica o una vacuna que puede reconocer los antígenos que se expresan en diferentes fases del ciclo vital de Borrelia burgdorferi. Así, las proteínas quiméricas de la presente invención pueden actuar a nivel de la garrapata así como a nivel del hospedador en la prevención de la infección y/o de la enfermedad provocada por Borrelia. Además, al incorporar fragmentos polipeptídicos únicos de familias patógenas de Borrelia, tales como Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii y Borrelia garinii, se produce una herramienta diagnóstica o vacuna mejorada que puede detectar la exposición clínicamente importante a una diversidad más amplia de Borrelia patógena, a la vez que se pasan por alto el resto de familias de Borrelia que no son patógenas. Además, los polipéptidos de OspC se pueden seleccionar de cepas de Borrelia que están asociadas con la enfermedad diseminada, como se describió en el documento WO 00/78966, cuyas enseñanzas se incorporan aquí en su totalidad.

La presente invención también proporciona una combinación de antígenos de Borrelia en un único polipéptido que, cuando se usa como una vacuna, se espera que evite que la enfermedad de Lyme se haga sistémica. Las proteínas quiméricas de la presente invención pueden ser eficaces para prevenir la enfermedad de Lyme, así como tener un efecto terapéutico sobre la infección establecida, por ejemplo después de que el paciente note la picadura de la garrapata.

La presente invención se dirige a proteínas quiméricas sin lipidar. Las proteínas quiméricas sin lipidar, tales como las proteínas quiméricas OspC/OspA descritas aquí, tienen ciertas ventajas sobre sus homólogos lipidados. Estas ventajas incluyen métodos de producción más simples, rendimientos mejorados de proteína y métodos de purificación más simples. Aunque la carencia de una señal de lipidación proporciona varias ventajas, se creyó que la señal de lipidación era necesaria para la inmunogenicidad. Sin embargo, como se describe aquí, las proteínas quiméricas OspC/OspA sin lipidar de la presente invención provocan una respuesta inmunitaria que es al menos tan ampliamente reactiva como la de las proteínas de control OspA lipidadas y OspC lipidadas. Además, las proteínas quiméricas OspC/OspA sin lipidar de la presente invención provocan de forma inesperada una respuesta inmunitaria hacia más de una genoespecie y/o cepa de Borrelia que provoca la enfermedad de Lyme, que incluyen las genoespecies y/o cepas que no se usaron para generar el inmunógeno quimérico OspC/OspA particular.

Para una mejor comprensión de la presente invención junto con otros objetivos adicionales, se hace referencia a la siguiente descripción, junto con los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 resume los péptidos y los dominios antigénicos localizados mediante fragmentación proteolítica y química de OspA.

La Fig. 2 es una comparación de los dominios antigénicos representados en la Fig. 1 para OspA de nueve cepas de B. burgdorferi.

La Fig. 3 es un gráfico que representa el polimorfismo ponderado frente a la posición de aminoácidos entre 14 variantes de OspA. Los máximos marcados son: a) aminoácidos 132-145; b) aminoácidos 163-177; c) aminoácidos 208-221. La línea inferior en el valor de polimorfismo 1,395 demarca los excesos estadísticamente significativos del polimorfismo a p=0,05. La línea superior en el valor de polimorfismo 1,520 es lo mismo, excepto que se han eliminado del análisis original los primeros 29 aminoácidos en el extremo N-terminal monomórfico.

La Fig. 4 representa la alineación de aminoácidos de los residuos 200 a 220 para OspAs de las cepas B31 y K48, así como para los mutantes dirigidos 613, 625, 640, 613/625 y 613/640. La flecha indica Trp216. Los cambios de aminoácidos están subrayados.

La Fig. 5 es una proyección planar de la hélice de los residuos 204-217 de OspA de B31. Las letras mayúsculas indican los residuos hidrofóbicos; las letras minúsculas indican los residuos hidrofílicos; + y - indican residuos cargados de forma positiva y negativa, respectivamente. La línea discontinua indica la división de la hélice \alpha en un arco hidrofóbico (por encima de la línea) y un arco polar (por debajo de la línea). Adaptado de France et al. (Biochem. Biophys. Acta 1120: 59 (1992)).

La Fig. 6 representa un árbol filogenético para las cepas de Borrelia descritas en la Tabla I. Las cepas son las siguientes: 1 = B31; 2 = PKa1; 3 = ZS7; 4 = N40; 5 = 25015; 6 = K48; 7 = DK29; 8 = PHei; 9 = Ip90; 10 = PTrob;
11 = ACAI; 12 = PGau; 13 = Ip3; 14 = PBo; 15 = PKo.

Las Figs. 7A y 7B representan la secuencia de ácido nucleico de OspA-B31 (ID SEC Nº 6) y la secuencia de la proteína codificada (ID SEC Nº 7).

Las Figs. 8A, 8B y 8C representan la secuencia de ácido nucleico de OspA-K48 (ID SEC Nº 8) y la secuencia de la proteína codificada (ID SEC Nº 9).

Las Figs. 9A, 9B y 9C representan la secuencia de ácido nucleico de OspA-PGau (ID SEC Nº 10) y la secuencia de la proteína codificada (ID SEC Nº 11).

Las Figs. 10A y 10B representan la secuencia de ácido nucleico de una porción de un gen de OspA (ID SEC Nº 185) y la secuencia de la proteína codificada (ID SEC Nº 186).

Las Figs. 11A, 11B y 11C representan la secuencia de ácido nucleico de OspB-B31 (ID SEC Nº 21) y la secuencia de la proteína codificada (ID SEC Nº 22).

Las Figs. 12A y 12B representan la secuencia de ácido nucleico de OspC-B31 (ID SEC Nº 29) y la secuencia de la proteína codificada (ID SEC Nº 30).

Las Figs. 13A y 13B representan la secuencia de ácido nucleico de OspC-K48 (ID SEC Nº 31) y la secuencia de la proteína codificada (ID SEC Nº 32).

Las Figs. 14A y 14B representan la secuencia de ácido nucleico de OspC-PKo (ID SEC Nº 33) y la secuencia de la proteína codificada (ID SEC Nº 34).

Las Figs. 15A y 15B representan la secuencia de ácido nucleico de OspC-PTrob (ID SEC Nº 35) y la secuencia de la proteína codificada (ID SEC Nº 36).

Las Figs. 16A, 16B, 16C, 16D y 16E representan la secuencia de ácido nucleico de p93-B31 (ID SEC Nº 65) y la secuencia de la proteína codificada (ID SEC Nº 66).

La Fig. 17 representa la secuencia de ácido nucleico de p93-K48 (ID SEC Nº 67).

La Fig. 18 representa la secuencia de ácido nucleico de p93-PBo (ID SEC Nº 69).

La Fig. 19 representa la secuencia de ácido nucleico de p93-PTrob (ID SEC Nº 71).

La Fig. 20 representa la secuencia de ácido nucleico de p93-PGAU (ID SEC Nº 73).

La Fig. 21 representa la secuencia de ácido nucleico de p93-25015 (ID SEC Nº 77).

La Fig. 22 representa la secuencia de ácido nucleico de p93-PKo (ID SEC Nº 75).

Las Figs. 23A, 23B y 23C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspA-K48/OspA-PGAU (ID SEC Nº 85) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 86).

Las Figs. 24A, 24B y 24C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspA-B31/OspA-PGAU (ID SEC Nº 88) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 89).

Las Figs. 25A y 25B representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspA-B31/OspA-K48 (ID SEC Nº 91) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 92).

Las Figs. 26A, 26B y 26C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspA-B31/OspA-25015 (ID SEC Nº 94) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 95).

Las Figs. 27A, 27B y 27C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspA-K48/OspA-B31/OspA-K48 (ID SEC Nº 97) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 98).

Las Figs. 28A, 28B y 28C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspA-B31/OspA-K48/OspA-B31/OspA-K48 (ID SEC Nº 100) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 101).

Las Figs. 29A, 29B y 29C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspA-B31/OspB-B31 (ID SEC Nº 103) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 104).

Las Figs. 30A, 30B, 30C y 30D representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspA-B31/OspB-B31/OspC-B31 (ID SEC Nº 106) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 107).

Las Figs. 31A, 31B, 31C y 31D representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31/OspA-B31/OspB-B31 (ID SEC Nº 109) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 110).

Las Figs. 32A, 32B, 32C, 32D y 32E representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspA-B31/p93-B31 (ID SEC Nº 111) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 112).

Las Figs. 33A, 33B, 33C y 33D representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspB-B31/p41-B31 (122-234) (ID SEC Nº 113) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 114).

Las Figs. 34A, 34B, 34C y 34D representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspB-B31/p41-B31 (122-295) (ID SEC Nº 115) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 116).

Las Figs. 35A, 35B y 35C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspB-B31/p41-B31 (140-234) (ID SEC Nº 117) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 118).

Las Figs. 36A, 36B, 36C y 36D representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspB-B31/p41-B31 (140-295) (ID SEC Nº 119) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 120).

Las Figs. 37A, 37B, 37C, 37D y 37E representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspB-B31/p41-B31 (122-234)/OspC-B31 (ID SEC Nº 121) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 122).

Las Figs. 38A, 38B, 38C y 38D representan una alineación de las secuencias de ácidos nucleicos para OspC-B31 (ID SEC Nº 29), OspC-PKo (ID SEC Nº 33), OspC-PTrob (ID SEC Nº 35) y OspC-K48 (ID SEC Nº 31). Los ácidos nucleicos que son idénticos a los de la secuencia de ácido nucleico principal (aquí, OspC-B31) están representados por un punto (.); los ácidos nucleicos distintos se muestran en letras minúsculas.

Las Figs. 39A, 39B, 39C y 39D representan una alineación de las secuencias de ácidos nucleicos para OspD-PBo (ID SEC Nº 123), OspD-PGAU (ID SEC Nº 124), OspD-DK29 (ID SEC Nº 125) y OspD-K48 (ID SEC Nº 126). Los ácidos nucleicos que son idénticos a los de la secuencia de ácido nucleico principal (aquí, OspD-PBo) están representados por un punto (.); los ácidos nucleicos distintos se muestran en letras minúsculas.

Las Figs. 40A, 40B y 40C representan la secuencia de ácido nucleico de p41-B31 (ID SEC Nº 127) y después la secuencia de la proteína codificada (ID SEC Nº 128).

Las Figs. 41A, 41B, 41C, 41D, 41E, 41F, 41G y 41H representan una alineación de las secuencias de ácidos nucleicos para p41-B31 (ID SEC Nº 127), p41-PKa1 (ID SEC Nº 129), p41-PGAU (ID SEC Nº 51), p41-PBo (ID SEC Nº 130), p41-DK29 (ID SEC Nº 53) y p41-PKo (ID SEC Nº 131). Los ácidos nucleicos que son idénticos a los de la secuencia de ácido nucleico principal (aquí, p41-B31) están representados por un punto (.); los ácidos nucleicos distintos se muestran en letras minúsculas.

Las Figs. 42A, 42B, 42C, 42D, 42E, 42F, 42G, 42H, 42I, 42J, 42K, 42L, 42M, 42N, 42O y 42P representan una alineación de las secuencias de ácidos nucleicos para OspA-B31 (ID SEC Nº 6), OspA-PKa1 (ID SEC Nº 132), OspA-N40 (ID SEC Nº 133), OspA-ZS7 (ID SEC Nº 134), OspA-25015 (ID SEC Nº 12), OspA-PTrob (ID SEC Nº 135), OspA-K48 (ID SEC Nº 8), OspA-Hei (ID SEC Nº 136), OspA-DK29 (ID SEC Nº 49), OspA-Ip90 (ID SEC Nº 50), OspA-PBo (ID SEC Nº 55), OspA-Ip3 (ID SEC Nº 56), OspA-PKo (ID SEC Nº 57), OspA-ACAI (ID SEC Nº 58) y OspA-PGAU (ID SEC Nº 10). Los ácidos nucleicos que son idénticos a los de la secuencia de ácido nucleico principal (aquí, OspA-B31) se representan mediante un punto (.); los ácidos nucleicos distintos se muestran en letras minúsculas.

Las Figs. 43A y 43B representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspA-Tro/OspA-Bo (ID SEC Nº 137) que codifica la secuencia de la proteína quimérica de ID SEC Nº 138.

Las Figs. 44A y 44B representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspA-PGAU/OspA-Bo (ID SEC Nº 139) que codifica la secuencia de la proteína quimérica de ID SEC Nº 140.

Las Figs. 45A y 45B representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspA-B31/OspA-PGAU/OspA-B31/OspA-K48 (ID SEC Nº 143) que codifica la secuencia de la proteína quimérica de ID SEC Nº 144.

Las Figs. 46A y 46B representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspA-PGAU/OspA-B31/OspA-K48 (ID SEC Nº 141) que codifica la secuencia de la proteína quimérica de ID SEC Nº 142.

La Fig. 47 es un gráfico de barras que muestra la reactividad (medida mediante ELISA) de sueros de ratones inmunizados con la proteína de Borrelia indicada (OspA u OspC) o la proteína quimérica recombinante (OspC2-OspA) (eje X) frente a antígenos de OspA de B31 u OspC de B31 (leyenda).

La Fig. 48 es un gráfico de barras que muestra la reactividad (medida mediante ELISA) de sueros de ratones inmunizados con la proteína de Borrelia indicada (OspA u OspC) o la proteína quimérica recombinante (OspC2-OspA) (eje X) frente a antígenos de OspA de B31 u OspC de B31 (leyenda). Para los resultados del ELISA para el antígeno de OspA de B31, se añadió un fragmento de OspA de B31 purificado (aminoácidos 18-139) en exceso a los sueros de forma que la respuesta inmunitaria detectada fue específica para la región C-terminal de OspA.

La Fig. 49 es un gráfico de barras que muestra la reactividad de sueros de ratones inmunizados con la proteína quimérica de Borrelia indicada (lipOspA/Bo, lipOspAB/P u OspC-OspAB/P) (eje X) contra los antígenos de OspA indicados (leyenda) de las cepas B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) y PGau (Borrelia afzelii).

La Fig. 50 es un gráfico de barras que muestra la reactividad de sueros de ratones inmunizados con la proteína quimérica de Borrelia indicada (lipOspAP/Bo, lipOspAB/P) u OspC-OspAB/P) (eje X) contra la OspA indicada (leyenda) de las cepas B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) y PGau (Borrelia afzelii). En todos los casos, se añadió un fragmento purificado de OspA de B31 (aminoácidos 18-139) en exceso a los sueros de forma que la respuesta inmunitaria detectada es específica para la región C-terminal de OspA.

La Fig. 51 es un gráfico de barras que muestra la reactividad de sueros de ratones inmunizados con la proteína quimérica de Borrelia indicada (OspCB31-OspAB31, OspC2-OspAB31 o lip OspC-B31) (eje X) contra el antígeno de OspC indicado (leyenda) de la cepa B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto).

La Fig. 52 es un gráfico de barras que muestra la reactividad de sueros de ratones inmunizados con la proteína quimérica de Borrelia indicada (OspCB31-OspAB31, OspC2-OspAB31 o Lip OspA K/T) (eje X) contra los antígenos de OspA indicados (leyenda) de las cepas B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) y PGau (Borrelia afzelii).

La Fig. 53 es un gráfico de barras que muestra la reactividad de sueros de ratones inmunizados con la proteína quimérica de Borrelia indicada (OspCB31-OspAB/P, OspCB31-OspABPBP u OspCB31-OspAB31) (eje X) contra los antígenos de OspA indicados (leyenda) de las cepas B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) y PGau (Borrelia afzelii).

La Fig. 54 es un gráfico de barras que muestra la reactividad de sueros de ratones inmunizados con la proteína quimérica de Borrelia indicada (OspCB31-OspAB/P, OspCB31-OspABPBP u OspCB31-OspAB31) (eje X) contra la OspA indicada (leyenda) de las cepas B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) y PGau (Borrelia afzelii). En todos los casos, se añadió un fragmento purificado de OspA de B31 (aminoácidos 18-139) en exceso a los sueros de forma que la respuesta inmunitaria detectada es específica para la región C-terminal de
OspA.

Las Figs. 55A, 55B y 55C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31 (pb 55-633)/OspA-B31 (pb 52-822) (ID SEC Nº 145) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 146).

Las Figs. 56A, 56B y 56C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31 (pb 55-624)/OspA-B31 (pb 52-822) (ID SEC Nº 147) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 148).

Las Figs. 57A, 57B y 57C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-C2 (pb 55-612)/OspA-B31 (pb 52-822) (ID SEC Nº 149) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 150).

Las Figs. 58A, 58B y 58C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31 (pb 55-633)/OspA-B31 (pb 52-651)/OspA-K48 (pb 652-820) (ID SEC Nº 151) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 152).

Las Figs. 59A, 59B y 59C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-C2 (pb 55-612)/OspA-B31 (pb 52-651)/OspA-K48 (pb 652-820) (ID SEC Nº 153) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 154).

Las Figs. 60A, 60B y 60C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31 (pb 55-633)/OspA-B31 (pb 52-651)/OspA-PKo (pb 652-820) (ID SEC Nº 155) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 156).

Las Figs. 61A, 61B y 61C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-C2 (pb 55-612)/OspA-B31 (pb 52-651)/OspA-PKo (pb 652-820) (ID SEC Nº 157) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 158).

Las Figs. 62A, 62B y 62C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31 (pb 55-633)/OspA-K48 (pb 52-654)/OspA-Tro (pb 655-819) (ID SEC Nº 159) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 160).

Las Figs. 63A, 63B y 63C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-C2 (pb 55-612)/OspA-K48 (pb 52-654)/OspA-Tro (pb 655-819) (ID SEC Nº 161) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 162).

Las Figs. 64A, 64B y 64C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-C12 (pb 55-612)/OspA-B31 (pb 88-492)/OspA-PKo (pb 493-537)/OspA-B31 (pb 538-822) (ID SEC Nº 163) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 164).

Las Figs. 65A, 65B y 65C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-PKo (pb 55-639)/OspA-B31 (pb 88-492)/OspA-PKo (pb 493-537)/OspA-B31 (pb 538-651)/OspA-K48 (pb 652-825) (ID SEC Nº 165) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 166).

Las Figs. 66A, 66B y 66C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-Tro (pb 55-624)/OspA-B31 (pb 88-492)/OspA-PKo (pb 493-537)/OspA-B31 (pb 538-651)/OspA-PKo (pb 652-822) (ID SEC Nº 167) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 168).

Las Figs. 67A y 67B representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31 (pb 55-633)/OspA-B31 (pb 394-820) (ID SEC Nº 169) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 170).

Las Figs. 68A y 68B representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31 (pb 55-631)/OspA-B31 (pb 394-651)/OspA-K48 (pb 652-820) (ID SEC Nº 171) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 172).

Las Figs. 69A y 69B representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31 (pb 55-633)/OspA-B31 (pb 394-651)/OspA-PKo (pb 652-820) (ID SEC Nº 173) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 174).

Las Figs. 70A y 70B representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31 (pb 55-633)/OspA-K48 (pb 394-654)/OspA-Tro (pb 655-819) (ID SEC Nº 175) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 176).

Las Figs. 71A, 71B y 71C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31 (pb 55-633)/OspA-B31 (pb 88-492)/OspA-PKo (pb 493-537)/OspA-B31 (pb 541-651)/OspA-PKo (pb 652-822) (ID SEC Nº 177) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 178); también se generó una variante de esta secuencia, en la que se delecionó el N de la posición 190 de OspA de B31.

Las Figs. 72A, 72B y 72C representan la secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-C2 (pb 55-612)/OspA-B31 (pb 88-492)/OspA-PKo (pb 493-537)/OspA-B31 (pb 541-651)/OspA-PKo (pb 652-822) (ID SEC Nº 179) y la secuencia de la proteína quimérica codificada (ID SEC Nº 180); también se generó una variante de esta secuencia, en la que se delecionó el N de la posición 190 de OspA de B31.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a proteínas quiméricas que comprenden diversos polipéptidos antigénicos de Borrelia. La proteína quimérica comprende la proteína C de la superficie externa (OspC) y la proteína A de la superficie externa (OspA) de Borrelia. Estas proteínas quiméricas tienen la estructura general de OspC unida a OspA por medio de un enlace peptídico. Cada una de las porciones de OspA y OspC de la proteína quimérica OspC/OspA pueden estar lipidadas o sin lipidar. La quimera OspC/OspA comprende fragmentos de polipéptidos de OspC y OspA que no poseen señales de lipidación.

Las formas quiméricas de las proteínas OspA y OspC descritas aquí se biomodificaron de forma que la proteína quimérica resultante mantuvo al menos cierta antigenicidad de una o ambas moléculas originarias. Como se describe aquí, antigénico se refiere a la capacidad de un compuesto de unirse a los productos de una respuesta inmunitaria, tales como anticuerpos, receptores de células T o ambos. Tales respuestas se pueden medir mediante el uso de ensayos estándar de detección de anticuerpos, tales como ELISA o ensayos estándar de activación de células T. En una realización particular, las proteínas quiméricas OspC/OspA comprenden polipéptidos de OspA que carecen del dominio autorreactivo putativo que tiene similitud hacia una región del antígeno 1 asociado a la función de leucocitos humanos (hLFA-1) (Gross, D.M. et al., Science, 281: 703-706 (1998)).

La presente invención se refiere a proteínas quiméricas que comprenden polipéptidos antigénicos de Borrelia que no se dan en la naturaleza en la misma proteína de Borrelia. Las proteínas quiméricas son una combinación de dos o más polipéptidos antigénicos derivados de proteínas de Borrelia. Los polipéptidos antigénicos pueden derivar de diferentes proteínas de la misma especie de Borrelia, o de diferentes proteínas de especies diferentes de Borrelia, así como de las proteínas correspondientes de especies diferentes. Como se usa aquí, la expresión "proteína quimérica" describe una proteína que comprende dos o más polipéptidos que derivan de la proteína nativa de Borrelia correspondiente y/o no correspondiente. Un polipéptido "derivado de" una proteína nativa de Borrelia es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos igual que una secuencia de aminoácidos presente en una proteína de Borrelia, una secuencia de aminoácidos equivalente a la secuencia de aminoácidos de una proteína de Borrelia que se da de forma natural, o una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la secuencia de aminoácidos de una proteína de Borrelia que se da de forma natural (p.ej., que difiere en unos cuantos aminoácidos), como cuando un ácido nucleico que codifica una proteína se somete a mutagénesis dirigida. Las proteínas "correspondientes" son proteínas equivalentes de diferentes especies o cepas de Borrelia, tales como la proteína A de la superficie externa (OspA) de la cepa B31 y OspA de la cepa K48. La invención se refiere además a los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas
quiméricas.

En una realización, la presente invención se dirige a proteínas quiméricas que comprenden polipéptidos antigénicos de las cepas de Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme. En otra realización, las proteínas quiméricas descritas aquí comprenden polipéptidos antigénicos de diferentes genoespecies patógenas de Borrelia, tales como Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii y Borrelia garinii. En una realización preferida, las proteínas quiméricas comprenden polipéptidos antigénicos de cada una de las genoespecies patógenas de Borrelia, que incluyen Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii y Borrelia garinii.

La porción de OspA de las moléculas quiméricas de la presente invención pueden ser ellas mismas combinaciones quiméricas de más de un polipéptido de OspA. De forma similar, la porción de OspC de las moléculas quiméricas de la presente invención pueden ser ellas mismas combinaciones quiméricas de más de un polipéptido de OspC. Como se describe más adelante, los solicitantes han identificado dos dominios antigénicos distintos de OspA y OspB que flanquean el único triptófano conservado presente en OspA y en OspB. Estos dominios comparten una reactividad cruzada con diferentes genoespecies de Borrelia. Los aminoácidos precisos responsables de la variabilidad antigénica se determinaron por medio de mutagénesis dirigida, de forma que las proteínas con sustituciones específicas de aminoácidos están disponibles para el desarrollo de versiones quiméricas de OspA que se pueden incluir en las proteínas quiméricas OspC/OspA de la presente invención. Además, los solicitantes han identificado dominios hipervariables inmunológicamente importantes en las proteínas OspA, como se describe más adelante en el Ejemplo 2. El primer dominio hipervariable de interés para las proteínas quiméricas, el dominio A, incluye los residuos de aminoácidos 120-140 de OspA, el segundo dominio hipervariable, el dominio B, incluye los residuos 150-180, y el tercer dominio hipervariable, el dominio C, incluye los residuos 200-216 ó 217 (dependiendo de la posición del único residuo de triptófano conservado en OspA de esa especie particular de Borrelia) (véase la Fig. 3). Además, los solicitantes han secuenciado los genes de diversas proteínas de Borrelia.

Estos descubrimientos han ayudado en el desarrollo de nuevas proteínas recombinantes de Borrelia que incluyen dos o más regiones o secuencias de aminoácidos que no se dan en la misma proteína de Borrelia en la naturaleza. Las proteínas recombinantes comprenden polipéptidos de una diversidad de proteínas de Borrelia, que incluyen, pero no se limitan a, OspA, OspB, OspC, OspD, p12, p39, p41, p66 y p93. Las combinaciones preferidas incluyen la totalidad o una porción de OspC unida a la totalidad o una porción de OspA. Los polipéptidos antigénicamente relevantes de cada una de varias proteínas se combinan en una única proteína quimérica.

En una realización de la presente invención, hay quimeras disponibles que incluyen polipéptidos de OspA antigénicos que flanquean un residuo de triptófano. OspB tiene una estructura primaria similar a OspA y se incluye en la siguiente discusión. Los polipéptidos antigénicos derivan de la porción proximal del triptófano (la porción de la proteína OspA presente entre el extremo aminoterminal y el triptófano conservado de la proteína), o de la porción distal del triptófano (la porción de la proteína OspA presente entre el triptófano conservado de la proteína y el extremo carboxiterminal) de OspA. Las quimeras resultantes pueden ser quimeras OspA-OspA (p.ej., quimeras que incorporan polipéptidos derivados de OspA de diferentes cepas de Borrelia), quimeras OspA-OspB, o quimeras OspB-OspB, y se construyen de forma que los residuos de aminoácidos amino-proximales al triptófano invariable son de una proteína y los residuos carboxi-proximales al triptófano invariable son de la otra proteína. Por ejemplo, una quimera disponible consiste en un polipéptido derivado de la región amino-proximal de OspA de la cepa B31, seguido por el residuo de triptófano, seguido por un polipéptido derivado de la región carboxi-proximal de OspA de la cepa K48 (ID SEC Nº 92). Otra quimera disponible incluye un polipéptido derivado de la región amino-proximal de OspA de la cepa B31, y un polipéptido derivado de la región carboxi-proximal de OspB de la cepa B31 (ID SEC Nº 104). Si el polipéptido proximal al triptófano de estas proteínas quiméricas deriva de OspA, el polipéptido proximal puede estar subdividido adicionalmente en tres dominios hipervariables (dominios A, B y C), cada uno de los cuales puede derivar de OspA de una cepa diferente de Borrelia. Estas proteínas quiméricas comprenden además polipéptidos antigénicos de OspC, además de los polipéptidos antigénicos que flanquean el residuo de triptófano.

Las proteínas quiméricas OspC/OspA de la presente invención comprenden al menos un primer y un segundo polipéptido, en el que el primer polipéptido comprende OspC de Borrelia burgdorferi y en el que el segundo polipéptido comprende OspA de Borrelia burgdorferi, de forma que OspC comprende el extremo N-terminal de la proteína.

El primer polipéptido comprende un polipéptido de OspC de Borrelia burgdorferi desde alrededor del residuo de aminoácido 19 hasta alrededor del residuo de aminoácido 213, y el segundo polipéptido comprende un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi. En otra realización, el primer polipéptido comprende un polipéptido de OspC de Borrelia burgdorferi desde alrededor del residuo de aminoácido 19 hasta alrededor del residuo de aminoácido 211. En otra realización, el primer polipéptido comprende un polipéptido de OspC de Borrelia burgdorferi desde alrededor del residuo de aminoácido 19 hasta alrededor del residuo de aminoácido 208. En otra realización, el primer polipéptido comprende un polipéptido de OspC de Borrelia burgdorferi desde alrededor del residuo de aminoácido 19 hasta alrededor del residuo de aminoácido 204. La numeración de los residuos de OspC es según la numeración de la ID SEC Nº: 30 (Figs. 12A y 12B). Es evidente que la persona experta en la técnica reconoce que los genes de OspC de diferentes cepas y/o genoespecies pueden diferir en su secuencia primaria, y que basándose en la homología se podrían identificar y usar en la presente invención regiones similares de tales proteínas OspC solamente con experimentación rutinaria o sin ella.

En una realización, la invención se dirige a proteínas quiméricas OspC/OspA en las que el primer polipéptido comprende un polipéptido de OspC de Borrelia burgdorferi y el segundo polipéptido comprende un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi desde alrededor del residuo de aminoácido 18 hasta alrededor del residuo de aminoácido 273. En otras realizaciones, la proteína quimérica OspC/OspA comprende un primer polipéptido que es un polipéptido de OspC de Borrelia burgdorferi y un segundo polipéptido que es un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido de OspA desde alrededor del residuo de aminoácido 132 hasta alrededor del residuo de aminoácido 273, un polipéptido de OspA desde alrededor del residuo de aminoácido 18 hasta alrededor del residuo de aminoácido 273. La numeración de los residuos de OspA es según la numeración de la ID SEC Nº: 7 (Figs. 7A y 7B). Es evidente que la persona experta en la técnica reconoce que los genes de OspA de diferentes cepas y/o genoespecies pueden diferir en su secuencia primaria, y que basándose en la homología se podrían identificar y usar en la presente invención regiones similares de tales proteínas OspA solamente con experimentación rutinaria o sin ella.

La presente invención se dirige además a proteínas quiméricas OspC/OspA en las que el primer polipéptido comprende un polipéptido de OspC de Borrelia burgdorferi y el segundo polipéptido comprende un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi, en las que el polipéptido de OspA comprende dos o más fragmentos de polipéptido de OspA como se describió anteriormente. El polipéptido de OspA comprende porciones de OspA de dos o más cepas de Borrelia. En otra realización preferida, el polipéptido de OspA comprende porciones de OspA de dos o más genoespecies de Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme, p.ej., en las que las genoespecies son Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii y/o Borrelia garinii. En aún otra realización preferida, la proteína quimérica OspC/OspA comprende uno o más polipéptidos de cada una de las genoespecies patógenas, Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii y Borrelia garinii.

Las quimeras descritas aquí se pueden producir de forma que son sumamente solubles, producidas abundantemente en E. coli, y sin lipidar. También se pueden producir proteínas quiméricas lipidadas. Además, las proteínas quiméricas se pueden diseñar para que acaben en una etiqueta de afinidad (etiqueta de His) para facilitar la purificación. Las proteínas recombinantes descritas aquí se han construido para mantener la antigenicidad de al menos uno de los polipéptidos originarios. Además, hay disponibles proteínas recombinantes específicas de las diversas genoespecies de Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme, porque se han secuenciado los genes de cada una de las genoespecies principales. Estas proteínas recombinantes con sus propiedades biofísicas y antigénicas nuevas serán reactivos diagnósticos y vacunas experimentales importantes.

Las proteínas quiméricas de la presente invención son ventajosas, ya que mantienen al menos cierta reactividad específica hacia los anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen las proteínas de Borrelia de tipo natural. Las proteínas son inmunógenas, y provocan anticuerpos que inhiben el crecimiento y/o inducen la lisis de Borrelia in vitro. Además, en algunas realizaciones, las proteínas proporcionan dominios antigénicos de dos o más cepas y/o proteínas de Borrelia en una única proteína. Tales proteínas son particularmente útiles en ensayos inmunodiagnósticos. Por ejemplo, las proteínas de la presente invención se pueden usar como reactivos en ensayos para detectar la presencia de anticuerpos hacia Borrelia nativa en individuos potencialmente infectados. Estas proteínas se pueden usar también como reactivos inmunodiagnósticos, tales como en transferencias en mancha, transferencias de Western, ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), o ensayos de aglutinación. Las proteínas quiméricas de la presente invención se pueden producir mediante técnicas conocidas, tales como mediante metodología recombinante, reacción en cadena de la polimerasa, o mutagénesis.

Además, las proteínas de la presente invención son útiles como inmunógenos vacunales contra la infección por Borrelia. Debido a que se ha demostrado que Borrelia es clonal, una proteína que comprenda polipéptidos antigénicos de una diversidad de proteínas y/o especies de Borrelia proporcionará inmunoprotección durante un tiempo considerable cuando se use en una vacuna. La carencia de recombinación intragénica significativa, un proceso que podría generar rápidamente epítopos nuevos con propiedades antigénicas modificadas, asegura que Borrelia solamente puede cambiar el tipo antigénico mediante la acumulación de cambios mutacionales, lo cual es lento comparado con la recombinación para generar tipos antigénicos diferentes. La proteína quimérica se puede combinar con un vehículo fisiológicamente aceptable y administrarla a un animal vertebrado por medio de métodos estándar (p.ej., de forma intravenosa o intramuscular).

Además de las proteínas quiméricas descritas aquí, la presente invención se dirige además a los ácidos nucleicos que codifican la proteína quimérica de Borrelia descrita aquí. En una realización de la presente invención, la composición comprende un ácido nucleico que codifica una proteína quimérica de al menos dos polipéptidos, en la que el primer polipéptido comprende OspC de Borrelia burgdorferi, y el segundo polipéptido comprende OspA de Borrelia burgdorferi, de forma que OspC está en dirección 5' de OspA. Los fragmentos de ácidos nucleicos de OspC y OspA que constituyen la proteína quimérica pueden ser de la misma cepa o genoespecie de Borrelia, de diferentes cepas o genoespecies de Borrelia, o de combinaciones de ácidos nucleicos que son de las mismas y/o de diferentes cepas o genoespecies de Borrelia.

Se entiende que los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que comprenden la proteína quimérica pueden incluir nucleótidos adicionales o menos nucleótidos para simplificar la construcción del gen que codifica el polipéptido quimérico, p.ej., para permitir el uso de sitios de endonucleasas de restricción adecuados o para permitir la ligadura de los fragmentos génicos de forma que se crea una región codificante contigua. Basándose en la orientación proporcionada aquí, alguien de experiencia habitual en la técnica podría fácilmente añadir o eliminar nucleótidos de los extremos de los fragmentos génicos que codifican los polipéptidos de la proteína quimérica OspC/OspA para generar proteínas quiméricas de la presente invención solamente con experimentación rutinaria o sin ella. Además, puede haber alrededor de 1 a alrededor de 10 aminoácidos adicionales en el extremo N- y/o C-terminal de los polipéptidos y las proteínas quiméricas de la presente invención, y aún mantenerse las propiedades de la presente invención. También se entiende que los expertos en la técnica, mediante el uso de métodos conocidos en la técnica y/o los métodos descritos aquí, podrían generar proteínas quiméricas OspC-OspA adicionales, y que la invención abarca estas proteínas
quiméricas.

La presente invención se dirige además a vectores de expresión que comprenden un ADN aislado que codifica la proteína quimérica de Borrelia descrita aquí. La composición incluye un vector de expresión que comprende un ADN aislado que codifica una proteína quimérica OspC/OspA, en la que la porción de OspC de la proteína está en dirección 5' de la porción de OspA. La presente invención también abarca células hospedadoras que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína quimérica OspC/OspA, como se describe aquí.

La presente invención se dirige además a métodos para producir los polipéptidos quiméricos de Borrelia descritos aquí. El método para producir una proteína quimérica de Borrelia comprende seleccionar una secuencia polinucleotídica que codifica OspC, o una porción antigénica suya, seleccionar una secuencia polinucleotídica que codifica OspA, o una porción antigénica suya, y ligar estas secuencias polinucleotídicas, de forma que OspC comprende el extremo N-terminal de la proteína. Los polipéptidos de la presente invención también se pueden expresar de forma recombinante en hospedadores microbianos adecuados, en los que dichos hospedadores incluyen, pero no se limitan a, hospedadores bacterianos, tales como E. coli, hospedadores fúngicos, tales como S. cerevisiae, u hospedadores de cultivo de células, tales como los de cultivo de células mamíferas o los de cultivo de células de insectos.

La presente invención se puede usar además en métodos para administrar los polipéptidos quiméricos de Borrelia descritos aquí. El método comprende administrar la proteína quimérica en un vehículo fisiológicamente aceptable a un individuo. El individuo desarrolla al menos cierta respuesta inmunitaria hacia la proteína quimérica. Como ejemplo, el individuo podría generar una respuesta inmunitaria humoral, en la que el individuo produce anticuerpos que reconocen al menos una porción de dicho polipéptido quimérico. Los anticuerpos que reconocen el polipéptido quimérico pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, tal como IgM, IgD, IgA e IgG o sus combinaciones.

La presente invención se puede usar además en métodos para administrar un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico descrito aquí. El método comprende administrar el ácido nucleico en un vehículo fisiológicamente aceptable a un individuo mediante el uso de métodos aceptados en la técnica de administración de ADN, que incluyen, pero no se limitan a, administración biolística y encapsulación lipídica. El polipéptido quimérico se expresa al menos de forma transitoria y el individuo desarrolla al menos cierta respuesta inmunitaria hacia la proteína quimérica codificada por el ácido nucleico.

La invención también abarca métodos para usar las proteínas quiméricas descritas aquí en ensayos diagnósticos. En una realización, el método se puede usar para detectar la presencia de anticuerpos específicos de OspA y/o OspC en una muestra, p.ej., una muestra de interés de un hospedador. En una realización, el método comprende poner en contacto una muestra de interés del hospedador con la proteína quimérica OspC/OspA en condiciones en las que los anticuerpos, si están presentes en la muestra del hospedador, se unen a la proteína quimérica, por lo que forman complejos antígeno-anticuerpo. Los complejos antígeno-anticuerpo se detectan después. De esta manera, se puede detectar una respuesta inmunitaria hacia Borrelia que provoca la enfermedad de Lyme.

Como se describe aquí, las proteínas quiméricas de la presente invención incorporan dominios antigénicos de diferentes proteínas de Borrelia, así como de diferentes cepas y/o genoespecies de Borrelia. Como tales, son útiles en la detección o el diagnóstico de la presencia de Borrelia que provoca la enfermedad de Lyme, en especial de Borrelia de grupos capaces de provocar síntomas diseminados de la enfermedad de Lyme. Los síntomas diseminados se refieren a la infección fuera de la lesión cutánea de eritema migratorio, p.ej., infección en la sangre, SNC o líquido
sinovial.

Los polipéptidos quiméricos de la presente invención provocan respuestas inmunitarias específicas hacia OspC y OspA. En una realización, los polipéptidos quiméricos provocan respuestas inmunitarias hacia cepas de Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme de la misma genoespecie que la representada por la proteína quimérica OspC/OspA. En otra realización, los polipéptidos quiméricos provocan respuestas inmunitarias hacia cepas de Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme de diferentes genoespecies que la representada por la proteína quimérica OspC/OspA, así como hacia Borrelia que provoca la enfermedad de Lyme de la misma genoespecie que la representada por la proteína quimérica OspC/OspA. La respuesta inmunitaria incluye, pero no se limita a, una respuesta humoral, una respuesta secretora, una respuesta mediada por células o cualquier combinación suya.

Las composiciones inmunógenas de la presente invención se pueden usar también para inmunizar animales, p.ej. mamíferos, que incluyen humanos. Se entiende que la inmunización provoca respuestas inmunógenas específicas como se describe aquí. En una realización, la administración de una composición inmunógena, concretamente una proteína quimérica OspC/OspA o un ácido nucleico quimérico OspC/OspA, a un mamífero da como resultado que el animal desarrolle inmunidad hacia la infección por Borrelia que provoca la enfermedad de Lyme, p.ej., Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii y/o Borrelia garinii.

La inmunidad, como se describe aquí, se entiende que significa la capacidad del animal tratado para resistir la infección (p.ej., la infección sistémica), para superar la infección (p.ej., la infección sistémica), o para superar la infección (p.ej., la infección sistémica) más fácilmente y/o más rápidamente en comparación con los individuos sin inmunizar y/o sin tratar. La inmunidad puede incluir además una capacidad mejorada del individuo tratado para sufrir una infección con síntomas clínicos reducidos o sin síntomas clínicos de infección sistémica. Se puede tratar al individuo con las proteínas quiméricas de la presente invención de forma proactiva, p.ej. una vez al año, o alternativamente tras sufrir una picadura de garrapata.

En una realización, la proteína quimérica OspC/OspA de la presente invención, junto con excipientes y/o adyuvantes adecuados, se administra a un animal de forma que el animal desarrolla una respuesta inmunitaria hacia al menos uno de los polipéptidos de OspC y/o OspA de la composición. La composición farmacéutica se puede administrar también con otros componentes adecuados para el uso in vitro y/o in vivo. Estos componentes adicionales incluyen tampones, proteínas portadoras, adyuvantes, excipientes, conservantes y sus combinaciones.

La presente invención se dirige además a composiciones farmacéuticas que se pueden usar para vacunar y/o tratar la infección por Borrelia en un animal o humano. En una realización particular, la composición farmacéutica comprende una proteína quimérica OspC/OspA de Borrelia burgdorferi. La composición farmacéutica se puede administrar también junto con un vehículo, un excipiente y/o un adyuvante fisiológicamente aceptables. Los adyuvantes adecuados se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO 96/40290, cuyas enseñanzas completas se incorporan aquí como referencia), y se pueden usar, por ejemplo, para incrementar la inmunogenicidad, la potencia o la semivida de las proteínas quiméricas en el animal tratado.

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Las composiciones farmacéuticas usadas para vacunar y/o tratar la infección por Borrelia se pueden preparar mediante el uso de métodos para preparar vacunas que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, las proteínas quiméricas OspC/OspA descritas aquí se pueden aislar y/o purificar mediante técnicas conocidas, tales como mediante cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis preparativa, precipitación selectiva o sus combinaciones. Las proteínas quiméricas preparadas se pueden mezclar con otros reactivos adecuados como se describe aquí, de forma que la proteína quimérica está a una concentración adecuada. La dosis de la proteína quimérica variará, y depende de la edad, peso y/o condición física del animal, p.ej., mamífero, humano, a tratar. La dosis óptima se puede determinar mediante técnicas de optimización rutinarias, mediante el uso de modelos animales adecuados.

La administración de la composición farmacéutica a usar como vacuna puede ser mediante cualquier técnica adecuada. Las técnicas adecuadas para la administración de la composición farmacéutica incluyen, pero no se limitan a, inyección, p.ej., inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intravenosa, inyección intraperitoneal; administración mucosa, p.ej., mediante la exposición de la mucosa nasal a gotas nasales que contienen las proteínas o las proteínas quiméricas de la presente invención; administración oral; e inmunización con ADN.

La incorporación de fragmentos de polipéptidos de diferentes cepas y/o genoespecies de Borrelia burgdorferi permite un intervalo de detección mayor y una herramienta de vacunación más eficaz. La presente invención proporciona una combinación quimérica de proteínas que, cuando se usa como una vacuna, puede evitar que la enfermedad de Lyme se haga sistémica. Las proteínas quiméricas de la presente invención pueden ser eficaces para prevenir la enfermedad de Lyme, así como tener un efecto terapéutico sobre la infección establecida, por ejemplo, después de que el paciente note la picadura de garrapata. Ya que las proteínas quiméricas de la presente invención comprenden los polipéptidos de OspC y OspA, se espera que actúen a nivel de la garrapata así como a nivel del hospedador para prevenir tanto la infección como la enfermedad debidas a Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii y/o Borrelia garinii.

La presente invención se dirige además a equipos diagnósticos que comprenden los polipéptidos quiméricos descritos aquí. El equipo comprende una proteína quimérica que comprende al menos un primer y un segundo polipéptido, en el que el primer polipéptido comprende OspC de Borrelia burgdorferi y en el que el segundo polipéptido comprende OspA de Borrelia burgdorferi, de forma que OspC comprende el extremo N-terminal de la proteína. El equipo también incluye reactivos para detectar los complejos anticuerpo-antígeno que se forman entre la proteína quimérica OspC/OspA y los anticuerpos que están presentes en una muestra, p.ej., una muestra del hospedador suministrada por el usuario.

Como resultado de la presente invención, es posible preparar herramientas diagnósticas mejoradas que comprenden antígenos de OspA y OspC de diversas cepas y/o genoespecies de Borrelia burgdorferi. Ya que OspA se expresa principalmente en el vector de garrapata, y OspC se incrementa en respuesta a la alimentación de una garrapata infectada en un mamífero, las composiciones diagnósticas de la invención pueden reconocer los antígenos que se expresan en diferentes fases del ciclo vital de Borrelia burgdorferi. Además, mediante la incorporación de fragmentos de polipéptidos únicos de las familias patógenas de Borrelia, la presente invención posibilita composiciones diagnósticas mejoradas que pueden detectar la exposición clínicamente importante a Borrelia patógena, a la vez que se pasa por alto el resto de las familias de Borrelia que no son patógenas.

Como se describe aquí, las proteínas quiméricas OspC/OspA se biomodificaron de forma que se mantuvieron los dominios protectores de cada proteína. En los experimentos descritos aquí, los ratones se inmunizaron con proteínas OspA, OspC u OspC/OspA quiméricas en hidróxido de aluminio. Después se extrajo sangre a los ratones y se ensayaron las respuestas de anticuerpos contra OspC y OspA derivadas de diversas cepas de Borrelia. En experimentos adicionales, estos ratones inmunizados se expusieron a garrapatas infectadas con Borrelia burgdorferi y se estudió la transmisión de la infección.

Los ratones inmunizados con la proteína quimérica OspC/OspA proporcionaron una respuesta de anticuerpos notable y equivalente hacia OspA y OspC, en comparación con los ratones inmunizados con proteínas de control OspA y OspC (Figs. 47 y 48). Además, los anticuerpos de los sueros de los ratones inmunizados con la proteína quimérica OspC/OspA fueron reactivos también contra antígenos derivados de diferentes cepas de Borrelia burgdorferi (Figs. 49-50 y 52-54). Los ratones inmunizados con quimera estuvieron protegidos completamente contra la exposición a garrapatas infectadas con Borrelia burgdorferi en comparación con los controles vacunados de referencia (tasas de infección del 100%) (Tabla VI).

En otros experimentos descritos aquí, los ratones se inmunizaron con una proteína quimérica OspA lipidada, una proteína quimérica OspC lipidada, o una proteína quimérica OspC/OspA sin lipidar, una vez más en presencia de hidróxido de aluminio. Después se extrajo sangre a los ratones y se ensayaron las respuestas de anticuerpos contra OspA y OspC derivadas de diversas cepas de Borrelia. Sorprendentemente, los resultados de estos estudios indican que los ratones inmunizados con la proteína quimérica OspC/OspA sin lipidar tienen respuestas de anticuerpos hacia OspA y OspC que son equivalentes o mayores que las generadas por los ratones inmunizados con las proteínas quiméricas OspA u OspC lipidadas correspondientes (Figs. 49-51).

Los resultados de los estudios presentados aquí indican que los ratones inmunizados con las proteínas quiméricas OspC-OspA generan una respuesta de anticuerpos potente contra dos objetivos inmunoprotectores que se expresan en diferentes fases del ciclo vital de Borrelia burgdorferi.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos, que no se deben interpretar como limitantes de ninguna manera.

Ejemplificación Ejemplo 1 Purificación de la proteína A de la superficie externa de Borrelia burgdorferi y análisis de los dominios de unión a anticuerpo

Este ejemplo detalla un método para la purificación de grandes cantidades de proteína A de la superficie externa (OspA) nativa hasta homogeneidad, y describe la cartografía de las especificidades antigénicas de varios MAbs anti-OspA. Se purificó OspA hasta homogeneidad aprovechando su resistencia a la digestión con tripsina. El marcado intrínseco con ácido ^{14}C-palmítico confirmó que OspA estaba lipidada, y la digestión parcial estableció la lipidación en la cisteína aminoterminal de la molécula.

Se determinó la reactividad de siete anticuerpos monoclonales murinos anti-OspA hacia nueve aislamientos diferentes de Borrelia mediante análisis de transferencia de Western. La OspA purificada se fragmentó mediante escisión enzimática o química, y los anticuerpos monoclonales fueron capaces de definir cuatro dominios inmunógenos distintos (véase la Fig. 1). El dominio 3, que incluyó los residuos 190-220 de OspA, fue reactivo con anticuerpos protectores que se sabe que aglutinan el organismo in vitro, e incluyeron distintas especificidades, algunas de las cuales no se limitaban a un genotipo de B. burgdorferi.

A. Purificación de OspA nativa

La solubilización con detergente de B. burgdorferi desprende las proteínas de la superficie externa y produce preparaciones parcialmente purificadas que contienen tanto OspA como proteína B de la superficie externa (OspB) (Barbour, A.G. et al., Infect. Immun. 52 (5): 549-554 (1986); Coleman, J.L. y J.L. Benach, J Infect. Dis. 155 (4): 756-765 (1987); Cunningham, T.M. et al., Ann. NY Acad. Sci. 539: 376-378 (1988); Brandt, M.E. et al., Infect. Immun. 58: 983-991 (1990); Sambri, V. y R. Cevenini, Microbiol. 14: 307-314 (1991)). Aunque tanto OspA como OspB son sensibles a la digestión con proteinasa K, en contraste con OspB, OspA es resistente a la escisión mediante tripsina (Dunn, J. et al., Prot. Exp. Purif. 1: 159-168 (1990); Barbour, A.G. et al., Infect. Immun. 45: 94-100 (1984)). La insensibilidad relativa a la tripsina es sorprendente en vista del hecho de que OspA tiene un contenido elevado de lisina (16% para B31), y puede estar relacionada con la configuración relativa de OspA y B en la membrana
externa.

Radiomarcado intrínseco de Borrelia

Se realizó el marcado de lipoproteínas como describió Brandt et al. (Brandt et al., Infect. Immun. 58: 983-991 (1990)). Se añadió ácido ^{14}C-palmítico (ICN, Irvine, California) a los medios BSK II hasta una concentración final de 0,5 \muCi por mililitro (ml). Los organismos se cultivaron a 34ºC en este medio hasta que se alcanzó una densidad de 10^{8} células por ml.

Purificación de la proteína OspA de la cepa B31 de Borrelia

Borrelia burgdorferi, marcada con ácido ^{14}C-palmítico o sin marcar, se recogió y se lavó como se describió (Brandt, M.E. et al., Infect. Immun. 58: 983-991 (1990)). Se tripsinizaron los organismos completos según el protocolo de Barbour et al. (Infect. Immun. 45: 94-100 (1984)) con algunas modificaciones. El sedimento se suspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS 10 mM, pH 7,2) que contenía un 0,8% de tripsina tratada con tosil-L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK) (Sigma, St. Louis, Missouri), esta última en una proporción de 1 \mug por 10^{8} células. La reacción se llevó a cabo a 25ºC durante 1 hora, tras lo cual se centrifugaron las células. El sedimento se lavó en PBS con 100 \mug/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Se llevó a cabo la partición del sedimento con Triton X-114 como describió Brandt et al. (Brandt et al., Infect. Immun. 58: 983-991 (1990)). Tras el tratamiento con tripsina, las células se resuspendieron en un 2% (v/v) de Triton X-114 helado en PBS a 10^{9} células por ml. La suspensión se hizo rotar durante la noche a 4ºC, y la fracción insoluble se extrajo en forma de un sedimento tras centrifugación a 10.000 X g durante 15 minutos a 4ºC. El sobrenadante (fracción soluble) se incubó a 37ºC durante 15 minutos y se centrifugó a temperatura ambiente a 1000 X g durante 15 minutos para separar las fases acuosa y de detergente. La fase acuosa se decantó y se añadió PBS helado a la fase inferior de Triton, se mezcló, se calentó a 37ºC, y se centrifugó de nuevo a 1000 X g durante 15 minutos. Se repitió el lavado dos veces más. Finalmente, se extrajo el detergente de la preparación mediante el uso de una columna de centrifugación de Bio-Beads SM2 (BioRad, Melville, Nueva York) como se describió (Holloway, P.W., Anal. Biochem. 53: 304-308 (1973)).

La cromatografía de intercambio iónico se llevó a cabo como describió Dunn et al. (Dunn et al., Prot. Exp. Purif. 1: 159-168 (1990)) con modificaciones menores. Se disolvió OspA bruta en tampón A (1% de Triton X-100, tampón fosfato 10 mM (pH 5,0)) y se cargó en una resina de Sepharose SP (Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey), se pre-equilibró con tampón A a 25ºC. Después de lavar la columna con 10 volúmenes de lecho de tampón A, se eluyó la OspA unida con tampón B (1% de Triton X-100, tampón fosfato 10 mM (pH 8,0)). Las fracciones de OspA se detectaron mediante ensayo de proteínas con el uso del método BCA (Pierce, Rockford, Illinois), o como la radiactividad cuando se fraccionó el material marcado de forma intrínseca. El Triton X-100 se eliminó mediante el uso de una columna de centrifugación de Bio-Beads SM2.

Este método purifica OspA a partir de una preparación de membranas de la superficie externa. En ausencia del tratamiento con tripsina, OspA y B fueron los componentes principales de la fracción soluble obtenida tras la partición con Triton de la cepa B31. Por contraste, cuando la extracción con Triton se llevó a cabo después del tratamiento con tripsina, no se observó la banda de OspB. La purificación adicional de OspA-B31 en una columna de Sepharose SP dio como resultado una única banda mediante SDS-PAGE. El rendimiento tras la eliminación del detergente fue de aproximadamente 2 mg por litro de cultivo. Este método de purificación de OspA, como se describe aquí para la cepa B31, se puede usar también para otros aislamientos de Borrelia. Para las cepas tales como la cepa K48, que carece de OspB, se puede omitir el tratamiento con tripsina.

Sitio de lipidación de OspA-B31

Se purificó OspA marcada con ácido ^{14}C-palmítico de la cepa B31 como se describió anteriormente y se digirió parcialmente con endoproteinasa Asp-N (datos no mostrados). Tras la digestión, fue aparente mediante SDS-PAGE una banda nueva de peso molecular menor, y se descubrió mediante secuenciación aminoterminal directa que comenzaba en Asp_{25}. Esta banda no tuvo señal de radiactividad mediante autorradiografía (datos no mostrados). OspA y B contienen una secuencia señal (L-X-Y-C) similar al consenso descrito para las lipoproteínas de E. coli, y se ha predicho que el sitio de lipidación de OspA y B debería ser la cisteína aminoterminal (Brandt, M.E. et al., Infect. Immun 58: 983-991 (1990)). Los resultados presentados aquí apoyan esta predicción.

B. Comparación de las regiones de unión a anticuerpo de OspA en nueve cepas de Borrelia burgdorferi

La disponibilidad de los aminoácidos secuenciados para OspA de varios aislamientos diferentes, combinada con la cartografía de péptidos y el análisis de transferencia de Western, permitió la identificación de los dominios antigénicos reconocidos por los anticuerpos monoclonales (MAbs) y posibilitó la inferencia de los residuos de aminoácidos claves responsables de la reactividad específica con anticuerpos.

Cepas de Borrelia burgdorferi

Se usaron nueve cepas de Borrelia, que incluían siete cepas europeas y dos norteamericanas, en este estudio de dominios de unión a anticuerpos de varias proteínas. La información concerniente a las cepas se resume en la Tabla I, a continuación.

TABLA I Cepas representativas de Borrelia

1

2

Las cepas K48, PGAU y DK29 fueron suministradas por R. Johnson, Universidad de Minnesota; PKo y PTrob fueron suministradas por B. Wilske y V. Preac-Mursic del Instituto Pettenkhofer, Múnich, Alemania; e Ip3 e Ip90 fueron suministradas por L. Mayer del Centro de Control de Enfermedades, Atlanta, Georgia. Las cepas norteamericanas incluyeron la cepa 25015, proporcionada por J. Anderson del Departamento de Agricultura de Connecticut; y la cepa B31 (ATCC 35210).

Anticuerpos monoclonales

Se utilizaron siete anticuerpos monoclonales (MAbs) en este estudio. Cinco de los MAbs (12, 13, 15, 83 y 336) se produjeron a partir de hibridomas clonados y subclonados como se describió previamente (Schubach, W.H., et al, Infect. Immun. 59(6):1911-1915 (1991)). El MAb H5332 (Barbour, A.G. et al., Infect. Immun. 41: 795-804 (1983)) fue una donación del Dr. Alan Barbour, Universidad de Texas, y el MAb CIII.78 (Sears, J.E. et al., J. Immunol. 147(6):1995-2000 (1991)) fue una donación de Richard A. Flavell, Universidad de Yale. Los MAbs 12 y 15 se generaron contra B31 completa sonicada; el MAb 336 se produjo contra PGAU completa; y los MAbs 13 y 83 se generaron hacia una forma truncada de OspA clonada a partir de la cepa K48 y expresada en E. coli mediante el uso del sistema de ARN polimerasa de T7 (McGrath, B.C. et al., Vaccines, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York, págs. 365-370 (1993)). Todos los MAbs se tipificaron como inmunoglobulinas G (IgG).

Métodos de escisión de proteínas, transferencia de Western y secuenciación aminoterminal

La predicción de los diversos sitios de escisión se llevó a cabo mediante el conocimiento de la secuencia primaria de aminoácidos derivada de las secuencias nucleotídicas completas de OspA, muchas de las cuales están disponibles actualmente (véase la Tabla II, más adelante). Los sitios de escisión se pueden predecir también basándose en la secuencia peptídica de OspA, que se puede determinar mediante técnicas estándar tras el aislamiento y la purificación de OspA mediante el método descrito anteriormente. Se llevó a cabo la escisión de varios aislamientos de OspA para determinar la localización de la unión a anticuerpos monoclonales de las proteínas.

La escisión de OspA mediante hidroxilamina-HCl (HA), N-clorosuccinimida (NCS) y bromuro de cianógeno siguió los métodos descritos por Bornstein (Biochem. 9 (12):2408-2421 (1970)), Shechter et al., (Biochem. 15 (23):5071-5075 (1976)) y Gross (en Hirs, C.H.W. (ed): Methods in Enzymology, (N.Y. Acad. Press), 11:238-255 (1967)), respectivamente. La escisión con proteasas mediante endoproteinasa, Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana), se realizó como describió Cleveland D.W. et al., (J. Biol. Chem. 252: 1102-1106 (1977)). Se usaron diez microgramos de OspA para cada reacción. La proporción de enzima respecto de OspA fue aproximadamente 1 a 10 (p/p).

Las proteínas y los péptidos generados mediante escisión se separaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli, U.K., Nature (London) 227:680-685 (1970)), y se electrotransfirieron a membranas Immobilon de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) (Ploskal, M.G. et al., Biotechniques 4: 272-283 (1986)). Se detectaron mediante tinción con negro amido o mediante inmunotinción con MAbs murinos, seguido de IgG anti-ratón de cabra conjugada a fosfatasa alcalina. Se detectó la unión específica mediante el uso de un sistema de revelado con fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP)/nitroazul de tetrazolio (NBT) (KPL Inc., Gathersburg, Maryland).

Además, se llevó a cabo análisis de la secuencia de aminoácidos aminoterminal en varios productos de escisión, como describió Luft et al. (Infect. Immun. 57: 3637-3645 (1989)). Las bandas teñidas con negro amido se cortaron de las transferencias de PVDF y se secuenciaron mediante degradación de Edman con el uso de un secuenciador modelo 475A de Biosystems con un analizador PTH modelo 120A y un analizador de control/datos modelo 900A.

Productos de escisión de los aislamientos de proteína A de la superficie externa

La OspA-B31 purificada, marcada con ácido ^{14}C-palmítico, se fragmentó con hidroxilamina-HCl (HA) en dos péptidos, designados HA1 y HA2 (datos no mostrados). La banda de HA1 migró a 27 KD y mantuvo su radiactividad, lo que indica que el péptido incluyó el sitio de lipidación en el extremo N-terminal de la molécula (datos no mostrados). A partir del punto de escisión predicho, HA1 debería corresponder a los residuos 1 a 251 de OspA-B31. HA2 tuvo un PM de 21,6 KD mediante SDS-PAGE, y el análisis de la secuencia aminoterminal demostró que comienza en Gly72, es decir los residuos 72 a 273 de OspA-B31. Por contraste, HA escindió OspA-K48 en tres péptidos, designados HA1, HA2 y HA3 con PMs aparentes de 22 KD, 16 KD y 12 KD, respectivamente. La secuenciación aminoterminal demostró que HA1 comienza en Gly72, y HA3 en Gly142. Se descubrió que HA2 tiene un extremo aminoterminal bloqueado, como se observó para la proteína OspA de tamaño completo. Se predijo que HA1, 2 y 3 de OspA-K48 eran los residuos 72-274, 1 a 141 y 142 a 274, respectivamente.

N-clorosuccinimida (NCS) escinde en triptófano (W), que es el residuo 216 de OspA-B31 o el residuo 217 de OspA-K48 (datos no mostrados). NCS escindió OspA-B31 en 2 fragmentos, NCS1, con un PM de 23 KD, residuos 1-216 de la proteína, y NCS2 con un PM de 6,2 KD, los residuos 217 a 273 (datos no mostrados). De forma similar, OspA de K48 se dividió en 2 trozos, NCS1, residuos 1-217, y NCS2, residuos 218 a 274 (datos no mostrados).

La escisión de OspA mediante bromuro de cianógeno (CNBr) se da en el lado carboxilo de la metionina, residuo 39. El fragmento principal, CNBr1, tiene un PM de 25,7 KD, residuos 39-274 mediante análisis de secuencia de aminoácidos aminoterminal (datos no mostrados). CNBr2 (alrededor de 4 KD) no se pudo visualizar mediante tinción con negro amido; en su lugar, se observaron bandas ligeramente teñidas de alrededor de 20 KD de PM. Estas bandas reaccionaron con MAbs anti-OspA, y muy probablemente fueron productos de degradación debido a la escisión con ácido fórmico.

Determinación de los dominios de unión a anticuerpo para anticuerpos monoclonales anti-OspA

Los productos de escisión de OspA-B31 y OspA-K48 se analizaron mediante transferencia de Western para determinar su capacidad de unirse a los seis MAbs diferentes. De forma preliminar, los análisis de transferencia de Western de los productos de escisión demostraron que las cepas K48 y DK29 tienen patrones similares de reactividad, como Ip3, PGAU y PKo. La OspA de la cepa PTrob fue inmunológicamente distinta de las otras, y fue reconocida solamente por el MAb 336. El MAb 12 reconoció solamente las dos cepas norteamericanas, B31 y 25015. Cuando los aislamientos se separaron en genogrupos, fue notable que todos los MAbs, excepto MAb 12, tuvieron reactividad cruzada con múltiples genogrupos.

MAb12, específico para OspA-B31, se unió tanto a HA1 como a HA2 de OspA-B31. Sin embargo, la escisión de OspA-B31 mediante NCS en el residuo Trp216 creó fragmentos que no reaccionaron con MAb12, lo que sugiere que el dominio relevante está cerca o depende estructuralmente de la integridad de este residuo (datos no mostrados). MAb 13 se unió solamente a OspA-K48, y a los péptidos que contenían el extremo aminoterminal de esa molécula (p.ej. HA2; NCS1). No se unió a CNBr1, residuos 39 a 274. Así, el dominio reconocido por MAb13 está en el extremo aminoterminal de OspA-K48, cerca de Met38.

MAb15 reacciona con OspA de las cepas B31 y K48, y con los péptidos que contienen el extremo N-terminal de OspA, tales como HA1 de OspA-B31 y NCS1, pero no con los péptidos HA2 de OspA-B31 y HA1 de OspA-K48 (datos no mostrados). Ambos péptidos incluyen el residuo 72 del extremo C-terminal de las moléculas. MAb15 se unió a CNBr1 de OspA-K48, lo que indica que el dominio para este anticuerpo son los residuos 39 a 72, específicamente cerca de Gly72 (datos no mostrados).

MAb83 se une a OspA-K48, y a los péptidos que contienen la porción C-terminal de la molécula, tales como HA1. No se une a HA2 de OspA-K48, lo más probablemente debido a que el extremo C-terminal de HA2 de OspA-K48 termina en 141. De forma similar para MAb12 y OspA-B31, la unión de los MAbs 83 y CIII.78 se elimina mediante la escisión de OspA en el residuo de triptófano. Así, la unión de los MAbs 12, 83 y CIII.78 a OspA depende de la integridad estructural del residuo Trp_{216}, que parece ser crítica para la antigenicidad. También es aparente que, aunque estos MAbs se unen a un dominio antigénico común, los epítopos exactos que reconocen son distintos entre sí, dados los grados variables de reactividad cruzada hacia estos MAbs entre cepas.

Aunque existe una pérdida similar de actividad de unión de MAb336 con la escisión en el Trp_{216}, este MAb no se une a HA1 de OspA-B31, lo que sugiere que el dominio para este anticuerpo incluye el extremo carboxiterminal de la molécula, incluidos los residuos 251 a 273. Los péptidos de PM bajo, tales como HA3 (10 KD) y NCS2 (6 KD), de OspA-K48 no se unen a este MAb en las transferencias de Western. Para confirmar esta observación, se ensayó la unión de los 6 MAbs con una construcción de fusión recombinante p3A/EC que contiene una proteína líder trpE fusionada con los residuos 217 a 273 de OspA-B31 (Schubach, W.H. et al., Infect. Immun. 59(6): 1911-1915 (1991)). Solamente MAb336 reaccionó con esta construcción (datos no mostrados). Los péptidos y los dominios antigénicos localizados mediante la fragmentación de OspA se resumen en la Fig. 1.

Cartografía de los dominios para definir la base molecular del análisis de serotipos

Para definir la base molecular del análisis de serotipos de OspA, se compararon las secuencias de aminoácidos derivadas de OspA para los nueve aislamientos (Fig. 2). En el extremo aminoterminal de la proteína, estas predicciones pueden ser más precisas dado del número relativamente pequeño de sustituciones de aminoácidos en esta región en comparación con el extremo carboxiterminal. El dominio 1, que es reconocido por MAb13, incluye los residuos Leu34 a Leu41. MAb13 se une solamente a la OspA de las especies K48, DK29 e IP90. En esta región, el residuo 37 es variable, sin embargo Gly37 está conservado entre las tres cepas reactivas. Cuando Gly37 se cambia a Glu37, como es en OspA de las cepas B31, PTrob, PGAU y PKo, MAb13 no reconoce la proteína (datos no mostrados). Mediante un análisis similar, se puede observar que Asp70 es un residuo crucial para el dominio 2, que incluye los residuos 65 a 75 y es reconocido por MAb15. El dominio 3 es reactivo con los MAbs H5332, 12 y 83, e incluye los residuos 190-220. Está claro que existe una heterogeneidad significativa entre los MAbs reactivos con este dominio, y que más de un epítopo conformacional debe estar contenido dentro de la secuencia. El dominio 4 se une a MAb336, e incluye los residuos 250 a 270. En esta región, el residuo 266 es variable y por lo tanto puede ser un determinante importante. Es aparente, sin embargo, que otros determinantes de la reactividad de este anticuerpo monoclonal residen en la región que comprende los aminoácidos 217-250. Además, la integridad estructural de Trp216 es esencial para la reactividad del anticuerpo en la proteína intacta. Finalmente, es importante destacar que la Fig. 2 indica solamente las localizaciones de los dominios, y no abarca necesariamente el dominio entero. Se están analizando los epítopos exactos mediante mutagénesis dirigida de residuos específicos.

En conjunto, las pruebas sugieren que la porción N-terminal no es el dominio inmunodominante de OspA, posiblemente en virtud de su lipidación y de la función putativa del resto lipídico en el anclaje de la proteína a la cubierta externa. El extremo C-terminal es inmunodominante e incluye dominios que justifican en parte la heterogeneidad estructural (Wilske, B. et al., Med. Microbiol. Immunol. 181: 191-207 (1992)), y puede proporcionar epítopos para la neutralización con anticuerpos (Sears, J.E. et al., J. Immunol. 147(6): 1995-2000 (1991)), y está relacionado con otras actividades, tales como la inducción de la proliferación de células T (Shanafel, M.M., et al., J. Immunol. 148: 218-224 (1992)). Existen epítopos comunes en el extremo carboxilo de la proteína que se comparten entre genoespecies que pueden tener un potencial inmunoprotector (Wilske, B., et al., Med. Microbiol. Immunol. 181: 191-207 (1992)).

La predicción de la estructura secundaria basándose en el análisis de la hidrofobicidad y en medidas de espectroscopía de dicroísmo circular y de fluorescencia (McGrath, B.C., et al., Vaccines, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York; págs. 365-370 (1993)) sugiere que los dominios 3 y 4 están en una región de la molécula con predisposición a formar hélice \alpha, mientras los dominios 1 y 2 se dan en regiones que se predice que son láminas \beta (véase la Fig. 1). Estas diferencias pueden distinguir los dominios en cuanto a la accesibilidad a los anticuerpos o a las células T reactivas (Shanafel, M.M. et al., J. Immunol. 148: 218-224 (1992)). La mutagénesis dirigida de epítopos específicos, como se describe más adelante en el Ejemplo 2, ayuda a identificar los epítopos exactos.

Ejemplo 2 Identificación de un dominio hipervariable inmunológicamente importante de la proteína A de la superficie externa principal de Borrelia

Este ejemplo describe estudios de cartografía de epítopos mediante el uso de proteínas de fusión de trpE-OspA y OspA escindidas químicamente. Los estudios indican una región hipervariable que rodea al único residuo de triptófano conservado de OspA (en el residuo 216, o en algunos casos 217), tal como se determina mediante un análisis poblacional de ventana móvil de OspA de quince aislamientos europeos y norteamericanos de Borrelia. La región hipervariable es importante para el reconocimiento inmunitario.

Se llevó a cabo también mutagénesis dirigida para examinar más atentamente las regiones hipervariables. Las espectroscopias de fluorescencia y de dicroísmo circular han indicado que el triptófano conservado es parte de una región de hélice \alpha en la que el triptófano está enterrado en un medio hidrofóbico (McGrath, B.C., et al., Vaccines, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York; págs. 365-370 (1993)). Es probable que las cadenas laterales de los aminoácidos más polares que flanquean el triptófano estén expuestas al disolvente hidrofílico. La hipervariabilidad de estos residuos expuestos al disolvente entre las diversas cepas de Borrelia sugirió que estos residuos de aminoácidos pueden contribuir a la variación antigénica de OspA. Por lo tanto, se realizó mutagénesis dirigida para sustituir algunas de las cadenas laterales de los aminoácidos potencialmente expuestas en la proteína de una cepa con los residuos análogos de una segunda cepa. Las proteínas alteradas se analizaron después mediante transferencia de Western con el uso de anticuerpos monoclonales que se unen a OspA en la superficie de la espiroqueta intacta sin mutar. Los resultados indicaron que ciertos cambios de aminoácidos específicos cerca del triptófano pueden eliminar la reactividad de OspA hacia estos anticuerpos monoclonales.

A. Verificación de polimorfismos agrupados en las secuencias de proteína A de la superficie externa

El clonado y la secuenciación de la proteína OspA de quince aislamientos europeos y norteamericanos (descritos anteriormente en la Tabla I) demostró que el polimorfismo de aminoácidos no está distribuido aleatoriamente a lo largo de la proteína; más bien, el polimorfismo tendió a agruparse en tres regiones de OspA. El análisis se llevó a cabo representando el polimorfismo medio ponderado móvil de una ventana (una subsección de longitud fija de la secuencia total) a medida que se desliza a lo largo de la secuencia. El tamaño de la ventana en este análisis fue de trece aminoácidos, basados en la determinación del mayor número de puntos de desviación significativa establecido mediante el método de Tajima (J. Mol. Evol. 33: 470-473 (1991)). El polimorfismo ponderado medio se calculó sumando el número de alelos variantes para cada sitio. Los cálculos de polimorfismo se ponderaron mediante la gravedad de la sustitución de aminoácidos (Dayhoff, M.O. et al., en: Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure NBRF, Washington, vol. 5, supl. 3: 345 (1978)). La suma se normalizó mediante el tamaño de la ventana y se representó. La posición de la secuencia de aminoácidos corresponde a una ventana que abarca los aminoácidos 1 a 13. Se usó un remuestreo Bootstrap para generar intervalos de confianza del 95% en el análisis de ventana deslizante. Ya que se ha demostrado que Borrelia es clonal, el análisis de Bootstrap debería proporcionar una estimación fiable de la varianza esperada de los cálculos de polimorfismos. El Bootstrap se repitió quinientas veces en cada posición, y se calculó la media a partir de la suma de todas las posiciones. La naturaleza clonal de Borrelia asegura que se minimizará la varianza estocástica que resulta de las diferentes historias genealógicas de las posiciones de las secuencias (como se esperaría si la recombinación fuera prevalente).

Este ensayo verificó que las tres regiones alrededor de los máximos observados tienen excesos significativos de polimorfismo. Los excesos de polimorfismo se observaron en las regiones que incluyen los residuos de aminoácidos 132-145, los residuos 163-177 y los residuos 208-221 (Fig. 3). Se muestra una alineación de aminoácidos entre los residuos 200 y 220 para B31, K48 y los cuatro mutantes dirigidos en la Fig. 4. La región de los aminoácidos 208-221 incluye la región de OspA que se ha modelado como una hélice \alpha orientada en la que el único residuo de triptófano en el aminoácido 216 está enterrado en un bolsillo hidrofóbico, por lo que se exponen los aminoácidos más polares al disolvente (Fig. 5). (France, L.L., et al., Biochem. Biophys. Acta 1120: 59 (1992)). Estos residuos potencialmente expuestos al disolvente mostraron una variabilidad considerable entre las OspAs de diversas cepas, y pueden ser un componente importante de la variación antigénica de OspA. Para los fines de generar proteínas quiméricas, los dominios hipervariables de interés son el dominio A, que incluye los residuos de aminoácidos 120-140 de OspA; el dominio B, que incluye los residuos 150-180; y el dominio C, que incluye los residuos 200-216 ó 217.

B. Mutagénesis dirigida de la región hipervariable

Se realizó mutagénesis dirigida para convertir los residuos del dominio 204-219 de OspA de B31 recombinante en los residuos análogos de una variante de OspA europea, K48. En la región de OspA entre los residuos 204 y 219, que incluye el dominio helicoidal (aminoácidos 204-217), hay siete diferencias de aminoácidos entre OspA-B31 y OspA-K48. Se generaron tres oligonucleótidos, y cada uno contenía cambios de nucleótidos que incorporarían los aminoácidos de K48 en sus posiciones análogas en la proteína OspA de B31. Los oligonucleótidos usados para crear los mutantes dirigidos fueron:

\quad: 5'-CTTAATGACTCTGACACTAGTGC-3' (nº 613, que convierte la serina de la posición 204 en treonina, y la serina de 206 en treonina (Ser204-Thr, Ser206-Thr)) (ID SEC Nº 1);

\quad: 5'-GCTACTAAAAAAACCGGGAAATGGAATTCA-3' (nº 625, que convierte la alanina de 214 en glicocola, y la alanina de 215 en lisina (Ala214-Gly, Ala215-Lys)) (ID SEC Nº 2); y

\quad: 5'-GCAGCTTGGGATTCAAAAACATCCACTTTAACA-3' (nº 640, que convierte la asparagina de 217 en aspartato, y la glicocola de 219 en lisina (Asn217-Asp, Gly219-Lys)) (ID SEC Nº 3).

La mutagénesis dirigida se llevó a cabo realizando mutagénesis con pares de los oligonucleótidos anteriores. Se crearon tres mutantes dirigidos, cada uno con dos cambios: OspA 613 (Ser204-Thr, Ser206-Thr), OspA 625 (Ala214-Gly, Ala215-Lys), y 640 (Asn217-Asp, Gly219-Lys). Hubo también dos proteínas con cuatro cambios: OspA 613/625 (Ser204-Thr, Ser206-Thr, Ala214-Gly, Ala215-Lys) y OspA 613/640 (Ser204-Thr, Ser206-Thr, Asn217-Asp, Gly219-Lys).

Especificidad de la unión de anticuerpo a epítopos de la región hipervariable sin mutar

Los anticuerpos monoclonales que aglutinan espiroquetas, que incluyen varios que son neutralizantes in vitro, reconocen epítopos que se cartografían en la región hipervariable alrededor de Trp216 (Barbour, A.G. et al., Infect. and Immun. 41: 759 (1983); Schubach, W.H. et al., Infect. and Immun. 59: 1911 (1991)). El análisis mediante transferencia de Western demostró que la escisión química de OspA de la cepa B31 en Trp 216 elimina la reactividad de la proteína con el MAb 105 aglutinante, un anticuerpo monoclonal generado contra espiroquetas B31 (datos no mostrados). El reactivo, N-clorosuccinimida (NCS), escinde OspA en el Trp 216, por lo que se forma un fragmento de 23,2 kd y un péptido de 6,2 kd que no se retiene en la membrana Immobilon-P tras la transferencia. El material sin escindir se une a MAb 105; sin embargo, el fragmento de 23,2 kd no es reactivo. Las transferencias de Western similares con una proteína de fusión TrpE-OspA que contiene la porción carboxiterminal de la proteína OspA demostraron que el trozo pequeño
de 6,2 kd tampoco es capaz de unirse al MAb 105 (Schubach, W.H. et al., Infect. and Immun. 59: 1911 (1991)).

Se ha demostrado mediante inmunofluorescencia que los anticuerpos monoclonales H5332 y H3TS (Barbour, A.G. et al., Infect. and Immun. 41: 759 (1983)) recubren la superficie de espiroquetas fijadas (Wilske, B. et al., World J. Microbiol. 7: 130 (1991)). Estos anticuerpos monoclonales también inhiben el crecimiento del organismo en cultivo. La cartografía de epítopos con proteínas de fusión ha confirmado que los epítopos que se unen a estos MAbs están determinados conformacionalmente y residen en la mitad carboxiterminal de la proteína. MAb H5332 tiene reactividad cruzada entre todos los grupos filogenéticos conocidos, mientras MAb H3TS y MAb 105 parecen ser específicos para la cepa B31 hacia la que se generaron. Como MAb 105, las reactividades de H5332 y H3TS hacia OspA se abrogan mediante la fragmentación de la proteína en Trp216 (datos no mostrados). MAb 336 se generó hacia espiroquetas completas de la cepa PGau. Tiene reactividad cruzada hacia OspA del grupo 1 (el grupo al que pertenece B31) pero no hacia el grupo 2 (del cual K48 es un miembro). Los estudios previos mediante el uso de proteínas de fusión y escisión química han indicado que este anticuerpo reconoce un dominio de OspA en la región entre los residuos 217 y 273 (datos no mostrados). Todos estos MAbs aglutinarán con la espiroqueta B31.

Análisis de transferencia de Western de la unión de anticuerpos a regiones hipervariables mutadas

Se usaron MAbs para el análisis de transferencia de Western de los mutantes dirigidos de OspA inducidos en E. coli mediante el uso del sistema de expresión en T7 (Dunn, J.J. et al., Protein Expression and Purification 1: 159 (1990)). Las células de E. coli que portan los plásmidos pET9c que tienen un inserto de mutante dirigido de OspA se indujeron en el cultivo en mitad de la fase logarítmica con IPTG durante cuatro horas a 37ºC. Se hicieron lisados celulares haciendo hervir una alícuota de los cultivos inducidos en tinción de carga de gel de SDS, y este material se cargó después en un gel de SDS del 12% (BioRad Mini-Protean II), y se realizó la electroforesis. Las proteínas se transfirieron después a membranas Immobilon-P (Millipore) 70V, 2 horas a 4ºC mediante el uso del sistema de transferencia Mini de BioRad. El análisis de Western se llevó a cabo como describió Schubach et al. (Infect. Immun. 59: 1911 (1991)).

El análisis de transferencia de Western indicó que solamente el mutante 625 (Ala214-Gly y Ala215-Lys) mantuvo la unión al anticuerpo monoclonal H3TS aglutinante (datos no mostrados). Sin embargo, el mutante 613/625 que tiene alteraciones adicionales hacia el extremo aminoterminal de Trp216 (Ser204-Thr y Ser206-Thr) no se unió a este anticuerpo monoclonal. Los OspAs 640 y 613/640 que tienen los cambios Asn217-Asp y Gly219-Lys en el lado carboxiterminal de Trp216 tampoco se unieron al MAb H3TS. Esto indicó que el epítopo de la OspA de B31 que se une al MAb H3TS comprende las cadenas laterales de los aminoácidos a ambos lados de Trp216.

El mutante 613/625 no se unió a los MAbs 105 y H5332, mientras los otros mutantes mantuvieron su capacidad de unirse a estos MAbs. Esto es importante a la luz de los datos mediante el uso de proteínas de fusión, que indican que el MAb 105 se comporta más como el MAb H3TS en cuanto a su especificidad de serotipo y unión a OspA (Wilske, B. et al., Med. Microbiol. Immunol. 181: 191 (1992)). La proteína 613/625 tiene, además de las diferencias en los residuos Ser204 y Ser206, cambios inmediatamente aminoterminales respecto de Trp216 (Ala214-Gly y Ala215-Lys). La abrogación de la reactividad de los MAbs 105 y H5332 hacia esta proteína indicó que los epítopos de OspA que se unen a estos anticuerpos monoclonales comprenden los residuos del lado aminoterminal de Trp216.

Las dos proteínas que portan las sustituciones Asn217-Asp y Gly219-Lys en el lado carboxiterminal de Trp216 (OspAs 640 y 613/640) mantuvieron la unión a los MAbs 105 y H5332; sin embargo, no reaccionaron con el MAb 336, un anticuerpo monoclonal que se ha cartografiado con las proteínas de fusión TrpE-OspA y mediante escisión química en un dominio más carboxiterminal. Este resultado puede explicar por qué MAb 336 no reconoció el tipo de K48 de OspA (grupo 2).

Está claro que los aminoácidos Ser204 y Ser206 desempeñan un papel importante en los epítopos de aglutinación de la región de OspA de B31 que flanquean el Trp216. La sustitución de estos dos residuos alteró los epítopos de OspA que se unen a los MAbs 105, H3TS y H5332. La capacidad de los cambios 640 solos para eliminar la reactividad de MAb 336 indicó que Ser204 y Ser206 no están implicados en la interacción directa con el MAb 336.

Los resultados indicaron que los epítopos de OspA que están disponibles para los MAbs que aglutinan espiroquetas comprenden al menos en parte los aminoácidos que están en estrecha proximidad de Trp216. Ya que el análisis reciente de dicroísmo circular indicó que las estructuras de OspA de B31 y K48 difieren muy poco en este dominio, es poco probable que los cambios hechos mediante mutaciones hayan alterado de forma radical la estructura global de la proteína OspA (France, L.L. et al., Biochem. Biophys. Acta 1120: 59 (1992); y France et al., Biochem. Biophys Acta, presentado (1993)). Esta hipótesis está apoyada por el hallazgo de que las OspAs mutantes recombinantes exhiben la misma solubilidad elevada y las propiedades de purificación que la proteína originaria de B31 (datos no mostrados).

En resumen, las cadenas laterales de los aminoácidos en Ser204 y Ser206 son importantes para muchos de los epítopos aglutinantes. Sin embargo, un grupo limitado de cambios conservativos en estos sitios no fueron suficientes para eliminar la unión de todos los MAbs aglutinantes. Estos resultados sugirieron que los epítopos aglutinantes de OspA son distintos, aunque pueden tener cierta coincidencia parcial. Los resultados también apoyan la hipótesis de que el epítopo expuesto en la superficie alrededor de Trp216 que se cree que es importante para el reconocimiento inmunitario y la neutralización es un dominio de OspA determinado conformacionalmente y complejo.

Ejemplo 3 Cepas y proteínas de Borrelia

Se pueden utilizar en la presente invención las proteínas y los genes de cualquier cepa de Borrelia. Las cepas representativas se resumen en la Tabla I, anteriormente.

A. Genes que codifican proteínas de Borrelia

Los péptidos quiméricos de la presente invención pueden comprender péptidos derivados de cualquier proteína de Borrelia. Las proteínas representativas incluyen OspA, OspB, OspC, OspD, p12, p39, p41 (fla), p66 y p93. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican varias proteínas de Borrelia están disponibles actualmente (véase la Tabla II, a continuación); de forma alternativa, se pueden aislar y caracterizar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas de Borrelia mediante el uso de métodos tales como los descritos más adelante.

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TABLA II Referencias para las secuencias de ácidos nucleicos de varias proteínas de diversas cepas de Borrelia

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B. Aislamiento de genes de Borrelia

Se aislaron las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas lipidadas de tamaño completo de las cepas de Borrelia conocidas mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como se describe más adelante. Además, se generaron secuencias de ácidos nucleicos que codificaban proteínas truncadas (proteínas en las que la señal de lipidación se ha eliminado, tal como mediante la eliminación de la secuencia de ácido nucleico que codifica los 18 primeros aminoácidos, lo que da como resultado proteínas sin lipidar). Se generaron otras proteínas que codificaban polipéptidos de un gen particular (es decir, que codificaban un segmento de la proteína que tiene un número de aminoácidos diferente que el que tiene la proteína en la naturaleza). Mediante el uso de métodos similares a los descritos más adelante, se generaron cebadores a partir de secuencias de ácidos nucleicos conocidas que codifican proteínas de Borrelia y se usaron para aislar otros genes que codifican proteínas de Borrelia. Los cebadores se pueden diseñar para amplificar todo un gen, así como para amplificar una secuencia de ácido nucleico que codifica secuencias de proteínas truncadas, tales como las descritas más adelante para OspC, o secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido derivado de una proteína de Borrelia. Los cebadores se pueden diseñar también para incorporar sitios únicos de escisión mediante enzimas de restricción en las secuencias de ácidos nucleicos amplificadas. El análisis de las secuencias de ácidos nucleicos amplificadas se puede llevar a cabo mediante el uso de técnicas estándar.

Clonado y secuenciación de genes de OspA y de secuencias de ácidos nucleicos relevantes

Se aislaron secuencias de OspA de Borrelia de la siguiente manera: se usaron 100 \mul de mezclas de reacción que contenían KCl 50 mM, TRIS-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 1,5 mM, 200 \muM de cada NTP, 2,5 unidades de TaqI ADN polimerasa (Amplitaq, Perkin-Elmer/Cetus) y 100 pmol de cada uno de los cebadores de 5' y 3' (descritos más adelante). Se llevó a cabo la amplificación en un termociclador Perkin-Elmer/Cetus como se describió (Schubach, W.H. et al., Infect. Immun. 59: 1811-1915 (1991)). El amplicón se visualizó en un gel de agarosa mediante tinción con bromuro de etidio. Se clonaron veinte nanogramos de producto de PCR extraído con cloroformo directamente en el vector PC-TA (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se seleccionaron las colonias recombinantes que contenían el fragmento amplificado, se prepararon los plásmidos y se determinó la secuencia de ácido nucleico de cada OspA mediante la técnica de terminación de la cadena con didesoxi mediante el uso del equipo Sequenase (United States Biochemical). Se llevó a cabo la secuenciación dirigida con cebadores M13 seguida por cebadores específicos de OspA derivados de las secuencias, obtenidos previamente con los cebadores M13.

Debido a que los extremos 5' y 3' del gen de OspA están sumamente conservados (Fikrig, E.S. et al., J. Immunol. 7: 2256-2260 (1992); Bergstrom, S. et al., Mol. Microbiol. 3: 479-486 (1989); Zumstein, G. et al., Med. Microbiol. Immunol. 181: 57-70 (1992)), se pueden usar los cebadores de 5' y 3' para el clonado basándose en las secuencias de OspA conocidas. Por ejemplo, se usaron los siguientes cebadores basándose en la secuencia de ácido nucleico de OspA de la cepa B31:

\quad: 5'-GGAGAATATATTATGAAA-3' (-12 a +6) (ID SEC Nº 4); y

\quad: 5'-CTCCTTATTTTAAAGCG-3' (+826 a +809) (ID SEC Nº 5) (Schubach, W.H. et al., Infect. Immun 59: 1811-1915 (1991)).

Los genes de OspA aislados de esta manera incluyen los de las cepas B31, K48, PGau y 25015; las secuencias de ácidos nucleicos se representan en el listado de secuencias como ID SEC Nº 6 (OspA-B31), ID SEC Nº 8 (OspA-K48), ID SEC Nº 10 (OspA-PGau) e ID SEC Nº 12 (OspA-25015). Se muestra una alineación de estas y otras secuencias de ácidos nucleicos de OspA en la Fig. 42. Las secuencias de ácidos nucleicos de las proteínas codificadas por estas secuencias de ácidos nucleicos se representan como ID SEC Nº 7 (OspA-B31), ID SEC Nº 9 (OspA-K48), ID SEC Nº 11 (OspA-PGau) e ID SEC Nº 13 (OspA-25015).

Se usaron los siguientes cebadores para generar secuencias de ácidos nucleicos específicas del gen de OspA, a ser usadas para generar secuencias quiméricas de ácidos nucleicos (como se describe en el Ejemplo 4):

\quad: 5'-GTCTGCAAAAACCATGACAAG-3' (cebador de la cadena positiva nº 369) (ID SEC Nº 14);

\quad: 5'-GTCATCAACAGAAGAAAAATTC-3' (cebador de la cadena positiva nº 357) (ID SEC Nº 15);

\quad: 5'-CCGGATCCATATGAAAAAATATTTATTGGG-3' (cebador de la cadena positiva nº 607) (ID SEC Nº 16);

\quad: 5'-CCGGGATCCATATGGCTAAGCAAAATGTTAGC-3' (cebador de la cadena positiva nº 584) (ID SEC Nº 17);

\quad: 5'-GCGTTCAAGTACTCCAGA-3' (cebador de la cadena negativa nº 200) (ID SEC Nº 18);

\quad: 5'-GATATCTAGATCTTATTTTAAAGCGTT-3' (cebador de la cadena negativa nº 586) (ID SEC Nº 19); y

\quad: 5'-GGATCCGGTGACCTTTTAAAGCGTTTTTAAT-3' (cebador de la cadena negativa nº 1169) (ID SEC Nº 20).

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Clonado y secuenciación de OspB

También se usaron métodos similares para aislar los genes de OspB. Un gen de OspB aislado se representa como ID SEC Nº 21 (OspB-B31); su secuencia de aminoácidos codificada es ID SEC Nº 22.

Se usaron los siguientes cebadores para generar secuencias de ácidos nucleicos específicas del gen de OspB, a ser usadas en la generación de secuencias quiméricas de ácidos nucleicos (véase el Ejemplo 4):

\quad: 5'-GGTACAATTACAGTACAA-3' (cebador de la cadena positiva nº 721) (ID SEC Nº 23);

\quad: 5'-CCGAGAATCTCATATGGCACAAAAAGGTGCTGAGTCAATTGG-3' (cebador de la cadena positiva nº 1105) (ID SEC Nº 24);

\quad: 5'-CCGATATCGGATCCTATTTTAAAGCGTTTTTAAGC-3' (cebador de la cadena negativa nº 1106) (ID SEC Nº 25); y

\quad: 5'-GGATCCGGTGACCTTTTAAAGCGTTTTTAAG-3' (cebador de la cadena negativa nº 1170) (ID SEC Nº 26).

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Clonado y secuenciación de OspC

También se usaron métodos similares para aislar los genes de OspC. Se usaron los siguientes cebadores para aislar genes de OspC completos de las cepas de Borrelia B31, K48, PKo y PTrob:

\quad: 5'-GTGCGCGACCATATGAAAAAGAATACATTAAGTGCG-3' (cebador de la cadena positiva que tiene el sitio NdeI combinado con el codón de inicio) (ID SEC Nº 27), y

\quad: 5'-GTCGGCGGATCCTTAAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC-3' (cebador de la cadena negativa que tiene el sitio BamHI seguido por el codón de parada) (ID SEC Nº 28).

Después se determinaron las secuencias de ácidos nucleicos de los genes de OspC mediante la técnica de terminación de la cadena con didesoxi mediante el uso del equipo Sequenase (United States Biochemical). Los genes de OspC aislados y secuenciados de esta manera incluyen los de las cepas B31, K48, PKo y Tro; las secuencias de ácidos nucleicos se representan en el listado de secuencias como ID SEC Nº 29 (OspC-B31), ID SEC Nº 31 (OspC-K48), ID SEC Nº 33 (OspC-PKo) e ID SEC Nº 35 (OspC-Tro). Se muestra una alineación de estas secuencias en la Fig. 38. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por estas secuencias de ácidos nucleicos se representan como ID SEC Nº 30 (OspC-B31), ID SEC Nº 32 (PspC-K48), ID SEC Nº 34 (OspC-PKo) e ID SEC Nº 36 (OspC-Tro).

Se generaron genes de OspC truncados mediante el uso de otros cebadores. Estos cebadores se diseñaron para amplificar las secuencias de ácidos nucleicos, derivadas del gen de OspC, que carecían de los ácidos nucleicos que codifican la secuencia de la peptidasa señal de la proteína de tamaño completo. Los cebadores correspondieron a los bp 58-75 de la proteína natural, con los codones de Met-Ala unidos delante. Para la cepa B31, se usaron los siguientes cebadores:

5'-GTGCGCGACCATATGGCTAATAATTCAGGGAAAGAT-3': (ID SEC Nº 37).

Para la cepa PKo, se usó

5'-GTGCGCGACCATATGGCTAGTAATTCAGGGAAAGGT-3': (ID SEC Nº 38).

Para las cepas PTrob y K48, se usó

5'-GTGCGCGACCATATGGCTAATAATTCAGGTGGGGAT-3': (ID SEC Nº 39).

También se diseñaron cebadores adicionales para amplificar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos particulares para el uso en la creación de secuencias quiméricas de ácidos nucleicos (véase el Ejemplo 4). Estos cebadores incluyeron:

\quad: 5'-CTTGGAAAATTATTTGAA-3' (cebador de la cadena positiva nº 520) (ID SEC Nº 40);

\quad: 5'-CACGGTCACCCCATGGGAAATAATTCAGGGAAAGG-3' (cebador de la cadena positiva nº 58) (ID SEC Nº 41);

\quad: 5'-TATAGATGACAGCAACGC-3' (cebador de la cadena negativa nº 207) (ID SEC Nº 42); y

\quad: 5'-CCGGTGACCCCATGGTACCAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC-3' (cebador de la cadena negativa nº 636) (ID SEC Nº 43).

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Clonado y secuenciación de OspD

Se pueden usar métodos similares para aislar genes de OspD. Se muestra una alineación de cuatro secuencias de ácidos nucleicos de OspD (de las cepas PBo, PGau, DK29 y K48) en la Fig. 39.

Clonado y secuenciación de p12

Se identificó de forma similar el gen de p12. Los cebadores usados para clonar el gen de p12 completo incluyeron: 5'-CCGGATCCATATGGTTAAAAAAATAATATTTA-TTTC-3' (cebador directo nº 757) (ID SEC Nº 44); y 5'-GATATCTAGATCTTTAATTGC-TCTGCTCACTCTCTTC-3' (cebador inverso nº 758) (ID SEC Nº 45).

Para amplificar un gen de p12 truncado (uno en el que la proteína transcrita no está lipidada, y comienza en el aminoácido 18 de la secuencia nativa), se usaron los siguientes cebadores: 5'-CCGGGATCCATATGGCTAGTG
CAATTGGTCGTGG-3' (cebador directo nº 759) (ID SEC Nº 46); y cebador nº 758 (ID SEC Nº 45).

Clonado y secuenciación de p41 (fla)

Se usó una aproximación similar para clonar y secuenciar los genes que codifican la proteína p41 (fla). Se aislaron las secuencias de p41 enumeradas en la Tabla II con los números de acceso de GenBank mediante el uso de los siguientes cebadores de la cepa B31:

5'-ATGATTATCAATCATAAT-3' (+1 a +18) (ID SEC Nº 47); y 5'-TCTGAACAATGACAAAAC-3' (+1008 a +991) (ID SEC Nº 48). Las secuencias de ácidos nucleicos de p41 aisladas de esta manera se representan en el listado de secuencias como ID SEC Nº 51 (p41-PGau) e ID SEC Nº 53 (p41-DK29). Se muestra una alineación de varias secuencias de ácidos nucleicos de p41, que incluyen las de las cepas B31, PKa1, PGau, PBo, DK29 y PKo, en la Fig. 41. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por estas secuencias de ácidos nucleicos se representan como ID SEC Nº 52 (p41-PGau) e ID SEC Nº 54 (p41-DK29).

Se diseñaron otros cebadores para amplificar secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de p41, para el uso en secuencias quiméricas de ácidos nucleicos. Estos cebadores incluyeron:

\quad: 5'-TTGGATCCGGTCACCCCATGGCTCAATATAACCAATG-3' (cebador de la cadena negativa nº 122) (ID SEC Nº 59);

\quad: 5'-TTGGATCCGGTCACCCCATGGCTTCTCAAAATGTAAG-3' (cebador de la cadena positiva nº 140) (ID SEC Nº 60);

\quad: 5'-TTGGATCCGGTGACCAACTCCGCCTTGAGAAGG-3' (cebador de la cadena negativa nº 234) (ID SEC Nº 61); y

\quad: 5'-TTGGATCCGGTGACCTATTTGAGCATAAGATGC-3' (cebador de la cadena negativa nº 141) (ID SEC Nº 62).

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Clonado y secuenciación de p93

Se usó la misma aproximación para clonar y secuenciar proteínas p93. Se aislaron los genes que codifican p93, tal como se exponen en la Tabla II con los números de acceso de GenBank, mediante este método con los siguientes cebadores de la cepa B31:

\quad: 5'-GGTGAATTTAGTTGGTAAGG-3' (-54 a -35) (ID SEC Nº 63); y

\quad: 5'-CACCAGTTTCTTTAAGCTGCTCCTGC-3' (+1117 a +1092) (ID SEC Nº 64).

Las secuencias de ácidos nucleicos de p93 aisladas de esta manera se representan en el listado de secuencias como ID SEC Nº 65 (p93-B31), ID SEC Nº 67 (p93-K48), ID SEC Nº 69 (p93-PBo), ID SEC Nº 71 (p93-PTrob), ID SEC Nº 73 (p93-PGau), ID SEC Nº 77 (p93-25015) e ID SEC Nº 75 (p93-PKo). Las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por estas secuencias de ácidos nucleicos se representan como ID SEC Nº 66 (p93-B31), ID SEC Nº 68 (p93-K48) ID SEC Nº 70 (p93-PBo), ID SEC Nº 72 (p93-PTrob), ID SEC Nº 74 (p93-PGau), ID SEC Nº 78 (p93-25015) e ID SEC Nº 76 (p93-PKo).

Se usaron otros cebadores para amplificar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de p93 para el uso en la generación de secuencias quiméricas de ácidos nucleicos. Estos cebadores incluyeron:

\quad: 5'-CCGGTCACCCCATGGCTGCTTTAAAGTCTTTA-3' (cebador de la cadena positiva nº 475) (ID SEC Nº 79);

\quad: 5'-CCGGTCACCCCATGAATCTTGATAAAGCTCAG-3' (cebador de la cadena positiva nº 900) (ID SEC Nº 80);

\quad: 5'-CCGGTCACCCCATGGATGAAAAGCTTTTAAAAAGT-3' (cebador de la cadena positiva nº 1168) (ID SEC Nº 81);

\quad: 5'-CCGGTCACCCCCATGGTTGAGAAATTAGATAAG-3' (cebador de la cadena positiva nº 1423) (ID SEC Nº 82); y

\quad: 5'-TTGGATCCGGTGACCCTTAACTTTTTTTAAAG-3' (cebador de la cadena negativa nº 2100) (ID SEC Nº 83).

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C. Expresión de proteínas a partir de genes de Borrelia

Las secuencias de ácidos nucleicos descritas anteriormente se pueden incorporar en plásmidos de expresión mediante el uso de técnicas estándar, y transfectarlos en células hospedadoras compatibles para expresar las proteínas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos. Como ejemplo, se expone la expresión del gen de p12 y el aislamiento de la proteína p12.

La amplificación de la secuencia de ácido nucleico de p12 se llevó a cabo con cebadores que incluyeron un sitio de restricción NdeI en la secuencia de ácido nucleico. El producto de PCR se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. El producto precipitado se digirió y se ligó en un plásmido de expresión como sigue: se combinaron 15 \mul (aproximadamente 1 \mug) de ADN de PCR con 2 \mul de tampón de restricción 10X para NdeI (Gibco/BRL), 1 \mul de NdeI (Gibco/BRL) y 2 \mul de agua destilada, y se incubó durante la noche a 37ºC. Esta mezcla se combinó posteriormente con 3 \mul de tampón 10X (tampón 3, New England BioLabs), 1 \mul de BamHI (NEB) y 6 \mul de agua destilada, y se incubó a 37ºC durante dos horas. El material resultante se purificó mediante electroforesis preparativa en gel con el uso de agarosa de punto de fusión bajo, y la banda se visualizó con luz ultravioleta de longitud de onda larga y se cortó del gel. El trozo de gel se trató con GELase mediante el uso de las condiciones recomendadas por el fabricante (Epicentre Technologies). El sedimento de ADN resultante se resuspendió en 25-50 \mul de TRIS-Cl 10 mM (pH 8,0) y EDTA 1 mM (TE). Se ligó una alícuota de este material en el vector de expresión pET9c (Dunn, J.J. et al., Protein Expression and Purification 1: 159 (1990)).

Para ligar el material en el vector de expresión pET9c, se combinaron 20-50 ng de secuencias de ácido nucleico de p12 cortadas y purificadas como se describió anteriormente con 5 \mul de tampón One-Phor-All (OPA) 10X (Pharmacia), 30-60 ng de pET9c cortado con NdeI y BamHI, 2,5 \mul de ATP 20 mM, 2 \mul de ADN ligasa de T4 (Pharmacia) diluida 1:5 en tampón OPA 1X, y agua destilada suficiente para llevar el volumen final a 50 \mul. La mezcla se incubó a 12ºC durante la noche.

Las ligaduras resultantes se transformaron en células DH5-\alpha competentes y se colocaron en placas de agar nutriente que contenía 50 \mug/ml de kanamicina, y se incubaron durante la noche a 37ºC. Se usó DH5-\alpha como una "cepa de almacenamiento" para los clones de expresión de T7, debido a que es deficiente en RecA, de forma que la recombinación y la concatenación no son problemáticas, y debido a que carece del gen de la ARN polimerasa de T7 necesario para expresar el gen clonado. El uso de esta cepa permite el clonado de productos génicos potencialmente tóxicos a la vez que se minimiza la posibilidad de deleción y/o reordenamiento de los genes deseados. Se pueden usar otras líneas celulares que tienen propiedades similares.

Las colonias resistentes a kanamicina se purificaron mediante colonias únicas en placas de agar nutriente suplementado con 50 \mug/ml de kanamicina. Se inoculó una colonia de cada aislamiento en 3-5 ml de medio líquido que contenía 50 \mug/ml de kanamicina, y se incubó a 37ºC sin agitación. Se obtuvo ADN plasmídico a partir de 1 ml de cada aislamiento mediante el uso de un procedimiento de lisis alcalina en caliente (Mantiatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)).

Se digirió el ADN plasmídico con EcoRI y BglII de la siguiente manera: se combinaron 15 \mul de ADN plasmídico con 2 \mul de tampón 3 (NEB) 10X, 1 \mul de EcoRI (NEB), 1 \mul de BglII (NEB) y 1 \mul de agua destilada, y se incubó durante dos horas a 37ºC. La mezcla de reacción completa se sometió a electroforesis en un gel de agarosa para análisis. Los plásmidos que portaban el inserto de p12 se identificaron mediante la presencia de una banda que correspondía a 925 pares de bases (p12 de tamaño completo) o 875 pares de bases (p12 sin lipidar). Se usaron uno o dos ADNs plasmídicos de los clones de p12 de tamaño completo y sin lipidar en pET9c para transformar BL21 DE3 pLysS en resistencia a kanamicina como describió Studier et al. (Methods in Enzymology, Goeddel, D. (Ed.), Academic Press, 185: 60-89 (1990)). Se purificaron mediante colonias únicas uno o dos transformantes de los clones de tamaño completo y sin lipidar en placas nutrientes que contenían 25 \mug/ml de cloranfenicol (para mantener pLysS) y 50 \mug/ml de kanamicina a 37ºC. Se inoculó una colonia de cada aislamiento en medio líquido suplementado con cloranfenicol y kanamicina y se incubó durante la noche a 37ºC. El cultivo de la noche se subcultivó a la mañana siguiente en 500 ml de caldo líquido con cloranfenicol (25 \mug/ml) y kanamicina (50 \mug/ml) y se cultivó con aireación a 37ºC en un agitador orbital con aire hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzó 0,4-0,7. Se añadió isopropil-tiogalactósido (IPTG) hasta una concentración final de 0,5 mM para la inducción, y el cultivo se incubó durante 3-4 horas a 37ºC como anteriormente. Las células inducidas se sedimentaron mediante centrifugación y se resuspendieron en 25 ml de NaPO_{4} 20 mM (pH 7,7). Se extrajo una pequeña alícuota para el análisis mediante electroforesis en gel. Los clones que tenían expresión produjeron proteínas que migraron en la posición de 12 kDa.

Se preparó un lisado bruto de células a partir del cultivo como describió para OspA recombinante Dunn, J.J. et al., (Protein Expression and Purification 1: 159 (1990)). El lisado bruto se hizo pasar primero por una columna de Q-sepharose (Pharmacia) que se había preequilibrado en tampón A: NaPO_{4} 10 mM (pH 7,7), NaCl 10 mM, PMSF 0,5 mM. La columna se lavó con NaPO_{4} 10 mM, NaCl 50 mM y PMSF 0,5 mM, y después se eluyó p12 en NaPO_{4} 10 mM, PMSF 0,5 mM con un gradiente de NaCl de 50-400 mM. p12 eluyó aproximadamente a la mitad del gradiente entre NaCl 100 y 200 mM. Las fracciones del máximo se mezclaron y se dializaron con NaPO_{4} 10 mM (pH 7,7), NaCl 10 mM, PMSF 0,5 mM. La proteína se concentró y se aplicó después a una columna de filtración en gel de Sephadex G50 de aproximadamente un volumen de lecho de 50 ml (Pharmacia), en NaPO_{4} 10 mM, NaCl 200 mM, PMSF 0,5 mM. p12 eluiría típicamente poco después del marcador de volumen excluido. Las fracciones del máximo se determinaron utilizando alícuotas pequeñas de todas las fracciones en un gel de SDS. El máximo de p12 se mezcló y se almacenó en alícuotas pequeñas a -20ºC.

Ejemplo 4 Generación de secuencias quiméricas de ácidos nucleicos y proteínas quiméricas A. Protocolo general para la creación de secuencias quiméricas de ácidos nucleicos

Se usó el método del megacebador de mutagénesis dirigida y su modificación para generar secuencias quiméricas de ácidos nucleicos (Sarkar y Sommer, Biotechniques 8(4): 404-407 (1990); Aiyar, A. y J. Leis, Biotechniques 14(3): 366-369 (1993)). Se usa para amplificar la región deseada un cebador de 5' para el primer molde genómico y un oligonucleótido de fusión de 3'. El cebador de fusión consiste en un extremo 3' del primer molde (ADN que codifica el polipéptido amino-proximal de la proteína de fusión) acoplado a un extremo 5' del segundo molde (ADN que codifica el polipéptido carboxi-proximal de la proteína de fusión).

Las amplificaciones mediante PCR se realizan con el uso de Taq ADN polimerasa, tampón de PCR 10X y MgCl_{2} (Promega Corp., Madison, WI) y Ultrapure dNTPs (Pharmacia, Piscataway, NJ). Un \mug de molde genómico 1, 5 \mul de oligonucleótido de 5' 10 \muM y 5 \mul de oligonucleótido de fusión 10 \muM se combinan con los siguientes reactivos a las concentraciones finales indicadas: tampón 10X exento de Mg (1X), MgCl_{2} (2 mM), mezcla de dNTP (200 \muM de cada dNTP), Taq ADN polimerasa (2,5 unidades), agua hasta llevar el volumen final a 100 \mul. Se usa un termociclador (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) para amplificar en las siguientes condiciones: 35 ciclos a 95ºC durante un minuto, 55ºC durante dos minutos, y 72ºC durante tres minutos. Este procedimiento da como resultado un "megacebador".

El megacebador resultante se analiza en un gel de agarosa de punto de fusión bajo del 4%, TAE 1X. La banda del megacebador se corta del gel y se purifica mediante el uso del sistema de purificación de ADN Magic PCR Preps de Promega. El megacebador purificado se usa después en una segunda etapa de PCR. Se añade un \mug de molde genómico 2, aproximadamente 0,5 \mug del megacebador, y 5 \mul de oligonucleótido de 3' 10 \muM a una mezcla de tampón 10X, MgCl_{2}, dNTPs y Taq a las mismas concentraciones finales expuestas anteriormente, y se lleva hasta 100 \mul con agua. Las condiciones de PCR son las mismas que anteriormente. El producto de fusión resultante de esta amplificación se purifica también mediante el uso del sistema de purificación de ADN Magic PCR Preps de Promega.

El producto de fusión se liga después en el vector TA y se transforma en E. coli mediante el uso del equipo TA Cloning de Invitrogen (San Diego, CA). Se ligan aproximadamente 50 ng de producto de fusión de PCR a 50 ng de vector pCRII con tampón de ligadura 1X, 4 unidades de ligasa de T4, y se llevan hasta 10 \mul con agua. Esta mezcla de productos ligados se incuba a 12ºC durante la noche (aproximadamente 14 horas). Se añaden dos \mul de la mezcla de productos de ligadura a 50 \mul de células competentes INC F' y 2 \mul de \beta-mercaptoetanol. Las células se incubaron después durante 30 minutos, seguido de tratamiento de choque térmico a 42ºC durante 60 segundos, y parada en hielo durante dos minutos. Después se añaden 450 \mul de medio SOC calentado a las células, lo que da como resultado un cultivo de células transformadas que se incuba a 37ºC durante una hora con agitación ligera. 50 \mul del cultivo de células transformadas se colocan en placas de LB + 50 \mug/\mul de ampicilina y se incuban durante la noche a 37ºC. Se recogen colonias blancas
únicas y se añaden a cultivos individuales durante la noche que contienen 3 ml de LB con ampicilina (50 \mug/\mul).

Los cultivos individuales de la noche se preparan mediante el uso del sistema de purificación de ADN Magic Miniprep de Promega. Se corta una pequeña cantidad del ADN resultante mediante el uso de una digestión de restricción como comprobación. Después se realiza la secuenciación del ADN para comprobar la secuencia de ácido nucleico de la fusión, mediante el uso del equipo de secuenciación de ADN Sequenase versión 2.0 de United States Biochemical (Cleveland, OH). Se usan tres a cinco \mug de ADN plasmídico por reacción. Se añaden 2 \mul de NaOH 2 M/EDTA 2 mM al ADN, y el volumen se lleva hasta 20 \mul con agua. La mezcla se incuba después a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se añaden 7 \mul de agua, 3 \mul de NaAc 3 M, 75 \mul de EtOH. La mezcla resultante se mezcla mediante agitación en vórtex y se incuba durante diez minutos a -70ºC, y después se somete a microcentrifugación. Después de la microcentrifugación durante diez minutos, el sobrenadante se elimina mediante aspiración, y el sedimento se seca en el Speed Vac durante 30 segundos. Después se añaden 6 \mul de agua, 2 \mul de tampón de hibridación y 2 \mul de 10 \muM del oligonucleótido apropiado. Esta mezcla se incuba durante 10 minutos a 37ºC y después se deja reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Posteriormente, se añaden 5,5 \mul de mezcla de marcadores (como se describió anteriormente) a cada muestra de la mezcla, que se incuba a temperatura ambiente durante cinco minutos adicionales. Después se añaden 3,5 \mul de ADN marcado a cada muestra, que se incuba después durante cinco minutos a 37ºC. Se añaden 4 \mul de disolución de parada a cada pocillo. El ADN se desnaturaliza a 95ºC durante dos minutos, y después se coloca en hielo.

Los clones con las secuencias de fusión de ácidos nucleicos deseadas se consideran después en el marco de lectura en el sistema de expresión pET en las formas lipidadas (tamaño completo) y sin lipidar (truncadas, es decir, sin los primeros 17 aminoácidos). El producto se amplifica mediante el uso de los sitios de restricción contenidos en los cebadores de PCR. El vector y el producto se cortan con las mismas enzimas y se ligan con ligasa de T4. El plásmido resultante se transforma en E. coli competentes mediante el uso de técnicas de transformación estándar. Las colonias se criban como se describió previamente y los clones positivos se transforman en células de expresión, tales como E. coli BL21, para la expresión de proteínas con IPTG para la inducción. La proteína expresada en su forma de lisado de cultivo bacteriano y/o su forma purificada se inyecta después en ratones para la producción de anticuerpos. Se extrae sangre a los ratones, y los sueros se recogen para ensayos de aglutinación, inhibición del crecimiento in vitro y lisis dependiente e independiente del complemento.

B. Secuencias quiméricas de ácidos nucleicos específicas

Se generaron diversas secuencias quiméricas de ácidos nucleicos. Se describe que las secuencias de ácidos nucleicos codifican polipéptidos de proteínas de Borrelia. Las secuencias quiméricas de ácidos nucleicos se producen de forma que la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido está en el mismo marco de lectura que la secuencia de ácido nucleico que codifica el siguiente polipéptido en la secuencia de la proteína quimérica codificada por la secuencia quimérica de ácido nucleico. Las proteínas se enumeran secuencialmente (por orden de presencia en la secuencia codificante) en la descripción de la secuencia quimérica de ácido nucleico. Por ejemplo, si una secuencia quimérica de ácido nucleico consiste en los bp 1-650 de OspA-1 y los bp 651-820 de OspA-2, la secuencia de la quimera incluiría los primeros 650 pares de bases de OspA-1 seguidos inmediatamente por los pares de bases 651-820 de OspA-2.

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OspA-K48/OspA-PGau

Se generó una quimera de OspA de la cepa K48 (OspA-K48) y OspA de la cepa PGau (OspA-PGau) mediante el uso del método descrito anteriormente. Esta secuencia quimérica de ácido nucleico incluyó los bp 1-654 de OspA-K48, seguidos por los bp 655-820 de OspA-PGau. Los cebadores usados incluyeron: la secuencia aminoterminal del cebador de OspA nº 607 (ID SEC Nº 16); el cebador de fusión, 5'-AAAGTAGAAGTTTTTGAATCCCATTTTC
CAGTTTTTTT-3' (cebador de la cadena negativa nº 668-654) (ID SEC Nº 84); la secuencia carboxiterminal del cebador de OspA nº 586 (ID SEC Nº 19); y los cebadores de la secuencia nº 369 (ID SEC Nº 14) y nº 357 (ID SEC Nº 15). La secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 85; la proteína quimérica codificada por esta secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 86.

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OspA-B31/OspA-PGau

Se generó una quimera de OspA de la cepa B31 (OspA-B31) y OspA de la cepa PGau (OspA-PGau) mediante el uso del método descrito anteriormente. Esta secuencia quimérica de ácido nucleico incluyó los bp 1-651 de OspA-B31, seguidos por los bp 652-820 de OspA-PGau. Los cebadores usados incluyeron: el cebador de fusión, 5'-AAAG
TAGAAGTTTTTGAATTCCAAGCTGCAGTTTT-3' (cebador de la cadena negativa nº 668-651) (ID SEC Nº 87); y el cebador de la secuencia, nº 369 (ID SEC Nº 14). La secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 88; la proteína quimérica codificada por esta secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 89.

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OspA-B31/OspA-K48

Se generó una quimera de OspA de la cepa B31 (OspA-B31) y OspA de la cepa K48 (OspA-K48) mediante el uso del método descrito anteriormente. Esta secuencia quimérica de ácido nucleico incluyó los bp 1-651 de OspA-B31, seguidos por los bp 652-820 de OspA-K48. Los cebadores usados incluyeron: el cebador de fusión, 5'-AAAGTG
GAAGTTTTTGAATTCCAAGCTGCAGTTTTTTT-3' (cebador de la cadena negativa nº 671-651) (ID SEC Nº 90); y el cebador de la secuencia, nº 369 (ID SEC Nº 14). La secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 91; la proteína quimérica codificada por esta secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 92.

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OspA-B31/OspA-25015

Se generó una quimera de OspA de la cepa B31 (OspA-B31) y OspA de la cepa 25015 (OspA-25015) mediante el uso del método descrito anteriormente. Esta secuencia quimérica de ácido nucleico incluyó los bp 1-651 de OspA-B31, seguidos por los bp 652-820 de OspA-25015. Los cebadores usados incluyeron: el cebador de fusión, 5'-TAAAGTTGAAGTGCCTGCATTCCAAGCTGCAGTTT-3' (ID SEC Nº 93). La secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 94; la proteína quimérica codificada por esta secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 95.

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OspA-K48/OspA-B31/OspA-K48

Se generó una quimera de OspA de la cepa B31 (OspA-B31) y OspA de la cepa K48 (OspA-K48) mediante el uso del método descrito anteriormente. Esta secuencia quimérica de ácido nucleico incluyó los bp 1-570 de OspA-K48, seguidos por los bp 570-651 de OspA-B31, seguidos por los bp 650-820 de OspA-K48. Los cebadores usados incluyeron: el cebador de fusión, 5'-CCCCAGATTTTGAAATCTTGCTTAAAACAAC-3' (ID SEC Nº 96); y el cebador de la secuencia, nº 357 (ID SEC Nº 15). La secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 97; la proteína quimérica codificada por esta secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 98.

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OspA-B31/OspA-K48/OspA-B31/OspA-K48

Se generó una quimera de OspA de la cepa B31 (OspA-B31) y OspA de la cepa K48 (OspA-K48) mediante el uso del método descrito anteriormente. Esta secuencia quimérica de ácido nucleico incluyó los bp 1-420 de OspA-B31, seguidos por los pb 420-570 de OspA-K48, seguidos por los bp 570-650 de OspA-B31, seguidos por los bp 651-820 de OspA-K48. Los cebadores usados incluyeron: el cebador de fusión, 5'-CAAGTCTGGTTCCAATTTGCTCTTGT
TATTAT-3' (cebador de la cadena negativa nº 436-420) (ID SEC Nº 99); y el cebador de la secuencia, nº 357 (ID SEC Nº 15). La secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 100; la proteína quimérica codificada por esta secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 101.

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OspA-B31/OspB-B31

Se generó una quimera de OspA y OspB de la cepa B31 (OspA-B31, OspB-B31) mediante el uso del método descrito anteriormente. La secuencia quimérica de ácido nucleico incluyó los bp 1-651 de OspA-B31, seguidos por los bp 652-820 de OspB-B31. Los cebadores usados incluyeron: el cebador de fusión, 5'-GTTAAAGTGCTAGTACTGT
CATTCCAAGCTGCAGTTTTTTT-3' (cebador de la cadena negativa nº 740-651) (ID SEC Nº 102); la secuencia carboxiterminal del cebador de OspB nº 1106 (ID SEC Nº 25); y el cebador de la secuencia nº 357 (ID SEC Nº 15). La secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 103; la proteína quimérica codificada por esta secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 104.

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OspA-B31/OspB-B31/OspC-B31

Se generó una quimera de OspA, OspB y OspC de la cepa B31 (OspA-B31, OspB-B31 y OspC-B31) mediante el uso del método descrito anteriormente. La secuencia quimérica de ácido nucleico incluyó los bp 1-650 de OspA-B31, seguidos por los bp 652-820 de OspB-B31, seguidos por los bp 74-630 de OspC-B31. Los cebadores usados incluyeron: el cebador de fusión, 5'-TGCAGATGTAATCCCATCCGCCATTTTTAAAGCGTTTTT-3' (ID SEC Nº 105); y la secuencia carboxiterminal del cebador de OspC (ID SEC Nº 28). La secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 106; la proteína quimérica codificada por esta secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 107.

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OspC-B31/OspA-B31/OspB-B31

Se generó una quimera de OspA, OspB y OspC de la cepa B31 (OspA-B31, OspB-B31 y OspC-B31) mediante el uso del método descrito anteriormente. La secuencia quimérica de ácido nucleico incluyó los bp 1-630 de OspC-B31, seguidos por los bp 52-650 de OspA-B31, seguidos por los bp 650-820 de OspB-B31. Los cebadores usados incluyeron: la secuencia aminoterminal del cebador de OspC que tiene la ID SEC Nº 27; el cebador de fusión, 5'-GCTGCTAACATTTTGCTTAGGTTTTTTTGGACTTTC-3' (cebador de la cadena negativa nº 69-630) (ID SEC Nº 108); y los cebadores de la secuencia nº 520 (ID SEC Nº 40) y nº 200 (ID SEC Nº 18). La secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 109; la proteína quimérica codificada por esta secuencia quimérica de ácido nucleico se presenta como ID SEC Nº 110.

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Secuencias quiméricas de ácidos nucleicos adicionales

Mediante el uso de los métodos descritos aquí, se produjeron otras secuencias quiméricas de ácidos nucleicos. Estas secuencias quiméricas de ácidos nucleicos, y las proteínas codificadas, se resumen en la Tabla III.

TABLA III Secuencias quiméricas de ácidos nucleicos y las proteínas codificadas

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C. Purificación de las proteínas generadas mediante secuencias quiméricas de ácidos nucleicos

Las secuencias quiméricas de ácidos nucleicos descritas anteriormente, así como las secuencias quiméricas de ácidos nucleicos producidas mediante los métodos descritos anteriormente, se usan para producir proteínas quiméricas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos. Se pueden usar métodos estándar, tales como los descritos anteriormente en el Ejemplo 3 con respecto a la expresión de proteínas a partir de genes de Borrelia, para expresar las proteínas en un organismo hospedador compatible. Las proteínas quiméricas se pueden aislar y purificar después mediante el uso de técnicas estándar.

Si la proteína quimérica es soluble, se puede purificar en una columna de Sepharose. Las proteínas insolubles se pueden solubilizar en guanidina y purificarlas en una columna de Ni^{2+}; de forma alternativa, se pueden solubilizar en NaPO_{4} 10 mM con 0,1-1% de TRITON X 114, y posteriormente purificarlas en una columna S (Pharmacia). Las proteínas lipidadas se purificaron en general mediante el segundo método. Se determinó la solubilidad separando las fracciones soluble e insoluble del lisado celular en un gel de PAGE del 12%, y comprobando la localización de la proteína mediante tinción de Coomassie, o mediante transferencia de Western con anticuerpos monoclonales dirigidos hacia un polipéptido antigénico de la proteína quimérica.

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Ejemplo 5 Generación de ácidos nucleicos quiméricos de OspC/OspA y proteínas quiméricas A. Protocolo general para la creación de secuencias quiméricas de ácidos nucleicos

Se generó un gran número de secuencias quiméricas de ácidos nucleicos que codifican proteínas que comprenden al menos un primer y un segundo polipéptido de Borrelia burgdorferi. Estas secuencias quiméricas de ácidos nucleicos se produjeron de forma que la proteína quimérica codificada comprendía un polipéptido de OspC de Borrelia burgdorferi en dirección N-terminal (o N-terminal respecto de) un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi. Las secuencias quiméricas de ácidos nucleicos se produjeron además de forma que el ácido nucleico que codifica un polipéptido estuvo en el mismo marco de lectura que la secuencia de ácido nucleico que codifica el siguiente polipéptido de la proteína quimérica.

Se usó la estrategia general de clonado para construir las secuencias quiméricas de ácidos nucleicos. El fragmento deseado de OspC se amplificó mediante el uso de un cebador de 5' que contenía un sitio de restricción adecuado para clonar el producto resultante en un vector de interés, y un cebador de 3' que contenía un sitio de restricción adecuado para ligar el fragmento de OspC al fragmento de OspA. El producto de OspC se clona en un vector adecuado. Para la porción de OspA del ácido nucleico quimérico, se amplificó el fragmento de OspA deseado mediante el uso de un cebador de 5' que contenía un sitio de restricción para ligar el fragmento de OspA resultante al fragmento de OspC y un cebador de 3' que contenía un sitio de restricción adecuado para clonar el producto de OspA resultante en el vector con el producto de OspC. El uso de un sitio de restricción para permitir la ligadura del fragmento de OspC y OspA da como resultado la inserción de 0 a alrededor de 3 aminoácidos entre los fragmentos de OspC y OspA.

Un ejemplo específico de tal construcción se expone a continuación. Se entiende que se podrían usar otros sitios de restricción adecuados sin más que la experimentación rutinaria. Las quimeras OspC/OspA resultantes podrían tener, por lo tanto, la adición de 0 a alrededor de 3 aminoácidos entre los fragmentos de OspC y OspA, dependiendo del sitio de restricción utilizado.

Para las porciones de OspC de los ácidos nucleicos quiméricos, se amplificaron mediante PCR los fragmentos deseados de los genes de OspC de diversas cepas o genoespecies mediante el uso de un cebador de 5' que contenía un sitio NdeI y un cebador de 3' que contenía un sitio NcoI y BamHI. El producto de OspC amplificado se clonó después en los sitios de NdeI y BamHI del vector de expresión controlado por el promotor de T7, pET9c. Para la porción de OspA del ácido nucleico quimérico, se amplificaron mediante PCR los fragmentos deseados de los genes de OspA de una cepa de interés o genoespecie de interés mediante el uso de un cebador de 5' que contenía un sitio NcoI y un cebador de 3' que contenía un sitio BamHI. Esta porción de OspA se pudo clonar directamente después en los sitios de NcoI y BamHI del vector pET9c que contenía la secuencia de OspC deseada, por lo que se produjo la construcción OspC-OspA deseada. Mediante la inclusión de la secuencia del sitio de restricción NcoI en los cebadores, se produjo una secuencia ligadora de nueve nucleótidos que codifica los aminoácidos Ser-Met-Ala en la unión entre la secuencia N-terminal de OspC y la secuencia C-terminal de OspA. El uso de la enzima de restricción NcoI (CCATGG) en esta estrategia de clonado fue una elección adecuada, ya que el ADN de Borrelia es rico en AT y por lo tanto posee solamente unos cuantos sitios de NcoI en su genoma.

Como ejemplo, se generaron ácidos nucleicos quiméricos de OspC-OspA que contenían OspC sin lipidar de B31 mediante el uso de los siguientes cebadores:

\quad: (5'OspC-NdeI): 5'-GT CAT ATG GCT TGT AAT AAT TCA GGG AAA GA-3' (ID SEC Nº:181); y

\quad: (3'OspC-NcoI): 5'-T TTC CAT GGA AGG TTT TTT TGG ACT TTC TG-3' (ID SEC Nº:182).

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Para los ácidos nucleicos quiméricos de OspC-OspA que contienen OspA sin lipidar de B31, se usaron los siguientes cebadores:

\quad: (5'OspA-NcoI): 5'-TT TCC ATG GCC AAG CAA AAT GTT AGC AGC C-3' (ID SEC Nº:183); y

\quad: (3'OspA-BamHI): 5'-TAA GGA TCC TTA TTT TAA AGC GTT TTT-3' (ID SEC Nº:184).

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Las versiones lipidadas de las quimeras OspC/A se pueden construir clonando un vector de expresión que contiene una secuencia líder que contiene un sitio de lipidación, de forma que la secuencia líder se une en dirección 5' de la porción de OspC de la quimera y en el marco de lectura de la quimera. La secuencia líder que comprende una señal de lipidación puede ser, por ejemplo, de un gen que codifica los polipéptidos de OspA, B o C.

Las secuencias quiméricas de ácidos nucleicos que se produjeron, y las proteínas que codifican, se resumen en la Tabla IV. Otras secuencias quiméricas de ácidos nucleicos adicionales, y las proteínas codificadas, se representan también en la Tabla IV. En las realizaciones adicionales, se construyen proteínas quiméricas OspC/OspA en las que un primer segmento de OspA es de B31 y comprende los pares de bases de alrededor de 88 a alrededor de 450, y un segundo segmento de OspA comprende los pares de bases de alrededor de 451 a alrededor de 537 de PKo. Estas quimeras pueden comprender también segmentos adicionales de OspA tales como los dos últimos segmentos de las ID SEC Nºs 167 ó 165 o el último segmento de ID SEC Nº: 163.

TABLA IV Secuencias quiméricas de ácidos nucleicos de OspC/OspA y proteínas codificadas

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Los diferentes fragmentos de polinucleótidos o polipéptidos de la quimera están separados por un "/"

B. Expresión de proteínas

Como se describió en los dos ejemplos previos, es posible expresar y purificar proteínas de Borrelia tales como OspA, OspC y polipéptidos quiméricos OspC/OspA. Esto se lleva a cabo incorporando la secuencia de ácido nucleico deseada, que codifica la proteína de elección, en un plásmido de expresión mediante el uso de técnicas estándar. Este plásmido de expresión se puede transfectar después en una célula hospedadora compatible para expresar la proteína deseada.

Las proteínas OspA, OspC u OspC/OspA quiméricas purificadas, que se usaron para inmunizar ratones y en los ensayos de ELISA descritos más adelante, se generaron y se purificaron clonando secuencias de ácidos nucleicos de OspA, OspC u OspC/OspA quiméricas en el marco de lectura en el plásmido de expresión pET. El plásmido de expresión se transfectó después en la línea de células de expresión compatibles de la cepa BL21 (DE3)/(pLysS) o la cepa B834 (DE3) de Escherichia coli. Las células BL21 o B834 se cultivaron después en 10 ml de medio LB (5 g/l de NaCl, 10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 25 mg/l de cloranfenicol y 50 mg/l de ampicilina) a 37ºC con agitación. Cuando la densidad óptica a 600 nm alcanzó las 0,3-0,4 unidades, se indujo la expresión de las proteínas recombinantes mediante la adición de IPTG (isopropil-B-D-tiogalactopiranósido) hasta una concentración final de 0,5 mM, y las células se cultivaron durante tres horas adicionales. Los cultivos se recogieron mediante centrifugación a 3800xg durante cinco minutos. Las células se resuspendieron en NaPO_{4} 20 mM, pH 7,7 y se almacenaron a -20ºC durante la noche. Una vez descongelados, los extractos brutos se incubaron con DNasa (2 \mug/ml) en presencia de MgCl_{2} 2,5 mM a temperatura ambiente durante treinta minutos y después se centrifugaron a 14,000 rpm (Eppendorf 5417C) durante cinco minutos.

Para purificar las proteínas OspC descritas más adelante, los extractos brutos de las células que expresan OspC se cargaron en una columna de intercambio aniónico (Q Sepharose Fast Flow, 2,2x10 cm, Pharmacia) que se había preequilibrado con Tris-Cl 20 mM, pH 9,3. La columna se lavó con el mismo tampón (Tris-Cl 20 mM, pH 9,3) que eluyó la proteína OspC. Las fracciones de lavado que contuvieron OspC se concentraron mediante el uso de Amicon 10K y después se dializaron con una disolución que contenía NaPO_{4} 20 mM de pH 8,0 y NaCl 250 mM. La OspC parcialmente purificada se pasó después por una columna de afinidad de metal Ni^{2+} (Chelating Sepharose Fast Flow 2,2x10 cm, Pharmacia) equilibrada con NaPO_{4} 20 mM de pH 8,0 y NaCl 250 mM. La columna se lavó mediante el uso de un gradiente de pH decreciente de ácido acético-acetato sódico 20 mM y NaCl 250 mM, y la OspC unida eluyó a alrededor
de pH 5,7. Las fracciones de OspC se concentraron después mediante ultrafiltración y se almacenaron a -70ºC.

Para la purificación de las proteínas OspA se siguió el mismo procedimiento, excepto que la etapa de diálisis, tras la filtración con Amicon 10K, se realizó en NaPO_{4} 20 nM, pH 6,0. La OspA parcialmente purificada se aplicó después a una columna de intercambio catiónico (S Sepharose Fast Flow 2,2X10 cm, Pharmacia) equilibrada con NaPO_{4} 20 nM, pH 6,0. La columna se lavó mediante el uso de un gradiente creciente de NaCl desde 0 hasta 100 mM. Las fracciones que contenían OspA se concentraron mediante ultrafiltración y se almacenaron a -70ºC.

Como se indicó previamente, se generaron tanto formas lipidadas como sin lipidar (truncadas, es decir, sin los primeros 17 aminoácidos) de proteínas OspC, OspA y OspC/OspA quiméricas.

C. Inmunización de ratones y caracterización serológica mediante el uso de ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) Inmunización de ratones

Se inmunizaron ratones, C3H-J o ICR, con 3 \mug de proteína quimérica OspC/OspA lipidada o 6 \mug de quimeras OspC/OspA sin lipidar en 100 \mul de adyuvante de hidróxido de aluminio (concentración de 1,8 mg/ml) mediante inyección subcutánea (SC). Como control negativo, los ratones se inmunizaron con 100 \mul de adyuvante de hidróxido de aluminio solamente. Todos los ratones recibieron un total de tres inyecciones que se administraron a intervalos de dos semanas. Una semana después de la inmunización final se extrajo sangre de cada ratón (lo que incluye a los controles negativos) y se analizó la reactividad de IgG del suero mediante el uso del método de ELISA descrito más adelante, en busca de la presencia de anticuerpos anti-OspA hacia las tres proteínas OspA diferentes purificadas (Borrelia burgdorferi sensu stricto (B31), Borrelia garinii (K48) y Borrelia afzelii (PGau)). Los sueros se ensayaron a una dilución de 1:1000.

Los ratones se inmunizaron con las proteínas quiméricas descritas en la Tabla V.

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TABLA V Proteínas quiméricas usadas para inmunizar ratones

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Caracterización serológica mediante el uso de ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) Inmovilización de antígeno en placas de ELISA

Se añadió una disolución de proteína OspC u OspA recombinante purificada de cada una de las cepas B31 de Borrelia burgdorferi (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) y PGau (Borrelia afzelii) a tampón de fosfato sódico, pH 9,0, y se usó para revestir una placa de micropocillos comercial (MaxiSorp®, Nunc). El procedimiento de revestimiento fue el siguiente: se añadieron 100 \mul de una disolución que contenía la proteína OspA u OspC apropiada (preparada a una concentración de 250 ng/ml en el siguiente tampón de revestimiento: Bis-Tris propano 100 mM, pH 9,7) a cada pocillo de una placa de microtitulación que se incubó durante una hora a 37ºC. La disolución de antígeno se extrajo de los pocillos, la placa se lavó tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) de pH 9,0, y se añadieron 300 \mul de la disolución tampón de bloqueo (3% de leche en polvo, 0,1% de polioxietilensorbitán (denominado aquí Tween 20^{TM}), 0,02% de NaN_{3} en Bis-Tris propano 100 nM, pH 9,7). Después de una incubación de una hora a 37ºC, las placas se lavaron cuatro veces con tampón de lavado TBS-Tween 20^{TM} (Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 136 mM, 0,1% de Tween 20^{TM} y 0,02% de NaN_{3}) y después se dejaron secar. Las placas se envolvieron después en plástico y se almacenaron a 4ºC hasta que se usaron.

Ensayos de ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas)

El procedimiento estándar para los ensayos de ELISA fue el siguiente: el suero de ratón se diluyó 1:1000 en tampón de dilución de muestras (1% de leche en polvo, NaCl 136 mM, 0,1% de Tween 20^{TM}, 0,02% de NaN_{3} en Tris-Cl 20 mM, pH 7,5) y se añadieron 100 \mul del suero diluido a los pocillos de la placa de microtitulación de ELISA que se habían revestido con el antígeno como se describió anteriormente. Tras una incubación durante 1 hora a 37ºC, se extrajeron las muestras y las placas se lavaron cuatro veces en TBS-Tween^{TM} (Tris-Cl 20 mM, pH 7,5; NaCl 136 mM; 0,1% de Tween 20^{TM} y 0,02% de NaN_{3}). Para el anticuerpo secundario, se diluyeron antisueros anti-ratón de cabra conjugados a fosfatasa alcalina específicos para IgM (Fc) o IgG (Fab), (Jackson Immuno Research Laboratories) 1:750 en tampón de dilución de muestras (1% de leche en polvo, NaCl 136 mM, 0,1% de Tween 20^{TM}, 0,02% de NaN_{3} en Tris-Cl 20 mM, pH 7,5) y se añadieron 100 \mul del anticuerpo secundario diluido a cada pocillo. Tras la incubación durante treinta minutos a 37ºC, las placas se lavaron tres veces con TBS-Tween^{TM} (Tris-Cl 20 mM, pH 7,5; NaCl 136 mM; 0,1% de Tween 20^{TM} y 0,02% de NaN_{3}) y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de disolución de sustrato de fosfatasa (5 mg de comprimidos de p-nitrofenilfosfato disueltos en tampón sustrato de dietanolamina 1X para producir una disolución de 2 mg/ml, Kirkegaard Perry Laboratory). Las placas se incubaron durante treinta minutos a 37ºC y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de disolución de parada (5% de EDTA). Se leyó la absorbancia a 405 nm en un lector de microplacas (Dynatech). Se consideró que una muestra era positiva si produjo una absorbancia media mayor que la media de los controles negativos más tres desviaciones estándar.

Los trabajos previos han demostrado que es la región carboxiterminal de OspA la que contiene los sitios antigénicos que proporcionan la respuesta inmunoprotectora. Así, además del ensayo de ELISA descrito anteriormente, se realizó un ELISA modificado (denominado aquí ensayo de ELISA protector), en el que se usó la región N-terminal purificada de OspA de B31 (aminoácidos 18-139) para bloquear cualquier anticuerpo presente en el suero de ratón que tuviera especificidad hacia esta región N-terminal de OspA. Estos ensayos de ELISA protectores se llevan a cabo como se describió anteriormente, excepto que se añadieron 80 \mug/ml de un fragmento de OspA de B31 purificado (aminoácidos 18-139) al suero de ratón diluido antes de añadir los sueros a los pocillos de la placa de microtitulación de ELISA revestidos con antígeno.

Resultados de los ensayos de ELISA

Mediante el uso de los ensayos de ELISA anteriormente descritos, se demostró que los ratones inmunizados con una proteína quimérica OspC/OspA sin lipidar (OspC2-OspA, compuesta de OspC (aa. 19-204 de la cepa C2)/OspA (aa. 18-273 de la cepa B31) (ID SEC Nº 150)) produjeron una respuesta inmunitaria hacia OspA y OspC que fue comparable a la respuesta inmunitaria generada hacia las proteínas de control OspA sin lipidar (OspA, aa. 18-273 de la cepa B31) y OspC sin lipidar (OspC, aa. 19-211 de la cepa B31) (Fig. 47). Como se indica en la Fig. 47 y se describió anteriormente, los ratones se inmunizaron con proteínas OspA, OspC u OspC2-OspA y se midieron las respuestas inmunitarias de los sueros contra el antígeno OspA de B31 (barras claras) y el antígeno OspC de B31 (barras rayadas).

Mediante el uso del ensayo de ELISA protector anteriormente descrito, se demostró también que los ratones inmunizados con la misma proteína quimérica OspC/OspA sin lipidar (OspC2-OspA, compuesta de OspC (aa. 19-204 de la cepa C2)/OspA (aa. 18-273 de la cepa B31) (ID SEC Nº 150)) produjeron una respuesta inmunitaria hacia la porción C-terminal de OspA que fue comparable a la respuesta inmunitaria generada hacia la porción C-terminal de una proteína de control OspA sin lipidar (OspA, aa. 18-273 de la cepa B31) (Fig. 48). Como se indica en la Fig. 48, los ratones se inmunizaron con proteínas OspA, OspC u OspC2-OspA y se midieron las respuestas inmunitarias de los sueros contra el antígeno OspA de B31. La respuesta de anticuerpos protectores hacia el antígeno OspA de B31 se indica en las barras claras.

Así, estos resultados demuestran claramente que las proteínas quiméricas OspC/OspA sin lipidar son capaces de inducir respuestas inmunitarias en ratones que son comparables a la respuesta inmunitaria generada contra las proteínas de control OspC y OspA sin lipidar.

Previamente se pensó que las señales de lipidación que están presentes en las proteínas de la superficie externa de Borrelia burgdorferi eran necesarias para la inmunogenicidad, y que las proteínas OspC y OspA que carecían de esta señal de lipidación serían menos inmunógenas o no serían inmunógenas. Para poner a prueba esta idea, se inmunizaron los ratones con una proteína quimérica OspC/OspA sin lipidar (OspC-OspAB/P, compuesta de OspC (aa. 19-211 de la cepa B31)/OspA (aa. 18-216 de la cepa B31)/OspA (aa. 217-273 de la cepa PKo) (ID SEC Nº:156) así como con dos proteínas OspA lipidadas, lipOspAP/Bo (compuesta de OspA (aa. 1-217 de la cepa PGau)/OspA (aa. 218-273 de la cepa Bo)) y lipOspAB/P (compuesta de OspA (aa. 1-216 de la cepa B31)/OspA (aa. 217-273 de la cepa PKo)) y se sometieron a ensayos de ELISA. Los ratones inmunizados con la proteína quimérica OspC/OspA sin lipidar (OspC-OspAB/P) produjeron una respuesta inmunitaria hacia OspA de cada una de las cepas de Borrelia burgdorferi B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) y PGau (Borrelia afzelii) que fue equivalente o mayor que la respuesta inmunitaria generada hacia las dos proteínas de control OspA lipidadas (lipOspAP/Bo y lipOspAb/P) (Fig. 49).

Se obtuvieron resultados similares a éstos mediante el uso del ensayo de ELISA protector descrito anteriormente. Los ratones inmunizados con la proteína quimérica OspC/OspA sin lipidar (OspC-OspAB/P) produjeron una respuesta inmunitaria hacia la región C-terminal de OspA de cada una de las cepas de Borrelia burgdorferi B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) y PGau (Borrelia afzelii) que fue equivalente o mayor que la respuesta inmunitaria generada hacia la región C-terminal de OspA de las dos proteínas de control de OspA lipidadas (lipOspAP/Bo y lipOspAb/P) (Fig. 50).

Además de las comparaciones entre las proteínas quiméricas OspC/OspA sin lipidar y las proteínas de control OspA lipidadas, también se realizaron experimentos para comparar las proteínas quiméricas OspC/OspA sin lipidar con una proteína de control OspC lipidada (Fig. 51). Los ratones que se inmunizaron con la proteína quimérica OspC/OspA sin lipidar OspCB31-OspAB31 (compuesta de OspC (aa. 19-211 de la cepa B31)/OspA (aa. 18-273 de la cepa B31) (ID SEC Nº:146) o la proteína quimérica OspC/OspA sin lipidar OspC2-OspAB31 (compuesta de OspC (aa. 19-204 de la cepa C2)/OspA (aa. 18-273 de la cepa B31) (ID SEC Nº:150) produjeron una respuesta inmunitaria hacia OspC derivada de la cepa B31 de Borrelia burgdorferi que fue comparable a la respuesta inmunitaria producida por una proteína de control OspC lipidada (lip OspC-B31, compuesta de OspC (aa. 1-211 de la cepa B31)) (Fig. 51).

Así, estos resultados demuestran claramente que las proteínas quiméricas OspC/OspA sin lipidar son capaces de inducir respuestas inmunitarias contra OspA y OspC que son comparables a la respuesta inmunitaria generada contra OspA y OspC mediante el uso de proteínas de control de OspA u OspC lipidadas. El uso de formas sin lipidar de estas proteínas como inmunógenos vacunales o antígenos diagnósticos es sumamente deseable, debido a que el rendimiento del producto es mucho mayor y las proteínas son mucho más fáciles de purificar. Por estas razones, la producción de estas proteínas es más barata.

Las proteínas quiméricas OspC/OspA de la presente invención son capaces también de generar respuestas inmunitarias contra proteínas OspA que derivan de cepas que no están representadas en la proteína quimérica. Los ratones inmunizados con las proteínas quiméricas OspC/OspA, OspCB31-OspAB31 (ID SEC Nº:146) y OspC2-OspAB31 (ID SEC Nº:150), no solamente son capaces de generar respuestas inmunitarias que reconocen OspA derivada de la cepa B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), sino que también reconocen OspA derivada de la cepa K48 (Borrelia garinii) y de la cepa PGau (Borrelia afzelii) (Fig. 52). A modo de comparación, los ratones también se inmunizaron con la proteína quimérica OspA lipidada, Lip OspA K/T (compuesta de OspA (aa. 1-217 de la cepa K48)/OspA (aa. 218-273 de la cepa Tro)) (Fig. 52).

También se presentan las respuestas de anticuerpos adicionales hacia OspA derivada de la cepa B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), de la cepa K48 (Borrelia garinii) y de la cepa PGau (Borrelia afzelii) para los sueros de ratones inmunizados con otras proteínas quiméricas OspC/OspA. Así, la Fig. 53 presenta los resultados de los ELISA de ratones inmunizados con OspCB31-OspAB/P (ID SEC Nº:156), OspCB31-OspABPBP (ID SEC Nº:178) u OspCB31-OspAB31 (ID SEC Nº:146). En cada caso, los sueros de los ratones inmunizados se ensayaron contra OspA derivada de las cepas B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) y PGau (Borrelia afzelii). En todos los casos, se generó una respuesta inmunitaria intensa (Fig. 53). Como ocurrió con las proteínas quiméricas OspC/OspA descritas previamente, las tres proteínas quiméricas OspC/OspA usadas para inmunizar a los ratones de la Fig. 52 también provocaron una respuesta inmunitaria intensa hacia la región C-terminal de OspA cuando se examinaron mediante el uso del ensayo de ELISA protector descrito anteriormente (Fig. 54).

Exposición a garrapatas de ratones inmunizados

Los ratones, C3H-J o JCR, que se habían inmunizado como se describió anteriormente, también se expusieron a ninfas infectadas en laboratorio o ninfas de campo. Los ratones inmunizados se colocaron en jaulas de aislamiento y cada ratón recibió 5-10 ninfas. Todas las ninfas se recogieron y se contaron después de 6 días. Cuatro semanas tras la exposición, se extrajo sangre a los ratones y se analizaron los sueros mediante el uso de tiras de transferencia de Western disponibles comercialmente para la cepa B31 de Borrelia burgdorferi sensu stricto (tiras MarDx) y/o para Borrelia garinii (tiras MRL). Ocho semanas tras la exposición, se extrajo sangre a los ratones, se analizaron los sueros de nuevo mediante transferencia de Western y se cultivaron muestras de sacabocados de oreja y de vejiga. Como control positivo, se sometió a la misma exposición a ratones que se habían inmunizado solamente con adyuvante de hidróxido de aluminio, como se describió anteriormente.

Los resultados de los estudios de exposición a garrapatas (Tabla VI) demuestran que mientras la inmunización con proteína OspC lipidada fue incapaz de proteger a los ratones, como se demostró mediante una señal positiva en la transferencia de Western (en 4 de 5 ratones), la inmunización con dos proteínas quiméricas OspC/OspA diferentes (ID SEC Nº 146 e ID SEC Nº 150) sí proporcionó protección, como se indica mediante la ausencia de señal en la transferencia de Western (en 0 de 8 ratones y en 0 de 3 ratones) (Tabla VI). El control positivo de referencia demostró que la exposición a las garrapatas fue eficaz en todos los casos, como se demostró mediante una señal positiva del 100% en las transferencias de Western (Tabla VI).

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TABLA VI Efecto de la vacunación sobre la transmisión de Borrelia de garrapatas

11

<110> Research Foundation of the State University of New York Brookhaven Sciences Associates, LLC

\hskip1cm Benjamin J. Luft

\hskip1cm John J. Dunn

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<120> Constructos Recombinantes de Borrelia burgdorferi

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<130> 2631.1001010

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<140> PCT/US01/24736

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<141> 07-08-2001

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<150> US 60/226,484

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<151> 18-08-2000

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<150> US 09/666,017

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<151> 19-09-2000

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<160> 186

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<170> FastSEQ para Windows Version 4.0

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<210> 1

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador Oligonucleótido

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23

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador Oligonucleótido

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gctactaaaa aaaccgggaa atggaattca

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30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador Oligonucleótido

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gcagcttggg attcaaaaac atccacttta aca

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33

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<212> ADN

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<220>

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<223> Cebador Oligonucleótido

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ggagaatata ttatgaaa

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18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador Oligonucleótido

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ctccttattt taaagcg

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17

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(822)

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12

13

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<212> ADN

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<213> Borrelia burgdorferi

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<220>

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<212> PRT

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<213> Borrelia burgdorferi

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<212> ADN

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<220>

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22

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<212> ADN

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<213> Borrelia burgdorferi

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<220>

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<221> CDS

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<211> 273

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<212> PRT

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<213> Borrelia burgdorferi

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<212> ADN

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<220>

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<223> Cebador Oligonucleótido

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gtctgcaaaa accatgacaa g

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21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador Oligonucleótido

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<220>

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<223> Cebador Oligonucleótido

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<223> Cebador Oligonucleótido

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<223> Cebador Oligonucleótido

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<223> Cebador Oligonucleótido

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<220>

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<223> Cebador Oligonucleótido

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31

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<211> 891

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<212> ADN

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<213> Borrelia burgdorferi

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(891)

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<400> 21

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<212> PRT

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<213> Borrelia burgdorferi

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<400> 22

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29

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtacaatta cagtacaa

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgagaatct catatggcac aaaaaggtgc tgagtcaatt gg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgatatcgg atcctatttt aaagcgtttt taagc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatccggtg accttttaaa gcgtttttaa g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgcgcgacc atatgaaaaa gaatacatta agtgcg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcggcggat ccttaaggtt tttttggact ttctgc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 633

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(633)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 630

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(630)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 639

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(639)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 624

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(624)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgcgcgacc atatggctaa taattcaggg aaagat

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgcgcgacc atatggctag taattcaggg aaaggt

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgcgcgacc atatggctaa taattcaggt ggggat

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttggaaaat tatttgaa

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacggtcacc ccatgggaaa taattcaggg aaagg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatagatgac agcaacgc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggtgaccc catggtacca ggtttttttg gactttctgc

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggatccat atggttaaaa aaataatatt tatttc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatatctaga tctttaattg ctctgctcac tctcttc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgggatcca tatggctagt gcaattggtc gtgg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgattatca atcataat

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctgaacaat gacaaaac

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 825

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 824

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1011

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1011)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1008

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1008)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 821

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 821

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 821

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 822

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggatccgg tcaccccatg gctcaatata accaatg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggatccgg tcaccccatg gcttctcaaa atgtaag

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggatccgg tgaccaactc cgccttgaga agg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggatccgg tgacctattt gagcataaga tgc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgaattta gttggtaagg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caccagtttc tttaagctgc tcctgc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(2100)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

57

58

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 700

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

60

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2081

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(2079)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

62

63

64

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 693

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

66

67

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1991

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1989)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

69

70

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 663

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

72

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2081

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(2079)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

74

75

76

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 693

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

78

79

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(2100)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

81

82

83

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 700

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

85

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2126

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(2124)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

87

88

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 708

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

90

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1991

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1989)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

92

93

94

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 663

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

96

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggtcaccc catggctgct ttaaagtctt ta

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggtcaccc catgaatctt gataaagctc ag

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggtcaccc catggatgaa aagcttttaa aaagt

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggtcaccc ccatggttga gaaattagat aag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggatccgg tgacccttaa ctttttttaa ag

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaagtagaag tttttgaatc ccattttcca gttttttt

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 825

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(825)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ácido nucleico quimérico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

98

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

100

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaagtagaag tttttgaatt ccaagctgca gtttt

\hfill

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 822

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(822)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ácido nucleico quimérico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

102

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 273

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36

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<220>

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132

133

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<223> Ácido nucleico quimérico

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135

136

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<212> PRT

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137

138

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<220>

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<211> 380

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<212> PRT

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<220>

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<223> Proteína quimérica

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142

143

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)...(1323)

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<223> Ácido nucleico quimérico

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144

145

146

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<210> 120

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<211> 441

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Proteína quimérica

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

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147

148

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<210> 121

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<211> 1765

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<212> ADN

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<220>

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<223> Ácido nucleico quimérico

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<400> 121

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149

150

151

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<210> 122

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<211> 588

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

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<400> 122

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152

153

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<210> 123

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<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

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154

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<210> 124

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<211> 704

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<212> ADN

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<213> Borrelia burgdorferi

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<400> 124

155

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<211> 704

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<212> ADN

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<213> Borrelia burgdorferi

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156

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<210> 126

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<211> 704

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<212> ADN

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157

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<212> ADN

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<213> Borrelia burgdorferi

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<220>

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<221> CDS

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158

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<211> 1008

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<220>

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171

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<220>

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<223> Proteína quimérica

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<400> 138

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173

174

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(822)

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<223> Ácido nucleico quimérico

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175

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<223> Proteína quimérica

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(822)

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<223> Ácido nucleico quimérico

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178

179

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<220>

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<223> Proteína quimérica

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<223> Proteína quimérica

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<220>

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<220>

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<223> Ácido nucleico quimérico

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194

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<212> PRT

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202

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)...(1362)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ácido nucleico quimérico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

204

205

206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 453

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\vskip1.000000\baselineskip

207

208

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1341

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1341)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ácido nucleico quimérico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip1.000000\baselineskip

209

210

211

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 446

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\vskip1.000000\baselineskip

212

213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1365

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1365)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ácido nucleico quimérico

\newpage

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<400> 159

\vskip1.000000\baselineskip

214

215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 454

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\vskip1.000000\baselineskip

216

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<210> 161

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<211> 1344

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)...(1344)

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<223> Ácido nucleico quimérico

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\vskip1.000000\baselineskip

217

218

219

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 447

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\vskip1.000000\baselineskip

220

221

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1305

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)...(1305)

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<223> Ácido nucleico quimérico

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\vskip1.000000\baselineskip

222

223

224

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 434

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\vskip1.000000\baselineskip

225

226

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1332

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1332)

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<223> Ácido nucleico quimérico

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\vskip1.000000\baselineskip

227

228

229

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 443

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

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230

231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1317

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1317)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ácido nucleico quimérico

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\vskip1.000000\baselineskip

232

233

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 438

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\vskip1.000000\baselineskip

234

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1029

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1029)

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<223> Ácido nucleico quimérico

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\vskip1.000000\baselineskip

235

236

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 342

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

237

238

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1029

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1029)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ácido nucleico quimérico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

239

240

241

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 342

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

242

243

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1029

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1029)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ácido nucleico quimérico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\vskip1.000000\baselineskip

244

245

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 342

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\vskip1.000000\baselineskip

246

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1035

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1035)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ácido nucleico quimérico

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\vskip1.000000\baselineskip

247

248

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\vskip1.000000\baselineskip

249

250

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1323

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1323)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ácido nucleico quimérico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\vskip1.000000\baselineskip

251

252

253

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 440

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\vskip1.000000\baselineskip

254

255

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1302

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1302)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ácido nucleico quimérico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\vskip1.000000\baselineskip

256

257

258

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 433

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína quimérica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\vskip1.000000\baselineskip

259

260

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcatatggc ttgtaataat tcagggaaag a

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttccatgga aggttttttt ggactttctg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttccatggc caagcaaaat gttagcagcc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taaggatcct tattttaaag cgttttt

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

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<211> 819

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<212> ADN

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<213> Borrelia burgdorferi

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(819)

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<400> 185

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261

262

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<210> 186

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<211> 273

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<212> PRT

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<213> Borrelia burgdorferi

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<400> 186

263

Claims

1. Una proteína quimérica sin lipidar que comprende al menos un primer y un segundo polipéptido, en la que el primer polipéptido comprende OspC de Borrelia burgdorferi y en la que el segundo polipéptido comprende OspA de Borrelia burgdorferi, de forma que:

(a) el polipéptido de OspC comprende el extremo N-terminal de la proteína, en el que el polipéptido de OspC se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 19 al residuo de aminoácido 211, el residuo de aminoácido 19 al 204, y el residuo de aminoácido 19 al 213, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspC de la ID SEC Nº: 30; y

(b) el polipéptido de OspA:

(i): se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 18 al 273, y el residuo de aminoácido 132 al 273, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspA de la ID SEC Nº: 7; o

(ii): es un polipéptido quimérico que comprende polipéptidos de OspA de al menos dos cepas diferentes de Borrelia burgdorferi.

2. La proteína quimérica de la reivindicación 1, en la que los polipéptidos de OspA y OspC son de la misma cepa de Borrelia burgdorferi; y/o

los polipéptidos de OspA y OspC son de la misma genoespecie de Borrelia burgdorferi.

3. La proteína quimérica de la reivindicación 1, en la que los polipéptidos de OspA y OspC son de diferentes cepas de Borrelia burgdorferi; y/o

los polipéptidos de OspA y OspC son de diferentes genoespecies de Borrelia burgdorferi; y/o

en la que el polipéptido quimérico de OspA comprende polipéptidos de OspA de diferentes genoespecies de Borrelia burgdorferi.

4. La proteína quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el polipéptido de OspA comprende

(a) un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi del residuo de aminoácido 18 al residuo de aminoácido 216 de una primera cepa de Borrelia burgdorferi, y del residuo de aminoácido 217 al residuo de aminoácido 273 de una segunda cepa de Borrelia burgdorferi; o

(b) un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi del residuo de aminoácido 132 al residuo de aminoácido 217 de una primera cepa de Borrelia burgdorferi, y un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi del residuo de aminoácido 218 al residuo de aminoácido 273 de una segunda cepa de Borrelia burgdorferi, en los que la numeración de los aminoácidos se basa en la secuencia del polipéptido de OspA de la ID SEC Nº: 7.

5. La proteína quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el polipéptido de OspA comprende al menos cuatro fragmentos de polipéptidos de OspA distintos; y además opcionalmente

en la que el primer fragmento de polipéptido de OspA comprende un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi del residuo de aminoácido 30 al residuo de aminoácido 150, en la que el segundo fragmento de polipéptido de OspA comprende un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi del residuo de aminoácido 151 al residuo de aminoácido 179, en la que el tercer fragmento de polipéptido de OspA comprende un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi del residuo de aminoácido 180 al residuo de aminoácido 216, y en la que el cuarto fragmento de polipéptido de OspA comprende un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi del residuo de aminoácido 217 al residuo de aminoácido 273, en los que la numeración de los aminoácidos se basa en la secuencia del polipéptido de OspA de la ID SEC

\hbox{Nº:
7.}

6. Una proteína quimérica que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178 y 180.

7. Un ácido nucleico que codifica una proteína quimérica sin lipidar que comprende:

al menos un primer y un segundo polipéptido, en el que el primer polipéptido comprende OspC de Borrelia burgdorferi y en el que el segundo polipéptido comprende OspA de Borrelia burgdorferi, de forma que OspC comprende el extremo N-terminal de la proteína codificada, en el que:

(a) el polipéptido de OspC se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 19 al residuo de aminoácido 211, el residuo de aminoácido 19 al 204, y el residuo de aminoácido 19 al 213, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspC de la ID SEC Nº: 30; y

(b) el polipéptido de OspA:

(ii): el polipéptido de OspA es un polipéptido quimérico que comprende polipéptidos de OspA de al menos dos cepas diferentes de Borrelia burgdorferi.

8. El ácido nucleico de la reivindicación 7, en el que el polipéptido de OspA comprende el residuo de aminoácido 18 al residuo de aminoácido 216 de una primera cepa de Borrelia burgdorferi y del residuo de aminoácido 217 al residuo de aminoácido 273 de una segunda cepa de Borrelia burgdorferi, o

del residuo de aminoácido 132 al residuo de aminoácido 216 de una primera cepa de Borrelia burgdorferi y el residuo de aminoácido 217 al residuo de aminoácido 273 de una segunda cepa de Borrelia burgdorferi, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en la secuencia del polipéptido de OspA de la ID SEC Nº: 7.

9. El ácido nucleico de la reivindicación 7 ó 8, en el que el polipéptido de OspA comprende al menos cuatro fragmentos de polipéptido de OspA distintos, en el que el primer fragmento de polipéptido de OspA comprende un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi del residuo de aminoácido 30 al residuo de aminoácido 150, en el que el segundo polipéptido de OspA comprende un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi del residuo de aminoácido 151 al residuo de aminoácido 179, en el que el tercer polipéptido de OspA comprende un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi del residuo de aminoácido 181 al residuo de aminoácido 216, y en el que el cuarto polipéptido de OspA comprende un polipéptido de OspA de Borrelia burgdorferi del residuo de aminoácido 216 al residuo de aminoácido 273, en los que la numeración de los aminoácidos se basa en la secuencia del polipéptido de OspA de la ID SEC Nº: 7.

10. Un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que:

los polipéptidos de OspC y OspA codificados son de diferentes cepas de Borrelia burgdorferi y/o los polipéptidos de OspC y OspA codificados son de diferentes genoespecies de Borrelia burgdorferi.

11. Un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que:

los polipéptidos de OspC y OspA codificados son de la misma cepa de Borrelia burgdorferi; y/o

los polipéptidos de OspC y OspA codificados son de la misma genoespecie de Borrelia burgdorferi.

12. Un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177 y 179.

13. Un vector de expresión que comprende:

(a) un ADN aislado que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177 y 179; o

(b) un ADN aislado que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178 y 180.

14. Una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico recombinante que:

(a) tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177 y 179; o

(b) codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178 y 180.

15. Un método para producir una proteína quimérica sin lipidar de Borrelia burgdorferi que comprende:

a) seleccionar un polinucleótido que codifica OspC o una porción antigénica suya;

b) seleccionar un polinucleótido que codifica OspA o una porción antigénica suya; y

c) ligar el polinucleótido de a) al polinucleótido de b), para formar una secuencia polinucleotídica quimérica que codifica una proteína quimérica OspC-OspA de forma que OspC esta en dirección 5' de OspA, en el que:

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el polipéptido de OspC se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 19 al residuo de aminoácido 211, el residuo de aminoácido 19 al 204, y el residuo de aminoácido 19 al 213, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspC de la ID SEC Nº: 30; y

el polipéptido de OspA:

(i): se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 18 al 273, y el residuo de aminoácido 132 al 273, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspA de la ID SEC Nº: 7, o

(ii): el polipéptido de OspA es un polipéptido quimérico que comprende polipéptidos de OspA de al menos dos cepas de Borrelia burgdorferi diferentes.

16. El método de la reivindicación 15, en el que:

(a) la proteína quimérica OspC-OspA tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178 y 180;
y/o

(b) el método para producir una proteína quimérica comprende además mantener una célula hospedadora que comprende el polinucleótido quimérico de la reivindicación 15 en condiciones adecuadas para la expresión del polinucleótido.

17. El uso de al menos un primer y un segundo polipéptido para la fabricación de una proteína quimérica sin lipidar para el uso en la inmunización de un animal contra la enfermedad de Lyme, en el que el primer polipéptido comprende OspC de Borrelia burgdorferi y en el que el segundo polipéptido comprende OspA de Borrelia burgdorferi, de forma que OspC comprende el extremo N-terminal de la proteína, que comprende administrar la proteína quimérica a un animal, en el que:

(a) el polipéptido de OspC se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 19 al residuo de aminoácido 211, el residuo de aminoácido 19 al 204, y el residuo de aminoácido 19 al 213, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspC de la ID SEC Nº: 30, y

(b) el polipéptido de OspA:

18. El uso de la reivindicación 17, en el que:

(a) la proteína quimérica se administra con un vehículo o portador fisiológicamente aceptable;

(b) la proteína quimérica está codificada por un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177 y 179; o

(c) la proteína quimérica comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178 y 180.

19. Un método para detectar una proteína quimérica sin lipidar que comprende al menos un primer y un segundo polipéptido, en el que el primer polipéptido comprende OspC de Borrelia burgdorferi y en el que el segundo polipéptido comprende OspA de Borrelia burgdorferi, de forma que OspC comprende el extremo N-terminal de la proteína, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra del hospedador con la proteína quimérica en condiciones en las que los anticuerpos de la muestra del hospedador, si están presentes, se unen a la proteína quimérica, por lo que se forman complejos antígeno-anticuerpo; y

(b) detectar los complejos antígeno-anticuerpo,

en el que el polipéptido de OspC se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 19 al residuo de aminoácido 211, el residuo de aminoácido 19 al 204, y el residuo de aminoácido 19 al 213, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspC de la ID SEC Nº: 30; y

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el polipéptido de OspA se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 18 al 273, y el residuo de aminoácido 132 al 273, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspA de la ID SEC Nº: 7; o

el polipéptido de OspA es un polipéptido quimérico que comprende polipéptidos de OspA de al menos dos cepas de Borrelia burgdorferi diferentes.

20. El método de la reivindicación 19, en el que:

(a) la proteína quimérica está codificada por un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177 y 179; o

(b) la proteína quimérica comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178 y 180.

21. El uso de un ácido nucleico que codifica una proteína quimérica sin lipidar que comprende un primer y un segundo polipéptido, en el que el primer polipéptido comprende OspC de Borrelia burgdorferi y en el que el segundo polipéptido comprende OspA de Borrelia burgdorferi, de forma que OspC comprende el extremo N-terminal de la proteína, para la fabricación de una composición para el uso en la inmunización de un animal contra la enfermedad de Lyme, en el que: (a) el polipéptido de OspC se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 19 al residuo de aminoácido 211, el residuo de aminoácido 19 al 204, y el residuo de aminoácido 19 al 213, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspC de la ID SEC Nº: 30; y

el polipéptido de OspA:

(ii): el polipéptido de OspA es un polipéptido quimérico que comprende polipéptidos de OspA de al menos dos cepas de Borrelia burgdorferi diferentes, y opcionalmente

en el que el ácido nucleico que codifica la proteína quimérica se selecciona del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177 y 179.

22. Una composición fisiológica para vacunar contra y tratar la infección por Borrelia en animales o humanos, y la composición comprende:

a) (i) una proteína quimérica sin lipidar que comprende al menos un primer y un segundo polipéptido, en la que el primer polipéptido comprende OspC de Borrelia burgdorferi y en la que el segundo polipéptido comprende OspA de Borrelia burgdorferi, de forma que OspC comprende el extremo N-terminal de la proteína, en la que el polipéptido de OspC se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 19 al residuo de aminoácido 211, el residuo de aminoácido 19 al 204, y el residuo de aminoácido 19 al 213, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspC de la ID SEC Nº: 30, y el polipéptido de OspA se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 18 al 273, y el residuo de aminoácido 132 al 273, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspA de la ID SEC Nº: 7; o un polipéptido quimérico que comprende polipéptidos de OspA de al menos dos cepas de Borrelia burgdorferi diferentes, y la cantidad es eficaz para provocar una respuesta inmunitaria hacia Borrelia burgdorferi; o (ii) un ácido nucleico que codifica dicha proteína quimérica;

b) un vehículo o portador fisiológicamente aceptable; y opcionalmente

c) un adyuvante.

23. La composición de la reivindicación 22, en la que:

(a) la proteína quimérica se selecciona del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178 y 180; y/o

(b) el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177 y 179.

24. Un equipo que comprende:

(a) una proteína quimérica sin lipidar que comprende al menos un primer y un segundo polipéptido, en la que el primer polipéptido comprende OspC de Borrelia burgdorferi y en la que el segundo polipéptido comprende OspA de Borrelia burgdorferi, de forma que OspC comprende el extremo N-terminal de la proteína, en la que el polipéptido de OspC se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 19 al residuo de aminoácido 211, el residuo de aminoácido 19 al 204, y el residuo de aminoácido 19 al 213, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspC de la ID SEC Nº: 30, y el polipéptido de OspA: (i) se selecciona del grupo que consiste en: el residuo de aminoácido 18 al 273, y el residuo de aminoácido 132 al 273, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en el polipéptido de OspA de la ID SEC Nº: 7; o (ii) es un polipéptido quimérico que comprende polipéptidos de OspA de al menos dos cepas diferentes de Borrelia burgdorferi, y

(b) reactivos para detectar los complejos anticuerpo-antígeno formados entre la proteína quimérica y los anticuerpos, si están presentes, de una muestra de hospedador suministrada por el usuario.

25. El equipo de la reivindicación 24, en el que la proteína quimérica se selecciona del grupo que consiste en: las ID SEC Nºs: 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178 y 180.