CZ280743B6 - Imunogen proti lymské boreliose savců - Google Patents

Imunogen proti lymské boreliose savců Download PDF

Info

Publication number
CZ280743B6
CZ280743B6 CS922172A CS217292A CZ280743B6 CZ 280743 B6 CZ280743 B6 CZ 280743B6 CS 922172 A CS922172 A CS 922172A CS 217292 A CS217292 A CS 217292A CZ 280743 B6 CZ280743 B6 CZ 280743B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
protein
burgdorferi
vaccine
antibodies
detecting
Prior art date
Application number
CS922172A
Other languages
English (en)
Inventor
Ian Folex
Friedrich Prof. Dr. Dorner
Original Assignee
Immuno Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27419096&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ280743(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immuno Aktiengesellschaft filed Critical Immuno Aktiengesellschaft
Publication of CZ217292A3 publication Critical patent/CZ217292A3/cs
Publication of CZ280743B6 publication Critical patent/CZ280743B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Účinný imunogen proti Lymské boreliose savců obsahuje homogenní B. burgdorferi pC protein a fysiologicky přijatelný excipient.ŕ

Description

Vynález se týká vakcíny k prevenci nebo léčení lymské boreliosy u savců. Podrobněji se tento vynález týká imunogenních prostředků a způsobu jejich použití ke zpomalení nebo prevenci rozvoje lymské nemoci.
Dosavadní stav techniky
Tato přihlášky částečně 07/727 245 přihláška je částečně pat. spisu 07/824 161 pokračovací přihláškou z 11. července 1991.
pokračovací přihláškou USA z 22. ledna 1992, která je USA přihlášky pat. spisu
Pojem lymská nemoc nebo lymská boreliosa genericky označuje klíšťové infekce, které jsou způsobovány spirochetou Borrelia burgdorferi. Toto onemocnění představuje nejobvyklejší onemocnění, přenášené klíštětem, jak ve Spojených státech, tak i v Evropě. Lymské onemocnění je podobné syfilidě, protože ovlivňuje mnoho orgánů, nejobvykleji kůži, nervovou soustavu, srdce a klouby, jelikož se vyvíjí postupně a může se stát chronickým onemocněním.
Jelikož lymská nemoc může napodobovat jiné choroby, existuje potřeba přesných diagnostických prostředků, zvláště v těžkých případech, kdy klinický obraz není přesvědčivý. Vyvstává také potřeba způsobu léčení nebo předcházení této chorobě. Léčení antibiotiky může být efektivní, jestliže se s ním začne brzy po infekci. Je-li však onemocnění v pokročilém stádiu, je zapotřebí delšího léčení vysokými dávkami. Kromě toho není léčení antibiotiky vždy úspěšné, viz Preac Mursic a spol.: Infection 18, 332-341 (1990). Je tedy žádoucí předcházet tomuto onemocnění očkováním.
Jsou známé některé antigeny Borrelia burgdorferi. O dvou hlavních proteinech vnějšího povrchu membrány Borrelia burgdorferi, aspA (molekulová hmotnost 31 000) a ospB (molekulová hmotnost 34 000) pojednává Barbour: Clin. Mikrobiol. Revs. 1, 399 414 (1988). Vnější povrchový protein ospA (outer-surface protein, zkráceně osp) je přítomný ve většině kmenů, je však heterogenní. To znamená, že ospA proteiny z různých kmenů se mohou lišit v molekulové hmotnosti a v serologické aktivitě.
OspB je méně rozšířený mezi kmeny než ospA, podobně jako ospA existuje ve formách, které se mohou lišit v molekulové hmotě a v sérologické reaktivitě. Geny pro ospA a ospB, které jsou kódovány plasmidy, byly klonovány, sekvenovány a připraveny expresí v E. coli. Viz: Barbour a spol.: Rev. Inf. Dis 11(6) , S1470 až S1474 (1989), Bergstróm a spol.: Mol. Microbiol. 2 479 až 486 (1989).
-1CZ 280743 B6 pC protein (o molekulové hmotnosti 24 000) z Borrelia burgdorferi je v některých směrech podobný ospA a ospB. Je to také lipoprotein, také vykazuje heterogeničnost jak v molekulové hmotnosti, tak serologickou a vyskytuje se na buněčném povrchu (je dostupný na buněčném povrchu pro navázání aglutinační protilátky a pC asociovaný s buňkou je citlivý na štěpení preteasami). Kmeny, které expresí poskytují pC protein, jsou v Evropě obvyklé. Z 28 evropských izolovaných vzorků, testovaných podle Wilskeho a spol.: N. Y. Acad. Sci. 539, 126 až 143 (1988) bylo mezi 40 a 50 % vzorků pozitivních na pC protein, i když toto číslo může být podhodnoceno, neboť exprese pC může být proměnlivá.
Mezi další B. burgdorferi antigeny patří protein vnějšího povrchu v oblasti molekulové hmotnosti 60 000 (Barbour a spol.: viz výše), protein s flagelární (bičíkovitou) strukturou v oblasti molekulové hmotnosti 41 000 (Gassman a spol.: Nucleic Acids Res. 17, 3590 (1989)), protein s molekulovou hmotností v oblasti 39 000 (Simpson a spol.: J. Clin. Micro. 28, 1329 až 1337 (1990).) a protein s molekulovou hmotností přibližně 94 000 (Fuchs a spol.: Fourth International Conference on Lyme Borreliosis (1990).).
Pro přípravu antigenů pro další studium a pro jejich charakterizaci byly v této souvislosti použity různé způsoby čištění. Například Wilske a spol. (Zbl. Bakt. Hyg. 263, 92 až 102 (1986).) podrobili celé Borreliae SDS-PAGE, přičemž proteiny byly denaturovány teplem a vystaveny působení smáčecího činidla dodecylsulfátu sodného (SDS) a 2-merkaptoethanolu. Hansen a spol. (J. Clin. Microbiol. 26(2), 338 až 346 (1988).) popsali čištění B. burgdorferi flagellum. Ve WO(PCT) patentové přihlášce č. 90/04411 (Bergstróm a spol.) je popsán nedenaturační způsob částečného čištění frakcí Borrelia burgdorferi.
Pozornost byla soustředěna také na studie přípravy a charakterizace různých antigenů za účelem vyvinutí diagnostických testů. Tak diagnostický postup detegování B. burgdorferi nepřímo, analyzováním produkce specifické protilátky jako odpovědi na infekci, je popsán ve shora uvedené přihlášce Bergstróma a spol. a v USA patentové přihlášce č. 07/487 716 (Simpson a Schwan) (publikované 18. července 1990).
Dis. 155, 756 až 765 (1987).) burgdorferi zpracováním celých činidlem (detergentem). zbavené proteinového
Coleman a spol. (J. Infect.
také popisují přípravu frakcí B. spirochet s denaturujícím SDS smáčecím Získá se tak protoplazmová frakce (bakterie, potahu), která se po dalším zpracování může použít jako antigen.
Wilske a spol. (Fourth International Conference on Lyme Borreliosis (1990).) popisují identifikaci imunodominantních Borrelia proteinů, o nichž se uvádí, že jsou užitečné při diagnostikování Lymské boreliosy. Tito výzkumní pracovníci došli k závěru, že dva proteiny, pC a plOO, mohou být zvláště důležité v tom, že poskytují indikaci časných a pozdních stavů onemocnění.
I když jsou známy různé antigeny, nelze předpovědět ochrannou účinnost ze schopností antigenů vyvolávat imunitní odpověď během přirozené nebo pokusné infekce. Například bičíkovitý (flagelární) protein o molekulové hmotnosti 41 000 indukuje
-2CZ 280743 B6 imunitní odpověď, ale není ochranný. Viz Simon a spol.: Immunology Today 12, 11 až 16 (1991). Podobně i protein o molekulové hmotnosti 94 000 selhává při ochraně, jak je to popsáno dále v příkladu 3. Ve skutečnosti autoři této přihlášky pozorovali, že antigeny, které jsou ochranné, jsou relativně vzácné. Velká část imunitní odpovědi se tedy týká antigenů, které nejsou vhodné pro ochranu. A naopak, některé potenciálně vhodné antigeny mohou selhat při vyvolání adekvátní odpovědi. Použitelnost vakcínové složky se nemůže tedy odvozovat od schopnosti antigenu vyvolávat proti látkovou odpověď.
Existuje tedy potřeba pokračování výzkumu vývoje vhodné vakcíny proti Lymské chorobě, Lymské boreliose. Z tohoto pohledu je důležitý fakt, že v USA patentu č. 4 721 617 (Johnson) je popsána vakcina proti Lymské boreliose, sestávající z celých buněk B. burgdorferi, které byly dezaktivovány lyofilizaci. Na základě izolace pathogenu z ledviny nebo sleziny Johnson prokázal na dávce závisející snížení vnímavosti imunizovaných křečků na infekci virulentním kmenem B. burqdorferi. Avšak účinek byl krátkodobý. Zvířata devadesát dnů po očkování nebyla úplně chráněna.
Evropská patentová přihláška pat. spisu 418 827 (Simon a spol.) popisuje vakcínu proti B. burqdorferi, zvláště kmenům B31 a ZS7, která sestává z monoklonálních protilátek, které rozeznávají ospA protein o molekulové hmotě 31 000. Podle shora uvedené evropské patentové přihlášky Simona a spol. pasivní imunizace SCID-myší těmito protilátkami inhibuje vývoj příznaků indukovaných Borrelia (Ochrana je definována v pojmech: rezistence na infekci a vývoje artritidy.) Tato evropská přihláška popisuje také expresi v E. coli rekombinantního proteinu s napojením β-galaktosidasa/ospA. Popsané monoklonální protilátky vznikají imunizací celou bakteriální buňkou nebo rekombinantními antigenními proteiny.
Fikrig a spol. (Science 250, 553 až 556 (1990)) dokumentují pasivní ochranu myší (C3H/HeJ) polyklonálním sérem na zabité B. burqdorferi nebo na E. coli expresí poskytující ospA nebo ospA-specifickou monoklonální protilátkou. Předpokládá se, že myši byly aktivně chráněné po imunizaci vyčištěným rekombinantním proteinem s napojení ospA/glutathion S-transferasá. Ochrana je měřena v termínech schopnosti imunogenu chránit před infekcí nebo odstraňovat histopatologické projevy onemocnění.
Bergstróm a spol. (PCT pat. spis WO 90/04411) navrhují také možnost, že by se imunologicky aktivní frakce B. burgdorferi mohly používat ve vakcínách. Neuvádějí však žádné údaje, které by prokazovaly imunogeničnost nebo ochrannou účinnost popsaných frakcí.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je vakcina s obsahem proteinu pC k prevenci lymské boreliosy. Podstata vakcíny je v tom, že obsahuje (a) materiál vybraný ze skupiny, zahrnující alespoň jednou sérologickou formou proteinu pC B. burgdorferi v homogenní formě, variantu pC, vyvolávající produkci ochranných protilátek a imitaci pC, vyvolávající produkci ochranných protilátek, (b) fyziologicky přijatelný excipient a (c) adjuvans, přičemž uvedený mate
-3CZ 280743 B6 riál je obsažen v účinném množství 1 až 100 μ9 v jedné dávce k ochraně citlivých savců.
Vakcína podle vynálezu může s výhodou dále obsahovat alespoň jeden ne-pC antigen B. Burgdorferi.
Jako adjuvans obsahuje vakcína podle vynálezu s výhodou hydroxid hlinitý.
Vakcína podle vynálezu se používá zejména v ochranně účinném množství 10 až 50 μg v jedné dávce.
Předmětná vakcína se aplikuje především na lidech jakožto savcích.
Dalším předmětem vynálezu je způsob čištění proteinu B. burgdorferi. Jeho podstata spočívá v tom, že se (a) buňky B. burgdorferi rozbijí a potom frakcionují na membránovou složku a cytoplazmovou složku, (b) membránová složka se resuspenduje v nedenaturujícím detergentu na získání rozpuštěného proteinu a nerozpuštěného materiálu, načež se rozpuštěný protein oddělí od nerozpuštěného materiálu, (c) rozpuštěný protein se chromatografuje na ionexu, (d) proteinové frakce se spojí a (e) spojené proteinové frakce se podrobí antigenové zkoušce.
Při výhodném provedení způsobu podle vynálezu se po stupni (a) spojené frakce dále chromatografují na hydroxyapatitu za zkoncentrování a dalšího vyčištění proteinových frakcí.
Jako protein se s výhodou čistí protein pC.
Jiným předmětem vynálezu je diagnostické činidlo k detekci protilátek B. burgdorferi ve vzorcích zejména lidské tělní kapaliny, jehož podstata je v tom, že obsahuje protein B. burgdorferi, získávaný způsobem podle tohoto vynálezu.
Posledním předmětem vynálezu je způsob zjišťování přítomnosti protilátek B. burgdorferi ve vzorcích tělní kapaliny. Jeho podstata spočívá v tom, že se vzorek tělní kapaliny inkubuje s diagnostickým činidlem podle vynálezu a stanoví se přítomnost vazby protilátky jakožto výsledek inkubace.
Obrázek 1 je fotografie, ukazující výsledky elektroforetické analýzy antigenů, které byly vyčištěny od Orth-1 zde popsanými způsoby.
Obrázek 2 je fotografie, ukazující SDS-PAGE buněk B. burgdorferi, inkubovaných trypsinem (pásy 2, 6, a 10), proteinasou
K (pásy 3,7a 11) nebo bez proteas (pásy 1, 5 a 9) ve srovnání s vyčištěným pC proteinem (pásy 4 a 8). Elektroforeticky oddělené proteiny byly charakterizovány vybarvováním zlatém aurobarvivem (pásy 1 až 4), westernovým blotováním pC-specifickou monoklonálni protilátkou (Mab35, pásy 5 až 8) a fluorografií lipoproteinů (palmitová kyselina značená 3H, pásy 9 až 11).
V následující části tohoto spisu budou podrobně popsána výhodná uspořádání tohoto vynálezu.
-4CZ 280743 B6
I když bylo identifikováno a do různých stupňů charakterizováno několik různých antigenů B. burgdorferi, protein pC až dosud nebyl rozpoznán jako ochranné činidlo proti Lymské chorobě. Klíčovým aspektem tohoto objevu bylo poznání, že pro optimální ochrannou potenci by bylo nutné zachovat co možná nejvíce původní konformaci pC proteinu. Byl tedy vyvinut nový způsob přípravy homogenního pC proteinu, který ponechává přírodní konfiguraci proteinu v podstatě neovlivněnou. To umožňuje použít pC jako imunogen proti Lymské boreliose. Tato nedenaturující čisticí metoda je aplikovatelná pro produkci Borrelia antigenů pro použití při detekci Lymské nemoci.
Ochranný účinek nedenaturovaného pC proteinu demonstruje u gerbily (mongolská pouštní myš, až do dnešní doby nebyla považována za dobrý zjišťování účinnosti daného antigenů, jako je získávání ochranných protilátek proti Lymské zjištěno, že gerbila je dobře vhodná pro zčásti proto, že boreliosa gerbil imituje některé důležité aspekty se snadno Gerbilles), která zvířecí model pro například pC, při nemoci. Bylo však toto vyhodnocování, tohoto onemocnění u člověka. Tak u gerbil stejné jako u lidí:
1) infekce je multisystémová, ovlivňuje rozmanité orgány, jako je například kůže, klouby, nervový systém, slezina, srdce, žlučník a ledviny,
2) onemocnění může být chronické. B. burgdorferi byly izolovány z gerbil po více než jednom roce po výzvě,
3) u gerbil, stejně jako u lidí, se může vyvinout otékání kloubů, připomínající artritidu a
4) existuje podobná humorální imunitní odpověd, pokud jde o specifičnost a dočasný vývoj odpovědi. Například bylo objeveno, že infektované gerbily i infektovaní lidé odpovídají imunologicky málo, jestliže vůbec odpovídají, na ospA a ospB proteiny. Ve skutečnosti jsou ospA a ospB protilátky u gerbil i u lidí (na rozdíl od myši) vzácné.
Jedno uspořádání podle tohoto vynálezu se týká vakcíny proti Lymské boreliose, kdy imunogen obsahuje pC protein B. burqdorferi. pC protein je antigen povrchu buňky, jak bylo demonstrováno jeho proteolytickým štěpením z neporušených buněk B. burgdorferi. Dále je charakterizován tím, že má molekulovou hmotnosti asi 24 000, i když pC z různých kmenů může mít jak různé molekulové hmotnosti tak i sérologickou heterogeničnost. Pomocí konvenční metodologie hybridomů se produkuje jedenáct monoklonálnich protilátek (B. burgdorferi monoklonální protilátky 22, 28, 29, 34 až včetně, 42 až 45), které se váží s pC z B. burgdorferi kmene Orth-1 a několika dalších kmenů).
Úplná DNA sekvence a odvozené sekvence aminokyselin pC proteinu B. burgdorferi, použitého pro studie ochrany je následuj ící:
Met Lys Lys Asn Thr Leu Ser Ala Ile Leu Met Thr Leu Phe
ATG AAA AAG AAT ACA TTA AGT GCG ATA TTA ATG ACT TTA TTT
Leu Phe Ile Ser Cys Asn Asn Ser Gly Lys Gly Gly Asp Ser
TTA TTT ATA TCT TGT AAT AAT TCA GGG AAA GGT GGA GAT TCT
-5CZ 280743 B6
Ala Ser Thr Asn Pro Ala Asp Glu Ser Ala Lys Gly Pro Asn
GCA TCT ACT AAT CCT GCT GAC GAG TCT GCG AAA GGA CCT AAT
Leu Thr Glu Ile Ser Lys Lys Ile Thr Asp Ser Asn Ala Phe
CTT ACA GAA ATA AGC AAA AAA ATT ACA GAT TCT AAT GCA TTT
Val Leu Ala Val Lys Glu Val Glu Thr Leu Val Ser Ser Ile
GTA CTG GCT GTT AAA GAA GTT GAG ACT TTG GTT TCA TCT ATA
Asp Glu Leu Ala Thr Lys Ala Ile Gly Lys Lys Ile Gin Gin Asn
GAT GAA CTT GCT ACT AAA GCT ATT GGT AAA AAA ATA CAA CAA AAT
Asn Gly Leu Gly Ala Asn Ala Asp Lys Asn Gly Ser Leu Leu Ala
AAT GGT TTA GGC GCC AAT GCG GAT AAA AAC GGA TCA TTG TTA GCA
Gly Ala Tyr Ala Ile Ser Thr Leu Ile Thr Glu Lys leu Lys Ala
GGA GCT TAT GCA ATA TCA ACC CTA ATA ACA GAA AAA TTA AAG GCA
Leu Lys Asn Ser Gly Glu Leu Lys Ala Lys Ile Glu Asp Ala Lys
TTG AAA AAT TCA CGA GAA TTA AAG GCA AAA ATT GAA GAT GCT AAG
Lys Cys Ser Glu Asp Phe Thr Lys Lys Leu Ala Ala Gly His Ala
AAA TGT TCT GAA GAT TTT ACT AAA AAA CTA GCT GCT GGG CAT GCA
Gin Leu Gly Ile Asp Gly Ala Thr Asp Asn Asp Ser Lys Glu Ala
CAG CTT GGT ATA GAC GFA GCT ACT GAT AAT GAT TCA AAA GAA GCA
Ile Leu Lys Thr Asn Gly Thr Lys Thy Lys Gly Ala Glu Glu Leu
ATT TTG AAA ACA AAT GGG ACT AAA ACT AAG GGT CGT GAA GAA CTT
Val Lys Leu Ser Glu Ser Val Ala Ser Leu Ser lys Ala Ala Gin
GTA AAG TTA TCT GAA TCA GTA GCA AGC TTG TCA AAA GCG GCT CAA
Glu Ala Ser Ala Asn Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val
GAA GCA TCA GCT AAT TCA GTT AAA GAG CTT ACA AGT CCT GTT GTA
Ala Glu Thr Pro Lys Lys Pro +++
GCA GAA ACT CAA AAA AAA CCT TAA
pC protein podle tohoto vynálezu může obsahovat směs různých sérologických forem přirozeně se vyskytujícího pC proteinu. Vedle pC proteinu, získaného z buněk B. burqdorferi, jak je zde dále popsáno, se mohou používat rekombinantní pC, varianty přirozeně se vyskytující molekuly (pC varianty) a imitace - sloučeniny s mimotopy, které imitují pC epitopy.
Mezi kategorii pC variant patří například oligopeptidy a polypeptidy, odpovídající imunogenním částem pC molekuly, a jakékoliv neproteinové imunogenní části pC molekuly. Jako varianty jsou tedy považovány takové polypeptidy, které jsou homologní a které si zachovávají imunologické rysy přírodní pC molekuly. V tomto smyslu homologie mezi dvěma sekvencemi označuje podobnost identity, označující odvození první sekvence od druhé. Například polypeptid je homologní s pC, jestliže obsahuje sekvenci aminokyselin, která odpovídá epitopu, rozeznávanému protilátkami, specifickými pro pC nebo T-buňkami. Taková sekvence může mít délku několika málo aminokyselin a může být lineární determinantou nebo determinantou, která vznikne, jestliže aminokyseliny z oddělených
-6CZ 280743 B6 částí lineární sekvence jsou prostorově umístěny za sebou po proteinovém skladu nebo po modifikaci kovalentní vazby. Sekvence aminokyselin, které jsou antigenními determinantami podle tohoto vynálezu, mohou být zjištěny například analytickou technikou monoklonálního mapování, která je známa odborníkům. Viz Regenmortel: Immunology Today 10, 266 až 272 (1989) a Berzofsky a spol.: Immunological Reviews 98., 9 až 52 (1987). Analýza podobnosti tohoto typu se může provádět studií kompetitivní inhibice v případě protilátek nebo proliferací T-buněk.
Polypeptidy, které se kvalifikují podle těchto kritérií jako pC varianty, se mohou připravovat podle tohoto vynálezu konvenčními reverzními genetickými technikami, tj. navržením genetické sekvence, založené na sekvenci aminokyselin, nebo konvenčními genetickými střihovými technikami. Například pC varianty se mohou připravovat technikami, mezi něž patří místně řízené mutagenese nebo oligonukleotidem řízené mutagenese. Viz například Mutagenesis of Cloned DNA v Current Protocols in Molecular Biology 8.0.3 a následující (Ausubel a spol., red., 1989) (Ausubel).
Jiné pC varianty podle tohoto vynálezu jsou molekuly, které odpovídají části pC nebo které obsahují část pC, ale nejsou koincidenční s přírodní molekulou a které vykazují imunogenní aktivitu pC, jestliže jsou přítomny samotné nebo jestliže jsou navázány na nosič. pC varianta tohoto druhu by mohla představovat skutečný fragment přírodní molekuly nebo by mohla být polypeptidem, který byl syntetizován de novo nebo rekombinantně.
Aby byla polynukleotidová molekula, kódující takovou molekulu, použitelná při rekombinantni expresi pC nebo pC varianty, měla by s výhodou obsahovat nukleotidovou sekvenci, odpovídající žádané sekvenci aminokyselin, která je optimální pro vybraného hostitele v takových pojmech, jako jsou použitý kodon, počátek translace a exprese komerčně užitečných množství pC nebo žádané varianty pC. Také vektor, který je vybrán pro transformaci vybraného hostitelského organismu takovou polynukleotidovou molekulou, by měl umožnit efektivní uchování a transkripci sekvence, kódující polypeptid. Kódující polynukleotidová molekula může kódovat chimerní protein. To znamená, že může mít nukleotidovou sekvenci, kódující imunologickou část pC molekuly, odštěpitelně napojenou na kódující sekvenci ne-pC části, jako je například signální peptid hostitelské buňky.
Aby se izoloval DNA segment, který kóduje pC molekulu, může se celková B. burqdorferi DNA připravit podle publikovaných způsobů. Viz například Maniatis a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, N. Y. 1982, Baess: Acta Pathol. Microbiol. Scand. (Séct. B) 82., 780 až 784 (1974). Takto získaná DNA se může částečně rozštěpit restrikčním enzymem. Získá se tak více nebo méně náhodné seřazení genomových fragmentů. Pro tento účel je vhodný enzym s tetranukleotidovým rozeznávacím místem, jako je například Sau3A (Mbol). Fragmenty z takového částečného štěpení se pak mohou rozdělit na frakce podle velikostí, například odstřeďováním v sacharózovém gradientu (viz Maniatis a spol. výše) nebo elektroforézou na gelu v pulzním poli (viz Anad: Trends in Genetics 278 až 283, listopad 1986). Získají se tak fragmenty o délce srovnatelné s délkou DNA, kódující molekulu pC.
-7CZ 280743 B6
Podle dobře známých popsaných způsobů, například Ausubel 5.0.1, respektive následující, se vybrané fragmenty mohou klonovat do vhodného klonovacího vektoru. Takto se získaná DNA může vložit například v místě BamHI klonovacího vektoru pUC18. Chimerní plasmidy nebo fág, mimo jiné, připravené napojením fragmentů vybraných podle velikosti na klonovací vektor, se pak mohou transformovat do E. coli nebo jiných hostitelských buněk, které se pak testují na expresi kódovaného proteinu. Pro identifikování klonu, obsahujícího pC gen při testování bank se mohou používat různé způsoby. Mezi tyto způsoby patří testování hybridizační sondou, specifickou pro pC, jako je například oligonukleotidová sonda, nebo testování na expresi pC antigenu imunologickým činidlem, specifickým pro pC. Druhý způsob může být prováděn imunoblotováním banky anti-pC monoklonálních protilátek nebo specifickou monoklonální protilátkou, přípravnou ze zvířat, imunizovaných vyčištěním pC. Jakmile je v bance klon, obsahující DNA, která kóduje pC, jednou identifikován, může být izolována DNA, může být plně charakterizována oblast kódující pC protein (sekvenováním) a následně se DNA muže použít pro produkci pC expresních vektorů, vhodných pro produkci pC-aktivního proteinu.
Jak bylo již shora poznamenáno, pro získání efektivního imunogenu by měla být struktura rekombinantně expresí získaného pC proteinu dostatečně podobná struktuře přírodního (nedenaturovaného) pC; tento protein pak indukuje produkci ochranných protilátek. Je výhodné, aby expresí byla produkována DNA, kódující pC takovým způsobem, že se obejde intracelulární proteolýza a agregace expresovaného produktu v denaturované formě. Jedním způsobem, jak obejít tyto problémy, je rekombinantně připravit pC v hostitelském vektorovém systému tak, že dochází k sekreci pC z hostitelské buňky, s výhodou přímo do kultivačního média. Jeden takový systém poskytuje Bacillus subtilis. Vhodný sekreční vektor lze pro Bacillus subtilis zkonstruovat navázáním B. amyloliquefaciens α-amylasové signální sekvence (viz Young a spol.: Nucleic Acid Res. 11, 237 až 249 (1983).) na Bacillus plasmidový vektor pUBUO, jak popsali Ulmanen a spol.: J. Bacteriol 162, 176 až 182 (1985). Podle tohoto přístupu se kódující sekvence pro cizí protein klonuje po směru vlákna promotoru ribosomového vazebného místa a signální sekvence pro α-amylázu. Transkripce a translace pC je pod kontrolou α-amylázového promotorou a translačního aparátu v této konstrukci. Sekrece pC z hostitelské buňky se dosáhne α-amylázovou signální sekvencí. Pro použití v kvasinkách byly použity podobné vektory. Použitím těchto vektorů lze dojít k sekreci expresí získaného pC v kvasinkách.
Ještě jiným přístupem k expresi pC v systému hostitel-vektor, který se vyhýbá proteolýze, agregaci a denaturaci, je použití viru vakcínie jako vektoru, schopného exprese v rozmanitých savčích hostitelských buňkách, citlivých na infekci virem vakcínie. Podle tohoto postupu lze připravit vektor, odvozený od rekombinantního viru vakcínie, v němž je pC gen umístěn pod kontrolu promotoru, spolu s translačními a sekrečními signály, vhodně pro expresi pC proteinu ve vakcínií infektovaném hostiteli. Jako je to popsáno v US pat. spisu 4 603 112, tento plasmid by také obsahoval 5' k transkripčnímu kontrolním oblastem a 3' k 3' terminačním a polyadenylačním signálům, obklopující sekvence, které přispívají k homologní rekombinaci do přírodního genomu vakcínie. Když je konstrukce tohoto druhu zavedena do hos-8CZ 280743 B6 titelské buňky, infektované vakcínií, obklopující sekvence řídí rekombinaci mezi plasmidovým vektorem a virem vakcínie. Výsledkem je, že klonová strukturní sekvence (zde, kódující pC) se stává částí, která je množena a která je produkována expresí virem vakcínie. S výhodou oblast mezi obklopujícími sekvencemi obsahuje také selektovatelný markér, takový, aby v přítomnosti selekčního média přežily pouze ty buňky, které obsahují rekombinovaný virus vakcínie (a, v naší souvislosti, sekvenci kódující pC-aktivní polypeptid).
Rekombinantní vakcínia kmen, který je produkován tímto způsobem, se může použít pro infektování savčích buněk, jako jsou například buňky Věro nebo buňky CV1, vhodné pro fermentační růst ve vysoké hustotě. pC-aktivní protein, který se získává expresí v těchto buňkách během fermentace, by se sekretoval do fermentačního média, z něhož by se vyčistil konvenčními způsoby.
Vedle přírodního pC a pC variant jsou v tomto vynálezu zahrnuty sloučeniny (imitace, mimikry), které imitují pC epitopy (mimotopy). Jedním příkladem imitace je anti-idiotypová protilátka, tj. protilátka, která je produkována imunizací živočicha protilátkou, která se specificky váže na epitop na antigenu. Anti-idiotypová protilátka rozeznává a odpovídá kombinačnímu místu na první protilátce. Tvar tohoto kombinačního místa úzce připomíná epitop, který se hodí do kombinačního místa první protilátky. Jelikož antiidiotypová protilátka má kombinační místo, jehož tvar imituje originální antigen, může být použita jako vakcína pro generaci protilátek, které reagují s původním antigenem. Viz Fineberg a Ertl: CRC Critical Reviews in Immunology 7, 269 až 284 (1987). Příslušné imitace by mohly být identifikovány testováním pC protilátkou. Tím se deteguje, která sloučenina se na ně váže nebo která by mohla být produkována molekulárním modelováním. Viz Morgan a spol.: Approaches to the Discovery of Non-Peptide Ligands for Peptide Receptors and Peptidases, v Annual Report in Medicinal Chemistry (Academie Press 1989), na stranách 243 a následujících.
Vakcína podle tohoto vynálezu je určena pro imunizaci vnímavého savce, včetně člověka, na Lymskou nemoc. Pojem imunogen znamená antigen, který vyvolává specifickou imunitní odpověď, vedoucí k humorální nebo buňkami zprostředkované imunitě, v této souvislosti proti infekci, způsobené Borrelia. Pojem imunita tedy označuje schopnost jednotlivce být rezistentní k infekci nebo překonávat infekci snadněji ve srovnání s neimunizovanými jednotlivci, nebo snášet infekci bez toho, aby došlo ke klinickému ovlivnění jednotlivce.
Imunogen podle tohoto vynálezu může dále obsahovat přijatelný fyziologický nosič. Takové nosiče jsou dobře známé odborníkům. Patří mezi ně makromolekulám! nosiče. Mezi příklady vhodných nosičů u savců patří tuberkulin PPD, hovězí sérumalbumin, ovalbumin nebo KLH (Keyhole limpet hemocyanin). Nosič by měl být s výhodou netoxický a nealergenický.
Imunogen může dále obsahovat adjuvant, jako je například hlinitá sloučenina, voda a emulze rostlinného nebo minerálního oleje (například Freundův adjuvant), liposomy, ISCOM (imunostimulační komplex), ve vodě rozpustná skla, polyanionty (např.
-9CZ 280743 B6 polyA:U, dextransulfát, lentinan), netoxické lipopolysacharidové analogy, muramyldipeptid a imunostimulační sloučeniny (například interleukiny 1 a 2) nebo jejich kombinace. Výhodným adjuvantem je hydroxid hlinitý. Imunogeničnost může být také zvýšena u savců, kteří dostali živé zeslabené bakteriální vektory, jako je například Salmonella nebo Mycobacteria, nebo virové vektory, jako Vaccinia, který expresí poskytuje pC-aktivní polypeptid.
Způsoby formulace takových imunogenů jsou dobře známé odborníkům. Například imunogen podle tohoto vynálezu může být lyofilizován pro následnou rehydrataci v excipientu, jako je například solný roztok nebo jiný fyziologický roztok. Vakcína podle tohoto vynálezu se připravuje tak, že se smíchá imunologicky aktivní množství pC s excipientem v množství, které vede k žádané koncentraci imunogenicky efektivní složky vakcíny. Množství imunogenicky efektivní složky ve vakcíně závisí na savci, který má být imunizován s tím, že se bere v úvahu věk a hmotnost subjektu a také imunogeničnost imunogenní složky, přítomné ve vakcíně. Ve většině případů množství imunogenní složky vakcíny bude v rozmezí 1 až 100 μg na dávku, s výhodou bude v rozmezí od 10 do 50 μg na dávku.
V ještě jiném uspořádání podle tohoto vynálezu imunogen sestává z pC, pC varianty nebo pC imitace a jednoho nebo více B. burqdorferi antigenů.
Způsoby přípravy vakcín podle tohoto vynálezu jsou navrženy tak, aby zajistily, že identita a imunologická účinnost specifických molekul je zachována a že se nezavádí žádné další nechtěné mikrobiální znečišténiny. Konečné produkty se distribuují a uchovávají za aseptických podmínek.
Způsob imunizace savce proti Lymské chorobě zahrnuje podávání efektivního množství předcházejícího imunogenu savci. Podávání může probíhat jakýmkoliv postupem, dobře známým odborníkům. Například vhodnou strategií podávání je podávání shora popsané vakcíny savcům, o nichž je známo, že jsou vystaveni klíšťatům, nesoucím B. burqdorferi, přibližně šest měsíců až jeden rok před známou dobou nebo před předpokládaným vystavením jejich působení. V souladu s tímto vynálezem je možné použít jakoukoliv imunizační cestu, o které lze předpokládat nebo u níž bylo ukázáno, že produkuje příslušnou imunitní odpověď, i když výhodným je parenterální podávání. Mezi vhodné formy podávání patří subkutánní, intrakutánní nebo intramuskulární injekce, nebo prostředky, vhodné pro orální, nosní nebo rektální podávání.
V jiném uspořádáni podle tohoto vynálezu byl pro čištění různých B. burqdorferi antigenů z rozmanitých B. burqdorferi kmenů vyvinut ne-denaturační způsob. Mezi antigeny patří, ale nejsou na ně omezeny, ospA, ospB, pC, protein s flagelární strukturou a proteiny, které mají přibližně molekulové hmotnosti 21 000, 56 000, 60 000 a 63 000. Tyto postupy znamenají zlepšení proti způsobům, známým z odborné literatury, které jsou buď denaturační, jsou specifické jenom pro příslušný typ antigenu, nebo při nichž se dosahuje pouze částečného vyčištění. Výhodný způsob čištění zahrnuje následující stupně:
-10CZ 280743 B6
a) rozbití buněk B. burqdorferi a frakcionaci odstřeďováním na membránové a cytoplazrnové složky,
b) extrakci membránové frakce nedenaturačním smáčecím činidlem s následujícím odstřeďováním; získá se tak supernatant, obsahující solubilizovaný protein, nerozpustný materiál se odstraní jako peleta a
c) frakcionaci solubilizovaných antigenú chromatografli na ionexu (diethylaminoethyl nebo DEAE), přičemž absorbované antigeny se eluují gradientem chloridu sodného.
Čištění může zahrnovat zahuštění a další čištění antigenú:
a) chromatografli na hydroxyapatitu, adsorbované antigeny se eluují zvyšováním obsahu fosforečnanu v pufru a/nebo
b) afinitní chromatografli na imobilizovaném kovu, adsorbované antigeny se eluují imidazolem.
Mezi jiné eluční způsoby známé odborníkům patří eluce snížením pH nebo zvýšením koncentrací chloridu amonného, histidinu nebo jiné látky s afinitou ke komplexovanému kovu.
Rozbití buněk lze provést lyžováním buněk, jejich třepáním v suspenzi s maličkými skleněnými perličkami v buněčném mlýnu, působením ultrazvuku nebo ve francouzském lisu. Antigeny se mohou také extrahovat přímo z buněčné stěny organismu tak, že se tato buňka vystaví působení smáčecího činidla, změnou iontové síly buněčného okolí nebo mírnou změnou teploty. Lze použít také výchozí materiál, který obsahuje také membránové puchýřky, které jsou vypouštěny z buněk.
Extrakce membránové frakce se může provádět smáčecím činidlem, které má s výhodou dobrou rozpouštěcí schopnost, je nedenaturační a je slučitelné s chromatografli na ionexu. Výhodným smáčecím činidlem je zwiteriontové (obojetně iontové) činidlo 3-14 (Calbiochem), i když se může používat jakékoliv smáčecí činidlo nebo organické rozpouštědlo, které má shora uvedené vlastnosti. Smáčecí činidlo se typicky používá v koncentraci 1 % (hmotnostní díly k objemovým dílům). Účinné je měnění této koncentrace v rozmezí od 0,01 do 10 % (hmotnostní díly k objemovým dílům). Extrakce smáčecím činidlem se provádí za teploty v rozmezí od 0 do 60 °C, s výhodou při teplotě 37 °C. Extrakce by měla trvat deset minut až osm hodin, s výhodou jednu hodinu. Pro zlepšení procesu rozpouštění by se mohla vedle smáčecího činidla používat chaotropní činidla, jako je například močovina.
Antigeny, které jsou pomocí smáčecího činidla uvedeny do roztoku, se pak rozdělují na frakce DEAE-chromatografií. S výhodou se používá DEAE ionexová pryskyřice. Je však možné používat jiné anexové nebo katexové pryskyřice místo DEAE ionexové pryskyřice, nebo se používají ve vzájemné kombinaci. Podle tohoto vynálezu ionexová pryskyřice obsahuje nerozpustnou matrici, se kterou byly zkondenzovány nabité skupiny. Mezi funkční skupiny, používané u anexů, patří aminoethylová (AE), diethylaminoethylová (DEAE) a kvarterní aminoethylová skupina (QAE). Katexy mohou mít karboxymethylovou (CM), fosfono- nebo sulfopropylovou (SP) skupinu. I když se vzorky na kolonu nanášejí v pufru Tris, obsahujícím
-11CZ 280743 B6 zwiteriontové smáčecí činidlo 3-14 (1 %), a antigeny se eluují gradientem chloridu sodného, mohou být stejně účinná i jiná uspořádání .
Antigeny se mohou zkoncentrovat navázáním na hydroxyapatit podle způsobů, které jsou dobře známé odborníkům. Alternativní nebo doplňkový postup, podle kterého mohou být antigeny dále zkoncentrovány/vyčištěny, je afinitní chromatografie na imobilizovaném kovu. Tento druhý způsob je výhodnější než chromatografie na hydroxyapatitu při čištění pC, neboť se tak dosáhne lepšího oddělení od ospA a B.
Výhodou shora popsaného nedenaturačního čisticího postupu je to, že zůstává zachována 3-D konfigurace proteinu. Tím se udrží všechna protilátková kombinační místa na přírodním proteinu, včetně těch, která jsou zahrnuta v ochraně. Jestliže je protein denaturován, vazebná místa mohou být částečné nebo úplně zničena. Kapacita antigenu indukovat protilátky na antigenních místech bude odpovídajícím způsobem snížena. Takto pozměněné proteiny by tedy byly nevhodné pro použití ve vakcínách.
Výhodou shora uvedeného způsobu čištění proti způsobu s celými buňkami, jako je například způsob podle Johnsona (1988), je to, že se podle něj získává homogenní protein bez jakýchkoliv toxických složek. Tím se snižuje pravděpodobnost nepříznivé reakce. Pojem homogenní v této souvislosti znamená, že alespoň 80 % (hmotnostní díly k objemovým dílům) proteinu je zcela neporušený pC s téměř všemi zbytky, reprezentovanými pC rozkladnými produkty. Takže pokud vůbec jsou, jsou nečistoty ve formě složek média a jiných Borrelia proteinů přítomny pouze ve stopových množstvích. Homogenní pC může sestávat z více než jedné sérologické formy pC.
Tímto způsobem se podle tohoto vynálezu umožňuje odstraněni nechtěných potenciálně imunogenních proteinů, které by mohly indukovat autoprotilátky a způsobovat škodlivé autoimunní reakce v imunizovaném savci. Shora popsaný způsob čištění rovněž zajišťuje reprodukovatelnost všech složek během výroby vakcíny. Na základě objevu, že gebrily jako zvířecí model jsou pro účely tohoto vynálezu cenné, byly provedeny pokusy, potvrzující, že by bylo možné sdílet imunitu proti infekci B. burgdorferi. Tyto pokusy jsou diskutovány níže v příkladu 3. I když byly testovány také ospA, ospB, pC, protein vnějšího povrchu s molekulovou hmotou 63 000, proteiny z kmene Orth-1 B. burgdorferi o molekulové hmotě 21 000 a 94 000, pouze pC protein vykazoval zřetelné známky ochranného účinku.
Antigeny, které byly připraveny podle předcházejícího postupu čištění, jsou vhodné pro použití v diagnostických testech, jako je například detekce protilátek na B. burgdorferi v tělesné kapalině savců. Například nedenaturovaný homogenní protein, připravený podle předcházejícího způsobu, může být inkubován se vzorkem tělesné kapaliny. Deteguje se tak přítomnost navázané protilátky, pocházející z takové inkubace. Pojem tělesná kapalina zahrnuje (ale není omezen pouze na uvedené) mozkomíšní mok, synoviální kapalinu, moč, kapalinu tělesných dutin, krev, sérum, semeno a sliny. Takové testy, i když jsou dobře známy odborníkům,
-12CZ 280743 B6 by byly velice zlepšeny citlivostí a specifičností antigenů, vyčištěných podle tohoto vynálezu.
Tento vynález je popsán podrobněji následujícími příklady, které jsou ilustrující a v žádném případě nejsou zamýšleny jako omezení rozsahu tohoto vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Čištění proteinů
Příprava membránových frakcí
Buňky Borrelia burgdorferi se izolují odstřelováním (7000 x g) (dvacet minut, 4 °C). Buněčná peleta se promyje dvakrát PBS a 5mM chloridem hořečnatým. Stanoví se suchá hmotnost buněk. Promyté buňky se resuspendují ve lOOmM pufru Tris-HCl, pH 7,5 (v poměru 1 g buněk na 2 ml pufru). Tato suspenze se přidá ke skleněným perličkám (průměr 0,17 až 0,18 mm, 5 g perliček na 1 g buněčné pasty) v kovové kádince. Tyto buňky se potom lyžují třepáním směsi v buněčném mlýnu VibrogenR (Model VI4, Buhler). Tříminutové cykly třepání s ochlazením (na 4 °C) se opakují, dokud lyže není větší než 99 %, což se testuje mikroskopem s tmavým polem. Lyzát se pak zfiltruje sintrovým skleněným filtrem, aby se odstranily skleněné perličky. Zadržené perličky se promyjí pufrem, aby se zlepšil výtěžek bakteriálních antigenů ve filtrátu.
Tento lyzát se odstřeďuje dvacet minut při 7 500 x g při teplotě 4 °C. Získá se tak surová membránová frakce (lsp, což znamená peleta, získaná při nízké rychlosti (law speed pellet)). Supernatant se dále odstřeďuje třicet minut při 100 000 x g při teplotě 4 °C. Získá se tak druhá membránová frakce (hsp, což znamená peleta, získaná při vysoké rychlosti (high speed pellet)). Obě membránové frakce byly promyty dvakrát ve lOOmM pufru Tris-HCl (pH 7,5) za původních podmínek odstřeďování. Jako výchozí materiál pro čištění pC (nebo jiných s membránou asociovaných antigenů) by se mohla použít kterákoliv z membránových frakcí. Avšak frakce hsp obsahovala menší množství kontaminujících proteinů.
Extrakce membrán smáčecím činidlem se provádí tak, že se membrány resuspendují tak, aby bylo asi 10 mg proteinu v 1 ml lOmM pufru Tris-HCl (pH 7,5), který obsahuje 1 % (hmotnostní díly k objemovým dílům) zwiteriontového smáčecího činidla 3-14 (Serva). Po jednohodinové inkubaci při 37 ’C se nerozpustný materiál oddělí odstřeďováním (100 000 x g, šedesát minut, 4 ’C).
Antigeny, které byly rozpuštěny pomocí smáčecího činidla, byly frakcionovány DEAE chromatografii za následujících podmínek: kolona: semi-prep a délce 150 mm od vého prostředku, průtok: 4 ml/min, díly k objemovým kolona Protein-PAK SEAE 5PW o průměru 21,5 mm firmy Watrs, vzorek: 20 ml (4 x 5 ml) antigenorozpuštěného ve smáčecím činidle (10 mg/ml), pufr A: lOmM Tris-HCl, pH 7,5/1 % (hmotnostní dílům) zwiteriontového činidla 3-14, pufr B:
-13CZ 280743 B6
A + 1M chlorid sodný, gradient: 0 % B po dobu 35 minut, 0 až 30 % B po dobu 90 minut, 30 až 65 % po dobu 45 minut a 65 až 100 % B během 10 minut.
Kolona se ekvilibruje pufrem A a antigeny se eluují zvyšujícími se množstvími chloridu sodného. Pro identifikování frakcí, které obsahují žádaný antigen, se části osmimililitrových frakcí vysrážejí acetonem a pelety se analyzují SDS-PAGE a/nebo imunoblotováním.
Při chromatografii na hydroxyapatitu se frakce, obohacené o žádaný antigen, jako je například pC, spojí a dialyzují proti pufru C před tím, než se nanesou na hydroxyapatitovou kolonu. Navázaný antigen se eluuje zvyšujícím se množstvím fosforečnanových iontů, například pufrem D. Tímto způsobem se mohou zahustit zředěné roztoky antigenu, načež se antigen může oddělit od znečištěnin. Technický popis tohoto přístupu je následující: kolona: kolona Βίο-Gel HPHT o průměru 7,8 a délce 100 mm od firmy Bio-Rad, vzorek: spojené pC obsahující frakce z předcházejícího stupně (např. frakce 20 až 22) po dialýze proti pufru C (4 x 5 ml), průtok: 0,5 ml za minutu, pufr C: 10mM MOPS-NaOH (3-N-morfolino-propansulfonová kyselina), pH 6,8/1 mM fosforečnan sodný/0,01 mM chlorid vápenatý/1 % (hmotnostní díly k objemovým dílům) zwiteriontového činidla 3-14), pufr D: pufr C + 400 mM fosforečnan sodný, gradient: 0 % D po dobu 60 minut, 0 až 100 % D během 20 minut. Frakce byly analyzovány postupem, který je popsán při chromatografii na ionexu.
Při afinitní chromatografii na imobilizovaném kovu se frakce, obohacené o žádaný antigen, jako jsou například pC frakce z dělení chromatografií na DEAE ionexu, spojí a pH se upraví pufrem (např. u chromatografických frakcí z ionexu, obsahujících pC protein, se přidá chlorid sodný na konečnou koncentraci 150 mM) . Zfiltrovaný roztok antigenu (0,2 μιη) se nanese na chromatografickou kolonu s imobilizovaným kovem (předem naplněnou Cu++ podle popisu výrobce a ekvilibrovanou pufrem A), promyjí se pufrem A a navázaný antigen se eluuje pufrem B, který obsahuje imidazol. Tímto způsobem se mohou zahustit zředěné roztoky antigenu, načež se antigen může oddělit od znečištěnin. Technický popis tohoto postupu pro protein pC (jako příklad) je následující. Kolona: s chelátovanou superosou HR 16/5 o průměru 16 mm a délce 50 mm od fy Pharmacia/LKB, vzorek: spojené pC obsahující frakce z chromatograf ie na DEAE iontoměniči s přidaným chloridem sodným (150 mM), pufr A: 20 mM tris/acetát, pH 7,5/150 mM chlorid sodný/1 % (hmot, díly/obj. díly) obojetně iontového detergentu 3-14, pufr B: 20 mM tris/acetát, pH 7,0/150 mM chlorid sodný/1 % (hmotnostně/objemově) obojetně iontového detergentu 3-14/50 mM imidazol, průtok: 2 ml/min, gradient: A po dobu 30 minut, 0 až 100 % B po dobu 40 minut. Frakce, které obsahují pC, se identifikují postupem popsaným při chromatografii na ionexu.
Příklad 2
Výsledky postupu čištění
Na obrázku 1 jsou charakterizovány následující antigeny, které byly připraveny podle shora uvedených postupů:
-14CZ 280743 B6 protein vnějšího povrchu o molekulové hmotnosti 63 000 (pás 7),
protein o molekulové hmotnosti 60 000 (pás 8),
protein o molekulové hmotnosti 56 000 (pás 9),
protein s flagelární strukturou (pás 10),
ospB (pás 11) ,
ospA (pás 12) ,
pC (pás 13) a
protein o molekulové hmotnosti 21 000 (pás 14) .
První tři stupně čištění byly v podstatě identické bez ohledu na to, který protein byl čištěn, i když lze podle potřeby provést modifikace, které optimalizují dělení. Stupeň chromatografie na hydroxyapatitu, použitý pro čištění/koncentraci pC proteinu, je široce aplikovatelný, nebot téměř všechny žádané proteiny se vážou na hydroxyapatit v pufru C.
Příklad 3
Studie ochrany
Jelikož imunita, získaná během aktivní infekce, je obvykle vyšší než imunita, získaná očkováním, bylo skupině deseti gerbil intraperitoneálně podáno 2.10 virulentních B. burqdorferi, kmen Orth-1, aby se ukázalo, že ochranná imunita, získaná očkováním, proti Lymské boreliose je realistickým cílem. Tato dávka byla retrospektivně vyhodnocena jako ekvivalent přibližně tisícinásobku infekční dávky, které je potřeba pro infektování poloviny zvířat. Po třech týdnech byla zvířata léčena jeden týden antibiotiky, aby se zbavila infekce. Dalších 17 dnů byla zvířata ponechána v klidu, aby se odstranila antibiotika. Zvířata pak byla opět infikována podáním stejné dávky, jak shora uvedeno. Po dalších dvou týdnech byla zvířata usmrcena. Žlučník, slezina, ledviny a srdce byly kultivovány. Všechna tato zvířata byla chráněna proti B. burgdorferi, která nebyla detegována ani v jedné kultuře žádaného orgánu, přestože tyto kultury byly pravidelně sledovány po dobu osmi týdnů. Naproti tomu 80 % kontrolních gerbil, kterým nebyla podána původní imunizační dávka, bylo infektováno. Aby byla zajištěna srovnatelnost s testovanými zvířaty, tyto gerbily byly rovněž léčeny antibiotiky. Tím bylo potvrzeno, že ochrana studijní skupiny se může připsat získané imunitě a ne přetrvávání antibiotik ve tkáních.
V další sérii pokusů byla hodnocena ochranná potence antigenů, vyčištěných popsanými způsoby z B. burqdorferi. Gerbily se dvakrát intraperitoneálně imunizují s dvoutýdenním intervalem mezi imunizacemi 10 μg antigenu s hydroxidem hlinitým jako adjuvantem. Dva týdny po konečné imunizaci se zvířatům intraperitoneálně podá (společné s neimunizovanou kontrolní skupinou) 2.107 virulentního B. burqdorferi, kmen Orth-1. Po dvou týdnech se zvířata zabijí. Žlučník, slezina, ledviny a srdce se kultivují na přítomnost spirochet. Kultury byly pravidelně sledovány po dobu osmi týdnů.
-15CZ 280743 B6
Byly testovány ospA, ospB, pC a protein vnějšího povrchu o molekulové hmotnosti 63 000, všechny z podaného kmene Orth-1. Pouze zvířata, imunizovaná pC proteinem, vykazovala zřetelné znaky ochranného účinku. I když nebyla prokázána úplná ochrana, infekce zvířat, imunizovaných pC, byla méně prudká a bylo zasaženo méně orgánů. Kultury srdce a ledvin z imunizovaných zvířat byly negativní na B. burgdorferi ve srovnání s přibližně 50% infekcí u kontrolních zvířat. Podobně i infekce u sleziny, která byla přibližně 70%, byla snížena téměř na polovinu. Pouze u nejcitlivějšího orgánu, u žlučníku, nebyla pozorovatelná změna v počtu infektovaných kultur. OspA, ospB a protein o molekulové hmotnosti 63 000 byly naprosto neúčinné. Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny níže v tabulce I.
Tabulka I
pokus imunogen počet infektovaných gerbil ku počtu testovaných gerbil
imunizované kontrola1 2 3
25 zíve bakterie 0/10 4/5
20 zabité bakterie 6/10 10/10
23 zabité bakterie“1 7/8 10/10
30 zabité bakterie 8/9 10/10
21/27 30/30
33 pC protein 8/9 10/10
37 ospB 10/10 9/9
38 osp o molekulové hmotnosti 63 000 10/10 9/9
41 ospA 10/10 10/10
1 uKontrola nebo neimunizované gerbily 2 Podány živé B. burgdorferi, léčeno antibiotiky a znovu podány B. burgdorferi pro zjištění ochrany, tj. přirozené imunity 3 Formalinem zabité B. burgdorferi (dvě 25 μg dávky, počítáno jako protein)
Následující pokus byl proveden podle stejného shora popsaného protokolu až na to, že podávaná dávka byla snížena na 10 organismů. Po imunizaci pC prokazuje zřetelnou ochranu. Na rozdíl od pC však nedošlo k žádné imunizaci působením ospA, proteinem o molekulové hmotnosti 21 000 nebo proteinem o molekulové hmotnosti 94 000. Jak je uvedeno v tabulce II, všechny gerbily, imunizované pC, ukazovaly ochranný účinek, přičemž žádná z gerbil, imunizovaná ospA, proteinem o molekulové hmotnosti 21 000 nebo proteinem o molekulové hmotnosti 94 000 nevykazovala přílišnou účinnost.
-16CZ 280743 B6
Tabulka II počet infektovaných gerbil pokus imunogen ku počtu testovaných gerbil imunizované kontrola1
46 pC protein 0/10 9/10
protein o molekulové 8/9
hmotnosti 94 000
47 ospA 10/10 10/10
protein o molekulové
hmotnosti 21 000 10/10
1 Kontrola nebo neimunizované gerbily
Příklad 4
Charakterizace pC proteinu jako lipoproteinu
B. burqdorferi vyrostlá v přítomnosti 3H-palmitové kyseliny inkorporuje tuto radioaktivně značenou mastnou kyselinu do svých lipoproteinu. Tyto radioaktivně označené lipoproteiny se oddělí SDS-PAGE elektroforézou a identifikují se fluorografii. Jeden takový lipoprotein, identifikovnaý z kmene Orth-1, má stejnou zdánlivou molekulovou hmotu (asi 24 000) jako pC protein z tohoto
O kmene. Jestliže se H-palmitovou kyselinou radioaktivně označené celé buňky B. burqdorferi Orth-1 nechají zreagovat s trypsinem a potom se analyzují SDS-PAGE, je vidět charakteristický dvojitý pás, odpovídající částečně rozštěpenému pC proteinu. Westernovo blotování tohoto materiálu s monoklonálními protilátkami, specifickými na pC, potvrdilo, že tyto pásy skutečně odpovídají pC proteinu. Tento dublet, který je diagnostický pro pC protein, byl detegován také fluorografií materiálu, který se nechal zreagovat s trypsinem. Analogický pokus, používající proteinasu K, která podstatně snižuje množství na buňku asociovaného pC proteinu, vede téměř k úplné ztrátě lipoproteinu o molekulové hmotnosti 24 000. Tato data, jak ukazuje obrázek 2, potvrzují, že pC protein je lipoprotein.
Radioaktivně značené B. burqdorferi buňky: B. burqdorferi Orth-1 buňky (3,5 ml kultury, obsahující 1,6.10 buněk na mililitr) byly nechány růst v médiu BSK, doplněném o radioaktivní kyselinu palmitovou (70 μΐ [3H]-palmitové kyseliny, 55 Ci/mmol, 1 mCi/ml) 48 hodin při 33 °C, potom byly promyty dvakrát pufrem PBS/5mM chloridem hořečnatým. Každý podíl byl suspendován ve 190 μΐ pufru PBS/chlorid hořečnatý.
Proteolytické štěpení: Do 190 μΐ buněčné suspenze se přidá 10 μΐ buď PBS/chlorid hořečnatý (kontrola), 62,5 μg trypsinu v lmM kyselině chlorovodíkové nebo 62,5 μg proteinasy K ve vodě. Tyto vzorky se inkubují třepáním 50 minut při teplotě 25 °C (proteinasa K) nebo 100 minut, načež se přidají 2 mikrolitry PMSF
-17CZ 280743 B6 (50 mg fenylmethylsulfonylfluoridu na 1 ml v ethanolu). Buňky se peletují (deset minut při 8000 x g) a dvakrát se promyjí 500 μ.1 PBS/5mM chlorid hořečnatý/0,5 mg/ml PMSF. Odstraní se tak rozštěpené produkty.
Analýza vzorků: SDS-PAGE a Westernovo blotování se provádí standardními způsoby. Gely pro fluorografii se inkubují jednu hodinu v EN3HANCE (NEN), promývají se třicet minut vodou, suší se dvě hodiny při 65 °C a exponují se při -80 °C na Hyperfilm MP (Amersham).
Příklad 5
Exprese rekombinantního pC proteinu
DNA se extrahuje z B. burqdorferi Orth-1, částečně se rozštěpí působením Sau 3A, rozdělí se podle velikosti a klonuje se do místa Bam H1 plasmidu pUC18. Testování (vyhledávání, skríning) se provádí oligonukleotidovou hybridizační sondou. Detegovaný gen se sekvenuj e.
Před klonováním do expresního vektoru se pC gen amplifikuje PCR. Jako PCR primery se používají:
Primer 1, odpovídající počátku pC otevřené čtecí fáze (počáteční kodon je podtržen):
5'ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCGATATTA 3'.
Primer 2, odpovídající konci pC otevřené čtecí fáze (stop kodon je podtržen):
5'ATTAGGTTTTTTTGGAGTTTCTG 3'.
PCR reakce byla prováděna podle instrukcí výrobce s použitím VentR DNA polymerasy (New England Biolabs). Primery byly anelovány s templátovou DNA (rekombinantní plasmid pUC18 s DNA fragmentem, odvozeným od B. burqdorferi, obsahujícím pC gen spolu s obklopující DNA) při 57 C a prodlouženy při 74 °C. Bylo provedeno celkem 25 cyklů, každý 1 minutu. Potom se vzorek zahřívá pět minut na teplotu 50 °C.
Potom se provede exprese pC proteinu ve formě napojení proteinu s MBP (maltose binding protein), komerčně dostupným expresním systémem (New England Biolabs).
Zkonstruování napojených plasmidů se provádí následujícím postupem: PCR amplifikovaný gen pC se vloží po směru vlákna genu malE, přítomného na expresních vektorových plasmidech pMAL-p2 a pMAL-c2 (100 ng plasmidové DNA se rozštěpí restrikčním enzymem Xmnl a liguje se s 20 nanogramy PCR produktu, tj. pC genem). Ligovaná DNA se transformuje do α-komplementárního E. coli hostitele (např. TB1 nebo DH5a). Na LB agaru, obsahujícím ampicilin a X-gal, se vyberou klony, které obsahují pC gen. Inzerce pC genu do klonovacího vektoru, který propůjčuje rezistenci na ampicilin, přeruší spojení male-laxZa. Výsledkem je změna fenotypu kolonie
-18CZ 280743 B6 (modrá na bílou) za zvolených testovacích podmínek. Konstrukce s pC genem se správnou orientací vzhledem k tac promotoru vektoru vede k expresi napojeného proteinu pC-MBP. To bylo potvrzeno Westernovým blotováním monoklonálními protilátkami, které jsou specifické na pC. Napojený protein pC-MBP byl produkován jak se signálním peptidem (pMAL-p2), který usměrňuje napojený protein do periplazmy, tak bez signální sekvence, kdy napojený protein zůstává v cytoplazmě (pMAL-c2). Cytoplazmová exprese byla vyšší než periplazmová exprese, která však byla potenciálně výhodná, neboť poskytovala rozpustný produkt.
Rekombinantní pC se čistí tak, že se podle pokynů výrobce připraví surové extrakty, které obsahují pC-MBP expresí v periplazmě a cytoplazmě. Napojený protein se vyčistí afinitní chromatografií vlivem specifického navázání MBP na amylosovou afinitní pryskyřici. Z napojeného proteinu pC-MBP se odštěpí MBP část. Získá se tak úplný pC protein, protože napojený protein obsahuje jediné rozpoznávací místo pro proteasový faktor Xa, přilehlý k počátku sekvence aminokyselin pC. MBP část, uvolněná v tomto postupu spolu s jakýmkoliv neodštěpeným napojeným proteinem, se odstraní projitím amylasovou pryskyřicí (MBP se váže, ale pC nikoliv). Lze použít také jiné způsoby, o nichž je známo, že jsou vhodné pro čištění pC, např. chromatografii na ionexu, chromátografii na hydroxyapatitu, afinitní chromatografii na imobilizovaném kovu.
pC protein, získaný podle tohoto způsobu, je úplný. Použitím příslušných PCR primerů se však mohou připravovat zkrácené formy pC proteinu (např. bez domnělé leader sekvence).

Claims (9)

1. Vakcína s obsahem proteinu pC k prevenci nebo léčení lymské boreliosy, vyznačující se tím, že obsahuje (a) materiál, vybraný ze skupiny, zahrnující alespoň jednu sérologickou formu proteinu pC z B. burgdorferi v homogenní formě, varianty pC a imitace pC, obojí vyvolávající produkci ochranných protilátek, (b) fyziologicky přijatelný excipient a (c) adjuvans, přičemž uvedený materiál je obsažen v množství které účinně chrání vnímavé savce, 1 až 100 μg v jedné dávce, s výhodou 10 až 50 μg v jedné dávce.
2. Vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje dále alespoň jeden ne-pC antigen B. burgdorferi.
3. Vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako adjuvans obsahuje hydroxid hlinitý.
4. Vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že je určena pro člověka jakožto savce.
5. Způsob čištění proteinu B. burgdorferi, vyznačuj ící se tím, že se (a) buňky B. burgdorferi rozbijí a potom frakcionují na membránovou složku a cytoplazmovou složku, (b) membránová složka se resuspenduje v nedenaturujícím detergentu za získání rozpuštěného proteinu a nerozpuštěného materiálu, načež se rozpuštěný protein oddělí od nerozpuštěného materiálu, (c) rozpuštěný protein se chromatografuje na ionexu, (d) proteinové frakce se spojí a (e) podrobí antigenové zkoušce.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se po stupni (e) spojené proteinové frakce dále chromatograf ují na hydroxyapatitu za zkoncentrování a dalšího jejich vyčištění.
7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se jako protein čistí protein pC.
8. Diagnostické činidlo k detekci protilátek B. burgdorferi ve vzorku, zejména lidské tělní kapaliny , vyznačující se tím, že obsahuje protein B. burgdorferi, získávaný způsobem podle nároku 5.
9. Způsob zjišťování přítomnosti protilátek B. burgdorferi ve vzorku tělní kapaliny, vyznačující se tím, že se vzorek tělní kapaliny inkubuje s diagnostickým činidlem podle nároku 8 a stanoví se přítomnost vázané protilátky, vyplývající z inkubace.
CS922172A 1991-07-11 1992-07-10 Imunogen proti lymské boreliose savců CZ280743B6 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72724591A 1991-07-11 1991-07-11
US82416192A 1992-01-22 1992-01-22
US07/903,580 US6221363B1 (en) 1991-07-11 1992-06-25 Vaccine for the prevention of lyme disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ217292A3 CZ217292A3 (en) 1993-01-13
CZ280743B6 true CZ280743B6 (cs) 1996-04-17

Family

ID=27419096

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS922172A CZ280743B6 (cs) 1991-07-11 1992-07-10 Imunogen proti lymské boreliose savců

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6221363B1 (cs)
EP (1) EP0522560B2 (cs)
JP (1) JP2611095B2 (cs)
AT (1) ATE198489T1 (cs)
AU (1) AU660178B2 (cs)
CA (1) CA2073486C (cs)
CZ (1) CZ280743B6 (cs)
DE (1) DE69231619T3 (cs)
DK (1) DK0522560T4 (cs)
ES (1) ES2154633T3 (cs)
FI (1) FI107334B (cs)
HR (1) HRP950174B1 (cs)
HU (1) HU219772B (cs)
MX (1) MX9204078A (cs)
NO (1) NO304546B1 (cs)
SI (1) SI9200143B (cs)
SK (1) SK217292A3 (cs)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6872550B1 (en) * 1991-07-11 2005-03-29 Baxter Vaccine Ag Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens
US6303129B1 (en) * 1992-07-28 2001-10-16 Rx Technologies Production of borrelia burgdorferi vaccine, product produced thereby and method of use
PL178775B1 (pl) * 1993-04-29 2000-06-30 Baxter Ag Kompozycja immunogenna, rekombinacyjne sekwencje DNA, rekombinacyjny wektor ekspresyjny, transformowana komórka gospodarza i antygen OspC
US6248562B1 (en) 1993-11-01 2001-06-19 Research Foundation State University Of New York Chimeric proteins comprising borrelia polypeptides and uses therefor
US7008625B2 (en) 1993-11-01 2006-03-07 Research Foundation Of The State University Of New York Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi
PT757556E (pt) 1994-04-11 2006-10-31 Wyeth Corp Bacterina borrelia burgdorferi
US6087097A (en) * 1994-05-12 2000-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research PCR detection of Borrelia burgdorferi
ZA964896B (en) * 1995-06-07 1997-01-08 Connaught Lab Expression of lipoproteins
CN1285608C (zh) * 1995-09-22 2006-11-22 康诺特实验室有限公司 副流感病毒糖蛋白和疫苗
WO1997015600A1 (en) * 1995-10-26 1997-05-01 The Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island And Providence Plantations Tick (ixodes scapularis) vector saliva-induced lyme disease spirochete (borrelia burgdorferi) antigens as vaccine candidates
US6045804A (en) * 1996-03-07 2000-04-04 Mayo Foundation For Medical Educational Research Method for detecting B. burgdorferi infection
US6716574B2 (en) 1996-05-02 2004-04-06 Dako A/S Osp-C derived peptide fragments
US6969520B2 (en) * 1997-10-20 2005-11-29 Acambis Inc. Active immunization against clostridium difficile disease
GB9811219D0 (en) * 1998-05-26 1998-07-22 Smithkline Beecham Biolog Novel process
EP1173577A2 (en) * 1999-04-21 2002-01-23 Boston Medical Center Corporation Prevention, diagnosis and treatment of lyme disease
PT1194559E (pt) * 1999-06-18 2007-01-31 Brook Biotechnologies Inc Grupos de borrelia burgdorferi e borrelia afzelii que causam a doença de lyme em seres humanos
WO2002016421A2 (en) 2000-08-18 2002-02-28 Research Foundation Of The State University Of New York Altered ospa of borrelia burgdorferi
US8277852B2 (en) * 2002-01-25 2012-10-02 Akzo Nobel Surface Chemistry Llc Bioactive botanical cosmetic compositions and processes for their production
US7442391B2 (en) * 2002-01-25 2008-10-28 Integrated Botanical Technologies, Llc Bioactive botanical cosmetic compositions and processes for their production
ES2652603T3 (es) 2004-01-12 2018-02-05 Isp Investments Llc Composiciones bioactivas de plantas de Theacea y procedimientos para su producción y uso
EP1983247A1 (en) 2006-01-19 2008-10-22 Toyo Seikan Kaisya, Ltd. Coupler and fuel cartridge for fuel cell
EP2077856B1 (en) * 2006-11-03 2015-08-12 Intervet International BV Canine lyme disease vaccine
ATE496935T1 (de) 2007-02-22 2011-02-15 Baxter Int Verfahren zur aufreinigung hydrophober proteine
JP2011518338A (ja) * 2008-04-22 2011-06-23 リサーチ ファンデーション オブ ステート ユニバーシティ オブ ニューヨーク ボレリア・ブルグドルフェリ（ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の細胞エンベロープタンパク質のアレイ
CN102791727A (zh) * 2009-11-17 2012-11-21 爱贝斯股份有限公司 用于检测莱姆病抗体的肽和方法
DK3549949T5 (da) 2011-04-22 2024-09-02 Wyeth Llc Sammensætninger vedrørende et mutant Clostridium-difficile-toksin og fremgangsmåder dertil
US8758772B2 (en) 2011-11-04 2014-06-24 Abaxis, Inc. Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies
BR122016023101B1 (pt) 2012-10-21 2022-03-22 Pfizer Inc Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile
KR102451333B1 (ko) * 2018-10-22 2022-10-06 주식회사 엘지화학 마이크로비드 및 그 제조방법

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK590288D0 (da) 1988-10-24 1988-10-24 Symbicom Ab Kemiske forbindelser
US4603112A (en) * 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4767622A (en) * 1983-08-19 1988-08-30 University Of Illinois Method and materials for development of immunological responses protective against malarial infection
US4601903A (en) * 1985-05-01 1986-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease
US4888276A (en) 1986-06-26 1989-12-19 Minnesota Mining And Manufacturing Company Method and composition for the diagnosis of Lyme disease
US4721617A (en) 1986-08-14 1988-01-26 Regents Of The University Of Minnesota Vaccine against lyme disease
US5192540A (en) * 1988-04-19 1993-03-09 American Cyanamid Company Haemophilus influenzae type b oxidized polysaccharide-outer membrane protein conjugate vaccine
DE3818013A1 (de) 1988-05-27 1989-11-30 Henkel Kgaa Gewebeweichmachungsmittel
IT1223777B (it) * 1988-08-18 1990-09-29 Gevipi Ag Rubinetto a due uscite con inversore a depressione
DE4015911A1 (de) * 1989-09-19 1991-03-28 Max Planck Gesellschaft Impfstoff gegen die lyme-krankheit
DE3942728C1 (en) 1989-12-22 1991-05-23 Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh, 8000 Muenchen, De New immunologically active proteins derived from Borelia burgdorferiensity polyethylene vessel and a high density polyethylene sealing cap - useful as vaccine and for quick accurate diagnosis of Borelia infections
CA2072008C (en) * 1989-12-22 2003-01-28 Renate Fuchs Immunologically active proteins from borrelia burgdorferi, related test kits which contain these proteins and are suitable for detecting antibodies in test fluids, and the use of these proteins as vaccines against infections caused by borrelia strains
DE69122240T2 (de) 1990-03-05 1997-02-13 The United States of America, represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, Washington, D.C. Antigen-wirkende proteine von borrelia burgdorferi
EP1016416A3 (en) * 1990-07-06 2002-10-23 Wyeth Vaccine against lyme disease and a challenge model for evaluating vaccine efficacy

Also Published As

Publication number Publication date
SK279250B6 (sk) 1998-08-05
AU660178B2 (en) 1995-06-15
US6221363B1 (en) 2001-04-24
FI923175A (fi) 1993-01-12
EP0522560A3 (en) 1994-05-11
DE69231619T3 (de) 2007-07-12
ES2154633T3 (es) 2001-04-16
HRP950174B1 (en) 2001-08-31
JP2611095B2 (ja) 1997-05-21
EP0522560B2 (en) 2006-12-20
AU1934992A (en) 1993-01-14
EP0522560B1 (en) 2001-01-03
FI923175A0 (fi) 1992-07-09
NO922746D0 (no) 1992-07-10
CA2073486A1 (en) 1993-01-12
EP0522560A2 (en) 1993-01-13
US5530103A (en) 1996-06-25
ATE198489T1 (de) 2001-01-15
DE69231619T2 (de) 2001-05-31
SK217292A3 (en) 1998-08-05
HRP950174A2 (en) 1997-08-31
SI9200143B (en) 2001-06-30
CZ217292A3 (en) 1993-01-13
HUT66525A (en) 1994-12-28
NO304546B1 (no) 1999-01-11
DE69231619D1 (de) 2001-02-08
JPH072696A (ja) 1995-01-06
HU219772B (hu) 2001-07-30
NO922746L (no) 1993-01-12
DK0522560T3 (da) 2001-03-05
HU9202289D0 (en) 1992-10-28
DK0522560T4 (da) 2007-04-10
SI9200143A (en) 1993-03-31
FI107334B (fi) 2001-07-13
MX9204078A (es) 1993-04-01
CA2073486C (en) 2002-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ280743B6 (cs) Imunogen proti lymské boreliose savců
Koizumi et al. Leptospiral immunoglobulin-like proteins elicit protective immunity
EP0540457A1 (en) Improvements in Borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis
EP0711563A1 (en) Novel Borrelia vaccine
EP1012181B1 (en) Surface antigens and proteins useful in compositions for the diagnosis and prevention of lyme disease
US5656451A (en) OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi
CA2077434C (en) Antigenic proteins of borrelia burgdorferi
Centurion-Lara et al. Conservation of the 15-kilodalton lipoprotein among Treponema pallidum subspecies and strains and other pathogenic treponemes: genetic and antigenic analyses
CZ289212B6 (cs) Imunogenní prostředek proti lymskému onemocnění, sekvence rekombinantní DNA, OspC antigen, pouľití kombinace antigenů a způsob rekombinantní výroby OspC antigenu
US6610301B1 (en) Immunologically active proteins from Borrelia burgdorferi, nucleic acids which encode them, and their use in test kits and as vaccines
Lo et al. Characterization of two lipoproteins in Pasteurella multocida
Champion et al. Sequence analysis and recombinant expression of a 28-kilodalton Treponema pallidum subsp. pallidum rare outer membrane protein (Tromp2)
AU712882B2 (en) Leptospira membrane proteins
RU2102081C1 (ru) Иммуногенная композиция против боррелиоза лайма, способ иммунизации млекопитающего против боррелиоза лайма, способ получения белка pc borrelia burgdorferi, диагностический агент для обнаружения b.burgdorferi и способ обнаружения антител к b.burgdorferi
US6716591B1 (en) B. burgdorferi polypeptides
WO1997042325A1 (en) B. burgdorferi polypeptides expressed in vivo
MXPA97001224A (en) Vaccines against borrelia burgdorferi o

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20100710