CZ289212B6 - Imunogenní prostředek proti lymskému onemocnění, sekvence rekombinantní DNA, OspC antigen, pouľití kombinace antigenů a způsob rekombinantní výroby OspC antigenu - Google Patents

Abstract

Imunogenn prost°edek proti lymsk mu onemocn n , kter² obsahuje alespo jeden OspC antigen alespo jednoho reprezentanta ka d z b n rozpozn van²ch OspC skupin, sekvence rekombinantn ch DNA, OspC antigen, pou it kombinace antigen obsa en²ch v imunogenn ch prost°edc ch pro v²robu vakc ny pro l en nebo p°edch zen lymsk boreliosy u savce a zp sob rekombinantn v²roby OspC antigenu.\

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká imunogenního prostředku, sekvence rekombinantní DNA, OspC antigenu a použití kombinace antigenu. Tento vynález se týká také způsobu rekombinantní přípravy OspC antigenu.

Dosavadní stav techniky

Lymská nemoc nebo lymská boreliosa jsou pojmy, které se používají při popisu různých 15 klinických příznaků souvisejících s klíšťovými spirochetovými infekcemi způsobenými lymskou nemocí Borrelia. Mezi obvyklé příznaky lymské nemoci patří onemocnění kůže [erythema migrans (EM) nebo acrodermatitis chronica atroficans (ACA)] a onemocnění nervového systému (neuroboreliosa) a kloubů (artritida). Infikovat a onemocnět mohou i jiné orgány a tkáně. Lymská nemoc je rozšířena po celém světě a je nejčastější nemocí způsobenou klíštětem jak v USA tak 20 v Evropě. Rozsah klinických příznaků obvykle souvisejících s lymskou nemocí v Evropě je širší než ve Spojených státech. Onemocnění kůže a nervového systému jsou v Evropě obvyklá, ve Spojených státech jsou vzácná, zatímco artritida je obvyklejší ve Spojených Státech než v Evropě. Klinické příznaky v Severní Americe se zdají být podpříznaky těch, které jsou pozorovány v Evropě.

Lymská nemoc se typicky léčí antibiotiky. Léčení se však často opožďuje vzhledem k často složitému klinickému obrazu a nedostatku obecně dostupných a spolehlivých diagnostických testů. Jestliže se nemoc nechá probíhat do chronického stavu, léčení antibiotiky je obtížnější a není vždy úspěšné. Pravděpodobnost perspektivy, že dojde ke stálému poškození, se dále zvyšuje 30 s prodlouženou dobou infekce. Je tedy žádoucí očkovací látka, která by chránila před lymskou nemocí.

Jsou popsány dva antigeny z Bonelie, která způsobuje lymskou nemoc, které mohou chránit před infekcí/nemocí způsobenou tímto organismem, jak to bylo ukázáno na zvířecích modelech 35 lymské nemoci. Tyto antigeny, OspA a OspC (nebo „pC“), jsou tedy pravděpodobnými kandidáty pro zahrnutí do vakcíny, která je určena pro ochranu proti lymské nemoci. Viz Simon a spol.: evropský patent č. 418 827, Fikrig a spol.: Science 250. 553 (1990), Preac-Mursic a spol.: Infection 20. 342 (1992). OspA a OspC mají mnohé vlastnost společné. Oba sou lipoproteiny, které se nacházejí na povrchu buněk (Howe a spol.: Science 227, 645 (1985), Bergstrom a spol.: 40 Mol. Microbiol. 3, 479 (1989).), oba jsou kódovány plazmidem (Barbour a spol.: Science 237,

409 (1987), Marconi a spol.: J. Bacteriol. 175. 926 (1993).), geny těchto proteinů jsou přítomny ve většině kmenů (Barbour a spol.: J. Infect. Dis. 152. 478 (1985), Marconi a spol.: J. Bacteriol. 175. 926 (1993).) a oba existují v násobných serologicky rozdílných formách (Wilske a spol. (1989).).

Existence násobných, serologicky rozdílných forem těchto antigenů je překážkou vývoje OspA a/nebo OspC vakcíny pro ochranu proti většině, jestliže ne proti všem, formám lymské nemoci. Bylo například ukázáno (Fikrigem a spol.: J. Immun. 148. 2256 (1992).), že imunizace jednou serologickou formou OspA, jako je rekombinantní OspA kmene N40, nemusí chránit proti 50 stimulaci kmenem, který exprimuje jiný OspA, například kmenem 25015. Je tedy nutné vyvinout takové typizační schéma pro klasifikaci a skupinu různých variant antigenu (tj. OspA a/nebo OspC), aby se mohla určit optimální směs serologicky rozdílných forem antigenu (antigenů), které je potřeba pro dosažení široké ochrany.

-1 CZ 289212 B6

Pro OspA byl jako typizační nástroj pomocí omezené množství monoklonálních protilátek vyvinout serotypizační systém. Tímto způsobem bylo popsáno 7 serotypů OspA (Wilske a spol.: Ann. N. Y. Acad. Sci. 539, 126 (1988).). Analýza polymorfie délky restrikčního fragmentu (RFLP) OspA genů z 55 různých evropských a severoamerických kmenů identifikovala šest různých genoskupin (Wallich a spol: Infection and Immunity 60. 4856 (1992).). OspA proteiny ze severoamerických izolátů se zdají být dostatečně jednotné, jelikož 12 až 14 OspA náleželo k OspA typu I a dva k OspA typu ΙΠ. Naproti tomu OspA z evropských izolátů jsou mnohem heterogennější a zahrnují reprezentanty OspA typul (18), II (17), IV (4) a V (1). Konstrukce fylogenetického stromu na základě sekvenčních dat pro 12 OspA proteinů z jednotlivých kmenů B. burgdorferi podporuje zjištění RFLP analýzy, ale ještě chybí informace o sekvenci izolátů dvou ze šesti genoskupin. V současné době neexistuje žádný typizační systém pro OspC.

Jinou úvahou při výběru příslušných antigenů pro zahrnutí do vakcíny je to, jestli jsou odvozeny od kmenů, které jsou epidemiologicky důležité pro nemoc. Uprostřed osmdesátých let bylo považováno za jisté, že patogenní bakterie pocházejí z omezeného počtu klonů vysoce příbuzných bakterií, které mají v některém směru selektivní výhodu při vzniku nemoci. Tato klonální hypotéza byla od té doby potvrzena. Viz Achtman a spol.: J. Infect. Dis. 165, 53 (1992). Je tedy vysoce pravděpodobné, že mezi četnými kmeny Borrelia způsobující lymskou nemoc, které se v přírodě vyskytují, existuje pouze omezený počet „klonů“, které jsou vysoce přizpůsobeny ktomu, aby způsobovaly savcům, zvláště lidem, toto onemocnění. Při vývoji vakcíny na ochranu proti onemocnění savců a tedy také lidí, je rozhodujícím způsobem důležité identifikovat klony související s onemocněním, takže by se pak úsilí mohlo soustředit na tyto klony. Je tedy nutné vysvětlit populační strukturu druhu Borrelia způsobujícího lymskou nemoc a identifikovat klony související s tímto onemocněním.

Do dnešní doby byly pro vyřešení populační struktury Borrelia způsobující lymskou nemoc používány četné způsoby, mezi něž patří A) RFLP analýza genomové DNA nebo specifických genů (LeFebvre a spol.: J. Clin. Microbiol. 27. 636 (1989), Marconi a Garon: J. Bacteriol. 174, 241 (1992), Postíc a spol.: Res. Microbiol. 141, 465 (1990), Stahlhammar-Carlemalm a spol.: Zbl. Bak 274. 28 (1990), Adam a spol.: Infect. Immun. 549, 2579 (1991), Wallich a spol.: Infect. Immun. 60, 4856 (1992).), B) DNA-DNA hybridizace (LeFebvre a spol.: J. Clin. Microbiol. 27, 636 (1989), Postíc a spol.: Res. Microbiol. 141, 465 (1990).), C) analýza 16S rRNA hybridizací na oligonukleotidové sondy (Marconi a spol.: J. Clin. Microbiol. 30, 628 (1992).) nebo sekvenováním (Adam a spol.: Infect. Immun. 59, 2579 (1991), Marconi a Garon: J. Bacteriol. 174. 241 (1992).), D) fmgerprintem libovolně senzibilizovaná polymerázová řetězová reakce (Welsch a spol.: Int. J. Systém. Bacteriol. 42,370 (1992).), E) elektroforesa (multi-locus enzyme electrophoresis) (Boerlin a spol.: Infect. Immun. 60. 1677 (1992).) a F) serotypizace izolátů (Peter a Bretz: Zbl. Baktk. 277.28 (1992).).

Mezi výsledky, které byly získány těmito různými postupy, existuje široká shoda. Obecně platí, že se zdá, že izoláty Borrelia, které způsobují lymskou nemoc, lze rozdělit do alespoň tří hlavních skupin. Někteří výzkumníci skutečně věří, že genetické rozdíly mezi členy těchto skupin jsou dostatečné k opodstatnění rozdělení na tři různé druhy: B. burgdorferi sensu stricto (typ kmene B31), B. garinii sp. nov. (typ kmene 20047) a druhy označené B. afzelii nebo „skupina VS461 Borrelia“. Viz Baranton a spol.: Int. J. Syst. Bacteriol. 42, 378 (1992) a Marconi a Garon: viz výše.

Zbývá plně objasnit význam existence těchto různých skupin pro vývoj vakcíny. Z dat Wallicha a spol.: Infection and Immunity 60. 4856 (1992) je jasné, že existuje silná asociace mezi genoskupinou, ke které izolát patří, a typem OspA, který je produkován: izoláty ze skupiny obsahující kmen B31 (genoskupina AAA nebo B. burgdorferi sensu stricto) produkují OspA typ I (všech izolovaných 30 kmenů), izoláty ze skupiny obsahující kmen 20047 (genoskupina BBB nebo B. garinii sp.nov.) obvykle produkují OspA typ II (17/19), byly ale také zaznamenány typy V (1/19) a VI (3/39), izoláty z klonu obsahující kmen B023 (genoskupina BBA nebo skupina

-2CZ 289212 B6

VS 461) produkují OspA typ IV (4/4), zbývající dva izoláty (genoskupina B, B/A, A) produkují

OspA typ III.

Izoláty lymské nemoci ze Severní Ameriky patří převážně k jedné skupině (genoskupina AAA nebo B. burgdorferi sensu stricto), representované kmenem B31, a výsledně produkují OspA typ I. To ukazuje, že vakcína obsahující OspA tyo I může být v dnešní době postačující k ochraně proti většině izolátů způsobujících lymskou nemoc v Severní Americe. V Evropě je obraz složitější, jelikož zde byly nalezeny všechny tři hlavní klony a tomu odpovídá i zvýšená rozmanitost přítomných typů OspA (genotypy I, II, IV, V, VI). Nebylo zjištěno, že by OspA chránil ve dvou studiích, provedených s izoláty lymské nemoci z Evropy, což také demonstrovalo užitečnost OspC jako ochranného antigenů. Viz USA patentová přihláška č. 07/903 580 a PreacMursic a spol.: Infection 20, 342 (1992). DNA a aminokyselinová sekvence OspC antigenů B. burgdorferi kmene Orth-1, její čištění a použití jako imunogen ve vakcíně je popsáno v evropském patentu 0 522 560. Jouris-Heipke a spol. [Medicinal Microbiology and Immunology 182, 37 (1993).] popisují klonování, expresi a sekvenci OspC antigenů B. burgdorferi kmene PKO, PBi a B31.

Dosud nebylo známo, jestli byl OspC klonován dědičně se specifickými typy OspC omezenými na příslušné skupiny lymské nemoci (tj. na B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii sp. nov. nebo skupinu VS461). Jelikož OspC je kódován plazmidem (Marconi a spol.: J. Bacteriol. 175, 926 (1993).), bylo myslitelné, že existoval plazmidem zprostředkovaný přenos genu OspC mezi různými druhy izolátů lymské nemoci. Jestliže jde o tento případ, potom různé typy OspC, o nichž je známo, že existují, ale které nebyly definovány, by se nutně dědičně neklonovaly.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je poskytnout efektivní OspC vakcínu, se širokým zkříženým ochranným účinkem ke všem klonům proti lymské nemoci u savců, vybráním OspC prostředků založených na definovaných OspC skupinách rozlišených fenotypickým typizováním (OspC „serovar“ typizování), RFLP typizační analýzou a sekvenční analýzou mnoha rozmanitých kmenů z celého světa.

Dále byl objeven OspC klon, který se dědičně klonuje. Proto je nyní možné interpretovat výsledky OspC typizačních schémat z pohledu epidemiologické informace z níže popsaného „typizačního schéma obvyklého membránového antigenů“ CMAT, které bylo použito pro objasnění struktury klonální populace kmenů Borrelia lymské nemoci. Ze stejného důvodu je nyní možné vybrat nejvhodnější prostředky OspC vakcíny buď a) pro navržení vakcín pro ochranu proti kmenům převládajícím v definovaných geografických oblastech, nebo b) pro specifickou a preferenční ochranu proti klonům nebo klonálním klastrům B. burgdorferi souvisejícím s epidemiologicky důležitým onemocněním.

Pro dosažení tohoto a dalších předmětů byl získán podle jednoho aspektu tohoto vynálezu imunogenní prostředek, který obsahuje:

a) takové množství materiálu obsahujícího i) jeden nebo více OspC antigenů Borrelia způsobující lymskou nemoc v podstatě vyčištěných z každé z 20 běžně rozpoznávaných OspC skupin na obrázku 11 nebo ii) OspC varianty nebo OspC mimetika uvedených OspC antigenů, při čemž tyto OspC varianty nebo OspC mimetika mají takovou strukturu, která je dostatečně podobná přírodnímu OspC, aby indukovaly produkci ochranných látek, a

b) fyziologicky přijatelný excipient, které je dostatečné k vyvolání, u savců, kteří jsou citliví na lymskou boreliosu, imunitní odpovědi, která je chrání před lymskou boreliosou.

-3CZ 289212 B6

Podle dalšího provedení shora uvedený imunogenní prostředek obsahuje jeden nebo více, s výhodou dva nebo více OspC antigenu Borrelia, způsobující lymskou nemoc, z 20 běžně rozpoznávaných OspC skupin na obrázku 11 nebo OspC variant nebo OspC mimetik uvedených antigenů jak shora definováno pod ad ii) a fyziologicky přijatelný excipient, jak shora definováno pod ad b).

Podle jiného aspektu tohoto vynálezu se získává imunogenní prostředek, který obsahuje takové množství materiálu obsahujícího i) jeden nebo více OspC antigenů Borrelia způsobující lymskou nemoc v podstatě vyčištěných z každé OspC skupiny na obrázku 19 exprimované jedním nebo 10 více klony nebo klonovými klastiy souvisejícími s onemocněním lidí (HDA) nebo ii) OspC varianty nebo OspC mimetika OspC antigenů, při čemž tyto OspC varianty nebo OspC mimetika mají takovou strukturu, která je dostatečně podobná přírodnímu OspC, aby indukovaly produkci ochranných látek, a

b) fyziologicky přijatelný excipient, které je dostatečné k vyvolání, u savců, kteří jsou citliví na lymskou boreliosu, imunitní odpovědi, která je chrání před lymskou boreliosou.

Výhodným provedením je shora uvedený imunogenní prostředek, který obsahuje jeden nebo 20 více, s výhodou dva nebo více OspC antigenů OspC skupiny na obrázku 19, nebo OspC varianty nebo OspC mimetika, jak shora uvedeno pod ad ii), a fyziologicky přijatelný excipient, jak shora uvedeno pod ad b).

Ve výhodném provedení je imunogenní prostředek podle tohoto vynálezu navržen jako ochrana 25 proti kmenům Borrelia, způsobujících lymskou nemoc, převládajícím v příslušné geografické oblasti, jako je Severní Amerika, Evropa nebo Rakousko. Jako výhodné provedení je nárokována kombinovaná OspA/OspC vakcína, která je lepší než vakcína připravená z kteréhokoliv antigenu samotného.

Tento vynález zahrnuje také rekombinantní způsoby produkce nových OspC antigenů společně s DNA sekvencemi, expresními vektory a transformovanými hostitelskými buňkami.

Další předměty, vlastnosti a výhody tohoto vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu. Tomu je třeba rozumět tak, že podrobný popis a specifické příklady, i když představují 35 výhodná provedení vynálezu, jsou zde uvedena pouze jako ilustrace, protože odborníkům v oblasti techniky budou na základě tohoto podrobného popisu zřejmé různé změny a modifikace v rozsahu tohoto vynálezu.

V následující části popisu jsou stručně popsány obrázky.

Obrázek 1 popisuje 77 kmenů Borrelia, které byly použity v pokusech tohoto výzkumu. Je popsána země původu a biologický zdroj (tj. člověk, klíště nebo zvíře), z něhož byly tyto kmeny izolovány. Je uveden také klinický materiál, z něhož byly získány lidské izoláty, a příznak onemocnění (zkratky: CSF znamená mozkomíšní mok, ACA znamená akrodermatitida chronická 45 atrofická, EM znamená erytéma migrující). Jsou zde zahrnuty také vlastnosti 5 dalších kmenů, které nebyly experimentálně studovány, protože v některých analýzách byly použity publikované informace týkající se těchto kmenů.

Obrázek 2 uvádí seznam adres všech přispěvatelů kmenů.

Obrázek 3 uvádí seznam monoklonálních protilátek a jejich antigenových specificit. Je označen také homologní reagující kmen a isotyp monoklonální protilátky.

Obrázek 4 uvádí jednotlivá skóre a representativní kmeny každého CMAT vyřešeného CMAT 55 typizačním schématem.

-4CZ 289212 B6

Obrázek 5 ukazuje dendrogram klastrové analýzy provedený s CMAT typizačními daty. Je uvedena také frekvence výskytu CMAT mezi testovanými kmeny, jako je seskupení jednotlivých

CMAT do CMAT klastrů (všechny CMAT s > než 50% podobností) a CMAT podskupin (všechny CMAT s větší než 20% podobností).

Obrázek 6 ukazuje reakční sestavu panelu 16 OspC-specifických monoklonálních protilátek s kmeny různých serovaných typů.

Obrázek 7 ukazuje velikosti restrikčních fragmentů získaných PCR amplifikací ospC genů (připravených jak shora popsáno v příkladu 4) rozštěpených enzymy Dpnl 1, Ddel a Dral. Jsou také uvedena data, která ukazují 35 jedinečných sestav restrikčních fragmentů (tj. 35 ospC RFLP typů) identifikovaných analýzou dat restrikčních fragmentů z 82 kmenů uvedených v seznamu typů kmenů vybraných jako reprezentant každého z ospC RFLP typu.

Obrázek 8 ukazuje přiřazené částečné nukleotidové sekvence dvaceti čtyř ospC genů vybraných z kmenů příslušejících ospC RFLP typů 1 až 24 na obrázku 1.

Obrázek 8a ukazuje úplné sekvence nových ospC genů podle obrázku 8 včetně 3' konce. Obrázek 8a také obsahuje sekvence ospC genů kmenů H13 a 28691.

Obrázek 9 ukazuje přiřazené částečné aminokyselinové sekvence odvozené z nukleotidových sekvencí na obrázku 8. Oblast, která byla sekvenována, odpovídá prvním 92 % maturovaného OspC proteinu.

Obrázek 9a ukazuje úplné aminokyselinové sekvence nových OspC antigenů podle obrázku 9 včetně C-konce. Obrázek 9a obsahuje také sekvence OspC antigenů kmenů H13 a 28691.

Obrázek 10 je dendrogram sekvenčních dat OspC proteinu z obrázku 9 ukazující fylogenetický vzájemný vztah mezi sekvencemi a stupněm identity sekvence. Tato analýza byla použita pro zařazení OspC proteinů od OspC skupin. Členové OspC skupiny obsahují příbuzné OspC sekvence s větší než 80% identitou. Je také uvedeno, že OspC proteiny se shlukují (klastrují) druhově specifickým způsobem, což ukazuje na to, že OspC protein se dědičně klonuje.

Obrázek 11 je seznam 20 OspC skupin a uvádí kmeny vybrané jako představitele těchto skupin.

Obrázek 12 souhrnně uvádí výsledky CMAT a OspC typizačních analýz 82 kmenů z obrázku 1. Tato data jsou seřazena podle OspC skupiny a RFLP-typu, aby ukázala výskyt frekvence, se kterou kmeny přísluší k příslušné OspC skupině. Kmeny, které nebyly přiřazeny k OspC skupině, jsou označeny 99. Jsou uvedeny biologické a geografické původy těchto kmenů, aby se umožnilo srovnání těchto parametrů s OspC skupinou. Hodnoty CMAT byly přiřazeny 5 kmenům, pro které byl publikován popis, ale které nebyly testovány (tj. kmeny B. burgdorferi, B. afzelii a B. garinii odpovídají CMAT 1, 3 a 4). OspC serovary nebyly přiřazeny všem kmenům; 5 kmenů bylo nedostupných (NA), další nebyly testovány (NT), protože exprimují nedostatečná množství OspC pro spolehlivou typizaci, a některé byly testovány, ale byly ne-reaktivní (NR) s panelem monoklonálních protilátek.

Obrázek 13 uvádí seznam sekvencí mapovaných ospC epitopů spolu s frekvencí jejich výskytu mezi analyzovanými kmeny. Na konci tabulky jsou monoklony seřazeniny do kategorií podle frekvence, se kterou reagují se 77 kmeny v této studii.

Obrázek 14 ukazuje mapu generalizovaného OspC proteinu označující umístění epitopů četných BBM monoklonálních protilátek označených jejich čísly.

-5CZ 289212 B6

Obrázek 15 ukazuje výsledky pokusů aktivní imunizace použitím modelu gerbil. Skupiny zvířat byly imunizovány vyčištěnými variantami OspC proteinů buď stejných (H7), nebo různých OspC skupin (ZS7, PKO a W) na vybraný kmen Orth. Výsledky ukazují, že existuje silná zkřížená ochrana, jestliže se imunizuje variantou stejné skupiny, která je exprimována vybraným kmenem, ale že existuje malá nebo žádná ochrana, jestliže se imunizuje OspC variantou jiné OspC skupiny na vybraný kmen.

Obrázek 16 shrnuje informace o OspC typizaci a distribuci lidských izolátů mezi různými OspC typy. Je uvedena také specifičnost a převaha OspC protilátek přítomných v lidském séru při lymské nemoci z České republiky. Specifičnost OspC protilátky byla definována testováním na panel 18 různých kmenů Borrelia representuj ících 16 OspC skupin.

Obrázek 17 ukazuje kvasinkový expresní vektor pPC-PP4 sOspC kódující sekvencí pod transkripční kontrolou methanolem indukovatelného AOX-1 promotoru.

Obrázek 18 ukazuje výsledky pokusů aktivní imunizace použitím modelu gerbil. Zvířata byla imunizována vyčištěným OspC proteinem odvozeným od kmene Orth B. burgdorferi a rekombinantně produkovaném vP. pastoris GS115/pPC-PP-4. Výsledky ukazují silnou ochranu OspC proteinem odvozeným od Borrelia i od kvasinek.

Obrázek 19 ukazuje příklady prostředků OspC vakcíny navržených jako ochrana proti klonům nebo klonovým klastrům Borrelia způsobující lymskou nemoc souvisejících se specifickou nemocí lidí.

V další části spisuje podrobně popsán tento vynález.

Pomocí serovaru, polymorfíe délky restrikčního fragmentu (RFLP) a sekvenační analýzy popsaných podrobněji níže bylo objeveno, že, navzdory vysokému stupni heterogenity OspC proteinu v různých izolátech lymské nemoci, se OspC proteiny mohou sestavit do omezeného počtu skupin na základě, mimo jiné, podobnosti v sekvenci aminokyselin. Závěry tohoto zjištění jsou podle tohoto vynálezu realizovány navržením vakcínových prostředků, které vzhledem k různým kmenům poskytují vysokou úroveň zkřížené ochrany, které nebylo předtím dosaženo.

Aby se získala taková zkřížená ochrana, musí existovat schopnost předpovídat efektivnost složek dané vakcíny při ochraně proti všem možným kmenům způsobujícím onemocnění. Podle tohoto vynálezu se tento problém vyřeší tím, že heterogenita složek ochranných antigenů ve vakcíně optimálně odráží heterogenitu nacházející se v přírodě. Zvláště pak u OspC proteinu se toho dosáhne přípravou vakcín, které obsahují představitele všech OspC skupin odhalených zde popsanou sekvenační analýzou. Příkladem takového prostředku je, že do vakcíny se zahrne 20 OspC proteinů, které jsou reprezentanty všech shora uvedených OspC skupin. OspC skupina je definována jako taková skupina OspC proteinů, které mají větší než 80% identitu v sekvenci aminokyselin proti 92% identitě maturovaného OspC proteinu, tj. vyjma informací pro leader sekvenci 18 aminokyselin a koncovou sekvenci 16 aminokyselin, jak je uvedeno na obrázcích 9, 9a 10.

Tento vynález se tedy týká imunogenního prostředku obsahujícího jeden nebo více OspC antigenů v podstatě vyčištěných z každé z 20 OspC skupin, které poprvé načrtli autoři tohoto vynálezu. Použití například 20 antigenů je zlepšením proti perspektivě zahrnutí všech možných OspC variant nalezených v přírodě (viz 35 zde popsaných OspC RFLP typů), podle jiného aspektu tohoto vynálezu se prostředek vakcíny lymské nemoci dále zjednoduší omezením počtu antigenních složek takovým způsobem, který nesnižuje ochrannou účinnost vakcíny, spojenou aplikací OspC typizačních dat a epidemiologických dat. Příklady tohoto postupu, jak jsou podrobněji popsány níže, jsou A) návrh vakcínových prostředků pro použití v příslušné geografické oblasti, jako je Severní Amerika a Evropa, nebo v příslušné zemi, jako je Rakousko, a B) návrh vakcíny, která je určena jako ochrana specificky proti pouze těm klonům,

-6CZ 289212 B6 identifikovaných CMAT analýzou, které souvisejí s onemocněním lidí. V jednom provedení podle ad A) je připravena vakcína pro použití v Severní Americe a obsahuje antigeny, které jsou representovány pouze těmi OspC skupinami, které byly pozorovány v amerických kmenech, jmenovitě skupiny 2 a 3 (viz obrázek 12).

Podle jiného provedení se připravuje vakcína pro použití v Severní Americe, která obsahuje kmeny ze skupin 2, 3,18 a 20.

Pro identifikování klonů Borrelia způsobující lymskou nemoc byla CMAT analýzou provedena strukturní analýza populace. „CMAT (typ)“ je definován jako jedinečné devítimístné skóre pocházející zkombinovaného skóre variant molekulových hmotností devíti detegovaných obvyklých membránových antigenu, v některých případech různě rozeznatelných danou řadou monoklonálních protilátek specifických pro tyto antigeny. „CMAT klastr“ je skupina příbuzných CMAT (typů) s alespoň 50% podobností v jejich CMAT skóre. „CMAT skupina“ se zde používá k označení skupiny CMAT typů majících více než nebo 20% podobnost v jejich CMAT skóre. CMAT skupina může tedy obsahovat několik CMAT klastrů, které dále mohou obsahovat několik CMAT typů.

„Klon“ je definován jako CMAT typ obsahující více než jeden kmen nebo jinak, klon znamená skupinu kmenů, které mají stejný CMAT typ a jsou tedy považovány za pocházející z obecného dědičného kmene. „Klonový klastr“ je skupina klonů příbuzných na úrovni CMAT klastru (tj. taková, že jejich CMAT typy mají větší než 50% podobnost). „Klon související s onemocněním člověka“ je takový klon, o kterém lze na základě epidemiologických a klinických dat uvést, že často souvisí s onemocněním člověka. Podobně „klonový klastr související s onemocněním člověka“ je takový klonový klastr, o kterém lze na základě epidemiologických a klinických dat uvést, že často souvisí s onemocněním člověka. V provedení podle ad B) (viz shora) se tedy připravuje OspC vakcína proti CMAT klonům 1.2.4 a 3.2.13 a klonovým klastrům 4.2.17,4.2.18, 4.2.20 a 4.2.22, které souvisejí s onemocněním člověka.

O OspC je známo, že je vhodným imunogenem pro vyvolání ochranné imunitní odpovědi u zvířecích modelů lymské nemoci, jestliže vybraným organismem je stejný izolát lymské nemoci, z něhož je odvozen OspC. Avšak díky serologické heterogenitě OspC proteinů mezi kmeny Borrelia lymské nemoci se předpokládalo, že imunizace OspC zjednoho kmene nemusí chránit proti infekci širokým rozmezím izolátů Borrelia lymské nemoci. Byla zjištěna potřeba vyhodnotit tento předpoklad založený na studiích zkřížené ochrany (příklad 6). Na základě těchto studií je zřejmé, že vakcína založená na OspC by měla obsahovat několik serologicky rozdílných forem OspC. Předpokladem prostředku takové násobné OspC vakcíny je znalost stupně rozdílnosti různých forem OspC a toho, jak spolu tyto rozdílné formy souvisejí. Tato informace se pak aplikuje podle tohoto vynálezu při vývoji nových vakcínových prostředků proti lymské nemoci, kterou způsobuje Borrelia.

První stupeň, který vede k získání potřebné informace, byl vývoj typizačního systému založeného na monoklonální protilátce (příklad 1) pro charakterizování OspC proteinů z různých kmenů Borrelia způsobující lymskou nemoc. Aby se zajistilo, že se bude analyzovat nejširší rozmezí OspC proteinů, byl studován velký počet kmenů Borrelia způsobující lymskou nemoc (tj. bylo vybráno 62 z 82 kmenů uvedených na obrázku 1 jako produkující dostatek OspC, což umožňuje rozumnou charakterizaci) z různých geografických míst a izolovaných z lidí (například kůže, mozkomíšní kapaliny a krve), zvířat a klíšťat. Jiným klíčovým aspektem této analýzy bylo použití velkého počtu monoklonálních protilátek specifických na OspC (v tomto příkladu 25), které byly produkovány nejenom na jeden OspC protein, ale na šest různých OspC proteinů, čímž se zvyšuje rozmanitost OspC epitopů schopných být rozpoznáván a tedy se zvyšuje účinnost rozlišovat různé OspC proteiny. Data získaná touto analýzou jasně ukázala, že existuje velký stupeň serologické homogenity mezi OspC proteiny z různých zdrojů. Příklady těchto reakčních sestav 16 různých typů, nebo serovarů, OspC, které byly identifikovány ve sbírce 13

-7CZ 289212 B6 monoklonálních protilátek, jsou uvedeny na obrázku 6.12 kmenů bylo netypizovatelných, jelikož nereagovaly s žádnou z monoklonálních protilátek.

I když typizace OspC serologickými prostředky byla vysoce efektivní, nebyla však úplná, jelikož vyžaduje jak to, že OspC je exprimován jako hlavní protein, tak to, zeje dostupná řada protilátek s širokým rozmezím specifičností. Z výsledků serovarové analýzy bylo jasné, že úplné spektrum antigenové rozmanitosti nebylo detegováno použitými monoklonálními protilátkami, i když byly vybrány tak, aby se tento problém minimalizoval. Heterogenita OspC byla proto dále studována analyzováním polymorfie délek restrikčních fragmentů (RFLP), ke které dochází u ospC genu (příklad 3). Analýza dat 82 kmenů (tj. experimentální data ze všech 77 kmenů v naší sbírce kultur plus informace odvozené z 5 publikovaných ospC sekvencí; viz obrázek 1) odhalily přítomnost 35 různých RFLP ospC typů. I když tento způsob deteguje více variací než je zřejmé ze serovarového typizování, mezi výsledky získanými těmito dvěma způsoby existuje mimořádně dobrá shora (obrázek 12).

Klasifikace kmenů Borrelia na serovary a RFLP-typy podle jejich OspC proteinu nebo genu umožňuje podle tohoto vynálezu zvolit pro podrobnější charakterizaci omezený počet OspC variant, které jsou representativní pro populaci jako celek. Byl tedy vybrán panel 29 kmenů obsahující jednoho nebo více představitelů každého z nejčastěji přítomných OspC typů. OspC gen byl amplifikován PCR a byla stanovena nukleotidová a odvozená aminokyselinová sekvence (viz příklad 4). Aminokyselinová sekvence maturovaného OspC proteinu (od cysteinu 19; viz USA patentová přihláška č. 07/903 580, shora zde uvedené jako odkaz) bez posledních 16 aminokyselin byla použita pro stanovení vzájemného vztahu mezi OspC proteiny různých OspC serovarů/RFLP-typů.

Jako další kontrola platnosti typizačních systémů a pro zjištění, jestliže existuje další heterogenita v daném OspC typu, byl zkoumán vzájemný vztah mezi blízce příbuznými OspC proteiny od stejného OspC typu. Nukleotidová a odvozená aminokyselinová sekvence OspC proteinů z 24 kmenů jsou uvedeny na obrázcích 8 a 9 (tj. 22 sekvencí z této studie a 2 publikované sekvence pro kmeny 2591 a PBI). Dendrogram ukazující fylogenetický vzájemný vztah mezi OspC proteinem je uveden na obrázku 10.

Imunogen založený na OspC antigenu podle tohoto vynálezu obsahuje směs různých serologických forem přirozeně se vyskytujícího OspC proteinu. V jiném provedení podle vynálezu imunogenní prostředek obsahuje Osp varianty nebo OspC mimetika OspC antigenů. Vedle OspC proteinu získaného z buněk Borrelia lymské nemoci, jak shora popsáno, se tedy mohou používat rekombinantní OspC varianty přirozeně se vyskytující molekuly („OspC varianty“) a „mimetika“ - sloučeniny, které mají mimotypy, které napodobují ospC epitopy.

Do kategorie OspC variant patří například oligopeptidy a polypeptidy odpovídající imunogenním částem OspC molekuly a jakékoliv ne-proteinové imunogenní části OspC molekuly. Varianta je tedy myšlena tak, že zahrnuje polypeptid, který je homologní s přírodní OspC molekulou a zachovává si nápadné imunologické vlastnosti přírodní OspC molekuly. V tomto smyslu „homologie“ mezi dvěma sekvencemi zahrnuje podobnost krátké identity indikující odvození první sekvence od druhé. Například polypeptid je „homologní“ sOspC, jestliže obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která odpovídá epitopu rozpoznávanému OspC specifickými protilátkami nebo T-buňkami. Taková sekvence může být dlouhá pouze několik aminokyselin a může být lineární determinantou nebo sekvencí, která vznikne, jestliže aminokyseliny z oddělených částí lineární sekvence jsou prostorově postaveny vedle sebe za proteinovým vinutím nebo po tom, co jsou podrobeny modifikaci kovalentní vazby. Aminokyselinové sekvence, které jsou antigenními determinantami pro účely podle tohoto vynálezu, mohou být stanoveny například technikou analýzy monoklonálního mapování, která je známa odborníkům v oblasti techniky. Viz Regenmortel: Immunology Today 10, 266 (1989) a Berzofsky a spol.: Immunological Reviews 98, 9 (1987). Například podle tohoto vynálezu OspC antigen obsahuje jednu nebo více z následujících sekvencí aminokyselin (obrázek 13)

-8CZ 289212 B6

1) VKLSESVASLSKAA (sekv. id. č. 53),

2) TDNDSKEAILKTNGT (sekv. id. č. 54),

3) KELTSPWAETPKKP (sekv. id. č. 55),

4) FVLAVKEVETL (sekv. id. č. 56),

5) YAISTLITEKLKAL (sekv. id. č. 57),

6) PNLTEISKKITDSNA (sekv. id č. 58),

7) ASANSVKELTSPVV (sekv. id. č. 59),

8) SPVVAETPKKP (sekv. id. č. 60),

9) GKKIQQNNGLGA (sekv. id. č. 61) a

10) SPWAESPKK (sekv. id. č. 62) nebo varianty nebo mimetika shora uvedených sekvencí epitopů.

Ve výhodném provedení by vakcína obsahovala peptidy odpovídající serotypově specifickým epitopům vybraným z jednoho nebo více zde popsaných OspC proteinů zOspC skupin. Studie zkřížené ochrany (příklad 6) ukazují, že ochranná imunita je indukována serotypově specifickými epitopy. Příkladem serotypově specifického epitopu je sekvence číslo 2 z kmene Orth (viz shora), který je rozpoznáván monoklonálními protilátkami BBM38 a BBM39, které jsou specifické pro OspC proteiny zOspC skupiny5 (serovar 4). Tento epitop odpovídá domnělému epitopu (DNDSKE) předpovězenému z analýzy hydrofilnosti Orth OspC. Lze pravděpodobně předpovědět, že potenciální serotypově specifické epitopy se vyskytují mezi aminokyselinovými zbytky 120 až 155 (počínaje od prvního cysteinového zbytku) v OspC proteinech z jiných OspC skupin (příklad 4). Taková vakcína může zahrnovat varianty nebo mimetika peptidových sekvencí jak dále popsáno. Testování podobnosti tohoto typu lze provádět také studií kompetitivní inhibice v případě protilátek nebo proliferaci T-buňkami.

Polypeptidy, které se kvalifikují jako OspC varianty podle těchto kriterií, se mohou připravovat podle tohoto vynálezu konvenčními reverzními genetickými způsoby, tj. navržením genetické sekvence založené na aminokyselinové sekvenci, nebo konvenčními genetickými střihovými způsoby. Například OspC varianty se mohou produkovat technikami, které zahrnují místně řízenou mutagenesi nebo oligonukleotidem řízenou mutagenesi. Viz například „Mutagenesis of Cloned DNA“ v Current Protocols in Molecular Biology“ 8.0.3 a násl. (Ausubel a spol., red., 1989) („Ausubel“).

Jinými OspC variantami v tomto vynálezu jsou molekuly, které odpovídají části OspC nebo které obsahují část OspC, ale nesouhlasí s přírodní molekulou, a které vykazují imunogenní aktivitu OspC, jestliže jsou přítomny samotné nebo také jestliže jsou napojeny na nosič. OspC varianta tohoto druhu by mohla být representována skutečným fragmentem přirozené molekuly nebo by mohla znamenat polypeptid, který je syntetizován de novo nebo rekombinantně.

Pro použití v rekombinantní expresi OspC nebo OspC varianty by polynukleotidová molekula kódující takovou molekulu s výhodou obsahovala sekvenci nukleotidů odpovídající žádané aminokyselinové sekvenci, která je optimalizována pro zvoleného hostitele, pokud jde o použitý kodon, iniciaci translace a expresi komerčně užitečných množství OspC nebo žádané OspC varianty. Vektor vybraný pro transformování zvoleného hostitelského organismu takovou polynukleotidovou molekulou by měl také umožňovat účinné zachování a transkripci sekvence kódující polypeptid. Kódující polynukleotidová molekula může kódovat chimemí protein, to znamená, že může mít nukleotídovou sekvenci kódující imunologickou část OspC molekuly odštěpitelně napojenou na kódující sekvenci ne-OspC části, jako je signální peptid pro hostitelskou buňku.

Pro izolování DNA segmentu, který kóduje OspC molekulu se podle publikovaných způsobů připraví celková DNA Borrelie způsobující lymskou nemoc. Viz například Maniatis a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, NY 1982) a Baess:

-9CZ 289212 B6

Acta Pathol. Microbiol. Scand. (Séct. B) 82. 780 (1974). Takto získaná DNA se může částečně rozštěpit restrikčním enzymem. Získá se víceméně náhodná sestava genomových fragmentů. Pro tento účel je vhodný enzym s tetranukleotidovým rozpoznávacím místem, jako je Sau3A (Mbol). Fragmenty z tohoto částečného štěpení se pak mohou frakcionovat podle velikosti, například odstřeďováním sacharosovým gradientem (viz Maniatis: shora) nebo elektroforesou na gelu s pulzním polem, viz Anal. Trends in Genetics (listopad 1986), str. 278. Získají se tak fragmenty s délkou, která je srovnatelná s DNA kódující OspC molekulu.

Podle dobře známých popsaných způsobů, například v Ausubelovi na 5.0.1 a násl., mohou být vybrané fragmenty klonovány do vhodného klonovacího vektoru. Takto získaná DNA by se pak mohla vložit například do místa BamHI klonovacího vektoru pUC18. Chimemí plazmidy nebo fág, mimo jiné, produkované napojením fragmentů vybraných velikosti na klonovací vektor, se pak mohou transformovat do E. coli nebo jiných hostitelských buněk, kde jsou testovány na expresi kódovaného proteinu. Pro prohledávání knihoven se mohou použít rozmanité způsoby, kterými se identifikuje klon obsahující OspC gen. Mezi tyto způsoby patří prohledávání hybridizační sondou specifickou pro OspC, jako je oligonukleotidová sonda, nebo vyhledávání exprese OspC antigenu pomocí imunologického činidla specifického pro OspC. Poslední lze provádět imunoblotováním knihovny anti-OspC monoklonálními protilátkami nebo specifickou polyklonální protilátkou připravenou ze živočichů imunizovaných vyčištěným OspC. Jakmile je jednou klon obsahující DNA kódující OspC v knihovně identifikován, může se izolovat DNA, plně charakterizovat oblast kódující OspC protein (jako je sekvenování) a následně lze DNA použít pro přípravu ospC expresních vektorů vhodných pro přípravu OspC-aktivního proteinu.

Jak bylo shora uvedeno, pro získání efektivního imunogenu by měla být struktura rekombinantně exprimovaného pC proteinu dostatečně podobná struktuře přírodního (nedenaturovaného) OspC tak, aby protein indukoval produkci ochranných protilátek. Je výhodné exprimovat DNA kódující OspC takovým způsobem, že se při tom vyhneme intracelulámí proteolyse a agregaci expresního produktu v denaturované formě. Jedním způsobem, jak se tomuto problému vyhnout, je rekombinantně produkovat pC v systému hostitel-vektor, který poskytuje sekreci pC z hostitelských buňky, s výhodou přímo do kultivačního média. Jedním takovým systémem je Bacillus subtilis. Lze zkonstruovat vhodný sekreční vektor pro B. subtilis navázáním signální sekvence B. amyloliguefaciens α-amylázy, viz Young a spol.: Nucleic Acid Res. 11, 237 (1983), na Bacillus plazmidový vektor pUBllO, jak popsal Ulmanen a spol.: J. Bacteriol. 162, 176 (1985). Podle tohoto přístupu se sekvence kódující cizí protein klonuje po směru vlákna promotoru a ribosomového vazebného místa a signální sekvence α-amylázy. Transkripce a translace OspC je pod kontrolou α-amylázového promotoru translační mašinérie této konstrukce. Sekrece pC z hostitelské buňky se dosáhne α-amylázovou signální sekvencí. Tento vynález zahrnuje expresní vektory, které jsou funkční v prokaryotech stejně jako v eukaryotech. Byly popsány podobné vektory pro použití v kvasinkách. Těmito vektory lze dosáhnout expresní sekrece OspC v kvasinkách. Vhodný expresní vektor lze zkonstruovat navázáním sekvence kódující OspC na indukovatelný promotor v kvasinkovém replikačním plazmidu. Podle tohoto přístupu se sekvence kódující cizí protein klonuje po směru vlákna např. AOX-1 promotoru. Transkripci a translaci lze indukovat přidáním methanolu ke kultivačnímu médiu. Lze získat buď intracelulámí expresi, nebo sekreci cizího proteinu (navázáním signální sekvence na kódující sekvenci maturovaného proteinu). Výhodným kvasinkovým kmenem je Pichia pastoris. U kvasinek, zvláště P. Pastoris, byly získány vysoké výtěžky expresních produktů.

Jiným způsobem exprimování OspC v systému hostitel-vektor, který se vyhýbá proteolyse, agregaci a denaturaci, je použití viru vakcinie jako vektoru schopného exprese v rozmanitých savčích hostitelských buňkách citlivých na infekci vakcinií. Tento přístup by vyžadoval připravení rekombinantního vektoru odvozeného od viru vakcinie, v němž je pC gen umístěn pod kontrolu promotoru, spolu se signály translace a sekrece vhodných pro exprimování OspC proteinu v hostiteli infikovaném vakcinií. Jak je to popsáno v USA patentu č. 4 603 112, jehož obsah je zde zahrnut jako odkaz, tento plazmid by obsahoval také 5' k oblastem kontroly

-10CZ 289212 B6 transkripce a 3' k 3' signálům terminace a polyadenylace, obklopující sekvence, které přispívají k homologní rekombinací v genomu vakcinie divokého typu. Jestliže se do hostitelské buňky infikované vakcinii zavede konstrukce tohoto druhu, obklopující sekvence řídí rekombinací mezi plazmidovým vektorem a virem vakcinie s tím výsledkem, že klonovaná strukturní sekvence (zde kódující OspC) se stává její součástí, množí se a je exprimována virem vakcinie. Oblast mezi obklopujícími sekvencemi s výhodou obsahuje také selektovatelný markér, takový, že v přítomnosti selekčního media přežijí pouze ty buňky, které obsahují rekombinovaný virus vakcinie (a v této souvislosti sekvenci kódující polypeptid s aktivním OspC).

Rekombinantní virus vakcinie produkovaný tímto způsobem lze použít k infikování savčích buněk, jako jsou buňky Věro nebo buňky CV1, vhodných pro fermentační růst s vysokou hustotou. OspC-aktivní protein exprimovaný v těchto buňkách během fermentace by měl být sekretován do fermentačního média, z něhož by byl vyčištěn konvenčními způsoby.

Vedle přírodního OspC a OspC variant zahrnuje tento vynález sloučeniny („mimetika“), které napodobují OspC epitopy („mimotopy“). Jedním příkladem mimetika je anti-idiotypová protilátka, to jest protilátka, která je produkována imunizováním živočicha protilátkou, která se specificky váže na epitop na antigenu. Antiidiotypová protilátka rozpoznává a odpovídá spojenému místu na první protilátce. Tvar tohoto místa spojení proto blízce připomíná epitop, který padne do spojovacího místa první protilátky. Jelikož antiidiotypová protilátka má místo spojení, jehož tvar napodobuje původní antigen, může být používána jako vakcína pro vznik protilátek, které reagují s původním antigenem. Viz Fineberg a Ertl: CRC Critical Reviews in Immunology 7, 269 (1987). Příslušná mimetika lze identifikovat testováním pomocí OspC protilátky, která deteguje, která sloučeniny se na ni vážou nebo by mohly být produkovány molekulárním modelováním. Viz Morgan a spol.: „Approaches to the Discovery of Non-Peptide Ligands for Peptide Receptors and Peptidases“ vAnnual Reports in Medicinal Chemistry (Academie Press 1989), str. 243 a další.

Vakcína podle tohoto vynálezu je určena pro imunizaci živočicha včetně člověka, který je na ni vnímavý, proti lymské nemoci. Pojem „imunogen“ znamená antigen, který vyvolává specifickou imunitní odpověď vedoucí k humorální nebo buňkami zprostředkované imunitě, v tomto případě na infekci Borrelií. „Imunita“ tedy znamená schopnost jednotlivce snáze odolávat nebo překonávat infekci při srovnání s jednotlivci, kteří nejsou imunizováni, nebo snášet infekci bez toho, aby byli klinicky ovlivněni.

Imunogen podle tohoto vynálezu může dále obsahovat přijatelný fyziologický nosič. Takové nosiče jsou velmi dobře známy v oblasti techniky. Patří mezi ně makromolekulám! nosiče. Mezi příklady vhodných nosičů pro savce patří tuberkulinový PPD, hovězí sérový albumin, ovalbumin nebo KLC (keyhole limpet hemocyanin). Nosič by měl být s výhodou netoxický a nealergenní.

Imunogen může dále obsahovat pomocné činidlo, jako je hlinitá sloučenina, voda, emulze rostlinných nebo minerálních olejů (např. Freundův adjuvant), liposomy, ISCOM (imunostimulační komplex), ve vodě nerozpustná skla, polyanionty (jako je póly A:U, dextransulfát nebo lentinam), netoxické analogy Iipopolysacharidů, muramyldipeptid a imunomodulační sloučeniny (například interleukiny 1 a 2) nebo jejich kombinace. Výhodným pomocným činidlem je hydroxid hlinitý. Imunogeničnost může být zvýšena také u těch savců, kteří dostali živé oslabené bakteriální vektory, jako je Salmonella nebo Mycobacteria, nebo virové vektory podobné vakcinii, které exprimují OspC aktivní polypeptid.

Způsoby přípravy takových imunogenů jsou v oblasti techniky dobře známy. Například imunogen podle tohoto vynálezu může být lyofilizován pro následnou rehydrataci ve fyziologicky přijatelném excipientu, jako je solný nebo jiný fyziologický roztok. V každém případě se vakcína podle tohoto vynálezu připravuje smícháním imunologicky efektivního množství OspC s excipientem v takovém množství, které vede k žádoucí koncentraci imunogenicky účinné složky vakcíny. Množství imunogenicky účinné složky ve vakcíně bude záviset na savci, který je imunizován, při čemž se bere v úvahu věk a hmotnost subjektu stejně

-11CZ 289212 B6 jako imunogeničnost imunogenní složky přítomné ve vakcíně. Ve většině případů bude množství imunogenní složky vakcíny v rozmezí od 1 do 100 pg na antigen na dávku, s výhodou od 10 do mg na antigen na dávku.

V ještě jiném provedení podle vynálezu imunogenní prostředek sestává z jednoho nebo více OspC antigenů, OspC variant, OspC mimetik nebo OspC antigenů v podstatě vyčištěných z každé z OspC skupin na obrázku 11 exprimovaných klony a klonovými klastry souvisejícími s lidským onemocněním, jak je to popsáno v příkladu 1.

Tento vynález tedy podle nároků 1 až 3 zahrnuje imunogenní prostředky OspC antigenů Borrelia lymské nemoci sestávajících z jednoho nebo více, s výhodou dvou nebo více OspC antigenů z 20 běžně rozpoznávaných OspC skupin, jako je to uvedeno na obrázku 11, nebo jeden nebo více OspC antigenů z každé z 20 běžně rozpoznávaných OspC skupin na obrázku 11. Místo shora uvedených OspC antigenů může tato kombinace obsahovat OspC varianty nebo OspC mimetika uvedených OspC antigenů, OspC varianty nebo OspC mimetika, která mají takovou strukturu, která je dostatečně podobná přírodnímu OspC, aby indukovaly ochranu ochrannými protilátkami. Obrázek 11 ukazuje sekvence podstatných epitopů. Podle tohoto vynálezu sem patří OspC antigeny, které obsahují jeden nebo více takových epitopů. Tyto antigeny nebo polypeptidy podle tohoto vynálezu tedy obsahují alespoň epitopovou sekvenci, která je uvedena na obrázku 13. Tato epitopová sekvence může být tak krátká, jako je aminokyselinová sekvence uvedená v závorkách na obrázku 13.

Jako další provedení tento vynález obsahuje také imunogenní prostředky, které obsahují buď jeden, nebo více, s výhodou dva nebo více, OspC antigenů OspC skupin na obrázku 19 nebo jeden nebo více antigenů z každé OspC skupiny na obrázku 19. Tyto imunogenní prostředky odpovídají patentovým nárokům 4 až 6.

V jiném provedení se připravuje imunogenní prostředek pro chránění proti kmenům Borrelia způsobujícím lymskou nemoc převládající v příslušné geografické oblasti. V jednom provedení se tedy připravuje vakcína, která s výhodou chrání proti takovým kmenům Borrelia způsobujícím lymskou nemoc, které nejvíce převládají v Severní Americe. V jiném provedení se připravuje vakcína, která s výhodou chrání proti takovým kmenům Borrelia způsobujícím lymskou nemoc, které nejvíce převládají v Evropě. V třetím provedení se připravuje vakcína proti takovým kmenům Borrelia způsobujícím lymskou nemoc, které nejvíce převládají v Rakousku. Vakcínové prostředky pro každou z těchto geografických oblastí jsou uvedeny na obrázku 7.

Vedle OspC vakcínových prostředků se uvažuje také o kombinované OspA/OspC vakcíně, protože tato vakcína může být lepší než vakcína připravená s každým antigenem samostatně: za prvé proto, že kmeny Borrelia způsobující lymskou nemoc nemusejí vždy exprimovat jeden nebo druhý z těchto antigenů, ale vždy exprimují buď OspA, nebo OspC, za druhé, bylo popsáno, že existuje nepřímo úměrná regulace těchto dvou antigenů, tj. taková, že jestliže je exprese jednoho snížena (např. jako odpověď na imunitní odpověď), exprese druhého je zvýšena, za třetí, alespoň u in vitro studií s OspA bylo ukázáno, že mohou vznikat mutanty, které unikají vakcíně. Existuje tedy problém, který lze obejít zahrnutím druhého antigenů do vakcíny, protože dvojitá mutační událost u dvou nezávislých antigenů je mimořádně nepravděpodobná, za čtvrté, imunitní odpověď očkovaných na daný antigen není jednotná. Zahrnutím dvou antigenů se zvyšuje pravděpodobnost, že jednotlivec, který špatně odpovídá buď na OspA, nebo na OspC, by nicméně byl chráněn vyvoláním ochranné odpovědi na jiný antigen.

A konečně, očekává se, že by mohl existovat synergický efekt a že by se vakcínou, která obsahuje OspA i OspC, mohla získat silnější imunita.

-12CZ 289212 B6

Podle jednoho provedení by se jeden nebo více OspC proteinů z OspC skupin 1 až 20 mohl(y) zkombinovat s jedním nebo více OspA proteiny, jak jsou exprimovány Borrelia kmeny B31,

Orth, H4aKLll.

Podle jiného provedení kombinovaná OspA/OspC vakcína pro Spojené státy obsahuje Osp z OspC skupiny 2 a 3 společně sOspA exprimovány kmeny B31. Podle dalšího provedení kombinovaná OspA/OspC vakcína pro použití v Evropě obsahuje 14 OspC z OspC skupin 2, 4 až 7, 9, 10, 12, 13, 14, 15 až 17 a 19 společně sOspA exprimovanými kmeny B31, Orth, H4 a KLI 1. Podle dalšího provedení kombinovaná OspA/OspC vakcína pro Rakousko obsahuje OspC ze skupin 2,4 až 7,10,13 a 19.

Tento vynález zahrnuje také použití kombinace antigenů, jak jsou obsaženy ve shora uvedených imunogenních prostředcích, pro výrobu vakcíny pro léčení nebo předcházení lymské boreliosy u savců. Výhodným provedením této vakcíny je vakcína použitelná pro člověka.

Způsoby přípravy vakcín podle tohoto vynálezu jsou navrženy tak, aby zajistily, že je zachována identita a imunologické účinky specifických molekul a že nejsou zavedeny žádné nechtěné mikrobiální znečištěniny. Konečné produkty se distribuují a uchovávají za aseptických podmínek. Způsob imunizování savce proti lymské nemoci zahrnuje podávání efektivního množství imunogenu tomuto savci. Podávání se může provádět jakýmkoliv způsobem známým z oblasti techniky. Mezi vhodné způsoby podávání patří například podávání shora popsané vakcíny savcům, o kterých je známo, že budou vystaveni působení klíšťat nesoucích Borrelia, způsobující lymskou nemoc, přibližně 6 měsíců až 1 rok před dobou předpokládaného styku s tímto klíštětem. Může se použít jakákoliv imunizační cesta, o které se předpokládá, že vede nebo která vede k vyvolání příslušné imunitní odpovědí podle tohoto vynálezu, i když výhodným je parenterální podávání. Mezi vhodné formy podávání patří subkutánní, intrakutánní nebo intramuskulámí injekce nebo prostředky vhodné pro orální, nazální nebo rektální podávání.

Pojem „v podstatě vyčištěný“ znamená homogenní protein, který neobsahuje jakékoliv toxické složky, čímž se snižuje pravděpodobnost nepříznivé reakce. Pojem „homogenní“ v této souvislosti znamená, že alespoň 80 % (hmotn. kobj. dílům) proteinu znamená plně neporušený OspC a téměř veškerý zbytek znamená rozkladné produkty OspC. Jestliže jsou tedy přítomny nečistoty jako složky prostředí a další Borrelia proteiny, potom pouze ve stopových množstvích. Homogenní OspC může sestávat z více než jedné serologické formy OspC.

Tímto způsobem tento vynález umožňuje odstranění nechtěných, potenciálně imunogenních proteinů, které by mohly indukovat protilátky a způsobit škodlivé autoimunní reakce v imunizovaném savci. Shora popsaný způsob čištění zajišťuje také reprodukovatelnost přípravy vakcíny.

Výhodný způsob čištění zahrnuje následující stupně:

a) rozrušení buněk Borrelia, které způsobují lymskou nemoc, a frakcionaci odstřeďování na „membránové“ a „cytoplasmové“ složky,

b) extrakci membránové frakce nedenaturujícím detergentním činidlem a následné odstřeďování za získání supematantu, který obsahuje solubilizovaný protein, při čemž se nerozpustný materiál odstraní jako peleta, a

c) frakcionace solubilizovaného antigenů chromatografií na ionexu (diethylaminoethylový nebo „DEAE“) a eluování adsorbovaných antigenů gradientem chloridu sodného.

Způsob čištění může zahrnovat zahušťování a další čištění antigenů:

-13CZ 289212 B6

a) chromatografií na hydroxylapatitu, při čemž adsorbované antigeny jsou eluovány zvyšujícím se obsahem fosforečnanu v pufru, a/nebo

b) afinitní chromatografií na imobilizovaném kovu, při čemž adsorbované antigeny jsou eluovány imidazolem.

Mezi další eluční způsoby známé v oblasti techniky patří eluce snížením pH nebo zvyšující se koncentrací chloridu amonného, histidinu nebo jiné látky s afinitou na chelatovaný kov.

Rozbití buněk se může provést lyžováním buněk tím, že se třepou jako suspenze v buněčném mlýnu s malinkými skleněnými perličkami, působením ultrazvuku nebo ve francouzském mlýnu. Antigeny se mohou také extrahovat přímo z povrchu buněk mikroorganismu tím, že se buňky vystaví působení detergentního činidla, změnou iontové síly buněčného prostředí nebo mírným posunem teploty. Může se také použít výchozí materiál obsažený v záhybech membrán, který se uvolňuje z buněk.

Extrakce membránové frakce se provádí detergentním činidlem, které má s výhodou dobré solubilizační vlastnosti, je nedenaturující a je slučitelné s chromatografií na ionexu. Výhodným detergentním činidlem je obojetné detergentní činidlo 3-14 vyráběné Calbiochem, i když lze použít jakékoliv detergentní činidlo nebo organické rozpouštědlo, které má shora uvedené vlastnosti. Detergentní činidlo se typicky používá v koncentraci 1 % (hmotn. kobj. dílům). Je však možné používat ho v rozmezí od 0,01 do 10 % (hmotn. k obj. dílům). Extrakce detergentním činidlem se provádí za teploty v rozmezí od 0 do 60 °C,.s výhodou při 37 °C, a měla by trvat od 10 minut do 8 h, s výhodou 1 h. Vedle detergentního činidla se pro zlepšení procesu solubilizace mohou používat chaotropní činidla, jako je močovina.

Antigeny solubilizované detergentním činidlem se pak frakcionují DEAE-chromatografií. S výhodou se používá DEAE ionexová pryskyřice, mohou se však používat jiné anexové nebo katexové pryskyřice nebo jejich kombinace. Podle tohoto vynálezu ionexová pryskyřice obsahuje nerozpustnou matrici, na níž se nekondenzují nabité skupiny. Mezi funkční skupiny, které se používají vanexech, patří aminoethylová (AE), diethylaminoethylová (DEAE) a kvartemí aminoethylová (QAE) skupina. Katexy mohou mít karboxymethylovou (CM), fosfo- nebo sulfopropylovou (SP) skupinu. I když se vzorky nanášejí na kolonu v Tris pufru obsahujícím obojetné detergentní činidlo 3-14 (1 %) a antigeny se eluují gradientem chloridu sodného, mohou být stejně účinné i jiné prostředky.

Antigeny se mohou zahušťovat navázáním na hydroxylapatit podle způsobů dobře známých v oblasti techniky. Jiným nebo doplňkovým postupem, podle kterého se mohou antigeny dále zahustit/vyčistit, je afinitní chromatografie na imobilizovaném kovu. Tento způsob je výhodný pro chromatografii na hydroxylapatitu při čištění OspC, protože se dosáhne lepšího oddělení OspA od OspB.

Výhoda shora popsaného nedenaturujícího čisticího postupu je vtom, že se zachovává trojrozměrná konformace proteinu, čímž se uchovávají všechna kombinující místa protilátky nacházející se v přírodním proteinu včetně těch, která fungují při ochraně. Jestliže je protein denaturován, vazebná místa mohou být částečně nebo úplně zničena a kapacita antigenu indukovat protilátky proti antigenním místům bude pak odpovídajícím způsobem snížena. Takto změněné proteiny by pak byly nežádoucí pro použití ve vakcínách.

Tento vynález dále zahrnuje rekombinantní prostředek nových OspC antigenů, jak jsou uvedeny na obrázku 9a. Tento vynález zahrnuje také nové DNA sekvence kódující OspC antigeny podle obrázku 9a. Tyto DNA sekvence jsou uvedeny na obrázku 8a. Tento vynález zahrnuje také ty DNA sekvence, které mají alespoň 80% homologii s jakoukoliv sekvencí na obrázku 8a.

-14CZ 289212 B6

Tento vynález zahrnuje také rekombinantní expresní vektory v prokaryotických a eukaryotických hostitelských buňkách, zvláště expresní vektory použitelné v kvasinkách, s výhodou Pichia pastoris. Podle výhodného provedení podle vynálezu je expresní vektor indukovatelný methanolem.

Tento vynález zahrnuje nové OspC antigeny jako jsou i) antigeny kódované kteroukoliv sekvencí na obrázku 8a nebo ii) antigeny mající alespoň 80% homologii s kteroukoliv aminokyselinovou sekvencí na obrázku 9a.

Tento vynález je podrobněji popsán následujícími příklady, které jsou ilustrativní a v žádném případě nejsou zamýšleny jako omezení rozsahu tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

CMAT typizování kmenů Borrelia burgdorferi a klastrová analýza výsledků, které umožňují objasnění CMAT klastrů, CMAT skupin a klonů a klonových klastrů „souvisejících s onemocněním lidí“.

Z četných zdrojů, jejichž seznam je uveden na obrázku 2, bylo získáno 77 kmenů (viz obrázek 1). Péče byla věnováno tomu, aby sbírka obsahovala kmeny různého geografického původu a z tak mnoha různých epidemiologických a klinických situací, jak je to jen možné.

Ze všech kmenů byly připraveny membránové frakce následujícím způsobem:

Buňky Borrelia způsobující lymskou nemoc byly získány odstřeďováním (7000 xG, 20 minut, 4 °C), buněčná peleta byla dvakrát promyta PBS obsahujícím 5mM MgCl₂ a byla stanovena suchá hmotnost buněk. Promyté buňky byly pak lyžovány třepáním směsi v buněčném mlýnu Vibrogen (model V14, Buhler). Tříminutové cykly třepání s chlazením (4 °C) se opakují tak dlouho, dokud lyže není větší než 99 %, podle vyhodnocení mikroskopií v tmavém poli. Lyzát se pak zfiltruje filtrem ze sintrovaného skla, aby se odstranily skleněné perličky. Zadržené perličky se promyjí pufrem, aby se zvýšil výtěžek bakteriálních antigenů ve filtrátu. Lyzát se pak odstřeďuje 20 minut při 7500 x G při 4 °C. Získá se surová membránová frakce označená membránová frakce 2 nebo „lsp“ (peleta získaná při nízké rychlosti, low speed pellet) frakce. Supematant se dále odstřeďuje 30 minut při 100 000 x G při 4 °C. Získá se tak čistší membránová frakce označená membránová frakce 1 nebo „hsp“ (peleta získaná při vysoké (high) rychlosti). Obě membránové frakce se dvakrát promyjí lOOmM Tris-HCl pufrem, pH7,4, za původních podmínek odstřeďování. Membránová frakce 2 se použije pro typizování, zatímco membránové frakce 1 se uchovají pro čištění antigenů.

Membránové proteiny přítomné v membránových frakcích 2 každého kmene se pak analyzují SDS-PAGE, jak popsal Laemmli U.K.: Nátuře (London) 227. 680 (1970). Variace v molekulové hmotnosti byly stanoveny srovnáním s elektroforetickou pohyblivostí řady standardních proteinů pokrývajících rozmezí molekulových hmotností plného spektra markérů membránových antigenů použitých v analýze.

Antigeny se přenesou na nitrocelulosový filtr a identifikují se panelem monoklonálních protilátek, například způsoby imunoblotování dobře známými v oblasti techniky. Ausubel a spol.: 2Current Protocols in Molecular Biology 10.8.1 a násl. (1992). Monoklonální protilátky se připravují dobře známou technologií hybridomů, viz Kohler a Millstein: Nátuře 256. 495 (1975). Ve výhodném provedení tohoto vynálezu se analyzují kmeny uvedené na obrázku 1. Obecně platí, že výběr membránového antigenů pro zahrnutí do analýzy je dán a) dostupností monoklonálních protilátek je detegovat a rozlišit je od četných jiných antigenů přítomných

-15CZ 289212 B6 v SDS-PAGE profilech membránových antigenů bakteriálních kmenů, b) antigenem, o který se jedná, přítomným ve významném podílu analyzovaných kmenů, tj. obecným antigenem, c) skutečností, že může být reprodukovatelně detegován ve více, odděleně připravených, membránových frakcích stejného kmene, tj. neexistuje žádný důkaz pro intra-kmenovou variaci příslušného antigenu, d) skutečností, že antigenový markér je stabilně exprimován ve stejném izolátu po násobné kultivaci a pasážování a po značné době skladování (až dva roky) a e) chybějícím důkazem v publikované vědecké literatuře, že geny kódující markéry jsou extrachromosomálně děděny nebo že variace antigenů byly pod specifickým mechanismem antigenové variace, která vede k intra-kmenové variaci.

Obrázek 3 ukazuje monoklonální protilátky použité pro identifikaci 9 obvyklých membránových antigenů použitých v analýze (E90, E60, E59, E43, Fla, E29, E22 antigeny, kombinovaný antigen E18 + E20 a E10 antigen). Tyto antigeny jsou seřazeny podle molekulové hmotnosti a v případě, v němž existuje více než jedna monoklonální protilátka, jejich nepatrně se lišící reaktivitou (například E60 a E43) podle reakční sestavy antigenu s monoklonálními protilátkami.

Obrázek 4 uvádí seznam všech jedinečných kombinací 9 skóre nalezených pro analyzované kmeny, které jsou representovány devítimístným číslem. Toto devítimístné číslo je pak považováno za obvyklý typ membránového antigenu (CMAT) tohoto kmene. Pro stanovení vzájemného vztahu mezi všemi pozorovanými CMAT byla provedena klastrová analýza. Tato analýza byla provedena stanovením genetické odlišnosti každého antigenu a stanovením nevážené nepodobnosti matrice vypočtené z dat všech jedinečných CMAT. Nepřítomnost skóre jednotlivých obvyklých antigenů byla brána tak, jako kdyby tato data chyběla. Vytvořená matrice byla podrobena klastrové analýze navázáním způsobem skupiny váženého páru použitím aritmetických průměrů (Sneath a Sokal, viz výše) na osobním počítači kompatibilním s IBM s programem CSS Statistica Statsoft.

Výsledný dendrogram klastrové analýzy je uveden na obrázku 5. Tento dendrogram skutečně ukazuje, že populace Borrelia způsobující lymskou nemoc ne dobře strukturována. Vynesením vlastních hodnot, při kterých dochází ke každému klastrovému stupni, do grafu je možné vybrat nejvýhodnější hladinu, při které lze bakterie zařadit do kategorií.

Nej ideálnější místa pro rozdělení pro následující stupně klastrování jsou ty body na křivce, kde jsou hlavní skoky ve vlastních hodnotách. Jak ukazuje dendrogram na obrázku 5, dochází k tomu tam, kde je rozdíl v CMAT skóre mezi 68 a 88 %. Toto dělení dělí populaci na čtyři hlavní skupiny označené jako CMAT skupiny. Ke druhému hlavnímu skoku ve vlastních hodnotách pro postupné klastrování dochází tam, kde je rozdíl v CMAT skóre mezi 40 a 52 %. Toto dělení rozdělí každou CMAT skupinu na dva nebo tři klastry jednotlivých CMAT. Z důvodu vhodnosti byl rozdíl skóre 80 % vzat jako hladina, při níž dochází k seskupení CMAT a 50% jako hladiny, při níž dochází ke klastrování.

Z předchozího je zřejmé, že populace B. burdgorferi se může rozdělit na čtyři hlavní CMAT skupiny, každá z nich při tom sestává ze dvou až tří CMAT klastrů. Každý CMAT klastr byl sám složen z jednoho až pěti jednotlivých CMAT. Srovnání těchto výsledků s výsledky taxonomických studií strukturní analýzy jiných populací [Marconi a Garon: J. Bacteriol. 174, 241 (1992), Boerlin a spol.: Infect. Immun. 60. 1677 (1992), Baranton a spol.: Int. J. Systém Bacteriol. 42, 378 (1992).] ukazuje, že skupina CMAT 1 odpovídá genovému druhu Borrelia burgdorferi sensu stricto, že skupina CMAT 3 je ekvivalentní s Borrelia afzelii, také známa jako „skupina VS461“, a že skupiny CMAT 2 a 4 odpovídají B. garinii sp. nov. Důvod, proč CMAT analýza rozdělila genové dráhy B. garinii na dvě CMAT skupiny není jasný, ale může tomu být proto, že bylo použito méně markérů než u případu isoenzymové elektroforetické studie (Boerlin a spol.: Infect. Immun. 60. 1677 (1992).].

Jestliže si prohlédneme výskyty příslušných kmenů v každém CMAT (obrázek 5), je zřejmé, že 7 CMAT má více než jednoho reprezentanta a mohou být tedy považovány za klony, tj. kmeny

-16CZ 289212 B6 které mají obecnou příbuznost. Ve skutečnosti 67 % všech kmenů spadá právě do tří různých CMAT klonů, například CMAT 4 (klon 1:2:4) obsahuje 12 kmenů, CMAT 13 (klon 3:2:13) obsahuje 23 kmenů a CMAT 18 (klon 4:2:18) 15 kmenů. Je pozoruhodné, že bylo zjištěno, že 76 % (31 z 41) analyzovaných lidských izolátů je distribuováno mezi tyto tři hlavní kmeny. Dále pak, jestliže se CMAT 17, 18, 20 a 22 považují společně jako část příbuzného klonálního klastru, všechny přísluší k CMAT klastru 4.2, a potom souvislost s onemocněním lidí je až 87 %. Díky této úzké souvislosti s onemocněním lidí je až 87 %. Díky této úzké souvislosti s onemocněním lidí mohou být považovány za klony nebo klonové klastry „související s onemocněním lidí“ (HDA) (viz definice shora). Jestliže projdeme typy izolátů nacházející se mezi těmito třemi hlavnímu klony, je zřejmé, že například CMAT 13 souvisí s chronickým syndromem kůže ACA (5 kmenů) a že tento klon obecně souvisí se syndromy kůže (17 z 19). Naproti tomu se zdá, že další dva HDA kmeny převažují při rozšiřování nemoci, to znamená, že jsou izolovány z krve nebo CSF pacientů trpících neuroboreliosou nebo lymskou artritidou. V případě CMAT klastru 4.2 (tj. CMAT 17, 18, 20, a 22) epidemiologická data ukazují na úzkou souvislost s neuroboreliosou. Z 10 lidských izolátů jich 6 bylo izolováno z CSF materiálu nebo z pacientů s neuroboreliosou a čtyři byly izolovány z pacientů s ECM, syndromem normálně souvisejícím s akutním onemocněním, které také může souviset s neuroboreliosou. Souvislost kmenů CMAT 4 s příznaky není tak docela jasná, protože 2 z lidských izolátů byly izolovány z krve 3, z CSF a 1 z pacienta s EM.

Další analýza epidemiologických dat týkajících se různých kmenů zjistila, že tři hlavní klony nebo klonové klastry mají rozdílné geografické distribuce a že tato vlastnost odpovídá obecným rozdílům v primárním syndromu lymské nemoci pozorované v těchto oblastech. Například CMAT 4 je nejpřevládající CMAT pozorovaný v Severní Americe, oblasti, kde převládají příznaky artritidy. Bylo zjištěno, že CMAT 13 a CMAT 18 byly nalezeny převážně v severní střední Evropě, kde převládají neurologické příznaky a příznaky chronického onemocnění kůže. Ze 3 hlavních kmenů pouze CMAT 4 byl nalezen jak v Severní Americe tak v Evropě (Francie, Rakousko, Rusko), při čemž v obou světadílech je široce rozšířen. Je zajímavé, že v oblastech střední Evropy, zvláště v Rakousku a Švýcarsku, kde je lymská nemoc endemická, existují společně všechny 3 hlavní klony související s onemocněním lidí.

Uvědomění si skutečnosti, že onemocnění lidí je způsobeno převážně právě jedním klonem (CMAT 4) ve skupině CMAT 1 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), jedním klonem (CMAT 18) skupiny CMAT 3 (Borrelia afzelii) a klonovým klastrem (CMAT klastr 4.2) skupiny CMAT 4 (B. garinii sp. nov.) umožňuje, v souladu s tímto vynálezem, soustředit se na tyto klony/klonové klastry s cílem navrhnout vakcíny, jako je OspC vakcína nebo kombinovaná OspC/OspA vakcína, které proti nim specificky chrání. Tato vakcína by pak mohla být používána v těch geografických oblastech, v nichž tyto klony extrémně převládají. Dále pak, vzhledem k tomu, že různé klinické příznaky souvisejí s různými klony, lze zacílit vakcínu proti těmto klonům. Výsledkem je tedy navrhnout takovou vakcínu, která chrání proti specifickým příznakům.

Příklad 2

Vývoj OspC serovarového typizačního schématu pro analyzování serologické variace OspC antigenu Borrelia způsobující lymskou nemoc

Příprava anti-OspC protilátek

Byl připraven panel 25 monoklonálních protilátek proti a) čtyřem vyčištěným OspC proteinům odvozeným od 1) rakouského kmene Orth (BBM 34 až 39), 2) německého kmene PKO (BBM 42 až 45), 3) československých kmenů E61 (BBM 46,47 a 49) a 4) KL10 (BBM 40 až 41), b) OspC proteinem obohacené směsi antigenů odvozených od rakouského kmene W (BBM 22,24, 25, 27, 28 a 29) a c) membránové frakci 2 českého kmene M57 (BBM 75 až 77).

-17CZ 289212 B6

Specifičnost anti-OspC proteinu různých monoklonálních protilátek byla potvrzená blotovou analýzou proti membránové frakci kmene W nebo M57 v případě BBM 22, 24, 25, 27 až 29 a

BBM 75 až 77, v případě dalších pak řadovou blotovou analýzou proti příslušně vyčištěnému proteinu.

Membránová ELISA

Serotypizace OspC proteinů se provádí standardním způsobem membránové ELISA. Membránové frakce 2 všech kmenů, připravených jak popsáno v příkladu 1, se zředí na 0,1 mg/ml fosforečnanem pufrovaným solným roztokem (PBS), pH7,4, a rozdělí se do jednotlivých jamek mikrotitrovacích desek. Desky se nechají vysušit při 37 °C přes noc. Před použitím se desky dvakrát promyjí v PBS, potom se do každé jamky přidá 50 μΐ zředěného roztoku protilátky v PBS obsahujícím 1 % lidského albuminu a desky se inkubují 1 h při 37 °C. Desky se pak čtyřikrát promyjí před přidáním protilátky konjugované s anti-myšími IgG alkalickými fosfáty. Tyto desky se inkubují další 1 h při 37 °C, potom se čtyřikrát promyjí a přidá se substrát, aby se vyhodnotilo množství navázané protilátky.

Původně byly všechny kmeny testovány proti všem 25 monoklonálním protilátkám, aby bylo vidět, které monoklonály byly nejvhodnější pro serotypizační účely. Byly udělány pokusy, aby se zjistila jednotná positivní a negativní testovací kriteria. Ukázalo se však, že to není možné, díky velice rozdílných úrovním exprese OspC antigenů v různých kmenech. Pro překonání tohoto problému byly membránové frakce 2 analyzovány způsobem Westernového blotování, přeneseny na nitrocelulosu a obarveny barvivém Aurogold. Ty kmene, které neexprimovaly žádná nebo exprimovala nízká množství OspC proteinů (celkem 15 kmenů), což bylo posouzeno na základě nepřítomnosti hlavního proteinu s molekulovou hmotností v rozmezí 22 000 až 28 000, byly ze studie odstraněny. Přesto v mnoha případech (například, jestliže se používá BBM 28,29, 37,43 a 45), ještě stále nebylo možné snadno pozorovat rozdíly mezi positivními a negativními výsledky. Tyto monoklonální protilátky byly tedy považovány za nevhodné pro typizační účely. Všechny tyto protilátky rozpoznávají obvyklé epitopy a mají tedy malou diskriminační hodnotu. Na základě dat původní analýzy kmenů bylo také zjištěno, že četné monoklonální protilátky rozpoznávají podobné epitopy, např. BBM 24, 25 a 27, BBM 38 a 39 a BBM 75, 76 a 77. Proto byl použit v konečném serovarovém typizačním schématu pouze jeden z každé skupiny (BBM 24, BBM 39 a BBM77). Odstraněním těchto kmenů a monoklonálních protilátek bylo potom možné stanovit kriteria positivní reakce, kterou je ta, v niž získané hodnoty optické hustoty byly významně (třikrát) vyšší než hodnota pozadí negativních kmenů. V praxi to znamená, že positivní výsledek má hodnota optické hustoty (OD) větší než 0,6. Všechny positivní reakce byly potom potvrzeny analýzou Westernovým blotováním stejných membránových prostředků. Výsledky analýzy Westernovým blotováním byl objev, že BBM 48 silně zkříženě reaguje s proteinem o velikosti přibližně 60 000 hmotn. jednotek a že poskytuje četné falešné positivní výsledky při analýze ELISA. BBM 48 byl tedy také vynechán ze serovarové analýzy. Důsledkem bylo, že serovarová analýza byla poněkud zjednodušena použitím pouze 13 z původních 25 dostupných anti-OspC protilátek.

Potom se izoluje reakční sestava každého kmene s úplným panelem 13 monoklonálních protilátek. Každá jednotlivá sestava se označí jako „serovar“ (viz obr. 6). Ve sbírce konečně analyzovaných 62 kmenů bylo pozorováno 16 jedinečných serovarů, což ukazuje na velký stupeň serologické heterogenity tohoto membránového proteinu. Počet pozorovaných positivních reakcí mezi jednotlivými serovary byl mezi 1 a 7.

Na obrázku 12 je uveden úplný seznam serovarů nalezených pro každý kmen. Jak je vidět, 12 kmenů (19% z analyzovaných kmenů) nereagovalo s žádnou z panelu 13 monoklonálních protilátek (označeno „NR“, tj. nereaktivní) a byly považovány za netypizovatelné. Společně s kmeny, které byly vynechány kvůli chybějící nebo nízké expresi (15 kmenů), nemohlo být typizováno celkem 22 % z dostupných kmenů. Frekvence výskytu serovarů mezi 78 kmeny, které mohly být jednoznačně typizovány, byla značně proměnná. Byl pozorován pouze jediný

-18CZ 289212 B6 reprezentant serovarů 6, 8 a 9, zatímco 10 kmenů mělo serovar 2, nejobvyklejší serovar. Existuje úzký vzájemný vztah mezi skupinou a genotypem osp C proteinu a jeho serovarů. Ve většině případů se zdá, že poměr je 1 ku 1, např. u skupin 1, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 14 a 15. Skupiny 3, 12, 13, 17, 18 a 19 buď nemohly být testovány, nebo nebyly typizovatelné při použití běžně dostupných monoklonálních protilátek. Skupiny 6, 8 a 11 mohou být dále rozděleny serologicky na 2 nebo 3 serovary. Je však zajímavé si všimnout, že genotypy těchto skupin také vykazují jistou různorodost. Jeden serovar (serovar 16) byl pozorován u více než jedné skupiny (skupiny 16 a 20). Ktomu může dojít proto, že u tohoto serovarů existují pouze dvě positivní reakce a tedy běžné monoklonální protilátky nebyly schopny rozlišit mezi těmito skupinami.

Příklad 3

Analýza polymorfie délky restrikčních fragmentů (RFLP) ospC heterogenity

Byl klonován gen ospC z kmene Orth. Shora popsaným způsobem (USA patentová přihláška č. 07/903 580) byla stanovena sekvence nukleotidů. Oligonukleotidy odpovídající sousednímu (kódující vlákno, ATGAAAAAGAATACATTAAGTGC, start kodon podtržen) a vzdálenému (nekódující vlákno, TAATTAAGGITTfTTTGGAGTTTCGTG. stop kodon podtržen) konci ospC genu z kmene Orth byly pak použity pro polymerázovou řetězovou reakci (viz příklad 4) k amplifikaci ospC genů ze 77 kmenů naší sbírky kultur. Všechny testované kmeny, včetně 14 kmenů ze Spojených Států, poskytly PCR fragmenty předpovězené velikosti (627 až 642 p.n.), což ukazuje, že plazmidem kódovaný ospC gen není jen stabilně uchováván, ale převládá mnohem více než bylo dosud předpokládáno. Selhání detekce OspC antigenů v kulturách rostoucích in vitro je nepravděpodobné díky nepřítomnosti ospC genu, ale spíše díky nepřítomnosti nebo nízké hladině antigenů, který je exprimován.

Polymorfie mezi ospC geny z různých kmenů byla stanovena analýzou sestavy restrikčních fragmentů získaných po štěpení PCR amplikovaného ospC genu (připraveného jak shora popsáno) restrikčními enzymy Dpnll, Ddel a Dral. Analýza dat od těchto 82kmenů (tj. experimentální data od všech 77 kmenů v naší sbírce kultur plus informace odvozené z 5 publikovaných ospC sekvencí, viz obrázek 1) ukázaly přítomnost 35 různých RFLP ospC typů. Počet a velikost fragmentů experimentálně stanovených standardními postupy byly potvrzeny mnoha příklady sekvenování, tj. pro alespoň jednoho reprezentanta RFLP typů 1 až 23 a typu 24 je založen na sekvenčních datech Paduly a spol. RFLP sestavy související s každým RFLP typem jsou uvedeny na obrázku 7. Jestliže jsou dostupné, byly místo změřených hodnot s výhodou uvedeny velikosti fragmentů odvozené od informací o sekvenci (RFLP typy 1 až 24). Úplný seznam RFLP-typů pro každý analyzovaný kmen je uveden na obrázku 12.

Příklad 4

PCR amplifikace a sekvenování nukleotidů různých allel ospC genu a klastrová analýza odvozených aminokyselinových sekvencí

Jak je to popsáno v příkladech 1 a 2 a souhrnně uvedeno na obrázku 12, bylo možné rozklasifikovat kmeny Borrelia na OspC serovary a ospC RFLP typy. Byly vybrány kmeny představující ospC RFLP typy 1 až 17 a 19 až 23, ospC gen byl amplifikován polymerázovou řetězovou reakcí a byla stanovena sekvence nukleotidů a odvozená sekvence aminokyselin. V několika případech byl studován vzájemný vztah mezi blízce příbuznými OspC proteiny jako další kontroly platnosti typizačních systémů a jako kontrola pro další nedetegovanou heterogenitu OspC typů. Celkem bylo PCR amplifikováno a sekvenováno, jak níže popsáno 27 ospC genů. Informace o sekvencích byly použity pro klasifikování OspC proteinů do OspC skupin.

Materiály a způsoby

-19CZ 289212 B6

Suspenze zmrazených zásobních buněk Borrelia byla roztátá a 2 μΐ (5.10⁶ až 1.10⁸ buněk/ml) této suspenze byly odstřeďovány 5 minut při nejvyšší rychlosti v mikroodstředivce Heraeus Biofuge A. Peleta buněk byla resuspendována v 10 μΐ lx TAQ-pufru (Boehringer Mannheim), převrstvena 50 μΐ minerálního oleje (Pharmacia), inkubována 8 minut ve vroucí vodní lázni a potom ihned umístěna na led. K buněčnému lyzátu bylo přidáno 90 μΐ směsi reakčních činidel [9 μΐ lOx Taq polymerázového pufru, Boehringer Mannheim, 2 μΐ lOmM dNTP roztoku, Boehringer Mannheim, 5 μΐ primeru 1 (ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCG), lOmM zásobní roztok, 5 μΐ primeru 2 (AATTAAGGTTTTTTTGGAGTTTCTG), lOmM zásobní roztok, 0,5 μΐ Taq polymerázy o koncentraci 5000 jedn./ml, Boehringer Mannheim, a 68,5 μΐ vody]. DNA amplifíkace byla prováděna v zařízení LKB Thermocycler (95 °C 26 vteřin, 53 °C 60 vteřin a 70 °C 84 vteřin, 30 cyklů). Amplifíkace byla sledována analyzováním 5 μΐ produktu na 1% (hmotn. kobj. dílům) agarosovém gelu v Tris-acetátovém pufru (40mM Tris-acetát, 2mMEDTA, pH 8,0), obarvena ethidiumbromidem a zviditelněna pod UF světlem. Amplifikované produkty byly zahuštěny mikroodstřeďující kazetou Spin Bind (FMC). DNA byla izolována ve 30 μΐ vody. Izolace byla sledována u 2 μΐ vyčištěného produktu na agarosovém gelu jak shora popsáno.

Amplifikované DNA fragmenty (2 až 7 μΐ) byly připraveny pro sekvenování na zařízení LKB Thermocycler (25 cyklů: 36 vteřin při 95 °C, 30 vteřin při 53 °C a 80 vteřin při 70 °C) pomocí sekvenační soupravy Auto Cycle Sequencing Kit (Pharmacia) s primery 5ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCG-3' a 5'-ATTAAGGTTTTTTTGGAGTTT. CTG-3'. Vzorky byly elektroforesovány na 6 polyakrylamidovém sekvenačním gelu automatickou sekvenační aparaturou s laserovou fluorescencí (ALF) (Pharmacia LKB) podle popisu uvedeného výrobcem. Sestava dat o sekvencích nukleotidů z ALF byla shromážděna a analyzována programem DNASIS, odvozené sekvence proteinů programem PROSIS (Pharmacia LKB).

Aminokyselinové sekvence OspC proteinů z 24 různých kmenů spirochet lymské nemoci (tj. 22 sekvencí z této studie a 2 publikované sekvence pro kmeny 2591 a PBI) byly seřazeny rychlou/přibližnou metodou podle Wilburyho a Lipmana: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80. 726 (1983). Takto získaná podobná skóre byla použita pro zkonstruování dendrogramu způsobem UPGMA (forma klastrové analýzy) podle Sneatha a Sokala, viz výše. Tyto analýzy byly prováděny pomocí programu Clustal V (Higgins a Sharp: CABIOS 5, 151 (1989) a Higgins a spol.: CABIOS (1991).).

Výsledky a diskuse

Seřazené nukleotidové a odvozené částečné aminokyselinové sekvence ospC genů a proteinů z 24 kmenů představujících 24 různých RFLP typů jsou uvedeny na obrázku 8 a 9. Jelikož aminokyseliny předcházející první cysteinový zbytek (aminokyselina 19 vOrth sekvenci) v OspC proteinu znamenají leader sekvenci a nejsou přítomny v maturovaném proteinu (sekvence FISC je předpokládaným místem štěpení signálními peptidy), nebyly zahrnuty do srovnávání sekvencí. Na karboxylovém konci proteinu bylo vynecháno 16 aminokyselin. Tyto aminokyseliny zahrnují oblast odpovídající vazebnému místu primeru 2 (ekvivalent posledních 7 aminokyselin) a potom mezeru 9 dalších aminokyselin, dokud se nezískají data první sekvence. Zdá se, že tato koncová část OspC genů je ve velké míře zachována a má menší důležitost při vzniku rozmanitosti pozorované mezi OspC proteiny, jak ukazuje schopnost amplifikovat a sekvenovat ospC gen ze všech testovaných kmenů pomocí primeru 2. Navíc, monoklonální protilátky, které se váží na tuto oblast OspC, jsou velice reaktivní (například BBM 29,42 a 45 na obrázcích 13 a 14).

OspC sekvence jsou vysoce variabilní s nej vzdálenějšími příbuznými aminokyselinami sekvencemi (B. burgdorferi kmen 297 a B. garinii kmen IP90), při čemž vykazují pouze 59% identitu aminokyselinové sekvence (80% podobnost). Žádné rozdíly mezi sekvencemi nebyly

-20CZ 289212 B6 však detegovány mezi členy stejného RFLP typu, což ukazuje, že tento typizační způsob velmi přesně představuje heterogenitu mezi ospC geny (tj. OspC sekvence kmenů VS215, VS219 a DK7 RFLP typu 1 jsou identické s ZS7, kmeny IP2 a 26816 RFLP typu 2 jsou identické s B31, kmeny H15 a ACA1 RFLP typu 6 jsou stejné, kmeny PKO a DK62 RFLP typu 7 jsou identické 5 s JSB, kmeny H4 a W RFLP typu 10 jsou stejné, kmeny 871104 a KL11 RFLP typu 13 jsou identické a kmeny 20047 a VS185 RFLP typu 14 jsou stejné).

Stupeň příbuznosti mezi částečnými OspC aminokyselinovými sekvencemi stanovený klastrovou analýzou je presentován jako dendrogram na obrázku 10. OspC proteiny z kmenů stejného druhu io jsou příbuznější než OspC proteiny z různých druhů. U každého druhu jsou však zřejmé značné různosti. Rozdílnosti OspC sekvence jsou zvláště vysoké mezi kmeny B. garinii, jak ukazuje hlubší větvení pozorované v této části fýlogenetického stromu a větší počet OspC variant souvisejících s B. garinii než s dalšími dvěma druhy Borrelia. Klonální struktura ospC dědičnosti předpokládá, že neexistuje žádná významná výměna genetického materiálu ani intragenovou 15 rekombinací ani horizontálním přenosem plazmidem kódovaného ospC mezi různými druhy Borrelia způsobující lymskou nemoc.

OspC proteiny byly přiřazeny k OspC skupinám. OspC skupina je definována jako taková skupina OspC proteinů, které mají vyšší než 80% identitu aminokyselinové sekvence proti 20 dřívější 92% maturovaného OspC proteinu, tj. vyjma informace pro leader sekvenci o aminokyselinách a posledních 16 aminokyselin. Na obrázku 1 je uvedeno 18 různých OspC skupin, ale dvě další OspC skupiny (19 a 20) byly identifikovány z neúplné informace o sekvenci OspC proteinů z kmenů H13 a 28691, které nebyly v dendrogramu zahrnuty.

Přes velkou rozmanitost OspC proteinů je zachována první třetina maturovaného OspC proteinu (obrázek 10), kmeny stejného druhu vykazují 80 až 90% identitu sekvencí v této oblasti. Avšak identita sekvencí mezi OspC proteiny z různých kmenů není v této části proteinu tak vysoká díky přítomnosti kmenově specifických sekvenčních motivů na aminovém konci OspC proteinu. Jak bylo shora uvedeno, část OspC na karboxylovém konci, která nebyla uvedena, je zřejmě také na vysokém stupni zachována. Intervenující oblast (tj. dolní dva bloky na obrázku 9 mezi aminokyselinovými zbytky KKI a NS) je velice proměnná a je hlavním zdrojem rozmanitosti související s OspC. Je třeba očekávat, že serotypově specifické epitopy jsou uvnitř této proměnlivé oblasti. Analýza profilů hydrofilnosti sekvencí jednotlivých proteinů způsobem podle Hoppa a Woodse zjistila, že nejvyšší hydrofilní maximum, vysoce předpovídající existenci epitopů, leží uvnitř této oblasti. Přes velkou proměnlivost mezi OspC sekvencemi v této oblasti, předpokládaný epitop neměnné leží mezi zbytky aminokyselin 120 až 155 maturovaného proteinu. V OspC kmene Orth se hydrofilní maximum vyskytuje u zbytků 136 až 141 (DNDSKE), oblasti s vysokou flexibilitou a předpovězenou β-otáčkou, což jsou parametry, které by také naznačovaly epitop (analýzy dělány pomocí PC/GENE).

Příklad 5

Mapování epitopů anti-OspC monoklonálních protilátek

Epitopy některých anti-OspC monoklonálních protilátek byly mapovány komerčně dostupnou soupravou Custom Designated Epitope Scanning Kit od firmy Cambridge Research Biochemicals Ltd., Gradbrook Park, Northwich, Cheshire, Anglie. Tato sestava používá buď způsob pin technologie popsaný Geysenem a spol.: J. Immunol. Methods 102, 259 (1987), analýzu ELISA 50 s biotinylovaným peptidem, nebo způsob tečkového blotování popsaný výrobcem. Jediným stupněm bylo 2026 syntetizovaných testovaných peptidů, překrývající lOmery sekvencí OspC proteinů jsou uvedeny na obrázku 9. Do analýzy byly zahrnuty také překrývající peptidy sekvence signálního proteinu kmene Orth a C konce OspC proteinů kmenů Orth PKO a B31.

-21CZ 289212 B6

Kombinovaná sekvence sekvenčních peptidu reagujících s monoklonální protilátkou je popsána jako „plná sekvence epitopu“. Obrázek 13 uvádí úplnou sekvenci epitopu těchto monoklonálních protilátek, kterými by se tyto epitopy mohly rozlišovat. Sekvence uvedená v hranatých závorkách zahrnuje aminokyseliny obvyklé pro všechny reagující peptidy a tvoří tedy důležitou část epitopu. Umístění každé úplné sekvence v generalizovaném OspC proteinu je uvedeno na obrázku 14. V jednom případu je dáno (obrázek 13) a uvedeno (obrázek 14) číslo epitopů, které by mohly být rozlišeny, avšak pouze pro první, tj. nejreaktivnější. V případech, kdy monoklonální protilátky reagují s peptidy odpovídajícími podobným oblastem ve více než jednom OspC proteinu, je uvedena pouze monoklonální látka pro kmen Orth. Naopak, jestliže monoklonální protilátky nereaguje sOrth proteinem (např. BBM 43), je uvedena reagující sekvence pro homologní kmen (PKO). Dole na obrázku 13 jsou monoklonální protilátky seřazeny do kategorií na základě frekvence výskytu toho epitopu, který rozpoznávají, což je uvedeno v horní části tohoto obrázku. Jak lze vidět, více než polovina z nich rozpoznává vysoce specifické epitopy, v nichž se vyskytuje méně než 10 z analyzovaných kmenů. Pět z monoklonálních protilátek rozpoznává epitopy vyskytujících se meziproduktů, zatímco sedm zbývajících lze považovat za protilátky, které rozpoznávají obvyklé epitopy, protože se vyskytují ve více než 25 až 77 analyzovaných kmenů. Monoklonální protilátky, o nichž bylo zjištěno, že jsou vhodné pro serovarovou analýzu, jsou na obrázku 13 označeny hvězdičkou. Je zajímavé poznamenat, že to byly primárně monoklonální protilátky, které rozpoznávají obvyklé epitopy (BBM 28, 29, 34, 37, 42, 43 a 45) nebo epitopy vyskytující se jako meziprodukty (BBM 22, 35 a 40), které by mohly být jednoznačně zmapovány. Ve skutečnosti by mohly být zmapovány pouze 3 monoklonální protilátky, které by mohly být považovány za typově specifické (BBM 38, 39 a 44), tj. reagující s méně než 10 kmeny. Jak BBM 38 tak 39 mají stejnou sestavu reakcí kmenů a mapovaly stejnou oblast (aminokyseliny 155 až 170). Na základě hydrofilnosti sekvence aminokyselin proteinu Orth hydrofilní maximum a předpovězená β-otáčka se shoduje s touto oblastí, parametry vysoce indikativními pro epitop. Epitop BBM 44 leží mezi aminokyselinami 79 a 90, což je také značně proměnná oblast. Naneštěstí nemohl být mapován žádný z epitopů jiných typově specifických monoklonálních protilátek, což ukazuje na to, že jsou závislé na konformaci molekuly. Jelikož však všechny 3 typově specifické protilátky mapují oblasti, které jsou mezi nejproměnlivějšími oblastmi proteinu, je vysoce pravděpodobné, že je také v jiných typově specifických epitopech. Je zajímavé, že BBM 28, který reaguje sepitopem vysoké frekvence, také mapuje stejné oblasti jako BBM 38 a 39. Důvody pro to nejsou známy. Mohou zde však existovat malé rozdíly v počtu a skutečných aminokyselinách, které jsou ve vazebném místě, což s sebou nese tuto nejednoznačnost. Čtyři z protilátek (BBM 29, 42, 43 a 45), které reagují s obvyklým epitopem, mapují protein na vzdáleném C konci (aminokyseliny 200 až 212), při čemž dva další reagují blízko N konce tohoto proteinu (aminokyseliny 41 až 67), oblastech, které jsou vysoce konzervativní. Monoklonální protilátky rozpoznávají epitopy s výskytem meziproduktů mapovaných uvnitř polozachovaných oblastí (aminokyseliny 103 až 114 a aminokyseliny 176 až 196) molekuly. Tyto výsledky byly potvrzeny také dalším pokusem, v němž bylo testováno vícemocné králičí sérum specifické pro membránové frakce 2 kmenů, z nichž každý exprimuje 16 serovarových variant Osp C proteinu, proti 203 překrývajícím peptidům Orth proteinu. Byly nalezeny zkříženě reagují epitopy ve shora zachovaných a polozachovaných oblastech. Je zajímavé, že séra z kmenů CMAT skupiny 1 (B. burgdorferi sensu stricto) nereagují zkříženě tak často jako séra z kmenů CMAT skupiny 3 (B. afzelii) a 4 (B. garinii).

Příklad 6

Studie zkřížené ochrany u gerbil

Pro zjištění, jestli je možná zkřížená ochrana mezi různými skupinami OspC, byly vyčištěny Osp proteiny z B. burgdorferi kmene ZS7 (OspC skupina 1), B. afzelii kmene PKO (OspC skupina 7) a B. garinii kmene W (OspC skupina 10) a použity jako imunogeny u modelu lymské boreliosy gerbil proti stimulaci kmenem Orth B. Afzelii (OspC skupina 5). Pro testování uvnitř skupiny byl

-22CZ 289212 B6 jako imunogen proti kmenu Orth použit OspC z kmene H7 (OspC skupina 5). OspC z kmene H7 patří ke stejnému serovaru a RFLP typu jako OspC z kmene Orth.

Gerbilám byla podána buď jedna subkutánní imunizace vyčištěného OspC (20 pg proteinu/200 μΐ) s pomocným činidlem TiterMax #R-1 (CytRx), tj. byla připravena jako emulze vody voleji (skvalem) se syntetickým imunomodulátorem (kopolymer CRL89-41). Nebo byly gerbilám podány dvě intraperitoneální injekce ospC (10 pg proteinu/500 pl) s hydroxidem hlinitým jako pomocným činidlem. Vyčištěné antigeny byly připraveny z kmenů podle způsobů popsaných v USA patentové přihlášce č. 07/903 580, jejíž obsah zde byl již dříve zahrnut jako odkaz. Tři a půl týdne po první imunizaci byly z očí a plasmy odebrány vzorky krve připravené tak, aby mohla být zjištěna protilátková odpověď na imunogen v době stimulace (podobně bylo postupováno s neimunizovanými kontrolními zvířaty). Po čtyřech týdnech od první imunizace bylo zvířatům podáno intraperitoneálně 10⁴ buněk (JD5o25 až 100) kmene Orth, stejně jako skupině neimunizovaných kontrolních zvířat. Podávaná suspenze byla také titrována u neimunizovaných gerbil, aby se stanovila dávka potřebná pro infikování 50 % zvířat. Po dalších 2 týdnech byla zvířata stimulovaná dávkou 10⁴ zabita a měchýř, srdce, ledviny a sleziny byly kultivovány v médiu BSK. Kultury byly zkoumány na přítomnost spirochet v týdenních intervalech od druhého do šestého týdne po naočkování, mikroskopií v tmavém poli. Byla také odebrána krev a získaná plasma byla analyzována Westernovým blotováním na sero-konverzi, tj. na vyvinutí protilátek po stimulaci na antigeny z kmene Orth jiných než imunogen. Byla zjištěna dobrá shoda mezi kultivačními a serologickými testy použitými ke zjištění, která zvířata byla infikována. Pouze serologické testování bylo použito pro stanovování ID50, ale v tomto případě byla zvířata nechána vykrvácet 3 týdny po stimulaci. Další čas byl poskytnut proto, aby protilátková odpověď u infikovaných gerbil byla dostatečně silná a aby mohla být snadno detegována.

Mezi druhy neexistovaly žádné známky zkřížené ochrany, tj. OspC proteiny zOspC skupin 1 (B. burgdorferi) a 10 (B. garinii) byly neúčinné jako imunogeny proti podanému kmenu Orth (B. afzelii). Podobně neexistovala žádný známka zkřížené ochrany mezi různými OspC skupinami stejných druhů, tj. OspC protein z izolátů OspC skupiny 7 (kmen PKO B. afzelii) byl neúčinný jako imunogen proti podanému kmenu Orth, který exprimuje OspC protein z OspC skupiny 5. Naproti tomu imunizace OspC proteinem z kmene H7 (OspC skupiny 5) byla účinná na kmen Orth (OspC skupina 5). Tato data (obrázek 15) ukazují, že zkřížená ochrana mezi OspC skupinami je nepravděpodobná a že je možná ochrana uvnitř jedné skupiny. Pro ochranu proti většině kmenů Borrelia způsobující lymskou nemoci by měla být účinná násobná vakcína obsahující jeden nebo více typů OspC proteinů z každé z OspC skupiny.

Příklad 7

Frekvence geografického rozšíření různých skupin OspC proteinů souvisejících s onemocněním lidí

Vzhledem k vysokému stupni proměnlivosti OspC proteinu je mimořádně obtížné navrhnout vakcínové prostředky, které poskytují dobré ochranné krytí a při tom nevyžadují zahrnutí mimořádně vysokých počtů variant, aby se dosáhlo tohoto cíle. Jedním způsobem optimalizování výběru OspC variant by bylo stanovení, které OspC varianty souvisejí s onemocněním lidí a vyskytují se s vysokou frekvencí. Vzácné OspC varianty nebo OspC varianty vzácně související s onemocněním člověka by tak byly z jakéhokoliv vakcínového prostředku vyloučeny s minimální ztrátou účinnosti vakcíny. A dále, jestliže je vakcína určena pouze pro použití v příslušné geografické oblasti, nebylo by nutné zahrnout do ní ty OspC varianty, které nepřevládají v Borrelia způsobující lymskou nemoc v této oblasti. Využitím epidemiologických a OspC typizačních informací o kmenech Borrelia použitých v této studii (obrázek 12) je možné vybrat OspC varianty, které by měly být ve vakcíně (vakcínách) obsaženy.

-23CZ 289212 B6

Analýza izolátů B. burgdorferi (CMAT skupina 1 zahrnující kmen 25015, celkem 23 kmenů) ukazuje, že nejvíce převládající OspC varianty mezi těmito kmeny jsou ty, které příslušejí ke skupinám 1 a 2. Kmeny skupiny 1 jsou všechny evropskými izoláty a mohou způsobovat onemocnění lidí, i když pouze 1 až 5 kmenů byl lidský izolát. To může naznačovat, že tyto kmeny nejsou vysoce virulentní. Kmeny skupiny 2 jsou jediným nejobvyklejším typem OspC skupiny s 10 členy. Na rozdíl od kmenů skupiny 1 jsou tyto kmeny široce rozšířeny v izolátech ze Spojených Států, Evropy a Ruska. Kmeny skupiny 2 úzce souvisejí s onemocněním lidí, při čemž 50 % izolátů jsou klinické vzorky. Zbývajících 8 testovaných izolátů B. burgdorferi jsou všechno izoláty ze Spojených Států a jsou velmi rozmanité, pokud jde o OspC, které exprimují, jelikož každý kmen exprimuje jiný OspC RFLP typ. Pouze jeden z těchto kmenů (kmen 297, skupina 3) byl izolován z případů lymské nemoci. Kmeny skupiny 2 a 3 náležejí, s výjimkou kmene 25015, k jednomu ze 3 hlavních klonů CMAT typu 1.2.4. souvisejících s onemocněním lidí (obrázek 5).

kmenů B. afzelii (tj. skupina VS461, CMAT skupina 3) spadá do 6 různých skupin: OspC skupin 4 až 8 a skupiny 16 s 5,4,6,2 respektive 4 členy. Kromě jednoho japonského izolátů byly všechny tyto kmeny z Evropy: Rakousko (14), Česká republika (4), Dánsko (1), Německo (2), Itálie (1), Slovinsko (1), Švédsko (1) a Švýcarsko (1). 28 % evropských izolátů bylo lidského původu, z toho bylo 80 % izolátů ze vzorků kůže a 8 % ze vzorků love. Tato data ukazují na vysokou souvislost mezi kmeny B. afzelii a vývojem dermatologických forem lymské nemoci. Lidské izoláty byly stejnoměrně rozšířeny i v různých OspC skupinách. Rakouské izoláty patřily především ke skupinám 4 až 6 (86%), ale jednotliví představitelé bylo nalezeni také ve skupinách 7 a 8. Nízký výskyt rakouských izolátů mezi OspC skupinou 7 (tj. 1/5) a nepřítomnost izolátů ze skupiny 16 (0/4) ukazuje, že uvnitř Evropy jsou geografické variace s převládáním různých B. afzelii OspC skupin. Nicméně kmeny B. afzelii z OspC skupin 4 až 8 a 16 jsou v Evropě široce rozšířeny. Tyto kmeny jsou téměř výlučně členy jiného klonu souvisejícího s onemocněním člověka, konkrétně 3.2.13 (obrázek 5).

Třicet kmenů B. garinii (tj. CMAT skupina 4, vylučující atypické kmeny 19857 a 19952 a CMAT 2 kmeny 20047, IP90 a NBS16) může být dále rozděleno do 9 OspC skupin a

RFLP typů, pro které neexistuje žádné přiřazení do skupin. 53 % testovaných kmenů B. garinii byly lidské izoláty a tyto kmeny byly rozšířeny ve všech OspC typech vyjma jednoho (RFLP 34). 75 % (12/16) z těchto kmenů B. garinii bylo izolováno z případů neoroboreliosy, zbývající byly izoláty z kůže. B. garinii tedy primárně souvisí s neuroboreliosou, i když je očekáván výskyt izolátů z kůže, protože poranění kůže (EM) je příznakem obvyklým pro všechny formy lymské nemoci bez ohledu na příčinné činidlo. Kmeny OspC skupiny 13 byly nejobvykleji izolovanými OspC typy, 23 % (7/30) bylo B. garinii OspC typů a 25 % (4/16) lidské izoláty. Kmeny této OspC skupiny jsou široce rozšířeny v Evropě a zahrnují izoláty ze 6 různých zemí. OspC skupina 11 je také široce rozšířena, vyskytuje se často (17% nebo 5/30), ale souvislost s onemocněním lidí je méně jasná, jelikož jenom jeden izolát byl lidského původu. To ale může ukazovat na chybu ve vzorku a malý počet analyzovaných kmenů. To lze také aplikovat na kmeny OspC skupiny 14 (4 kmeny, ale jenom 1 lidský izolát). Izoláty z jiných OspC skupin (9, 10,12,15,17,19 a RFLP typy 33 a 34) byly nalezeny méně často. Pro vakcínu proti rakouské B. garinii by však měly být dále uvažovány Osp skupiny 10 a 19, jelikož všechny 4 izoláty B. garinii z Rakouska náležejí k těmto 2 OspC skupinám.

Vedle přímé analýzy kmenů Borrelia, jak shora popsáno, je možné stanovit také převládající z různých OspC variant a jejich souvislost s lidskou boreliosou nepřímo. To se provádí testováním specifičnosti OspC protilátek v séru od pacientů s lymskou nemocí. Na protilátky na OspC bylo testováno 50 sér odebraných pacientům v oblasti Prahy (Česká republika), kteří měli EM (15), ACA (15), neurologické poruchy (10) a příznaky související s klouby a svaly (10). Při testování proti panelu 18 kmenů bylo zjištěno, že 17 vzorků sér (34%) (3 EM, 10 ACA, lymská artritida a 1 neuroborreliosa) reaguje s jednou nebo více ze 16 testovaných OspC skupin (obrázek 16). 12 sér reagovalo specificky správě jednou OspC skupinou [skupina 5 (4x), skupina 7 (3 x), skupina 6 (2x), skupina 8, 13 a 14 (1 x)J. Tři séra reagovala jak se skupinou 4 tak se skupinou 6, zatímco 2 další séra byla široce zkříženě reaktivní reagující s 6 a 8

-24CZ 289212 B6 z testovaných skupin. V České republice jsou tedy přítomny kmeny Borrelia exprimující OspC varianty z OspC skupin 5 až 7, 13, 14 a možná 4. Tato serologická data jsou v souladu a tedy podporují výsledky získané analýzou kmenů v sousední zemi - Rakousku.

Na základě shora popsaných výsledků byly připraveny vakcíny pro použití ve:

1) Spojených státech: OspC z OspC skupin 2 a 3,

2) Evropě: 14 OspC variant z OspC skupin 2,4 až 7,9,10,12,13,14,15 až 17 a 19 a

3) Rakousku: 8 nebo více OspC z ospC skupin 2,4 až 7,10,13 a 19.

Příklad 8

Exprese rekombinantního OspC v P. pastoris

Konstrukce Pichia pastoris OspC expresního vektoru

Rekombinantní P. pastoris/E. coli vektor pro více hostitelů pHIL-Al (získaný od Phillips Petroleum) byl použit pro klonování OspC kódující sekvence B. burgdorferi. Byl zvolen panel kmenů obsahujících jeden nebo více představitelů z každé skupiny. OspC gen byl amplifikován polymerázovou řetězovou reakcí. Kódující sekvence maturovaného OspC proteinu počínající první aminokyselinou cysteinem (aminokyselina 19 v sekvenci OspC proteinu z kmene Orth) byla amplifikována použitím primerů specifických pro kmen odvozených od OspC nukleotidových sekvencí, jak je to popsáno v USA patentové přihlášce 07/903 580 (evropský patent 0 522 560).

Pro vytvoření 5' a 3' konce B. burgdorferi Orth OspC genu byla provedena polymerázová řetězová reakce (PCR) v podstatě tak, jak je to popsáno v příkladu 4 s použitím aminokoncového primerů PC-F se sekvencí 5'-AAATGTGTAATAATTCAGGGAAAGG-3' a primerů PC-B na karboxylovém konci se sekvencí 5'-ATTAAGGTTT. TTTTGGAGTTTCTG-3'. Podtržená sekvence v primerů PC-F je identická s translačním start kodonem maturovaného OspC proteinu a v primerů PC-B s translačním stop kodonem.

Strategie klonování (restrikční místo ve vektoru a v primerech použitých pro PCR) pro vložení OspC kódující sekvence B. burgdorferi kmen B31, PKO, ZS7, KL10 a E61 do pHIL-Al je souhrnně uvedena níže v tabulce I.

Vektor pHIL-Al se rozštěpí působením Sful. Přečnívající konce se doplní Klenowovou polymerázou za vzniku zarovnaných konců. Vyčištěný PCR fragment obsahující sekvenci kódující OspC se přes noc liguje s vektorem. Tato ligační směs se použije pro transformaci příslušné E. coli DH5a. Pro další amplifikaci plazmidu se vyberou na LB-Amp deskách kolonie resistentní na ampicilin. Minipreparace (Maniatis a spol., 1982) se testují a analyzují podle délky restrikčního fragmentu. Plazmid, který má OspC gen, se označí pPC-PP4 (obrázek 17). Připraví se vyčištěná pPC-PP4 DNA. Sekvence se potvrdí sekvenováním DNA. Vyčištěný plazmid pPCPP4 se přenese do P. pastoris kmene GS115 NRRL-Y 11430 (Gregg a spol.: Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985).) způsobem, který popsal Dohmen a spol. (Yeast 7, 691) a na MD deskách se vyberou transformanty.

-25CZ 289212 B6

kmen B.	vektor pHIL-Al rozštěpený
burgdorferi	primer
Orth	5'-AA ACG ATG TGT AAT AAT TCA GGG AAA-3' 5'-GGATTAAGGTTTTTTTGGTTTCTG-3'	Sful/Klenow
KL10	5'-GGGACTTCGAAACGA ATG TGTAATAATTCA-3' 5'-GGTGGG GGA ATT CAT TAA GGT TTT-3' 5'-TTT GGA-3'	Sful/EcoRI
ZS7	5'-CGGAAAAAAAACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3' 5'-TAATTCAGGGAAAG GGA AAT CAT TAA-3' 5'-GGT TTT TTT GGA-3'	Sful/EcoRI
B31	5'-CGGAAAAAAAACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3' 5'-TAATTCAGGGAAAG GGA AAT CAT TAA-3' 5'-GGT TTT TTT GGA-3'	Sful/EcoRI
E61	5'-CGGAAAAAAAACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3' 5'-TAATTCAGGGAAAG GGA AAT CAT TAA-3' 5'-GGT TTT TTT GGA-3'	Sful/EoRI
PKO	5'-CGGAAAAAAAACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3' 5'-TAATTCAGGGAAAG GGA AAT CAT TAA-3' 5'-GGT TTT TTT GGA-3'	Sful/EcoRI

Tabulka I ukazuje oligonukleotidové příměry použité pro PCR amplifikaci kódující sekvence maturovaného OspC proteinu různých kmenů Borrelia lymské nemoci. Jsou uvedeny také restrikční enzymy použité pro vložení sekvence kódující OspC do vektoru pHIL-Al.

Exprese rekombinantního OspC v P. pastoris

Z MD desek byly sebrány P. pastoris GS115/pPC-PP4 transformanty a byly nechány růst ve 3 ml MG media při 30 °C za stálého míchání do optické hustoty (OD 600) 2 až 10. Pro indukci OspC syntézy se 1 ml kultury odstřeďuje, promyje se jednou MM, resuspenduje se ve 3 ml MM nebo ΜΜΥ’-mediu a inkubuje se 2 dny při 30 °C za stálého míchání. Exprese OspC se indukuje přítomností methanolu v růstovém médiu. Odebírají se podíly kultury a lyzáty se analyzují Westernovým blotováním pomocí OspC specifické monoklonální protilátky BBM 45.

[’ vše v následujících mediích je vyjádřeno jako množství/1

MD: kvasinková dusíková báze (YNB, 13,4 g), síran amonný (5 g), biotik (400 mg), glukosa (2%)

MG: YNB, síran amonný, biotin, glycerol (10 ml/1), fosforečnan draselný (1 OOmM)

-26CZ 289212 B6

MM: YNB, síran amonný, biotin, methanol (5 ml), fosforečnan draselný (lOOmM)

MMY: MM, kvasinkový extrakt (10 g), kasein (20 g)]

Čištění rekombinantního OspC

P. pastoris GS115/pPC-PP4 buňky byly izolovány odstřeďováním (3000 xg, 5 minut, 4°C). Promyté buňky se resuspendují ve 150mM Tris/HCl pufru, pH 7,4 a tato suspenze se přidá ke skleněným perličkám. Buňky se pak lyžují třepáním směsí v buněčném mlýnu Vibrogen® (model V14, Biihler). Lyzát se pak odfiltruje na filtru ze sintrovaného skla, by se odstranily skleněné perličky. Lyzát se odstřeďuje 5 minut při 3000 x G při 4 °C. Supematant se pak dále odstřeďuje 1 h při 100000 x G při 4 °C. „Supematant získaný při vysoké rychlosti“ se použije pro další čištění OspC antigenů.

OspC antigeny se frakcionují DEAE-chromatografií, jejíž příklad je uveden níže: kolona: Protein-PAK DEAE 5PW od firmy Waters vzorek: 45 ml dialyzovaného antigenového prostředku rovnovážný pufr (A): lOmM Tris/HCl, pH 7,5 eluční pufr: (B): lOmM Tris/HCl, 1M NaCl, pH 7,5 průtok: 4 ml/min gradient: 0 % B 70 minut, 0 až 100 % 50 minut.

Kolona se ekvilibruje pufrem A. Antigeny se eluují zvyšujícími se množstvími NaCl. Pro identifikování frakcí, které obsahují příslušný antigen, se části frakcí vysrážejí acetonem a pelety se analyzují SDS-PAGE a/nebo imunoblotováním. Frakce z dělení DEAE ionexovou chromatografií obohacené OspC antigenem se dále čistí afinitní chromatografií na imobilizovaném kovu, jak je to popsáno v evropském patentu 0 522 560.

Příprava OspC proteinu ve velkém měřítku ve fermentoru

Příprava OspC byla zkoumána v kontinuálním fermentačním cyklu. Každý cyklus byl proveden s fermentorem opatřeným monitory a kontrolami pro pH, rozpuštěný kyslík, rychlost míchání, teplotu, průtok vzduchu a průtok kyslíku. Teplota byla udržována na 30 °C. Výtěžek buněk byl stanovován z mokré hmotnosti promytých buněk.

Očka pro fermentační cykly byla nechána růst ve 21 Erlenmeyerových baňkách obsahujících 500 ml modifikovaného FM21 média, jak je to popsáno v evropském patentu 0 263 311. Fermentační kultury vyrostlé po dávkách byly množeny s glycerolem jako jediným zdrojem uhlíku a energie. Kontinuální kultury měly stálý přívod glycerolu, dokud koncentrace biomasy nedosáhla 500 až 700 g hmotnosti vlhkých buněk/litr. Jakmile se odeberou kontrolní vzorky, přidává se ke kultuře methanol jako napájení směsí methanol-soli-biotin po dobu několika dnů tak, aby se koncentrace methanolu udržovala mezi 0,05 a 1,5 % hmotn. Produkovaná biohmota se každý den odstraňuje. P. pastoris buňky se izolují odstřeďováním a resuspendují se v pufru (150mM Tris/HCl, 2mM EDTA, lmM hydrochlorid benzamidinu, 0,01% (hmotn.) NaN₃, pH 7,4). Na francouzském lisu se získají buněčné lyzáty. Koncentrace OspC proteinu byla stanovena způsobem podle Bradforda. Předběžné výsledky ukázaly, že došlo kaši lOOnásobně zvýšenému výtěžku OspC antigenů (na objemovou jednotku kultury) u P. pastoris při srovnání s výtěžky získanými u kmenů B. burgdorferi.

Studie imunizace a stimulace (ochrany) OspC antigenů odvozeného od P. pastoris

Studie ochrany byly prováděny na gerbilách, jak je to popsáno v příkladu 5. Na ochrannou účinnost byla testována 25mg množství OspC zP. pastoris (klonováno z kmene Orth) nebo Borrelia kmene Orth, jak ukazuje obrázek 18. Všechny gerbily imunizované OspC odvozeným od P. pastoris byly chráněny proti homolognímu kmenu Orth. Výsledky jsou srovnatelné se studiemi ochrany získanými s OspC antigenem odvozeným od Borrelia.

-27CZ 289212 B6

DNA sekvence OspC genů následujících kmenů Borrelia uvedených na obrázku 8a odpovídají následujícím sekvencím identifikačních čísel (sekv. id. č.):

28691

2591

IP2

25015

ZS7

297

SIMON

E61

ORTH

ACA1

H9

JI

JSB

VS461

M57

W

VSDA

NBS23a

20047

KL10

IP90

NBS1AB

BITS

KL11

PBI

H13 sekv. id. č. 1 sekv. id. č. 3 sekv. id. č. 5 sekv. id. č. 7 sekv. id. č. 9 sekv. id. č. 11 sekv. id. č. 13 sekv. id. č. 15 sekv. id. č. 17 sekv. id. č. 19 sekv. id. č. 21 sekv. id. č. 23 sekv. id. č. 25 sekv. id. č. 27 sekv. id. č. 29 sekv. id. č. 31 sekv. id. č. 33 sekv. id. č. 35 sekv. id. č. 37 sekv. id. č. 39 sekv. id. č. 41 sekv. id. č. 43 sekv. id. č. 45 sekv. id. č. 47 sekv. id. č. 49 sekv. id. č. 51.

Aminokyselinové sekvence OspC antigenů následujících kmenů Borrelia uvedených na obrázku 9a odpovídají následujícím sekvencím identifikačních čísel (sekv. id. č.):

28691 2591 IP2 25015 ZS7 297 SIMON

sekv. id. č. 2 sekv. id. č. 4 sekv. id. č. 6 sekv. id. č. 8 sekv. id. č. 10 sekv. id. č. 12 sekv. id. č. 14

E61 ORTH ACA1 H9 JI

sekv. id. č. 16 sekv. id. č. 18 sekv. id. č. 20 sekv. id. č. 22 sekv. id. č. 24

JSB sekv. id. č. 26

VS461 sekv. id. č. 28

M57

W VSDA NBS23a 20047

KL10

IP90 NBS1AB BITS KL11 sekv. id. č. 30 sekv. id. č. 32 sekv. id. č. 34 sekv. id. č. 36 sekv. id. č. 38 sekv. id. č. 40 sekv. id. č. 42 sekv. id. č. 44 sekv. id. č. 46 sekv. id. č. 48

-28CZ 289212 B6

PBI sekv. id. č. 50

H13 sekv. id. č. 52.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Imunogenní prostředek proti lymskému onemocnění, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden OspC antigen alespoň jednoho reprezentanta každé z běžně rozpoznávaných OspC skupin na obrázku 12.

   2. Imunogenní prostředek proti lymskému onemocnění, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden OspC antigen, kteiý je vybrán z OspC polypeptidů s aminokyselinovými sekvencemi ze skupiny sekv. id. č. 2, sekv. id. č. 8, sekv. id. č. 10, sekv. id. č. 12, sekv. id. č. 14, sekv. id. č. 16, sekv. id. č. 20, sekv. id. č. 22, sekv. id. č. 24, sekv. id. č. 28, sekv. id. ě. 30, sekv. id. č. 32, sekv. id. č. 34, sekv. id. č. 36, sekv. id. č. 38, sekv. id. č. 40, sekv. id. č. 42, sekv. id. č. 44, sekv. id. č. 46, sekv. id. č. 48 a sekv. id. č. 52.

   3. Imunogenní prostředek proti lymskému onemocnění, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden OspC antigen, který je z alespoň 80% homologní s jakoukoliv aminokyselinovou sekvencí vybranou z OspC polypeptidů s aminokyselinovými sekvencemi ze skupiny sekv. id. č. 2, sekv. id. č. 8, sekv. id. č. 10, sekv. id. č. 12, sekv. id. č. 14, sekv. id. č. 16, sekv. id. č. 20, sekv. id. č. 22, sekv. id. č. 24, sekv. id. č. 28, sekv. id. č. 30, sekv. id. č. 32, sekv. id. č. 34, sekv. id. č. 36, sekv. id. č. 38, sekv. id. č. 40, sekv. id. č. 42, sekv. id. č. 44, sekv. id. č. 46, sekv. id. č. 48 a sekv. id. č. 52.

   4. Imunogenní prostředek proti lymskému onemocnění podle kteréhokoliv z předcházejících nároků laž 3, vyznačující se tím, že obsahuje fyziologicky přijatelný excipient.

   5. Imunogenní prostředek proti lymskému onemocnění podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že obsahuje vyčištěný OspC antigen.

   6. Imunogenní prostředek proti lymskému onemocnění podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní OspC antigen.

   7. Imunogenní prostředek proti lymskému onemocnění podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že antigen obsahuje epitop se sekvencí aminokyselin, která je vybrána ze skupiny sestávající ze sekv. id. č. 53 až 62

   1) VKLSESVASLSKAA (sekv. id. č. 53),
2. 2) TDNDSKEAILKTNGT (sekv. id. č. 54),
3. 3) KELTSPWAETPKKP (sekv. id. č. 55),
4. 4) FVLAVKEVETL (sekv. id. č. 56),
5. 5) YAISTLITEKLKAL (sekv. id. č. 57),
6. 6) PNLTEISKKITDSNA (sekv. id. č. 58),
7. 7) ASANSVKELTSPVV (sekv. id. č. 59),
8. 8) SPWAETPKKP (sekv. id. č. 60),
9. 9) GKKIQQNNGLGA (sekv. id. č. 61) a
10. 10) SPVVAESPKK (sekv. id. č. 62).

    8. Imunogenní prostředek proti lymskému onemocnění podle nároku 7, vyznačující se t í m, že obsahuje každý z epitopů 1) až 10), tedy sekv. id. č. 53 až 62.

    -29CZ 289212 B6

    9. Imunogenní prostředek proti lymskému onemocnění podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že dále obsahuje pomocné činidlo.

    10. Sekvence rekombinantní DNA, která obsahuje sekvenci nukleotidů kterékoliv sekvence OspC genu vybranou ze skupiny sekv. id. č. 1, sekv. id. č. 7, sekv. id. č. 9, sekv. id. č. 11, sekv. id. č. 13, sekv. id. č. 15, sekv. id. č. 19, sekv. id. č. 21, sekv. id. č. 23, sekv. id. č. 27, sekv. id. č. 29, sekv. id. č. 31, sekv. id. č. 33, sekv. id. č. 35, sekv. id. č. 37, sekv. id. č. 39, sekv. id. č. 41, sekv. id. č. 43, sekv. id. č. 45, sekv. id. č. 47 a sekv. id. č. 51.

    11. Sekvence rekombinantní DNA, která kóduje kterýkoliv z OspC antigenů, vybraná ze skupiny sekv. id. č. 2, sekv. id. č. 8, sekv. id. č. 10, sekv. id. č. 12, sekv. id. č. 14, sekv. id. č. 16, sekv. id. č. 20, sekv. id. č. 22, sekv. id. č. 24, sekv. id. č. 28, sekv. id. č. 30, sekv. id. č. 32, sekv. id. č. 34, sekv. id. č. 36, sekv. id. č. 38, sekv. id. č. 40, sekv. id. č. 42, sekv. id. č. 44, sekv. id. č. 46, sekv. id. č. 48 a sekv. id. č. 52.

    12. Sekvence rekombinantní DNA podle nároku 10, která je alespoň z 80 % homologní s kteroukoliv sekvencí OspC genu vybranou ze skupiny sekv. id. č. 1, sekv. id. č. 7, sekv. id. č. 9, sekv. id. č. 11, sekv. id. č. 13, sekv. id. č. 15, sekv. id. č. 19, sekv. id. č. 21, sekv. id. č. 23, sekv. id. č. 27, sekv. id. č. 29, sekv. id. č. 31, sekv. id. č. 33, sekv. id. č. 35, sekv. id. č. 37, sekv. id. č. 39, sekv. id. č. 41, sekv. id. č. 43, sekv. id. č. 45, sekv. id. č. 47 a sekv. id. č. 51.

    13. OspC antigen, kteiý

    i) je kódován kteroukoliv z nukleotidových sekvencí, která je vybrána ze skupiny sekvencí OspC genu sekv. id. č. 1, sekv. id. č. 7, sekv. id. č. 9, sekv. id. č. 11, sekv. id. č. 13, sekv. id. č. 15, sekv. id. č. 19, sekv. id. č. 21, sekv. id. č. 23, sekv. id. č. 27, sekv. id. č. 29, sekv. id. č. 31, sekv. id. č. 33, sekv. id. č. 35, sekv. id. č. 37, sekv. id. č. 39, sekv. id. č. 41, sekv. id. č. 43, sekv. id. č. 45, sekv. id. č. 47 a sekv. id. č. 51 nebo ii) je alespoň z 80 % homologní s kteroukoliv aminokyselinovou sekvencí, která je vybrána ze skupiny OspC sekv. id. č. 2, sekv. id. č. 8, sekv. id. č. 10, sekv. id. č. 12, sekv. id. č. 14, sekv. id. č. 16, sekv. id. č. 20, sekv. id. č. 22, sekv. id. č. 24, sekv. id. č. 28, sekv. id. č. 30, sekv. id. č. 32, sekv. id. č. 34, sekv. id. č. 36, sekv. id. č. 38, sekv. id. č. 40, sekv. id. č. 42, sekv. id. č. 44, sekv. id. č. 46, sekv. id. č. 48 a sekv. id. č. 52.

    14. Použití kombinace antigenů obsažených v imunogenních prostředcích podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 9 pro výrobu vakcíny pro léčení nebo předcházení lymské boreliosy u savce.

    15. Způsob rekombinantní výroby OspC antigenu podle nároku 13, vyznačující se t í m, že sestává ze stupňů:

    a) transformování eukaiyotické kvasinkové buňky expresním vektorem, který obsahuje sekvenci rekombinantní DNA podle kteréhokoliv z nároků 10 až 12,

    b) kultivování této kvasinkové buňky,

    c) popřípadě indukování exprese OspC genu přidáním methanolu,

    d) izolování buněk a

    e. vyčištění OspC antigenu.

    54 výkresů

    -30CZ 289212 B6

    Kmeny Borrelia použité v této studii

    kmen země Člověk klíště zvíře odkaz na dárce Kónig Rakousko I.ricinus I.Livey Orth Rakousko I.ricinus I.Livey HB1 Rakousko krev (myositida) E.Aberer W Rakousko CSF G.Stanek H1 Rakousko kůže E.Aberer H10 Rakousko kůže E.Aberer Hll Rakousko kůže E.Aberer H13 Rakousko kůže E.Aberer H15 Rakousko kůže E.Aberer H2 Rakousko kůže E.Aberer H5 Rakousko kůže E.Aberer H6 Rakousko kůže E.Aberer H8 Rakousko kůže E.Aberer H9 Rakousko kůže E.Aberer Simon Rakousko kůže E.Aberer H12 Rakousko kůže(ACA) E.Aberer H14 Rakousko kůže(ACA) E.Aberer H7 Rakousko kůže(ACA) E.Aberer H4 Rakousko kůže(EM) E.Aberer KL10 Česká rep. I.ricinus J.Jirous KLU Česká rep. I.ricinus J.Jirous KL5 Česká rep. I.ricinus J.Jirous KL6 Česká rep. I.ricinus J.Hercogova KC10 česká rep. krev (kardiak) J.Hercogova C78 Česká rep. krev(NB) J.Hercogova M57 Česká rep. CSF J.Hercogova E180 česká rep. kůže(EM) J.Hercogova E51 česká rep. kůže(EM) J.Hercogova E61 Česká rep. kůže(EM) J.Jirous

    Obr. 1

    -31CZ 289212 B6

    Kmeny Borrelia použité v této studii (pokračování)

    kmen země člověk klíště zvíře odkaz na dárce DK6 Dánsko CSF Theisen a spol.: J. Clin. Microiol. 21, 2570 (1993). DK7 Dánsko kůže(ACA) Theisen a spol.: J. Clin.

    Microiol, 21, 2570 (1993).

    DK26 Dánsko kůže(EM) Theisen a spol.: J. Clin. Microiol. 21, 2570 (1993). 153 Francie I.ricinus G.Baranton 20047 Francie I.ricinus G.Baranton IP1 Francie CSF G.Baranton IP2 Francie CSF G.Baranton ZS7 Německo I.ricinus DMS(5527) PBI Německo CSF Jauris-Heipke a sp.:

    Med. Microbiol. Inmunol.

    182. 37 (1993).

    PIH Německo kůže(ACA) V.Preac-Mursic PKO Německo kůže(AM) J.Jirous MK5 Maďarsko I.ricinus A.Lakos MK6 Maďarsko I.ricinus A.Lakos BITS Itálie I.ricinus M.Cinco Gaultier Itálie kůže(EM) M.Cinco JI Japonsko I.persulcatus G.Baranton Litva Litva I.ricinus J.Bunikis IP21 Rusko I.persculatus E.L.Kornberg IP90 Rusko I.persculatus S.Bergstrom IR210 Rusko I.ricinus E.L.Kornberg JSB Slovinsko kůže E.Ruzic 871104 švédsko CSF J.Jirous NBS16 Švédsko Neuroborrelios S.Bergstrom NBSlab Švédsko Neuroborrelios S.Bergstrom NBS23a Švédsko Neuroborrelios S.Bergstrom NBS23b Švédsko Neuroborrelios S.Bergstrom

    Obr. 1 (pokračování)

    -32CZ 289212 B6

    Kmeny Borrelia použité v této studii (dokončení)

    kmen země člověk klíště zvíře odkaz na dárce ACA1 Švédsko kůže (ACA) S.Bergstrom IRS švýcarsko I.ricinus ATCC(35211) VS102 Švýcarsko I.ricinus 0.Peter VS116 švýcarsko I.ricinus 0.Peter VS185 Švýcarsko I.ricinus 0.Peter VS215 švýcarsko I.ricinus 0.Peter VS219 Švýcarsko I.ricinus 0.Peter VS461 Švýcarsko I.ricinus G.Baranton VSBM Švýcarsko CSF 0.Peter VSBP Švýcarsko CSF 0.Peter VSDA Švýcarsko CSF 0.Peter 26815 USA deňka J.F.Anderson 19857 USA králík J.F.Anderson 26816 USA hraboš J.F.Anderson 21347 USA myš/bílé tlapky J.F.Anderson 2591 USA myš/bílé tlapky Padula a sp.: Infect.Immun. žl, 5097 (1993). 25015 USA I.dammini J.F.Anderson 27579 USA I.dammini J.F.Anderson 27985 USA I.dammini J.F.Anderson 28354 USA I.dammini J.F.Anderson 28691 USA I.dammini J.F.Anderson B31 USA I.dammini ATCC(35210) 19952 USA I.dentatus J.F.Anderson Son 188 USA I.pacificus J.Jirous HB4 USA krev j.Jirous 297 USA CSF J.Jirous

    Obr. 1 (dokončení)

    -33CZ 289212 B6

    Adresy dodavatelů kmenů

    Dr. G. Stanek: Vídeňská universita, Ústav hygieny, Kinderspital Gasse 15, 1095 Vídeň, Rakousko

    J. Bunikis, Vilnius University, Lab. of Zosmoses, P.O.Box 472, 232007 Vilius 7, Lithmgmiam, USS

    ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776

    Dr. G. Baranton, Pasteur Institute, 28 rue du Dr. Roux, 75724 Ced 15 Paris, Francie

    Dr. J. Jirouš, Ústav hygieny a epidemiologie, Svobarova 48, 100 42 Praha 10, Česká republika

    Doc. S. Bergstróm, University of Umeá, Mikrobiologické oddělení, 901 87 Umea, Švédsko

    Dr. M. Cinco, University of Trieste, Mikrobiologický ústav, Via Flemin 22, Trieste, Itálie

    Dr. J. F. Anderson, Danderyd Hospital, oddělení infekčních onemocnění, 182 88 Dandery, švédsko

    Dr. V. Preac-Mursic, Pettenkofer Institute, Pettenkoferstr. 9a, 8000 Múnchen 2, SRN

    Dr. E. Aberer, II oddělení dermatologie, AlserstraBe 4, 1090 Vídeň, Rakousko

    Prof. G. Stierstedt, Danderyd Hospital, Oddělení infekčních onemocnění, 182 88 Dandery, Švédsko

    Dr. J. Hercogová, Dermatovenerologická klinika, Karlova universita, Bodimova 2, 180 81 Praha 8, Česká republika

    Dr. R. Ruzic, Mikrobiologický ústav, Zaleska 4, 61105 Ljubljana, Slovinsko

    Prof. E. Korenberg, The Gamaleya institute, Vector Laboratory, Gemeleya Strasse 18, 123098 Moskva, Rusko

    Dr. A. Lakos, Cebtral Hospital, Infect. Dis., P.O.Box 29, 1450 Budapešť, Maďarsko

    Dr. O. Peter, Institut Centrál des Hospitaux Val, 1950 Sión, Švýcarsko

    Obr. 2

    -34CZ 289212 B6

    BBM serie monoklonálních protilátek použitých v CMAT analýze

    BBM antigenová mol.hmotn. homologní isotyp monoklonální specifita homologního kmen protilátka antigenu BBM 33 E 90 90,5 W/B31 IgGl BBM 26 E 60 60,4 W/B31 IgGl BBM 20 E 60 60,4 W/B31 IgGl BBM 21 E 59 58,7 W/B31 IgGl BBM 14 Fla 42,2 W IgGl BBM 17 E 43 43,1 w IgGl BBM 16 E 43 43,1 w IgGl BBM 1 E 29 29 B31 IgGl BBM 12 E 22 22 B31 IgGl BBM 10 E 20 20 B31 IgGl BBM 32 E 18 18 W/B31 IgGl BBM 11 E 10 <15,0 B31 IgG3

    Obr. 3

    -35CZ 289212 B6

    Obvyklé skoré antigenů použitých v klastrové analýze

    CMAT - CM co xt m CO r- oo CD O v— - CM c*> T“ Tf LQ CO r~- oo cn 5T~ 20 CM 22 | co CM •P w c H .V. W· - CM CM CM CM CM - - - CM t— CM CM - - CM CM CM CM CM CM CO podsk. j v- - - - - - CM CM CM CM co CO CO xT xr xt xr xr XT xr xT M- o ναι CM CM CM CM CM CM CM CM UJ + Γ— UJ CM CM CM CM CM CM CM - - - X- - - - - E19 CM CM - CM CM - CM - CM xr - X- - - xT co xr xT xt xt xr - cn CM UJ - CM CM - - CO xT co xr UJ CM CO xT *M· xr xT xr Tj- xr xr X- m XT co co co co CO CO co co CO xř UJ - - - - - X- X- - - - X- - v— X- v— X- v— X“ - X- - v— i E50 CM CM CO co co co co xr M- xT xT CM - - xr co co LO LO tn - - E60 CO CO co co co co co LO tn co - CM CM CM LQ LO LO CO co CM tn o σ» UJ CM CM CM CM CM CM CM CM x~ CO CO T~ - Xt LO IO ->t tn CO xT to gc ΓΟΟ rsi SON 188 B31 21347 26815 xT tn Q co CM 20047 IP90 NBS16 20515 =5 X Ct O ACA1 | 19857 19952 871104 KL5 LITH H13 153 H4 | NBS23 CMAT - CM co xT tn co Γ- oo CD o - CM CO xr LQ <0 t— >- co V“ CD 20 CM | 22 23

    Obr. 4

    -36CZ 289212 B6

    Populační struktura onemocnění lymskou boreliosou lidský vý- podIsolát skyt skupina

    ... ...

    3Ί

    1Ί

    6 131

    Ί2

    1 12

    20 233

    1 13

    1Z.

    1Z,

    1 2Z.

    6 17I»

    1Z,

    2 2Z.

    1Z.

    2 2Z.

    2 2Z.

    klastr CHAT representativní knen

    1 1 IRS 1 2 ZS7 2 3 SON188 2 Z. 831 2 5 21367 2 6 26815 2 7 28351· 1 8 20047 1 9 IP90 1 10 NBS16 2 11 20515 1 12 JI 2 13 ORTH 2 U ACAI 1 15 19857 1 16 19952 2 17 871104 2 18 KL5 2 19 LITU 2 20 1113 2 21 153 2 22 HZ, 3 23 NBS23

    klastr č.

    skupina č.

    Obr. 5

    -37CZ 289212 B6

    Obr. 6

    Reakční schéma OspC Serovac monoklonální protilátky silná reakce někdy slabá- reakce

    -38CZ 289212 B6

    Polymorfie délky restrikčních fragmentů (RFLP) mezi OspC geny

    RFLP typ typ kmene neštěpeno Dpn11 Dde1 Dral 1 ZS7 639 103,189,347 258,381 120,159,360 2 B31 636 148,204,284 255,381 156,480 3 25015 639 287,352 045,141,453 104,535 4 297 636 010,149,206,271 120,135,381 156,480 5 H9 642 284,358 255,387 052,104,486 6 JI 639 284,355 639 052,104,483 7 ORTH 642 287,355 120,135,387 642 8 ACA1 639 206,433 032,223,348 052,104,483 9 JSB 642 027,149,175,287 165,222,255 040,116,213,273 10 E61 639 287,352 255,384 156,483 11 Simon 642 149,206,287 089,553 156,486 12 M57 633 089,176,179,189 253,378 154,222,255 13 W 636 065,086,117,179,189 636 156,480 14 KL10 639 122,235,282 114,261,264 155,484 15 NBSlab 639 235,404 114,120.141,264156,483 16 IP90 639 115,120,404 114,120,141,264156,483 17 BITS 639 101,115,120,303 639 052,104,483 18 PBI 627 627 027,228,372 052,104,471 19 KL11 627 115,512 005,027,223,372 156,471 20 20047 633 189,444 261,372 025,104,477 21 NBS23a 639 215,424 162,213,262 154,483 22 VS461 633 149,206,278 135,49B 104,529 23 VSDA 630 119,160,355 255,375 052,104,474 24 2591 642 281,361 219,423 156,228,258 25 H13 627 189,438 024,213,390 156,471 26 Son188 642 110,240.290 205,437 152,490 27 28691 633 633 255,378 052,104,477 28 21347 633 290,343 108,132,393 145,488 29 26815 642 642 083,559 095,547 30 28354 642 642 245,397 095,547 31 19857 639 281,358 275,382 298,341 32 19952 639 67,197,375 260,373 639 33 NBS16 633 090,195,348 240,393 150,483 34 153 642 267,375 120,120,402 160,482 35 VS116 633 155,200,278 633 633