PL178775B1

PL178775B1 - Kompozycja immunogenna, rekombinacyjne sekwencje DNA, rekombinacyjny wektor ekspresyjny, transformowana komórka gospodarza i antygen OspC

Info

Publication number: PL178775B1
Application number: PL94311301A
Authority: PL
Inventors: Ian Livey; Brian Crowe; Friedrich Dorner
Original assignee: Baxter Ag
Priority date: 1993-04-29
Filing date: 1994-04-29
Publication date: 2000-06-30
Also published as: AU6722994A; JPH08509371A; FI955150A0; WO1994025596A2; NO954318L; HRP940279A2; SK279968B6; CZ289212B6; CA2161534A1; EP0701612B1; PL311301A1; DE69408135T2; ES2114687T3; DK0701612T3; NO954318D0; AU683260B2; HUT72923A; HU9502002D0; EP0701612A1; WO1994025596A3

Abstract

1 Kompozycja immunogenna, znam ienna tym, ze zawiera (a) pewna ilosc materialu zawierajacego (i) dwa lub wiecej antygenów OspC oczyszczonych z kretka Borrelia choroby z Lyme 7 kazdej z 20 rodzin OspC, przedstawionych na fig 11, lub (ii) dwa lub wiecej antygenów OspC oczyszczonych 7 kretka Borrelia choroby z Lyme z rodzin OspC przedstawionych na fig 19, które ulegaja ekspresji w jednym lub wiecej klonach lub grupach klonów zwiazanych 7 chorobami czlowieka (HDA), lub (iii) warianty OspC lub mimetyki OspC tych antygenów OspC, przy czym te warianty OspC lub mimetyki OspC maja strukture dostatecznie podobna do struktury natywnego OspC dla pobudzenia ochronnej odpowiedzi immunologicznej, a ilosc ta jest wystarczajaca do wywolania u ssaka narazonego na borelioze z Lyme, odpowiedzi immunologicznej na poziomie zabezpieczajacym przed borelioza z Lyme i jest rzedu od 1 do 100 mikrogramów na antygen na dawke, oraz (b) fizjologicznie dopuszczalna zarobke 16 Rekombinacyjna sekwencja DNA, znamienna tym, ze zawiera sekwencje nukleotydowa dowolnej sekwencji genu OspC ze szczepów 28691, 25015, SZ7, 297, SIMON, E61, ACA1, H9, J 1, VS461, M57, W, VSDA, NBS przedstawionych na fig 8a 17 Rekombinacyjna sekwencja DNA kodujaca antygeny OspC ze szczepów 28691, 25015, SZ7, 297, SIMON, E61, ACA1, H9, J 1, VS461, M57, W, VSDA, NBS przedstawionych na fig 9a 19 Rekombinacyjny wektor ekspresyjny zawierajacy sekwencje kodujaca antygen OspC dowolnej z 20 rodzin OspC przedstawionych na fig 1 1 25 Komorka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym zawierajacym a) sekwencje kodujaca antygen OspC dowolnej z 20 rodzin OspC przedstawionych na fig 11, albo b) rekombinacyjna sekwencje DNA, która i) zawiera sekwencje nukleotydowa dowolnej sekwencji genu OspC ze szczepów 28691, 25015, SZ7, 297, SIMON, H61, ACA1, H9, J 1, VS461, M57, W, VSDA, NBS przedstawionych na fig 8a, albo ii) koduje antygeny OspC ze szczepów 28691, 25015, SZ7, 297, SIMON, E61, ACA1, H9, J 1, VS461, M57, W, VSDA, NBS przedstawionych na fig 9a, albo iii) jest homologiczna w co najmniej 80% do jednej z sekwencji genu OspC z fig 8a 26 Antygen OspC, znam ienny tym, ze a) jest kodowany przez sekwencje która i) zawiera sekwencje nuklcotydowa dowolnej sekwencji genu OspC ze szczepów 28691, 25015, SZ7, 297, SIMON, E61, ACA1, H9, J 1, VS461, M57, W, VSDA, NBS przedstawionych na fig 8a, albo ii) koduje antygeny OspC ze szczepów 28691, 25015, SZ7, 297, SIMON, E61, ACA1, H9, J 1, VS461, M57, W, VSDA, NBS przedstawionych na fig 9a, albo iii) jest homologiczna w co najmniej 80% do jednej z sekwencji genu OspC z fig 8a b) wykazuje co najmniej 80% homologn z dowolna z sekwencji aminokwasowych, przedstawionych na fig 9a PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są również rekombinacyjne sposoby wytwarzania nowych antygenów.

Choroba z Lyme, czyli borelioza z Lyme, to terminy stosowane dla opisania różnorodnych objawów klinicznych, związanych z przenoszonymi przez kleszcze zakażeniami krętkowymi, wywołanymi przez krętek Borrelia choroby z Lyme. Do najczęstszych objawów choroby z Lyme należą zaburzenia dotyczące skóry [erythema migrans (rumień wędrujący) - EM, lub acrodermatitis chronica atrophicans (zapalenie zanikowe skóry obwodowych części kończyn) - ACA], układu nerwowego (neuroborelioza), i stawów (zapalenie stawów), jednakże zakażenie i choroba mogą dotyczyć również innych narządów i tkanek. Choroba z Lyme występuje na całym święcie; stanowi ona najczęstszą chorobę przenoszoną przez kleszcze zarówno w Stanach Zjednoczonych, jak i w Europie. Choroba z Lyme, spotykana w Europie, wiąże się zwykle z bardziej różnorodnymi objawami klinicznymi, niż w Stanach Zjednoczonych: zaburzenia dotyczące skóry i układu nerwowego są częste w Europie, a rzadkie w Stanach Zjednoczonych, natomiast zapalenie stawów występuje częściej w Stanach Zjednoczonych, niż w Europie. Objawy

178 775 kliniczne tej choroby w Ameryce Północnej wydają się stanowić podgrupę objawów obserwowanych w Europie.

Chorobę z Lyme leczy się, typowo, antybiotykami. Wdrożenie leczenia bywa jednakże opóźnione z powodu często złożonego obrazu klinicznego i braku szeroko dostępnych, wiarygodnych testów diagnostycznych. Jeżeli dopuści się do przejścia choroby w stadium przewlekłe, leczenie antybiotykami jest trudniejsze i nie zawsze skuteczne. Ponadto, w przypadku przedłużającego się zakażenia, zwiększa się ryzyko trwałych uszkodzeń. Tak więc, korzystne byłoby wytworzenie szczepionki zapobiegającej chorobie z Lyme.

Opisano dwa antygeny krętka boreliozy choroby z Lyme, które mogłyby zapobiegać zakażeniu/zachorowaniu, wywołanemu przez ten krętek, co określano na modelach zwierzęcych choroby z Lyme. Antygeny te, OspA i OspC (czyli „pC”) mogłyby więc stanowić składnik szczepionek zabezpieczających przed chorobą z Lyme Por. Simon i wsp., patent europejski nr 418 827; Fikng i wsp., Science, 250: 553-56 (1990); Preac-Mursic i wsp Infection 20: 342-49, 1992) OspA i OspC mają wiele cech wspólnych. Oba te antygeny stanowią hpoprotemy, eksponowane na powierzchni komórek (Howe i wsp. Science 227: 645-46, (1985); Bergstrom i wsp., Mol. Microbiol. 3: 479-486, (1989)), oba są kodowane w plazmidach (Barbour i wsp., Science 237’ 409-11, (1987); Marconi i wsp., J. BacterioL 175: 926-32, (1983)), geny kodujące te białka są obecne u większości szczepów bakteryjnych (Barbour i wsp., J. Infect. Dis. 152: 478-84 (1985); Marconi i wsp., J. Bacteriol. 175: 926-32, (1993), i oba istniejąw licznych, serologicznie różnych postaciach (Wilske i wsp., (1989)).

Istnienie wielu serologicznie odmiennych postaci tych antygenów jest przeszkodąw opracowaniu szczepionki OspA i/lub OspC, zapobiegającej większości, jeśli nie wszystkim, odmianom choroby z Lyme. Na przykład, Fikng i wsp. (J. Immun. 148: 2256-60, (1992) wykazali, że immumzacja jedną postacią serologiczną OspA, np. rekombinacyjnym OspA szczepu N40, niekoniecznie zabezpiecza przed zakażeniem szczepem wykazującym ekspresję innego OspA, np., szczepem 25015. Tak więc niezbędne jest opracowanie schematu typowania dla klasyfikacji i podziału na grupy różnych odmian antygenów (np. OspA i/lub OspC), w celu określenia optymalnej mieszaniny serologicznie odmiennych postaci antygenu (antygenów), niezbędnych do zapewnienia szerokiego zakresu zabezpieczenia.

System typowania serologicznego dla OspA opracowano, stosując ograniczoną liczbę przeciwciał monoklonalnych jako narzędzi typowania; stosując tę metodologię, opisano siedem serotypów OspA. Wilske i wsp., Ann. N. Y. Acad. Sci. 539:126-43 (1988). Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) genów OspA 55 różnych szczepów europejskich i północnoamerykańskich pozwoliła zidentyfikować sześć odrębnych grup genetycznych. Wallich i wsp., Infection and Immunity 60:4856-66 (1992). Białka OspA, wyizolowane ze szczepów północnoamerykańskich, wydają się dość jednolite: dwanaście z czternastu OspA należało do typu OspA I, a dwa - do typu OspA III. Przeciwnie, OspA wyizolowano ze szczepów europejskich są znacznie bardziej heterogenne: należą do nich OspA typu I (18), II (17), IV (4) i V (1). Odtworzenie „drzewa filogenetycznego” w oparciu o dane dotyczące sekwencji aminokwasowej dwunastu białek OspA poszczególnych szczepów B burgdorfen potwierdza wyniki analizy RFLP, jednakże brak danych o sekwencji aminokwasowej białek należących do dwóch z sześciu grup genetycznych. Jak dotąd nie opracowano systemu typowania OspC.

Przy doborze odpowiednich antygenów do zastosowania w szczepionce należy wziąć również pod uwagę, czy pochodzą one ze szczepów mających znaczenie epidemiologiczne w danej chorobie. W połowie lat 70 postulowano, że bakterie patogenne pochodzą od ograniczonej liczby klonów blisko spokrewnionych bakterii, które sąw pewien sposób szczególnie chorobotwórcze. Ta hipoteza klonalna została później potwierdzona Por. Achtman i wsp., J. Infect. Dis. 165: 53-68 (1992) Tak więc, jest wysoce prawdopodobne, ze spośród licznych występujących naturalnie szczepów krętka Borrelia choroby z Lyme tylko niewielka liczba klonów jest wysoce zaadaptowana do wywoływania choroby u ssaków, w szczególności u ludzi. W opracowaniu szczepionki, zabezpieczającej przed chorobąssaki, tak więc również ludzi, niezwykle istotne jest zidentyfikowanie klonów, związanych z chorobą, tak aby wysiłki skoncentrować właśnie

178 775 przeciwko nim. Tak więc niezbędne jest wyjaśnienie struktury populacyjnej gatunków krętka Borrelia choroby z Lyme i zidentyfikowanie klonów związanych z chorobą.

Jak do tej pory, stosowano różne sposoby dla wyjaśnienia struktury populacyjnej krętka Borrelia choroby z Lyme, w tym (A) analizę RFLP DNA genomu lub genów swoistych (LeFebvre i wsp., J. Chn. Microbiol. 27: 636-39 (1989); Marconi & Garon, J. Bactenol. 174: 241-44 (1992), Postic i wsp., Res. Microbiol. 141.465-75 (1990); Stahlhamrnar-Carlemalm i wsp., Zbl. Bak 274: 28-39 (1990), Adam i wsp., Infect. Immun. 549: 2579-85 (1991), Walhch i wsp., Infect. Immun 60, 4856-66 (1992), (B) hybrydyzację DNA/DNA (LeFebvre i wsp., J. Chn. Microbiol. 27 636-39 (1989); Postic i wsp., Res. Microbiol. 141: 465-75 (1990), (C) analizę 16S rRNA poprzez hybrydyzację do sond ohgonukleotydowych (Marconi i wsp., J. Chn. Microbiol. 30: 628-32 (1992) lub przez sekwencjonowame (Adam i wsp Infect. Immun. 59: 2579-85 (1991), Marconi & Garon, J. Bacteriol. 174:241-44 (1992)), (D) metodę „odcisków palców DNA” przez zapoczątkowaną w dowolnym miejscu pohmerazową reakcję łańcuchową (Welsh i wsp., Int. J. System. Bacteriol. 42: 370-77 (1992)), (E) elektroforezę enzymów z wielu miejsc (loci) genowych (Boerlin i wsp., Infect. Immun. 60: 1677-83 (1992), oraz (F) typowanie serologiczne izolatów (Peter & Bretz, Zbl. Baktk. 277: 28-33 (1992)). Dane uzyskane za pomocą tych różnych procedur wykazują daleko idącą zgodność. Ogólnie wy daje się, że izolaty krętka Borrelia choroby z Lyme można podzielić na co najmniej trzy główne grupy. Niektórzy uczeni uważająnawet, że różnice genetyczne pomiędzy szczepami należącymi do tych grup uzasadniałyby podział ich na trzy oddzielne gatunki: właściwy gatunek B. burgdorferi (typ szczepu B31), B. gannii sp. nov. (typ szczepu 20047) i gatunek określanyjako B. afzehi lub „Borrelia grupy VS461”. Por. Baranton i wsp., Int J. Syst. Bacteriol. 42: 378-383,1992, Marconi & Garon, jw. Pozostałe do pełnego wyjaśnienia znaczenie istnienia tych odmiennych grup dla opracowania szczepionki. Z danych Walhch i wsp., Infection & Immunity, 60: 4856-66 (1992) jasno wynika, że istnieje wyraźny związek między grupą genetyczną, do której należy izolat, i typem wytwarzanego OspA: izolaty z grupy, do której należy szczep B31 (grupa genetyczna AAA, czyli właściwa B. burgdorferi) wytwarzają OspA typu I (wszystkie trzydzieści analizowanych szczepów), izolaty z grupy, do której należy szczep 20047 (grupa genetyczna BBB, czyli B. gannii sp. nov.), wytwarzają zwykle OspA typu II (17/19), ale stwierdzano również OspA typu V (1/9) i VI (3/39), izolaty z grupy, do której należy szczep BO23 (grupa genetyczna BBA, czyli grupa VS461) wytwarzająOspA typu IV (4/4), pozostałe dwa izolaty (grupa genetyczna B, B/A, A) wytwarzają OspA typu III.

Północnoamerykańskie izolaty choroby z Lyme należą zwykle do jednej grupy (grupy genetycznej AAA, tzn. właściwa B. burgdorferi), których przedstawicielem jest B31, i w związku z tym wytwarzająOspA typu I. Wynika z tego, ze szczepionka zawierająca OspA typu I zabezpieczałaby wystarczająco przed większością izolatów powodujących obecnie chorobę z Lyme w Ameryce Północnej. W Europie obraz jest bardziej złożony, ponieważ wykrywa się wszystkie trzy główne klony, tak więc, odpowiednio, wykrywane typy OspA są znacznie bardziej różnorodnej (genotypy I, II, V, VI). Ponadto, w dwóch badaniach, przeprowadzonych z zastosowaniem izolatów choroby z Lyme, pochodzących z Europy stwierdzono, że OspA nie stanowiło zabezpieczenia; w badaniach tych stwierdzono również użyteczność OspC jako antygenu zabezpieczającego. Por. zgłoszenia patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 7/903 580; Preac-Mursic i wsp., Infection 20: 342-49 (1992).

Nie było uprzednio wiadomo, czy OspC jest dziedziczone klonalnie, przy czym poszczególnym grupom izolatów choroby z Lyme (tzn.: właściwa B. burgdorferi, B. gannii sp. nov. i grupa VS461) odpowiadałyby swoiste typy OspC. Ponieważ OspC jest kodowane w plazmidach, Marconi i wsp., J. Bacteriol. 175: 926-32, (1993), istnieje możliwość, że pomiędzy różnymi gatunkami izolatów choroby z Lyme zaszła poprzez plazmid wymiana genu OspC. W takim przypadku różne typy OspC, o których wiadomo, że istnieją, lecz nie zostały one zdefiniowane, nie musiałyby być dziedziczone klonalnie.

Krótki opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest opracowanie skutecznej szczepionki OspC, zapewniającej szeroką, krzyżową ochronę przed wszystkimi szczepami choroby z Lyme u ssaków,

178 775 poprzez dobór preparatów OspC w oparciu o konkretne rodziny OspC, ustalone poprzez typowanie fenotypowe (typowanie „serovar” OspC), typowanie sposobem RFLP, oraz analizę sekwencji różnych szczepów, pochodzących z całego świata. Ponadto stwierdzono, że gen OspC jest dziedziczony klonalnie. Tak więc możliwe jest obecnie interpretowanie wyników schematów typowania OspC w odniesieniu do informacji epidemiologicznych ze schematu „Typowania Wspólnych Antygenów Błonowych” (CMAT), opisanego poniżej, który można stosować do wyjaśnienia klonalnej struktury populacji szczepów krętka Borrelia choroby z Lyme. W ten sam sposób można obecnie dobrać najbardziej odpowiednie preparaty szczepionki OspC (a) dla umożliwienia opracowania szczepionki zabezpieczającej przed szczepem przeważającym w danym regionie geograficznym lub (b) dla zabezpieczenia swoistego, korzystnie, przed znaczącymi epidemiologicznie klonami lub grupami klonów B burgdorferi, związanymi z chorobą.

Dla spełnienia tego i pozostałych celów wynalazku, zgodnie z pierwszą cechą charakterystyczną niniejszego wynalazku, zapewnia się kompozycję immunogenną zawierającą:

(a) pewną ilość materiału zawierającego (i) jeden lub więcej oczyszczonych antygenów OspC krętka Borrelia choroby z Lyme z każdej z 20 znanych obecnie rodzin OspC z fig. 11, lub (u) substancje podobne do OspC lub odmiany OspC tych antygenów OspC, przy czym te substancje podobne do OspC lub odmiany OspC mają strukturę dostatecznie podobną do struktury natywnego OspC dla wytwarzania przeciwciał ochronnych; i (b) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym ta ilość jest wystarczająca do wywołania, u ssaka narażonego na borehozę z Lyme, odpowiedzi immunologicznej na poziomie zabezpieczającym przed borehozą z Lyme

Zgodnie z inną odmianą wykonania, powyższa kompozycja immunogenną zawiera jeden lub więcej, korzystnie, dwa lub więcej, antygenów OspC krętka Borrelia choroby z Lyme, spośród 20 znanych obecnie rodzin OspC, przedstawionych na fig. 11, lub substancji podobnych do OspC lub odmian OspC tych antygenów, jak to przedstawiono powyżej w punkcie (ii), i fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, jak to opisano powyżej w punkcie (b).

Zgodnie z kolejną cechą charakterystyczną niniejszego wynalazku, zapewnia się kompozycję immunogenną, zawierającąpewnąilość materiału zawierającego (i)jeden lub więcej oczyszczonych antygenów OspC krętka Borrelia choroby z Lyme z każdej z rodzin OspC wymienionych na fig. 19, które ulegają ekspresji na klonach lub grupach klonów HDA (związanych z chorobami człowieka) lub (ii) substancje podobne do OspC lub odmian OspC tych antygenów OspC, przy czym te substancje podobne do OspC lub odmiany OspC mają strukturę dostatecznie podobną do struktury natywnego OspC dla wytwarzania przeciwciał ochronnych; i (b) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym ta ilość jest wystarczająca do wywołania, u ssaka narażonego na boreliozę z Lyme, odpowiedzi immunologicznej na poziomie zabezpieczającym przed borehozą z Lyme.

W korzystnym wykonaniu, powyższa kompozycja immunogenną zawiera jeden lub więcej, korzystnie, dwa lub więcej, antygenów OspC z rodzin OspC, przedstawionych na fig. 19, lub substancji podobnych do OspC lub odmian OspC tych antygenów, jak to przedstawiono powyżej w punkcie (ii), i fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, jak to opisano powyżej w punkcie (b).

W korzystnym wykonaniu, kompozycja immunogenną według niniejszego wynalazku ma działanie zabezpieczające przed szczepami krętka Borrelia choroby z Lyme, przeważającymi w danym regionie geograficznym, takim np. jak Ameryka Północna, Europa lub Austria.

Zastrzega się jako korzystne wykonanie kombinowaną szczepionkę OspA/OspC, która jest korzystniejsza od szczepionki zawierającej tylko jeden z wymienionych antygenów.

Przedmiotem wynalazku są również rekombinacyjne sposoby wytwarzania nowych antygenów OspC, wraz z sekwencjami aminokwasowymi, wektorami ekspresyjnymi i transformowanymi komórkami - gospodarzami.

Inne przedmioty, cechy i korzystne właściwości niniejszego wynalazku wynikają w sposób oczywisty z następującego opisu szczegółowego. Rozumie się jednak, że szczegółowy opis i konkretne przykłady, wskazujące korzystne wykonania wynalazku, są podane jedynie dla ilu

178 775 stracji, ponieważ dla specjalistów oczywiste będą różne zmiany i modyfikacje, pozostające w zakresie mniejszego wynalazku

Krótki opis rysunków

Na figurze 1 przedstawiono 77 szczepów krętka Borrelia, stosowanych w badaniach doświadczalnych. Opisano kraj pochodzenia, źródło biologiczne (tzn. człowiek, kleszcz czy zwierzę), z których dany szczep został wyizolowany W przypadku izolatów ludzkich przedstawiono również materiał kliniczny i zespół objawów chorobowych, obecny u pacjenta (skróty: CSF płyn mózgowo-rdzeniowy; ACA - acrodermatitis chronica atrophicans; EM - erythema migrans). Zamieszczono również właściwości pięciu dodatkowych szczepów, nie badanych doświadczalnie, ponieważ opublikowane informacje dotyczące tych szczepów zastosowano w niektórych analizach.

Na figurze 2 przedstawiono spis adresów naukowców, którzy dostarczyli szczepów.

Na figurze 3 wymieniono przeciwciała monoklonalne i właściwości ich wspólnego antygenu błonowego. Przedstawiono również szczep reagujący homologicznie i izotyp przeciwciała monoklonalnego.

Na figurze 4 przedstawiono liczbę punktów i szczepy dla wszystkich CM AT, uzyskanych w schemacie typowania CMAT.

Na figurze 5 przedstawiono dendrogram analizy grupowej, przeprowadzonej na danych uzyskanych z typowania CMAT. Ukazano również częstość występowania CMAT pośród testowanych szczepów, a także grupowanie poszczególnych CMAT w grupy CMAT (wszystkie CMAT wykazujące>50% podobieństwa), i w rodzaje CMAT (wszystkie CMAT wykazujące > 20% podobieństwa).

Na figurze 6 przedstawiono wzorzec reakcji zestawu szesnastu przeciwciał monoklonalnych, skierowanych swoiście przeciwko OspC, z różnymi szczepami typu serovar.

Na figurze 7 przedstawiono wielkość fragmentów restrykcyjnych, uzyskanych po amplifikacji za pomocąPCR genów OspC (wytworzonych tak, jak to opisano w przykładzie 4, a następnie trawionych przez enzymy Dpnll, Ddel i Dral. Przedstawione dane ukazują 35 odrębnych wzorców fragmentów restrykcyjnych (tzn. 35 typów RFLP OspC), zidentyfikowanych na podstawie danych z analizy fragmentów restrykcyjnych 82 wymienionych szczepów). Podano również szczepy typowe, dobrane dla zilustrowania poszczególnych typów RFLP OspC.

Figura 8 przedstawia w sposób liniowy sekwencję nukleotydów, wchodzących w skład 24 genów OspC, dobranych ze szczepów, wymienionych na fig. 1, należących do typów RFLP OspC 1-24.

Na figurze 8a przedstawiono pełną sekwencję nowych genów OspC według fig. 8 wraz z końcem 3'. Dodatkowo, na fig. 8a przedstawiono sekwencję genów OspC szczepów Η13 i 28691.

Figura 9 przedstawia w sposób liniowy sekwencję aminokwasów, wyprowadzoną z danych dotyczących sekwencji nukleotydowej, przedstawionych na fig. 8. Region sekwencyjny odpowiada pierwszym 92% dojrzałego białka OspC.

Na figurze 9a przedstawiono pełną sekwencję aminokwasową nowych antygenów OspC według fig 9 wraz z aminokwasami C-końcowymi. Dodatkowo, na fig. 9a przedstawiono sekwencję antygenów OspC szczepów H13 i 28691.

Figura 10 stanowi dendrogram danych na temat sekwencji białka OspC, przedstawionych na fig. 9, ukazujący związki filogenetyczne między sekwencjami i stopień identyczności sekwencji Ten rodzaj analizy zastosowano dla przydzielenia białek OspC do rodzin OspC. Białka należą do rodziny OspC wtedy, kiedy ich sekwencje wykazująponad 80% tożsamość. Wykazano również, że białka OspC grupująsię zależnie od gatunku, co wskazywałoby na to, że białka OspC są dziedziczone klonalnie.

Na figurze 11 wymieniono 20 rodzin OspC i wskazano szczepy, wybrane jako przykłady każdej z rodzin.

Na figurze 12 podsumowano wyniki CMAT i typowania OspC 82 szczepów, wymienionych na fig 1. Dane posegregowano w zależności od rodziny OspC i typu RFLP, aby wykazać częstość występowania szczepów z danej rodziny OspC. Szczepy nie należące do żadnej rodziny

178 775

OspC oznaczono jako 99. Przedstawiono również dane na temat biologicznego i geograficznego pochodzenia szczepów dla umożliwienia porównania tych parametrów z danymi dotyczącymi rodziny OspC. Podano wartości CMAT dla pięciu szczepów, których opisy zostały opublikowane, lecz których me poddano badaniom (np. szczepy B. burgdorferi, B. afzeln i B. garinn odpowiadają, odpowiednio, CMAT 1, 3 i 4). Nie przedstawiono serovar OspC dla wszystkich szczepów; pięciu szczepów nie uzyskano (NA), innych nie badano (NT), ponieważ ekspresja OspC była niewystarczająca dla przeprowadzenia wiarygodnego typowania; niektóre szczepy przebadano, jednakże me reagowały one (NR) z zestawem przeciwciał monoklonalnych.

Na figurze 13 wymieniono sekwencje mapowanych epitopów OspC wraz z częstością ich występowania wśród analizowanych szczepów. Na dole tabeli podano podział przeciwciał monoklonalnych na kategorie według częstości, z jaką reagowały one z 77 badanymi szczepami.

Na figurze 14 przedstawiono ogólną mapę białka OspC z zaznaczeniem umiejscowienia epitopów wielu przeciwciał monoklonalnych BBM, oznaczonych numerami.

Na figurze 15 przedstawiono wyniki doświadczeń z aktywną immumzacją na modelu zwierzęcym (gerbile). Poszczególne grupy zwierząt immunizowano oczyszczonymi odmianami białka OspC z tej samej (H7) lub innych (ZS7, PKO, W) rodzin OspC, co szczep Orth, którym następnie zakażano zwierzęta. Wyniki wskazują, że istnieje silna ochrona krzyżowa przy immunizacji odmianą należącą do tej samej rodziny, co szczep, na który później organizm jest narażony, natomiast stopień ochrony jest bardzo niewielki lub żaden przy immunizacji odmianąOspC należącą do innej rodziny OspC, niż szczep, którym później zakaza się zwierzę.

Na figurze 16 podsumowano informacje z typowania OspC i dystrybucję izolatów ludzkich pomiędzy poszczególne typy OspC. Przedstawiono również swoistość i częstość występowania przeciwciał OspC w surowicy osób cierpiących na chorobę z Lyme, pochodzących z Republiki Czeskiej. Swoistość przeciwciał OspC określono za pomocą badania zestawem 18 różnych szczepów krętka Borreha z 16 rodzin OspC.

Na figurze 17 przedstawiono wektor ekspresyjny pPC-PP4, uzyskany z drożdży, z sekwencją kodującą OspC, pozostającą pod kontrolą transkrypcyjną promotora Α0Χ-1, indukowanego metanolem.

Na figurze 18 przedstawiono wyniki doświadczeń z aktywną immumzacją na modelu zwierzęcym (gerbile). Zwierzęta immunizowano oczyszczonym białkiem OspC, pochodzącym ze szczepu Orth B. burgdorferi, i wytworzonym rekombinacyjme przez P. pastons GS115/pPC-PP4. Wyniki wskazująna istnienie wysokiego stopnia ochrony, uzyskanego zarówno za pomocąbiałka OspC pochodzącego z krętka Borreha, jak i za pomocą białka wytworzonego przez drożdże.

Na figurze 19 przedstawiono przykłady preparatów szczepionki OspC, opracowanej dla ochrony przed swoistą chorobą człowieka, związaną z klonami lub grupami klonów krętka Borreha choroby z Lyme.

Szczegółowy opis wynalazku

Za pomocą sposobu serovar, polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) i analizy sekwencyjnej, opisanej bardziej szczegółowo poniżej, stwierdzono, że mimo wysokiej heterogeniczności białek OspC, stwierdzanej wśród izolatów choroby z Lyme, białka OspC można podzielić na ograniczoną liczbę rodzin na podstawie, między innymi, podobieństwa sekwencji aminokwasowej. Według niniejszego wynalazku, w następstwie tego stwierdzenia opracowano preparaty szczepionki, zapewniające wysoki stopień krzyżowej ochrony, w odniesieniu do różnych szczepów, jakiego me uzyskiwano uprzednio.

W celu zapewnienia takiej krzyżowej ochrony, należy przewidzieć skuteczność poszczególnych składników danej szczepionki w zabezpieczaniu przed wszystkimi możliwymi szczepami chorobotwórczymi Według mniejszego wynalazku, problem ten rozwiązano w ten sposób, że heterogenność ochronnych składników antygenowych w szczepionce możliwie wiernie odzwierciedla heterogenność stwierdzanąw naturze. W szczególności, w przypadku białka OspC osiąga się to wytwarzając szczepionki w ten sposób, że zawierają one szczepy należące do wszystkich rodzin OspC, określanych przez opisaną analizę sekwencyjną Co za tym idzie, w skład preparatu

178 775 szczepionki musi wchodzić 20 białek OspC, należących do wszystkich wyżej wymienionych rodzin OspC. Jako rodzinę OspC określa się grupę białek OspC, które wykazują powyżej 80% zgodności sekwencji aminokwasowej w pierwszych 92% dojrzałego białka OspC, tzn. z wyłączeniem informacji kodującej sekwencję początkowych 18aa i końcowych 16aa, jak to przedstawiono na fig 9, 9a i 10.

Zgodnie z jednąz cech charakterystycznych, przedmiotem mniejszego wynalazku jest kompozycja immunogenna, zawierająca jeden lub więcej antygenów OspC, uzyskanych z każdej z 20 rodzin OspC, przy czym rodziny te zostały po raz pierwszy opisane przez autorów niniejszego wynalazku, zastosowanie 20 antygenów, na przykład, stanowi postęp w porównaniu ze stosowaniem wszystkich możliwych odmian OspC, znajdywanych w naturze (por. 35 typów RFLP OspC, wzmiankowanych w niniejszym opisie). Według innej cechy niniejszego wynalazku, wytwarzanie szczepionki przeciwko chorobie z Lyme jest jeszcze bardziej uproszczone przez ograniczenie liczby składników antygenowych w sposób nie ograniczający profilaktycznej skuteczności szczepionki, przez łączne zastosowanie danych z typowania OspC i danych epidemiologicznych. Przykłady takiego podejścia, jak to opisano bardziej szczegółowo poniżej, stanowią (A) wytwarzanie preparatów szczepionki do stosowania w określonym regionie geograficznym, jak np w Ameryce Północnej, Europie, lub konkretnym kraju, takim jak Austria, oraz (B) opracowanie szczepionki zabezpieczającej swoiście przeciwko tylko tym klonom, zidentyfikowanym dzięki analizie CMAT, które są związane z chorobąu człowieka. W jednym z wykonań z punktu (A), szczepionka jest opracowywana do stosowania w Ameryce Północnej i zawiera antygeny należące tylko do tych rodzin OspC, do których należą szczepy amerykańskie, tzn. do rodzin 2 i 3 (por. fig. 12).

Zgodnie z innym wynalazkiem, szczepionka do zastosowania w Ameryce Północnej zawiera szczepy z rodzin 2, 3, 18 i 20.

W celu identyfikacji klonów krętka Borrelia choroby z Lyme, przeprowadzono analizę struktury populacyjnej za pomocą analizy CMAT. „(typ) CMAT” definiuje się jako niepowtarzalny, dziewięciocyfrowy numer, będący połączeniem numerów odmian (numery zależą od masy cząsteczkowej) dziewięciu wykrywanych wspólnych antygenów błonowych, i w niektórych przypadkach rozróżnianych przy zastosowaniu danego zestawu przeciwciał monoklonalnych, skierowanych swoiście przeciwko tym antygenom. „Grupa CMAT” stanowi grupę spokrewnionych (typów) CMAT, wykazujących co najmniej 50% podobieństwo co do numeru CMAT. Termin „rodzaj CMAT” stosuje się w niniejszym opisie dla określenia grupy typów CMAT, wykazujących co najmniej 20% podobieństwo co do numeru CMAT. Tak więc do rodzaju CMAT należeć może kilka grup CMAT, do których z kolei należeć może kilka typów CMAT „Klon” definiuje się jako typ CMAT, zawierający więcej niż jeden szczep, lub, inaczej, klon stanowi grupę szczepów o tym samym typie CMAT, o których zatem sądzi się, że pochodzą od wspólnego szczepu - przodka. „Grupa klonów” stanowi grupę klonów spokrewnionych na poziomie grupy CMAT (tzn. wtedy, gdy ich typy CMAT wykazują powyżej 50% podobieństwo). „Klon związany z chorobąu człowieka” stanowi klon, który, jak to można stwierdzić na podstawie danych epidemiologicznych i klinicznych, często wywołuje chorobę u ludzi. Podobnie, „grupa klonów związana z chorobąu człowieka” stanowi grupę klonów, o której można stwierdzić na podstawie danych epidemiologicznych i klinicznych, że często wywołuje chorobę u ludzi. W wykonaniu z punktu B (por. wyżej), szczepionka OspC jest skierowana przeciwko klonom CMAT, związanym z chorobąu człowieka, 1.2.4,3.2.13 i grupom klonów 4.2.17,4.2.18, 4 2.2014 2.22.

Wiadomo, że OspC stanowi immunogen odpowiedni do wywoływania ochronnej odpowiedzi immunologicznej w badaniach na modelach zwierzęcych choroby z Lyme, jeżeli organizm zakażający stanowi ten sam izolat choroby z Lyme, z którego pochodzi OspC. Jednakże z powodu heterogeniczności serologicznej białek OspC wśród szczepów krętka Borrelia choroby z Lyme uważano, że immunizacja OspC jednego szczepu niekoniecznie zabezpiecza przed zakażeniem rozmaitymi innymi izolatami krętków Borrelia choroby z Lyme, i zgłaszano potrzebę potwierdzenia tych założeń w oparciu o badania nad zabezpieczeniem krzyżowym (przykład 6).

178 775

Po przeprowadzeniu tych badań stało się jasne, ze szczepionka oparta na OspC musi zawierać kilka serologicznie odmiennych form OspC. Warunkiem wstępnym wytworzenia takiej pohwalentnej szczepionki OspC jest znajomość stopnia odmienności różnych form OspC i stopnia spokrewnienia tych różnych form. Zgodnie z powyższym, informację taką wykorzystano według niniejszego wynalazku do opracowania nowych preparatów szczepionki przeciwko krętkom Borreha choroby z Lyme.

Pierwszym etapem w uzyskaniu niezbędnej informacji było opracowanie systemu typowania, opartego na przeciwciałach monoklonalnych (przykład 1) dla scharakteryzowania białek OspC różnych szczepów krętków Borreha choroby z Lyme. W celu zapewnienia zanalizowania jak najszerszego zakresu białek OspC, zbadano liczne szczepy krętka Borreha choroby z Lyme (tj. spośród 82 szczepów, przedstawionych na fig 1, dobrano 62, wytwarzające OspC w ilości wystarczającej dla umożliwienia wiarygodnej charakterystyki), pochodzące z różnych regionów geograficznych, wyizolowane od ludzi (np. ze skóry, płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi), zwierząt i kleszczy. Inny kluczowy aspekt tej analizy stanowiło zastosowanie licznych przeciwciał monoklonalnych, skierowanych swoiście przeciwko OspC (25 w mniejszym przykładzie), które były skierowane me tylko przeciwko jednemubiałku OspC, lecz przeciwko sześciu różnym białkom OspC, zwiększając w ten sposób różnorodność epitopów OspC, które mogą być rozpoznawane, przez co uzyskano większą zdolność rozróżniania poszczególnych białek OspC. Z danych uzyskanych w tej analizie wynika jasno, że pośród białek OspC, uzyskanych z różnych źródeł, istnieje znaczny stopień serologicznej heterogenności. Na figurze 6 przedstawiono przykłady wzorców reakcji 16 odrębnych typów, czyli serovar, OspC zidentyfikowanych za pomocą zestawu 13 przeciwciał monoklonalnych. Ponadto 12 szczepów nie nadawało się do typowania, ponieważ nie reagowały one z żadnym z przeciwciał monoklonalnych

Jakkolwiek wysoce skuteczne, serologiczne typowanie OspC jest jednakże niepełne, ponieważ wymaga ono zarówno ekspresji OspC jako głównego białka, jak i dostępności przeciwciał o szerokim zakresie swoistości. Z wyników analizy serovar jasno wynika, że nie wykrywano pełnego spektrum różnorodności antygenowej za pomocą stosowanych przeciwciał monoklonalnych, mimo że dobrano je tak, aby ten problem zminimalizować. W związku z tym heterogenność OspC badano dalej, stosując analizę za pomocą polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) dla genu OspC ((przykład 3). Analiza danych, odnoszących się do 82 szczepów (tzn. dane doświadczalne dotyczące wszystkich 77 szczepów w naszej hodowli plus informacje wywiedzione z pięciu opublikowanych sekwencji OspC; po. fig. 1), wykazała istnienie 35 odmiennych typów RFLP OspC. Jakkolwiek sposób ten pozwala wykryć więcej odmian, niż przy typowaniu sposobem serovar, istnieje znakomita zgodność pomiędzy wynikami uzyskanymi tymi dwoma sposobami (fig. 12).

Klasyfikacja szczepów krętka Borreha w typy serovar i RFLP w zależności od białka OspC lub genu, które szczepy te posiadają umożliwia, według mniejszego wynalazku, dobranie, dla bardziej szczegółowej charakterystyki, pewnej liczby odmian OspC, reprezentujących całość populacji. Tak więc dobrano zestaw 29 szczepów, zawierających po jednym lub więcej przedstawicielu wszystkich najpospolitszych typów OspC, następnie za pomocą PCR dokonano amphfikacji genu OspC i określono sekwencję nukleotydową a następnie wywiedziono z niej sekwencję aminokwasową (por. przykład 4).

Sekwencję aminokwasowądojrzałego białka OspC (od cysteiny 19; por. zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych nr 07/903 580, uprzednio już włączone do niniejszego opisu przez przywołanie), z wyjątkiem ostatnich 16 aminokwasów, zastosowano do określenia pokrewieństwa pomiędzy białkami OspC należącymi do różnych typów OspC serovar/RFLP.

Jako kolejny sprawdzian prawidłowości systemu typowania i ustalenia, czy istnieje dalsza heterogenność w danym typie OspC, badano pokrewieństwo pomiędzy blisko spokrewnionymi białkami OspC, należącymi do tego samego typu OspC. Na figurach 8 i 9 przedstawiono, odpowiednio, sekwencję nukleotydów i wywiedzioną sekwencję aminokwasową białek OspC 24 szczepów (tzn. 22 sekwencje z mniejszego badania i dwie sekwencje opublikowane - szczepów

178 775

2591 i PBI). Na figurze 10 przedstawiono dendrogram, ukazujący związek filogenetyczny pomiędzy białkami OspC.

Immunogen oparty na antygenie OspC według niniejszego wynalazku może zawierać mieszaninę różnych form serologicznych występujących w przyrodzie białek OspC. W innym wykonaniu wynalazku, kompozycja immunogenna zawiera odmiany OspC lub substancji podobnych do OspC antygenów OspC. Tak więc, oprócz białek OspC, uzyskanych z komórek krętka Borreha choroby z Lyme, jak to opisano poniżej, można stosować rekombinacyjne odmiany OspC cząsteczek występujących w przyrodzie („odmiany OspC”), i substancje podobne do OspC związki posiadające mimotopy naśladujące epitopy OspC.

Do kategorii odmian OspC należą np. ohgopeptydy i pohpeptydy, odpowiadające częściom immunogennym cząsteczki OspC, i dowolne niebiałkowe części immunogenne cząsteczki OspC. Tak więc, odmianę stanowić może polipeptyd homologiczny z naturalną cząsteczką OspC i zachowujący jej najważniejsze cechy immunologiczne. W tym ujęciu, „homologia” między dwiema sekwencjami oznacza podobieństwo przy braku tożsamości, wskazujące na pochodzenie pierwszej sekwencji od drugiej. Na przy kład, pohpeptydjest „homologiczny” do OspC, jeżeli zawiera sekwencję ammokwasową odpowiadającąepitopowi rozpoznawanemu przez przeciwciała lub komórki T skierowane swoiście przeciwko OspC. Taka sekwencja może być zbudowana tylko z kilku aminokwasów i może stanowić determinantę liniową lub taką, która powstaje wtedy, gdy aminokwasy z oddzielnych części sekwencji liniowej znajdą się naprzeciwko siebie w przestrzeni po sfałdowaniu białka lub wtedy, gdy ulegną modyfikacji poprzez powstanie wiązań kowalencyjnych. Sekwencje aminokwasowe, które stanowią determinanty antygenowe w rozumieniu mniejszego wynalazku, można sprawdzić, stosując np. techniki analizy mapowania monoklonalnego znane ze stanu techniki. Por. Regenmortel, Immunology Today 10: 266-72 (1989) i Berzofsky i wsp., Immunological Reciews 98:9-52 (1987). Na przykład, w niniejszym wynalazku antygen OspC zawiera jedną lub więcej następujących sekwencji aminokwasowych (fig. 13):

(1) VKLSEVSALSKAA; (2) TDNDSKEAILKTNGT;

(3) KELTSPWAETPKKP; (4) FVLAVKEVETL;

(5) YAISTLITEKLKAL; (6) PNLTEISKKITDSNA;

(7) ASANSVKELTSPW; (8) SPWAETPKKP;

(9) GKKIQQNNGLGA; i (10) SPWAESPKK lub odmiany lub sekwencje podobne do powyższych sekwencji epitopowych.

W korzystnym wykonaniu, szczepionka zawiera peptydy odpowiadające epitopom serotypowo swoistym, dobrane spośród jednego lub więcej białek OspC z rodzin OspC, opisanych w mniejszym zgłoszeniu. Badania nad zabezpieczeniem krzyżowym (przykład 6) wskazują, że odporność zabezpieczająca wywoływana jest przez epitopy serotypowo swoiste. Przykład epitopu serotypowo swoistego stanowi sekwencja #2 ze szczepu Orth (por. wyżej), rozpoznawana przez przeciwciała monoklonalne BBM38 i BBM39, skierowane swoiście przeciwko białkom OspC z rodziny 5 OspC (serovar 4). Epitop ten odpowiada epitopowi próbnemu (DNDSKE), którego istnienie można wywnioskować z analizy hydrofilności OspC Orth. Podobnie można wnioskować o obecności potencjalnych serotypowo swoistych epiotopów pomiędzy resztami aminokwasowymi 120-155 (poczynając od pierwszej reszty cysteinowej) w białkach OspC pochodzących z innych rodzin OspC (przykład 4). W skład takiej szczepionki mogą wchodzić odmiany lub substancje podobne do sekwencji peptydowych, jak to opisano poniżej. Próby na tego rodzaju podobieństwo można również wykonać poprzez badanie hamowania kompetycyjnego, w przypadku przeciwciał, lub poprzez proliferację komórek T.

Według niniejszego wynalazku, przeciwciała stanowiące odmianę OspC zgodnie z niniejszymi kryteriami można wytwarzać stosując konwencjonalne odwrotne techniki genetyczne, tzn. oznaczając sekwencję genetycznąw oparciu o sekwencję ammokwasową, lub poprzez konwencjonalne genetyczne techniki składania genów. Na przykład, odmiany OspC wytwarzać można technikami obejmującymi mutagenną ukierunkowaną na miejsce lub na oligonukleotyd. Por.

178 775 np. „Mutageneza klonowanego DNA” w CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 8.0. 3 et seq. (pod red. Ausubel i wsp., 1989) („Ausubel”).

Inne odmiany OspC według niniejszego wynalazku stanowią cząsteczki odpowiadające części OspC, lub zawierające część OspC, lecz me ściśle tożsame z cząsteczką naturalną wykazujące aktywność immunogennąOspC, kiedy prezentowane są samodzielnie lub kiedy połączone są z nośnikiem. Tego rodzaju odmiana OspC może stanowić fragment cząsteczki naturalnej lub polipeptyd wytworzony de novo, lub rekombinacyjme.

Dla zastosowania do rekombinacyjnej ekspresji OspC lub odmiany OspC, cząsteczka pohnukleotydowa kodująca taką cząsteczkę zawiera, korzystnie, sekwencję nukleotydową odpowiadającą pożądanej sekwencji aminokwasowej, dobranej optymalnie ze względu na gospodarza pod względem zastosowania kodonu, zapoczątkowania translacji i ekspresji handlowo użytecznych ilości OspC lub pożądanej odmiany OspC. Również wektor, dobrany do transformacji danego organizmu - gospodarza za pomocą takiej cząsteczki polinukleotydowej, musi zapewniać skuteczne warunki i transkrypcję sekwencji kodującej polipeptyd. Kodująca cząsteczka polinukleotydowa może kodować białko chimeryczne, tzn. może mieć sekwencję nukleotydową kodującą część immunologiczną cząsteczki OspC, przyłączoną w sposób umożliwiający działanie do sekwencji kodującej me-OspC część cząsteczki, takiej jak np. peptyd stanowiący sygnał dla komórki - gospodarza.

W celu wyizolowania segmentu DNA kodującego cząsteczkę OspC, można wytworzyć opublikowanym sposobami całość DNA krętka Borrelia choroby z Lyme. Por. np. Maniatis i wsp., MOLECULAR CLON1NG: A LABORATORY MANUAŁ (Cold Spring Harbor Laboratories, NY 1982); Baees, acta Pathol Microbiol. Scand. (Sect. B) 82:780-84 (1974). Uzyskane w ten sposób DNA można częściowo trawić enzymami restrykcyjnymi dla zapewnienia mniej czy więcej losowego doboru fragmentów genomowych; do tego celu odpowiedni jest enzym z tetranukleotydowym miejscem rozpoznawania, jak np. Sau3A (Mbol) Fragmenty uzyskane po takim częściowym trawieniu można frakcjonować w zależności od wielkości, stosując np.odwirowywanie gradientowe w sacharozie (por. Maniatis, jw) lub elektroforezę żelowąpola impulsowego, por. AnaL Trends in Genetics (listopad 1986), str. 278-83, dla zapewnienia fragmentów o długości współmiernej z długością DNA kodującego cząsteczkę OspC

Zgodnie z dobrze znanymi sposobami, opisanymi np. w Ausubel 5.0.1 et seq., dobrane fragmenty można klonować do odpowiedniego wektora klonującego. Można następnie dokonywać insercji otrzymanego w ten sposób DNA, np do miejsca BamHI wektora klonującego pUC18. Następnie chiemryczne plazmidy lub fag, między innymi, wytworzone przez dołączenie fragmentów dobranych ze względu na wielkość do wektora klonującego, można transformować do E. coli, lub innej komórki - gospodarza, którą następnie przegląda się pod kątem ekspresji kodowanego białka. Do przeglądania biblioteki w celu zidentyfikowania klonu zawierającego gen OspC można stosować różne sposoby. Do tych sposobów należy przeglądanie z użyciem sondy hybrydyzacyjnej swoistej dla OspC, takiej jak np sonda oligonukleotydowa, lub przeglądanie pod kątem ekspresji antygenu OspC z zastosowaniem OspC - swoistego reagentu immunologicznego. Tego ostatniego dokonać można np. przez immunoblotting biblioteki przeciwciałami monoklonalnymi, skierowanymi przeciwko OspC, lub swoistym przeciwciałem poliklonalnym, uzyskanym od zwierząt immumzowanych oczyszczonym OspC. Po zidentyfikowaniu w bibliotece klonu zawierającego DNA kodujące OspC, można wyizolować DNA, w pełni scharakteryzować region kodujący białko OspC (np. przez sekwencjonowanie) i następnie DNA można zastosować do wytwarzania wektorów ekspresji OspC odpowiednich do wytwarzania białek OspC - aktywnych.

Jak poprzednio zaznaczono, dla zapewnienia skutecznego immunogenu struktura rekombinacyjnie wyrażanego białka pC powinna być w dostatecznym stopniu podobna do struktury natywnego (nie zdenaturowanego) OspC tak, aby białko indukowało wytwarzanie przeciwciał ochronnych. W tym celu, korzystnie doprowadza się do ekspresji DNA kodującego OspC w taki sposób, zęby uniknąć wewnątrzkomórkowej proteohzy i agregacji produktu ekspresji, w postaci zdenaturowanej. Jednym ze sposobów uniknięcia tych problemów jest rekombinacyjne wytwo

178 775 rżenie pC w układzie gospodarz-wektor, zapewniającym wydzielenie pC z komórki-gospodarza, korzystnie bezpośrednio do podłoża hodowlanego. Jeden z tego rodzaju układów dostarcza Bacillus subtillis Odpowiedni wektor sekrecyjny można skonstruować dla B. subtillis przez związanie sekwencji sygnałowej α-amylazy B. amyloliguefaciens [patrz : Young i in., Nucleic Acid Res., 11, 237 - 249 (1983)] z wektorem plazmidowym Bacillus pUB 110, jak to opisali Ulmaneniin. [J. Bacteriol., 162,176- 182(1985)]. Zgodnie z tym podejściem, sekwencję kodującą dla obcego białka klonuje się w prawo od promotora, miejsca wiązania rybosomu i sekwencji sygnałowej dlaa-amylazy. Transkrypcja i translacja OspC znajdująsię pod kontrolą promotora a-amylazy i kompleksu translacji tego konstruktu, i wydzielenie pC z komórki-gospodarza zapewnione jest przez sekwencję sygnałowąα-amylazy. Wynalazek mniejszy obejmuje swym zakresem wektory ekspresji funkcjonujące tak u prokariotów jak i u eukanotów. Opisano także podobne wektory nadające się do wykorzystania w przypadku drożdży i można uzyskać ekspresyjne wydzielenie OspC u drożdży przy wykorzystaniu tych wektorów. Odpowiednie wektory ekspresji można skonstruować za pomocą połączenia sekwencji kodującej OspC z indukowalnym promotorem w plazmidzie replikacyjnym drożdży. Zgodnie z tym podejściem, sekwencję kodującą obce białko klonuje się w prawo od, na przykład, promotora ΑΟΧ-1, a transkrypcję i translację indukować można za pomocą dodania do podłoża hodowlanego metanolu. Można w ten sposób uzyskać albo wewnątrzkomórkową ekspresję, albo wydzielenie obcego białka (przez związanie sekwencji sygnałowej z sekwencją kodującą dojrzałego białka). Korzystnym szczepem drożdży j est w tym przypadku Pichia pastons. Z zastosowaniem drożdży, a zwłaszcza Pichia pastons, osiągano wysoką wydajność produktów ekspresji.

Jeszcze inne podejście do doprowadzania do ekspresji OspC w układzie gospodarz-wektor, z umknięciem proteolizy, agregacji i denaturacji, polega na zastosowaniu jako wektora wirusa krowianki, który jest zdolny do doprowadzania do ekspresji w szeregu różnych komórkach-gospodarzach ssaków podatnych na zakażenie ospą krwią. Takie podejście wymaga otrzymania rekombinantowego, wywodzącego się z wirusa krowianki, wektora, w którym gen pC umieszczony jest pod kontrolą promotora, wraz z sygnałami translacji i wydzielania, nadającego się do ekspresji białka OspC w organizmie gospodarza zakażonego ospąkrowią. Jak to opisano w patentcie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4603112, którego treść włączona jest do niniejszego opisu jako odnośnik, plazmid powinien także zawierać sekwencje flankujące, 5' do regionów kontrolnych transkrypcji oraz 3' do 3' sygnałów terminacji i poliadenylacji, sprzyjające homologicznej rekombinacji do genomu krowianki typu dzikiego. W przypadku wprowadzenia konstruktu tego typu do komórki-gospodarza zakażonej ospąkrowią, sekwencje flankujące dyrygują rekombinacją między plazmidowym wektorem a wirusem krowianki z takim rezultatem, że klonowana sekwencja strukturalna (w danym przypadku kodująca OspC) staje się częścią wirusa krowianki, namnaża się z nim i ulega wraz z nim ekspresji. Korzystnie, region znajdujący się między sekwencjami flankującymi zawiera także selekcyjny marker taki, że w obecności podłoża selekcyjnego przeżywać będą tylko te komórki, które zawierają rekombinowany wirus krowianki (w danym przypadku, sekwencję kodującąpolipeptyd o aktywności OspC) Wytworzonego w ten sposób rekombinantowego szczepu wirusa krowianki można użyć do zakażenia komórek ssaków, takich jak komórki Vero lub komórki CV1, nadające się do otrzymywania, metodą fermentacyjną hodowli o wysokiej gęstości OspC-aktywne białko, ulegające ekspresji w takich komórkach podczas fermentacj i, zostaje wydzielone do podłoża fermentacyjnego, z którego zostaje wyodrębnione z zastosowaniem typowych sposobów postępowania. Oprócz naturalnych OspC i odmian OspC, wynalazek mniejszy obejmuje swym zakresem związki („mimetyki”), które naśladują epitopy OspC („mimotopy”). Jednym z przykładowych tego rodzaju mimetyków jest przeciwciało antyidiotypowe, to znaczy przeciwciało, które wytwarza się za pomocąuodpomiema zwierzęcia przeciwciałem wiążącym się swoiście z epitopem na antygenie. Przeciwciało antyidiotypowe rozpoznaje i dostosowuje się do centrum wiązania antygenu pierwszego przeciwciała. Stąd też, kształt jego centrum wiązania antygenu ściśle przypomina epitop, który pasuje do centrum wiązania antygenu pierwszego przeciwciała. Ponieważ przeciwciało antyidiotypowe posiada centrum wiążące antygen o kształcie naśladującym pierwotny

178 775 antygen, może ono zostać użyte jako szczepionka w celu wytwarzania przeciwciał reagujących z pierwotnym antygenem. Patrz : Fineberg i Ertl, CRC Cntical Reviews m Immunology, 7,269 284 (1987). Odpowiednie mimetyki zidentyfikować można za pomocą dokonania przeglądu z udziałem przeciwciała OspC w celu wykrycia, które związki wiążąsię z mm lub mogąbyć wytwarzane metodą modelowania cząsteczkowego. Patrz : Morgan i m., „Approaches to the Discovery ofNon-Peptide Ligands for Peptide Receptors and Peptidases” w: ANNUAL REPORTS IN MEDICINAL CHEMISTRY (Academic Press 1989) na str. 243 i następnych.

Szczepionka według niniejszego wynalazku przeznaczona jest do uodporniania wrażliwego ssaka, włączając w to człowieka, przeciw chorobie z Lyme Termin „rmmunogen” oznacza antygen wywołujący swoistą odpowiedź immunologiczną prowadzącą do odporności humoralnej lub odporności komórkowej, w danym przypadku, na zakażenia Borreha „Odporność” oznacza więc zdolność danego osobnika do przeciwstawienia się lub pokonania zakażenia w łatwiejszy sposób niż, porównując, w przypadku osobników nie poddanych uodpornieniu, albo do tolerowania zakażenia bez skutków klinicznych.

Immunogen według niniejszego wynalazku może być, w dalszym ciągu, złożony z fizjologicznie dopuszczalnego nośnika. Nośniki tego rodzaju są dobrze znane w tej dziedzinie techniki i należą do nich nośniki makromolekularne. Przykładowymi odpowiednimi nośnikami u ssaków są takie nośniki, jak tuberkulma PPD, albumina surowicy bydlęcej, albumina jaj a kurzego, lub hemocyj amna uzyskiwana z mięczaków. Korzystnie, nośnik powinien nie być toksyczny i alergogenny.

Immugen może, może w dalszym ciągu, składać się z adiuwanta, takiego jak związek glinu, woda i emulsje z olejem roślinnym lub mineralnym (na przykład może to być admwant Freunda), hposomy, ISCOM (kompleks immunostymulujący), szkła rozpuszczalne w wodzie, poliamony (takie jak poh A : U, siarczan dekstranu i lentman), nietoksyczne analogi hpopohsacharydów, dipeptyd muramylowy oraz substancje immunomodulujące (na przykład interleukiny 1 i 2) lub ich kombinacje. Korzystnym adiuwantem jest wodorotlenek glinowy. Immunogenność może także ulec wzmożeniu u ssaków, które otrzymały żywe, atenuowane wektory bakteryjne, takie jak Salmonella lub Mycobacteria, albo wektory wirusowe, takie jak wirus krowianki, w przypadku których dochodzi do ekspresji polipeptydu o aktywności OspC.

Metody formułowania tego rodzaju immunogenów są dobrze znane w tej dziedzinie techniki I tak, na przykład, immunogen według niniejszego wynalazku może być zhofilizowany z przeznaczeniem do późniejszego ponownego uwodnienia z użyciem fizjologicznie dopuszczalnej zarobki, takiej jak fizjologiczny roztwór soli lub inny roztwór fizjologiczny. W każdym przypadku, szczepionkę według niniejszego wynalazku wytwarza się za pomocą zmieszania immunologicznie skutecznej ilości OspC z zaróbkąużytąw takiej ilości, która zapewnia w rezultacie pożądane stężenie immunogenme skutecznego składnika w szczepionce. Ilość immunogenme skutecznego składnika w szczepionce zależeć będzie od rodzaju ssaka poddawanego immumzacji, ze zwróceniem uwagi na wiek i masę ciała, jak również od immunogenności składnika immunogennego występującego w szczepionce. W większości przypadków, ilość immunogennego składnika szczepionki mieści się w zakresie od 1 do 100 mikrogramów/antygen/dawkę i korzystnie mieści się w zakresie od 10 do 50 mikrogramów/antygen/dawkę.

W jeszcze innym wykonaniu niniejszego wynalazku, kompozycja immunogenna złożona jest z jednego, lub więcej niż jednego antygenu OspC lub odmiany OspC lub mimetyku OspC, albo antygenu zasadniczo wyodrębnionego z każdej z rodzin OspC z fig. 11, wyrażonych przez związane z chorobą człowieka klony/zespoły klonów, jak to opisano w przykładzie 1.

I tak, wynalazek obejmuje swym zakresem, zgodnie z zastrzeżeniami 1-3, kompozycje immunogenne zawierające antygeny OspC krętka Borreha choroby z Lyme, złożone albo z jednego, albo, korzystniej, z dwóch lub większej ilości, antygenów OspC spośród 20 znanych obecnie rodzin OspC, jak ta przedstawiona na fig. 11, lub z jednego, lub większej ilości antygenów Ospa z każdej z 20 znanych obecnie rodzin OspC z fig. 11. Zamiast powyżej wspomnianych antygenów OspC, kompozycja może zawierać odmiany OspC lub mimetyki wspomnianych antygenów OspC, przy czym wspomniane odmiany OspC lub mimetyki OspC majątakąstrukturę, która

178 775 jest wystarczająco podobna do struktury natywnego OspC, aby wzbudzały ochronę lub wytwarzanie przeciwciał ochronnych.

Figura 11 pokazuje sekwencję podstawowych epitopów. Zgodnie z wynalazkiem, włączone są takie antygeny OspC, które zawierają jeden, lub większą ilość tych epitopów. W konsekwencji, te antygeny lub polipeptydy według wynalazku zawierają co najmniej epitopową sekwencję przedstawioną na fig. 13. Ta sekwencja epitopową może być tak krótkajak sekwencja aminokwasów, pokazana w nawiasach na fig. 13.

W dalszym wykonaniu, wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem także kompozycje immunogenne, zawierające albo jeden, albo, korzystnie dwa lub więcej, antygenów OspC z rodzin OspC pokazanych na fig. 19, albo jeden, lub większą ilość antygenów OspC z każdej z rodzin OspC z fig. 19. Te kompozycje immunogenne odpowiadają zastrzeżeniom patentowym 4-6.

W innym wykonaniu, kompozycję immunogenną formułuje się z przeznaczeniem do zabezpieczania przed szczepami krętka Borrelia choroby z Lyme, przeważającymi w danym regionie geograficznym. I tak, wjednym z wykonań wynalazku, formułuje się szczepionkę, która jest w sposób preferencyjny skuteczna w sensie zabezpieczania przed szczepami Borrelia choroby z Lyme przeważającymi w Ameryce Północnej. W innym wykonaniu, formułuje się szczepionkę skuteczną wobec szczepów Borrelia choroby z Lyme przeważających najbardziej w Europie. W trzecim wykonaniu, formułuje się szczepionkę skuteczną w stosunku do szczepów Borrelia choroby z Lyme najbardziej rozpowszechnionych w Austrii. W przykładzie 7 przedstawiono preparaty szczepionek przeznaczonych do stosowania w każdym z tych obszarów geograficznych.

Poza tym, do preparatów szczepionek OspC zalicza się szczepionkę kombinowaną OspA/OspC, ponieważ może okazać się, że przewyższa ona szczepionkę sformułowaną z udziałem jednego tylko antygenu.

- po pierwsze dlatego, że szczepy krętka Borrelia choroby z Lyme mogąme zawsze wyrażać albo jeden albo drugi ze wspomnianych antygenów, ale zawsze dochodzi u nich do ekspresji albo OspA, albo OspC;

- po drugie, doniesiono, że w przypadku tych dwóch antygenów ma miejsce odwrotność regulacji ich poziom, to znaczy, że w przypadku, gdy ekspresja jednego z nch zostaje stłumiona (na przykład w odpowiedzi na odpowiedź immunologiczną), wtedy dochodzi do wzmożenia ekspresji drugiego antygenu;

- po trzecie, co najmniej w przypadku badań przeprowadzonych in vitro z udziałem OspA, wykazano, że tworzyć się mogą szczepionkowe mutanty „uciekające”, przy czym problem ten można ominąć przez włączenie drugiego antygenu, ponieważ zajście podwójnego zdarzenia mutacyjnego dla dwóch niezależnych antygenów jest w najwyższym stopniu nieprawdopodobne;

- po czwarte, odpowiedź immunologiczna szczepionek na dany antygen nie jest jednolita. Włączenie dwóch antygenów zwiększa prawdopodobieństwo, że osobnik, który wykazuje słabą odpowiedź czy to na OspA czy OspC, zostanie mimo tego zabezpieczony przez zaistnienie odpowiedzi ochronnej na ten drugi antygen.

W końcu, należy oczekiwać, że może tu wystąpić działanie synergistycznc i że zostanie osiągnięta bardziej trwała odporność w przypadku szczepionki zawierającej OspA i OspC.

W jednym z wykonań wynalazku, połączyć można ze sobą jedno lub więcej niż jedno białko OspC z rodziny OspC 1-20 i jedno, lub więcej niż jedno białko OspA, jak ma to miejsce w przypadku ekspresji przez szczepy Borrelia B31, Orth, H4 i KL11.

W innym wykonaniu, szczepionka kombinowana OspA/OspC, przeznaczona do stosowania na terenie Stanów Zjednoczonych Ameryki, obejmuje OspC z rodziny OspC 21 3 razem z OspA, jak ma to miejsce w przypadku ekspresji przez szczepy B31.

W dalszym wykonaniu, kombinowana szczepionka OspA/PspC, przeznaczona do stosowania w Europie, obejmuje 14OspCzrodzmOspC2,4-7,9,10,12,13 114,15 -17,19,razemz OspA, jak ma to miejsce w przypadku ekspresji przez szczepy B31, Orth, H4 i KL11.

W dalszym wykonaniu, kombinowana szczepionka OspA/OspC, przeznaczona do stosowania na terenie Austrii, zawiera OspC z rodzin 2, 4 - 7, 10, 13 i 19.

178 775

Wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem także zastosowanie kombinacji antygenów, zawartych w opisanych powyżej kompozycjach immunogennych, do wytwarzania szczepionki przeznaczonej do leczenia lub zapobiegania borehozy z Lyme u ssaków. Korzystnym wykonaniem tej szczepionki jest szczepionka użyteczna dla ludzi. Sposoby wytwarzania szczepionek według niniejszego wynalazku są tak zaprojektowane, aby zapewnić utrzymanie identyczności i skuteczności immunologicznej specyficznych cząsteczek, a także aby uniemożliwić wprowadzenie jakichkolwiek niepożądanych zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Produkty końcowe rozprowadza się i przechowuje w warunkach aseptycznych Sposób uodporniania ssaka przeciw chorobie z Lyme polega na podaniu temu ssakowi omówionego powyżej immunogenu w ilości skutecznej. Podania dokonać można jakimkolwiek sposobem znanym w tej dziedzinie wiedzy. I tak, na przykład, odpowiednia strategia podawania może obejmować podawanie opisanej powyżej szczepionki ssakom, 4co do których wiadomo, że sąnarażone na ukąszenie przez kleszcze przenoszące krętka Borrelia choroby z Lyme, mniej więcej na 6 do 12 miesięcy przed przewidywaną ekspozycją. Można tu zastosować jakąkolwiek drogę immumzacji, co do której sądzi się, lub wykazano, że zapewnia odpowiednią odpowiedź immunologiczną, zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Tym niemniej jednak, korzystnie podaje się szczepionkę drogąpozajehtową. Do stosowanych sposobów podawania należą wstrzyknięcia podskórne, śródskóme lub domięśniowe, a także odpowiednie sąpreparaty nadające się do podawania drogą doustną, donosową lub doodbytniczą.

Przez „zasadniczo oczyszczone” rozumie sięjednorodne białko me zawierające jakichkolwiek składników toksycznych, dzięki czemu zmniejsza się prawdopodobieństwo zajścia szkodliwej reakcji „Jednorodne” w tym kontekście oznacza, że co najmniej 80% (wag./obj.) białka stanowi całkowicie nienaruszony OspC, przy czym prawie całą resztę stanowią produkty rozkładu OspC. Tak więc, zanieczyszczenia w postaci składników podłoży oraz innych białek pochodzących z Borrelia występują, jeżeli w ogóle są obecne, jedynie w ilościach śladowych. Jednorodne białko OspC może składać się z więcej niz jednej serologicznej formy OspC

W ten sposób, wynalazek niniejszy umożliwia usunięcie niepożądanych, potencjalnie immunogennych białek, które mogłyby wzbudzać tworzenie się autoprzeciwciał i powodować zachodzenie szkodliwych reakcji autoimmunologicznych u uodpornianego ssaka. Na tej samej zasadzie, opisany powyżej sposób oczyszczania zapewnia także powtarzalność procesu z szarzy na szarzę w toku produkcji szczepionki.

Korzystny sposób oczyszczania obejmuje następujące etapy :

(a) Dezintegracja komórek Borrelia choroby z Lyme i rozfrakcjonowanie produktu dezintegracji na składniki „błonowe” i składniki „cytoplazmatyczne” za pomocą wirowania;

(b) Ekstrakcja frakcji błonowej z użyciem detergenta niedenaturującego, z następującym po tym odwirowaniem, w celu otrzymania supematantu zawierającego solubihzowane białko oraz w celu usunięcia, w osadzie, substancji nierozpuszczalnych;

(c) Frakcjonowanie solubihzowanych antygenów metodą chromatografu jonowymiennej (dietyloaminoetyl lub „DEAE”), przy czym zaadsorbowane antygeny zostają wyeluowane w gradiencie NaCl,

Sposób oczyszczania może obejmować zatężanie i dalsze oczyszczanie antygenów na drodze:

(a) chromatografu na hydroksyapatycie, przy czym zaadsorbowane antygeny zostają wyeluowane buforem o wzrastającej zawartości fosforanu, i/lub (b) chromatografii powinowactwa z unieruchomionym metalem, przy czym zaadsorbowane antygeny zostają wyeluowane imidazolem.

Do innych metod elucji, znanych w tej dziedzinie techniki, należy elucja z obniżaniem wartości pH lub ze wzrostem stężenia chlorku amonowego, histydyny lub innej substancji odznaczającej się powinowactwem do schelatyzowanego metalu.

Dezintegracji komórek dokonać można za pomocą hzy, za pomocą wytrząsania ich w zawiesinie z drobnymi kulkami szklanymi w młynie typu „celi mili”, za pomocąnadźwiękawiania lub w prasie Frencha. Alternatywnie, antygeny można wyekstrahować bezpośrednio z powierzchni komórek organizmu za pomocą ekspozycji komórek na działanie detergenta, przez zmianę

178 775 siły jonowej środowiska, w którym znajdująsię komórki lub za pomocą niewielkich zmian temperatury. Alternatywnie, użyć można materiału wyjściowego złożonego z pęcherzyków błon, usuniętych z komórek.

Ekstrakcji frakcji błonowej dokonać można przy użyciu detergenta odznaczającego się, korzystnie, wysoką zdolnością rozpuszczania, me działającego denaturująco i zgodnego z chromatografią jonowymienną. Korzystnym detergentem jest amfoteryczny detergent o charakterze jonu obojnaczego, 3-14, z firmy Galbiochem, aczkolwiek użyć tu można jakiegokolwiek detergenta lub rozpuszczalnika organicznego odznaczającego się powyżej wspomnianymi właściwościami. Detergentu używa się, typowo, w stężeniu 1% (wag./obj.), ale działa on skutecznie w stężeniach wahających się w zakresie od 0,01 do 10% (wag./obj.). Ekstrakcję detergentową prowadzi się w temperaturze w zakresie od 0 do 60°C, korzystnie w temperaturze 37°C i powinna ona trwać od 10 minut do 8 godzin, korzystnie godzinę. Dla polepszenia zachodzenia procesu solubihzacji, oprócz detergenta użyć tu można środków chaotropowych, takich jak mocznik.

Następnie, antygeny solubilizowane z udziałem detergenta poddaje się frakcjonowaniu metodąDEAE-chromatografii. Korzystnie stosuje się żywicę jonowymiennąDEAE, ale użyć tu można także i innych anionowych lub kationowych żywic jonowymiennych, wymiennie lub łącznie jedną z drugą. Według mniejszego wynalazku, żywica jonowymienna zawiera merozpuszczalnąmatrycę, z którą sprzęgnięte sąnaładowane grupy. Do grup funkcyjnych stosowanych w przypadku anionowych wymieniaczy jonowych należą takie grupy jak grupa aminoetylowa (AE), grupa dietyloaminoetylowa (DEAE) i czwartorzędowa grupa aminoetylowa (QAE). Kationowe wymieniacze jonowe mogą posiadać takie grupy jak grupa karboksymetylowa (CM), grupa fosfo- lub sulfopropylowa (SP). Aczkolwiek próbki wprowadza się na kolumnę w buforze Tns zawierającym detergent 3-14 o charakterze jonu obojnaczego (1%), a antygeny eluowane są w gradiencie NaCl, równie skuteczne mogą okazać się inne preparaty, sformułowane odmiennie

Zatężenia antygenów dokonać można za pomocą związania ich na hydroksyapatycie, zgodnie z metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie techniki. Alternatywny lub komplementarny sposób postępowania prowadzący do dalszego zatężenia/oczyszczenia antygenów, stanowi chromatografia powinowactwa z unieruchomionym metalem. Ta ostatnia metoda przewyższa chromatografię na hydroksyapatycie, jeśli chodzi o oczyszczanie OspC, ponieważ zapewnia ona lepsze oddzielenie od OspA i OspB.

Korzyściąodnoszonąz zastosowania powyżej opisanego, me prowadzącego do zdenaturowama, sposobu postępowania przy oczyszczaniu jest to, że zostaje zachowana trójwymiarowa konformacja białka, dzięki czemu zostająutrzymane wszystkie miejsca wiążące antygenu znajdujące się w białku natywne, włączając w to centra zaangażowane w zapewnianiu ochrony. W przypadku zdenaturowania białka, miejsca wiążące zostają częściowo lub całkowicie zniszczone, a zdolność antygenu do skłaniania przeciwciał do wiązania się z miejscami antygenowymi ulega, w odpowiednim stopniu, ograniczeniu. Tak zmienione białka są niepożądane z punktu widzenia wykorzystania ich w szczepionkach.

Następnie, wynalazek obejmuje swym zakresem rekombinantowy preparat nowych antygenów OspC, jak to pokazano na fig. 9a. Wynalazek obejmuje swym zakresem nowe sekwencje DNA kodujące antygeny OspC zgodnie z fig. 9a. Te sekwencje DNA przedstawione sąna fig. 8a. Wynalazek obejmuje swym zakresem także te sekwencje DNA, które wykazująco najmniej 80% homologii z którąkolwiek z sekwencji pokazanych na fig. 8a.

Wynalazek obejmuje swym zakresem także rekombinantowe wektory ekspresji w prokariotycznych lub eukariotycznych komórkach-gospodarzach, a zwłaszcza wektory ekspresji użyteczne w komórkach drożdży, korzystnie z rodzaju Pichia (Pichia pastoris). Zgodnie z korzystnym wykonaniem wynalazku, wektor ekspresji daje się indukować metanolem

Wynalazek obejmuje swym zakresem nowe antygeny OspC, stanowiące antygeny, które (i) kodowane są przez jakąkolwiek z sekwencji według fig. 8a, albo (u) wykazuj ąhomologię co najmniej 80% z którąkolwiek z sekwencji aminokwasów pokazanych na fig. 9a.

178 775

Wynalazek opisany jest w sposób bardziej szczegółowy w następujących przykładach, podanych jedynie dla objaśnienia, bez zamiaru ograniczania w jakikolwiek sposób zakresu wynalazku

Przykład 1. Typowanie CMAT szczepów Borrelia burgdorferi i analiza klasterowa wyników z umożliwieniem wyjaśnienia zagadnienia grup CMAT, rodzin CMAT, klonów „związanych z chorobą u człowieka” i grup klonów.

Z wielu rozmaitych źródeł, wyszczególnionych na fig. 2, wyizolowano 77 szczepów (patrz fig 1) Zatroszczono się przy tym, tak dalece, jak tylko jest to możliwe, aby kolekcja szczepów obejmowała szczepy szeroko różniące się od siebie w sensie geograficznego pochodzenia, a także szczepy z różnych sytuacji epidemiologicznych i klinicznych.

Ze wszystkich tych szczepów otrzymywano frakcje błonowe w sposób następujący ·

Komórki Borrelia choroby z Lyme zebrano za pomocą odwirowania (7000 x g, 20 minut, 4°C), po czym osad komórek przemyto dwukrotnie PBS zawierającym 5 mM MgCl₂, po czym oznaczono ciężar wilgotnej biomasy komórek. Następnie przemyto komórki poddano lizie za pomocą wytrząśnięcia mieszaniny w urządzeniu Vibrogen cell-mill (Model V14, Buhler). Powtarzano 3-minutowe cykle wytrząsania z oziębianiem (4°C), aż do uzyskania hzy ponad 99%, zgodnie z oszacowaniem przeprowadzonym metodą mikroskopu w ciemnym polu. Otrzymany hzat przesączono następnie przez lejek z filtrem ze spiekanego szkła w celu usunięcia kuleczek szklanych i osadzone na filtrze kuleczki przemyto buforem w celu podwyższenia wydajności bakteryjnych antygenów w przesączu. Lizat odwirowywano w ciągu 20 minut 7500 x g, w temperaturze 4°C, w wyniku czego otrzymano surową frakcję błonową, określanąjako frakcja błonowa 2 lub „Isp” (Iow speed pellet). Utworzony tak supematant wirowano dalej w ciągu 30 minut przy 100000 x g, w temperaturze 4°C, w wyniku czego otrzymano bardziej oczyszczoną frakcję błonową, określanąjako frakcja błonowa 1 lub „hsp” (high speed pellet). Obie te frakcje błonowe przemyto dwukrotnie 100 ml buforu Tns-HCl pH 7,4, z zachowaniem pierwotnych warunków wirowania Frakcji błonowej 2 użyto do typowania, podczas gdy frakcje błonowe 1 zachowano z przeznaczeniem do izolowania/oczyszczania antygenu.

Następnie białka błony obecne we frakcjach błonowych 2 z każdego szczepu poddano analizie metodą SDS-PAGE, sposobem opisanym przez U. K. Laemmlfego [Naturę (London), 227, 680 - 685 (1970)]. Zmiany masy cząsteczkowej oznaczano w odniesieniu do elektroforetycznej ruchliwości zestawu białek wzorcowych, pokrywającego zakres mas cząsteczkowych pełnego spektrum błonowych markerów antygenowych stosowanych w analizie.

Antygeny przenosi się na filtr nitrocelulozowy i identyfikuje się z zastosowaniem zestawu przeciwciał monoklonalnych, na przykład metodami immunoblottingu, dobrze znanymi w tej dziedzinie techniki. [Ausubel i m., 2 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 10.8.1 i nast. (1992)]. Przeciwciała monoklonalne wytwarza się dobrze znanymi metodami technologu hybrydomów. [Kohler i Millstem, Naturę, 256,495 - 497 (1975)]. W korzystnym wykonaniu mniejszego wynalazku, analizie poddaje się szczepy przedstawione na fig. 1. Ogólnie, o wyborze danego antygenu błonowego do włączenia go w tok analizy decydują następujące czynniki (a) podatność przeciwciał monoklonalnych na detekcję i na rozróżnienie ich wśród licznych innych antygenów występujących w profilach SDS-PAGE antygenów błonowych szczepów bakteryjnych, (b) występowanie danego antygenu w dużej liczbie szczepów poddawanych badaniu, a więc charakter antygenu wspólnego, (c) fakt, ze dany antygen może być w sposób powtarzalny wykrywany w wielu osobno otrzymywanych frakcjach błonowych tego samego szczepu, co oznacza, że me ma dowodów na istnienie wewnątrzszczepowych odmian tego antygenu; (d) fakt, że dany marker antygenowy ulega w sposób stabilny ekspresji w tym samym izolacie po przeprowadzeniu wielu hodowli i pasaży oraz po przechowywaniu w ciągu długiego czasu (do 2 lat); (e) brak informacji w opublikowanej literaturze naukowej świadczących o tym, ze geny kodujące markery sądziedziczone pozachromosomalme lub, ze odmiany antygenów sąpod kontrolą swoistych mechanizmów zmian genów, prowadzących do tworzenia odmian wewnątrzszczepowych.

178 775

Figura 3 pokazuje przeciwciała monoklonalne stosowane do identyfikowania 9 wspólnych antygenów błonowych używanych w analizie [antygeny E90, E60, E59, E43, Ela, E29, E22, E18 + E20 (antygen połączony i E10]. Antygeny punktowano systemem opartym na zwiększaniu się mas cząsteczkowych, a w przypadku, gdy istnieje więcej (niżjedno) przeciwciał monoklonalnych, na zasadzie nieznacznych różnic w ich aktywności (na przykład antygeny E60 i E43), zgodnie z profilem reakcji danego antygenu z tymi przeciwciałami monoklonalnymi.

Figura 4 wyszczególnia wszystkiejednoznaczne kombinacje 9 ocen punktowych dla analizowanych szczepów, przedstawione dziewięciocyfrowym numerem. Ten dziewięciocyfrowy numer odnosi się do typu wspólnego antygenu błonowego (CMAT) danego szczepu. Następnie wykonano analizę klasterową w celu ustalenia pokrewieństwa między wszystkimi zaobserwowanymi CMAT. Dokonano tego przez określenie genetycznej różnorodności każdego antygenu i ustalenie macierzy niejednakowości nieważonej obliczonej na podstawie danych ze wszystkich jednoznacznych CMAT. Nieobecność cząstkowego zapisu punktowego dla wspólnego antygenu traktowano jako brak danych. Następnie utworzoną macierz poddano analizie klastera wej w powiązaniu z metodą par grup ważonych z zastosowaniem średnich arytmetycznych (Sneath i Sokal, powyżej przy użyciu kompatybilnego komputera osobistego IBM z oprogramowaniem CSS Statistica StatSoft Otrzymany tak dendrogram analizy klasterowej pokazano na fig. 5. Ogólnie, dendrogen ten ilustruje dobre ukonstytuowanie populacji Borrelia choroby z Lyme Przez naniesienie na wykres wartości Eigena, dla których zachodzi każdy etap tworzenia zespołów (klasterów), staje się możliwe wybranie najbardziej stosownego poziom, na którym dokonać można segregacji bakterii na właściwe kategorie.

Najbardziej idealna pozycja, jeśli chodzi o dokonanie podziałów, zdarza się w tych punktach krzywej, w których występują główne skoki wartości Eigena dla kolejnych etapów tworzenia zespołów. Jak to uwidoczniono na dendrogramie z fig. 5, zachodzi to na poziomie od 68% do 88% różnicy w punktacji CMAT. Na tym poziomie dokonuje się podziału populacji na cztery główne grupy, nazywane grupami CMAT. Drugi główny skok wartości Eigena dla kolejnych etapów tworzenia zespołów występuje na poziomie od 40% do 52% różnicy w punktacji CMAT. Ten podział dzieli każdą grupę CMAT na dwa - trzy zespoły poszczególnych CMAT. Dla wygody, przyjęto poziom 80% różnicy w punktacji jako ten poziom, w przypadku którego dochodzi do grupowania CMAT, a 50% różnicę w punktacji jako poziom,, w przypadku którego odbywa się tworzenie zespołów CMAT.

Na podstawie powyższego opisu staje się oczywiste, ze populację B. burgdorferi można podzielić na cztery główne grupy CMAT, z których każda złożona jest z dwóch - trzech zespołów CMAT. Z kolei każdy zespół CMAT był złożony z jednego - pięciu pojedynczych CMAT. Porównanie otrzymanych tu wyników z rezultatami badań taksonomicznych opartych na analizie struktury innych populacji [Marconi i Garon, J. Bacteriol., 174,241 -244(1992);Boerlinim ,Infect. Immun , 60,1677 - 1683 (1992); Baranton i in., Int. J. Syst. Bactenol, 42,378 - 383 (1992)] wykazuje, że grupa CMAT 1 odpowiada genogatunkowi Borrelia burgdorferi sensu stncto, że grupa CMAT 3 jest równoważna Borrelia afzelii znanej także jako „grupa VS461”, oraz, że grupy CMAT 2 i4 odpowiadająB. garinii sp. nov. Przyczyna, dla której analiza CMAT podzieliła B. garinii jako genogatunek na dwie grupy CMAT, me jest jasna, ale być może wynika to z tego faktu, ze użyto mniejszej ilości markerów niz, na przykład, w przypadku elektroforę tycznych badań nad wielomiejscowym izoenzymem [Boerhn i in., Infect. Immun., 60, 1677 - 1683 (1992)].

Rozpatrując występowanie poszczególnych szczepów w obrębie każdego CMAT (fig. 5) widać w sposób oczywisty, że 7 CMAT ma więcej niż jednego reprezentanta, a tym samym mogą być one uważane za klony, to znaczy szczepy pochodzące od wspólnego przodka. I rzeczywiście, 67% wszystkich szczepów przypadło na trzy różne klony CMAT, na przykład, CMAT 4 (klon 1:2:4)obejmował 12szczepów,CMAT 13 (klon3:2:1)obejmował23 szczepy,aCMAT 18(klon 4:2:18) obejmował 15 szczepów. Godne uwagi jest to, że 76% (31 spośród 41) przebadanych izolatów ludzkich, jak stwierdzono, przypada na te trzy główne klony. Następnie, jeśli weźmie się pod uwagę CMAT 17,18,20122 łącznie, jako cześć spokrewnionego zespołu klonowego, to okazuje się, ze wszystkie one należą do zespołu CMAT 4.2, z czego wynika, że grupa klonów

178 775 związana z chorobąu człowieka sięga 87%. Skutkiem tego silnego związku z chorobąu człowiekajest to, zc możnaje uważać za klony HDA („human disease associated” lub za zespoły klonów HDA (patrz podane powyżej definicje). Jeśli przyjrzeć się typom izolatów znajdujących się wśród trzech głównych klonów, staje się oczywiste, ze CMAT 13, na przykład, wydaje się być związanym z zapaleniem zanikowym skóry obwodowych części kończyn (ACA) (5 szczepów) oraz, że, mówiąc ogólnie, klon ten związany jest z objawami skórnymi (17 z 19). W przeciwieństwie do tego, dwa inne klony HDA wydają się przeważać w przypadku chorób rozsianych, to znaczy, wyodrębnia się je z krwi lub płynu rdzeniowo-mózgowego (CSF) pacjentów cierpiących na neuroborehozę lub zapalenia stawów na tle choroby z Lyme. W przypadku zespołu CMAT 4.2 (to znaczy CMAT 17,18,20 i 22) dane epidemiologiczne wydająsię sugerować, że istnieje tu silny związek z neuroborehozą. Na 10 izolatów ludzkich, 6 wyodrębniono z materiału CSF lub od pacjentów cierpiących na neuroborehozę, a 4 wyodrębniono od pacjentów cierpiących na rumień przewlekły pełzający Lipschutza (ECM), objaw normalnie towarzyszący ostremu przebiegowi choroby, który może być także związany z neuroborehozą. Problem zespołu związanego ze szczepami CMAT 4 me jest łatwy do roztrzygnięcia, ponieważ 2 izolaty ludzkie wyodrębnione z krwi, 3 z CSP, a 1 od pacjenta cierpiącego na EM. Dalsza analiza danych epidemiologicznych odnoszących się do poszczególnych szczepów potwierdza, że trzy głównej klony lub y klonów rozmieszczone są w sensie geograficznym w sposób charakterystyczny, i że ta cecha znamienna koreluje z kolei z ogólnymi różnicami obserwowanymi w przypadku pierwszych objawów choroby z Lyme, stwierdzonej w omawianych regionach. Itak, na przykład, CMAT 4 jest najbardziej przeważającym CMAT stwierdzonym w Ameryce Północnej, a więc obszarze, w skali całego świata, na którym przeważają zespoły zapalenia stawów CMAT 13 1CMAT 18, jak stwierdzono, przeważają w Europie Północnej i Środkowej, gdzie przeważają zespoły neurologiczne i chroniczne zespoły skórne. Stwierdzono, ze spośród 3 głównych klonów jedynie CMAT 4 występuje zarówno w Ameryce Północnej jak i w Europie (Francja, Austria i Rosja) i jest on ze wszystkich najbardziej rozpowszechniony na obu kontynentach. Jest rzeczą interesującą że w niektórych częściach Europy Środkowej, w szczególności na obszarze Austrii i Szwajcarii, gdzie choroba z Lyme ma charakter endemiczny, współwystępują wszystkie trzy główne klony związane z chorobąu człowieka.

Uświadomienie sobie, ze chorobę u człowieka powoduje przede wszystkim ściśle jeden klon (CMAT 4) w grupie CMAT 1 (Borrelia burgdorfen sensu stricto), jeden klon (CMAT 18) z grupy CMAT 3 (Borrelia afzcln) oraz zespół klonów (CMAT cluster 4.2) w grupie CMAT 4 (B gannii sp. nov.) umożliwia, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, zogniskować uwagę na tych właśnie klonach/zespołach klonów, a to w celu zaprojektowania szczepionek, takich jak szczepionka z OspC lub kombinowana szczepionka z OspC/OspA, które w sposób swoisty zapewniają ochronę przed tą chorobą. Następnie, szczepionkę taką można by stosować w tych regionach geograficznych, na których omawiane klony przeważająw najwyższym stopniu. Dalej, z uwagi na odmienność poszczególnych zespołów chorobowych związanych z różnymi klonami, można szczepionkę ukierunkować na te właśnie klony i w efekcie zaprojektować szczepionki przeznaczone do zabezpieczania przed poszczególnymi zespołami chorobowymi.

Przykład 2. Opracowanie schematu typowania serovar OspC z przeznaczeniem do analizowania serologicznych odmian antygenu OspC Borrelia choroby z Lyme.

Otrzymywanie przeciwciał przeciw OspC.

Wytworzono zestaw 25 przeciwciał monoklonalnych przeciw :

(a) czterem oczyszczonym białkom OspC pochodzącym z : (1) austriackiego szczepu Orth (BBM 34-39); (2) niemieckiego szczepu PKO (BBM 42 - 45); (3) czechosłowackich szczepów E61 (BBM 46, 47 i 49), oraz (4) KLIO (BBM 40-41);

(b) koktajlowi antygenów wzbogaconemu białkiem OspC, pochodzącemu z austriackiego szczepu W (BBM 22, 24, 25, 27 i 29), oraz (c) frakcji błonowej 2 ze szczepu czeskiego M57 (BBM 75 - 77).

Swoistość rozmaitych przeciwciał monoklonalnych przeciw białku OspC potwierdzono analizą „surfblot” wobec frakcji błonowej szczepu W lub M57 w przypadku, odpowiednio,

178 775

ΒΒΜ 22,24, 25 i 27 - 29, oraz BBM 75 - 77, a w przypadku innych analizą„hne biot” wobec odpowiedniego oczyszczonego białka

Błonowa metoda ELISA

Serotypowanie białek OspC przeprowadzono z zastosowaniem typowej błonowej techniki ELISA Frakcje błonowe 2 pochodzące ze wszystkich szczepów, otrzymane sposobem opisanym w przykładzie 1, rozcieńczono do stężenia 0,1 mg/ml fizjologicznym roztworem soli buforowanym fosforanem (PBS) pH 7,4 i rozdysponowano do poszczególnych dołków płytek do mikromiareczkowania. Płytki pozostawiono do wyschnięcia na noc, w temperaturze 37°C. Przed użyciem, płytki przemyto dwukrotnie PBS, po czym do każdego dołka wprowadzono 50 ml rozcieńczonego roztworu przeciwciała w PBS zawierającym 1% albuminy ludzkiej, po czym płytki inkubowano w ciągu godziny w temperaturze 37°C Następnie płytki przemyto cztery razy przed dodaniem skomugowanego z fosforanami alkalicznymi przeciwciała przeciw mysim IgC. Następnie płytki inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu jeszcze jednej godziny, po czym przemyto czterokrotnie i wprowadzono substrat, przy czym tego ostatniego przemycia dokonano w celu oszacowania ilości związanego przeciwciała.

Początkowo testowano wszystkie szczepy wobec wszystkich 25 przeciwciał monoklonalnych, aby przekonać się, które przeciwciało monoklonalne było najbardziej odpowiednie do zastosowania w serotypowaniu. Dokonano usiłowań w celu ustalenia jednolitych pozytywnych i negatywnych kryteriów testu. Jednakże, stało się jasne, że nie jest to możliwe wskutek ogromnie różnych poziomów ekspresji antygenów OspC u różnych szczepów. Aby pokonać ten problem, frakcje błonowe 2 poddano analizie metodą Western biot, przeniesiono na nitrocelulozę i zabarwiono przy użyciu Aurogold. Te szczepy, które nie dawały ekspresji, lub tylko nieznaczną białek OspC (ogółem 15 szczepów), jak to oceniono na podstawie nieobecności głównego białka w zakresie masy cząsteczkowej od 22 do 28 kD, usunięto z dalszego ciągu badań. Pomimo tego, w szeregu przypadków (na przykład, przy zastosowaniu BBM 28,29, 37,43 i 45) ciągle nie obserwowano różnic między wynikami pozytywnymi i negatywnymi, wobec czego także i te przeciwciała monoklonalne uznano za nieprzydatne do typowania. Wszystkie te przeciwciała rozpoznają wspólne epitopy, a przez to mają niewielką tylko wartość, jeśli chodzi o wykorzystanie ich do rozróżniania. W oparciu o dane odnoszące się do szczepów, z początkowych analiz, także stwierdzono, że szereg przeciwciał monoklonalnych rozpoznaje podobne epitopy, na przykład BBM 24,25 127, BBM 38 i 29, oraz BBM 75,76 i 77. W rezultacie, do opracowania schematu typowania serovar użyto tylko po jednym szczepie z każdej grupy (BBM 24, BBM 39 i BBM 77).

Dzięki usunięciu tych szczepów i przeciwciał monoklonalnych stało się możliwe ustalenie następnie kryteriów pozytywnej reakcji jako jednej, w przypadku której otrzymana wartość gęstości optycznej była znacząco (trzykrotnie) wyższa od poziomu tła szczepów negatywnych. W praktyce oznacza to, że jako wynik pozytywny przyjmuje się wartość gęstości optycznej (OD) wyzsząod 0,6. Wszystkie reakcje pozytywne potwierdzano także analizą Western biot dla tych samych preparatów błonowych. W rezultacie przeprowadzonych analiz Western biot odkryto, ze BBM 48 dawał silną reakcję krzyżowąz białkiem o około 60 kD i powodował uzyskiwanie wielu fałszywych wyników w analizie metodą ELISA. Toteż, BBM 48 także został pominięty przy dokonywaniu analiz serovar. W konsekwencji tego, analiza serovar została nieco uproszczona, gdyż zamiast początkowych 25 przeciwciał przeciw OspC dostępnych do badań, użyto ostatecznie tylko 13 przeciwciał.

Następnie skonstruowano wzorzec reakcji każdego szczepu z kompletnym zestawem 13 przeciwciał monoklonalnych i każdy charakterystyczny wzorzec oznaczono jako „serovar” (patrz fig. 6). W kolekcji 62 ostatecznie przebadanych szczepów stwierdzono istnienie 16 charakterystycznych serovarów, wykazując w ten sposób olbrzymi zasięg serologicznej heterogeniczności wykazywanej przez to białko błony. Liczba pozytywnych reakcji zaobserwowanych u poszczególnych serovarów wahała się w zakresie od 1 do 7.

178 775

Pełna lista serovarów stwierdzonych dla każdego szczepu przedstawiona jest na fig. 12. Jak można zauważyć, 12 szczepów (19% ogółu szczepów poddanych badaniu) nie reagowało z żadnym spośród zestawu 13 przeciwciał monoklonalnych (oznaczenie : „NR”, niereaktywny) i przyjęto, że nie nadają się one do typowania. Łącznie ze szczepami, które pominięto z powodu braku, lub niskiego poziomu ekspresji (15 szczepów), ogółem 22% dostępnych szczepów nie mogła zostać typowana. Częstotliwość występowania serovarów wśród 78% szczepów, które mogłyby być typowane w sposób jednoznaczny, zmieniała się znacznie. Zaobserwowano jedynie pojedynczych reprezentantów serovarów 6, 8 i 9, podczas gdy 10 szczepów wykazywało serovar 2, najczęściej spotykany serovar. Występowały silne korelacje między rodzinąi genotypem białka OspC a jego serovarem. I rzeczywiście, w większości przypadków, jak się wydaje, stosunekwynosi 1 : 1, na przykład dla rodzin 1,2,4,5,7,9,10,14 i 15.Rodzin3,12,13,17,18119albo me można było poddać badaniu, albo nie nadawały się do typowania z udziałem obecnie dostępnych przeciwciał monoklonalnych. Rodziny 6,8111 można w dalszym ciągu poddać podziałowi serologicznemu na 2 lub 3 serovary, jednakże jest rzeczą interesującą zauważyć, że genotypy tych rodzin także wykazywały pewną różnorodność. Jeden serovar (serovar 16) zauważono w przypadku więcej niż jednej rodziny (rodziny 16 120). Mogło się tak zdarzyć, ponieważ w przypadku tego serovaru stwierdza się tylko dwie reakcje pozytywne, wskutek czego obecnie dostępne przeciwciała monoklonalne me były zdolne do rozróżnienia tych dwu rodzin.

Przykład 3. Analiza heterogeniczności OspC za pomocą polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP).

Gen OspC ze szczepu Orth sklonowano i ustalono sekwencję nukleotydów sposobem poprzednio opisanym (zgłoszenie patentu Stanów Zjednoczonych Ameryki, nr kolejny 07/903580). Następnie użyto, w polimerazowej reakcji łańcuchowej, oligonukleotydów odpowiadających bliższemu (nić kodująca, ATGAAAAAGAATACATTAAGTGC, kodon inicjacyjny podkreślony) i dalszemu (nić niekodująca, TAATTAAGGTTTTTTTGGAGTTTCTG, kodon terminacyjny podkreślony) końcowi genu OspC ze szczepu Orth (patrz przykład 4) w celu amplifikacji genów OspC z 77 szczewpów z posiadanej kolekcji szczepów. Wszystkie przebadane szczepy, włącznie z 14 szczepami pochodzącymi ze Stanów Zjednoczonych Ameryki, dostarczyły fragmentów PCR o przewidzianej wielkości (627 - 642 pz), co wskazuje na fakt, ze kodowany plazmidem gen OspC me tylko utrzymuje się w sposób stabilny, ale jest o wiele bardziej rozpowszechniony niż poprzednio przypuszczano. Brak detekcji antygenu OspC w hodowlach wyrosłych in vitro wynika nie tyle z nieobecności genu OspC, co jest mało prawdopodobne, ale raczej z nieobecności lub niskiego poziomu antygenu ulegającego ekspresji. Polimorfizm występujący wśród genów OspC pochodzących z różnych szczepów określano przez badanie profilów fragmentów restrykcyjnych otrzymanych w wyniku trawienia genu OspC amplifikowanego metodą PCR (gen otrzymany sposobem powyżej opisanym). Trawienia dokonano przy użyciu enzymów restrykcyjnych Dpnl 1, Ddel i Dral. Analiza danych otrzymanych dla 82 szczepów (to znaczy danych doświadczalnych dla 77 szczepów z posiadanej kolekcji kultur szczepów oraz informacji wywnioskowanych z 5 opublikowanych sekwencji OspC, patrz fig. 1) wykazała obecność 35 odmiennych pod względem RFLP typów OspC. Liczbę i rozmiary fragmentów, oznaczone eksperymentalnie z zastosowaniem typowych sposobów postępowania, potwierdzono w licznych przypadkach na drodze sekwencjonowania, to znaczy, w przypadku co najmniej jednego reprezentanta typów RFLP 1-23, typ 24 opartyjest na danych dotyczących sekwencji przytoczonych przez Padulę i in. Wzorzec RFLP związane z każdym typem RFLP przedstawione są na fig 7. Tam, gdzie było to możliwe, przedstawiono wielkość fragmentów wydedukowaną z informacji dotyczących sekwencji (typy RFLP 1, 24) przed wartościami zmierzonymi. Na figurze 12 przedstawiono pełny wykaz typów RFLP dla każdego poddanego analizie szczepu.

Przykład 4. AmphfikacjametodąPCRisekwencjonowanienukleotydówróżnychalleh genu OspC i analiza klasterowa wydedukowanej sekwencji aminokwasów.

178 775

Jak to opisano w przykładach 1 i 2, oraz podsumowano na fig. 12, okazało się możliwe sklasyfikowanie szczepów Borrelia na serovary OspC i typy RFLP OspC. Wybrano szczepy reprezentujące typy RFLP OspC 1 - 17 i 19 - 23 i amplifikowano gen OspC metodą pohmerazowej reakcji łańcuchowej, po czym oznaczono sekwencję nukleotydów i wydedukowaną sekwencję aminokwasów. W kilku przypadkach przebadano związek między ściśle spokrewnionymi ze sobąbiałkami OspC, dla dalszego sprawdzenia prawidłowości systemów typowania i kontroli dalszej nie wykrytej heterogeniczności w obrębie typów OspC. Ogółem amplifikowano za pomocą PCR i poddano sekwencjonowaniu, jak to opisano poniżej, 27 genów OspC. Informacje dotyczące sekwencji wykorzystuje się do sklasyfikowania białek OspC na rodziny OspC.

Materiały i metody

Zamrożoną wyjściową zawiesinę komórek Borrelia rozmrożono 12 pl (5 χ 10⁶ -1 χ 10⁸ komórck/ml) tej zawiesiny wirowano w ciągu 5 minut przy najwyższej szybkości wirowania w mikrowirówce Heraeus Biofuge A. Otrzymany osad komórek ponownie zawieszono w 10 μΐ 1 x buforu TAQ (Boehringer Mannheim), pokryto warstwą 50 μΐ oleju mineralnego (Pharmacia) i inkubowano w ciągu 8 minut we wrzącej łaźni wodnej, po czym natychmiast umieszczono na lodzie Do otrzymanego lizatu komórek dodano 90 pl mieszaniny reagentów [9 μΐ buforu 10 x Taq polymerase, Boehringer Mannheim; 2 μΐ 10 mM roztworu dNTP, Boehringer Mannheim; 5 μΐ startera 1 (ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCG), 10 mM roztwór wyjściowy; 5 μΐ startera 2 (ATGAAAAAGAATACAATTAAGTGCG3, 10 mM roztwór wyjściowy; 0,5 μΐ 5000 jedn/ml pohmerazy Taq, Boehringer Mannheim; oraz 68,5 pl H₂O]. Amphfikację DNA przeprowadzono przy użyciu aparatu LKB Thermocycler (95°C w ciągu 36 sekund, 53°C w ciągu 60 sekund, 70°C w ciągu 84 sekund, 30 cykli). Przebieg amphfikacji śledzono i kontrolowano poddając analizie 5 μΐ próbki produktu na 1% (wag./obj.) żelu agarozowego w buforze Tns-octan (40 mM Tns-octan, 2 mM EDTA, pH 8,0). Do barwienia użyto bromku etydyny, a do wizualizacji światła UV. Produkt amphfikacji zatężono przy użyciu kaset do mikrowirowania Spin Bmd (EMC). Następnie zebrano DNA w 30 μΐ H₂O i odzysk skontrolowano za pomocą analizy 2 μΐ próbki oczyszczonego produktu na żelu agarozowym, sposobem powyżej opisanym.

Sporządzono 2 - 7 μΐ próbki amplifikowanych fragmentów DNA w celu sekwencjonowania przy użyciu aparatu LKB Thermocycler (25 cykli w temperaturze 95°C w ciągu 36 sekund, 53°C w ciągu 30 sekund, 70°C w ciągu 80 sekund), z zastosowaniem zestawu do sekwencjonowania Auto Cycle Seguencing (Pharmacia) i znakowanych fluorescemąstarterów 5' - ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCG - 3' oraz 5-ATTAAGGTTTTTTTGGAGTTT CTG-3'. Próbki poddawano elektroforezie na 6% żelu poliakryloamidowym do sekwencjonowama przy użyciu zautomatyzowanego laserowego fluorescencyjnego [ ALF ] aparatu do sekwencjonowama (Pharmacia LKB) zgodnie z instrukcją wytwórcy. Dane dotyczące sekwencji nukleotydów otrzymane z ALF zestawiono i zanalizowano z zastosowaniem pakietu oprogramowania DNASIS i wydedukowanych sekwencji białek (PROSIS, Pharmacia-LKB). Sekwencje aminokwasów dla białek OspC pochodzących z 24 różnych szczepów krętków choroby z Lyme (to znaczy 22 sekwencje objęte opisywanymi tu badaniami oraz 2 sekwencje opublikowane odnośnie do szczepów 2591 i PBI) uszeregowano w postać liniową metodą Wilbura i Lipmana („fast/approximate method”), opisanej w PNAS USA, 80,726 - 730 (1983). Tak otrzymaną punktację podobieństwa wykorzystano do skonstruowania dendrogramu metodą UPGMA (pewna forma analizy klasterowej), podanąprzez Sneatha i Sokala, powyżej. Analizy te przeprowadzono z zastosowaniem pakietu oprogramowania Clustal V [ Higgins i Sharp, CABIOS, 5, 151 - 153 (1989); Higgms i m., CABIOS (1991)].

Wyniki i omówienie

Na figurach 8 i 9 przedstawiono uszeregowane liniowo sekwencje nukleotydów oraz wydedukowane, częściowe sekwencje aminokwasów dla genów OspC i białek pochodzących z 24 szczepów reprezentujących 24 różne typy RFLP. Ponieważ aminokwasy poprzedzające pierwsząresztę cysteiny (aminokwas 19 w sekwencji Orth) w białku OspC stanowią sekwencję

178 775 wiodącą, nie występującą w dojrzałym białku (sekwencja FISC stanowi domniemane miejsce rozszczepiania peptydazy sygnałowej) nie objęto ich analizą sekwencji. Przy C-końcu białka wyłączono 16 ostatnich aminokwasów. Obejmuje to region odpowiadający miejscu wiązania startera 2 (równoważny 7 ostatnim aminokwasom), jednocześnie utworzoną lukę dalszych 9 aminokwasów, az do otrzymania danych dotyczących pierwszej sekwencji Ta końcowa część genów OspC wydaje się być wysoce konserwatywna i o mniejszym znaczeniu jeśli chodzi o powodowanie różnorodności obserwowanej u białek OspC, na co wskazuje zdolność do amplifikacji i sekwencja genu OspC w przypadku wszystkich szczepów badanych przy użyciu startera 2 Ponadto, przeciwciała monoklonalne, które wiążąsię z tym regionem OspC, są w szerokim zakresie aktywne (na przykład BBM 29, 42 i 45 na fig. fig. 13 i 14).

Sekwencje OspC są w wysokim stopniu zmienne, przy czym najdalej spokrewnione sekwencje aminokwasów (szczep B. burgdorfen 2971 szczep B. garinn IP90) wykazująjedynie 59% identyczności sekwencji aminokwasów (80% podobieństwa). Jednakże, nie wykryto żadnych różnic sekwencji między członkami tego samego typu RFLP, co wskazuje na fakt, że tego rodzaju metoda typowania bardzo dokładnie oddaje heterogeniczność występującą między genami OspC (co oznacza, że sekwencje OspC dla szczepów VS215, VS2191DK7 typu RFLP 1 są identyczne z sekwencjami ZS7; szczepy IP2 i 26816 typu RFLP 2 są identyczne z B31; szczepy HI 5 i ACA1 typu RFLP 6 sątakie same; szczepy PKO i DK26 typu RFLP-7 sąidentyczne z JSB; szczepy H₄ i W typu RFLP 10 są takie same; szczepy 871104 i KL11 typu RFLP 13 są identyczne; szczepy 20047 i VS185 typu RFLP 14 sątakie same).

Stopień pokrewieństwa występującego między częściowymi sekwencjami aminokwasów OspC, ustalony anahząklasterową przedstawia dendrogram na fig. 10. Białka OspC pochodzące ze szczepów tego samego gatunku są ze sobą ściślej spokrewnione niż białka OspC pochodzące ze szczepów różnych gatunków. Mimo to, jednak, nawet w obrębie jednego gatunku widoczna jest znaczna zmienność Różnorodność sekwencji OspC jest szczególnie wysoka wśród szczepów B garinn, jak to wykazano faktem bardziej rozległego rozgałęzienia drzewa filogenetycznego i większą ilością odmian OspC związanych z B. garinii niż w przypadku dwóch innych garunków Borrelia Struktura klonalna dziedziczenia OspC nasuwa przypuszczenie, że me zachodzi tam wymiana materiału genetycznego w znaczniejszym stopniu, czy to na drodze rekombinacji wewnątrzgenowej, czy horyzontalnego transferu kodowanego palzmidem OspC, pomiędzy różnymi gatunkami Borrelia choroby z Lyme. Białka OspC zostały zaliczone do rodzin OspC, przy czym rodzina OspC zdefiniowana jest jako grupa białek OspC, które wykazują ponad 80% identyczność sekwencji aminokwasów w pierwszych 92% dojrzałego białka OspC, to znaczy z wyłączeniem informacji dla sekwencji wiodącej 18aa i końcowej 16aa Na figurze 1 pokazano 18 rozmaitych rodzin OspC, z tym, że zidentyfikowano dwie dalsze rodziny OspC (19 i 20) na podstawie niekompletnych informacj i odnoszących się do sekwencj i dla białek OspC pochodzących ze szczepów H13 i 28691. Nie obejmuje ich wspomniany dendrogram. Pomimo tej wielkiej różnorodności stwierdzonej wśród białek OspC, pierwsza trzecia część dojrzałego białka OspC jest konserwatywna, przy czym szczepy z tego samego gatunku wykazująokoło 80 90% identyczność sekwencji w tym regionie. Jednakże, identyczność sekwencji dla białek OspC pochodzących z różnych szczepów nie jest wysoka w takim stopniu w tej części białka, a to w wyniku obecności gatunkowo swoistych motywów sekwencji przy N-końcu białka OspC. Jak wyżej zaznaczono, G-końcowa część białka OspC, której nie pokazano, także w oczywisty sposób była w znacznym stopniu konserwatywna. Region znajdujący się pośrodku (to znaczy niższe dwa bloki na fig. 9, pomiędzy resztami aminokwasów KKI i NS) jest w wysokim stopniu zmienny i stanowi główne źródło różnorodności związanej z OspC. Należy oczekiwać, że serotypowo swoiste epitopy znajdować się będą w obrębie tego zmiennego regionu. Analiza profilów hydrofilowości poszczególnych sekwencji białka, dokonana metodą Hoppa i Woodsa, wykazuje, że najwyższy pik hydrofitowy, świadczący mocno o istnieniu epitopu, leży w tym właśnie obszarze. Bardziej szczegółowo^- pomimo wielkiej zmienności występującej między sekwencjami OspC w tym regionie, domniemany epitop niezmiennie znajduje się pomiędzy resztami aminokwasów

178 775

120 - 155 dojrzałego białka. W białku OspC szczepu Orth, pik hydrofilowości znajduje się pomiędzy resztami 136 - 141 (DNDSKE), a więc w regionie o dużej elastyczności i przewidywanym skręcie β. Parametry te też mogą wskazywać na epitop (analizy wykonane przy użyciu PC/GENE).

Przykład 5. Mapowanie epitopów przeciwciał monoklonalnych przeciw OspC.

Epitopy niektórych przeciwciał monoklonalnych przeciw OspC mapowano przy użyciu dostępnego w handlu zestwu Custom Designated Epitope Scannmg produkcji Cambridge Research Biochemicals Ltd., Gradbrook Park, Northwich, Cheshire, Anglia, w przypadku którego stosuje się albo technikę szpilkową („pin technology method”) opisaną przez Geysena i in. [ J Immunol. Methods, 102, 259 - 274 (1987)], albo technikąELISA z biotynylowanym peptydem lub metodą Dot Biot, opisaną przez wytwórcę. Poddane testowaniu zsyntetyzowane w zwykły sposób peptydy, w liczbie 2026, były to jednostopniowe, zachodzące na siebie 10-mery sekwencji białek OspC, pokazane na fig. 9. Do analizy tej włączono również zachodzące na siebie peptydy z sekwencji peptydowej sygnałowej ze szczepu Orth oraz C-końce białek OspC pochodzące ze szczepów Orth PKO i B31.

Połączona sekwencja kolejnych peptydów reagujących z przeciwciałem monoklonalnym opisana jest jako „pełna sekwencja epitopu” .Na figurze 13 przedstawiono pełnąsekwencję epitopu tych przeciwciał monoklonalnych, w przypadku których można było rozróżnić epitopy. Sekwencja objęta nawiasami kwadratowymi, [ ], obejmuje aminokwasy wspólne dla wszystkich reagujących peptydów i dlatego stanowi ważną część epitopu. Umiejscowienie każdej pełnej sekwencji w obrębie ogólnej masy białka OspC przedstawiono na fig. 14. W jednym przypadku rozróżnić można było szereg epitopów, jednakże dotyczy to tylko epitopu pierwotnego, najbardziej aktywnego i to podano na fig. 13 i pokazano na fig. 14. W tych przypadkach, gdy przeciwciało monoklonalne reagowało z peptydarni odpowiadającymi podobnym regionom w więcej niż jednym białku OspC, podano to tylko dla szczepu Orth. I na odwrót, w przypadku gdy przeciwciało monoklonalne nie reaguje z białkiem Orth (na przykład BBM 43), podano sekwencję reagującą dla szczepu homologicznego (PKO). Na dole fig. 13 przeciwciała monoklonalne zgrupowano na kategorie w oparciu o częstotliwość występwoania epitopu, który one rozpoznają (i to pokazano w górnej części figury). Jak można zobaczyć, ponad połowa z nich rozpoznaj e wysoko swoiste epitopy, przy czym występują one w mniej niż dziesięciu szczepów poddawanych analizie. Pięć spośród przeciwciał monoklonalnych rozpoznaje epitopy pojawiające się przejściowo, podczas gdy siedem pozostałych, jak można przyjąć, rozpoznaje epitopy wspólne, gdyż występująone w ponad 25 na 77 szczepów badanych. Przeciwciała monoklonalne, co do których stwierdzono, że nadają się do analizy typu serovar, zaznaczono na fig. 13 gwiazdką. Jest rzeczą interesującą, że były to wpierw przeciwciała monoklonalne, które rozpoznają wspólne epitopy (BBM28,29,34,37,42,43 i 45) lub epitopy pojawiające się przejściowo (BBM 22,35140), które można było mapować w sposób jednoznaczny. I rzeczywiście, jedynie trzy przeciwciała monoklonalne, które można było uważać za typowo swoiste (BBM 38,39 i 44), to znaczy reagujące w mniej mz 10 szczepami, dały się mapować. Tak BBM 38 jak i 39 mają ten sam profil reakcji i zostały zmapowane do tego samego regionu (aminokwasy 155 i 170). W oparciu o wykresy hydrofilowości sekwencji aminokwasów białka Orth, pik hydrofilowości i przewidywany skręt β zgodne sąz tym regionem, stanowiąc parametry wyraźnie wskazujące na epitop. Epitop BBM 44 zajmuje pozycję pomiędzy aminokwasami 79 a 90, a więc także w obszarez wyraźnej zmienności. Niestety, nie udało się zmapować żadnego epitopu innych typowo swoistych przeciwciał monoklonalnych, co sugeruje, że zależą one od konformacji cząsteczki. Jednakże, ponieważ wszystkie 3 typowo swoiste przeciwciała mapujądo regionów należących do najbardziej zmiennych w białku, istnieje wysokie prawdopodobieństwo, że zachodzi to także w przypadku innych typowo swoistych epitopów. Jest rzeczą interesującą, że BBM 28, który reaguje z epitopem o wysokiej częstotliwości występowania, mapuje także do tych samych regionów co BBM 38 i 39 Przyczyna tego nie jest znana, jednakże może tu chodzić o nieznaczne różnice w liczbie i obecności aminokwasów zaangażowanych w miejscu wiążącym, powodujące tę niejasność.

178 775

Cztery przeciwciała (BBM 29, 42, 43 i 45), które reagują ze wspólnym epitopem, mapują przy dalszym C-końcu białka (aminokwasy 200 do 212), podczas gdy dwa mne reagująbhsko N-końca białka (aminokwasy 41 do 67), a więc w regionach, co do których wykazano, że sąw wysokim stopniu konserwatywne Przeciwciała monoklonalne rozpoznające epitopy o przejściowym występowaniu mapowały w obrębie regionów semikonserwatywnych (aminokwasy 103 do 114 i aminokwasy 176 do 196) cząsteczki

Wynik ten potwierdzono w dalszym eksperymencie, w którym poddano przeglądowi pohwalentne surowice królicze swoiste wobec frakcji błonowych 2 szczepów wyrażających każdą spośród 16 odmian serovarów białka OspC, testując je wobec 203 zachodzących na siebie peptydów białka Orth. Wszystkie wspólne, krzyżowo reagujące epitopy znaleziono w obrębie konserwatywnych i semikonserwatywnych regionów powyżej omówionych. Jest rzeczą interesującą, że surowice pochodzące ze szczepów z grupy CMAT 1 (B. burgdorfen sensu stricto) me reagowały krzyżowo tak często, jak surowice ze szczepów grupy CMAT 3 (B. afzelii) i grupy CMAT 4 (B. ganmi).

Przykład 6. Badania nad krzyżową ochroną na gerbilach.

W celu upewnienia się, czy możliwa jest krzyżowa ochrona z udziałem różnych rodzin OspC, wyodrębniono baiłka OspC ze szczepu B. Burgdorfen ZS7 (rodzina OspC 1), ze szczepu B. afzelii PKO (rodzina OspC 7) i ze szczepu B. gannn W (rodzina OspC 10). Białek tych użyto jako immunogenów w modelu gerbilowym borcliozy z Lyme w warunkach prowokacji przy użyciu B afzelii szczep Orth (rodzina OspC 5). W celu zbadania ochrony w obrębie rodziny, jako immunogenu, wobec szczepu Orth, użyto OspC ze szczepu H7 (rodzina OspC 5). OspC ze szczepu H7 należy do tego samego serovaru u typu RFLP, co OdpC ze szczepu Orth.

Gerbilom podawano dawkę immumzacyjną albo w postaci pojedynczego wstrzyknięcia podskórnego oczyszczonego OspC (20 pg białka/200 μΐ, z udziałem adiuwanta w postaci TiterMax nr R-l (CytRx), a więc jako emulsja typu woda w oleju (skwalen) z syntetycznym immunomodulatorem (kopolimer CRL89-41), albo w postaci dwóch wstrzyknięć dootrzewnowych OspC (10 pg białka/500 pi) z udziałem adiuwanta w postaci wodorotlenku glinu. Oczyszczone antygeny otrzymano ze szczepów sposobami opisanymi w zgłoszeniu patentu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/903580, którego treść została poprzednio włączona do mniejszego opisu jako odnośnik. Po upływie trzech i pół tygodnia od immunizacji przeprowadzonej po raz pierwszy, pobrano próbki krwi z oka i osocze przygotowano w taki sposób, aby można było dokonać sprawdzenia odpowiedzi, polegającej na wytworzeniu przeciwciał, na immunogen w czasie prowokacji (podobnemu potraktowaniu poddano nie immunozowane zwierzęta kontrolne). Po upływie czterech tygodni od pierwszej immunizacji, zwierzęta poddano dootrzewnowej prowokacji polegającej na wstrzyknięciu 10⁴ komórek (25 - 100 ID50) szczepu Orth. Podobnie postąpiono w przypadku grupy kontrolnej, obejmującej zwierzęta nie immunizowane. Użytą do prowokacji zawiesinę zmiareczkowano także u zwierząt nie immunizowanych w celu określenia dawki potrzebnej do zakażenia 50% zwierząt Po upływie dalszych dwóch tygodni zwierzęta poddane prowokacji dawką 10⁴ komórek uśmiercono, pobrano pęcherze, serca, nerki i śledziony i prowadzono ich hodowlę w podłożu BSK. Co tydzień, począwszy od drugiego tygodnia od inokulacji aż do szóstego tygodnia, hodowle kontrolowano pod względem obecności krętków, posługuj ąc się przy tym mikroskopią w ciemnym polu Pobierano także krew i otrzymywane osocze poddawano analizie metodą Western biot, badając serokonwersję, to znaczy powstawanie przeciwciał po prowokacji antygenami ze szczepu Orth, innymi niż immunogen. Stwierdzono dobrą zgodność testów hodowlanych i serologicznych przeprowadzonych w celu sprawdzenia, które zwierzęta zostały zainfekowane. W przypadku oznaczenia ID50 wykonano tylko testy serologiczne, ale w tym wykonaniu zwierzęta skrwawiono po upływie trzech tygodni od przeprowadzenia prowokacji, a czas ponad to poświęcono na upewnienie się czt odpowiedź humoralna u zakażonych gerbili jest dostatecznie silna, aby mogła być łatwo wykryta. Nie były żadnych oznak ochrony krzyżowej między gatunkami, co oznacza, że białka OspC z rodzin OspC 1 (B burgdorfen) 110 (B. garinn) były nieskuteczne jako immunogeny w stosunku do prowokującego szczepu

178 775

Orth (B afzehi). Podobnie, nie było żadnych oznak ochrony krzyżowej między różnymi rodzinami OspC tych samych gatunków, co oznacza, że białko OspC z rodziny OspC 7 (z izolatu) (B. afzelii szczep PKO) było nieskuteczne jako immunogen w stosunku do prowokacji szczepem Orth, który wyrażał białko OspC z rodziny OspC 5. W przeciwieństwie do tego, immunizacja przy użyciu białka OspC ze szczepu H7 (rodzina OspC 5) okazała się skuteczna w stosunku do użytego do prowokacji szczepu Orth (rodzina OspC 5). Dane te (fig. 15) wskazują na fakt, że ochrona krzyżowa między rodzinami OspC jest nieprawdopodona i że możliwa jest ochrona w obrębie rodziny Multiwalentna szczepionka zawierająca jeden, lub większą ilość typów białek OspC z każdej z rodzin OspC powinna być zadowalająca pod względem zabezpieczania przed większością szczepów Borrelia choroby z Lyme.

Przykład7. Częstość występowania (w sensie rozmieszczenia geograficznego) różnych rodzin białel OspC związanych z chorobą u człowieka.

W rezultacie istnienia wysokiego stopnia zmienności białka OspC, jest rzeczą nadzwyczaj trudną zaprojektowanie takich preparatów szczepionek, które stanowiłyby dobre zabezpieczenie ochronne, ale me wymagałyby włączenia nadmiernie dużej liczby odmian dla osiągnięcia tego celu. Jednym ze sposobów zoptymalizowania doboru odmian OspC mogłoby być ustalenie, które odmiany OspC są związane z chorobąu człowieka i występują z dużą częstością. Rzadkie odmiany OspC lub odmiany OspC rzadko kiedy związane z chorbąu człowieka mogłyby być w tym stanie rzeczy wyłączone ze składu jakichkolwiek preparatów szczepionek z minimalną tylko utratą skuteczności działania takiej szczepionki. Dalej, w przypadku zaprojektowania szczepionki z przeznaczeniem do stosowania w konkretnym regionie geograficznym, niepotrzebne byłoby włączanie do mej tych odmian OspC, które me przeważają wśród Borrelia choroby z Lyme w tym regionie. Z wykorzystaniem informacji epidemiologicznych oraz danych uzyskanych w wyniku typowania OspC z udziałem szczepów Borrelia, użytych do niniejszych badań (fig. 12) możliwy jest wybór tych odmian OspC, które powinny zostać włączone do szczepionki (szczepionek) OspC.

Analiza izolatów B. burgdorfen (grupa CMAT 1, włącznie ze szczepem 25015; ogółem 23 szczepy) wykazuje, że większość przeważających odmian OspC wśród tych szczepów są to odmiany należące do rodzin 1 i 2. Szczepy z rodziny 1 są to, w całości, izolaty europejskie i mogą one powodować chorobę u człowieka, aczkolwiekjedynie 1 spośród 5 szczepów okazał się izolatem ludzkim, co może stanowić wskazówkę, że szczepy te nie są szczególnie zjadliwe. Szczepy należące do rodziny 2 stanowiąjeden, najpowszechniejszy typ w rodzinie OspC, liczący 10 członków. Inaczej niż w przypadku rodziny 1, szczepy te są szeroko rozpowszechnione w Stanach Zjednoczonych Ameryki, w Europie oraz w Rosji. Szczepy należące do rodziny 2 są w oczywisty sposób związane z chorobąu człowieka, przy czym 50% izolatów są to próbki kliniczne. Osiem pozostałych przetestowanych izolatów B. burgdorferi są to w całości izolaty pochodzące ze Stanów Zjednoczonych Ameryki. Są one bardzo różnorodne, jeśli chodzi o wyrażane przez nie OspC, ponieważ każdy szczep wyraża odmienne OspC typu RFLR Tylko jeden z tych szzepów (szczep 297, rodzina 3) wyizolowano z przypadku choroby z Lyme Szczepy z rodzin 2 13 należa (z wyjątkiem szczepu 25015) do jednego z trzech głównych klonów związanych z chorobąu człowieka (typ CMAT 1.2.4. fig. 5). 26 szczepów B. afzehi (to znaczy grupa VS461, grupa CMAT 3) dzieli się na sześć osobnych rodzin : rodziny OspC 4 - 8 i rodzina 16, z, odpowiednio, 5, 4, 6, 2 lub 4 członkami. Z wyjątkiem jednego izolatu japońskiego, wszystkie szczepy pochodziły z Europy : Austria (14), Republika Czeska (4), Dania (1), Niemcy (2), Włochy (l), Słowenia (1), Szwecja (1) i Szwajcaria (1). 88% izolatów europejskich były to izolaty pochodzące od ludzi, z tym, że 80% izolatów pochodziła z biopsji skóry, a 8% z próbek krwi. Dane te odzwierciedlają silne powiązanie występujące między szczepami B. afzelii a rozwojem dermatologicznych form choroby z Lyme. Izolaty ludzkie rozmieszczone były równomiernie wśród poszczególnych różnych rodzin OspC. Izolaty austriackie należały głównie do rodzin 4 - 6 (86%), ale pojedynczych reprezentantów znaleziono także w rodzinach 7 i 8. Niski poziom występowania izolatów austriackich wśród rodziny OspC 7 (to znaczy 1/5) oraz nieobecność izolatów z rodziny 16 (0/4) nasuwa sugestię, że w Europie mamy do czynienia z rozmaitością

178 775 geograficzną pod względem przewagi poszczególnych rodzin OspC B. afzeln. Niezależnie od tego, szczepy B afzeln z rodzin OspC 4 - 8116 są szeroko rozproszone w całej Europie Szczepy te sąprawie wyłącznie członkami innego głównego klonu związanego z chorobąu człoowieka, a mianowicie 3 2.13 (fig. 5). Trzydzieści szczepów B. gannii (to znaczy grupa CMAT 4, z wyłączeniem nietypowych szczepów 19857 i 19952, oraz szczepów 20047, IP901NBS16 CMAT 2) można w dalszym ciągu podzielić na dziewięć rodzin OspC i 2 typy RFLP, co do których brak zaliczenia do jakiejś rodziny. 53% przebadanych szczepów B. gannii były to izolaty pochodzące od człowieka i szczepy te są rozmieszczone wśród wszystkich (z wyjątkiem jednego, RFLP 34) typów OspC 75% (12/16) tych szczepów B garinii wyizolowano z przypadków neuroborehozy, a pozostałe szczepy były to izolaty skórne. Tak więc, B. garinii jest w pierwszym rzędzie związany z przypadkami neuroboreliozy, aczkolwiek należy oczekiwać pojawiania się izolatów skórnych, ponieważ rozwój chorobowych zmian skóry (EM) stanowi przejaw wspólny dla wszystkich postaci choroby z Lyme, niezależnie od rodzaju czynnika przyczynowego. Szczepy rodziny OspC 13 były najczęściej izolowanym typem OspC, stanowiąc 23% (7/30) wszystkich typów OspC B. gannii 125% (4/16) izolatów pochodzących od człowieka. Szczepy należące do tej rodziny OspC są szeroko rozpowszechnione w całej Europie i obejmują izolaty z 6 różnych krajów. Również rodzina OspC 11 jest szeroko rozpowszechniona i występuje z umiarkowaną częstością (17% lub 5/30), natomiast jej związek z chorobąu ludzi jest mniej wyraźny, ponieważ tylko jeden izolat pochodził od człowieka. Może to być, jednakże, odzwierciedlenie jakiegoś błędu przy pobieraniu próbek, a także niewielkiej liczby szczepów poddawanych analizie Te ostatnie uwagi można także odnieść do szczepów z rodziny OspC 14 (na 4 szczepy tylko 1 jest izolatem ludzkim) Stwierdzono mniejszą częstość występowania izolatów z innych rodzin OspC (9, 10, 12, 15, 17, 191 typy RFLP 33 i 34). Jednakże, w przypadku szczepionki przeciw austriackim szczepom B. gannii, należy brać pod uwagę także rodziny OspC 10 i 19, ponieważ wszystkie cztery izolaty B gannii z Austrii należały do tych dwóch rodzin OspC.

Poza tym, oprócz bezpośredniego zbadania szczepów Borrelia, jak to powyżej opisano, jest także możliwe pośrednie określenie stopnia przeważania różnych odmian OspC i ich związku z boreliozą u człowieka. Można tego dokonać za pomocą przetestowania swoistości przeciwciał OspC w surowicy pobranej od pacjentów cierpiących na chorobę z Lyme. Badaniu pod względem wytwarzania przeciwciał przeciw OspC poddano surowice pobrane od 50 pacjentów z obszaru Pragi (Republika Czeska) cierpiących na EM (15), na AC A (15), zaburzenia neurologiczne (10) i zespoły związane ze stawami i mięśniami (10). Stwirerdzono, że w przypadku przeszukiwania z udziałem zestawu 18 szczepów, 17 (34%) surowic (3 EM, 10 AC A, 3 zapalenie stawównatle choroby z Lyme oraz 1 neuroborelioza) reagowałozjednąlub więcej niżjednąz 16 rodzin OspC użytych w teście (fig. 16) Dwanaście spośród tych surowic reagowało swoiście z konkretnie jednym OspC [rodzina 5 (4 x), rodzina 7 (3 x), rodzina 6 (2 x), rodzina 8,13 i 14(1 x)]. Trzy surowice reagowały z dwiema rodzinami, 4 i 6, podczas gdy dwie inne surowice dawały w szerokim zakresie reakcje krzyżowe z 618 rodzinami poddawanymi testowaniu. Tak więc, w Republice Czeskiej występują szczepy Borrelia wyrażające odmiany OspC z rodzin OspC 5-7,13, 14 i prawdopodobnie 4. Te dane serologiczne są zgodne, a tym samym ugruntowująwyniki uzyskiwane w wyniku analizy szczepów przeprowadzonej w sąsiednim kraju, Austrii.

Na podstawie opisanych powyżej wyników, sformułowano szczepionki przeznaczone do stosowanie w :

1) Stanach Zjednoczonych Ameryki : OspC z rodzin 2 i 3;

2) Europie : 14 odmian OspC z rodzin OspC 2, 4 - 7, 9, 10, 12, 13, 14, 15 - 17 i 19;

3) Austrii: 8 lub więcej OspC z rodzin OspC 2, 4 - 7, 13 i 19.

Przykład 8. Ekspresja rekombmantowego OspC w Pichia pastons. Konstruowanie wektora ekspresji OspC Pichia pastons.

Do klonowania sekwencji kodującej OspC B. burgdorfen użyto rekombmantowego bifunkcjonalnego wektora pHIL-Al P. pastons/ E. coli (dostarczonego przez firmę Phillips Petroleum). Wybrano zestaw szczepów obejmujący jednego, lub większą ilość reprezentantów z każdej rodziny i gen OspC amplifikowano metodąpohmerazowej reakcji łańcuchowej. Sekwencję ko

178 775 dującą dojrzałego białka OspC, rozpoczynającą się od pierwszej cysteiny (aminokwas 19 w sekwencji białka OspC ze szczepu Orth) amplifikowano przy użyciu szczepowo swoistych starterów wydedukowanych z sekwencji nukleotydów OspC sposobem ujawnionym w USSN 07/903580 (EP 0 522 560).

W celu utworzenia końca 5' 13' genu OspC B. burgdorferi Orth, pohmerazowąreakcję łańcuchową (PCR) przeprowadzono zasadniczo tak, jak to opisano w przykładzie 4, z zastosowaniem N-końcowego startera PC-F o sekwencji: 5' - AAATGTGTAATAATTCAGGGAAAGG-3' oraz C-końcowego startera PC-B o sekwencji : 5' -ATTAAGGTTTTTTTGGAGTTTCTG-3'. Sekwencja podkreślona w starterze PC-F jest identyczna z inicjacyjnym kodonem translacji dojrzałego białka OspC, i odpowiednio, podkreślona sekwencja w starterze PC-B jest identyczna z kodonem termmacyjnym translacji.

Strategie klonowania (miejsce restrykcji w wektorze i starterach stosowanych w PCR) przyjęte przy insercji sekwencji kodującej OspC szczepów B. burgdorferi B31, PKO, ZS7, KL10 i E61 do pHIL-Al, podsumowano w poniższej tabeli 1.

Wektor pHIL-Al poddano trawieniu przy użyciu Sful i wystające końce wypełniono polimcrazą Klenowa w celu utworzenia tępych końców. Oczyszczony grafment PCR zawieraj ący sekwencję kodującą OspC ligowano do wektora przez noc. Mieszaniny pohgacyjnej użyto do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5 cc, po czym wyselekcjonowano kolonie oporne na ampicylinę na płytkach LB-Amp, z przeznaczeniem do dalszej amplifikacji plazmidu. Dokonano przeszukania minipreparatów (Maniatis i in., 1982) i przeanalizowano pod względem długości fragmentu restrykcyjnego. Plazmid zawierający gen OspC oznakowano pPC-PP4 (fig. 17). Otrzymano oczyszczony pPC-PP4 DNA i sekwencję jego potwierdzono przez sekwencjonowame DNA. Oczyszczony plazmid pPC-PP4 transformowano w komórkach szczepu P. pastoris GS115 NRRL-Y 11430 [ Cregg i in , Mol. Celi. BioL, 5, 3376 - 3385 (1985)] z zastosowaniem metody opisanej przez Dohmena i in. [ Yeast, 7, 691 - 692 (1991)]. Otrzymane transformanty selekcjonowano na płytkach MD.

Szczep B burgdorferi	Starter	Wektor pHIL-Al trawiony ·
Orth	5' - AA ACG ATG TGT AAT AAT TCA GGG AAA-3' 5' GGATTAAGGTTTTTTTGGTTTCTG-3'	Sful/Klenow
KLIO	5' -GGGACTTCGAAACGA ATG TGTAATAATTCA-3' 5' - GGTGGG GGA ATT CAT TAA GGT TTT-3' 5' - TTT GGA-3'	Sfi.il/EcoRI
ZS7	5' -GGGAAAAAAAACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3' 5' -TAATTCAGGGAAAG GGA AAT CAT TAA-3' 5' -GGT TTT TTT GGA-3'	Sful/EcoRI
B31	5' -GGGAAAAAAAACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3' 5' -TAATTCAGGGAAAG GGA AAT CAT TAA-3' 5' -GGT TTT TTT GGA-3'	Sful/EcoRI
E61	5' -GGGAAAAAAAACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3' 5' -TAATTCAGGGAAAG GGA AAT CAT TAA-3' 5' -GGT TTT TTT GGA-3'	Sful/EcoRI
PKO	5'-CGGAAAAAAAACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3' 5'-TAATTCAGGGAAAG GGA AAT CAT TAA-3' 5' -GGT TTT TTT GGA-3'	Sful/EcoRI

178 775

Tabela 1 przedstawia startery oligonukleotydowe stosowane do amplikowania metodą PCR sekwencji kodującej dojrzałego białka OspC rozmaitych szczepów Borreha choroby z Lyme. Podano również enzymy restrykcyjne stosowane przy msercji sekwencji kodującej OspC do wektora pHil-Al.

Ekspresja rekombinantowego OspC w P. pastons

Transformaty P. pastons GS 115/pPC-PP4 wybrano z płytek MD i hodowano w 3 ml podłoża MG, w temperatueze 30°C, przy stałym mieszaniu, az do osiągnięcia gęstości optycznej (OD 600) 2 -10 W celu zapoczątkowania syntezy OspC, odwirowano 1 ml hodowli i po przemyciu j eden raz przy użyciu MM ponownie zawieszono w 3 ml MM lub podłoża MMY¹, po czym inkubowano w ciągu 2 dni, w temperaturze 30°C, przy stałym mieszaniu. Ekspresję OspC indukowano wprowadzeniem metanolu do podłoża wzrostowego. Pobierano próbki hodowli i hzaty poddawano analizie metodą Western biot przy użyciu swoistego względem OspC przeciwciała monoklonalnego BBM 45

[* Wszystkie wyszczególnione poniżej podłoża podano w ilościach/htr :

MD : Ycast nitrogen base (YNB, 13,4 g), siarczan amonowy (5 g), biotyna (400 mg), glukoza (2%)

MG : YNB, siarczan amonowy, biotyna, gliceryna (10 ml/htr), fosforan potasowy (100 mM).

MM : YNB, siarczan amonowy, biotyna, metanol (5 ml), fosforan potasowy (100 mM) MMY : MM, ekstrakt drożdżowy (10 g), kazeina (20 g)].

Oczyszczanie rekombinantowego OspC.

Komórki P. pastoris GS115/pPC-PP4 zebrano za pomocą odwirowania (3000 x g, 5 minut, 4°C). Przemyte komórki ponownie zawieszono w 150 mM buforze Tris/HCl, pH 7,4, po czym do zawiesiny dodano kuleczki szklane. Następnie komórki poddano bzie przez wytrząsanie mieszaniny w aparacie Vibrogen ^R cell-mill (Model V14, Buehler). Następnie hzat przesączono przez lejek z filtrem ze spiekanego szkła w celu usunięcia kuleczek szklanych, po czym wirowano w ciągu 5 minut przy 3000 x g, w temperaturze 4°C. Następnie supematant dalej wirowano w ciągu godziny przy 100000 x g, w temperaturze 4°C. Otrzymany tak „supematant wysokiej prędkości” stosowany był w dalszym ciągu oczyszczania antygenu OspC.

Antygeny OspC frakcjonowano metodą chromatografii DEAE, jak to przykładowo podano poniżej :

kolumna : Protein-PAK DEAE 5PW z firmy Waters próbka : 45 ml preparatu antygenu po dializie bufor do równoważenia (A) : 10 mM Tns/HCL pH 7,5 bufor do elucji (B): 10 mM Tris/HCL, 1 M NaCl, pH 7,5.

szybkość przepływu : 4 ml/min gradient: 0% B w ciągu 70 minut, 0 - 100% w ciągu 50 minut.

Kolumnę zrównoważono buforem A i antygeny eluowano przy wzrastających ilościach NaCl. W celu zidentyfikowania frakcji zawierających antygen będący przedmiotem zainteresowania, pobierano z frakcji próbki i po wytrąceniu acetonem otrzymane osady poddawano analizie metodą SDS-PAGE i/lub metodą immunoblottingu. Frakcje pochodzące z rozdziału metodą chromatografu jonowymiennej DEAE, zawierające antygen OspC, poddawano dalszemu oczyszczeniu metodą chromatografii powinowactwa z unieruchomionym metalem, opisaną w EP 0 522 560.

Wytwarzanie białka OspC w fermentorze w dużej skali.

Badaniu poddano wytwarzanie OspC w fermentacyjnym procesie ciągłym Każdą szarże prowadzono w fermentorze wyposażonym w urządzenia monitorujące i kontrolne, pozwalające mierzyć i regulować takie parametry, jak pH, ilość rozpuszczonego tlenu, szybkość mieszania, temperatura oraz przepływ powietrza i tlenu. Temperaturę utrzymywano na poziomie 30°C. Wydajność biomasy komórek oznaczano na podstawie ciężaru przemytych wilgitnych komórek. Inokula dla szarż fermentacyjnych hodowano w 2-htrowych kolbach Erlenmeyera zawierających 500 ml modyfikowanego podłoża FM21, tak, jak to ujawniono w EP 0 263 311. Hodow

178 775 le fermentacyjne otrzymane sposobem okresowym rozwijano przy użyciu gliceryny jako jedynego źródła węgla i energii. Hodowle ciągłe stabilizowano stałym zasilaniem gliceryną aż do osiągnięcia stężenia biomasy wynoszącego 500 - 700 g wilgotnych komórek/htr. Gdy już pobrane zostały kontrolne próbki odniesienia, do hodowli zaczęto wprowadzać metanol w postaci preparatu złożonego z metanolu, soli i biotyny, i dodawanie to kontynuowano w ciągu szeregu dni w celu utrzymania stężenia metanolu na poziomie od 0,05 do 1,5%. Każdego dnia usuwano wytworzoną biomasę. Komórki P. pastons zbierano za pomocą odwirowania i ponownie zawieszano w buforze (150 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 1 mM chlorowodorku benzamidyny, 0,1% NaN₃ pH 7,4). Lizaty komórek otrzymywano przy użyciu prasy Frencha. Stężenie białka OspC oznaczano metodą Bradforda. Wstępne wyniki wykazywały, że wydajność produkcji antygenu OspC (na jednostkę objętości hodowli) pochodzącego ze szczepów P. pastons była 100-krotnie wyższa od wydajności osiąganej w przypadku szczepów B. burgdorferi.

Badania nad immumzacją i prowokacją (ochroną) z udziałem antygenu OspC pochodzącego z P pastons.

Badania nad ochroną przeprowadzono na gerbilach tak, jak to opisano w przykładzie 5. Przetestowano 20-mikrogramowe dawki OspC z P. pastons (klonowanego ze szczepu Orth) lub Borrelia szczep Orth, pod względem skuteczności działania ochronnego, jak to przedstawiono na fig. 18. Wszystkie gerbile immunozowane OspC pochodzącym z P. pastons były zabezpieczone przed prowokacją homologicznym szczepem Orth i otrzymane wyniki są porównywalne z wynikami badań nad ochroną otrzymanymi przy użyciu antygenu OspC pochodzącego z Borrelia.

178 775

ZESTAWIENIE SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(1) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Inununo Aktiengesellshaft (B) ULICA: Industriestrasse 67 (C) MIASTO: Wiedeń (Wien) (E) KRAJ: Austria (AT) (F) KOD POCZTOWY (ZIP): A-1221 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Preparat immunogenny szczepionek antygenowych OspC do zapobiegania i leczenia choroby z Lyme oraz rekombinacyjne sposoby wytwarzania takich antygenów.

(lii) ILOŚĆ SEKWENCJI: 78 (iv) DANE KOMPUTEROWE:

(A) TYP ŚREDNI: Floppy disk (B) KUMPUTER: IBM PC kompatybilny (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE : Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (vi) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA :

(A) NUMER ZGŁOSZENIA : US 08/053863 (B) DATA ZGŁOSZENIA : 29 KWIETNIA 1993r (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)

DŁUGOŚĆ: 576 par zasad (B)

TYP: kwas nukleinowy (C)

STRUKTURA NICIOWA: podwójna

178 775 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vl) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia burgdorferi (B) SZCZEP: 28691 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS * (B) POZYCJA: 1..576 (xi) OPIS SEKWENCJI: NR ID.SEKW.: 1:

TGT AAT AAT TCA GGA

Cys Asn Asn Ser Gly

5

GAG TCT GTT AAA GGG

Glu Ser Val Lys Gly

GAA TCT AAC GCA GTT

Glu Ser Asn Ala Val

GCA TCT ATA GAT GAA

Ala Ser Ile Asp Glu

AAT AAT GGT TTA GAG

Asn Asn Gly Leu Glu

GGA GCT TAT GCA ATA

AAA GAT GGG AAT GCA TCT Lys Asp Gly Asn Ala Ser

CCT AAT CTT ACA GAA ATA Pro Asn Leu Thr Glu Ile

GTT CTG GCC GTG AAA GAA

Val Leu Ala Val Lys Glu

CTT GCT ACC AAA GCT ATT Leu Ala Thr Lys Ala Ile

GCC AAT CAG AGT AAA AAC Ala Asn Gin Ser Lys Asn

7075

TCT GAC CTA ATA GCA GAA

GCA AAT TCT GCT GAT48

Ala Asn Ser AlaAsp

AGT AAA AAA ATT ACA96

Ser Lys Lys IleThr

GTT GAG ACC TTA CTT144

Val Glu Thr LeuLeu

GGT AAA AAA ATA GGC192

Gly Lys Lys IleGly

ACA TCA TTG TTA TCA240

Thr Ser Leu Leu Ser

AAA TTA AAT GTA TTG 288 * CDS - Kodująca sekwencja DNA

178 775

Gly Ala Tyr Ala Ile Ser Asp Leu

Ile Ala Glu Lys Leu Asn Val Leu

90 95

AAA AAT GAA GAA TTA AAG GAA AAG ATT GAT Lys Asn Glu Glu Leu Lys Glu Lys Ile Asp

100 105

ACA GCT AAG CAA TGT TCT 336

Thr Ala Lys Gin Cys Ser

110

ACA GAA TTT ACT AAT AAA CTA AAA AGT GAA CAT GCA GTG CTT GGT CTG Thr Glu Phe Thr Asn Lys Leu Lys Ser Glu His Ala Val Leu Gly Leu

384

115 120 125

GAC AAT Asp Asn

CTT ACT

GAT Asp

GAT AAT GCA

CAA Gin

AGA GCT ATT

TTA Leu

AAA Lys

CAT His

432

Leu

Thr

Asp

Asn 135

Ala

Arg

Ala

Ile 140

130

GCA

AAT

AAA

GAT

AAG

GGT

GCT

GCA

GAA

CTT

GAA

AAG

TTA

TTT

AAA

GCG

480

Ala

Asn

Lys

Asp

Lys

Gly

Ala

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Phe

Lys

Ala

145

150

155

160

GTA

GAA

AAC

TTA

TCA

AAA

GCA

GCT

CAA

GAC

ACA

TTA

AAA

AAT

GCT

GTT

528

Val

Glu

Asn

Leu

Ser

Lys

Ala

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Asn

Ala

Val

165

170

175

AAA

GAG

CTT

ACA

AGT

CCT

ATT

GTG

GCA

GAA

AGT

CCA

AAA

CCT

TA

576

Lys

Glu

Leu

Thr

Ser

Pro

Ile

Val

Ala

Glu

Ser

Pro

Lys

Pro

180 185 190 (2) INFORMACJA DLA SEKW.NR ID.: 2:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 191 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

178 775 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.: 2

Cys Asn Asn Ser 1

Glu Ser Val Lys

Glu Ser Asn Ala 35

Ala Ser Ile Asp 50

Asn Asn Gly Leu 65

Gly Ala Tyr Ala

Lys Asn Glu Glu

100

Thr Glu Phe Thr 115

Asp Asn Leu Thr 130

Ala Asn Lys Asp 145

Val Glu Asn Leu

Gly Lys Asp Gly 5

Gly Pro Asn Leu

Val Val Leu Ala

Glu Leu Ala Thr

Glu Ala Asn Gin

Ile Ser Asp Leu 85

Leu Lys Glu Lys

Asn Lys Leu Lys

120

Asp Asp Asn Ala 135

Lys Gly Ala Ala 150

Ser Lys Ala Ala 165

Asn Ala Ser Ala

Thr Glu Ile Ser 25

Val Lys Glu Val

Lys Ala Ile Gly

Ser Lys Asn Thr 75

Ile Ala Glu Lys 90

Ile Asp Thr Ala 105

Ser Glu His Ala

Gin Arg Ala Ile

140

Glu Leu Glu Lys

155

Gin Asp Thr Leu

170

Asn Ser Ala Asp 15

Lys Lys Ile Thr 30

Glu Thr Leu Leu 45

Lys Lys Ile Gly

Ser Leu Leu Ser

Leu Asn Val Leu 95

Lys Gin Cys Ser 110

Val Leu Gly Leu 125

Leu Lys Lys His

Leu Phe Lys Ala

160

Lys Asn Ala Val 175

178 775

Lys Glu Leu Thr Ser Pro Ile Val Ala Glu Ser Pro Lys Lys Pro

180 185 190 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 585 par zasad (B) TYP: aminokwas (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia burgdorfi (B) SZCZEP:2591 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 585 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:3

TGT Cys 1

AAT Asn

TCA GGG

AAA Lys

GAT Asp

GGG AAT Gly Asn

ACA TCT

GCA Ala

AAT Asn

TCT Ser

GCT Ala 15

GAT Asp

48

Ser

Gly 5

Thr 10

Ser

GAG

TCT

GTT

AAA

GGG

CCT

AAT

CTT

ACA

GAA

ATA

AGT

AAA

ATT

ACA

96

Glu

Ser

Val

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu

Thr

Glu

Ile

Ser

Lys

Ile

Thr

20

25

30

GRA

TCT

AAC

GCA

GTT

CTC

GCC

GTG

AAA

GAA

GTT

GAA

ACT

CTG

CTT

144

Glu

Ser

Asn

Ala

Val

Leu

Ala

Val

Lys

Glu

Val

Glu

Thr

Leu

178 775

GCA TCT

ATA GAT

GAA

GTT

GCT

AAG

AAA

GCT ATT

GGG

AAT

TTG

ATA

GCC

192

Ala Ser

Ile Asp

Glu

Val

Ala

Lys

Ala Ile

Gly

Asn

Leu

Ile

Ala

50

55

60

CAA AAT Gin Asn 65

GGT TTA Gly Leu

AAT GCC GGT

GCT AAT CAA AAC GGA

TCA Ser

TTG Leu

TTA GCG Leu Ala 80

240

Asn Ala 70

Gly

Ala Asn

Gin Asn 75

Gly

GGA

GCC

TAC

GTA

ATA

TCA

ACC

CTA

ATA

GCA

GAA

AAA

TTA

GAT

GGA

TTG

288

Gly

Ala

Tyr

Val

Ile 85

Ser

Thr

Leu

Ile

Ala 90

Glu

Lys

Leu

Asp (

Gly 95

Leu

AAA

AAT

TCA

GAA

TTA

AAG

GAA

AAA

ATT

GAA

GAT

GCT

AAA

TGT

336

Lys

Asn

Ser

Glu 100

Glu

Leu

Lys

Glu

Lys 105

Ile

Glu

Asp

Ala

Lys 110

Lys

Cys

AAC

AAA

GCA

TTT

ACT

GAT

AAA

CTA

AAA

AGT

CAT

GCG

GAA

CTC

GGT

384

Asn

Lys

Ala 115

Phe

Thr

Asp

Lys

Leu 120

Lys

Ser

His

Ala 125

Glu

Leu

Gly

ATA

GCG

AAT

GGA

GCT

AGT

GAT

GCT

AAT

GCA

AAA

GCG

GCT

ATT

TTA

432

Ile

Ala 130

Asn

Gly

Ala

Ser 135

Asp

Ala

Asn

Ala

Lys 140

Ala

Ile

Leu

AAA

ACA

AAT

GGT

ACT

AAA

GAT

AAG

GGT

GCT

CAA

GAG

CTT

GAA

AAG

TTA

480

Lys 145

Thr

Asn

Gly

Thr

Lys 150

Asp

Lys

Gly

Ala

Gin 155

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu 160

TTT

GAA

TCA

GTA

AAA

AAC

TTG

TCA

AAA

GCA

GCT

CAA

GAA

ACA

CTA

AAT

528

Phe

Glu

Ser

Val

Lys 165

Asn

Leu

Ser

Lys

Ala 170

Ala

Gin

Glu

Thr

Leu 175

Asn

AAT

TCA

GTT

AAA

GAA

CTT

ACA

AGT

CCT

GTT

GTG

GCA

GAA

AAT

CCA

AAA

576

Asn

Ser

Val

Lys

Glu

Leu

Thr

Ser

Pro

Val

Ala

Glu

Asn

Pro

Lys

180

185

190

178 775

AAA CCT ΤΑ

Lys Pro

195

585 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 194 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:4:

Cys Asn Asn Ser Gly Lys Asp Gly Asn Thr Ser Ala Asn Ser Ala Asp

1015

Glu Ser Val Lys Gly Pro Asn Leu Thr Glu Ile Ser Lys Lys Ile Thr

2530

Glu Ser Asn Ala Val Val Leu Ala Val Lys Glu Val Glu Thr Leu Leu

4045

Ala Ser Ile Asp Glu Val Ala Lys Lys Ala Ile Gly Asn Leu Ile Ala

5560

Gin Asn Gly Leu Asn Ala Gly Ala Asn Gin Asn Gly Ser Leu LeuAla

70 7580

Gly Ala Tyr Val Ile Ser Thr Leu Ile Ala Glu Lys Leu Asp GlyLeu

9095

Lys Asn Ser Glu Glu Leu Lys Glu Lys Ile Glu Asp Ala Lys Lys Cys

178 775

100

105

110

Asn Lys Ala Phe 115

Ile Ala Asn Gly 130

Lys Thr Asn Gly 145

Phe Glu Ser Val

Asn Ser Val Lys

180

Lys Pro

Thr Asp Lys Leu

120

Ala Ala Ser Asp 135

Thr Lys Asp Lys 150

Lys Asn Leu Ser 165

Glu Leu Thr Ser

Lys Ser Ser His

Ala Asn Ala Lys

140

Gly Ala Gin Glu

155

Lys Ala Ala Gin

170

Pro Val Val Ala

185

Ala Glu Leu Gly 125

Ala Ala Ile Leu

Leu Glu Lys Leu

160

Glu Thr Leu Asn 175

Glu Asn Pro Lys

190 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 579 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia burgdorferi (B) SZCZEP:IP2 (ix) PARAMETRY:

178 775 (A) NAZWA/KLUCZ : CDS (B) POZYCJA: 1.. 579 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:5

TGT ΆΑΤ AAT TCA GGG AAA GAT GGG Cys Asn Asn Ser Gly Lys Asp Gly

5

GAG TCT GTT AAA GGG CCT AAT CTT Glu Ser Val Lys Gly Pro Asn Leu

AAT ACA TCT GCA AAT TCT GCT GAT

Asn Thr Ser Ala Asn Ser Ala Asp

15

ACA GAA ATA AGT AAA ΆΑΑ ATT ACG

Thr Glu Ile Ser Lys Lys Ile Thr

30

GAT TCT AAT GCG GTT TTA CTT GCT Asp Ser Asn Ala Val Leu Leu Ala

40

GTG AAA GAG GTT GAA GCG TTG CTG

Val Lys Glu Val Glu Ala Leu Leu

144

TCA TCT ATA GAT GAA ATT GCT GCT

Ser Ser Ile Asp Glu Ile Ala Ala

55

CAA AAT AAT GGT TTG GAT ACC GAA Gin Asn Asn Gly Leu Asp Thr Glu

70

GCG GGA GCT TAT GCA ATA TCA ACC

Ala Gly Ala Tyr Ala Ile Ser Thr

TTG AAA AAT GAA GGA TTA AAG GAA Leu Lys Asn Glu Gly Leu Lys Glu

100

TCT GAA ACA TTT ACT AAT AAA TTA Ser Glu Thr Phe Thr Asn Lys Leu

AAA GCT ATT GGT AAA AAA ATA CAC Lys Ala Ile Gly Lys Lys Ile His

192

AAT AAT CAC AAT GGA TCA TTG TTA

Asn Asn His Asn Gly Ser Leu Leu

7580

240

CTA ATA AAA CAA AAA TTA GAT GGA Leu Ile Lys Gin Lys Leu Asp Gly

9095

AAA ATT GAT GCG GCT AAG AAA TGT Lys Ile Asp Ala Ala Lys Lys Cys

105110

AAA GAA AAA CAC ACA GAT CTT GGT Lys Glu Lys His Thr Asp Leu Gly

288

336

384

178 775

115

120

125

AAA GAA GGT GTT ACT GAT GCT GAT GCA AAA GAA GCC ATT ΤΤΆ AAA ACA

Lys Glu Gly Val Thr Asp Ala Asp Ala Lys Glu Ala Ile Leu Lys Thr

130 135140

AAT GGT ACT AAA ACT AAA GGT GCT GAA GAA CTT GGA AAA ΤΤΑ TTTGAA

Asn Gly Thr Lys Thr Lys Gly Ala Glu Glu Leu Gly Lys Leu PheGlu

145 150 155160

TCA GTA GAG GTC TTG TCA AAA GCA GCT AAA GAG ATG CTT GCT AATTCA

Ser Val Glu Val Leu Ser Lys Ala Ala Lys Glu Met Leu Ala AsnSer

165 170175

GTT AAA GAG CTT ACA AGC CCT GTT GTG GCA GAA AGT CCA AAA AAACCT

Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Ser Pro Lys LysPro

180 185190

TA (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:6:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 192 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:6:

432

480

528

576

579

Cys Asn Asn Ser Gly Lys Asp Gly Asn Thr Ser Ala Asn Ser Ala Asp 15 10 15

178 775

Glu Ser Val Lys Gly Pro Asn

Asp Ser Asn Ala Val Leu Leu

Ser Ser Ile Asp Glu Ile Ala

55

Gin Asn Asn Gly Leu Asp Thr

70

Ala Gly Ala Tyr Ala Ile Ser

Leu Lys Asn Glu Gly Leu Lys

100

Ser Glu Thr Phe Thr Asn Lys

115

Lys Glu Gly Val Thr Asp Ala

130 135

Asn Gly Thr Lys Thr Lys Gly

145 150

Ser Val Glu Val Leu Ser Lys

165

Leu Thr Glu Ile Ser Lys Lys Ile Thr 2530

Ala Val Lys Glu Val Glu Ala Leu Leu 4045

Ala Lys Ala Ile Gly Lys Lys Ile His 60

Glu Asn Asn His Asn Gly Ser Leu Leu 7580

Thr Leu Ile Lys Gin Lys Leu Asp Gly 9095

Glu Lys Ile Asp Ala Ala Lys Lys Cys 105110

Leu Lys Glu Lys His Thr Asp Leu Gly 120125

Asp Ala Lys Glu Ala Ile Leu Lys Thr 140

Ala Glu Glu Leu Gly Lys Leu Phe Glu 155160

Ala Ala Lys Glu Met Leu Ala Asn Ser 170175

Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Ser

Pro Lys

Lys Pro

180

185

190

178 775 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 531 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia burgdorferi (B) SZCZEP:25015 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 531 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:7

TGT AAT AAT

TCA Ser

GGA AAA

GAT Asp

GGG AAC

GCT Ala 10

GCA Ala

TCT Ser

ACT Thr

AAT Asn

CCT Pro 15

GCT Ala

48

Cys 1

Asn Asn

Gly 5

Lys

Gly

Asn

GAT

GAG TCT

GTT

AAA

GGG

CCT

AAT

CTT

ACA

GAA

ATA

AGT

AAA

ATT

96

Asp

Glu Ser

Val 20

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu 25

Thr

Glu

Ile

Ser

Lys 30

Lys

Ile

ACA

GAT TCT

AAT

ACG

GTT

GTG

CTA

GCT

GTA

AAA

GAA

GTT

GAA

GCT

TTG

144

Thr

Asp Ser 35

Asn

Thr

Val

Leu 40

Ala

Val

Lys

Glu

Val 45

Glu

Ala

Leu

CTT

ACA TCT

ATA

GAT

GAA

CTT

GCT

ACT

AAA

GCT

ATT

GGT

AAA

ATA

192

178 775

Leu 50

Thr

Ser

Ile

Asp Glu

Leu 55

Ala

Thr

Lys

Ala

Ile 60

Gly

Lys

Ile

CAC

CAA

AAT

GGT

TTG

GAT

ACC

GAA

AAT

CAC

AAT

GGA

TCA

TTG

240

His 65

Gin

Asn

Gly

Leu 70

Asp

Thr

Glu

Asn

Asn 75

His

Asn

Gly

Ser

Leu 80

TTA

GCG

GGG

GCC

TAT

GCA

ATA

TCA

ACG

CTA

ATA

ACA

CAA

AAG

TTA

GGT

288

Leu

Ala

Gly

Ala

Tyr 85

Ala

Ile

Ser

Thr

Leu 90

Ile

Thr

Gin

Lys

Leu 95

Gly

GGA

TTG

AAA

AAT

GAA

TTA

AAG

GAA

AAG

ATT

GCC

GCA

GTC

AAG

AAA

336

Gly

Leu

Lys

Asn 100

Glu

Leu

Lys

Glu 105

Lys

Ile

Ala

Val 110

Lys

TGT

TCT

GAA

TTT

ACT

AAT

AAA

CTA

AAA

AGT

CAC

ACA

GAG

CTC

384

Cys

Ser

Glu 115

Glu

Phe

Thr

Asn

Lys 120

Leu

Lys

Ser

His 125

Thr

Glu

Leu

GGC

AAA

CAG

GAT

GCT

CAG

GAT

GCA

AAA

AAG

GCT

ATC

TTA

AGA

432

Gly

Lys 130

Gin

Asp

Ala

Gin

Asp 135

Asp

Ala

Lys

Lys 140

Ala

Ile

Leu

Arg

ACA

CAT

AAT

ACT

AAG

GAT

AAG

GGT

GCT

GAA

CTT

GAT

AAG

TTA

TTT

480

Thr 145

His

Asn

Thr

Lys

Asp 150

Lys

Gly

Ala

Glu

Glu 155

Leu

Asp

Lys

Leu

Phe 160

AAA

CCG

GTG

GAG

AAC

TTG

TCA

AAA

GCG

GCT

AAA

GAG

ATG

CTA

TCC

AAT

528

Lys

Pro

Val

Glu

Asn

Leu

Ser

Lys

Ala

Lys

Glu

Met

Leu

Ser

Asn

165 170 175

TCA

Ser

531

178 775 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:8:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 177 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:8:

Cys Asn Asn Ser Gly

5

Asp Glu Ser Val Lys

Thr Asp Ser Asn Thr 35

Leu Thr Ser Ile Asp 50

His Gin Asn Asn Gly 65

Leu Ala Gly Ala Tyr 85

Gly Leu Lys Asn Glu

100

Cys Ser Glu Glu Phe

115

Lys Asp Gly Asn Ala

Gly Pro Asn Leu Thr 25

Val Val Leu Ala Val

Glu Leu Ala Thr Lys 55

Leu Asp Thr Glu Asn 70

Ala Ile Ser Thr Leu

Glu Leu Lys Glu Lys 105

Thr Asn Lys Leu Lys

120

Ala Ser Thr Asn Pro Ala

Glu Ile Ser Lys Lys Ile

Lys Glu Val Glu Ala Leu

Ala Ile Gly Lys Lys Ile

Asn His Asn Gly Ser Leu

80

Ile Thr Gin Lys Leu Gly

Ile Ala Ala Val Lys Lys

110

Ser Ser His Thr Glu Leu

125

Gly Lys Gin Asp Ala Gin Asp Asp Asp Ala Lys Lys Ala Ile Leu Arg

178 775

130

135

140

Thr 145

His

Asn

Thr

Lys Asp 150

Lys Gly Ala

Glu

Glu 155

Leu

Asp

Lys

Leu

Phe 160

Lys

Pro

Val

Glu

Asn Leu 165

Ser Lys Ala

Ala 170

Lys

Glu

Met

Leu

Ser 175

Asn

Ser (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 582 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia burgdorferi (B) SZCZEP:ZS7 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 582 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:9

TGT AAT AAT TCA GGA AAA GAT GGG AAT ACA TCT GCA AAT TCT GCT GAT Cys Asn Asn Ser Gly Lys Asp Gly Asn Thr Ser Ala Asn Ser Ala Asp

178 775

GAG TCT GTT AAA GGG CCT AAT CTT ACA GAA ATA AGT AAA AAA ATT ACG96

Glu Ser Val Lys Gly Pro Asn Leu Thr Glu Ile Ser Lys Lys Ile Thr

2530

GAT TCT AAT GCG GTT TTA CTT GCT GTG AAA GAG GTT GAA GCG TTG CTG144

Asp Ser Asn Ala Val Leu Leu Ala Val Lys Glu Val Glu Ala LeuLeu

4045

TCA TCT ATA GAT GAG CTT GCT AAA GCT ATT GGT AAA AAA ATA AAA AAC192

Ser Ser Ile Asp Glu Leu Ala Lys Ala Ile Gly Lys Lys Ile LysAsn

5560

GAT GGT AGT TTA GGT GAT GAA GCA AAT CAC AAC GAG TCA TTG TTA GCA240

Asp Gly Ser Leu Gly Asp Glu Ala Asn His Asn Glu Ser Leu LeuAla

70 7580

GGA GCT TAT ACA ATA TCA ACC TTA ATA ACA CAA AAA TTA AGT AAA TTA2 88

Gly Ala Tyr Thr Ile Ser Thr Leu Ile Thr Gin Lys Leu Ser LysLeu

9095

AAC GGA TCA GAA GGT TTA AAG GAA AAG ATT GCC GCA GCT AAG AAA TGC336

Asn Gly Ser Glu Gly Leu Lys Glu Lys Ile Ala Ala Ala Lys LysCys

100 105110

TCT GAA GAG TTT AGT ACT AAA CTA AAA GAT AAT CAT GCA CAG CTT GGT384

Ser Glu Glu Phe Ser Thr Lys Leu Lys Asp Asn His Ala Gin LeuGly

115 120125

ATA CAG GGC GTT ACT GAT GAA AAT GCA AAA AAA GCT ATT TTA AAA GCA432

Ile Gin Gly Val Thr Asp Glu Asn Ala Lys Lys Ala Ile Leu LysAla

130 135140

AAT GCA GCG GGT AAA GAT AAG GGC GTT GAA GAA CTT GAA AAG TTG TCC480

Asn Ala Ala Gly Lys Asp Lys Gly Val Glu Glu Leu Glu Lys Leu Ser

145

150

155

160

178 775

GGA Gly

TCA Ser 165

TTA Leu

GAA Glu

AGC Ser

TTA Leu

TCA AAA

GCA GCT AAA

GAG ATG

CTT Leu

GCT AAT

528

Ser

Lys

Ala

Ala 170

Lys

Glu

Met

Ala 175

Asn

TCA

GTT

AAA

GAG

CTT

ACA

AGT

CCT

GTT

GTG

GTA

GAA

AGT

CCA

AAA

576

Ser

Val

Lys

Glu

Leu

Thr

Ser

Pro

Val

Glu

Ser

Pro

Lys

180

185

190

CCT TA

Pro

582 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 193 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:10:

Cys 1

Asn

Asn Ser Gly 5

Lys

Asp

Gly

Asn

Thr 10

Ser

Ala

Asn

Ser

Ala 15

Asp

Glu

Ser

Val Lys Gly

Pro

Asn

Leu

Thr

Glu

Ile

Ser

Lys

Ile

Thr

20

25

30

Asp

Ser

Asn Ala Val

Leu

Ala

Val

Lys

Glu

Val

Glu

Ala

Leu

35

40

45

Ser

Ile Asp Glu

Leu

Ala

Lys

Ala

Ile

Gly

Lys

Ile

Lys

Asn

178 775

Asp Gly Ser Leu Gly Asp

70

Gly Ala Tyr Thr Ile Ser

Asn Gly Ser Glu Gly Leu

100

Ser Glu Glu Phe Ser Thr

115

Ile Gin Gly Val Thr Asp

130

Asn Ala Ala Gly Lys Asp

145 150

Gly Ser Leu Glu Ser Leu

165

Ser Val Lys Glu Leu Thr

180

Glu Ala Asn His Asn

Thr Leu Ile Thr Gin

Lys Glu Lys Ile Ala 105

Lys Leu Lys Asp Asn 120

Glu Asn Ala Lys Lys 135

Lys Gly Val Glu Glu

155

Ser Lys Ala Ala Lys 170

Ser Pro Val Val Val

185

Glu Ser Leu Leu Ala

Lys Leu Ser Lys Leu 95

Ala Ala Lys Lys Cys 110

His Ala Gin Leu Gly 125

Ada Ile Leu Lys Ala 140

Leu Glu Lys Leu Ser

160

Glu Met Leu Ala Asn 175

Glu Ser Pro Lys Lys

190

Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:11:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 579 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa

178 775 (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia burgdorferi (B) SZCZEP:297 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 579 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:11

TGT Cys 1

AAT Asn

TCA Ser

GGG AAA

GAT Asp

GGG AAT

ACA TCT

GCA AAT Ala Asn

TCT Ser

GCT Ala 15

GAT Asp

48

Gly 5

Lys

Gly

Asn

Thr 10

Ser

GAG

TCT

GTT

AAA

GGG

CCT

AAT

CTT

ACA

GAA

ATA

AGT AAA

AAA

ATT

ACA

96

Glu

Ser

Val

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu

Thr

Glu

Ile

Ser Lys

Lys

Ile

Thr

20

25

30

GAA

TCT

AAC

GCA

GTT

CTC

GCC

GTG

AAA

GAA

GTT GAA

ACT

TTG

CTT

144

Glu

Ser

Asn

Ala

Val

Leu

Ala

Val

Lys

Glu

Val Glu

Thr

Leu

35

40

45

ACA

TCT

ATA

GAT

GAG

CTT

GCT

AAA

GCT

ATT

GGT

AAA AAA

ATA

AAA

AAC

192

Thr

Ser

Ile

Asp

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala

Ile

Gly

Lys Lys

Ile

Lys

Asn

50

55

60

GAT

GTT

AGT

TTA

GAT

AAT

GAG

GCA

GAT

CAC

AAC

GGA TCA

TTA

ATA

TCA

240

Asp

Val

Ser

Leu

Asp

Asn

Glu

Ala

Asp

His

Asn

Gly Ser

Leu

Ile

Ser

65

70

75

80

GGA

GCA

TAT

TTA

ATT

TCA

ACA

TTA

ATA

ACA

AAA

AAA ATA

AGT

GCA

ATA

288

Gly

Ala

Tyr

Leu

Ile

Ser

Thr

Leu

Ile

Thr

Lys

Lys Ile

Ser

Ala

Ile

178 775

AAA GAT Lys Asp

TCA GGA GAA TTG AAG

GCA GAA ATT

GAA Glu

AAG Lys

GCT Ala

AAG Lys 110

AAA Lys

TGT Cys

336

Ser

Gly 100

Glu

Leu

Lys

Ala

Glu 105

Ile

TCT GAA

GAA

TTT

ACT

GCT

AAA

TTA

AAA

GGT

GAA

CAC

ACA

GAT

CTT

GGT

384

Ser Glu

Glu

Phe

Thr

Ala

Lys

Leu

Lys

Gly

Glu

His

Thr

Asp

Leu

Gly

115

12(

)

125

AAA GAA

GGC

GTT

ACT

GAT

AAT

GCA

AAA

GCC

ATT

TTA

AAA

ACA

432

Lys Glu

Gly

Val

Thr

Asp

Asn

Ala

Lys

Ala

Ile

Leu

Lys

Thr

130

135

140

AAT AAT

GAT

AAA

ACT

AAG

GGC

GCT

GAT

GAA

CTT

GAA

AAG

TTA

TTT

GAA

480

Asn Asn

Asp

Lys

Thr

Lys

Gly

Ala

Asp

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Phe

Glu

145

150

155

160

TCA GTA

AAA

AAC

TTG

TCA

AAA

GCA

GCT

AAA

GAG

ATG

CTT

ACT

AAT

TCA

528

Ser Val

Lys

Asn

Leu

Ser

Lys

Ala

Lys

Glu

Met

Leu

Thr

Asn

Ser

165

170

175

GTT AAA

GAG

CTT

ACA

AGC

CCT

GTT

GTG

GCA

GAA

AGT

CCA

AAA

CCT

576

Val Lys

Glu

Leu

Thr

Ser

Pro

Val

Ala

Glu

Ser

Pro

Lys

Pro

180 185 190

ΤΑ

579 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 192 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa

178 775 (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:12:

Asn Asn Ser Gly Lys

Ser Val Lys Gly Pro

Ser Asn Ala Val Val 35

Ser Ile Asp Glu Leu 50

Val Ser Leu Asp Asn 70

Ala Tyr Leu Ile Ser 85

Asp Ser Gly Glu Leu 100

Glu Glu Phe Thr Ala

115

Glu Gly Val Thr Asp 130

Asn Asp Lys Thr Lys

150

Asp Gly Asn Thr Ser

Asn Leu Thr Glu Ile

Leu Ala Val Lys Glu 40

Ala Lys Ala Ile Gly 55

Glu Ala Asp His Asn

Thr Leu Ile Thr Lys

Lys Ala Glu Ile Glu 105

Lys Leu Lys Gly Glu 120

Asp Asn Ala Lys Lys 135

Gly Ala Asp Glu Leu

155

Ala Asn Ser Ala Asp

Ser Lys Lys Ile Thr 30

Val Glu Thr Leu Leu

Lys Lys Ile Lys Asn 60

Gly Ser Leu Ile Ser 80

Lys Ile Ser Ala Ile 95

Lys Ala Lys Lys Cys

110

His Thr Asp Leu Gly

125

Ala Ile Leu Lys Thr 140

Glu Lys Leu Phe Glu

160

Val Lys Asn Leu Ser Lys Ala Ala Lys Glu Met Leu Thr Asn Ser

178 775

	165	170	175
Val Lys Glu Leu	Thr Ser	Pro Val Val Ala Glu	Ser Pro Lys Lys Pro
180		185	190

(2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 534 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia afzelli (B) SZCZEP:SIMON (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 534 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:13

TGT AAT AAT TCA GGA AAA GGT GGG GAT TCT ACA TCT ACT AAT CCT GCT

Cys Asn Asn Ser Gly Lys Gly Gly Asp Ser Thr Ser Thr Asn Pro Ala

10 15

GAC GAG TCT GCT AAA GGG CCT AAT CTT ACA GAA ATA AGT AAA AAA ATT

Asp Glu Ser Ala Lys Gly Pro Asn Leu Thr Glu Ile Ser Lys Lys Ile

178 775

ACA AAT TCT AAT GCA TTT GTA CTT GCT Thr Asn Ser Asn Ala Phe Val Leu Ala

3540

GTT GCA TCT ATA GAT GAA CTT GCTACT

Val Ala Ser Ile Asp Glu Leu AlaThr

5055

AAA AAT GAT GGC ACT TTA GAG AACGAA

Lys Asn Asp Gly Thr Leu Glu AsnGlu

6575

GTT AAA GAA GTT GAG ACT TTG 144 Val Lys Glu Val Glu Thr Leu

AAA GCT ATT GGT AAA AAA ATA 192 Lys Ala Ile Gly Lys Lys Ile

GCA AAT CAC AAC GGA TCA TTG 240 Ala Asn His Asn Gly Ser Leu

80

TTA GCG GGA GCT TAT Leu Ala Gly Ala Tyr

GCA ATA TCA AAT

Ala Ile Ser Asn

CTA ATA AAA CAA AAA Leu Ile Lys Gin Lys

TTA GAT 288

Leu Asp

GGA TTG AAA GGT TTA GAA GGA TTA

Gly Leu Lys Gly Leu Glu Gly Leu

100

AAC TGT TCT GAA GCA TTT ACT AAA

Asn Cys Ser Glu Ala Phe ThrLys

115120

CTT GGG AAA GAG AAT GCT ACCGAT

Leu Gly Lys Glu Asn Ala ThrAsp

130135

AAA ACA GAT GCT ACT AAA GAT AAG Lys Thr Asp Ala Thr Lys Asp Lys

145150

TCT GAA TCA GTA GCA AGC TTA GTA

Ser Glu Ser Val Ala Ser Leu Val

AAT AAG GAA ATT GCG GAG GCC AAG Asn Lys Glu Ile Ala Glu Ala Lys

105 110

336

AAA CTA AAA GAG AAG CAC ACA GAT Lys Leu Lys Glu Lys Hrs Thr Asp

125

GAA GAT GCA AAA AAA GCT ATT TTA

Glu Asp Ala Lys Lys Ala Ile Leu

140

384

432

GGT GCT GCT GAA CTT GAA AAG CTA Gly Ala Ala Glu Leu Glu Lys Leu

155 160

480

AAA GCG GCT CAA GAA GCA CTA ACT Lys Ala Ala Gin Glu Ala Leu Thr

528

178 775

175

534

165

170

AAT TCA

Asn Ser (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:14:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 178 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:14:

Cys Asn Asn Ser Gly

5

Asp Glu Ser Ala Lys

Thr Asn Ser Asn Ala

Val Ala Ser Ile Asp 50

Lys Asn Asp Gly Thr 65

Leu Ala Gly Ala Tyr

Lys Gly Gly Asp Ser

Gly Pro Asn Leu Thr

Phe Val Leu Ala Val

Glu Leu Ala Thr Lys

Leu Glu Asn Glu Ala

Ala Ile Ser Asn Leu

Thr Ser Thr Asn Pro Ala

Glu Ile Ser Lys Lys Ile

Lys Glu Val Glu Thr Leu

Ala Ile Gly Lys Lys Ile

Asn His Asn Gly Ser Leu

80

Ile Lys Gin Lys Leu Asp

178 775

Gly Leu Lys Gly Leu Glu Gly Leu

100

Asn Cys Ser Glu Ala Phe Thr Lys

115120

Leu Gly Lys Glu Asn Ala Thr Asp

130135

Lys Thr Asp Ala Thr Lys Asp Lys

145150

Ser Glu Ser Val Ala Ser Leu Val

165

Asn Lys Glu Ile Ala Glu Ala Lys

105110

Lys Leu Lys Glu Lys His Thr Asp

125

Glu Asp Ala Lys Lys Ala Ile Leu

140

Gly Ala Ala Glu Leu Glu Lys Leu

155 160

Lys Ala Ala Gin Glu Ala Leu Thr

170 175

Asn Ser (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:15:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 582 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia afzelli (B) SZCZEP:E61 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 582

178 775 (xi) OPIS SEKWENCJI: NR ID. SEKW.:15:

TGT Cys 1

AAT Asn

TCA Ser

GGG Gly 5

AAA Lys

GGT GGG GAT

TCT ACA TCT ACT AAT

CCT Pro 15

GCT Ala

48

Gly

Asp

Ser 10

Thr

Ser

Thr

Asn

GAC

GAG

TCT

GCT

AAA

GGG

CCT

AAT

CTT

ACA

GAA

ATA

AGT

AAA

ATT

96

Asp

Glu

Ser

Ala 20

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu 25

Thr

Glu

Ile

Ser

Lys 30

Lys

Ile

ACA

GAT

TCT

AAT

GCA

TTT

GTA

CTT

GCT

GTT

AAA

GAA

GTT

GAG

ACT

TTG

144

Thr

Asp

Ser 35

Asn

Ala

Phe

Val

Leu 40

Ala

Val

Lys

Glu

Val 45

Glu

Thr

Leu

GTT

GCA

TCT

ATA

GAT

GAA

CTT

GCT

ACT

AAA

GCT

ATT

GGT

AAA

ATA

192

Val

Ala 50

Ser

Ile

Asp

Glu

Leu 55

Ala

Thr

Lys

Ala

Ile 60

Gly

Lys

Ile

AAA

AAT

GAT

GGC

ACT

TTA

GAT

AAC

GAA

GCA

AAT

CAC

AAC

GGA

TCA

TTG

240

Lys 65

Asn

Asp

Gly

Thr

Leu 70

Asp

Asn

Glu

Ala

Asn 75

His

Asn

Gly

Ser

Leu 80

TTA

GCA

GGA

GCC

TAT

GCA

ATA

TCA

ACT

CTA

ATA

ACA

CAA

AAA

TTA

AGT

288

Leu

Ala

Gly

Ala

Tyr 85

Ala

Ile

Ser

Thr

Leu 90

Ile

Thr

Gin

Lys

Leu 95

Ser

GTA

TTG

AAT

TCA

GAA

TTA

AAG

GCA

GAA

ATT

GTA

AAG

GCT

AAG

AAA

336

Val

Leu

Asn

Ser 100

Glu

Leu

Lys

Ala 105

Glu

Ile

Val

Lys

Ala 110

Lys

TGT

TCC

GAA

GAC

TTT

ACT

AAA

CTA

AAA

GAT

AAG

CAC

ACA

GAA

CTT

384

Cys

Ser

Glu 115

Asp

Phe

Thr

Lys

Lys 120

Leu

Lys

Asp

Lys

His 125

Thr

Glu

Leu

GGT

AAA

CAG

GAT

GCT

AAT

GAT

GCA

AAA

GCT

ATT

TTA

AAA

432

178 775

Gly

Lys 130

Gin

Asp

Ala Asn Asp Asp 135

Asp

Ala

Lys

Lys 140

Ala

Ile

Leu

Lys

ACA

AAT

GGC

GAT

AAA ACT TTG GGT

GCT

GAA

CTT

GAA

AAG

CTA

TCT 480

Thr 145

Asn

Gly

Asp

Lys Thr Leu Gly 150

Ala

Glu 155

Leu

Glu

Lys

Leu

Ser 160

GAA

TCA

GTA

ACA

AGC TTG TCA ARA

GCA

GCT

AAA

GAA

TCA

CTA

ACC

AAT 528

Glu

Ser

Val

Thr

Ser Leu Ser Lys 165

Ala

Ala 170

Lys

Glu

Ser

Leu

Thr 175

Asn

TCA

GTT

AAA

GAG

CTT ACA AGT CCT

GTT

GTA

GCA

GAA

ACT

CCA

AAA

AAA 576

Ser

Val

Lys

Glu 180

Leu Thr Ser Pro

Val 185

Val

Ala

Glu

Thr

Pro 190

Lys

CCT TA

Pro

582 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:16:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 193 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:16:

Cys Asn Asn Ser Gly Lys Gly Gly Asp Ser Thr Ser Thr Asn Pro Ala

Asp Glu Ser Ala Lys Gly Pro Asn Leu Thr Glu Ile Ser Lys Lys Ile

178 775

Thr

Asp

Ser 35

Asn

Ala

Phe

Val

Leu 40

Ala

Val

Lys

Glu

Val 45

Glu

Thr

Leu

Val

Ala 50

Ser

Ile

Asp

Glu

Leu 55

Ala

Thr

Lys

Ala

Ile 60

Gly

Lys

Ile

Lys 65

Asn

Asp

Gly

Thr

Leu 70

Asp

Asn

Glu

Ala

Asn 75

His

Asn

Gly

Ser

Leu 80

Leu

Ala

Gly

Ala

Tyr 85

Ala

Ile

Ser

Thr

Leu 90

Ile

Thr

Gin

Lys

Leu 95

Ser

Val

Leu

Asn

Ser 100

Glu

Leu

Lys

Ala 105

Glu

Ile

Val

Lys

Ala 110

Lys

Cys

Ser

Glu 115

Asp

Phe

Thr

Lys

Lys 120

Leu

Lys

Asp

Lys

His 125

Thr

Glu

Leu

Gly

Lys 130

Gin

Asp

Ala

Asn

Asp 135

Asp

AJ.a

Lys

Lys 140

Ala

Ile

Leu

Lys

Thr 145

Asn

Gly

Asp

Lys

Thr 150

Leu

Gly

Ala

Glu 155

Leu

Glu

Lys

Leu

Ser 160

Glu

Ser

Val

Thr

Ser 165

Leu

Ser

Lys

Ala

Ala 170

Lys

Glu

Ser

Leu

Thr 175

Asn

Ser

Val

Lys

Glu

Leu

Thr

Ser

Pro

Val

Ala

Glu

Thr

Pro

Lys

180 185 190

Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:17:

178 775 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 585 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia afzeln (B) SZCZEP:ORTH (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 585 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:17

TGT AAT AAT

TCA Ser

GGG Gly 5

AAA GGT

GGA Gly

GAT Asp

TCT Ser 10

GCA TCT

ACT Thr

AAT Asn

CCT Pro 15

GCT Ala

48

Cys 1

Asn Asn

Lys

Gly

Ala

Ser

GAC

GAG

TCT

GCG

AAA

GGA

CCT

AAT

CTT

ACA

GAA

ATA

AGC

AAA

ATT

96

Asp

Glu

Ser

Ala

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu

Thr

Glu

Ile

Ser

Lys

Ale

20

25

30

ACA

GAT

TCT

AAT

GCA

TTT

GTA

CTG

GCT

GTT

AAA

GAA

GTT

GAG

ACT

TTG

144

Thr

Asp

Ser

Asn

Ala

Phe

Val

Leu

Ala

Val

Lys

Glu

Val

Glu

Thr

Leu

35

40

45

GTT

TCA

TCT

ATA

GAT

GAA

CTT

GCT

ACT

AAA

GCT

ATT

GGT

AAA

ATA

192

Val

Ser

Ile

Asp

Glu

Leu

Ala

Thr

Lys

Ala

Ile

Gly

Lys

Ile

178 775

CAA CAR AAT AAT GGT TTA GGC GCC AAT GCG GAT AAA AAC GGA TCA TTG240

Gin Gin Asn Asn Gly Leu Gly Ala Asn Ala Asp Lys Asn Gly SerLeu

70 7580

TTA GCA GGA GCT TAT GCA ATA TCA ACC CTA ATA ACA GAA AAA TTA AAG2 88

Leu Ala Gly Ala Tyr Ala Ile Ser Thr Leu Ile Thr Glu Lys LeuLys

9095

GCA TTG AAA AAT TCA GGA GAA TTA AAG GCA AAA ATT GAA GAT GCT AAG336

Ala Leu Lys Asn Ser Gly Glu Leu Lys Ala Lys Ile Glu Asp AlaLys

100 105110

AAA TGT TCT GAA GAT TTT ACT AAA AAA CTA GCT GCT GGG CAT GCA CAG384

Lys Cys Ser Glu Asp Phe Thr Lys Lys Leu Ala Ala Gly His AlaGin

115 120125

CTT GGT ATA GAC GGA GCT ACT GAT AAT GAT TCA AAA GAA GCA ATT TTG432

Leu Gly Ile Asp Gly Ala Thr Asp Asn Asp Ser Lys Glu Ala IleLeu

130 135140

AAA ACA AAT GGG ACT AAA ACT AAG GGT GCT GAA GAA CTT GTA AAG TTA480

Lys Thr Asn Gly Thr Lys Thr Lys Gly Ala Glu Glu Leu Val LysLeu

145 150 155160

TCT GAA TCA GTA GCA ACC TTG TCA AAA GCG GCT CAA GAA GCA TCA GCT528

Ser Glu Ser Val Ala Ser Leu Ser Lys Ala Ala Gin Glu Ala SerAla

165 170175

AAT TCA GTT AAA GAG CTT ACA AGT CCT GTT GTA GCA GAA ACT CCA AAA576

Asn Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Thr ProLys

180 185190

AAA CCT TA585

Lys Pro

195

178 775 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:18:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 194 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:18:

Cys 1

Asn

Ser

Gly 5

Lys

Gly

Asp

Ser 10

Ala

Ser

Thr

Asn

Pro 15

Ala

Asp

Glu

Ser

Ala 20

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu 25

Thr

Glu

Ile

Ser

Lys 30

Lys

Ile

Thr

Asp

Ser 35

Asn

Ala

Phe

Val

Leu 40

Ala

Val

Lys

Glu

Val 45

Glu

Thr

Leu

Val

Ser 50

Ser

Ile

Asp

Glu

Leu 55

Ala

Thr

Lys

Ala

Ile 60

Gly

Lys

Ile

Gin 65

Gin

Asn

Gly

Leu 70

Gly

Ala

Asn

Ala

Asp 75

Lys

Asn

Gly

Ser

Leu 80

Leu

Ala

Gly

Ala

Tyr 85

Ala

Ile

Ser

Thr

Leu 90

Ile

Thr

Glu

Lys

Leu 95

Lys

Ala

Leu

Lys'

Asn 100

Ser

Gly

Glu

Leu

Lys 105

Ala

Lys

Ile

Glu

Asp 110

Ala

Lys

Cys

Ser

Glu

Asp

Phe

Thr

Lys

Leu

Ala

Gly

His

Ala

Gin

115

120

125

178 775

Leu

Gly 130

Ile

Asp

Gly Ala

Thr 135

Asp Asn

Asp

Ser

Lys 140

Glu

Ala

Ile

Leu

Lys

Thr

Asn

Gly

Thr

Lys

Thr

Lys

Gly

Ala

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

145

150

155

160

Ser

Glu

Ser

Val

Ala

Ser

Leu

Ser

Lys

Ala

Gin

Glu

Ala

Ser

Ala

165

170

175

Asn

Ser

Val

Lys

Glu

Leu

Thr

Ser

Pro

Val

Ala

Glu

Thr

Pro

Lys

180 185 190

Lys Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:19:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 582 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii), TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia afzelii (B) SZCZEP:ACA1 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 582 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:19:

178 775

TGT AAT AAT TCA GGG AAA GGT GGG GAT TCT GCA TCT ACT AAT CCT GCT48

Cys Asn Asn Ser Gly Lys Gly Gly Asp Ser Ala Ser Thr Asn Pro Ala

1015

GAC GAG TCT GCG AAA GGG CCT AAT CTT ACA GAA ATA AGC AAA AAA ATT96

Asp Glu Ser Ala Lys Gly Pro Asn Leu Thr Glu Ile Ser Lys LysIle

2530

ACA GRT TCT AAT GCA TTT GTA CTT GCT GTT AAA GAA GTT GAG ACT TTG144

Thr Asp Ser Asn Ala Phe Val Leu Ala Val Lys Glu Val Glu ThrLeu

4045

GTT TCA TCT ATA GAT GAA CTT GCC AAT AAA GCT ATT GGT AAA RAR ATA192

Val Ser Ser Ile Asp Glu Leu Ala, Asn Lys Ala Ile Gly Lys LysIle

5560

CAA CAA AAT GGT TTA GGC GCC GAA GCG AAT CGC AAC GAA TCA TTG TTA240

Gin Gin Asn Gly Leu Gly Ala Glu Ala Asn Arg Asn Glu Ser LeuLeu

70 7580

GCA GGA GTT CAT GAA ATA TCA ACA CTA ATA ACA GAA AAA TTA AGT AAA288

Ala Gly Val His Glu Ile Ser Thr Leu Ile Thr Glu Lys Leu SerLys

9095

TTG AAA AAT TCA GGA GAA TTA AAG GCA AAA ATT GAA GAT GCT AAG AAA336

Leu Lys Asn Ser Gly Glu Leu Lys Ala Lys Ile Glu Asp Ala LysLys

100 105110

TGT TCT GAA GAA TTT ACT AAT AAA CTA AGA GTT AGT CAT GCA GAT CTT384

Cys Ser Glu Glu Phe Thr Asn Lys Leu Arg Val Ser His Ala AspLeu

115 120125

GGT AAA CAA GGT GTT AAT GAC GAT GAT GCA AAA AAA GCT ATT TTA AAA432

Gly Lys Gin Gly Val Asn Asp Asp Asp Ala Lys Lys Ala Ile LeuLys

130

135

140

178 775

ACA AAT

GCA GAT AAA ACT

AAA GGT

GCT Ala

GAA GAA

CTT Leu

GGA Gly

AAG Lys

TTA Leu

TTT Phe 160

480

Thr 145

Asn

Ala

Asp Lys

Thr 150

Lys

Gly

Glu

Glu 155

AAA

TCA

GTG

GAA

GGT

TTG

GTA

AAA

GCA

GCT

CAA

GAA

GCA

CTA

ACT

AAT

528

Lys

Ser

Val

Glu

Gly

Leu

Val

Lys

Ala

Gin

Glu

Ala

Leu

Thr

Asn

165

170

175

TCA

GTT

AAA

GAG

CTT

ACA

AGT

CCT

GTT

GTA

GCA

GAA

AGT

CCA

AAA

576

Ser

Val

Lys

Glu

Leu

Thr

Ser

Pro

Val

Ala

Glu

Ser

Pro

Lys

180

185

190

CCT TA

Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:20:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 193 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:20:

Cys Asn Asn Ser Gly Lys Gly Gly Asp Ser Ala

582

Ser Thr Asn Pro Ala

15

Asp Glu Ser Ala Lys Gly Pro Asn Leu Thr Glu

Ile Ser Lys Lys Ile

Thr Asp Ser Asn Ala Phe Val Leu Ala Val Lys Glu Val Glu Thr Leu

178 775

40 45

Val

Ser 50

Ser

Ile

Asp

Glu

Leu 55

Ala

Asn

Lys

Ala

Ile 60

Gly

Lys

Ile

Gin 65

Gin

Asn

Gly

Leu

Gly 70

Ala

Glu

Ala

Asn

Arg 75

Asn

Glu

Ser

Leu

Leu 80

Ala

Gly

Val

His

Glu 85

Ile

Ser

Thr

Leu

Ile 90

Thr

Glu

Lys

Leu

Ser 95

Lys

Leu

Lys

Asn

Ser 100

Gly

Glu

Leu

Lys

Ala 105

Lys

Ile

Glu

Asp

Ala 110

Lys

Cys

Ser

Glu 115

Glu

Phe

Thr

Asn

Lys 120

Leu

Arg

Val

Ser

Hrs 125

Ala

Asp

Leu

Gly

Lys 130

Gin

Gly

Val

Asn

Asp 135

Asp

Ala

Lys

Lys 140

Ala

Ile

Leu

Lys

Thr 145

Asn

Ala

Asp

Lys

Thr 150

Lys

Gly

Ala

Glu

Glu 155

Leu

Gly

Lys

Leu

Phe 160

Lys

Ser

Val

Glu

Gly 165

Leu

Val

Lys

Ala

Ala 170

Gin

Glu

Ala

Leu

Thr 175

Asn

Ser

Val

Lys

Glu

Leu

Thr

Ser

Pro

Val

Ala

Glu

Ser

Pro

Lys

180 185 190

Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:21:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

178 775 (A) DŁUGOŚĆ: 585 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia afzeln (B) SZCZEP:H9 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 585 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:21:

TGT AAT AAT TCA

GGG AAA

GGT Gly

GGA GAT Gly Asp

TCT GCA

TCT Ser

ACT AAT

CCT Pro 15

GCT Ala

48

Cys 1

Asn Asn

Ser

Gly 5

Lys

Ser 10

Ala

Thr

Asn

GAC

GAG

TCT

GCG

AAA

GGG

CCT

AAT

CTT

ACA

GAA

ATA

AGC

AAA

ATT

96

Asp

Glu

Ser

Ala

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu

Thr

Glu

Ile

Ser

Lys

Ile

20

25

30

ACA

GAT

TCT

AAT

GCA

TTT

GTA

CTT

GCT

GTT

AAA

GAA

GTT

GAG

ACT

TTG

144

Thr

Asp

Ser

Asn

Ala

Phe

Val

Leu

Ala

Val

Lys

Glu

Val

Glu

Thr

Leu

35

40

45

GTT

TCA

TCT

ATA

GAT

GAA

CTT

GCT

CAA

GCT

ATT

GGT

AAA

ASA

ATA

192

Val

Ser

Ile

Asp

Glu

Leu

Ala

Gin

Ala

Ile

Gly

Lys

Ile

50

55

60

CAA

AAC

AAT

GGT

TTG

ACT

GCC

GAA

CAG

AAT

CAA

AAC

GGA

TCA

TTG

240

Gin

Asn

Gly

Leu

Thr

Ala

Glu

Gin

Asn

Gin

Asn

Gly

Ser

Leu

178 775

GCC GGA GCC

TAT GCA

ATA TCA GCC

CTA ATA ACA

AAA AAA

TTA GAT GAA

288

Ala

Gly

Ala

Tyr

Ala 85

Ile

Ser

Ala

Leu

Ile 90

Thr

Lys

Leu

Asp 95

Glu

TTG

ACC

AAA

AAT

TCA

GGA

GAA

TTA

AAA

GGA

GAA

GTT

GAA

AAA

GCT

AAG

336

Leu

Thr

Lys

Asn 100

Ser

Gly

Glu

Leu

Lys 105

Gly

Glu

Val

Glu

Lys 110

Ala

Lys

AAA

TGT

TCC

GAA

TTT

ACT

AAT

AAA

CTA

AAA

GGT

CAT

GCA

GAG

384

Lys

Cys

Ser 115

Glu

Phe

Thr

Asn 120

Lys

Leu

Lys

Gly

Gly 125

His

Ala

Glu

CTT

GGA

CTT

GCT

ACT

GAT

GAA

AAT

GCA

AAA

GCC

ATT

TTA

432

Leu

Gly 130

Leu

Ala

Thr 135

Asp

Glu

Asn

Ala

Lys 140

Lys

Ala

Ile

Leu

AAA

ACA

AAT

GGA

ACT

AAA

GAT

AAG

GGG

GCT

GAA

CTT

GAA

AAG

TTA

480

Lys 145

Thr

Asn

Gly

Thr

Lys 150

Asp

Lys

Gly

Ala

Glu 155

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu 160

TTT

AAA

TCA

GTA

GAA

AGC

TTG

GCA

AAA

GCA

GCT

AAA

GAA

TCA

CTA

ACC

528

Phe

Lys

Ser

Val

Glu 165

Ser

Leu

Ala

Lys

Ala 170

Ala

Lys

Glu

Ser

Leu 175

Thr

AAT

TCA

GTT

AAA

GAG

CTT

ACA

AAC

CCT

GTT

GTA

GCA

GAA

AGT

CCA

AAA

576

Asn

Ser

Val

Lys

Glu

Leu

Thr

Asn

Pro

Val

Ala

Glu

Ser

Pro

Lys

180 185 190

AAA CCT ΤΑ

Lys Pro

195

585 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:22:

178 775 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 194 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:22:

Cys 1

Asn

Ser

Gly 5

Lys

Gly

Asp

Ser 10

Ala

Ser

Thr

Asn

Pro 15

Ala

Asp

Glu

Ser

Ala 20

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu 25

Thr

Glu

Ile

Ser

Lys 30

Lys

Ile

Thr

Asp

Ser 35

Asn

Ala

Phe

Val

Leu 40

Ala

Val

Lys

Glu

Val 45

Glu

Thr

Leu

Val

Ser 50

Ser

Ile

Asp

Glu

Leu 55

Ala

Gin

Ala

Ile 60

Gly

Lys

Ile

Gin 65

Asn

Gly

Leu

Thr 70

Ala

Glu

Gin

Asn

Gin 75

Asn

Gly

Ser

Leu

Leu 80

Ala

Gly

Ala

Tyr

Ala 85

Ile

Ser

Ala

Leu

Ile 90

Thr

Lys

Leu

Asp 95

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn 100

Ser

Gly

Glu

Leu

Lys 105

Gly

Glu

Val

Glu

Lys 110

Ala

Lys

Cys

Ser 115

Glu

Phe

Thr

Asn 120

Lys

Leu

Lys

Gly

Gly 125

His

Ala

Glu

Leu

Gly

Leu

Ala

Thr

Asp

Glu

Asn

Ala

Lys

Ala

Ile

Leu

130

135

140

178 775

Lys

Thr

Asn Gly

Thr

Lys

Asp

Lys

Gly

Ala Glu

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

145

150

155

160

Phe

Lys

Ser Val

Glu

Ser

Leu

Ala

Lys

Ala Ala

Lys

Glu

Ser

Leu

Thr

165

170

175

Asn

Ser

Val Lys

Glu

Leu

Thr

Asn

Pro

Val Val

Ala

Glu

Ser

Pro

Lys

180 185 190

Lys Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 531 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia afzelii (B) SZCZEP:J1 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 531 (XI) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:23:

TGT AAT AAT TCA GGG AAA GGT GGG GAT TCT GCA TCT ACT AAT CCT ACT

178 775

Cys 1

Asn Asn

Ser

Gly 5

Lys

Gly

Asp

Ser 10

Ala

Ser

Thr

Asn

Pro 15

Thr

GAC

GAG

TCT

GCG

AAA

GGG

CCT

AAT

CTT

ACA

GAA

ATA

AGC

AAA

ATT

96

Asp

Glu

Ser

Ala 20

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu 25

Thr

Glu

Ile

Ser

Lys 30

Lys

Ile

ACA

GAT

TCT

AAT

GCA

TTT

GTA

CTT

GCT

GTT

AAA

GAA

GTT

GAG

ACT

TTG

144

Thr

Asp

Ser 35

Asn

Ala

Phe

Val

Leu 40

Ala

Val

Lys

Glu

Val 45

Glu

Thr

Leu

GTT

TCT

ATA

GAT

GAA

CTT

GCT

AAT

AAA

GCT

ATT

GGT

CAA

AAA

ATA

192

Val

Ser

Ser 50

Ile

Asp

Glu

Leu 55

Ala

Asn

Lys

Ala

Ile 60

Gly

Gin

Lys

Ile

CAA

AAC

AAT

GGT

TTG

AGT

GCC

GAA

CAG

AAT

CAA

AAC

GGA

TCA

TTA

240

Gin 65

Asn

Gly

Leu

Ser 70

Ala

Glu

Gin

Asn

Gin 75

Asn

Gly

Ser

Leu

Leu 80

GCA

GGA

GCC

TAT

GCA

ATA

TCA

ACC

CTA

ATA

AAA

CAA

AAA

CTA

GAT

GGA

288

Ala

Gly

Ala

Tyr

Ala 85

Ile

Ser

Thr

Leu

Ile 90

Lys

Gin

Lys

Leu

Asp 95

Gly

TTA

AAA

GGT

CTA

GAA

GGA

TTA

AAT

AAA

GAA

ATT

ACA

GAG

GCC

AAA

336

Leu

Lys

Gly

Leu 100

Glu

Gly

Leu

Asn

Lys 105

Glu

Ile

Thr

Glu

Ala 110

Lys

TGT

TCT

CAA

GAC

TTT

ATC

AAT

AAA

CTA

AAA

GGT

CAT

GCA

GAG

CTT

384

Cys

Ser

Gin 115

Asp

Phe

Ile

Asn

Lys 12 0

Leu

Lys

Gly

His 125

Ala

Glu

Leu

GGA

CTT

GTT

GCT

ACT

GAT

GCT

AAT

GCA

AAA

GCA

GCC

ATT

TTA

AAA

432

Gly

Leu 130

Val

Ala

Thr

Asp 135

Ala

Asn

Ala

Lys

Ala 140

Ala

Ile

Leu

Lys

ACA

AAT

GGC

GAT

AAA

ACT

AAA

GGG

GCT

GAC

GAA

TTT

GAA

AAG

CTA

TTT

480

178 775

Thr 145

Asn

Gly

Asp

Lys

Thr 150

Lys

Gly

Ala

Asp

Glu 155

Phe

Glu

Lys

Leu

Phe 160

AAA

TCA

GTA

GAA

GGT

TTG

TTA

AAA

GCA

GCT

CAA

GAA

GCA

CTA

ACT

AAT

528

Lys

Ser

Val

Glu

Gly

Leu

Lys

Ala

Gin

Glu

Ala

Leu

Thr

Asn

165

170

175

TCA

Ser

531 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 177 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:24:

Cys Asn Asn Ser Gly

5

Asp Glu Ser Ala Lys

Thr Asp Ser Asn Ala

Val Ser Ser Ile Asp

Lys Gly Gly Asp Ser

Gly Pro Asn Leu Thr 25

Phe Val Leu Ala Val 40

Glu Leu Ala Asn Lys 55

Ala Ser Thr Asn Pro Thr

Glu Ile Ser Lys Lys Ile

Lys Glu Val Glu Thr Leu

Ala Ile Gly Gin Lys Ile

Gin Asn Asn Gly Leu Ser Ala Glu Gin Asn Gin Asn Gly Ser Leu Leu

178 775

70

80

Ala Gly

Leu Lys

Cys Ser

Gly Leu

130

Thr Asn 145

Lys Ser

Ser

Ala Tyr

Gly Leu

100

Gin Asp 115

Val Ala

Gly Asp

Val Glu

Ala Ile 85

Glu Gly

Phe Ile

Ala Thr

Lys Thr

150

Gly Leu 165

Ser Thr

Leu Asn

Asn Lys

120

Asp Ala 135

Lys Gly

Leu Lys

Leu Ile

Lys Glu 105

Leu Lys

Asn Ala

Ala Asp

Ala Ala

170

Lys Gin

Ile Thr

Gly Gly

Lys Ala

140

Glu Phe 155

Gin Glu

Lys Leu

Glu Ala

110

His Ala 125

Ala Ile

Glu Lys

Ala Leu

Asp Gly 95

Lys Lys

Glu Leu

Leu Lys

Leu Phe

160

Thr Asn 175 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:25:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) ORGANIZM: Borrelia afzelii (B) SZCZEP:JSB

178 775 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 585 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:25

TGT AAT Cys Asn 1

AAT TCA

GGG Gly 5

AAA GGT

GGG GAT

TCT GCA

TCT ACT AAT

CCT Pro 15

GCT Ala

48

Asn

Ser

Lys

Gly

Asp

Ser 10

Ala

Ser

Thr

Asn

GAC

GAG

TCT

GCG

AAA

GGG

CCT

AAT

CTT

ACA

GAA

ATA

AGC

AAA

ATT

96

Asp

Glu

Ser

Ala 20

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu 25

Thr

Glu

Ile

Ser

Lys 30

Lys

Ile

ACA

GAT

TCT

AAT

GCA

TTT

GTA

CTT

GCT

GTT

AAA

GAA

GTT

GAG

ACT

TTG

144

Thr

Asp

Ser 35

Asn

Ala

Phe

Val

Leu 40

Ala

Val

Lys

Glu

Val 45

Glu

Thr

Leu

GTT

TTA

TCT

ATA

GAT

GAA

CTT

GCT

AAG

AAA

GCT

ATT

GGT

CAA

AAA

ATA

192

Val

Leu 50

Ser

Ile

Asp

Glu

Leu 55

Ala

Lys

Ala

Ile 60

Gly

Gin

Lys

Ile

GAC

AAT

GGT

TTA

GCT

TTA

AAT

CAG

AAT

GGA

TCG

TTG

240

Asp 65

Asn

Gly

Leu 70

Ala

Leu

Asn

Asn 75

Gin

Asn

Gly

Ser

Leu 80

TTA

GCA

GGA

GCC

TAT

GCA

ATA

TCA

ACC

CTA

ATA

ACA

GAA

AAA

TTG

AGT

288

Leu

Ala

Gly

Ala

Tyr 85

Ala

Ile

Ser

Thr

Leu 90

Ile

Thr

Glu

Lys

Leu 95

Ser

AAA

TTG

AAA

AAT

TTA

GAA

TTA

AAG

ACA

GAA

ATT

GCA

AAG

GCT

AAG

336

Lys

Leu

Lys

Asn

Leu

Glu

Leu

Lys

Thr

Glu

Ile

Ala

Lys

Ala

Lys

100

105

110

178 775

AAA TGT TCC GAA GAA TTT ACT AAT AAA CTA AAA AGT GGT CAT GCA GAT 384 Lys Cys Ser Glu Glu Phe Thr Asn Lys Leu Lys Ser Gly His Ala Asp

115 120125

CTT GGC AAA'CAG GAT GCT ACC GAT GAT CAT GCA AAA GCA GCT ATT TTA432

Leu Gly Lys Gin Asp Ala Thr Asp Asp His Ala Lys Ala Ala IleLeu

130 135140

AAA ACA CAT GCA ACT ACC GAT AAA GGT GCT AAA GAA TTT AAA GAT TTA480

Lys Thr His Ala Thr Thr Asp Lys Gly Ala Lys Glu Phe Lys AspLeu

145 150 155160

TTT GAA TCA GTA GAA GGT TTG TTA AAA GCA GCT CAA GTA GCA CTA ACT528

Phe Glu Ser Val Glu Gly Leu Leu Lys Ala Ala Gin Val Ala Leu Thr

165 170175

AAT TCA GTT AAA GAA CTT ACA AGT CCT GTT GTA GCA GAA AGT CCA AAA576

Asn Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Ser Pro Lys

180 185190

AAA CCT TA585

Lys Pro

195 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 194 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (11) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:26:

178 775

Cys Asn Asn Ser Gly

5

Asp Glu Ser Ala Lys

Thr Asp Ser Asn Ala

Val Leu Ser Ile Asp 50

Asp Asn Asn Asn Gly 65

Leu Ala Gly Ala Tyr

Lys Leu Lys Asn Leu

100

Lys Cys Ser Glu Glu 115

Leu Gly Lys Gin Asp 130

Lys Thr Hus Ala Thr 145

Phe Glu Ser Val Glu

165

Asn Ser Val Lys Glu

Lys Gly Gly Asp Ser Ala

Gly Pro Asn Leu Thr Glu 25

Phe Val Leu Ala Val Lys 40

Glu Leu Ala Lys Lys Ala 55

Leu Ala Ala Leu Asn Asn

75

Ala Ile Ser Thr Leu Ile

Glu Glu Leu Lys Thr Glu

105

Phe Thr Asn Lys Leu Lys 120

Ala Thr Asp Asp Hus Ala 135

Thr Asp Lys Gly Ala Lys

150 155

Gly Leu Leu Lys Ala Ala

170

Leu Thr Ser Pro Val Val

Ser Thr Asn Pro Ala

Ile Ser Lys Lys Ile

Glu Val Glu Thr Leu 45

Ile Gly Gin Lys Ile 60

Gin Asn Gly Ser Leu 80

Thr Glu Lys Leu Ser 95

Ile Ala Lys Ala Lys 110

Ser Gly Hus Ala Asp 125

Lys Ala Ala Ile Leu 140

Glu Phe Lys Asp Leu

160

Gin Val Ala Leu Thr

175

Ala Glu Ser Pro Lys

180

185

190

178 775

Lys Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 576 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia afzelii (B) SZCZEP:VS461 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 576 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:27:

TGT AAT

AAT TCA

GGG AAA

GGT Gly

GGG GAT

ATT Ile 10

GCA TCT ACT

AAT Asn

CCT Pro 15

GAT Asp

48

Cys 1

Asn

Ser

Gly 5

Lys

Gly

Asp

Ala

Ser

Thr

GAG

TCT

GCG

AAA

GGA

CCT

AAT

CTT

ACA

GAA

ATA

AGC

AAA

ATT

ACA

96

Glu

Ser

Ala

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu

Thr

Glu

Ile

Ser

Lys

Ile

Thr

20

25

30

GAT

TCC

AAT

GCA

GTT

GTA

CTA

GCT

GTG

AAA

GAA

GTT

GAG

GCT

TTG

CTT

144

Asp

Ser

Asn

Ala

Val

Leu

Ala

Val

Lys

Glu

Val

Glu

Ala

Leu

178 775

TCA TCT ΑΤΑ GAT GAA CTT GCT AAA ACT ATT GGT AAA AAA ATA GAG GCA192

Ser Ser Ile Asp Glu Leu Ala Lys Thr Ile Gly Lys Lys Ile GluAla

5560

AAT GGT TTG GGT AAC GAA GCG GAT AAA AAC GGA TCA TTA TTA GCA GGA240

Asn Gly Leu Gly Asn Glu Ala Asp Lys Asn Gly Ser Leu Leu AlaGly

70 7580

GCC TAT GCA ATA TCA ACC CTA ATA AAA CAA AAA TTA GAT GGA TTG AAA288

Ala Tyr Ala Ile Ser Thr Leu Ile Lys Gin Lys Leu Asp Gly LeuLys

9095

GGT CTA GAA GGA TTA AAT AAA GAA ATT GCG GAG GCC AAG AAA TGT TCC336

Gly Leu Glu Gly Leu Asn Lys Glu Ile Ala Glu Ala Lys Lys CysSer

100 105110

GAA GCA TTT ACT AAA AAG CTA CAA GAT AGT AAC GCA GAT CTT GGA AAA384

Glu Ala Phe Thr Lys Lys Leu Gin Asp Ser Asn Ala Asp Leu GlyLys

115 120125

CAT AAT GCT ACT GAT GCT GAT TCA AAA GAA GCA ATT TTG AAA ACA AAT432

His Asn Ala Thr Asp Ala Asp Ser Lys Glu Ala Ile Leu Lys ThrAsn

130 135140

GGG ACT AAA ACT AAG GGT GCT AAA GAA CTT GAA GAG TTG TTT AAA TCA480

Gly Thr Lys Thr Lys Gly Ala Lys Glu Leu Glu Glu Leu Phe LysSer

145 150 155160

GTA GAA AGC TTG TCA AAA GCA GCT AAA GAA GCA TTA AGT AAT TCA GTT528

Val Glu Ser Leu Ser Lys Ala Ala Lys Glu Ala Leu Ser Asn SerVal

165 170175

AAA GAG CTT ACA AGC CCT GTT GTA GCA GAA AGT CCA AAA AAA CCT TA576

Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Ser Pro Lys Lys Pro

180

185

190

178 775 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 191 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:128:

Cys Asn Asn Ser Gly Lys Gly Gly Asp Ile Ala Ser Thr Asn Pro Asp

10 15

Glu Ser Ala Lys Gly Pro Asn Leu Thr Glu Ile Ser Lys Lys Ile Thr

25 30

Asp

Ser

Asn Ala 35

Val Val

Leu

Ala Val 40

Lys

Glu

Val

Glu 45

Ala

Leu

Ser

Ile Asp

Glu Leu

Ala

Lys Thr

Ile

Gly

Lys

Ile

Glu

Ala

Asn

50 Gly

Leu Gly

Asn Glu

55 Ala

Asp Lys

Asn

Gly

60 Ser

Leu

Ala

Gly

65 Ala

Tyr

Ala Ile

70 Ser Thr

Leu

Ile Lys

Gin

75 Lys

Leu

Asp

Gly

Leu

80 Lys

Gly

Leu

Glu Gly

85 Leu Asn

Lys

Glu Ile

90 Ala

Glu

Ala

Lys

95 Cys

Ser

Glu

Ala

100 Phe Thr

Lys Lys

Leu

105 Gin Asp

Ser

Asn

Ala

Asp

110 Leu

Gly

Lys

115

120

125

178 775

His Asn

Ala

Thr

Asp

Ala Asp 135

Ser

Lys

Glu

Ala

Ile 140

Leu

Lys

Thr

Asn

130

Gly

Thr

Lys

Thr

Lys

Gly Ala

Lys

Glu

Leu

Glu

Leu

Phe

Lys

Ser

145

150

155

160

Val

Glu

Ser

Leu

Ser

Lys Ala

Ala

Lys

Glu

Ala

Leu

Ser

Asn

Ser

Val

165

170

175

Lys

Glu

Leu

Thr

Ser

Pro Val

Val

Ala

Glu

Ser

Pro

Lys

Pro

180 185 190 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) ORGANIZM: Borrelia garinii (B) SZCZEP:M57 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 576 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:29:

TGT AAT AAT TCA GGT GGG GAT ACC GCA TCT ACT AAT CCT GAT GAG TCT

178 775

Cys Asn Asn 1

Ser Gly 5

Gly

Asp

Thr

Ala

Ser 10

Thr

Asn

Pro

Asp

Glu 15

Ser

GCA

AAA

GGA

CCT

AAT

CTT

ACA

GTA

ATA

AGC

AAA

ATT

ACA

GAT

TCT

96

Ala

Lys

Gly

Pro 20

Asn

Leu

Thr

Val

Ile 25

Ser

Lys

Ile

Thr 30

Asp

Ser

AAT

GCA

TTT

GTA

CTG

GCT

GTG

AAA

GAA

GTT

GAG

GCT

TTG

ATC

TCA

TCT

144

Asn

Ala

Phe 35

Val

Leu

Ala

Val

Lys 40

Glu

Val

Glu

Ala

Leu 45

Ile

Ser

ATA

GAT

GAA

CTT

GCT

AAT

AAA

GCT

ATT

GGT

AAA

GTA

ATA

CAT

CAA

AAT

192

Ile

Asp 50

Glu

Leu

Ala

Asn

Lys 55

Ala

Ile

Gly

Lys

Val 60

Ile

His

Gin

Asn

AAT

GGT

TTA

AAT

GCT

AAT

GCG

GGT

CAA

AAC

GGA

TCA

TTG

TTA

GCA

GGA

240

Asn 65

Gly

Leu

Asn

Ala

Asn 70

Ala

Gly

Gin

Asn

Gly 75

Ser

Leu

Ala

Gly 80

GCC

TAT

GCA

ATA

TCA

ACC

CTA

ATA

ACA

GAA

AAA

TTA

AGT

AAA

TTG

AAA

288

Ala

Tyr

Ala

Ile

Ser 85

Thr

Leu

Ile

Thr

Glu 90

Lys

Leu

Ser

Lys

Leu 95

Lys

AAT

TCA

GAA

GAG

TTA

AAT

AAA

ATT

GRA

GAG

GCT

AAG

AAC

CAT

TCT

336

Asn

Ser

Glu

Glu 100

Leu

Asn

Lys

Ile 105

Glu

Ala

Lys

Asn 110

His

Ser

GAA

GCA

TTT

ACT

AAT

AGA

CTA

AAA

GGT

TCT

CAT

GCA

CRA

CTT

GGA

GTT

384

Glu

Ala

Phe 115

Thr

Asn

Arg

Leu

Lys 120

Gly

Ser

His

Ala

Gin 125

Leu

Gly

Val

GCT

ACT

GAT

CAT

GCA

AAA

GAA

GCT

ATT

TTA

AAG

TCA

AAT

432

Ala

Ala 130

Ala

Thr

Asp

His 135

Ala

Lys

Glu

Ala

Ile 140

Leu

Lys

Ser

Asn

CCT

ACT

AAA

GAT

AAG

GGT

GCT

AAA

GAA

CTT

AAA

GAC

TTA

TCT

GAA

TCA

480

178 775

Pro Thr Lys Asp Lys Gly Ala Lys Glu Leu Lys	Asp	Leu	Ser	Glu	Ser 160
145	150	155
GTA GAA AGC TTG GCA	AAA GCA	GCG CAA GAA GCA	TTA	GCT	AAT	TCA	GTT 528
Val Glu Ser Leu Ala	Lys Ala	Ala Gin Glu Ala	Leu	Ala	Asn	Ser	Val
165		170				175
AAA GAG CTT ACA AGT	CCT GTT	GTG GCA GAA ACT	CCA	AAA	AAA	CCT	TA 576
Lys Glu Leu Thr Ser	Pro Val	Val Ala Glu Thr	Pro	Lys	Lys	Pro
180		185			190

(2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 191 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:30:

Cys 1

Asn

Ser

Gly 5

Gly Asp

Thr

Ala

Ser 10

Thr Asn

Pro

Asp

Glu 15

Ser

Ala

Lys

Gly

Pro 20

Asn

Leu Thr

Val

Ile 25

Ser

Lys Lys

Ile

Thr 30

Asp

Ser

Asn

Ala

Phe 35

Val

Leu

Ala Val

Lys 40

Glu

Val

Glu Ala

Leu 45

Ile

Ser

Ile

Asp 50

Glu

Leu

Ala

Asn Lys 55

Ala

Ile

Gly

Lys Val 60

Ile

His

Gin

Asn

Gly

Leu

Asn

Ala

Asn Ala

Gly

Gin

Asn

Gly Ser

Leu

Ala

Gly

178 775

Ala Tyr Ala Ile

Asn Ser Glu Glu

100

Glu Ala Phe Thr

115

Ala Ala Ala Thr

130

Pro Thr Lys Asp 145

Val Glu Ser Leu

Lys Glu Leu Thr

180 (2) INFORMACJA :

Ser Thr Leu Ile 85

Leu Asn Lys Lys

Asn Arg Leu Lys

120

Asp Asp His Ala 135

Lys Gly Ala Lys 150

Ala Lys Ala Ala 165

Ser Pro Val Val )LA SEKW. NR ID.

Thr Glu Lys Leu 90

Ile Glu Glu Ala 105

Gly Ser His Ala

Lys Glu Ala Ile

140

Glu Leu Lys Asp 155

Gin Glu Ala Leu 170

Ala Glu Thr Pro 185

31:

Ser Lys Leu Lys 95

Lys Asn His Ser 110

Gin Leu Gly Val 125

Leu Lys Ser Asn

Leu Ser Glu Ser

160

Ala Asn Ser Val 175

Lys Lys Pro

190 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) ORGANIZM: Borrelia gannii

178 775 (B) SZCZEP:W (ιχ) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 579 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:31

TGT AAT AAT TCA GGT GGG GAT ACT GCA TCT ACT AAT CCT GAT GAG TCT 48 Cys Asn Asn Ser Gly Gly Asp Thr Ala Ser Thr Asn Pro Asp Glu Ser

1015

GCG AAA. GGA CCT AAT CTT ATA GAA ATA AGC AAA AAA ATT ACA GAT TCT96

Ala Lys Gly Pro Asn Leu Ile Glu Ile Ser Lys Lys Ile Thr AspSer

2530

AAT GCA TTT GTA CTG GCT GTG AAA GAA GTT GAG GCT TTG ATC TCA TCT144

Asn Ala Phe Val Leu Ala Val Lys Glu Val Glu Ala Leu Ile SerSer

4045

ATA GAT GAA CTT GCT AAT AAA GCT ATT GGT AAA AAA ATA AAT CAA AAT192

Ile Asp Glu Leu Ala Asn Lys Ala Ile Gly Lys Lys Ile Asn GinAsn

5560

GGT TTA GAT GCT GAT GCT AAT CAC AAC GGA TCA TTG TTA GCA GGA GCC240

Gly Leu Asp Ala Asp Ala Asn His Asn Gly Ser Leu Leu Ala GlyAla

70 7580

CAT GCA ATA TCA ACT CTA ATA AAA CAA AAA ACA GAT GGA TTG AAA GAT288

His Ala Ile Ser Thr Leu Ile Lys Gin Lys Thr Asp Gly Leu LysAsp

9095

CTA GAA GGG TTA AGT AAA GAA ATT GCA AAG GTG AAG GAA TGT TCC GAT336

Leu Glu Gly Leu Ser Lys Glu Ile Ala Lys Val Lys Glu Cys Ser Asp

100

105

110

178 775

AAA TTT ACT AAA AAG CTA ACA GAT AGT CAT GCA CAG CTT GGA GCA GTT 384 Lys Phe Thr Lys Lys Leu Thr Asp Ser His Ala Gin Leu Gly Ala Val

115 120125

GGT GGT GCT ATT AAT GAT GAT CGT GCA AAA GAA GCT ATT TTA AAA ACA432

Gly Gly Ala Ile Asn Asp Asp Arg Ala Lys Glu Ala Ile Leu LysThr

130 135140

CAT GGG ACT AAC GAT AAG GGT GCT AAA GAA CTT AAA GAG TTA TCT GAA480

His Gly Thr Asn Asp Lys Gly Ala Lys Glu Leu Lys Glu Leu SerGlu

145 150 155160

TCA GTA GAA AGC TTG GCA AAA GCA GCT CAA GCA GCA TTA GCT AAT TCA528

Ser Val Glu Ser Leu Ala Lys Ala Ala Gin Ala Ala Leu Ala AsnSer

165 170175

GTT AAA GAG CTT ACA AGT CCT GTT GTG GCA GAA ACT CCA AAA AAA CCT576

Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Thr Pro Lys LysPro

180 185190

TA579 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:32:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 192 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:32:

178 775

Cys Asn 1

Ala Lys

Asn Ala

Ile Asp 50

Gly Leu 65

Hus Ala

Leu Glu

Lys Phe

Gly Gly

130

His Gly 145

Ser Val

Val Lys

Asn Ser

Gly Pro 20

Phe Val 35

Glu Leu

Asp Ala

Ile Ser

Gly Leu

100

Thr Lys 115

Ala Ile

Thr Asn

Glu Ser

Glu Leu

180

Gly Gly

Asn Leu

Leu Ala

Ala Asn

Asp Ala 70

Thr Leu 85

Ser Lys

Lys Leu

Asn Asp

Asp Lys

150

Leu Ala

165

Thr Ser

Asp Thr

Ile Glu

Val Lys

Lys Ala 55

Asn His

Ile Lys

Glu Ile

Thr Asp

120

Asp Arg 135

Gly Ala

Lys Ala

Pro Val

Ala Ser

Ile Ser 25

Glu Val

Ile Gly

Asn Gly

Gin Lys

Ala Lys

105

Ser His

Ala Lys

Lys Glu

Ala Gin

170

Val Ala

185

Thr Asn

Lys Lys

Glu Ala

Lys Lys

Ser Leu 75

Thr Asp

Val Lys

Ala Gin

Glu Ala

140

Leu Lys 155

Ala Ala

Glu Thr

Pro Asp

Ile Thr

Leu Ile 45

Ile Asn

Leu Ala

Gly Leu

Glu Cys

110

Leu Gly 125

Ile Leu

Glu Leu

Leu Ala

Pro Lys

190

Glu Ser 15

Asp Ser

Ser Ser

Gin Asn

Gly Ala 80

Lys Asp 95

Ser Asp

Ala Val

Lys Thr

Ser Glu

160

Asn Ser

175

Lys Pro

178 775 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:33:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 573 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia garinii (B) SZCZEP:VSDA (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 573 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:33

TGT

AAT

TCA

GGT

GGG

GAT

ACT

GCA

TCT

ACT

AAT

CCT

GAT

GAA

TCT

48

Cys

Asn

Ser

Gly

Asp

Thr

Ala

Ser

Thr

Asn

Pro

Asp

Glu

Ser

1

5

10

15

GCG

AAA

GGA

CCT

GAT

CTT

ACA

GTA

ATA

AGC

AAA

ATT

ACA

GAT

TCT

96

Ala

Lys

Gly

Pro

Asp

Leu

Thr

Val

Ile

Ser

Lys

Ile

Thr

Asp

Ser

20

25

30

AAT GCA TTT GTA CTG GCT GTG AAA GAA GTT GAA GCT TTG CTT TCA TCT Asn Ala Phe Val Leu Ala Val Lys Glu Val Glu Ala Leu Leu Ser Ser

144

178 775

	35	40	45
GTA GAT	GAA CTT GCC AAA GCT	ATT GGT AAA	AAG AT A CAT CAA AAT AAT 192
Val Asp	Glu Leu Ala Lys Ala	Ile Gly Lys	Lys Ile His Gin Asn Asn

55 60

GGT Gly 65

TTA GAT

ACT CTG

TCA Ser 70

AAT Asn

CAA Gin

AAC Asn

GGA TCA TTG TTA

GCA GGA

GCC Ala 80

240

Leu

Asp

Thr

Leu

Gly

Ser Leu 75

Leu

Ala

Gly

TAT

GCA

ATA

TCA

ACC

CTA

ATA

ACA

AAA

TTA

GAT

GGA

TTG

AAA

GGT

288

Tyr

Ala

Ile

Ser

Thr 85

Leu

Ile

Thr

Lys

Lys 90

Leu

Asp

Gly

Leu

Lys 95

Gly

TCA

GAA

GGA

TTA

AAA

GCA

GAA

ATT

GCA

GAA

GCT

AAG

AAA

TGT

TCT

GAA

336

Ser

Glu

Gly

Leu 100

Lys

Ala

Glu

Ile

Ala 105

Glu

Ala

Lys

Cys 110

Ser

Glu

GAC

TTT

ACT

AAA

CTA

AAA

GAG

AAG

CAT

ACA

GAA

CTT

GGA

GTT

GCT

384

Asp

Phe

Thr 115

Lys

Leu

Lys

Glu 120

Lys

His

Thr

Glu

Leu 125

Gly

Val

Ala

GCT

ACT

GAT

AAT

GCA

AAA

GCT

ATT

TTA

AAA

GCA

AAT

GGG

432

Ala

Ala 130

Thr

Asp

Asn

Ala 135

Lys

Ala

Ile

Leu 140

Lys

Ala

Asn

Gly

GAT

AAG

ACT

TTA

GGT

GTT

GAA

GAG

CTT

GAA

AAG

TTA

TTT

AAA

TCA

GTA

480

Asp 145

Lys

Thr

Leu

Gly

Val 150

Glu

Leu

Glu

Lys 155

Leu

Phe

Lys

Ser

Val 160

GAA

AAA

TTG

TCA

AAA

GCA

GCG

CAA

GAA

GCA

CTA

GCT

AAT

TCA

GTT

CAA

528

Glu

Lys

Leu

Ser

Lys 165

Ala

Gin

Glu

Ala 170

Leu

Ala

Asn

Ser

Val 175

Gin

GAG Glu

CTT Leu

ACA Thr

AGT Ser

CCT Pro

GTT Val

GTG Val

GCA Ala

GAA Glu

ACT Thr

CCA Pro

AAA Lys

CCT Pro

TA

573

178 775

180 185 190 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 190 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI :NR ID. SEKW.-.34:

Cys Asn Asn Ser Gly Gly Asp Thr Ala Ser Thr Asn Pro Asp Glu Ser

1015

Ala Lys Gly Pro Asp Leu Thr Val Ile Ser Lys Lys Ile Thr Asp Ser

2530

Asn Ala Phe Val Leu Ala Val Lys Glu Val Glu Ala Leu Leu Ser Ser

4045

Val Asp Glu Leu Ala Lys Ala Ile Gly Lys Lys Ile His Gin Asn Asn

5560

Gly Leu Asp Thr Leu Ser Asn Gin Asn Gly Ser Leu Leu Ala GlyAla

70 7580

Tyr Ala Ile Ser Thr Leu Ile Thr Lys Lys Leu Asp Gly Leu LysGly

9095

Ser Glu Gly Leu Lys Ala Glu Ile Ala Glu Ala Lys Lys Cys Ser Glu

100 105110

Asp Phe Thr Lys Lys Leu Lys Glu Lys His Thr Glu Leu Gly Val Ala

178 775

115

120

125

Ala Ala 130

Thr

Asp

Asn

Ala 135

Lys

Lys Ala

Ile

Leu 140

Lys

Ala

Asn

Gly

Asp Lys

Thr

Leu

Gly

Val

Glu

Leu Glu

Lys

Leu

Phe

Lys

Ser

Val

145

150

155

160

Glu Lys

Leu

Ser

Lys

Ala

Gin

Glu Ala

Leu

Ala

Asn

Ser

Val

Gin

165

170

175

Glu Leu

Thr

Ser

Pro

Val

Ala

Glu Thr

Pro

Lys

Pro

180 185 190 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:35:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) ORGANIZM: Borrelia garinn (B) SZCZEP:NBS23a (1X) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 582 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:35

178 775

TGT Cys 1

AAT AAT

TCA Ser

GGT Gly 5

GGG Gly

GAT ACT

GCA Ala

TCT Ser 10

ACT AAT

CCT Pro

GAT Asp

GAG Glu 15

TCT Ser

48

Asn

Asp

Thr

Asn

GCG

AAR

GGA

CCT

AAT

CTT

ACA

GAA

ATA

AGC

AAA

RRR

ATT

ACA

GAT

TCT

96

Ala

Lys

Gly

Pro 20

Asn

Leu

Thr

Glu

Ile 25

Ser

Lys

Ile

Thr 30

Asp

Ser

AAT

GCA

TTT

GTA

CTC

GCC

GTT

ARR

GAA

GTT

GAG

GCT

TTG

ATT

TCA

TCT

144

Asn

Ala

Phe 35

Val

Leu

Ala

Val

Lys 40

Glu

Val

Glu

Ala

Leu 45

Ile

Ser

GTA

GAT

GAA

CTT

GCT

AAG

GCT

ATT

GGT

AAA

ATA

GAT

AAC

AAT

ACT

192

Val

Asp 50

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala 55

Ile

Gly

Lys

Ile 60

Asp

Asn

Thr

GGT

TTA

AGT

GCT

AAT

CAG

AAT

CAT

AAC

ACT

TCA

TTG

TTA

GCA

GGA

GCC

240

Gly 65

Leu

Ser

Ala

Asn

Gin 70

Asn

His

Asn

Thr

Ser 75

Leu

Ala

Gly

Ala 80

TAT

TCA

ATA

TCA

ACC

CTA

ATA

ACA

GAA

AAA

TTA

AGT

AAA

TTA

AAA

AAT

288

Tyr

Ser

Ile

Ser

Thr 85

Leu

Ile

Thr

Glu

Lys 90

Leu

Ser

Lys

Leu

Lys 95

Asn

TTA

GAA

GGG

TTA

AAA

GCA

GAG

ATT

GCA

GAA

GCT

AAG

AAA

TGT

TCT

GAA

336

Leu

Glu

Gly

Leu 100

Lys

Ala

Glu

Ile

Ala 105

Glu

Ala

Lys

Cys 110

Ser

Glu

GAC

TTT

ACT

AAA

CTA

AAG

GAT

AAT

CAT

GCA

GAT

CTT

GGA

GTG

GCG

384

Asp

Phe

Thr 115

Lys

Leu

Lys

Asp 120

Asn

His

Ala

Asp

Leu 125

Gly

Val

Ala

GGG

AAT

GGA

GCT

TCT

ACT

GAT

GAA

AAT

GCA

CAG

AAA

GCT

ATT

TTA

AAA

432

Gly

Asn

Gly

Ala

Ser

Thr

Asp

Glu

Asn

Ala

Gin

Lys

Ala

Ile

Leu

Lys

130

135

140

178 775

ACA AAT GCG ATT

GTC Val

GAT AAG GGT GCT AAA GAC CTT

AAA Lys

GAG TTA

TTT Phe 160

480

Thr 145

Asn Ala

Ile

Asp 150

Lys Gly

Ala

Lys Asp 155

Leu

Glu

Leu

GAA

TCA

GTA

GAA

AAA

TTG

TCA

AAA

GCA

GCG

CAA

GAA

GCA

CTA

GCT

AAT

528

Glu

Ser

Val

Glu

Lys

Leu

Ser

Lys

Ala

Gin

Glu

Ala

Leu

Ala

Asn

165

170

175

TCA

GTT

AAA

GAG

CTT

ACA

AGT

CCT

GTT

GTG

GCA

GAA

ACT

CCA

AAA

576

Ser

Val

Lys

Glu

Leu

Thr

Ser

Pro

Val

Ala

Glu

Thr

Pro

Lys

180

185

190

CCT TA

Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:36:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 193 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (11) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:36:

582

Cys Asn

Asn

Ser

Gly

Asp

Thr

Ala

Ser

Thr Asn

Pro

Asp

Glu

Ser

1

5

10

15

Ala Lys

Gly

Pro

Asn

Leu

Thr

Glu

Ile

Ser

Lys Lys

Ile

Thr

Asp

Ser

20

25

30

Asn Ala

Phe

Val

Leu

Ala

Val

Lys

Glu

Val

Glu Ala

Leu

Ile

Ser

178 775

Val Asp Glu Leu Ala Lys Ala Ile

55

Gly Leu Ser Ala Asn Gin Asn His

70

Tyr Ser Ile Ser Thr Leu Ile Thr

Leu Glu Gly Leu Lys Ala Glu Ile

100

Asp Phe Thr Lys Lys Leu Lys Asp

115120

Gly Asn Gly Ala Ser Thr Asp Glu

130135

Thr Asn Ala Ile Val Asp Lys Gly

145150

Glu Ser Val Glu Lys Leu Ser Lys

165

Gly Lys Lys Ile Asp Asn Asn Thr

Asn Thr Ser Leu Leu Ala Gly Ala

7580

Glu Lys Leu Ser Lys Leu Lys Asn

9095

Ala Glu Ala Lys Lys Cys Ser Glu

105110

Asn His Ala Asp Leu Gly Val Ala

125

Asn Ala Gin Lys Ala Ile Leu Lys

140

Ala Lys Asp Leu Lys Glu Leu Phe

155 160

Ala Ala Gin Glu Ala Leu Ala Asn

170 175

Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Thr

Pro Lys Lys

180 185 190

Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:37:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 576 par zasad

178 775 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa

	(11)	TYP CZĄSTECZKI	: DNA (genomowy)
TGT	(VI) (IX) (XI) AAT AAT TCA	ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: Borrelia garinii (B) SZCZEP:20047 PARAMETRY: (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 576 OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:37: GGT GGG GAT ACT GCA TCT ACT AAT CCT GAT GAA TCT
Cys	Asn Asn Ser	Gly Gly Asp Thr	Ala Ser Thr Asn Pro Asp Glu Ser
1 GTT	AAG GGG CCT	5 AAT CTT ACA GAA	10 15 ATA AGC AAA AAA ATT ACA GAT TCT
Val	Lys Gly Pro	Asn Leu Thr Glu	Ile Ser Lys Lys Ile Thr Asp Ser
AAT	20 GCA TTT GTA	CTG GCT GTG AAA	25 30 GAA GTT GAG GCT TTG ATC TCA TCT
Asn	Ala Phe Val	Leu Ala Val Lys	Glu Val Glu Ala Leu Ile Ser Ser
ATA	35 GAT GAA CTT	40 GCT AAA GCT ATT	45 GGT CAA AGA ATA CAA CAA AAT GGT
Ile	Asp Glu Leu	Ala Lys Ala Ile	Gly Gin Arg Ile Gin Gin Asn Gly
TTA	50 GTT GCT GAT	55 GCG GGT CAC AAC	60 AGC GCA TTG TTA GCA GGA GCC CAT
Leu	Val Ala Asp	Ala Gly His Asn	Ser Ala Leu Leu Ala Gly Ala His

144

192

240

178 775

GAA ATA

TCA Ser

ATC Ile

CTA ATA ACA

CAA Gin

AAA Lys

TTA GAT

GGA Gly

TTA Leu

AAA Lys

GGT Gly 95

TTA Leu

288

Glu

Ile

Leu 85

Ile

Thr

Leu 90

Asp

GAA

GGA

TTA

AAA

GCA

GAG

ATT

GCA

GAA

GCT

AAG

AAA

TAT

TCT

GAA

GCA

336

Glu

Gly

Leu

Lys

Ala

Glu

Ile

Ala

Glu

Ala

Lys

Tyr

Ser

Glu

Ala

100

105

110

TTT

ACT

AAA

CTA

AAA

GAT

AAT

CAT

GCA

CAG

CTT

GGT

ATA

CAG

AAT

384

Phe

Thr

Lys

Leu

Lys

Asp

Asn

His

Ala

Gin

Leu

Gly

Ile

Gin

Asn

115

120

125

GGT

GCT

TCT

CTT

GAT

GAG

GCA

AAA

GCT

ATT

TTA

AAA

ACA

AAT

432

Gly

Ala

Ser

Leu

Asp

Glu

Ala

Lys

Ala

Ile

Leu

Lys

Thr

Asn

130

135

140

GTG

GAC

AAA

ACC

AAG

GGT

GCT

GAA

GAG

CTT

GAA

AAG

TTA

TTT

AAA

TCA

480

Val

Asp

Lys

Thr

Lys

Gly

Ala

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Phe

Lys

Ser

145

150

155

160

GTA

GAA

AGC

TTG

TCA

AAA

GCA

GCG

CAA

GAA

GCA

CTA

ACT

AAT

TCA

GTT

528

Val

Glu

Ser

Leu

Ser

Lys

Ala

Gin

Glu

Ala

Leu

Thr

Asn

Ser

Val

165

170

175

AAA

GAG

CTT

ACA

AAT

CCT

GTT

GTG

GCA

GAA

ACT

CCA

AAA

CCT

TA

576

Lys

Glu

Leu

Thr

Asn

Pro

Val

Ala

Glu

Thr

Pro

Lys

Pro

180

185

190 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:38:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 191 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa

178 775 (u) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:38:

Cys 1

Asn

Ser Gly 5

Gly

Asp Thr

Ala

Ser 10

Thr Asn

Pro

Asp

Glu 15

Ser

Val

Lys

Gly

Pro 20

Asn

Leu

Thr

Glu

Ile 25

Ser

Lys

Ile

Thr 30

Asp

Ser

Asn

Ala

Phe 35

Val

Leu

Ala

Val

Lys 40

Glu

Val

Glu

Ala

Leu 45

Ile

Ser

Ile

Asp 50

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala 55

Ile

Gly

Gin

Arg

Ile 60

Gin

Asn

Gly

Leu 65

Val

Ala

Asp

Ala

Gly 70

His

Asn

Ser

Ala

Leu 75

Leu

Ala

Gly

Ala

His 80

Glu

Ile

Ser

Ile

Leu 85

Ile

Thr

Gin

Lys

Leu 90

Asp

Gly

Leu

Lys

Gly 95

Leu

Glu

Gly

Leu

Lys 100

Ala

Glu

Ile

Ala

Glu 105

Ala

Lys

Tyr

Ser 110

Glu

Ala

Phe

Thr

Lys 115

Lys

Leu

Lys

Asp

Asn 120

His

Ala

Gin

Leu

Gly 125

Ile

Gin

Asn

Gly

Ala 130

Ser

Leu

Asp

Glu 135

Ala

Lys

Ala

Ile 140

Leu

Lys

Thr

Asn

Val 145

Asp

Lys

Thr

Lys

Gly 150

Ala

Glu

Leu

Glu 155

Lys

Leu

Phe

Lys

Ser 160

Val Glu Ser Leu Ser Lys Ala Ala Gin Glu Ala Leu Thr Asn Ser Val

178 775

165

170

175

Lys Glu Leu Thr Asn Pro Val Val Ala Glu Thr Pro Lys Lys Pro

180 185 190 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.-.39:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) ORGANIZM: Borrelia garinii (B) SZCZEP:KL10 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 582 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:39:

TGT Cys 1

AAT AAT Asn Asn

TCA GGT

GGG GAT

ACC Thr

GCA Ala

TCT Ser 10

ACT Thr

AAT Asn

CCT GAT Pro Asp

GAG Glu 15

TCT Ser

48

Ser

Gly 5

Gly

Asp

GCA

AAA

GGA

CCT

AAT

CTT

ATA

GAA

ATA

AGC

AAA

ATT

ACA

GAT

TCT

96

Ala

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu

Ile

Glu

Ile

Ser

Lys

Ile

Thr

Asp

Ser

20

25

30

AAT

GCA

TTT

GTA

CTG

GCT

GTG

AAA

GAA

GTT

GAA

GCT

TTG

CTT

TCA

TCT

144

178 775

Asn

Ala

Phe Val 35

Leu Ala

Val

Lys Glu 40

Val Glu

Ala

Leu 45

Leu

Ser

ΑΤΑ

GAT

GAA

CTT

GCT

AAA

GGT

ATT

GGT

AAA

ATA

GAT

CAA

AAT

AGT

192

Ile

Asp 50

Glu

Leu

Ala

Lys

Gly 55

Ile

Gly

Lys

Ile 60

Asp

Gin

Asn

Ser

GGT

TTA

GCT

ACT

CAG

AAT

AAA

AAC

ACC

TCG

TTG

TTA

GCA

GGA

240

Gly 65

Leu

Ala

Thr 70

Gin

Asn

Lys

Asn

Thr 75

Ser

Leu

Ala

Gly 80

GCC

TAT

GCA

GTA

TCA

GCT

CTA

ATA

AAA

CAA

AAA

TTA

GAT

GGA

TTG

CAA

288

Ala

Tyr

Ala

Val

Ser 85

Ala

Leu

Ile

Lys

Gin 90

Lys

Leu

Asp

Gly

Leu 95

Gin

GGT

CCA

GAA

GGG

TTA

AAT

AAA

GAA

ATT

GAA

GCG

GCT

AAG

AAA

TGT

TCT

336

Gly

Pro

Glu

Gly 100

Leu

Asn

Lys

Glu

Ile 105

Glu

Ala

Lys

Lys 110

Cys

Ser

GAA

GCA

TTT

ACT

AAT

AAA

TTA

AAA

GAG

AAG

CAC

GCA

GAA

CTT

GGA

GTG

384

Glu

Ala

Phe 115

Thr

Asn

Lys

Leu

Lys 120

Glu

Lys

His

Ala

Glu 125

Leu

Gly

Val

AAT

GGT

GAT

ACT

GAT

AAT

GCA

AAA

GCA

GCT

ATT

TTT

AAA

432

Asn

Gly 130

Gly

Asp

Thr

Asp 135

Asp

Asn

Ala

Lys

Ala 140

Ala

Ile

Phe

Lys

ACA

CAT

CCT

ACT

AAA

GAT

AAG

GGT

GTC

GAA

GAT

CTT

GAA

AAG

TTA

TCT

480

Thr 145

His

Pro

Thr

Lys

Asp 150

Lys

Gly

Val

Glu

Asp 155

Leu

Glu

Lys

Leu

Ser 160

GAA

TCA

GTA

AAA

AGT

TTG

CTA

AAA

GCA

GCG

CAA

GCA

TTA

AGC

AAT

528

Glu

Ser

Val

Lys

Ser 165

Leu

Lys

Ala

Ala 170

Gin

Ala

Leu

Ser 175

Asn

TCA

GTT

AAA

GAG

CTT

ACA

AGT

CCT

GTT

GTG

GCA

GAA

GCT

CCA

AAA

576

100

178 775

Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Ala Pro Lys Lys

180 185 190

CCT TA

Pro

582 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:40:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 193 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:40:

Cys

Asn

Ser Gly Gly

Asp

Thr Ala

Ser

Thr

Asn

Pro

Asp

Glu

Ser

1

5

10

15

Ala

Lys

Gly

Pro Asn Leu

Ile

Glu Ile

Ser

Lys

Ile

Thr

Asp

Ser

20

25

30

Asn

Ala

Phe

Val Leu Ala

Val

Lys Glu

Val

Glu

Ala

Leu

Ser

35

40

45

Ile

Asp

Glu

Leu Ala Lys

Gly

Ile Gly

Lys

Ile

Asp

Gin

Asn

Ser

50

55

60

Gly

Leu

Ala

Ala Ala Thr

Gin

Asn Lys

Asn

Thr

Ser

Leu

Ala

Gly

65

70

75

80

Ala

Tyr

Ala

Val Ser Ala

Leu

Ile Lys

Gin

Lys

Leu

Asp

Gly

Leu

Gin

178 775

101

Gly Pro Glu Gly Leu 100

Glu Ala Phe Thr Asn 115

Asn Gly Gly Asp Thr 130

Thr His Pro Thr Lys 145

Glu Ser Val Lys Ser

165

Ser Val Lys Glu Leu

180

Asn Lys Glu Ile Glu Ala

105

Lys Leu Lys Glu Lys His

120

Thr Asp Asp Asn Ala Lys

135

Asp Lys Gly Val Glu Asp

150 155

Leu Leu Lys Ala Ala Gin

170

Thr Ser Pro Val Val Ala

185

Ala Lys Lys Cys Ser 110

Ala Glu Leu Gly Val 125

Ala Ala Ile Phe Lys 140

Leu Glu Lys Leu Ser

160

Ala Ala Leu Ser Asn 175

Glu Ala Pro Lys Lys

190

Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:41:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) ORGANIZM: Borrelia garinii (B) SZCZEP:IP90

102

178 775 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 531 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.-.41

TGT AAT AAT

TCA GGT Ser Gly 5

GGG Gly

GAT AGT GCA

TCT ACT AAT CCT GAT

GAG Glu 15

TCT Ser

48

Cys 1

Asn

Asp

Ser

Ala

Ser 10

Thr

Asn

Pro

Asp

GCG

AAA

GGA

CCT

GAT

CTT

ACA

GTA

ATA

AGC

AAA

ATT

ACA

GAT

TCT

96

Ala

Lys

Gly

Pro

Asp

Leu

Thr

Val

Ile

Ser

Lys

Ile

Thr

Asp

Ser

20

25

30

AAT

GCA

TTT

GTA

CTG

GCT

GTG

AAA

GAA

GTT

GAG

GCT

TTG

CTT

TCA

TCT

144

Asn

Ala

Phe

Val

Leu

Ala

Val

Lys

Glu

Val

Glu

Ala

Leu

Ser

35

40

45

ATA

GAT

GAA

CTT

GCT

AAA

GCT

ATT

GGT

CAA

AAA

ATA

GAT

CAA

AAT

192

Ile

Asp

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala

Ile

Gly

Gin

Lys

Ile

Asp

Gin

Asn

50

55

60

GGT

TTA

GCT

ACT

CAG

GAT

AAA

AAC

ACC

TCA

TTG

TTA

GCA

GGA

240

Gly

Leu

Ala

Thr

Gin

Asp

Lys

Asn

Thr

Ser

Leu

Ala

Gly

65

70

75

80

GCC

TAT

GCA

ATA

TCA

GCC

CTA

ATA

AAA

CAA

AAA

TTA

GAT

GGA

TTG

CAA

288

Ala

Tyr

Ala

Ile

Ser

Ala

Leu

Ile

Lys

Gin

Lys

Leu

Asp

Gly

Leu

Gin

85

90

95

GGT

CCA

GAA

GGG

TTA

AAT

AAA

GAA

ATT

GAA

GCG

GCT

AAG

AAA

TGT

TCT

336

Gly

Pro

Glu

Gly

Leu

Asn

Lys

Glu

Ile

Glu

Ala

Lys

Cys

Ser

100

105

110

178 775

103

GAA GCA	TTT ACT	AAT	AAA	TTA AAA GAG AAG CAC	CAA GAC	CTT	GGA GTG	384
Glu Ala	Phe Thr	Asn	Lys	Leu Lys Glu Lys His	Gin Asp	Leu	Gly Val
	115			120	125

GCG

AAT

GGT

GAT ACT

ACT

GAT

AAT AAT

GCA

AAA

GCA

GCT

ATT

TTA

AAA

432

Ala

Asn

Gly

Asp Thr

Thr

Asp

Asn Asn

Ala

Lys

Ala

Ile

Leu

Lys

130

135

140

ACA CAT	GGG ACT GAG GAC AAG GGT GTT AAA	GAA CTT AAA	GAT TTG TTG	480
Thr His	Gly Thr Glu Asp Lys Gly Val Lys	Glu Leu Lys	Asp Leu Leu
145	150	155	160

AAA

TCA GTA

GAA

AGC

TTG

GCA

AAA

GCA

GCG

CAA

GCA GCA

TCA AGC

AAT

528

Lys

Ser

Val

Glu

Ser

Leu

Ala

Lys

Ala

Gin

Ala

Ser

Asn

165

170

175

TCA

Ser

531 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:42:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 177 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: NR ID. SEKW.:42:

Cys Asn Asn Ser Gly Gly Asp Ser Ala Ser Thr Asn Pro Asp Glu Ser

10 15

Ala Lys Gly Pro Asp Leu Thr Val Ile Ser Lys Lys Ile Thr Asp Ser

104

178 775

Asn Ala Phe Val Leu 35

Ile Asp Glu Leu Ala 50

Gly Leu Ala Ala Ala 65

Ala Tyr Ala Ile Ser

Gly Pro Glu Gly Leu

100

Glu Ala Phe Thr Asn

115

Ala Asn Gly Asp Thr 130

Thr His Gly Thr Glu 145

Lys Ser Val Glu Ser

165

Ala Val Lys Glu Val

Lys Ala Ile Gly Gin 55

Thr Gin Asp Lys Asn 70

Ala Leu Ile Lys Gin

Asn Lys Glu Ile Glu

105

Lys Leu Lys Glu Lys

120

Thr Asp Asn Asn Ala

135

Asp Lys Gly Val Lys 150

Leu Ala Lys Ala Ala

170

Glu Ala Leu Leu Ser Ser

Lys Ile Asp Gin Asn Asn

Thr Ser Leu Leu Ala Gly

80

Lys Leu Asp Gly Leu Gin

Ala Ala Lys Lys Cys Ser

110

His Gin Asp Leu Gly Val

125

Lys Ala Ala Ile Leu Lys

140

Glu Leu Lys Asp Leu Leu

155 160

Gin Ala Ala Ser Ser Asn

175

Ser (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:43:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 531 par zasad

178 775

105 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (VI) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia garinii (B) SZCZEP:NBS1AB (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 531 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:43

TGT AAT Cys Asn 1

AAT Asn

TCA GGT

GGG GAT

ACT Thr

GCA Ala

TCT ACT AAT CCT

GAT Asp

GAG TCT

Ser

Gly 5

Gly

Asp

Ser 10

Thr Asn

Pro

Glu 15

Ser

GCA

AAA

GGA

CCT

AAT

CTT

ATA

GAA

ATA

AGC

AAA

ATT

ACA

GAT

TCT

Ala

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu

Ile

Glu

Ile

Ser

Lys

Ile

Thr

Asp

Ser

20

25

30

AAT

GCA

TTT

GTA

CTG

GCT

GTG

AAA

GAA

GTT

GAG

GCT

TTG

CTT

TCA

TCT

Asn

Ala

Phe

Val

Leu

Ala

Val

Lys

Glu

Val

Glu

Ala

Leu

Ser

35

40

45

ATA

GAT

GAA

CTT

GCT

AAA

GCT

ATT

GGT

CAA

AAA

ATA

G Aj

. CM

k ΑΑΊ

’ AAT

Ile

Asp

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala

Ile

Gly

Gin

Lys

Ile

Asp

Gin

Asn

50

55

60

GGT

TTA

GCT

ACT

CAG

GAT

AAA

AAC

ACC

TCA

TTG

TTA

GCA

GGA

Gly

Leu

Ala

Thr

Gin

Asp

Lys

Asn

Thr

Ser

Leu

Ala

Gly

144

192

240

106

178 775

GCC Ala

TAT GCA

ATA Ile

TCA GCT Ser Ala 85

CTA ATA AAA

CAA AAA

TTA GAT Leu Asp

GGA Gly

TTG CAA

288

Tyr

Ala

Leu

Ile

Lys

Gin 90

Lys

Leu 95

Gin

GGT

CCA

GAA

GGG

TTA

AAT

AAA

GAA

ATT

GAA

GCG

GCT

AAG

AAA

TGT

TCT

336

Gly

Pro

Glu

Gly 100

Leu

Asn

Lys

Glu

Ile 105

Glu

Ala

Lys

Lys 110

Cys

Ser

GAA

GCA

TTT

ACT

AAT

AAA

TTA

AAA

GAG

AAG

CAC

CAA

GAC

CTT

GGA

GTG

384

Glu

Ala

Phe 115

Thr

Asn

Lys

Leu

Lys 120

Glu

Lys

His

Gin

Asp 125

Leu

Gly

Val

GCG

AAT

GGT

GAT

ACT

GAT

AAT

GCA

AAA

GCA

GCT

ATT

TTA

AAA

432

Ala

Asn 130

Gly

Asp

Thr

Asp 135

Asn

Ala

Lys

Ala 140

Ala

Ile

Leu

Lys

ACA

CAT

GGG

ACT

GAG

GAC

AAG

GGT

GTT

AAA

GAA

CTT

AAA

GAT

TTG

480

Thr 145

His

Gly

Thr

Glu

Asp 150

Lys

Gly

Val

Lys

Glu 155

Leu

Lys

Asp

Leu

Leu 160

AAA

TCA

GTA

GAA

AGC

TTG

GCA

AAA

GCA

GCG

CAA

GCA

TCA

AGC

AAT

528

Lys

Ser

Val

Glu

Ser 165

Leu

Ala

Lys

Ala

Ala 170

Gin

Ala

Ser

Ser 175

Asn

TCA

Ser

531 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:44:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 177 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa

178 775

107 (11) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:44:

Cys Asn Asn

Ala Lys Gly

Ser Gly Gly Asp

Pro Asn Leu Ile

Thr Ala Ser Thr Asn

Glu Ile Ser Lys Lys

Pro Asp Glu Ser

Ile Thr Asp Ser

Asn Ala Phe Val Leu Ala Val

Ile Asp Glu Leu Ala Lys Ala

55

Lys Glu Val Glu Ala Leu Leu Ser Ser

45

Ile Gly Gin Lys Ile Asp Gin Asn Asn

Gly Leu Ala 65

Ala Tyr Ala

Gly Pro Glu

Ala Ala Thr Gin

Ile Ser Ala Leu

Gly Leu Asn Lys

100

Asp Lys Asn Thr Ser

Ile Lys Gin Lys Leu

Glu Ile Glu Ala Ala

105

Leu Leu Ala Gly

Asp Gly Leu Gin

Lys Lys Cys Ser

110

Glu Ala Phe

115

Ala Asn Gly

130

Thr His Gly

145

Thr Asn Lys Leu

Asp Thr Thr Asp

135

Thr Glu Asp Lys

150

Lys Glu Lys His Gin 120

Asn Asn Ala Lys Ala

140

Gly Val Lys Glu Leu 155

Asp Leu Gly Val 125

Ala Ile Leu Lys

Lys Asp Leu Leu

160

Lys Ser Val Glu Ser Leu Ala Lys Ala Ala Gin Ala Ala Ser Ser Asn

108

178 775

165 170 175

Ser (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:45:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) ORGANIZM: Borrelia garinii (B) SZCZEP: BITS (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 582 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.: 45:

TGT

AAT

TCA

GGT

GGA

GAT

TCT

GCA

TCT

ACT

AAT

CCT

GAT

GAG

TCT

48

Cys

Asn

Ser

Gly

Asp

Ser

Ala

Ser

Thr

Asn

Pro

Asp

Glu

Ser

1

5

10

15

GCA

AAA

GGA

CCT

GAT

CTT

ACA

GTA

ATA

AGC

AAA

ATT

ACA

GAT

TCT

96

Ala

Lys

Gly

Pro

Asp

Leu

Thr

Val

Ile

Ser

Lys

Ile

Thr

Asp

Ser

20

25

30

AAT

GCA

GTT

GTA CTG GCT

GTG AAA

GAA

GTT

GAA GCT

TTG

CTT

TCA

TCT

144

Asn

Ala

Val

Leu

Ala

Val

Lys

Glu

Val

Glu

Ala

Leu

Ser

178 775

109

ATA GAT GAA CTT GCT AAA GCT ATT GGT CAA AAA ATA GAT CGA AAT AAT192

Ile Asp Glu Leu Ala Lys Ala Ile Gly Gin Lys Ile Asp Arg Asn Asn

5560

GGT TTA GCT GTC GAA GCG AAT TTT AAC ACC TCA TTG TTA GCA GGA GCC240

Gly Leu Ala Val Glu Ala Asn Phe Asn Thr Ser Leu Leu Ala GlyAla

70 7580

TAT ACA ATA TCA ACC CTA ATA ACA AAA AAA TTA GAT GAA TTG ATC AAA288

Tyr Thr Ile Ser Thr Leu Ile Thr Lys Lys Leu Asp Glu Leu IleLys

9095

AAT TCA GGA GAA TTA AAA GGA GAA GTT GAA AAG GCT AAA AAC TGT TCT336

Asn Ser Gly Glu Leu Lys Gly Glu Val Glu Lys Ala Lys Asn CysSer

100 105110

GAA GCA TTT ACT AAT AAA TTA AAA GAG AAG ACC CAA GAA CTT GCA GTG384

Glu Ala Phe Thr Asn Lys Leu Lys Glu Lys Thr Gin Glu Leu AlaVal

115 120125

GCG GCT GGT GCT GCT ACT GAT ATT GAT GCA AAA AAA GCT ATT TTA AAA432

Ala Ala Gly Ala Ala Thr Asp Ile Asp Ala Lys Lys Ala Ile LeuLys

130 135140

ACA AAT AGG GAC AAG GAC CTA GGT GCT GAT GAA CTT GGC AAG TTA TTT480

Thr Asn Arg Asp Lys Asp Leu Gly Ala Asp Glu Leu Gly Lys LeuPhe

145 150 155160

AAA TCA GTA GAA AGC TTG TCA AAA GCA GCG CAA GAA GCA TCA GCT AAT528

Lys Ser Val Glu Ser Leu Ser Lys Ala Ala Gin Glu Ala Ser AlaAsn

165 170175

TCA GTT AAA GAG CTT ACA AGT CCT GTT GTG GCA GAA ACT CCA AAA AAA576

Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Thr Pro LysLys

110

178 775

190

582

180

185

CCT TA Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:46:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 193 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:46:

Cys	Asn Asn	Ser Gly	Gly	Asp	Ser Ala	Ser	Thr	Asn	Pro Asp	Glu	Ser
1		5				10				15
Ala	Lys Gly	Pro Asp	Leu	Thr	Val Ile	Ser	Lys	Lys	Ile Thr	Asp	Ser
		20			25				30
Asn	Ala Val	Val Leu	Ala	Val	Lys Glu	Val	Glu	Ala	Leu Leu	Ser	Ser
	35				40				45
Ile	Asp Glu	Leu Ala	Lys	Ala	Ile Gly	Gin	Lys	Ile	Asp Arg	Asn	Asn
	50			55				60
Gly	Leu Ala	Val Glu	Ala	Asn	Phe Asn	Thr	Ser	Leu	Leu Ala	Gly	Ala
65			70				75				80
Tyr	Thr Ile	Ser Thr	Leu	Ile	Thr Lys	Lys	Leu	Asp	Glu Leu	Ile	Lys

178 775

111

Asn Ser Gly Glu Leu Lys Gly Glu Val Glu Lys Ala Lys Asn Cys Ser

100

105

110

Glu Ala Phe Thr Asn Lys Leu Lys Glu Lys Thr Gin Glu Leu Ala Val

115

120

125

Ala Ala Gly Ala Ala Thr Asp Ile Asp Ala Lys Lys Ala Ile Leu Lys

130

135

140

Thr Asn Arg Asp Lys Asp Leu Gly Ala Asp Glu Leu Gly Lys Leu Phe

145

150

155

160

Lys Ser Val Glu Ser Leu Ser Lys Ala Ala Gin Glu Ala Ser Ala Asn

165

170

175

Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Thr Pro Lys Lys

180

185

190

Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:47:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 570 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia garinii (B) SZCZEB:KL11

112

178 775 (ix) PARAMETRY :

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 570 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:47:

TGT Cys 1

AAT Asn

TCA Ser

GGT Gly 5

GGG GAT Gly Asp

ACT Thr

GCA Ala

TCT ACT AAT CCT GAT GAA

TCT Ser

48

Ser 10

Thr

Asn

Pro

Asp

Glu 15

GCG

AAA

GGA

CCT

GAT

CTT

ACA

GTA

ATA

AGC

AAA

ATT

ACA

GAT

TCT

96

Ala

Lys

Gly

Pro

Asp

Leu

Thr

Val

Ile

Ser

Lys

Ile

Thr

Asp

Ser

20

25

30

AAT

GCA

GTT

GTA

CTG

GTT

GTG

AAA

GAA

GTT

GAG

GCT

TTG

CTT

TCA

TCT

144

Asn

Ala

Val

Leu

Val

Lys

Glu

Val

Glu

Ala

Leu

Ser

35

40

45

ATA

GAT

GAA

CTT

TCT

AAA

GCT

ATT

GGT

AAA

ATA

AGA

AAT

GAT

GGT

192

Ile

Asp

Glu

Leu

Ser

Lys

Ala

Ile

Gly

Lys

Ile

Arg

Asn

Asp

Gly

50

55

60

ACT

TTA

GAT

AAC

GAA

GCA

AAT

CGA

AAC

GAA

TCA

TTG

ATA

GCA

GGA

GCT

240

Thr

Leu

Asp

Asn

Glu

Ala

Asn

Arg

Asn

Glu

Ser

Leu

Ile

Ala

Gly

Ala

65

70

75

80

TAT

GAA

ATA

TCA

AAA

CTA

ATA

ACA

CAA

AAA

TTA

AGT

GTA

TTG

AAT

TCA

288

Tyr

Glu

Ile

Ser

Lys

Leu

Ile

Thr

Gin

Lys

Leu

Ser

Val

Leu

Asn

Ser

85

90

95

GAA

TTA

AAG

GAA

AAA

ATT

AAA

GAG

GCT

AAG

GAT

TGT

TCC

GAA

AAA

336

Glu

Leu

Lys

Glu

Lys

Ile

Lys

Glu

Ala

Lys

Asp

Cys

Ser

Glu

Lys

100

105

110

TTT

ACT

AAG

CTG

AGA

GAT

AGT

CAT

GCA

GAG

CTT

GGT

ATA

CAA

AAC

384

178 775

113

Phe Thr Thr Lys Leu Arg Asp Ser His Ala Glu Leu Gly Ile Gin Asn

115 120125

GTT CAG GAT GAT AAT GCA AAA AGA GCT ATT TTA AAA ACA CAT GGG AAT Val Gin Asp Asp Asn Ala Lys Arg Ala Ile Leu Lys Thr His Gly Asn

130 135140

AAA GAC AAG GGT GCT AAA GAA CTT AAA GAG TTA TCT GAA TCA TTAGAA

Lys Asp Lys Gly Ala Lys Glu Leu Lys Glu Leu Ser Glu Ser LeuGlu

145 150 155160

ARA TTG TCA AAA GCA GCG CAA GCA GCA CTA GCT AAT TCA GTT AAAGAG

Lys Leu Ser Lys Ala Ala Gin Ala Ala Leu Ala Asn Ser Val LysGlu

165 170175

CTT ACA AGT CCT GTT GTG GCA GAA ACT CCA AAA AAA CCTTA

Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Thr Pro Lys LysPro

180 185190 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:48:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 189 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:48:

432

480

528

570

Cys Asn Asn Ser Gly Gly Asp	Thr Ala	Ser	Thr	Asn Pro Asp Glu Ser
1 5		10		15
Ala Lys Gly Pro Asp Leu Thr	Val Ile	Ser	Lys	Lys Ile Thr Asp Ser

114

178 775

Asn

Ala

Val 35

Val

Leu

Val

Lys 40

Glu

Val

Glu

Ala

Leu 45

Leu

Ser

Ile

Asp 50

Glu

Leu

Ser

Lys

Ala 55

Ile

Gly

Lys

Ile 60

Arg

Asn

Asp

Gly

Thr 65

Leu

Asp

Asn

Glu

Ala 70

Asn

Arg

Asn

Glu

Ser 75

Leu

Ile

Ala

Gly

Ala 80

Tyr

Glu

Ile

Ser

Lys 85

Leu

Ile

Thr

Gin

Lys 90

Leu

Ser

Val

Leu

Asn 95

Ser

Glu

Leu

Lys 100

Glu

Lys

Ile

Lys

Glu 105

Ala

Lys

Asp

Cys

Ser 110

Glu

Lys

Phe

Thr

Thr 115

Lys

Leu

Arg

Asp

Ser 120

His

Ala

Glu

Leu

Gly 125

Ile

Gin

Asn

Val

Gin 130

Asp

Asn

Ala

Lys 135

Arg

Ala

Ile

Leu

Lys 140

Thr

His

Gly

Asn

Lys 145

Asp

Lys

Gly

Ala

Lys 150

Glu

Leu

Lys

Glu

Leu 155

Ser

Glu

Ser

Leu

Glu 160

Lys

Leu

Ser

Lys

Ala 165

Ala

Gin

Ala

Leu 170

Ala

Asn

Ser

Val

Lys 175

Glu

Leu

Thr

Ser

Pro

Val

Ala

Glu

Thr

Pro

Lys

Pro

180 185 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:49:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 519 par zasad

178 775

115 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (u) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia garinii (B) SZCZEP:PB1 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 519 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:49:

TGT AAT Cys Asn 1

AAT Asn

TCA Ser

GGT Gly 5

GGG GAT

TCT Ser

GCA Ala

TCT Ser 10

ACT Thr

AAT Asn

CCT GAT

GAG Glu 15

TCT Ser

48

Gly

Asp

Pro

Asp

GCA

AAA

GGA

CCT

AAT

CTT

ACC

GTA

ATA

AGC

AAA

ATT

ACA

GAT

TCT

96

Ala

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu

Thr

Val

Ile

Ser

Lys

Ile

Thr

Asp

Ser

20

25

30

AAT

GCA

TTT

TTA

CTG

GCT

GTG

AAA

GAA

GTT

GAG

GCT

TTG

CTT

TCA

TCT

144

Asn

Ala

Phe

Leu

Ala

Val

Lys

Glu

Val

Glu

Ala

Leu

Ser

35

40

45

ATA

GAT

GAA

CTT

TCT

AAA

GCT

ATT

GGT

AAA

ATA

AAA

AAT

GAT

GGT

192

Ile

Asp

Glu

Leu

Ser

Lys

Ala

Ile

Gly

Lys

Ile

Lys

Asn

Asp

Gly

50

55

60

ACT

TTA

GAT

AAC

GAA

GCA

AAT

CGA

AAC

GAA

TCA

TTG

ATA

GCA

GGA

GCT

240

Thr

Leu

Asp

Asn

Glu

Ala

Asn

Arg

Asn

Glu

Ser

Leu

Ile

Ala

Gly

Ala

116

178 775

TAT Tyr

GAA Glu

ATA TCA

AAA CTA

ATA ACA CAA

AAA Lys 90

TTA AGT GTA TTG

AAT Asn 95

TCA Ser

288

Ile

Ser

Lys 85

Leu

Ile

Thr

Gin

Leu

Ser

Val

Leu

GAA

TTA

AAG

GAA

AAA

ATT

AAA

GAG

GCT

AAG

GAT

TGT

TCC

CAA

AAA

336

Glu

Leu

Lys

Glu

Lys

Ile

Lys

Glu

Ala

Lys

Asp

Cys

Ser

Gin

Lys

100

105

110

TTT

ACT

AAG

CTA

AAA

GAT

AGT

CAT

GCA

GAG

CTT

GGT

ATA

CAA

AGC

384

Phe

Thr

Lys

Leu

Lys

Asp

Ser

His

Ala

Glu

Leu

Gly

Ile

Gin

Ser

115

120

125

GTT

CAG

GAT

AAT

GCA

AAA

GCT

ATT

TTA

AAA

ACA

CAT

GGA

ACT

432

Val

Gin

Asp

Asn

Ala

Lys

Ala

Ile

Leu

Lys

Thr

His

Gly

Thr

130

135

140

AAA

GAC

AAG

GGT

GCT

AAA

GAA

CTT

GAA

GAG

TTA

TTT

AAA

TCA

CTA

GAA

480

Lys

Asp

Lys

Gly

Ala

Lys

Glu

Leu

Glu

Leu

Phe

Lys

Ser

Leu

Glu

145

150

155

160

AGC

TTG

TCA

AAA

GCA

GCG

CAA

GCA

TTA

ACT

AAT

TCA

519

Ser

Leu

Ser

Lys

Ala

Gin

Ala

Leu

Thr

Asn

Ser

165 170 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:50:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 173 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: NR ID. SEKW.:50:

178 775

117

Cys 1

Asn

Ser

Gly 5

Gly

Asp

Ser

Ala

Ser 10

Thr

Asn

Pro

Asp

Glu 15

Ser

Ala

Lys

Gly

Pro 20

Asn

Leu

Thr

Val

Ile 25

Ser

Lys

Ile

Thr 30

Asp

Ser

Asn

Ala

Phe 35

Leu

Ala

Val

Lys 40

Glu

Val

Glu

Ala

Leu 45

Leu

Ser

Ile

Asp 50

Glu

Leu

Ser

Lys

Ala 55

Ile

Gly

Lys

Ile 60

Lys

Asn

Asp

Gly

Thr 65

Leu

Asp

Asn

Glu

Ala 70

Asn

Arg

Asn

Glu

Ser 75

Leu

Ile

Ala

Gly

Ala 80

Tyr

Glu

Ile

Ser

Lys 85

Leu

Ile

Thr

Gin

Lys 90

Leu

Ser

Val

Leu

Asn 95

Ser

Glu

Leu

Lys 100

Glu

Lys

Ile

Lys

Glu 105

Ala

Lys

Asp

Cys

Ser 110

Gin

Lys

Phe

Thr

Thr 115

Lys

Leu

Lys

Asp

Ser 120

His

Ala

Glu

Leu

Gly 125

Ile

Gin

Ser

Val

Gin 130

Asp

Asn

Ala

Lys 135

Lys

Ala

Ile

Leu

Lys 140

Thr

His

Gly

Thr

Lys 145

Asp

Lys

Gly

Ala

Lys 150

Glu

Leu

Glu

Leu 155

Phe

Lys

Ser

Leu

Glu 160

Ser

Leu

Ser

Lys

Ala

Gin

Ala

Leu

Thr

Asn

Ser

165 170 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:51:

118

178 775 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 570 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia (B) SZCZEP: H13 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 570 (xi) OPIS SEKWENCJI: NR ID.SEKW.: 51:

TGT

AAT

TCA

GGT

GGG

GAT

ACT

GCA

TCT

ACT

AAT

CCT

GAT

GAG

TCC

48

Cys

Asn

Ser

Gly

Asp

Thr

Ala

Ser

Thr

Asn

Pro

Asp

Glu

Ser

1

5

10

15

ACT

AAA

GGA

CCT

AAT

CTT

ATA

GAA

ATA

AGC

AAA

ATT

ACA

GAT

TCC

96

Thr

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu

Ile

Glu

Ile

Ser

Lys

Ile

Thr

Asp

Ser

20

25

30

AAT

GCA

GTT

GTA

CTG

GCT

GTG

AAA

GAA

GTT

GAG

GCT

TTG

ATC

TCA

TCT

144

Asn

Ala

Val

Leu

Ala

Val

Lys

Glu

Val

Glu

Ala

Leu

Ile

Ser

35

40

45

ATA Ile

GAT Asp 50

GAA Glu

CTT Leu

GCT Ala

AAG GCT ATT

GGT AAA

AAA GTA

GAG GCA AAT

GGT Gly

192

Lys

Ala 55

Ile

Gly

Lys

Val 60

Glu

Ala

Asn

TTG

GGT

AAC

GAA

GCG

GAT

AGA

AAC

ACC

TCA

TTG

TTA

GCA

GGA

GCT

CAT

240

178 775

119

Leu Gly 65

Asn

Glu Ala Asp 70

Arg

Asn

Thr

Ser

Leu 75

Leu

Ala

Gly

Ala

His 80

GAA

ATA

TCA

ATT

CTA

ATA

ACA

CAA

AAA

TTA

ACT

GCA

TTA

AAA

GAT

TCA

88

Glu

Ile

Ser

Ile

Leu 85

Ile

Thr

Gin

Lys

Leu 90

Thr

Ala

Leu

Lys

Asp 95

Ser

GGA

TTA

AAA

GCA

GAG

ATT

GCA

GAA

GCT

AAG

AAA

TGT

TCT

GAA

GCA

336

Gly

Leu

Lys 100

Ala

Glu

Ile

Ala

Glu 105

Ala

Lys

Cys

Ser 110

Glu

Ala

TTT

ACT

AAA

CTA

AAA

GAT

AAT

GCA

CAG

CTT

GGT

ATA

CAA

AAC

384

Phe

Thr

Lys 115

Lys

Leu

Lys

Asp

Asn 120

Asn

Ala

Gin

Leu

Gly 125

Ile

Gin

Asn

GTT

CAG

GAT

GTT

GAG

GCA

AAA

GCT

ATT

TTA

AAA

ACA

AAT

GGG

GAC

432

Val

Gin 130

Asp

Val

Glu

Ala

Lys 135

Lys

Ala

Ile

Leu

Lys 140

Thr

Asn

Gly

Asp

ATA

AGC

AAG

GGT

GCT

AAA

GAA

CTT

AAA

GAG

TTA

TTT

GAA

TCA

GTA

GAA

480

Ile 145

Ser

Lys

Gly

Ala

Lys 150

Glu

Leu

Lys

Glu

Leu 155

Phe

Glu

Ser

Val

Glu 160

AGC

TTG

GCA

AAA

GCA

GCG

CAA

GCA

CTA

GCT

AAT

TCA

GTT

CAA

GAG

528

Ser CTT Leu

Leu ACA Thr

Ala AGC Ser

Lys CCT Pro

Ala 165 GTT Val

Ala GTG Val

Gin GCA Ala

Ala GAA Glu

Ala ACT Thr

Leu 170 CCA Pro

Ala AAA Lys

Asn AAA Lys

Ser CCT Pro

Val TA

Gin 175

Glu

570

180 185 190 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:52:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 189 aminokwasów

120

178 775 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

Cys 1

Thr Lys

Asn Ala

Ile Asp

Leu Gly

Glu Ile

Gly Gly

Phe Thr

Val Gin

130 (xi) OPIS

Asn Asn Ser

Gly Pro

Val Val

Glu Leu

Asn Glu

Ser Ile

Leu Lys

100

Lys Lys 115

Asp Val

SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:52:

Gly Gly Asp Thr Ala

Asn Leu

Leu Ala

Ala Lys

Ala Asp

Leu Ile

Ala Glu

Leu Lys

Glu Ala

Ser Thr

Ile Glu Ile Ser

Val Lys

Ala Ile 55

Arg Asn

Thr Gin

Ile Ala

Asp Asn

120

Lys Lys 135

Glu Val

Gly Lys

Thr Ser

Lys Leu

Glu Ala 105

Asn Ala

Ala Ile

Asn

Lys Lys

Glu Ala

Lys Val

Leu Leu

Thr Ala

Lys Lys

Gin Leu

Leu Lys

140

Pro Asp

Ile Thr

Leu Ile 45

Glu Ala

Ala Gly

Leu Lys

Cys Ser

110

Gly Ile 125

Thr Asn

Glu Ser 15

Asp Ser

Ser Ser

Asn Gly

Ala His

Asp Ser 95

Glu Ala

Gin Asn

Gly Asp

Ile Ser Lys Gly Ala Lys Glu Leu Lys Glu Leu

Phe Glu Ser Val Glu

145

150

155

160

178 775

121

Ser Leu Ala Lys Ala Ala Gin Ala Ala

Leu Ala Asn Ser Val Gin Glu

165 170 175

Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Thr Pro Lys Lys Pro

180

185 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:53:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 528 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia burgdorfi (B) SZCZEP:B31 (1X) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 528

(xi)

OPIS SEKWENCJI

:NR

ID.SEKW.

:53:

TGT

AAT

TCA

GGG

AAA

GAT

GGG

AAT

ACA

TCT

GCA

AAT

TCT

GCT

GAT

48

Cys

Asn

Ser

Gly

Lys

Asp

Gly

Asn

Thr

Ser

Ala

Asn

Ser

Ala

Asp

1

5

10

15

GAG

TCT

GTT

AAA

GGG

CCT

AAT

CTT

ACA

GAA

ATA

AGT

AAA

ATT

ACG

96

Glu

Ser

Val

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu

Thr

Glu

Ile

Ser

Lys

Ile

Thr

122

178 775

GAT Asp

TCT AAT

GCG GTT

TTA CTT

GCT Ala 40

GTG Val

AAA Lys

GAG GTT

GAA GCG

TTG Leu

CTG Leu

144

Ser

Asn 35

Ala

Val

Leu

Glu

Val

Glu 45

Ala

TCA

TCT

ATA

GAT

GAA

ATT

GCT

AAA

GCT

ATT

GGT

AAA

ATA

CAC

192

Ser

Ser 50

Ile

Asp

Glu

Ile

Ala 55

Ala

Lys

Ala

Ile

Gly 60

Lys

Ile

His

CAA

AAT

GGT

TTG

GAT

ACC

GAA

AAT

CAC

AAT

GGA

TCA

TTG

TTA

240

Gin 65

Asn

Gly

Leu

Asp 70

Thr

Glu

Asn

His 75

Asn

Gly

Ser

Leu

Leu 80

GCG

GGA

GCT

TAT

GCA

ATA

TCA

ACC

CTA

ATA

AAA

CAA

AAA

TTA

GAT

GGA

288

Ala

Gly

Ala

Tyr

Ala 85

Ile

Ser

Thr

Leu

Ile 90

Lys

Gin

Lys

Leu

Asp 95

Gly

TTG

AAA

AAT

GAA

GGA

TTA

AAG

GAA

AAA

ATT

GAT

GCG

GCT

AAG

AAA

TGT

336

Leu

Lys

Asn

Glu 100

Gly

Leu

Lys

Glu

Lys 105

Ile

Asp

Ala

Lys 110

Lys

Cys

TCT

GAA

ACA

TTT

ACT

AAT

AAA

TTA

AAA

GAA

AAA

CAC

ACA

GAT

CTT

GGT

384

Ser

Glu

Thr 115

Phe

Thr

Asn

Lys

Leu 120

Lys

Glu

Lys

His

Thr 125

Asp

Leu

Gly

AAA

GAA

GGT

GTT

ACT

GAT

GCT

GAT

GCA

AAA

GAA

GCC

ATT

TTA

AAA

ACA

432

Lys

Glu 130

Gly

Val

Thr

Asp

Ala 135

Asp

Ala

Lys

Glu

Ala 140

Ile

Leu

Lys

Thr

AAT

GGT

ACT

AAA

ACT

AAA

GGT

GCT

GAA

CTT

GGA

AAA

TTA

TTT

GAA

480

Asn 145

Gly

Thr

Lys

Thr

Lys 150

Gly

Ala

Glu

Leu 155

Gly

Lys

Leu

Phe

Glu 160

TCA

GTA

GAG

GTC

TTG

TCA

AAA

GCA

GCT

AAA

GAG

ATG

CTT

GCT

AAT

TCA

528

Ser

Val

Glu

Val

Leu

Ser

Lys

Ala

Lys

Glu

Met

Leu

Ala

Asn

Ser

165

170

175

178 775

123 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:54:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 176 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:54:

Cys

Asn

Ser

Gly

Lys Asp

Gly Asn

Thr

Ser

Ala Asn

Ser

Ala

Asp

1

5

10

15

Glu

Ser

Val

Lys

Gly

Pro Asn

Leu Thr

Glu

Ile

Ser Lys

Lys

Ile

Thr

20

25

30

Asp

Ser

Asn

Ala

Val

Leu Leu

Ala Val

Lys

Glu

Val Glu

Ala

Leu

35

40

45

Ser

Ile

Asp

Glu

Ile Ala

Ala Lys

Ala

Ile

Gly Lys

Lys

Ile

His

50

55

60

Gin

Asn

Gly

Leu

Asp Thr

Glu Asn

Asn

His

Asn Gly

Ser

Leu

65

70

75

80

Ala

Gly

Ala

Tyr

Ala

Ile Ser

Thr Leu

Ile

Lys

Gin Lys

Leu

Asp

Gly

85

90

95

Leu

Lys

Asn

Glu

Gly

Leu Lys

Glu Lys

Ile

Asp

Ala Ala

Lys

Cys

100

105

110

Ser

Glu

Thr

Phe

Thr

Asn Lys

Leu Lys

Glu

Lys

His Thr

Asp

Leu

Gly

115

120

125

124

178 775

Lys Glu	Gly Val Thr Asp	Ala Asp Ala Lys Glu Ala	Ile	Leu	Lys	Thr
	130	135	140
Asn	Gly	Thr Lys Thr Lys	Gly	Ala Glu Glu Leu Gly	Lys	Leu	Phe	Glu
145		150		155				160
Ser	Val	Glu Val Leu Ser	Lys	Ala Ala Lys Glu Met	Leu	Ala	Asn	Ser

165 170 175 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:55:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (11) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:55

ATGAAAAAGA ATACATTAAG TGC (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:56:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)

178 775

125 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:56:

TAATTAAGGT TTTTTTGGAG TTTCTG (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:57:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (11) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:57:

ATGAAAAAGA ATACATTAAG TGCG 24 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.-.58:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:58:

126

178 775

ATTAAGGTTT TTTTGGAGTT TCTG (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:59:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (XI) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.-.59:

ATGAAAAAGA ATACATTAAG TGCG (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:60:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:60:

ATTAAGGTTT TTTTGGAGTT TCTG (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:61:

178 775

127 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:61:

AAATGTGTAA TAATTCAGGG AAAGG 25 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:62:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:62:

ATTAAGGTTT TTTTGGAGTT TCTG 24 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:63:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 585 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

128

178 775 (C) STRUKTURA NICIOWA: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Borrelia burgdorfi (B) SZCZEP:2591 (ix) PARAMETRY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1.. 585 (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.-.63:

TGT Cys 1

AAT Asn

TCA Ser

GGG AAA

GAT Asp

GGG AAT

ACA Thr 10

TCT Ser

GCA Ala

AAT Asn

TCT Ser

GCT Ala 15

GAT As

48

Gly 5.

Lys

Gly

Asn

GAG

TCT

GTT

AAA

GGG

CCT

AAT

CTT

ACA

GAA

ATA

AGT

AAA

ATT

ACA

96

Glu

Ser

Val

Lys

Gly

Pro

Asn

Leu

Thr

Glu

Ile

Ser

Lys

Ile

Thr

20

25

30

GAA

TCT

AAC

GCA

GTT

CTC

GCC

GTG

AAA

GAA

GTT

GAA

ACT

CTG

CTT

144

Glu

Ser

Asn

Ala

Val

Leu

Ala

Val

Lys

Glu

Val

Glu

Thr

Leu

35

40

45

GCA

TCT

ATA

GAT

GAA

GTT

GCT

AAG

AAA

GCT

ATT

GGG

AAT

TTG

ATA

GCC

192

Ala

Ser

Ile

Asp

Glu

Val

Ala

Lys

Ala

Ile

Gly

Asn

Leu

Ile

Ala

50

55

60

CAA

AAT

GGT

TTA

AAT

GCC

GGT

GCT

AAT

CAA

AAC

GGR

TCA

TTG

TTA

GCG

240

Gin

Asn

Gly

Leu

Asn

Ala

Gly

Ala

Asn

Gin

Asn

Gly

Ser

Leu

Ala

178 775

129

GGA GCC TAC GTA ATA TCA ACC CTA ATA GCA GAA AAA TTA GAT GGA TTG 288 Gly Ala Tyr Val Ile Ser Thr Leu Ile Ala Glu Lys Leu Asp Gly Leu

9095

AAA AAT TCA GAA GAA TTA AAG GAA AAA ATT GAA GAT GCT AAA AAA TGT336

Lys Asn Ser Glu Glu Leu Lys Glu Lys Ile Glu Asp Ala Lys LysCys

100 105110

AAC AAA GCA TTT ACT GAT AAA CTA AAA AGT AGT CAT GCG GAA CTC GGT384

Asn Lys Ala Phe Thr Asp Lys Leu Lys Ser Ser His Ala Glu LeuGly

115 120125

ATA GCG AAT GGA GCT GCT AGT GAT GCT AAT GCA AAA GCG GCT ATT TTA432

Ile Ala Asn Gly Ala Ala Ser Asp Ala Asn Ala Lys Ala Ala IleLeu

130 135140

AAA ACA AAT GGT ACT AAA GAT AAG GGT GCT CAA GAG CTT GAA AAG TTA480

Lys Thr Asn Gly Thr Lys Asp Lys Gly Ala Gin Glu Leu Glu LysLeu

145 150 155160

TTT GAA TCA GTA AAA AAC'TTG TCA AAA GCA GCT CAA GAA ACA CTA AAT528

Phe Glu Ser Val Lys Asn Leu Ser Lys Ala Ala Gin Glu Thr LeuAsn

165 170175

AAT TCA GTT AAA GAA CTT ACA AGT CCT GTT GTG GCA GAA AAT CCA AAA576

Asn Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Asn ProLys

180 185190

AAA CCT TA585

Lys Pro

195 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:64:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

130

178 775 (A) DŁUGOŚĆ: 194 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID. SEKW.:64:

Cys Asn Asn Ser Gly Lys Asp Gly

Glu Ser Val Lys Gly Pro Asn Leu

Glu Ser Asn Ala Val Val Leu Ala

3540

Ala Ser Ile Asp Glu Val Ala Lys

5055

Gin Asn Gly Leu Asn Ala Gly Ala

6570

Gly Ala Tyr Val Ile Ser Thr Leu

Lys Asn Ser Glu Glu Leu Lys Glu

100

Asn Lys Ala Phe Thr Asp Lys Leu

115120

Ile Ala Asn Gly Ala Ala Ser Asp

130135

Asn Thr Ser Ala Asn Ser Ala Asp

1015

Thr Glu Ile Ser Lys Lys Ile Thr

2530

Val Lys Glu Val Glu Thr Leu Leu

Lys Ala Ile Gly Asn Leu Ile Ala

Asn Gin Asn Gly Ser Leu Leu Ala

7580

Ile Ala Glu Lys Leu Asp Gly Leu

9095

Lys Ile Glu Asp Ala Lys Lys Cys

105110

Lys Ser Ser His Ala Glu Leu Gly

125

Ala Asn Ala Lys Ala Ala Ile Leu

140

Lys Thr Asn Gly Thr Lys Asp Lys Gly Ala Gin Glu Leu Glu Lys Leu

178 775

131

145 150 155160

Phe Glu Ser Val Lys Asn Leu Ser Lys Ala Ala Gin Glu Thr Leu Asn

165 170175

Asn Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Asn Pro Lys

180 185190

Lys Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:65:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:65

AAACGATGTG TAATAATTCA GGGAAAGG (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:66:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

132

178 775 (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:66

ATTAAGGTTT TTTTGGTTTC TG (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:67:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:67

GGGACTTCGA AACGAATGTG TAATAATTCA GGTGGG (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:68:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) STRUKTURA NICIOWA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (11) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)

178 775

133 (xi) OPIS SEKWENCJIrNR ID.SEKW.:68

GGAATTCATT AAGGTTTTTT TGGA (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:69:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (Β) TYB: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:69

Val Lys Leu Ser Glu Ser Val Ala Ser Leu Ser Lys Ala Ala

10 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:70:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:70:

134

178 775

Thr Asp Asn Asp Ser Lys Glu Ala Ile Leu Lys Thr Asn Gly Thr

10 15 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:71:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:71:

Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Thr Pro Lys Lys Pro

10 15 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:72:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:72:

178 775

135

Phe Val Leu Ala Val Lys Glu Val Glu Thr Leu (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:73:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:73:

Tyr Ala Ile Ser Thr Leu Ile Thr Glu Lys Leu Lys Ala Leu

10 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:74:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (11) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:74

136

178 775

Pro Asn Leu Thr Glu Ile Ser Lys Lys Ile Thr Asp Ser Asn Ala (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:75:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:75

Ala Ser Ala Asn Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Val Val (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:76:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:76

178 775

137

Ser Pro Val Val Ala Glu Thr Pro Lys Lys Pro

10 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:77:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:77

Gly Lys Lys Ile Gin Gin Asn Asn Gly Leu Gly Ala

10 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:78:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI:NR ID.SEKW.:78

Ser Pro Val Val Ala Glu Ser Pro Lys Lys

178 775

0) Ο ί* Ν

Η Φ •Η £ tS5 ΰ -Η

C Ό to nj Λ h

τ c (ί ο Γ. ο +J

Ν Ο •Η φ

Μ Ο

Χ2 ω Ν ο Ν

W (Λ Σ3 C ’ω

Φ -γ4

Ν to fp

<ΰ ΙΟ 44 ω ro co co ro co ca

H4 Austria skóra (EM) E. Aberer

KL10 Rep.czeuh Lricinus J. Jirous

KI11 Rep. Czech l.ricinus J, Jirous

KL5 Rep.Czech l.ricinus J. Jirous

178 775

Ν ω cd Ό tn ctf

O

ω ο ω· Ν Μ φ

Ν

cd <ticd

-Η -ΗΉ

CCC cd cdιϋ

Q QQ

cd <d rd

U O OO

C C £c cd cd cdcd

5-1H t, t-ι hEm

cd -H β O Eh cd •m

178 775

Ν ω cd

Ό tn (tf •Η Ο •Η β

ΗΟ Ο C

Π3 Ο

Ό 2 cd ο cd Q

—j LU CO LU UJ

E E E SE o o o oo

To 75 To 75co cd co co cooi οι ω α> aio m m m mco

CO CO CO COCO

oo

<d cd o o

0) 0) £

N N

CO co co co

ω .o co co CU OJ co co m m co tn

ZJ ZJ cz tzz o o co co

Z3 Z3 cz c 'o 'o

co cd cd cd cd <o rd rd rd rdcd •Η -Η -Η -Η -Η -Η ·Η -Η -ΗΉ oj cd <0 cd rd cd cd^cd cacd

-η υ o oo o ooooo

U -n -r-ι -η το τ-> τη τη τη τη τη tu ca cd cd cd rd rd <0 <0<d cd

N N N N N N N N N N N ωωωωωωωωωωω ojcocomcD^— — o -<— co <— τ— co — „ <.„^T-_T-CJCJ'iCDCflQ

178 775

Ν ω

Φ Ό tr ttf

-Η Ο

-Η 'CD Ο C Ό

Ο

Λ 3

Φ ο

Φ α

ccc ο ο ο ιη ιη ιη

c ο Ε Ε co 04 cn __ c CCCCCCoC

ω 4J ι ω φ & Ν

0) •Η £

Ν

<Μ ο

Φ αί •Η φ 43 Ή

Φ & Ο Ν Ο Ν ω α)

W ω ν >1 ω

Ε Ε Ε Ε Ε Ε 3

ΕΕΕΕΕΕωEEEEEEco njcoracocococuco

ΌΌΌΌΌΌΌ CL

Φ -Η 44

Ν Ό 2

Ν υ Ν ω φ CD

ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ

ΚΙ Ν Ν łJ-p-P-P-łJ-P-P-P ιηωωωωωωω +> 4J ω ω m r^Τ— LT4 CO CO CO 04 Cd -^CD Γ- U4 σ> LT> Tf- Τ-r— -^r->— τ— r— coLno4 cococr>OL004CO<o cD-r-iniDKr-coco CdCJCdCJCUCUCUOJ

178 775

Γ : η Adresy dostarczycieli szczepów i i y . l

Adres dostarczyciela szczepu Adres dostarczyciela szczepu

Dr. G. Stanek	University of Vienna	J. Bunikis Vilmus University
	Hygiene Institute	Lab of Zosmoses
	Kinderspital Gasse 15	P O Box 472
	1095 Wiedeń	232007 Wilno7
	Austria	Litwa uss
ATCC	American Type Culture Collection	Dr. G. Baranton Pasteur Institute
	12301 Parklawn Drive	28 rue du Dr. Roux
	Rockville; MARYLAND	75724 Ced 15 Paryż
	20852-1776	Francja
	Stany Zjednoczone	Ameryki
Dr.J. Jirous	Institute of Hygiene and	Docent S. Bergstrbm University of Umea
	Epidemiology	Department of
	Svobarova 48	Microbiology
	100 42 Praga 10	901 87 UMEA
	Republika Czech	Szwecja
Dr. M. Cinco	University of Trieste	Dr. J.F. Anderson Danderyd Hospital
	Institute of Microbiology	Department of Infections
	Via Flemin 22	Diseses
	Triest	182 88 DANDERY
	Włochy	Szwecja
Dr. V. Preac-Mursic Pettenkofer Institute	Dr. E. Aberer II Department of
	Pettenkoferstr. 9a	Dermatology
	8000 Monachium 2	AIserstraBe 4
	Republika Federalna 1090 Wiedeń
	Niemiec	Austria
Prof. G. Stierstedt	Danderyd Hospital Department of	Dr. J. Hercogova Dermatovenerological
	Infectious Diseases	Clinic
	182 88 DANDERY	Charles University
	Szwecja	Bodimova2 180 81 Praga 8
Dr. R. Ruzic	Institut for Microbiology	Republika Czech
	Zaleska 4 61105 LJUBLJANA	Prof. E. Korenberg The Gamaleya Institute
	Słowenia	Vector Laboratory Gemeleya Strasse 18
Dr. A. Lakos	Central Hospital	123098 Moskwa
	Infect Dis P O Box 29	USSR
	1450 Budapeszt	Dr. O. Peter Institut Central des
	Węgry	Hospitaux Val 1950 Sion
		Szwecja

178 775

Λ

CD CD

G CD

T— CD CD

G CD

<5 CD

G CD

CO CD CD

CMAT

4C N 1-

o

iowany w wnalizi

& o N O N ω

to G N O •H tD O o ε 0 Λ

CO co

co tn

i— CO co

T— CO co

co CD

n~~ co CD

t— CO CD

— co CD

i— CO CD

iklonalnych stos

1 Φ -P CD ctf N O 5-1 <ΰ •N •H O

15C (D CD to -P G CCS to & O λ: N O

o Cd 0) C N o Ή CD O O ε o X!

LO o CD

s

CD LO

OJ CM

CO

▼—* co

CD CO

O CO

CO i—

LO V

przeciwciał monc

Ό 'CD O C nj N £ O 0 -H G m cd >i CD O to CD +> CU c cn co

CD LU

o CO LU

s LU

CD LO LU

ns

co -er UJ

co xr LU

CD OJ LU

CO CO LU

o CU LU

CD ·»— LU

LU

Szereg BBM

o rM rc5 Ή O O 0) N S-l CU

S m m

O G «3 G o Λί O G O

CO co 2 CCI CD

CO CM 2 co co

co 2 co CD

CM m co

— m co

ΊΓ~— CD CD

CD Ί-- 2 co CD

*1“ ZE CD CD

CO 1— ϋ CD

o ΊΤ” H CD

OJ co m CD

T— 2 co CD

178 775 <U £ O λ: to s tn

Φ Ή

N •H <0 c d

X! O c

> o cn O 4J Ul

3t to

S (D tn >1 4-> C Π5 <0 u Ή

Λ d U d C to CU tn S

CMAT

T—

CM

CO

•^r

ud

co

r-

co

CD

01

•Ύ— T“

12

CO τ—

T '

15

16

17

18

CD T~

20

CM

22

23

Srudka

T~

T“

CM

T^-“

T—

CXJ

ΊΓ—

CM

T^-

i—-

CM

co

Podgrupa |

Ί--

T~

T-—

Ύ^-

T“

CM

CO

'CT

M

Ό-

xF

LU

CM

Ύ— UJ ł— LU

CM

•ł—

T“

T~

T”~

T~

T”“

E 19

CM

i—

CM

T~

CM

•V—

CM

T^-

Ύ—

T”

τ—'

M

CO

^r

•M

-M

ΊΓ—

E 29

CM

ΛΤ—

CO

E 43

CM

CO

•M

’ΤΤ

•M

M

ł—

UD

CO

CD

co

CD

CO

CD

co

T~“ LU

T“

TT—

t-“-

T””

T”“

T“

T”“

T—

π—

τ—

T“”

T—

τ—

Τ’”*

T^-

t—

T~

τ—

T”-

T“

T—

E 50

CM

co

CO

co

•M-

M

•^r

CM

T”~

T—

Μ^-

co

UD

T”

T—

E 60

CO

co

UD

co

τ—

CM

UD

CO

CM

UD

E90

CM

Tr—

i—

CO

ΊΓ—

T~

•M

UD

xT

UD

CO

Rep. Strain

IRS

ZS7

SON 188

B31

21347

26815

28354

20047

s

NBS16

20515

~o

ORTH

ACA1

19857

19952

871104

KL5

LITH

co zr

153

H4

NBS23

CMAT

τ—

CM

co

LO

co

CD

10

τ— V—

12

13 I

14

LO —

CD Τ’”·

a

18

19

20

CM

22

23

178 775

Fig. 5

Populacyjna struktura boreliozy z Lyme występowa- pod- grud-ru< nie grupa ka

1111

3112

112 3

1 24

1125

112 6

1127

1218

1219

21 10

3 112

3 213

3 214

4 115

4 116

4 217

4 218

4 219

4 220

4 221

4 222

4 323

Szepy reprezentatywne

IRS

ZS7

SON 188

831 21347

26815 28354

20047

IP90 N0S16 20515

ORTH ACA 1 19857 19952 871104

KL5 LITH ΗΊ3 153 H4 NBS23

Numer

Numer grupy

178 775

Wzorzec reakcji monoklonalnego przeciwciała OspC

Reakcja mocna

Czasami reakcja słaba

178 775

Fig. 7

Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych, różnych genów ospC

Typ RFLP	Typ szczepu	trawione Dpn11	Dde1	Dra1
1	ZS7	639	103,189, 347	258, 381	120,159, 360
2	B31	636	148, 204,284	255, 381	156,480
3	25015	639	287, 352	045,141,453	104, 535
4	297	636	010, 149,206,271	120,135,381	156,480
5	H9	642	284,358	255,387	052,104,486
6	J1	639	284,355	639	052,104,483
7	ORTH	642	287, 355	120,135, 387	642
8	ACA1	639	206,433	032,223,348	052,104,483
9	JSB	642	027, 149,175,287	165,222,255	040,116,213,273
10	E61	639	287,352	255,384	156,483
11	Simon	642	149,206,287	089,553	156,486
12	M57	633	089,176,179,189	253,378	154,222,255
13	W	636	065,086,117,179,189 636	156,480
14	KL10	639	122,235,282	114,261,264	155,484
15	NBSlab	639	235,404	114,120,141,264156,483
16	IP90	639	115,120,404	114,120,141,264156,483
17	BITS	639	101,115,120,303	639	052,104,483
18	PBI	627	627	027,228, 372	052,104,471
19	KL11	627	115,512	005,027,223,372	156,471
20	20047	633	189,444	261,372	025,104,477
21	NBS23a	639	215,424	162,213,262	154,483
22	VS461	633	149,206,278	135,498	104,529
23	VSDA	630	119,160,355	255,375	052,104,474
24	2591	642	281,361	219,423	156,228,258
25	H13	627	189,438	024,213,390	156,471
26	Son188	642	110,240,290	205,437	152,490
27	28691	633	633	255,378	052,104,477
28	21347	633	290, 343	108,132, 393	145,488
29	26815	642	642	083, 559	095, 547
30	28354	642	642	245, 397	095,547
31	19857	639	281,358	275, 382	298,341
32	19952	639	67,197, 375	260, 373	639
33	NBS16	633	090,195, 348	240, 393	150,483
34	153	642	267, 375	120,120, 402	160,482
35	VS116	633	155,200,278	633	633

178 775 ·>

* *

k * *

* * * * * * * * *

-k k *

iD Z

O σι h o u r^ Σ lT) ΓΩ lT) LO CT\ H Ν Ω M te OJ W

X —I KO τ-ł Η CQ r· kDCiU^HWWin uo<x^^>:£3:

ru CQ m r- <

178 775

5 91 TGAGTCTGTTAAAGGGCCTAATCTTACAGAAATAAGTAAAAAAATTACAG

B31 TGAGTCTGTTAAAGGGCCTAATCTTACAGAAATAAGTAAAAAAATTACGG

25015 TGAGTCTGTTAAAGGGCCTAATCTTACAGAAATAAGTAAAAAAATTACAG

OOOOOUOOOU0O0OOOU0

F¹ F F F* F· F< F· F¹ F¹ F¹ F¹ F¹ F¹ F¹ F F¹ F¹ F¹οοοοωυοουουουωοουο ουοοωοουωοουουωυυο □0ΰυ<υΰθ0<<<<<ο<<< υοωοοοωοοουοοωοωοω (i η w w ΰ □ ω d u ο ΰ ϋ ΰ ΰ □ ΰ ο □

FFUUUCJOOOUUUUOFUOO OOUOOOOOOOCIDOOOOOO Ε-· Ε-* Ε^-· Ε—· Ε—· Ε—· Ε—· Ε—· Ε—· Ε—· Ε-« Ε-^ Ε—’ Ε—· Ε-· Ε—· Ε—» υυυοοοοοουυυυοουου E·E-^E-‘E-^,E-^,E-‘E-‘E-^,E-^,E-’E-’F'E-^,E-^,E-·E-·E-·E-^, <<<<<<<<<<<<<<<<<< ουυυοοοοοοοοοωωοοω ffouuoooohhfhhhhhh < CN Ο Ο Γ—I

CQ •’τ ΓwciHkaoruaiHWWtn w ω ο J η ο ΝΝίθΰο<π:^^>Σ3:>ΖΝϊίΗΖ

BITS TGAGTCTGCAAAAGGACCTGATCTTACAGTAATAAGCAAAAAAATTACAG

KL11 TGAATCTGCGAAAGGACCTGATCTTACAGTAATAAGCAAAAAAATTACAG

ΡΒΙ TGAGTCTGCAAAAGGACCTAATCTTACCGTAATAAGCAAAAAAATTACAG

4? 4· 4τ4<·4<·4<· 4r4f 4<·4<· 4f 4r 4r 4r -k -k 4r 4r 4i -k -k -k -k -k -k -k -k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k

178 775

591 AATCTAACGCAGTTGTTCTCGCCGTGAAAGAAGTTGAAACTCTGCTTGCA

B31 ATTCTAATGCGGTTTTACTTGCTGTGAAAGAGGTTGAAGCGTTGCTGTCA

25015 ATTCTAATACGGTTGTGCTAGCTGTAAAAGAAGTTGAAGCTTTGCTTACA

Η E^-* u o u o

OUUUOOHO OOHHHHHH ϋϋϋϋϋυου ΟϋΰϋϋΟϋϋ

Ε-'Ε-’Ε-’Ε-’Ε-’Ε-^Ε-'ΕUUUUUUUU

00000000 <<<<<<<< oooooooo

0O0000O0

00000000

0OO0000O oooooooo OOOOOOOO oooooooo <<<<<<<< HHE-iHHE-iHE-¹000O0O0O E-HHHHE-HH

HHHHHHHO

OOOOOOOO

o o

o o <

Z-H

O X rHt£>

r Γ' Σ h E~*m-^rWCnHOąUCLrHWlOin ^οιοωο<χοη>χ o o o <

o < o aj m nr- <

i^N^OOHWH

OWOHCtWHHH wcDojoimHHia > z η X ι-1 z CQ X cl, + + * + +

4« * * * ·* * * *

* *

-¼ * *

-¼

178 775

000000000000000000000000+ C9OO<<O<<<O<<<<<<<<<<<<<< ουυυυυυυυυυυυυυυυυυυυυυυ+ C9OOOHOOOOOOOOOOOOOOOOOOO >1 <<<<<<<<<O<<<<<<<<<<<<<<

m ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΕ- + “ _ΗΗηΗ<ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗ<<

<« C9OOO<OOOOO<O<OOOOOOO Ο. ΟΟΟ

ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗ + _ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΕ-ΗΗΕ-Ε-ΗΗ + <<<<<<<<<<<O<<<<<<O<<<<< ο υυυυυυυυυυυυυυυυυυυυυυυυ+ ^υ _ΗΗ^ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΟΗΗΗΗΕ-Ε<<<0<<<<<<<<<<<<HUUUUU<< 04 0C9O<OOOO<OOOOOC9OOOUOUC9<<

C9 0 0O0OOOC9OOOOOUO<<<<<<OO

• <<<<0<<0<<<<00<<<0<O0<<<

CD £-4£-4£-4<<<<0000e-0O5-<OOOOC9O<<

_ II1I1IIJJIIIIIIII1<<<II1 , IIIII1IIIIIIII1IIIUUUIII

-*- | I 1 I 1 1 I. 1 I I 1 I I 1 1 1 I I 5— 5— 5— I I I υ<<υυυυυυ<<<υυυυ<υυυυυυυ 0<<OO0OOOUU<C9O0HUO<<<O19O Η<£ζ<0<<Η<<<<<ΗΗ0ΗΗΗΗΗ<<< 0<<<<<<<<<<H<<<H<<UUU<<< O00OOO0<U00HO<OU<O0O0OO0 UUUHHUUUUUUHUHHHHHHHHUUU UUU<<<<UUUUU<UUUUUUUUH<< 0<<O<<<000O0<O0<OO00UO<< HHHHHUHUUHHHHHHHHHHHHHHE-j <<<0<<<O0U0UU<<<OHUUUU<< <OOO00O00<<00<00<0O00O0O <0O<<<<<<0O<O<<<< <<<<<<< E— 5-5— 5— H 5— 5— Η H 5— 5— 5— 5— 5— E— 5— 5- E- H 5-E— 5— 5— H + HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH + HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH + 000OOUU000OO0O0O00U0UUUU

0O0<<<<OOOO0OO0OO0OOOO<<

I Η 5- 5- H U U 5- I 5- 5- Η 5- 5- I HE- I Η Η H 5- ΗH

I < < O H O O < I <<< I < I < U I O < < < OO < < O U O O < I <<< I < I < < I < < < < OO hhhhhhhhhuuh i hhhhhhhhhhh

LO Zr-| r—i «—I O X -4to (ΑηΟΓ'Γ'ΧηΗ^ CD -T rujrninco^H^iiu^HWWtn OsimOJtSJCNCQLJO<Xró^rD>S:

ω η Γ' Ν ν Ο Ο W Ο Η Ct CD Ο J Cl. Z OJ X H §

ω --i ω η ή μ CD I—i 4-3 CD Z. CD X CU

178 775 >1 Ν σι (ΰ (tf •Η υ

Η < 0

0 Η 0 0

Η < 0 <

0 < 0

0 Η < 0

Η Η < 0

0 Η <

π3 c ο kl -Ρ ω ο Ο Ο 0 υ

Ο 0

0 0 <

<

Ηθυ0Ηωοο<οοοοουωω<ζ υ

0 ο

ο ο

0 < Η Ο Ο 0

0 < 0

Η < Η 0 0 0

Ο 0 < 0

Η < Η 0 Ο 0

Ο 0 0 < 0

Ο 0 < Η

0 <

0 < Η Η 0 0 <

< Η Η

0 <

lO Ζ «—<

.-4.-4 Ο X -4 <Ο

CO rιηηιηοοσίΗ^αίυ^ΗωΚιΓ) ΝαοΐΝΝω^Γ_ύθ<π:^ΗΌ^,τ)>Σ ω n r~ <ζ 0\| -^· ο Q 10 Ο Η co m ο >-4 > Z Cs! Ζ §

Ο Η WΗ σι C0 Η ηη

Oj CO 1-4CO

H Z CO ZCu

178 775

0

Ο rtf

(3 C Ο Μ < 0 0 >

* )<

000000000 >

0<000000000000

I <0000000000000 ιη ζ

Γ-i rH Ο — Ή σ>ΗθΓ-Γ'ΣΗΗ< ιη m ω ω η ω αί u η ra CQ

-η m r- <

<NVOOHWH m r- OlOOtHCnCOHr-iM

W W in comojcumn^co ^>Ι3>ΖΜ^Ηζω^:^

178 775 ·>

ίΰ C ο Μ <

0

Ο 0

Π3

0 >

co

178 775 >ί Ν ω

Φ Ό

Cn ctf •Η υ c ο 5-ί -Ρ

OD

* * * * * *

*

-¼

-X υϋϋΰυϋϋΗΟΰοϋΗΟΰϋΰυϋϋΰϋυυ Η Η Η Η Η Ε-· Ε-· Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Ο Η Η Η Η Η Η ;ί<<<<<<<<<<<<<0<<<<<<<<< 5οο<^ϋϋϋϋ(ί<υ0υυςιςϋς^^ϋ<< Ε-« Ε~* Ε—» *=ζ Ε-» »=ζ Ε—· Ε—· Ε—· *=ζ Ε-< Ε-« Ε-· Ε-· Ε-» Ε-* Ε-* Ε-» Ε-· Ε-^ Ε-« Ε-< E-J

OO<<<<<<<<O<O<<<<<<<<H<< O0OOOO0<O00OOOO00OO<<<00 HHHHHHHHOHHHHHHHHHHHEjE-jE-jE-j <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<< 000000000000000000000000 ΗΗ0ΗΗΟΗΗΗΗΗΟΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΟ0 ou<uuu<o<uouuu<oohuuuu<< <<O<<<<<<<<<<<<<<O<<<<UU Ε-' Ε-· Ε-· Ε-· Η Ε-* Ε-¹ Ε-· Ε-· Ε-· Ε-¹ Ε-* Ε-¹ Η Ε-· Ε-¹ Ε-· Ε-¹ Ε-¹ Ε~· Ε-· Ε-· Ε-· Η OHOHHUOUHUUUUUHUUUUUUUHH οι I I I I I I I I 1 I ΙΟ<ϋΗΗ<<<υ)0Ο

Η I I I I I I I 1 I I I IHHHHHHHHHUU

Ol I 1 I 1 I I I I I I IOOOUO<<<OII οι 1 ι ι । I i i i i i I00IOU0U0UII <1 I i II I 1 I I I I ΙΗΗ1<ΗΗΗΗΗΙ I οι ι ι ι ι 1 ι ι ι ι ι IU0IOOO0O0Iι

Ο0Ο00ΟΟ0000ΟΟ00 I Ο Ο Ο Ο Ο Ο 1ι

HHHUUHH<HHHHHHH I Η Η Η Η Η Η II <0<OO<<0OOO<<I I 1 < < Ο < < ο ι1 <O000<0O0OO0<I 1 I < < Ο < < ο ιι

O<O0<O0U<HH0HI 1 1ΟΟΗ0Ο0<Ο U<<<<<<<<UH<<I0IO<I I I I <<

0000000000000 1000 1 I I I I <<

<<<<<<<<<HH<<IHHOI I 1 I I <<

η<^η<<<η<ηη<< I ΗΟΟΟ<ΟΟΟΟΟ

-¼

-¼ ·* ιη ζ ο σι Η Ο > Γ- ΖΗ ιΠ CO U) CO cn I—Iς£)

C4 CQ 04 tto 04 CDCd z H cd O

TO

CO Γ

O O CO O r-H cn m o j cu Z 04 Z H §

H W H

U) Η -Η M m w ,-4 m z m z Cl.

178 775 (ύ β Ο Μ >

00000ΟΟ0Ο0&^Η000ΟΟ0000000

000000000000000^0^^00000 ο

ο ο

ο ω

ο ο

0

Ο 0

0

0 0

0

Ο 0 0

0

0 0 0

0

ο ο

ο *

υ <

<

0

0 < 0 <

rn X <-ι r-l ,-l Ο X rH <0 criHODrSHE-¹^ CD ·σ· ^πιηω^ΗνΰβίυσΊΗ^Μιη

N(DC<t0iNWL10<~:DO>Z3:

ίϋ CD m r- <, ^ΓχΙ'σΟΟ.—lCQr-1 QCQOr-lC^OE-<^-IH wcnojkCiHDca >ZN^HZC2YCd

178 775 ιη <ΰ C O

CD to ttf

0 O 0 < 0 0 0

0

CD ω ro ω

CD ω

CD

KL11 TGAATCATTAGAAAAATTGTCAAAAGCAGCGCAAGCAGCACTAGCTAATT

PBI TAAATCACTAGAAAGCTTGTCAAAAGCAGCGCAAGCAGCATTAACTAATT + + *· k k kkkkkkkk k k k k k k k

178 775

<<<<<<<<<<< υοουουυοοοο

CO cn H< to d o cn n <n co ω o < i to

CQ Γη ω co ui > Σ 2 nj cn c— ίζ (N \r Q CO O ω m o > z cm § O O rH CL CO j ct m n Z

BITS CA

KL11 CA

PBI CA

178 775 • c CD O

--- 4J <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<> oooooooooooooi i j j i j j i i i i ii

FFFFHFFFFFFFFI i i i i i i i i i i ii

OOOOOOOOOOOOOI I I 1 1 1 I I 1 I i iI

OOOOOOOOOOO<OOOOOOOOOOOOOO F। F F¹ F H F¹ Η F F F· F F< F¹ H F F· F< F· F¹ F F E-< E-¹ F F F¹ -> υυυυουοωοοοουο ο'υ ouuouoouou* FFFOFFOOUOOOOOOOOOUOUOUOUO

ouuooooouoooououuouuoooouo^ OOO<OO<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<

FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF-k οουουοοοοοοοοοοοοοοωοοοουο-κ

O<<O<<<<OOOOOOOOOOOOOOOOOO 1 I 1 F l IFHFFFFFFUFFFFOFHFFFF

I I 1 O 1 lOOOOOOUFOOUOOOOOUOOO

I I 1 O 1 IFFFFFFF<<<<<<<<<F<F<

FFFOFFFFFFFFFFFFHFFFFHFE-jFE-! <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<* <<<<<<00000000000000000000 00000000<0<00000000000<000 oooooooooooooooooooooooooo* OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO* FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFHFFFFF^ <<<<<<OOOOOOOOI 1 I I 1 I I I i i i i

OOOOOOOOOOOOOO1 I I I I I 1 I i i ii <<<<<<<<<<<<<<I I I I I I 1 i i i ii <<<<<<<<<<<<<<I I I 1 1 ! I I I I II <<<<<<<<<<<<<<1 I I l 1 I I I I I II <OO<<O<OOOOOOO1 I I I 1 1 I I 1 i ii oooooooooooooooooooooooooo^ OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO*

FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF-* FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFE-jE^E-jE-j-*

FFFFFFFFFFFFFHFFFFFFFFFFFF·*

FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF-* OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO* FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFro m r-i LO Z CO r~ <

_H ^4 o X rH ko <CX)'^'OOrHWr-l 'ΌσιΝΟι^Γ'Σ'~ΐΕ-ι< Cl c~ ΩθΟτ-icncoF’—ii—lO mtDCLOW^HPciuaiHOiWLn 101200^040))-1(-31111-1 €Ν(ΝΗΓχΐ^<Νουο<χοο>Σ:^>ζ^^:ΜΣ:ω^θ4χ

178 775

CJ

>1 N tn

CO

Ό ύ> n?

O

HEHHE-‘HHHE-iHHHEHtHHE-iHE-iE—< οοωοωωοωοοοοωωωοωω υοοοωωοοοοωυυωωωωω 00000<0000<<<<<0<< 000000000000000000 000000000000000000 o < <

E^HHE-<Eh000000<000H<0 E^HHOOOOOOOOUOOOHOO 000000000000000000 Ε-'Ε-'Ε-'Ε-'Ε-’Ε-'Ε-'Ε-'Ε-’Ε-^Ε-^Ε-'Ε-'Ε^Ε-’Ε^Ε-'Ευοοοωουυωοοοοοωοωο ΗΕ-<Ε-<ΗΗΗΗΕ-<ΕηΗΕ-<ΗΗΗΕηΗΕ-Η 00000000000uo<0<00 <<<<<<<<<<<<<<<S<< 000000000000000000 HHHOOOOOOOHHHHHHHH

Ή ιΌ Ζ σ> t—I rH Ο X r-ł

Όσ>ΝθυΓ'ΣΗΕ-ι< ωιηϋυτωσ'ΗοαίυϋΊΗ NMHNKlNmidO<IĆ)

00000

ο ο ο ο ο 0 0 0 Ο Ο +

0 0 0 0*

Ε—* Ε-» Ε-« Ε-* Ε—¹ *

Η Η Ε-· Η Η * ο u ο υ ω *

Η Eh Η ΕΈπ 3<

Ε-< Η Η Ε-< Ε-< *

Ο Ο Ο Ο Ο * ο ο ο ο ο * < < < < <

0 0 0 0*

u ο υ ο ο

0 0 0 <

Ε-< Η Ε Η 0 ο ο υ ο ο*

Η Η Ε-< Ε^ Ε-<*

0 < 00 <<<<<* 0 0 0 00*

Ε-¹ Ε-· Η Ε-·Η r-1 CO r- <

kD <t\vOOHCOrH

Q v r auiOi-icncoE-ir-ii-ico ω ω lo ωχο^ί^ΩπΗΧΧΐ’-ι

178 775

CD CD CD < Η Η Ο CD <<<<<H<<<<<<<<<<<<< οωωουοΗουοωω. υυυουωυ CDCDHHHHHHHHHHHHHHHHH ΗΗΗΗΗΗΗΗΟΟΗΗΟΗΗΗΗΗΗ HHHHHHHHHHHHHE-iHHHHEΰουϋ0ϋΰυ<<υ<<υυυυου u ο υ ου ϋϋϋοόϋϋοοϋϋϋϋο ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗ ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΕ-ΗΗΗΗΗΗΗ ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗ υυυυυυυοοουωοουυυυο <<<<<<<000000000000 Οϋ0ϋϋϋυου0<ϋϋ<ϋϋ<0ϋ <<<<<<<<<<<<<<<<<<< ϋϋϋϋϋϋοϋϋοοϋϋοϋουϋϋ ΗΗΗΗΗΠΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗ ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗ 0000000000000000000

0000000000000000000

Η 0 υ ο Ο ο

Ε- Η ο υ ο ο

Ο Η

ΗΗΗΗΗΗΗΟΟΟ0Η0Ο00000 ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗ ϋϋϋϋϋϋϋϋϋϋϋϋϋουοϋϋϋ HHHHHHHHHHHUHHHHHHH ooououoocdoouououoho 0ϋϋ0ϋϋϋϋθ0ϋϋϋ00θϋϋϋ ΗΕϋΗΕ-<ΗΗ<υϋϋυοΰ0θϋϋ0 HHHHHHHHHHHE-iHHHHHHEoooooocdooooooooouoo <<<<<<<<<<<<<<<<<<< HE-iHE-iHHHE-tHHHHHHE-iHHHEΟ0000Ο0ΟΟ0Ο000ΟΟ00Ε-< HHHHHHHHHHHHHHHHHHE^-· ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗ ΗΗΗΗΗΗΗΟΗΗΗΗΗΗΗΗΟΟΗ

Ο0ΟΟ0Ο0ΟΟ0000000ΟΟ0 HHHHHHHHHHHHHHHHHHH

HHHHHHHUHHHHHHHHHHH ooooooooooooooooooo ΗΗΕ-ιΗΕ-'Ε-'ΗΗΗΕ-ηΕ-’ΕηΕ-’Ε-’ΗΕ-’Ε-'ΗΗ HHE-iHHHHHHHHHHHHE-iHHH <<<<<<<<<<<<<<<<<<<

-X •X •X * •k -k *

* -X -X -K *

*

-k

-¼

-¼ *

-k

-K

-k

-X

-X •X

-X

-X r-ł LO Z cn <—< >-< O kOCiNOrrSH COiOCLimCOCnuLD NWHWt^NWL£]

X

H < m

X U Crt r-i ω

O < x tó) ro m «-i co r- <

CD < C\l O O r-1 W rd 'ΤΓ αωΟΓ-Ησ^υΐΗΓ-ίΗΓΟ ω ιο comoncuccin^a·-) >S2:>x<nXhzxxcux

178 775

+> ω

00000000000000000000000000+ ΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΗΠΟ £ż—* Ε—¹ Ε—< Ε—¹ Ε—* Ε—¹ Ε—> Ε—· Ε—< £—· 5—¹ Ε—¹ 5—‘ Ε-· Ε—' Εξ—' Ε—* Ε^-* Ε~⁴ 5—* Ε—< Ε—· 5—¹ Ε-< Ε—’ 5—' + £-< 5~t 5“· Ε~· 5“· Ε~¹ 5¹ Ε~¹ Ε« Ε~' 5^-4 5“· 5“* Ε⁴ Ε^-4 5“⁴ Ε—< Ε”’ Ε~· Ε“* 5~⁴ Ε~' E^-· Ε“' £—· Ε· + οοωυυοοουωοοουοοοουω ____ _ _Ο0Ο0Ο000Ο00Ο00Ο00ΟΟΟ + Ε~< 5—< Ε-· Ε—« Ε—' Er-· 5—* Ε?-⁴ Eż—⁴ 5—⁴ E?-¹ Ε—⁴ Ε—' Ε—¹ Ε~( Εξ—< 5—⁴ Ε—⁴ Ε—⁴ 5-< Εξ—· Εσ-< Ε—⁴ E~j 5—¹ E-j + <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<* οοοοοοοοοοοωοοοοοοοοοοοοοο* <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<* Ε-·Ε-(Ε4Ε-'Ε-'Ε-(Ε-·Ε-·Ε-·Ε-⁴Ε-<Ε-ιΕ-ιΕ(Ε-(Ε-·Ε-'Ε-·Ε-·Ε-(Ε-'Ε-·Ε-·Ε^ΕΣ5-ί + <<<<<<<<<<<<<<<<00<<<<<<<< Ε—* Ε~* Ε-ι Ε—¹ 5~* 5—* Ε—* Ε~-< 5—· Ε—* 5—¹ Ε~< 5—' 5—* Ε^-< Ε—* Ε—¹ Ε~¹ Ε~¹ 5^-1 5—¹ 5-· Ε^-' 5—⁴ Ε^-1 Ε^--· + υουυυυυουυυοουοοοοουυυυοου+ 5-< Εξ—· 5-· Ε—⁴ Ε-* £—· Εξ—⁴ Ε-< Ε—⁴ Ε—⁴ Ε—⁴ Ε—' Ε—' Ε—⁴ Ε—⁴ Εξ-* Er-· Ε—⁴ Ε-⁴ 5-· £?-( EH Ε—· Er-» Ε—¹ Ε—¹ + r-4 lOΖ

CD τ-4 r-ΙΟ ω σι μ ο Γ' >Σ

Ο L0 Cu L0 CQ CDΗ

04 H 04 KJ 040

X <+ O

Ή 5-( < Q •σ’ ΓCi U σ> H W W lO ζο<χ00>χ^ ro o r04 o o

W o η σι

Q O J Ł Z 04 Z 1-4 §

ω m z

O «Η H ^r+ J—! Z1 m z

H O m 1-4 CU z

178 775

CJ J Μ iji . — 4-' <tf , cn -H

U— ---o oooooouuuuouuuuuuouoouu <UUU<<U<<<U<<<<<<<<<<<< oooooouooooouuoouoouoou HUUUUHUUUUUOUUUUUUUUUUU <<<<<<<<<<O<<<<<<<<<<<< HHHHHHHHHHHHHHH-HHHHHHHH E-l' E-l E-l E-l E-l

OOOOO<OOOOO<O<OOOOOOOOO E—« E-ι E—< E-* E—i E-i E-* E-^ E—· E—* £-» E-ł E-* E-/ E-i £-* E—i E—’ £—' £-< E—' E—' Ξ—<

ΠΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΟΗΗΗΗ

<<<<<O<<O<<<<OO<<<O<OO< UHHH<<<<UUUUHUUH<UUUUUU II1II1IIIIIII1IIIII<<<1 lllllllllllllililllUOOI IIIII1II11II11IIIIIHHH1 <O<<OOUUOO<<<OUUO<OOOOU OO<<OOOOOOUO<OUOHUO<<<U HH<<<U<<H<<<<<HHUHHHHH< <U<<<<<<<<<<H<<<H<<UOO< <UUUUUUU<UUUHU<UO<UUUUU OUUUHHUUOOUUHOHHHHHHHHU UUUU<<<<OOOOO<UUUOOUUUH UU<<U<<<UUOUU<UU<UUUUUU UHHHHHUHUOHHHHHHHHHHHHH <<<<U<<<UUOUOU<<<UHOUUU U<UUUUUUUU<<UU<UU<UUUUU <<uu<<<<<<uu<u<<<<<<<<< HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHE-i HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH UUUUUUUOUUUUUUUUUUUUUUO UUUU<<<<UUUUUUUUUUUUUUU I 1HHHHOUH1HHHHHIHH1HHHH 1 1<<UHUU<I<<<1<1<U1U<<< 1 1 < < U U U U < I <<< 1 < I << I <<<< E^HHHHHHHHHUOH l HHHHHHHHH r-1 lDZ

ΟΊ rH rHO

Μ N Η Μ N N w□

X T-Η kD η < co τ r·ci υ σ> h w w in Ο<ςγοο>ς:2:

roco co c-<

< C\J T O O r—1W

Q ca O r—i σι wH w m o cu mh > z n k: h z□

KL11 TGGTACTTTAGATAACGAAGC---AAATCGAAACGAATCATTGATAGCAG FBI T G GTACT T TAGATAACGAAG C---AAAT CGAAACG AAT CAT T GAT AG CAG HI 3 T---GGTTTGGGTAACGAAGC---GGATAG7XAACACCTCATTGTTAGCAG

178 775

CJ

CO

CX1 ro £ O s-i +> ω tP

Ή O

0 H

H < 0

O 0 H

O 0 Eh <

0 Eh <

0 E< 0

E-< < 0

Eh

UO<OOO<0OUO<0<U<OO0<<5^UOO EhHEhEhEhEhHEhE-<HEhEhEhEhEhEhEhEhEhEhEhEhEhEhE^Eh giiggggggiggggigggiggggggg FHbbHhbhhEHbhbbhHHHHbhHHHbh 0O0OEhEhOQOOOOUUOOOOOOOO00QO oquoo<ooooqoooo00Eh gggggisggggggiggig £-< £-4 £-4 £-< £-i f-1 f-ι E-· Eh E-· E-· Η Eh E-* Eh E-· E^-* E—¹ Eh

OHOOOHOOU<OUOU00OO<

< O 0

O < H U 0 0 < 0

O 0

0 o u o

Eh U rH X Z rH

CD <—i rH o X r-ιO θσλθ3θΓ'Γ~Χ·-ιΕ-4<Ω

O'ĄŁil0(Z)^h^ZUUhKW

N C\’ Η N N N M □ O < Z Z O >

roX co r- < fj^cu^oo·—)0>—i r- Q w O r-1 σι w H h h ć) lT) co X o X x Ω H-1 z ta H vs>zcNXnzmxxx

178 775

ο<οοοοοοοοοοοοουοοοοοοοοου

OOOHOOOOOOOOOOO^OOOOOOUUOO rn tn (Ο (0 (Τ Ο Ο η W η 19 U (9 ω ID D ID ϋ 0 ΰ ϋ 0 υ ϋ o 0 *

0000000000000000000 0'000000* rn rn rn rn rn CD 0 0 0 W 0 0 0 0 O 0 0 O 0 0 0 0 Ο Ο Ο Ο *

<—i li) Z rH

Ch ,-| r-ł O Z t-i to tOCLNOC'r'XHri< CD Γ' aiOŁinwGiHO + ucLHWWin

ΝΜΗΝΝ(ΝΜΙΪ1Ο<Σηη>Σ ω co r<ζ OJ <r OO

Q 0 O r-Ιcn ω CD O Z)Oj > Z OJ ZM

178 775

CD i i i cd

CD CD O

H O <j c o 5-1 P ω

CD

CD co

CD <

CD < H CD CD

CD

O < U

CD H CD

CD

OJ

CD CD CD O

H <

u CD < CD < CD CD H < O cd

CD <

co

O < U i CD H CD <

CD CD

O CD CD CD H U CD

CD

U H CD cd

CD CD H < CD

H CD

CD &CD

CD CD Η CD co

CD < O O O

U < O CD

O CD H <

CD < U cd

CQ

CO cd co

CD CD

U U iiilf1g

----------_{o o} ra

CO m

CD cd co co

U CD < CD <

CD CD < O ω cd cd

178 775

>1 Ν Φ

Φ to ο ctf Ή Ο

ουοουοοοοοοοοοοοουυοοοοοου-* 000190000000000000000000000-*

O0O000OUHO0U0H0000OU0000OO ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΟΗΗΗΗΗΗΟ <<<<<<<<<<<<<<<O<<<<<<<<<< <<00<<000o<<oooo<<o<<<o^<0 Η Ε-¹ Π¹ Η। < Ε-1 < Η Ε-· Η < Η Η¹ Η Η Η Ε-· < Η Η Η Η Η Ε-¹ Η Ε-* <οο<<<<<<<^ο<ο<<<<<<<<η<<η OO000OO0<0O0O0OOO0OO<<<000 <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<-* 00000000000000000000000000-*

ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗ-*

ΗΟΗΟΗΗΟΟΟΗΟΟΟΟΟΗΟΟΟΟΟΟΟΗΗΗ JO! 1 ! I 1 I I I I I I IO<OHH<<<OOO0

I Η I I I 1 I I I I I I I ΙΗΗΗΗΗΗΗΗΗΟΟΟ

ΙΟΙ I I I 1 I I I i I I IOO0OU<<<O1 1 I

101 1 I I I I 1 I I I I 10010000001)1

I < I I I I I I I I 1 I I IHHI<HHHHHI I 1

101 I I I I I II 1 I I IO0I00OOOOI1I

O00O0000O00OO0OO100OOOO! I I HHHHOOHH<HHHHHHHIHHHHHHI I l

rH ιΌZ

ΟΛ <—1 r—|O kD^NOrr-zH romcuinmchH^

NMHMtOMWLJ

H < cA O CD O < X

OJ rHCO <CM

CJ v r QCQ r-i CO (Z) LO wCO o o > z z >z

CD

C'<

O O «—) CO r—I

O Η Ul W H r-1 H CO O XI CD CO H X CD r-1 CMZl-iZCOZCDZ

178 775

-X

-¼ *

-X

-X * -X *

<—I lO Z σι H rH O X 'oa\NOr-rzHF-i< roiDCuifiWcnHkOiiU^H NNHNts)NWaO<ZO

GJ ΓΩ ^4 nr- <

<D ^OJ-^OOHWH

O v r QCOOrHcncQF<-ił-in ωωη comoxcucQt-<XiD»-i ο>Σ2:>2:ο4ΧΡΗζωχχχ

178 775

C O μ +j ω

N w rO U

O pS

Ή O

Ε- Η Ε- Ε- Η Ε-EΕ- Ε- Ε- Ε- Ε- Ε-EΗ Η E- U Η E-U

U O O O O UU < < < 0 <<

Ε- H < < < <<

Η Η Η H U E- Ευ U U O H UU

O 0 < < < <<

E- E- U U U UU < < 0 E- 0 0E0 0 0 0 0 00 i O U U 1 E-ι E- E- E- E- E-h Ευ U O U U UU

O 0 0 O 0O < < 0 < 0 <<

U U U U U UU

0 0 0 0 00

E- Ε- E- E- E- E- E-*

r-H Li)Z

W Η HO

O CL N O r Γ~ ΣH oinajincocriHco MtNHMNWWC!

Η ΕΗ Η E-

E- E- E0 0 0 E- E- H E- E- EE- E- U 0 0 O 0 0 <

O 0 O

Ε- Ε- E-* 0 0 0 < < < U U U Ε- Η E-

E- Ε- EE- Ε- Ε- E-

E- Ε- E-

E- U U U O U

< 0 < Η H O

Ο EX r-i

Ε- < Ω cc u cn r-i ω ω in o<xofr)>ss raCu co r-<

< C\J O O rHCO

Q W O H cl ωE+ co x o x x mh > Z <N X H ZCO

KL11 TGAATCATTAGAAA7UXTTGTCAAAAGCAGCGCAAGCAGCACTAGCTAATT

PBI ^rn\AATCACTAGAAAGCTTGTCAAAAGCAGCGCAAGCAGCATTAACTAATT

HI 3 TGAATCAGTAG7VXAGCTTGGC7WXAGCAGCGCAAGCAGCACTAGCT7XATT k -k -k k k kkkkkkkk k k k k k k

178 775

c

Η Η Η Ε-« Ε-< Ε-¹ Η Ε-< Ε-¹ Η Ε-¹ Η Ε-1 Ε-¹ Ε-। Ε-< Ε-¹ Ε-< Ε-<

ο ω ο ο ο υοωο οουυοοοο ου

ΟΛ »—I <-( Ο Ζ <-Η VO <Cg^rOO<-lW>-H

CO r- OMOHcnwbH ω λ Oj lq ci ω h tD cc u o η ω ci ιΏ ωωο,-ίευωι-ΐ)-!

6Ν<?^ι-ΐ€Ν(χΐηωωθ<ζ@)Υ)>Σ2:>ζοΝΖΜΖΩΧ

PBI CA

HI 3 CAGTTCAAGAGCTTACAAGCCCTGTTGTGGCAGAAACTCCAAAAAAACCTTAA + -k -k -k -k -k -k -k ~k -k -k -k -k -k -k ~k -k -k ~k -k -k k -k k -k kkkkkkkkkkkkkkkk

178 775

591 CmJSGKIXJNT-SANSADESVKGPNLTEISKKITESNAVVIJU/KEVETLLASIDEVAKKAIGNLI

B31 CNNSGKDGNT-SANSADESVKGPNLTEISKKITDSNAVLLAVKEVEALLSSIDEIAAKAIGKKI

25015 CNNSGKDGNAASTNPAOESVKGPNLTEISKKITDSNTWLAVKEVEALLTSIDELATKA1GKKI

qqqqqqqqq HHHHHHHHH WWCQ(/)WWWWW

ooooooooo MHHł-lł-iMMHM ωωωωωωυωω EEEEEEEEE D t-J ·—1 t-9 i-i tJ >—1 ►—1 zzzzzzzzz ibOiDaOjCuCbdiiLCU 000000000

ωιοωωωιοωωω υωωυωωυωω QQQQQQQaQ

WWDuDjOjOjCuDjDj

HE-iWWWWWWM 2221QQQQQQQ S00000OO0 QOO00O00

000000000 000000000

ωωωωωωωωω QQQ0QQQQQ F-II-I > > F-I Μ >—I H FI WWWWWCOWWW 000000000 F-I I—I »—1 I—I FH r—1 L] »—1 >—1

000000000 QQQQQQQQQ EhUHHHHHHE^-1HHHHHHHHH

000000000 F-1 H FIMF-1 Η Η Η H
> ω	> ω	ω ω	> ω >
H FH	E- E-<	Eh M	Eh FH Eh
		►-4 I-I	El »-l J
Z Z	O Z	Z Z	Q Z Q
CU CL,	CU CU	CU CU	CU cu CU
O O	O 0	O 0	0 O 0
22	22	>2	222
0 0	0 0	0 0	0 0 0
ω o	ω o	W ŁJ	ω ω ca
Q Q	Q Q	Q Q t I	q q a i i i
1 1 Cu Cu	1 1 CU CU	I 1 cu cu	1 1 1 cu cu cu
z z	z z	Z Z	Z z z
E- E-	E- Eh	Eh Eh	EHE
2222	22	222
Eh E-	Eh H	Eh Eh	0 Eh 0
Q Q	Q Q	Q Q	Q Q Q
O 0 1 1	0 0 1 1	0 O 1 1	O O 0 1 1 1
1 1 o o	1 l o o	1 1 o o	1 1 1 o o o
0 0	0 0	0 0	0 0 o
Z Z	z z	z Z	z z z
z z o o	z z u u	z z o u	z z z o O U

gc\l TT O O H W O O >-i en o H o o m o cu m fh Σ2:>ζν^ηζο

KL11 CNNSG--GDTASTNP-DESAKGPDLTVISKKITDSNAWLWKEVEALLSSIDELS-KAIGKKI

PBI CNNSG--GDSASTNP-DESAKGPNLTVISKKITDSNAFLLAVKEVEALLSSIDELS-KAIGKKI * + + *+ k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k

178 775

5 91 AQN-GLNAGANQ-NGSLLAGAYVISTLIAEKLDGL-KNSEELKEKIEDAKKCNKAFTDKLKSSH B31 HQNNGLDTENNH-NGSLLAGAYMSTLIKQKLDGL-KN-EGLKEKID?AKKCSETrTNKLKEKH 25015 HQNNGLDTENNH-NGSLU\GAYAISTLITQKLGGL-KN-EELKEKIAAWKCSEEFTNKLKSSH

οωοωωωωοωωωοοοωοοο ωοωωουοωωωωωωωωωωω CO CO Z I COCQCQZłZZCOZCOZZD-<iZCU

z zi z z z z Z z z Z Z z z z z z Z Z E-iE-iZZZZFi.ZZZZZZZr^-1<<< ωωωωωωωωωωωωωωωωωω

Z Z z z z z z z z z z z z z z z z z ZOOOOlZUOOOCOOHtZHHE-

< 9

X i m r- <

O X H to CM -<τ O O <—1 r- r- X r-H E-< < CQ ·ν r- Q η O h o « woHUccucnrHwcfiin comozcuco [θ(Ν(Ζ)ωο<Χ’η>^ΓΌ>Ζ3:>Σ:(ΝΧ>ΗΖ

BITS DRNNGLAVEANF-NTSLLAGAYTISTLITKKLDELIKNSGELKGEVEKAKNCSEAFTNKLKEKT KL11 RNDGTLDNEAN-RNESLIAGAYEISKLITQKLSVL--NSEELKEKIKEAKDCSEKETTKLRDSH PBI KNDGTLDNE?J4-RNESLIAGAYEISKLITQKLSVL--NSEELKEKIKE?J<DCSQKFTT}<LKDSH

178 775

591 AELGIAN~GAASDANAKAAILKTNGT-KDKGAQELEKLFESVKNLSKAAQETLNNS

B31 TDLGKEG---VTDADAKEAILKTNGT-KTKGAEELGKLFESVEVLSKAAKEMLANS

5015 TELGKQD---AQDDDAKKAILRTHNT-KDKGAEELDKLFKPVENLSKAAKEMLSNS ωωωωωωωωωωωωωωωωωω

ωωωωωωωΜωωωωωωωωιησ) οωωωωχχχωχωωχωχωχχ (ΛΐηΙΟυίΜΟ-ιίχιίυίυΗιΙΟΜϋ-ιΐΛΐΗιΜ,ΙΐΗΐ

ο q ι ι ι ι ί ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι < I HQFQFQFFFFQf-lQFHn

η co co ω

Oj co ω co

BITS QELAVAA-GAATDI DAKKAILimRD-KDLGADELGKLFKSVESLSKAAQEA^

KL11 AELGIQN---VQDDNAKRAILKTHGN-KDKGAKELKELSESLEKLSKAAQAALANS

PBI AELGIQS---VQDDNAKKAILKTHGT-KDKGAKELEELFKSLESLSKAAQAALTNS

178 775

178 775 ui

Ο

ΕUJ o Ul

Ul y:

ui ω

ui ui

Ul

Ul pi ci

Q

Ul

Ul cUJ £

e— tu

E— ω E-< Ul UJ

1.1 UJ

UJ Uj Ul Ul UJ

Ul Ul UJ

r.l

UJ

Ul Ul Ul

Ul Ul UJ

UJ £ Ul ui ui

Si

U)

υ.

Ul ta ui u l ui

Ul ui Ul f.)

I UJ I I § § ś ś

I I I I Ul Ul’Ul Ul > UJ UJ UJ

UJ ui l—I u

Ul UJ U)

UJ tul

Ul

1.1 Ul

I UJ z )

Ul UJ UJ

X Ul Ul w UJ

Ul ui UJ UJ

U) Ul Ul o

Ul

Ul Ul UJ

Ul iri H-l

Ul UJ (.1 UJ

UJ Ul

Cl,

Ul

Ul ul

UJ

Ul

UJ tli

Ul ) s· UJ

-Ί

Ul uj

Ul

UJ

O

O ca ta

Ul

UJ o

CD uj

-1 H UJ

-1 UJ

UJ

U)

UJ Ul

UJ «!

cUJ

UJ

Ul UJ UJ

Ul

UJ

Ul

UJ

I .9 UJ

xn

Ul

UJ

O <

ri.

Ul

UJ

U)

Ol

UJ

U)

I

Ul

Ul EUJ

Ul UJ

UJ Ul Ul

Ul E— UJ s

ul Ul

UJ

Ul

CT

UJ .-1

Ul cUJ I-I

E-i UJ I—I Ul

U)

U) UJ ui

UJ UJ cd

5555555

UJ

-1 UJ Ul

Ul UJ

-1 UJ U)

UJ

O rt ci

Ol 9

UJ

N (N H OJ ν Ν ω LI o < t o o > z U i a .-1

UJ ca

Ul o. UJ

Ul

UJ

Ul

Oj

Ul

UJ

f.l e—

Ul

UJ cf o

Ol

Ul Ul UJ UJ

Ul ta

Ul

Ul ca Ul

Ul *

UJ CD UJ

UJ

F· Ul

Pt. UJ ci, U)

Pi. UJ

Ul

U) UJ

Ul E-< UJ I—I

UJ

-1 Ul

Ul

Ul *

Ul ta

Ul -X

Ul

Ul * UJ

UJ

Ul

Ul UJ

UJ UJ UJ L-

U) ui rrm

U) Γ-<

rt‘ OJ O O U)r-l

O UJ O t-ι ot U) E- <-H I-ICl

UJ CD O Ul ŁYi ft) I-I Ul mr-l > z oj y h z ffl x cut:

178 775

Fig.11

Rodzina OspC i typy szczepów
Rodzina OspC	Przedstawiciele
1	ZS7
2	B31
3	297
4	H9
5	Orth
6	ACA1
7	JSB
8	E61
9	M57
10	W
11	KL10
12	B)TS
13	KL11
14	20047
15	NBS23a
16	VS461
17	VSDA
18	2591
19	H13
20	28691

178 775

<ο rl S-l <ύ u d H S4 rC O <D C O N υ o c Tl

0)

N

0) G O N O o c Tl Φ isi <u c o N υ o c Tl

Φ

N

>1 X!

U o .M s

H11 3.2.13 5 7 04 skóra Austria

Orth 3 2.13 5 7 04 l.ricinus Austria

178 775

ο 0) e 0)

-Η Z cO c <0 5-1 <D

Ό 0) Cm

OJ Λί ω CD N U (0 cn co Ai cn 05 N o cO C cO SM CD Ό

CD fa

> Im cn OT 5 <0 λ:

-H

Λ S

Cb <D tó <0 υ CD E N OT cO +> Ή PI

CO co O ffj cO

Im <0 U cO O N OT

6-t Π

U O PM 3 .-MOJ XM SE CKD <DH cO £ cO Q

178 775

Fig.13

Częstość występowania epitetów OspC w badanych 77 szczepach testowanych testem błonowym ELISA z zastosowaniem monoklonalnycj przeciwciał BBM

Numer BBM	Numer reakcji	Sekwencja pierwotnego epitetu

BBM 22'	14	VKLS[ESVASL]SKAA
BBM 24’	2
BBM 25	2
BBM 27	2
BBM 28	29	TDNDS[KEAIL]KTNGT
BBM 29	41	ΚΕίηβρννΑΕηρκκρ
BBM 34	37	F[VLAVKEVET\|L
BBM 35*	17	YA[ISTLlTEKLK]AL
BBM 36*	12
BBM 37	47	PNLTE[ISKKIJTDSNA
BBM 38	4	TDNDSKEAIL
BBM 39*	4	TDNDS[KEAIL]KTNGT
BBM 40*	23	ASAN[SVKELT]SPW
BBM 41’	2
BBM 42	49	S[PWAETPKK]P
BBM 43*	32	SPWAESPKK
BBM 44*	9	GK{KIQQNNGL]GA
BBM 45	66	S[PWAETPKK]P
BBM 46*	1
BBM 47*	21
BBM 48	6
BBM 49*	9
BBM 75	3
BBM 76	3
BBM 77*	3

* oznacza monoklonalne przeciwciała ostatecznie stosowane w analizie serovar

II. Podział przeciwciał monoklonalnych w kategorii według częstości ich występowania

Numer BBM

Numer reakcji niski 0-10

Numer reakcji średni 10-24

Numer reakcji wysoki >25

Częstość | 13 | 5

7

178 775

Fig.U

Umiejscowienie zmapowanych epitetów OspC na ogólnej mapie białka OspC

Zakończenie Zakończenie

Numer peptydu

1- 203 ® Reakcja McAb

178 775

Fig.15

Krzyżowa ochrona pomiędzy białkami OspC z różnych rodzin OspC

Doświad-	Test antygenu OspC	Numer zakażony/testowany
ozenie
	Rodziny		Test im-	Immuniza-	Nieim-
	OspC	Źródło	munizacj i	^^azOrth	munizo-
		^z OspC	OspCa	wanie
A	1	ZH7	10/10	1/10	10/10
B	5	H7	0/10	0/10	10/10
C	7	PKO	10/10	2/10	9/10
D	10	Wb	9/10	5/10	10/10

Q Rodzina 5 OspC b Z wodorotlenkiem aluminium jako adjuwantu i nie miareczkowane tak jak w doświadczeniu A-C

178 775

Fig.16

Podsumowanie informacji z typowania i częstość występowania specyficznych przeciwciał OspC w odpowiedzi humoralnej u człowieka

Rodzina Genotyp

OspC	OspC	OspC Serovar	Numer s z cz epu	Numer izolatu ludzkiego	Szczep stowany w badaniu częstości	0/ , *. ^/0 częstości
1	1	1	5	1	ZS7	6
2	2	2	9	5	B31 (IP2)	12
2	3	2	1	-
3	4	-	1	1	297	6
4	5	3	4	4	H5	29
4	6	3	1	-
5	7	4	4	3	ORTH	35
6	8	5	4	3	H14	12
6	8	6	1	1	H15	29
6	8	N.R.	1	1
7	9	7	5	3	JSB	18
8	10	8	1	1	E61	12
8	11	9	1	1
9	12	10	3	1	M57	6
10	13	11	2	2	W	0
11	14	12	2	-	KL10	0
11	15	13	3	1	NSBIab	0
12	17	N.R.	2	1	BITS	0
13	18		2	1	KL11	6
13	19	N.R.	4	1
14	20	14	4	1	20047	12
15	21	15	2	2
16	22	16	4	3	VS461	6
17	23	N.R.	1	1
18	24		1	-	H8	0
19	25	N.R.	2	2
20	26	16	1	-

całkowita ilość pozytywnej OspC sera=17 N.R. - brak reakcji

178 775

Fig.17

Plazmid pPC - PP4

ClaI23

Sali 3553

178 775

Fig. 18

An^gen

Adjuwnt

Stosowany szczep

Stosowana dawka

Zainfekowany/ testowany

OspC	Titermax	Orth	1x10⁴	2/10
OspC/ P. pastoris	Titermax	Orth	1x10^	0/10
Bez antygenu	Titermax	Orth	1x10⁴	9/10

178 775

Fig.19

Φ* +> ω

Ή Ο 3ϊ Μ t φ Ν kt CL >ι £ Ο kl 44 υ ο >1 X! Ο ki Ο Λ

Ο φ -Η

Φ kl kl Ο 32

Φ 44 4J Φ“ kl 44 £ Ό β Ο φ c φ 3 ο υ φ kl CL ο υ CL ω Ο

Ή 44 Φ Ο

Η CL Φ Ν υ Ν ω

-μ Φ ki Φ Ol Φ ki CL

Ό Φ rM 44 >. Ν kl CL

Ή ε φ CL 2 ki Cn

2 ε φ c ο

Ν φ· C Φ Ν Φ •Η

Ν

Φ 44

Φ

Η £ ο ιΜ Ν Ο

Φ* 42

Ο ki Ο 44

Ο

Ό

C Ο

Φ

Szczepionka przeciwko grup;. HDA (CMATs 17; 18; 20 & 22) krętka Borrelia garinii sp. nov.	_______Rodzina 9	Rodzina 10	________Rodzina 11	Rodzina 12	Rodzina 13	Rodzina 14	________Ro d z ina 17	Rodzina 19
Szczepionka przeciwko klonowi \| HDA (CMAT 13) krętka Borrelia afzelii	Rodziną 4	Rodzina 5	Rodzina θ	Rodzina 7	Rodziną θ	__________Rodzina 16_________
Szczepionka przeciwko klonowi HDA (CMAT 4) krętka Borrelia burgdorferi sensu stricto	Rodzina 2	Rodzina 3	Rodzina 30

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł

178 775

Claims

Zastrzeżenia patentowe

(1) VKLSESVASLSKAA;

1. Kompozycja immunogenna, znamienna tym, że zawiera:

(a) pewną ilość materiału zawierającego: (i) dwa lub więcej antygenów OspC oczyszczonych z krętka Borrelia choroby z Lyme z każdej z 20 rodzin OspC, przedstawionych na fig 11, lub (u) dwa lub więcej antygenów OspC oczyszczonych z krętka Borrelia choroby z Lyme z rodzin OspC przedstawionych na fig. 19, które ulegają ekspresji w jednym lub więcej klonach lub grupach klonów związanych z chorobami człowieka (HD A), lub (m) warianty OspC lub mimetyki OspC tych antygenów OspC, przy czym te warianty OspC lub mimetyki OspC mają strukturę dostatecznie podobną do struktury natywnego OspC dla pobudzenia ochronnej odpowiedzi immunologicznej, a ilość ta jest wystarczająca do wywołania u ssaka narażonego na borehozę z Lyme, odpowiedzi immunologicznej na poziomie zabezpieczającym przed borelioząz Lyme i jest rzędu od 1 do 100 mikrogramów na antygen na dawkę;

oraz (b) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
(2) TDNDSKEAILKTNGT;

2 Kompozycja immunogenna według zastrz. 1 dostosowaniaw Ameryce Północnej, znamienna tym, ze zawiera:

(a) pewną ilość materiału zawierającego (i) jeden lub więcej antygenów OspC oczyszczonych z krętka Borrelia choroby z Lyme z rodzin OspC 2 i 3, lub (ii) warianty OspC lub mimetyki OspC tych antygenów OspC, przy czym te warianty OspC lub mimetyki OspC mająstrukturę dostatecznie podobną do struktury natywnego OspC dla pobudzenia ochronnej odpowiedzi immunologicznej, a ilość ta jest wystarczająca do wywołania, u ssaka narażonego na boreliozę z Lyme, odpowiedzi immunologicznej na poziomie zabezpieczającym przed borelioząz Lyme;

oraz (b) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
(3) KELTSPWAETPKKP;

3. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1 albo zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera dodatkowo antygen Osp A z B. burgdorfen B31.
(4) PVLAVKEVETL;

4. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1 do stosowania w Europie, znamienna tym, ze zawiera:

(a) pewnąilość materiału zawierającego (i) jeden lub więcej antygenów OspC oczyszczonych z krętka Borrelia choroby z Lyme z rodzin OspC 2, 4-7, 9, 10, 12-17 i 19 lub (ii) warianty OspC lub mimetyki OspC tych antygenów OspC, przy czym te warianty OspC lub mimetyki OspC mają strukturę dostatecznie podobną do struktury natywnego OspC dla pobudzenia ochronnej odpowiedzi immunologicznej, a ilość ta jest wystarczająca do wywołania, u ssaka narażonego na boreliozę z Lyme, odpowiedzi immunologicznej na poziomie zabezpieczającym przed borehozą z Lyme;

oraz (b) fizjologicznie dopuszczalnązaróbkę.
(5) YAISTLITEKLKAL;

5. Kompozycja immunogenna według zastrz. 4 do stosowania w Austrii, znamienna tym, że zawiera:

(a) pewnąilość materiału zawierającego (i) jeden lub więcej antygenów OspC oczyszczonych z krętka Borrelia choroby z Lyme zrodzin OspC 2,4-7, 10,13119 lub (ii) warianty OspC lub mimetyki OspC tych antygenów OspC, przy czym te warianty OspC lub mimetyki OspC mają strukturę dostatecznie podobną do struktury natywnego OspC dla pobudzenia ochronnej odpowiedzi immunologicznej, a ilość ta jest wystarczająca do wywołania, u ssaka narażonego na bo

178 775 rehozę z Lyme, odpowiedzi immunologicznej na poziomie zabezpieczającym przed borehozą z Lyme;

oraz (b) fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
(6) PNLTEISKKITDSNA,

6. kompozycja immunogenna według zastrz. 4 albo zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera antygeny wybrane spośród antygenów OspA szczepów krętka Borrelia B31, Orth, H4 i KL11.
(7) ASANSVKELTSPW;

7. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera antygeny z punktu (i) lub (u) lub (iii) oczyszczone z całych komórek krętka Borrelia.
(8) SPWAETPKKP;

8 Kompozycja immunogenna według zastrz 1, znamienna tym, że zawiera antygeny z punktu (i) lub (ii) lub (iii) wytworzone technikami rekombinacyjnymi w gospodarzu eukariotycznym i z niego oczyszczone.
(9) GKKIQQNNGLGA; i (10) SPWAESPKK, lub warianty lub mimetyki tych epitopów, o strukturze dostatecznie podobnej do struktury epitopu natywnego dla pobudzenia ochronnej odpowiedzi immunologicznej.

9. Kompozycja immunogenna według zastrz. 8, znamienna tym, że gospodarza stanowią drożdże.
10. Kompozycja immunogenna według zastrz. 9, znamienna tym, że gospodarza stanowi P. pastons.
11. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1, znamienna tym, że antygeny zawierają jeden lub więcej epitopów o sekwencji aminokwasowej dobranej z grupy, do którego należą.
12 Kompozycja immunogenna według zastrz. 11, znamienna tym, ze reprezentowany jest każdy z epitopów od (1) do (10).
13. Kompozycja immunogenna według zastrz. 11 albo zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera ponadto adjuwant.
14. Kompozycja immunogenna według zastrz. 13, znamienna tym, że jako adjuwant zawiera wodorotlenek glinowy.
15. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1, znamienna tym, że wspomniana ilość zabezpieczająca wynosi od 10 do 50 pg na antygen na dawkę.
16. Rekombinacyjna sekwencja DNA, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową dowolnej sekwencji genu OspC ze szczepów 28691, 25015, SZ7, 297, SIMON, E61, ACA1, H9, Jl, VS461, M57, W, VSDA, NBS przedstawionych na fig. 8a.
17. Rekombinacyjna sekwencja DNA kodująca antygeny OspC ze szczepów 28691, 25015, SZ7,297, SIMON, E61, ACA1, H9, Jl, VS461, M57, W, VSDA, NBS przedstawionych na fig 9a.
18. Rekombinacyjna sekwencja DNA według zastrz. 16, znamienna tym, że jest homologiczna w co najmniej 80% do jednej z sekwencji genu OspC z fig. 8a.
19. Rekombinacyjny wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kodującą antygen OspC dowolnej z 20 rodzin OspC przedstawionych na fig. 11
20. Rekombinacyjny wektor ekspresyjny według zastrz. 19, znamienna tym, że zawiera rekombmacyjną sekwencję DNA, która:

i) zawiera sekwencję nukleotydową dowolnej sekwencji genu OspC ze szczepów 28691, 25015, SZ7, 297, SIMON, E61, ACA1, H9, Jl, VS461, M57, W, VSDA, NBS przedstawionych na fig. 8a, albo

178 775

π) koduje antygeny OspC ze szczepów 28691,25015, SZ7,297, SIMON, E61, ACA1, H9, Jl, VS461, M57, W, VSDA, BS przedstawionych na fig. 9a, albo ni) jest homologiczna w co najmniej 80% do jednej z sekwencji genu OspC z fig 8a.
21. Wektor ekspresyjny według zastrz. 19 albo zastrz. 20, znamienny tym, że stanowi wektor wahadłowy dla eukanotycznych/prokariotycznych komórek gospodarzy.
22. Wektor ekspresyjny według zastrz. 21, znamienny tym, że ulega replikacji w drożdżach, korzystnie w P. pastoris, i w E. coli.
23. Wektor ekspresyjny według zastrz 19, znamienny tym, że ekspresja genu OspC pozostaje pod kontrolą transkrypcyjną promotora, który może ulegać indukcji.
24. Wektor ekspresyjny według zastrz. 23, znamienny tym, że ekspresja sekwencji kodującej OspC jest indukowana przez metanol.
25. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym zawierającym:

a) sekwencję kodującą antygen OspC dowolnej z 20 rodzin OspC przedstawionych na fig. 11, albo

b) rekombinacyjną sekwencję DNA, która:

i) zawiera sekwencję nukleotydowądowolnej sekwencji genu OspC ze szczepów 28691, 25015, SZ7,297, SIMON, E61, ACA1, H9, Jl, VS461, M57, W, VSDA, NBS przedstawionych na fig. 8a, albo

n) koduje antygeny OspC ze szczepów 28691,25015, SZ7,297, SIMON, E61, ACA1, H9, Jl, VS461, M57, W, VSDA, NBS przedstawionych na fig. 9a, albo in) jest homologiczna w co najmniej 80% do jednej z sekwencji genu OspC z fig. 8a.
26. Antygen OspC, znamienny tym, że:

a) jest kodowany przez sekwencję która:

i) zawiera sekwencję nukleotydową dowolnej sekwencji genu OspC ze szczepów 28691, 25015, SZ7, 297, SIMON, E61, ACA1, H9, Jl, VS461, M57, W, VSDA, NBS przedstawionych na fig. 8a, albo ii) koduje antygeny OspC ze szczepów 28691,25015, SZ7,297, SIMON, E61, ACA1, H9, Jl, VS461, M57, W, VSDA, NBS przedstawionych na fig. 9a, albo ni) jest homologiczna w co najmniej 80% do jednej z sekwencji genu OspC z fig. 8a.

b) wykazuje co najmniej 80% homologn z dowolnąz sekwencji aminokwasowych, przedstawionych na fig. 9a.

* * *

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zapobieganie i leczenie choroby z Lyme u ssaków, a w szczególności preparaty immunogenne, zawierające różne formy serologiczne OspC dla opóźnienia lub zapobiegania rozwojowi choroby z Lyme.