AT405940B - Verfahren zur gewinnung und reinigung von rekombinantem, nicht-lipidiertem osp-protein - Google Patents
Verfahren zur gewinnung und reinigung von rekombinantem, nicht-lipidiertem osp-protein Download PDFInfo
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Description
AT 405 940 B
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von rekombinanten Osp-Proteinen, insbesondere von rekombinantem OspC, sowie ein rekombinantes, nicht-lipidiertes OspC. Weiters betrifft die Erfindung einen Impfstoff enthaltend rekombinantes, nicht-lipidiertes OspC, sowie die Verwendung des Impfstoffes zur Immunisierung von Vertebraten.
Die Lyme-Borreliose ist eine von Zecken übertragene und durch die Spirochäte Borrelia burgdorferi sensu lato ausgelöste Infektionskrankheit von Wirbeltieren. In gemäßigten Breiten (Nordamerika, Mitteleuropa) ist die Lyme-Borreliose die häufigste von Zecken übertragene Infektionskrankheit. Die hohe Durchseuchungsrate (bis zu 60%) der Zecken in bestimmten Gebieten, hat die Lyme-Borreliose in letzter Zeit zu einem epidemiologischen Problem werden lassen.
Die am häufigsten mit der Lyme-Borreliose assoziierten Symptome umfassen teilweise schwere Erkrankungen der Haut, des Nervensystems, des Herzens und der Gelenke. Die Lyme-Borreliose wird üblicherweise mit Antibiotika behandelt, eine Behandlung, die im frühen Infektionsstadium sehr effizient wirkt. Aufgrund der Heterogenität der verschiedenen Borrelia-Stämme ist jedoch die Früherkennung einer Borrelien-Infektion sehr schwierig. Ist die Erkrankung bis ins chronische Stadium fortgeschritten, ist die Antibiotika-Behandlung schwieriger und nicht immer erfolgreich. Mit der Dauer der Infektion vergrößert sich auch die Wahrscheinlichkeit, an schweren Spätfolgen zu erkranken. Eine effiziente, vorbeugende Impfung gegen die Lyme-Borreliose ist deshalb sehr erstrebenswert.
Der Begriff "Borrelia", wie er hier verwendet wird, entspricht Borrelia burgdorferi sensu lato und umfaßt die Erreger der Lyme-Borreliose, beispielsweise B.burgdorferi sensu stricto, B.garinii sp. nov. and B.afzelii. Für die Oberflächen-Lipoproteine OspA und OspC von Borrelia ist beschrieben, daß sie in Tierversuchen vor Borrelia-Infektionen schützen. Deshalb gelten OspA und OspC als bevorzugte Kandidaten als Impfantigene gegen Lyme-Borreliose (EP 418 827; Fikrig et al. (1990), Science 250:553-6; Preac-Mursic et al. (1992), Infection 20:342-9). OspA und OspC sind beides Plasmid-kodierte Proteine (Barbour et al. (1987), Science 237:409-11; Marconi et al. (1993), J. Bacteriol. 175:926-32) an deren N-Terminus in einem posttranslationeilen Prozeß ein Lipidanteil angehängt wird. Dieser Lipidanteil dient als "Membrananker", der das Lipoprotein in der äußeren Bakterienmembran verankert. Der nicht in der Membran verankerte Teil eines Osp-Proteins liegt an der Zelloberfläche exponiert vor (Howe et al. (1985), Science 227:645-6; Bergström et al. (1989), Mol. Microbiol. 3:479-86). Die für OspA und OspC kodierenden Gene kommen in fast allen Borrelia-Stämmen vor und beide Oberflächenproteine kommen in vielen serologisch verschiedenen Formen vor (Wilske et al. (1988), Ann. New York Acad. Sei. 539: 126-43; Livey et al. (1995), Mol. Microbiol. 18: 257-69). "Serologisch verschiedene Formen" bedeutet, daß in verschiedenen Borrelia-Stämmen verschiedene Varianten der einzelnen Oberflächenproteine (z.B. OspA, OspB, OspC) Vorkommen, wobei die Verschiedenheit sich in einer fehlenden Kreuzreaktivität mit Antikörpern und in verschiedenen RFLP-Mustern (RFLP = Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus) darstellt. Livey et al. (1995, Mol. Microbiol. 18: 257-69) haben 35 verschiedene RFLP-Typen von OspC beschrieben; diese entsprechen den in diesem Text erwähnten serologischen Varianten von OspC.
Das Vorliegen vieler serologisch verschiedener Formen erschwert die Entwicklung eines auf diesen Lipoproteinen basierenden Impfstoffes. So haben zum Beispiel Fikrig et al. (1992, J. Immunol. 148:2256-60) gezeigt, daß die Immunisierung mit einer serologischen Variante von OspA nicht vor einer Infektion mit einem Stamm, der eine andere OspA-Variante trägt, schützt. Infolgedessen wird in der Literatur überwiegend die Meinung vertreten, daß es notwendig ist, einen Impfstoff zu entwickeln, der eine Mischung aus serologisch verschiedenen Formen des Antigens enthält und so einen Impfschutz gegen möglichst viele verschiedene Borrelien-Stämme vermittelt. Dies erfordert für die effiziente und reproduzierbare Produktion, daß das Gewinnungs- und Reinigungsverfahren einheitlich für alle Varianten anwendbar ist.
Das Hauptinteresse in der Impfstoffentwicklung gegen Lyme-Borreliose galt bisher dem Lipoprotein OspA, von dem sieben verschiedene Serotypen beschrieben wurden. Aber auch das OspC-Lipoprotein ist während der natürlichen Infektion immunogen und schützt im Tierversuch vor homologem Challenge (WO 94/25596, Probert et al. (1994), Infect. Immun. 62:1920-26).
Die Begriffe "homolog" und "heterolog” werden hier im Zusammenhang mit Impfschutz und "Challenge” (Infizieren eines Säugetiers mit einem virulenten Erreger) verwendet. In diesem Kontext bedeutet "homolog" "von der selben serologischen Variante eines Erregers stammend", und "heterolog" bedeutet "nicht von der selben serologischen Variante eines Erregers stammend". Homologer Schutz bedeutet, daß das Impfantigen vor Erregern schützt, die ein Antigen tragen, das zur selben serologischen Variante gehört wie das Impfantigen. Heterologer Schutz bedeutet, daß das Impfantigen auch einen Kreuzschutz vermittelt, das heißt, daß der Schutz auch gegen Erreger wirkt, die Antigene anderer serologischer Varianten tragen. Bisher wurden folgende Strategien zur Produktion von Osp-Lipoproteinen (OspA, OspB, OspC von Borrelia) verfolgt: Einerseits wurden die Wildtyp Osp-Lipoproteine direkt aus der Bakterienzellwand der Borrelien isoliert, andererseits wurden Gene, die für Osp-Lipoproteine kodieren, rekombinant in E.coli oder der Hefe 2
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Pichia pastoris exprimiert. Weiters wurden verschiedene rekombinante Osp-Fusionsproteine in E.coli expri-miert.
Wildtyp Osp-Lipoproteine sind mit ihrem Membrananker in die Zellwand der Borrelien integriert. Um sie zu isolieren, muß zuerst die Membranfraktion präpariert werden, danach werden die Osp-Lipoproteine aus der Membran extrahiert. Dies kann in effizienter Weise nur mit Detergenzien oder Substanzen, die wie Detergenzien wirken, erreicht werden (z.B. EP 522 560, WO 94/25596, WO 93/08299, Belisle et al. (1994), J. Bacteriol. 176: 2151-57). Detergenzien haben die Eigenschaft, daß sie an Lipoproteine binden und sie so aus der sie umgebenden Membran lösen. Sie können aber nur sehr schwer und unter großen Verlusten an Produkt von den Lipoproteinen abgetrennt werden. Für die Applikation am Menschen ist jedoch die vollständige Abtrennung der Detergenzien notwendig. Weiters sind Lipoproteine aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit in Abwesenheit von Detergenzien sehr schwer zu handhaben. In Abwesenheit von Detergenzien neigen Lipoproteine dazu, Aggregate auszubilden, was z.B. die Sterilfiltration und die exakte Dosierung erschwert. Die Verwendung von Detergenzien ist also in der effizienten Impfstoffproduktion mit vielen Schwierigkeiten verbunden.
Gondolf et al. (1990, J. Chromatography 521:325-34) und Ma und Weis (1993, Infect. Immun. 61:3843-53) vermieden den Einsatz von Detergenzien dadurch, daß sie die Lipoproteine OspA und OspB mit n-Butanol extrahierten. n-Butanol erfüllte hierbei eine Detergens-artige Funktion, ohne aber ein echtes Detergens zu sein. Die Borrelien wurden hierbei nach Sonifikation einer Extraktion mit n-Butanol unterzogen. Die folgende Zentrifugation führte zur Ausbildung von drei Phasen, einer Butanol-Phase, einer Zwischenphase und einer wäßrigen Phase. Die Lipoproteine OspA und OspB befanden sich teilweise in der wäßrigen Phase, aus der sie nach Dialyse mit chromatographischen Methoden gereinigt wurden. E. coli ist der Wirtsorganismus, der in der Gentechnik am häufigsten verwendet wird, um rekombinante Proteine herzustellen. E. coli ist leicht zu kultivieren und gibt üblicherweise sehr hohe Ausbeuten. E. coli kann als Wirtsorganismus in allen Fällen angewendet werden, in denen keine posttranslatorischen Modifikationen oder nur solche, die auch von E. coli gemacht werden, benötigt werden, um ein funktionelles Protein zu erhalten.
Osp-Proteine von Borrelia werden natürlicherweise lipidiert, d.h. posttranslatorisch wird ein Lipidanteil am N-Terminus des Proteins angehängt. Viele Autoren haben schon darauf hingewiesen, daß die Lipidie-rung für die Immunogenität der Osp-Lipoproteine von Borrelia essentiell ist (WO 93/08299, Erdile et al. (1993), Infect. Immun. 61: 81-90; Belisle et al. (1994), J. Bacteriol. 176: 2151-57; Weis et al. (1994), Infect. Immun. 62:4632-36). Die Feststellung, daß E. coli rekombinante Osp-Proteine korrekt lipidiert, hat dazu geführt, daß die rekombinante Expression von Borrelien-Osp-Proteinen in E.coli in vielen Fällen die direkte Isolation der Osp-Proteine aus Borrelien abgelöst hat (WO 93/08299, Weis et al. (1994), Infect. Immun. 62:4632-36).
Wie in Borrelia ist das lipidierte Osp-Protein in E. coli mit der Zellmembran zu assoziiert. Wie im Falle von Borrelia muß das Osp-Protein folglich mit Detergenzien aus der Zellmembran extrahiert werden. Die Expression von rekombinanten Osp-Proteinen in E. coli verhindert also das schon oben beschriebene Problem der Zugabe von Detergenzien nicht. Der Einsatz von E.coli zur Expression von Osp-Proteinen erlaubt allerdings, Modifikationen in die rekombinanten Gene beziehungsweise Proteine einzuführen.
Im N-Terminus verkürzte Varianten von OspA, die nicht mehr lipidiert werden können, sind nicht mehr in der Zellmembran verankert. Dünn et al. (1990, Prot. Expr. Purif. 1:159-68) exprimierten ein rekombinantes OspA, dem die ersten 17 Aminosäuren des Wildtyps fehlten, in E. coli. Das N-terminal verkürzte OspA war nicht lipidiert und folglich in der Abwesenheit von Detergenzien löslich. Dieses nicht lipidierte OspA-Konstrukt war mit Seren von Lyme-Borreliose-Patienten detektierbar. Das heißt, daß zumindest einige der Borrelia-Epitope, die in Patienten eine Immunantwort auslösen, in dem N-terminal verkürzten, nicht-lipidierten OspA vorhanden waren. Ein weiteres rekombinantes, nichtlipidiertes OspA, dem die erste Aminosäure des Wildtyps fehlte, erwies sich im Tierversuch als nicht immunogen. (Erdile et al. (1993); Infect. Immun. 61: 81-90). Das Fehlen der Immunogenität wird von Erdile et al. experimentell eindeutig auf das Fehlen des Lipidanteils zurückgeführt. N-terminal verkürztes, nichtlipidiertes OspA-Protein aus E.coli bietet demnach eine unzureichende Immunogenität, um in einem Impfstoff eingesetzt zu werden.
Fusionsproteine sind nach dem Stand der Technik ein weiterer Weg, um Osp-Proteine in E. coli zu exprimieren. Fusionen von OspA mit NS-1 (Nicht-Strukturelles Protein von Influenza; Gern et al. (1994), Immunol. Lett. 39: 249-58; Telford III et al. (1995), J. Infect. Dis. 171: 1368-70), von OspA, OspB und OspC mit Glutathion-S-Transferase (Padula et al. (1993), Infect. Immun. 61: 5097-105; Telford III et al. (1993), J. Exp. Med. 178: 755-58) und von OspC mit Maltose-Binding-Protein (Probert et al. (1994), Infect. Immun. 62: 1920-26) sind schon beschrieben. In diesen Fällen ist das jeweilige Osp-Protein aufgrund der N-terminalen Blockade durch das anfusionierte Protein nicht lipidiert. Die im Stand der Technik erwähnten Fusionspartner haben entweder eine stimulierende Wirkung auf das Immunsystem oder sie erleichtern Expression oder 3
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Reinigung des Fusionsproteins. Die Idee der Fusionsproteine ist somit ein weiterer Versuch, zwei große Probleme bei der Herstellung von Osp-Proteinen zu lösen: die stark verminderte Immunogenität der nicht lipidierten Osp-Proteine und die Schwierigkeit der Reinigung von Osp-Lipoproteinen für einen am Menschen ersetzbaren Impfstoff. Da die Fusionsproteine nicht lipidiert sind, sind sie nicht mit der Zellmembran assoziiert, sodaß zur Isolierung des jeweiligen Osp-Fusionsproteins kein Detergens benötigt wird. Fusionen mit Glutathion-S-Transferase und Maltose-Binding-Protein erlauben, das Fusionsprotein über die spezifischen Affinitäten des jeweiligen, anfusionierten Proteins zu reinigen.
In der WO 95/14781 wird die Klonierung und Expression von p23 von B. burgdorferi als Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase in E. coli beschrieben. Die Fusion wurde im wesentlichen zur Erleichterung der Extraktion und Reinigung des Lipoproteins hergestellt. Dieses Protein ist aufgrund der N-terminalen Fusion bei der Expression in E. coli tatsächlich nicht lipidiert (wogegen nicht fusioniertes OspC bei der Expression in E. coli sehr wohl lipidiert wird), es weist jedoch eine OspC-Variante mit unspezifischen Sequenzen am N-Terminus des Proteins auf, was dessen Verwendung zur Impfstoffherstellung zumindest problematisch erscheinen läßt. Für eine Fusion von OspA mit dein 81 Aminosäuren langen N-Terminus von NS-1 konnte gezeigt werden, daß sowohl relative hohe Expressionsraten in E. coli erzielt werden, als auch, daß das Fusionsprotein mit homologem Immunserum reagiert (WO 93/04175). Aus der Reaktion mit homologem Immunserum schließen die Autoren, daß dieses Fusionsprotein die Fähigkeit hat, vor einer Infektion mit virulentem B.burgdorferi zu schützen. Diese Annahme wird aber in WO 93/04175 nicht mit experimentellen Daten belegt.
Bei Fusionen, die den N-Terminus der Osp-Proteine blockieren, wird angenommen, daß das Fusionsprodukt nicht lipidiert ist. Die Immunogenität dieser nicht-lipidierten Osp-Fusionsproteine ist einerseits auf eine mögliche immunstimulierende Wirkung des anfusionierten Proteins oder Proteinanteils zurückzuführen, andererseits wird sie in der Literatur auf sehr hohe Dosen an Adjuvans zurückgeführt (WO 93/08299). Zudem haben solche Fusionsproteine den Nachteil, daß nicht nur Osp-Protein-spezifische Antigene im Immunogen vorliegen. Hohe Dosen an Adjuvantien müssen verwendet werden, wenn das Impfantigen eine schlechte Immunogenität hat. Da hohe Dosen an Adjuvantien das Nebenwirkungs-Risiko des Impfstoffes stark erhöhen, sind Impfantigene, die hohe Dosen an Adjuvans benötigen, für den Einsatz am Menschen nicht günstig (Gupta et al. (1995); Vaccine 13: 1263-76). Auch in der WO 93/08299 wird ausdrücklich darauf hingewiesen, daß ein Adjuvans-freier Impfstoff erstrebenswert ist. Deshalb ziehen die Erfinder der WO 93/08299 natives, also lipidiertes Osp-Protein dem nicht-lipidierten für die Impfstoffentwicklung vor.
Probert et al. (1994) beschreiben einen anderen Weg, der vor allem eine Lösung für die Reinigungsproblematik darstellt. Sie exprimieren ein OspC-MBP (Maltose-Binding-Protein)-Fusionsprotein in E. coli und benutzen die Affinität von MBP zu Amylose, um das Fusionsprotein spezifisch anzureichern, indem sie es an einen Amylose-haltigen Träger binden. Nach der spezifischen Isolierung des Fusionsproteins, wird der MBP-Anteil vom Fusionsprotein abgespaltet, sodaß im Endprodukt nur mehr OspC vorhanden ist. Im Gegensatz zum nativen OspC fehlt dem so präparierten Endprodukt das N-terminaie Cystein. Auf DNA-Ebene wurde zwischen MBP und OspC eine Schnittstelle für Faktor Xa eingefügt, sodaß die beiden Proteine durch Faktor Xa-Aktivität gespalten werden konnten. Nachteilig bei dieser Methode ist, daß zusätzliche Schritte, nämlich die Spaltungsreaktion mit Faktor Xa und die spätere Abtrennung von Faktor Xa und des abgespalteten MBP-Anteils, nötig sind. Die Gefahr, daß Spuren beider oder eines der beiden Stoffe im Impfstoff vorhanden ist, spricht gegen den Einsatz einer solchen zusätzlichen Spaltungsreaktion. Der Einsatz einer Protease ist aber auch deshalb problematisch, weil zusätzliche Spaltstellen im Osp-Protein selbst vorliegen könnten. Die Protease-Reaktion würde in so einem Fall, das Endprodukt zerstören.
In der WO 94/25596 wird unter anderem die Produktion von rekombinantem OspC in der Hefe Pichia pastoris beschrieben. Das so erhaltene OspC erwies sich als immunogen und schützte im Tierversuch vor homologem Challenge. Die Präparation von OspC aus Pichia wurde ohne den Einsatz von Detergenzien durchgeführt. Die Zellen wurden in einer isotonischen Pufferlösung mechanisch zerkleinert, filtriert und zentrifugiert. Im Überstand vorhandenes OspC wurde anschließend über mehrere chromatographische Reinigungsschritte angereichert. Der Nachteil dieser Methode ergibt sich daraus, daß die Zentrifugation keine Spezifität für OspC aufweist. Dadurch befindet sich auch ein Teil der aus Wirtszellen und Medium stammenden Proteine im Überstand. Diese Proteine sind unerwünscht und müssen über mehrere, aufeinanderfolgende, chromatographische Schritte vom Produkt abgetrennt werden. Mit jedem chromatographischen Schritt ist aber ein hoher Verlust an Produkt verbunden. Außerdem kann nicht zweifelsfrei garantiert werden, daß Spuren von kontaminierenden Proteinen oder anderen Substanzen, wie Lipide, Nukleinsäuren und Kohlenhydrate, im Endprodukt vorhanden sind.
In der WO 95/21928 wird die Expression von heterologen Proteinen in methylotrophen Hefen, unter anderem Pichia, beschrieben. Als Beispiel für ein heterologes Protein wird unter anderen OspA beschrie- 4
AT 405 940 B ben. In der WO 95/21928 geht es hauptsächlich um hohe Ausbeuten, diese werden im Falle von OspA nach dem Aufbrechen der Zellen mit einer "French press” mit einem ELISA bestimmt. OspA wird nicht speziell gereinigt und auch nicht spezifisch charakterisiert.
Trotz der schon im Stand der Technik bekannten Methoden zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Lyme-Borreliose besteht also immer noch der Bedarf nach einem hochreinen Impfstoff, der bedenkenlos am Menschen eingesetzt werden kann und der einen breiten Impfschutz gegen die verschiedenen Stämme der Lyme-Borrelien vermittelt.
Es ist nun Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbessertes Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von rekombinantem Osp-Protein, insbesondere von rekombinantem OspC-Protein, zur Verfügung zu stellen, das eine einfache und effiziente Reinigung von immunologisch aktivem, rekombinantem Osp erlaubt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von rekombinantem, von Borrelien-Osp abgeleitetem Osp aus eukaryontischen Wirtszellen, vorzugsweise Hefezellen, zur Verfügung. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen lysiert werden und das Lysat mit einem organischen Lösungsmittel versetzt wird, unter Bedingungen, bei denen zelluläre Proteine im wesentlichen vollständig ausgefällt werden und rekombinantes Osp-Protein selektiv in Lösung bleibt, und das Osp-Protein aus der Lösung gereinigt und gewonnen wird. Aufgrund des außergewöhnlichen Lösungsverhaltens der rekombinanten Osp-Proteine, insbesondere des rekombinanten OspC, das sich von dem anderer Proteine stark unterscheidet, ist dieser Schritt sehr selektiv.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten organischen Lösungsmittel sind als proteinfällende Lösungsmittel bekannt: Alkohole, kurzkettige Ketone, Sulfoxide und Nitrile, vorzugsweise Methanol, Propanol-Isomere, Butanol-Isomere, DMSO, Acetonitril, Dioxan, Aceton und besonders bevorzugt Ethanol. Proteinfällende organische Lösungsmittel werden üblicherweise dazu verwendet, Proteine aus Lösungen auszufällen und nicht in Lösung zu halten. Das organische Lösungsmittel kann in diesem Fall als effizientes Fällungsreagens für verunreinigende Substanzen verwendet werden. Die meisten Proteine fallen unter den gemäß dem vorliegenden Verfahren verwendeten Bedingungen aus; durch ihre Assoziation mit Proteinen fallen auch die Nukleinsäuren zu 99,99% aus.
Damit bietet das erfindungsgemäße Verfahren eine sehr hohe Selektivität schon im ersten Reinigungsschritt an. Die hohe Anreicherung der rekombinanten Osp-Proteine, insbesondere von rekombinantem OspC, und die starke Abreicherung von kontaminierenden Substanzen in der Lösung reduzieren die Anzahl der notwendigen Folge-Reinigungsschritte, sodaß die hohen Ausbeuten der Expression in Pichia im weiteren Verlauf der Reinigung nur minimal reduziert werden und der Aufwand für die weitere Reinigung auch minimal gehalten werden kann.
Die Zugabe des organischen Lösungsmittels führt zur Ausfäliung von verunreinigenden Proteinen und eines Großteils der Nukleinsäuren. Die Abtrennung der ausgefällten Substanzen von der z.B. rekombinantes OspC enthaltenden Lösung kann gemäß der vorliegenden Erfindung durch Sedimentation oder Filtration erfolgen.
Die Sedimentation wird vorzugsweise durch Zentrifugation beschleunigt, sie kann aber auch durch längeres Stehenlassen erfolgen, wobei die ausgefällten Substanzen sich durch die Schwerkraft der Erde am Boden des die Lösung beinhaltenden Gefäßes sammeln. Nach der Sedimentation kann die rekombinantes OspC enthaltende Lösung vom ausgefällten Sediment abgenommen werden.
Bei der Filtration wird die rekombinantes OspC enthaltende Lösung über ein Filter von den ausgefällten Substanzen abgetrennt. Für die Filtration werden beispielsweise Sterilfilter verwendet. Die Filtration wird vorzugsweise in zwei Schritten durchgeführt. Für eine Vorfiltration wird ein relativ grobes Filter mit relativ großer Porengröße verwendet, beispielsweise ein 1 um Sterilfilter. Anschließend wird für die Hauptfiltration ein feineres Filter mit kleinerer Porengröße verwendet, beispielsweise ein 0,2 um Sterilfilter.
Nach der Fällung mit dem organischen Lösungsmittel und der Sedimentation oder Filtration enthält die rekombinantes OspC enthaltende Lösung noch Phospholipide, Farbstoffe und geringe Spuren an Protein und Nukleinsäuren aus der Wirtszelle. Verglichen mit der Lösung vor der Fällung bleiben noch ca. 10% Proteine aus Wirtszellen und Medium, ca. 0,001% Nukleinsäuren und ca. 5% Lipide nach der Fällung in Lösung. Diese können bevorzugterweise durch eine anschließende Umkehrphasenchromatographie von dem rekombinanten Osp-Protein, insbesondere OspC, sehr effizient abgetrennt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung kann die Umkehrphasen-Chromatographie auch ohne einen vorangegangenen Reinigungsschritt, wie etwa der Ausfällung von verunreinigenden Proteinen oder Nukleinsäuren durch organische Lösungsmittel (wie oben beschrieben), zur Reinigung eines Osp-haltigen Ausgangsmaterials eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt daher auch ein Verfahren zur Reinigung von Osp-Proteinen aus einem Osp-haltigen Ausgangsmaterial, bei dem das Osp-Protein selektiv an einen festen, zur Umkehrphasen-Chromatographie geeigneten Träger gebunden, gegebenenfalls gewa- 5
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Das Prinzip der Umkehrphasenchromatographie beruht darauf, daß sich Moleküle, abhängig von ihren spezifischen Affinitäten, zwischen einer festen, hydrophoben und einer flüssigen, hydrophilen Phase verteilen. Die erfindungsgemäßen Osp-Proteine, insbesondere OspC, haben eine hohe Affinität zum festen, hydrophoben Träger, während kontaminierende Substanzen - die restlichen Proteine aus Wirtszellen und Medium, Nukleinsäuren, Phospholipide und Farbstoffe - in der flüssigen, hydrophilen Phase bleiben und vom festen Träger, an das Osp-Protein gebunden ist, abgetrennt werden. Üblicherweise ist der feste Träger an einer Säulenmatrix immobilisiert, sodaß die flüssige Phase, die die kontaminierenden Substanzen enthält, durch die Säule durchfließt. Wenn der Träger in loser Form vorliegt, werden die Trägerpartikel von der flüssigen Phase abgetrennt und mit einem Elutionsmittel mit niedriger Elutionskraft gewaschen. Das Osp-Protein hat unter diesen Bedingungen eine höhere Affinität zum Träger als zur Lösung. In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist dieser Schritt besonders effizient in der Elimination von unerwünschten Proteinen aus Wirtszellen und Medium, Nukleinsäuren, Phospholipiden und Farbstoffen, eine Elimination, die bei der Fällung mit dem organischen Lösungsmittel nicht vollständig stattfindet. Die Umkehrphasenchromatographie nützt das besondere Lösungsverhalten des erfindungsgemäß erhaltenen, rekombinanten Osp-Protein, insbesondere OspC, in organischen Lösungsmitteln. Bei der Umkehrphasenchromatographie wird das organische Lösungsmittel erfindungsgemäß zum Eluieren des Osp-Proteins verwendet. Zuerst wird die z.B. rekombinantes OspC enthaltende Lösung mit einer wäßrigen Pufferlösung verdünnt und mit einem festen Träger in Kontakt gebracht. Die Bedingungen werden so eingestellt, daß Osp-Protein selektiv an den Träger bindet. Damit das erfindungsgemäße Osp-Protein an den Träger bindet, wird die Osp-Protein enthaltende Lösung mit dem organischen Lösungsmittel so verdünnt, daß die Lösungsmittelkonzentration eine niedrige Elutionskraft hat. Das erfindungsgemäß hergestellte Osp-Protein hat unter diesen Bedingungen eine höhere Affinität zum Träger als zur Lösung. Der Träger kann aus Silikat, bevorzugt ist dabei Spherisorb 5C18, oder aus Kunststoffpolymeren sein, bevorzugt ist Source RP15™ (Pharmacia) oder Amberchrome® CG 300 (Tosohaas). Der Träger kann in einer Säule gepackt vorliegen, er kann aber auch in loser Form mit der Lösung gemischt eingesetzt werden. In der verdünnten Lösung vorhandenes, rekombinantes Osp-Protein bindet selektiv an den Träger, während kontaminierende Phospholipide, Faro-stoffe, Proteine und Nukleinsäuren nicht binden. Die Selektivität beruht hier auf der eingesetzten Konzentration des Konzentrationsgradienten und der Art des organischen Lösungsmittels.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Ethanol als Lösungsmittel eingesetzt, vorzugsweise in einer Konzentration um 45%. Nach dem Waschen des Trägermaterials durch Spülen mit einem Elutionsmittel mit niedriger Elutionskraft, beispielsweise einer physiologischen Pufferlösung mit 35%, 40% oder 45% Ethanol, wird das Osp-Protein, insbesondere OspC, selektiv mit einem organischen Lösungsmittel in hoher Konzentration bzw. mit hoher Elutionskraft von der Säule eluiert. Ein Lösungsmittel mit hoher Elutionskraft veranlaßt das an den Träger gebundene Osp-Protein, insbesondere OspC, sich von diesem abzulösen und im Lösungsmittel in Lösung zu gehen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Ethanol in einer Konzentration zwischen 50% und 60%, bevorzugt zwischen 52% und 57%, besonders bevorzugt 55%, verwendet. Das zur Elution verwendete organische Lösungsmittel kann das selbe Lösungsmittel sein, das im ersten Schritt zur Fällung verwendet wurde, es kann aber auch ein anderes organisches Lösungsmittel sein. Es kann in einer ausgewählten Konzentration eingesetzt werden oder als Gradient zwischen zwei verschiedenen Konzentrationen. In jedem Fall liegen die Konzentrationen im Bereich von 10% bis 90%, vorzugsweise von 20% bis 70% und besonders bevorzugt im Bereich von 40% bis 60% vor. Das organische Lösungsmittel wird je nach gewünschter Konzentration in wäßriger Pufferlösung verdünnt. Die wäßrige Pufferlösung kann beispielsweise eine phosphatgepufferte Natrium-Chlorid-Lösung, Tris-Puffer oder Citratpuffer sein.
Bevorzugte organische Lösungsmittel im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind aus der Gruppe der proteinfällenden Substanzen ausgewählt, insbesondere der ein- oder mehrwertigen Alkohole, der kurzketti-gen Ketone, der Sulfoxide oder Nitrile, vorzugsweise Methanol, n-Propanol, 2-Propanol und andere Isomere des Propanols, t-Butanol, 2-Butanol und andere Isomere des Butanols, DMSO, Acetonitril, Dioxan oder Aceton und besonders bevorzugt Ethanol.
Das organische Lösungsmittel kann ein einziges organisches Lösungsmittel in wäßriger, gepufferter Lösung sein oder ein Gemisch aus verschiedenen organischen Lösungsmitteln darstellen. Das in den verschiedenen Reinigungsschritten des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete organische Lösungsmittel kann in allen Schritten dasselbe sein, es können aber auch in einem Reinigungsverfahren in verschiedenen Schritten verschiedene organische Lösungsmittel eingesetzt werden. 6
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Wie schon oben erwähnt, sollte ein Impfstoff, der einen effizienten Schutz vor Lyme-Borreliose vermittelt, vor allen serologischen Subtypen der Lyme-Borrelien schützen. Daher ist es sinnvoll, eine polyvalente Mischvakzine mit breiter Wirksamkeit zur Verfügung zu stellen. "Polyvalente Mischvakzine" heißt hier, daß der Impfstoff verschiedene serologische Subtypen der Osp-Proteine, insbesondere von OspC enthält. Für die großtechnische Produktion eines solchen polyvalenten Impfstoffes ist es wünschenswert, eine einheitliche Gewinnungs- und Reinigungsmethode für die verschiedenen Bestandteile zu haben. Die bisher zur Verfügung stehenden chromatographischen Verfahren mußten jedoch, um das jeweilige Osp-Protein von kontaminierenden Substanzen abzutrennen, sehr spezifisch auf jede Osp-Variante eingestellt werden. Denn schon kleinste Unterschiede in der Aminosäuresequenz, wie sie bei den verschiedenen serologischen Varianten der Osp-Proteine Vorkommen, können das Verhalten der Proteine in den hochspezifischen, chromatographischen Verfahren so verändern, daß die Reinigungseffizienz beeinträchtigt ist.
Viele der schon bekannten chromatographischen Verfahren basieren auf der Tatsache, daß Osp, insbesondere OspC, nicht oder nur sehr schwach an die für die klassische Proteinreinigung verwendeten Trägermaterialien, wie sie in Ionenaustauschern und hydrophoben Interaktionsgelen verwendet werden, bindet. Das Reinigungsverfahren läuft demzufolge als sogenannte "Negativ-Chromatographie" ab, das bedeutet, daß stufenweise die zu eliminierenden Substanzen durch Binden an verschiedene Träger aus der Osp (OspC) enthaltenden Lösung entfernt werden, während Osp (OspC) immer im Durchfluß zu finden ist. Nach einer Reihe solcher Schritte sollte dann Osp (OspC) in gereinigter Form vorliegen. Diese Methode ist arbeitsintensiv, außerdem ist die Gefahr, kontaminierende Substanzen im Durchfluß "mitzunehmen" sehr groß. Die "Negativ-Chromatographie" muß immer auf die jeweilige Osp-Variante abgestimmt werden, wobei aber auch schon Osp-Varianten gefunden wurden, auf die ein solches Verfahren nicht angewandt werden kann.
Methoden, die auf die jeweilige Osp-Variante eingestellt werden müssen, sind arbeitsintensiv und teuer und deshalb im großtechnischen Bereich nicht zufriedenstellend. Jeder Verfahrensschritt muß auf seine abreichernde Wirkung auf kontaminierende Substanzen überprüft und validiert werden. Viele aufeinanderfolgende Verfahrensschritte führen weiters zu großen Verlusten an Produkt, da bei jedem Schritt mit bestimmten Verlusten gerechnet werden muß.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von rekombinantem Osp, insbesondere OspC, ist maximal selektiv bei einem Minimum an Verfahrensschritten, wodurch der Produktverlust reduziert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist für alle serotypischen Varianten von Osp, insbesondere OspC, anwendbar und damit im großtechnischen Maßstab realisierbar. Ein Minimum an Verfahrensschritten bedingt weiters ein Minimum an Kontaminationsmöglichkeiten. Das nach dem in der WO 94/25596 beschriebenen Verfahren gereinigte Osp (OspC) enthält bis zu 20% Bruchstücke und Abbauprodukte. Das erfindungsgemäße Verfahren führt aufgrund der geringen Anzahl an notwendigen Verfahrensschritten nur zu maximal 5 % Bruchstücken und Abbauprodukten.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Hefezellen, vorzugsweise Pichia pastoris, die erfindungsgemäßes rekombinantes OspC exprimieren, in einem Tris-Puffer (pH 7,5) suspendiert und in einem Manton-Gaulin-Homogenisator aufgebrochen. Die festen Bestandteile der Zellen werden durch Zentrifugation von der Lösung abgetrennt. Ethanol wird zur Lösung bis zu einer Endkonzentration von 50% zugegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wird der entstandene Niederschlag durch Zentrifugation von der Lösung abgetrennt. Die Lösung wird mit Tris-Puffer (pH 7,5) auf 45 % Ethenol verdünnt und auf eine Chromatographiesäule, gefüllt mit Source RP15™ -(Pharmacia), aufgetragen. Mit einem Ethanolgradienten zwischen 45% und 70% wird OspC von der Säule eluiert, wobei die UV-Absorption des Effluents kontinuierlich gemessen wird. Unter diesen Bedingungen eluiert rekombinantes OspC bei einer Ethanolkonzentration zwischen 52% und 57%. Die OspC- enthaltenden Fraktionen werden vereint und gegen einen physiologisch verträglichen Puffer, beispielsweise Phosphatpuffer, mittels Gelfiltration, beispielsweise über kugelförmigem Gel, hergestellt durch Quervernetzung von Dextran mit Epichlorohydrin (Sephadex G25), umgepuffert. Danach erfolgt eine Aufkonzentration mittels Ultrafiltration durch Membranen mit einer Ausschlußgrenze von 5000 Da, beispielsweise Omega 5K (Filtron).
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Präparation enthaltend rekombinantes OspC zur Verfügung gestellt, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie rekombinantes OspC in einer Reinheit von mindestens 90%, vorzugsweise 95% und besonders bevorzugt von 98% enthält, wobei das OspC die komplette OspC-Aminosäuresequenz umfaßt, nicht fusioniert und nicht-lipidiert ist und lediglich aus dem Proteinanteil des B. burgdorferi OspC-Lipoproteins besteht. Dieses nicht-lipidierte OspC-Protein stellt demnach ein OspC-Apoprotein dar, also ein Lipoprotein, dem der Lipidanteil vollständig fehlt. Das OspC gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist daher komplettes, nichtfusioniertes OspC. Überraschenderweise wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße rekombinante OspC aus Pichia pastoris nichtlipidiert und 7
AT 405 940 B hoch immunogen ist. Dies war insbesondere deshalb überraschend, da für nicht-lipidiertes OspA festgestellt wurde, daß seine Immunogenität im Vergleich zu lipidiertem OspA stark herabgesetzt ist (Weis et al., 1994; Infect. Immun. 62:4632-36). Das erfindungsgemäße OspC zeichnet sich weiters dadurch aus, daß es in organischen Lösungsmitteln mit proteinfällender Wirkung, wie zum Beispiel in 50%-igem Ethanol, löslich ist.
Es zeigte sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß die Expression von einem für nicht-verkürztes OspC kodierenden Gen in Hefe, vorzugsweise in Pichia pastoris, überraschenderweise zu einem OspC-Protein führte, dem der Lipidanteil fehlte. "Nicht verkürzt" bedeutet, daß das rekombinante OspC auf Aminosäuren-Ebene dem prozessierten, nativen OspC entspricht und das N-terminale Cystein vorhanden ist. Der Grund für das Fehlen des Lipidanteils ist, daß Pichia pastoris ein für diese posttranslatorische Modifikation des OspC notwendiges Enzymsystem, wie es in Bakterien (Borrelia, E. coli) vorkommt, fehlt. Als Konsequenz des Fehlens des Lipidanteils ist das erfindungsgemäße OspC-Protein nicht mit der Membran der Wirtszelle assoziiert, sondern liegt im Cytosol der Wirtszelle vor. Üblicherweise dienen Lösungsmittel, wie sie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, dazu, Proteine aus Lösungen auszufällen. Um so überraschender war es daher, daß das erfindungsgemäße, rekombinante OspC nicht mit den anderen Proteinen, z.B. zellulären Proteinen oder Proteinbestandteilen des Mediums, ausfällt, wenn organische Lösungsmittel zugegeben werden, sondern in organischen Lösungsmitteln löslich ist. Diese besondere Eigenschaft wurde bisher noch nie mit OspC assoziiert. Für die Entwicklung eines neuen Reinigungsverfahrens für OspC ist diese besondere Form der Löslichkeit sehr wichtig. Wichtig für die Impfstoffproduktion ist weiters, daß diese Eigenschaft auf alle bisher getesteten, serologischen OspC-Varianten zutrifft.
Die erfindungsgemäß gereinigte, rekombinante OspC-Präparation vermittelt einen hoch effizienten Impfschutz vor homologem Challenge und auch einen überraschend hohen Impfschutz vor heterologem Challenge. Die Immunogenität des erfindungsgemäß gereinigten, rekombinanten, nicht-lipidierten OspC ist um so überraschender, als in der vorhandenen Literatur beschrieben ist, daß die Osp-Proteine von Borrelia nur immunogen sind, wenn sie einen Lipidanteil tragen. Das erfindungsgemäß gereinigte, rekombinante OspC ist weiters hochrein und frei von sämtlichen für den Menschen gefährlichen Kontaminationen wie Proteinen der Wirtszelle, Proteinen aus dem Nährmedium, Nukleinsäuren, pyrogenen und toxischen Substanzen und Lipiden. Aufgrund des erfindungsgemäßen Verfahrens zur seiner Gewinnung und Reinigung, ist das erfindungsgemäße, rekombinante OspC 100% frei von Detergenzien. Das erfindungsgemäß gereinigte OspC erweist sich im Tierversuch als vollkommen pyrogenfrei nach USP (United States Pharmacopoia). Seine Verträglichkeit wurde weiters in anomalen Toxizitätstests nach USP und in Tests auf Dermoreaktivität nach USP nachgewiesen. Es kann gefahrlos in am Menschen einzusetzenden Impfstoffpräparaten beinhaltet sein. Aufgrund seiner hohen Immunogenität benötigt das erfindungsgemäße OspC nur geringe Zugaben an Adjuvans.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine OspC-Präparation, welche durch das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren erhältlich ist.
Zur Herstellung von rekombinantem OspC gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein Polynukleotid-Molekül, das für OspC kodiert, in einem entsprechenden Vektor in die Wirtszelle eingebracht. Ein Polynukleotid-Molekül, das für OspC kodiert, wird hier in weiterer Folge als "OspC-Gen" bezeichnet.
Das OspC-Gen kann nach dem Fachmann bekannten Methoden aus Borrelia präpariert und in ein Vektormolekül inseriert werden (PCR, "Screening" von Genbanken, Klonierung; z.B.: Maniatis et al., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL; Cold Spring Harbor Laboratories (1982)). Das OspC-Gen kann aber auch synthetisch mit einem sogenannten Gene-Assembler hergestellt werden. Das OspC-Gen wird 3' von expressionssteuernden Sequenzen (Promotor; Enhancer, Ribosomen-Bindungsstelle) in das Vektormolekül inseriert. Expressionssteuernde Sequenzen bewirken die Transkription und Translation eines entsprechenden Gens, sie können auch auf Transkription oder Translation verstärkend wirken. Die expressionssteuernden Sequenzen werden nach dem Fachmann bekannten Kriterien so gewählt, daß sie hohe Produktionsraten in der ausgewählten Wirtszelle liefern. Die Produktionsraten des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen im Bereich von 0,1 mg/g Feuchtzellmasse (FZM) bis 100 mg/g FZM, bevorzugt im Bereich von 1 mg/g FZM.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Wirtszelle ist eine eukaryontische Zelle, bevorzugt eine Hefezelle. Vorzugsweise ist die Hefezelle aus der folgenden Gruppe ausgewählt: Hansenula sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, besonders bevorzugt ist Pichia pastoris. Erfindungsgemäß werden die expressionssteuernden Sequenzen so gewählt, daß sie für die Expression von rekombinantem Osp-Proteinen, insbesondere OspC, in Hefezellen geeignet sind. Es können zur Expression sowohl konstitutive als auch induzierbare Promotoren gewählt werden. Induzierbare Promotoren werden erst durch die Zugabe eines Induktormoleküles aktiv, sie sind gezielt zur Produktion "einschaltbar". Induzierbare 8
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Promotoren sind beispielsweise die Promotoren von ADH2, AOX, Isocytochrom C, Azidphosphatase, Enzymen, die mit dem Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-Phosphata-se Dehydrogenase und Enzymen, die im Galaktose- und Maltose-Metabolismus aktiv sind. Konstitutive Promotoren sind beispielsweise PGK1- und ADH1-Promotor und die Promotoren von 3-Phosphoglyceratki-nase und anderer glycolytischer Enzyme wie beispielsweise Enolase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofruktokinase, Glukose-6-Phosphat Isomerase, Pyruvatkinase und Glukokinase.
Das Vektormolekül zur Expression von Osp (OspC) kann in der Hefezelle im Cytoplasma vorliegen, beispielsweise als YEp, YRp, YCp oder YAC oder es kann in das Genom der Hefezelle integrieren, beispielsweise als Ylp. Weiters sind sogenannte "Shuttle-Vektoren" günstig, die sowohl in Hefezellen als auch in Bakterien, beispielsweise E. coli vermehrt werden können. Ein Beispiel für einen Shuttle-Vektor" ist pHIL-A1 (Phillips Petroleum) der in Pichia pastoris und in E. coli vermehrt werden kann (WO 94/25596).
Das OspC-Gen kodiert für ein OspC-Molekül, das mit einer Borrelia Wildtyp-Variante identisch ist oder davon abgeleitet ist. Abgeleitet heißt hier, daß das Gen für ein rekombinantes OspC-Protein kodiert, das soweit mit der ursprünglichen Variante ident ist, daß gegen die ursprüngliche Variante gerichtete Antikörper das rekombinante OspC erkennen. Das Gen kann gentechnisch modifiziert sein, es kann gentechnisch eingeführte Mutationen enthalten, und es kann im 5'- und 3'-Bereich Nukleotidsequenzen enthalten, die seine Expression in einer gewünschten Art und Weise beeinflussen. Wenn die Wirtszelle Pichia pastoris ist, kann das Gen beispielsweise unter die Kontrolle eines für Pichia spezifischen Promotors, zum Beispiel des mit Methanol induzierbaren AOX-1-Promotors gestellt werden. Zur Transformation und wenn nötig auch zur Expression in der Wirtszelle ist das Gen in einem Vektor enthalten. Die Art des Vektors hängt hier vor allem von der Wirtszelle ab, und die Auswahl des richtigen Vektors ist nach dem Fachmann bekannten Kriterien zu treffen. Erfindungsgemäß soll der verwendete Vektor eine effiziente Expression über einen langen Zeitraum zulassen. Wenn die Wirtszelle Pichia pastoris ist, ist der Vektor vorzugsweise pHIL-A1 (Phillips Petroleum) und das OspC-Gen steht unter der Kontrolle des mit Methanol induzierbaren AOX-1 Promotors. In einer besonderen Ausführungsform werden die pHIL-A1-Konstrukte konstruiert wie in WO 94/25596, beispielsweise pPC-PP4. Das inserierte OspC-Gen stammt wie in WO 94/25596 von den B.burgdorferi Stämmen B31, PKO, ZS7, KL10 oder E61, es kann aber auch von jedem anderen in Livey et al. (1995, Mol. Microbiol. 18: 257-69) beschriebenen RFLP-Typ stammen, beziehungsweise abgeleitet sein.
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Methode zur Gewinnung und Reinigung von rekombinantem OspC-Protein, das von Borrelia-OspC abgeleitet ist, zur Verfügung. Abgeleitet heißt, daß das erfindungsgemäße, rekombinante OspC soviel Ähnlichkeit mit einem nativen OspC von Borrelia hat, daß es noch die Produktion protektiver Antikörper gegen Lyme-Borreliose in Säugetieren auslöst, bzw. daß es noch mit von Säugetieren gegen OspC von homologen Erregern der Lyme-Borreliose produzierten Antikörpern reagiert. Das erfindungsgemäße OspC kann von allen serologischen Subtypen von Borrelia-OspC abgeleitet sein. Bei Borrelia handelt es sich erfindungsgemäß um die Erreger der Lyme-Borreliose, vorzugsweise B.burgdorferi sensu stricto, B.garinii sp. nov. und B.afzelii.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Präparation enthaltend ein neues, rekombinantes, von Borrelia-OspC abgeleitetes Protein zur Verfügung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß das OspC die komplette Aminosäure-Sequenz umfaßt, nicht fusioniert und nichtlipidiert ist und lediglich aus dem Proteinanteil des B. burgdorferi OspC-Proteins besteht. "Nicht-lipidiert" heißt, daß kein Lipidanteil kovalent am N-terminalen Cystein des OspC gebunden ist. Das erfindungsgemäße, rekombinante OspC kann jede serologische Variante von Borrelien-OspC darstellen, aber auch von serologischen Varianten abgeleitetes OspC.
Die erfindungsgemäße Präparation ist in einem organischen Lösungsmittel unter Bedingungen löslich, unter denen kontaminierende Proteine und mit Proteinen assoziierte Nukleinsäuren ausfallen. Das organische Lösungsmittel ist erfindungsgemäß aus der Gruppe der proteinfällenden Substanzen ausgewählt, insbesondere aus der Gruppe der ein- oder mehrwertigen Alkohole, der kurzkettigen Ketone, der Sulfoxide oder der Nitrile. Das organische Lösungsmittel ist vorzugsweise Methanol, n-Propanol, 2-Propanol oder ein anderes Isomer des Propanol, t-Butanol, 2-Butanol oder ein anderes Isomer des Butanol, DMSO, Acetonitril, Dioxan oder Aceton und besonders bevorzugt Ethanol. Das organische Lösungsmittel liegt in wäßriger Pufferlösung vor. Das organische Lösungsmittel kann ein einziges organisches Lösungsmittel in wäßriger gepufferter Lösung sein, oder ein Gemisch aus verschiedenen organischen Lösungsmitteln darstellen. Die wäßrige Pufferlösung kann beispielsweise eine phosphatgepufferte Natrium-Chlorid-Lösung, Tris-Puffer oder Citratpuffer sein. Erfindungsgemäß liegt das organische Lösungsmittel in einer Konzentration von 10% bis 90%, vorzugsweise 20% bis 70% und besonders bevorzugt 40% bis 60% in wäßriger Pufferlösung vor. Die wäßrige Pufferlösung kann beispielsweise eine phosphatgepufferte Natrium-Chlorid-Lösung, Tris-Puffer oder ein Citratpuffer sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das organische Lösungsmittel ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, besonders bevorzugt Ethanol. Ethanol liegt in wäßriger Pufferlösung in einer Konzentration 9
AT 405 940 B zwischen 4Q%-60%, vorzugsweise zwischen 45%-55% vor.
Die erfindungsgemäße Präparation weist eine Reinheit von mindestens 90% auf, vorzugsweise 95%, und besonders bevorzugt 98% auf. Sie ist frei von zellulären Proteinen, pyrogenen und toxischen Substanzen, Nukleinsäuren und Lipiden. Da die erfindungsgemäße Präparation ohne Zusatz von Detergens präpariert wurde, ist es auch 100% frei von Detergenzien. Die Reinheit wurde mit gängigen, biochemischen Methoden (HPLC, Elektrophorese und Massenspektroskopie) demonstriert (siehe Beispiel 3). Die erfindungsgemäße Präparation wird bevorzugterweise mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Osp präpariert. Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Präparation ist dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Lipidgehalt von < 0,01 mg/ml und einen Endotoxingehalt von < 1,5 EU/ml aufweist und im wesentlichen frei ist von Nukleinsäuren.
Erfindungsgemäß kann die Präparation eine einzige serologische Variante von OspC enthalten, sie kann aber auch ein aus mehreren verschiedenen Varianten zusammengesetztes OspC-Gemisch sein. Üblicherweise werden die verschiedenen serologischen Varianten getrennt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren präpariert. Da das Verfahren für alle serologischen Varianten von OspC einheitlich anzuwenden ist, ist es aber auch möglich, verschiedene Varianten gleichzeitig zu reinigen. Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist hierbei nicht nur, daß das Verfahren nicht an die jeweiligen Serotypen angepaßt werden muß, sondern auch, daß die verschiedenen Varianten vor oder nach der Präparation problemlos gemischt werden können. Das ist vor allem für die effiziente und einheitliche Produktion eines polyvalenten Impfstoffes, wie er zur Vorbeugung der Lyme-Borreliose notwendig ist, sehr nützlich.
In funktionellen Studien konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäße Präparation hoch immuno-gen ist. Das erfindungsgemäße, rekombinante OspC induziert in Mäusen die Ausbildung von Antikörpern. Weiters schützt die erfindungsgemäße Präparation Mäuse hundertprozentig vor homologem Challenge. Es vermittelt aber auch einen überraschend hohen Schutz vor einem heterologen Challenge, d.h. es vermittelt einen Schutz vor Borrelia-Stämmen, deren OspC-Varianten nicht im Impfstoff vorhanden waren. Wenn eine einzelne OspC-Variante als Impfantigen eingesetzt wurde, konnte ein bis zu 70-prozentiger Schutz beobachtet werden (siehe Beispiel 5). Wenn ein Gemisch aus 3 verschiedenen OspC-Varianten als Impfantigen verabreicht wurde, war der heterologe Schutz 80-prozentig (siehe Beispiel 6). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß ein effizient vor Lyme-Borreliose schützender Impfstoff bevorzugt mehrere verschiedene OspC-Varianten enthalten sollte. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung von OspC ist aufgrund seiner breiten Anwendbarkeit besonders günstig für die Herstellung einer solchen polyvalenten Mischvakzine. Die in den Beispielen 5 und 6 gezeigte hohe Immunogenität der erfindungsgemäßen Präparation steht weiters im Gegensatz zu der im Stand der Technik weit verbreiteten Annahme, daß die Osp-Proteine von Borrelia nur dann eine effiziente Immunogenität zeigen, wenn sie einen Lipidanteil tragen (WO 93/08299, Weis et al. (1994), Infect. Immun. 62:4632-36; Erdile et al. (1993), Infect. Immun. 61: 81-90).
Die erfindungsgemäße Präparation konnte mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in besonders hoher Reinheit und frei von sämtlichen für den Menschen gefährlichen Kontaminationen wie Proteinen der Wirtszelle, Proteinen aus dem Nährmedium, Nukleinsäuren, pyrogenen und toxischen Substanzen, Lipiden und Detergenzien hergestellt werden. Im Tierversuch (Pyrogenitätstest, anomaler Toxizitätstest, Dermoreak-tivität) wurde auch der Nachweis der Verträglichkeit erbracht. Die erfindungsgemäße Präparation kann gefahrlos in am Menschen einzusetzenden Impfstoffpräparaten beinhaltet sein. Es eignet sich also sehr gut zur pharmazeutischen Verwendung. Pharmazeutische Verwendung heißt hier, daß es in einem entsprechenden physiologischen Träger und mit eventuell zugefügten Substanzen an Säugetiere, insbesondere Menschen verabreicht werden kann und eine prophylaktische oder therapeutische Wirkung hat. Die prophylaktische oder therapeutische Wirkung von OspC besteht darin, daß es aufgrund seiner Immunogenität ein Impfantigen darstellt. Ein Impfantigen ist ein Antigen, das im Säugetier eine spezifische Immunantwort hervorruft. Diese Immunantwort führt zu humoraler und/oder zellulärer Immunität. Immunität bedeutet, daß das Säugetier vor einer Borrelia-Infektion geschützt ist oder die Borrelia-Infektion leichter verläuft als bei nicht immunen Säugetieren. Die prophylaktische Wirkung kommt bei der Immunisierung eines gesunden Säugetiers zur Wirkung. OspC ist hierbei in einem Impfstoff enthalten, der im gesunden Säugetier einen immunologischen Schutz vor Lyme-Borreliose vermittelt. Die therapeutische Wirkung kann genutzt werden, wenn das Säugetier schon an einer Borrelia-Infektion leidet und das im Impfstoff vorhandene OspC die Immunreaktion gegen Borrelia verstärkt und so den Heilungsprozeß unterstützt. Aufgrund seiner hohen Reinheit eignet sich das erfindungsgemäße OspC auch sehr gut als Impfantigen für Kinder.
Die erfindungsgemäße Präparation kann in geeigneter Weise als Immunogen zur Herstellung von Antiseren bzw. Antikörpern verwendet werden. Dazu können Probanden mit einer immunologisch wirksamen Dosis an Impfantigen immunisiert werden und die Immunglobuline nach im Stand der Technik bekannten Verfahren isoliert und gereinigt werden. Zudem kann durch den Nachweis einer Bildung von Antikörpern gegen rekombinantes OspC-Protein eine Aussage über den Impferfolg gemacht werden. 10
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Die erfindungsgemäße Präparation enthält vorteilhafterweise einen physiologisch akzeptablen Träger Als physiologische Träger werden üblicherweise physiologische Pufferlösungen, wie Phosphatpuffer oder Citratpuffer eingesetzt. Zu den eventuell zugefügten Substanzen gehören Adjuvanzien, beispielsweise Aluminiumverbindungen wie Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat, Freund's Adjuvans oder andere Mineralöl- oder Pflanzenöl-Emulsionen, Lipopolysaccharide, Lipid A, Saponin, Quil A, QS21 und ISCOMS. Bevorzugtes Adjuvans ist Aluminiumhydroxid. Neben Adjuvantien können dem Impfstoff auch "Carrier" zugesetzt werden. Typische Carrier sind Liposomen, Latexpartikel oder Bentonit. Um die Immunogenität des Impfstoffes zu verstärken, können auch weitere immunstimulierende Substanzen, wie Interleukine, beispielsweise IL-1 oder IL-2, zugesetzt werden.
Weiters gehören zu den eventuell zugefügten Substanzen auch andere Antigene, beispielsweise andere Borrelia-Antigene oder virale Antigene. Andere Borrelia-Antigene können beispielsweise OspA, OspB, OspE oder OspF (Nguyen et al. (1994); Infect. Immun. 62; 2079-84) oder Derivate davon sein. Andere virale Antigene können beispielsweise Antigene des TBE-Virus sein. Da sowohl das TBE-Virus als auch Borrelia von Zecken übertragen werden, bietet sich eine solche Kombination für einen Impfstoff für Menschen, die in zeckenverseuchten Gebieten leben, an. Weiters können sogenannte "Trägersubstanzen" dem Impfstoff zugesetzt sein. "Trägersubstanzen" sind beispielsweise Tuberculin PPD, Serumalbumin, Ovalbumin oder Keyhole-Limpet-Hemocyanin.
Alle neben den Impfantigenen im Impfstoff vorhandenen Substanzen sind vorzugsweise nicht toxisch und nicht allergen.
Die Formulierung von Impfstoffen ist dem Fachmann bekannt. Das Impfantigen der vorliegenden Erfindung, kann lyophilisiert vorliegen und erst zur Anwendung in einer physiologisch akzeptablen Pufferlösung aufgelöst werden. Als Pufferlösung eignen sich physiologische Salzlösungen oder andere physiologische Lösungen. Das Impfantigen wird mit der physiologischen Pufferlösung gemischt, um eine gewünschte Konzentration des Impfantigens zu bekommen. Die gewünschte Konzentration ist immunologisch wirksam; sie liegt im Bereich von 1 ug bis 100 u.g des jeweiligen Impfantigens pro Dosis, vorzugsweise im Bereich von 10 ug bis 50 ug. Gegebenenfalls kann in einer Kinder-Vakzine die Impfantigen-Dosis reduziert werden, beispielsweise auf eine Dosis im Bereich zwischen 5 und 30 u.g.
Schließlich stellt die vorliegende Erfindung einen Impfstoff zur Verfügung, der erfindungsgemäßes, rekombinantes, nicht-lipidiertes OspC enthält. Der Impfstoff ist zur Verabreichung an Säugetiere, vorzugsweise Menschen geeignet. Je nach Region und gewünschter Breite des Impfschutzes enthält der Impfstoff eine oder mehrere serologisch verschiedene Varianten des erfindungsgemäßen OspC. Die serologischen Varianten entsprechen den 35 von Livey et al. (1995, Mol. Microbiol. 18: 257-69) beschriebenen RFLP-Typen. Impfstoffzusammensetzungen können aber auch den in WO 94/25596 beschriebenen, regionenspezifischen Zusammensetzungen, enthaltend verschiedene OspC-Varianten, entsprechen.
In einer Ausführungsform enthält der Impfstoff drei bis acht verschiedene serologische Varianten des erfindungsgemäßen OspC und vermittelt einen breiten heterologen Schutz gegen die in einem bestimmten Gebiet vorkommenden Borrelia-Serotypen. In einer besonderen Ausführungsform enthält der Impfstoff drei verschiedene serologische Varianten von OspC, beispielsweise eine Zusammensetzung der RFLP-Varianten Orth, PKO und E61 oder der RFLP-Varianten ZS7, PKO und E61. Es ist aber jede Zusammensetzung von zwei oder mehreren RFLP-Varianten nach Livey et al. (1995, Mol. Microbiol. 18: 257-69) möglich.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, ohne sich aber darauf zu beschränken. BEISPIELE:
Beispiel 1: Expression von rekombinantem OspC (rOspC) in Pichia pastoris.
Pichia pastoris-Stamm GS115 NRRL-Y 11430 (Cregg et al. (1985); Mol. Cell. Biol. 5:3376-85) wurde nach der Methode von Dohmen et al. (1991; Yeast 7:691-92) mit dem Vektor pPC-PP4 (beschrieben in der WO 94/25596), der das OspC-Gen des Borrelia burgdorferi-Stammes Orth, des Stammes ACA1 oder der Stammes ZS7 enthält, transformiert. Transformanten wurden bei 30 *C in MD-Medium bis zu einer optischen Dichte (OD 600) von 2-10 angezüchtet. Induktion und Analyse der OspC Expression erfolgten wie in WO 94/25596 beschrieben.
Beispiel 2: Reinigung von rOspC aus Pichia pastoris. 500 g Feuchtzellmasse der transformierten rOspC (Stamm Orth oder ZS7) exprimierenden Pichia-Hefezellen wurde in 500 ml Tris-Puffer (20mM Tris-HCI, pH 9,0) suspendiert und in einem Manton-Gaulin- 11
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Homogenisator aufgebrochen. Feste Bestandteile der Hefezellen wurden durch Zentrifugation (15 min bei 10.000 g) aus der Suspension entfernt. 95%-iges Ethanol wurde unter Rühren zugegeben, bis eine Endkonzentration von 50% Ethanol erreicht wurde. Nach einer einstündigen Inkubation bei 4 * C wurde der entstandene Niederschlag durch Zentrifugation (15 min bei 20.000 g) entfernt. Der klare, zellfreie Überstand wurde mit Tris-Puffer (20mM Tris-HCI, pH 9,0) auf eine Ethanolkonzentration von 45 % verdünnt und anschließend auf eine Chromatographiesäule, gefüllt mit Source RP15TU (Pharmacia), aufgetragen. Die Säule wurde mit 45% Ethanol in phosphatgepufferter Natriumchloridlösung gewaschen.
Mit einem Ethanolgradienten von 45% bis 70% in phosphatgepufferter Natriumchloridlösung wurde rOspC von der Säule eluiert. Die UV-Absorption des Effluents wurde kontinuierlich bei einer Wellenlänge von 214 nm gemessen. rOspC eluierte bei einer Ethanolkonzentration um 55%. OspC-positive Fraktionen wurden vereinigt. Der Laufpuffer wurde mittels Gelfiltration über Sephadex G25 durch einen Tris-HCI + 0,9 % NaCI-Puffer (pH 7,4) ersetzt. Anschließend wurde die Lösung durch Ultrafiltration über eine Omega 5K-Membran (Filtron) aufkonzentriert.
Beispiel 3: Analyse von nach Beispiel 2 gereinigtem rOspC.
Ausbeute und Reinheit des nach Beispiel 2 gereinigten rOspC wurden mittels BCA-Methode, HPLC, SDS-PAGE, Limulus-Amoebozyten-Lysat-Methode, Gaschromatographie und Phenol/H2S04-Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 (Stamm Orth) und 2 (Stamm ZS7) zusammengefaßt. Das Beispiel zeigt, daß mit der erfindungsgemäßen Methode rOspC-Proteine von sehr unterschiedlichen Subtypen (Orth, ZS7: Homologie = 69,2 %) effizient gereinigt werden können. Die in den Tabellen beschriebenen Werte demonstrieren die hohe Reinheit des jeweiligen rOspCs.
Tabelle 1
Analyse von nach Beispiel 2 gereinigtem rOspC des Stammes Orth. Eigenschaft angewandte Methode Proteingehalt Reinheit Reinheit Endotoxingehalt Lipide Kohlenhydrate BCA-Methode HPLC SDS-PAGE LAL Gaschromatographie Phenol/HiSO« 1,5 mg/ml 98% > 95 % < 1,5 EU/ml < 0,01 mg/ml < 0,02 mg/ml
Tabelle 2
Analyse von nach Beispiel 2 gereinigtem rOspC des Stammes ZS7. Eigenschaft angewandte Methode Proteingehalt Reinheit Reinheit Endotoxingehalt Lipide Kohlenhydrate BCA-Methode HPLC SDS-PAGE LAL Gaschromatographie Phenol/H2SO* 0,9 mg/ml 98 % > 95 % < 1,5 EU/ml < 0,01 mg/ml < 0,02 mg/ml
Beispiel 4: Vergleich verschiedener organischer Lösungsmittel zur Reinigung von rOspC aus Pichia pastoris.
Jeweils 1 ml einer Suspension nach Beispiel 2 aufgebrochener Hefezellen, die rOspC des Stammes Orth exprimierten, wurden mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln auf die in Tabelle 3 angegebenen Konzentrationen gebracht. Nach einer einstündigen Inkubation bei 4*C, wird der entstandene Niederschlag 12
AT 405 940 B abzentrifugiert (15 min, 20.000 g). Ein Aliquot des Überstandes wird einer Proteinanalyse mittels SDS-PAGE unterzogen. Die Ausbeute an rOspC wird durch densitometrische Auswertung des mit Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE-Geles bestimmt. Die Ausbeute wird dabei auf den Wert der Fällung mit Ethanol bezogen. Das Beispiel zeigt, daß neben Ethanol auch andere organische Lösungsmittel, beispielsweise t-Butanol, 2-Butanol, Acetonitril und Dioxan, als Fällungsreagens für verunreinigende Substanzen verwendet werden konnte, wobei rOspC zum überwiegenden Teil als lösliches Protein im Fällungsüberstand erhalten wird.
Tabelle 3 LÖSUNGSMITTEL (Endkonz, in %) AUSBEUTE (in %) (nach dem 1. Fällungsschritt) REINHEIT (in %) (nach dem 1. Fällungsschritt) Ethanol (50 %) 100 80 2-Propanol (50 %) 70 25 t-Butanol (50 %) 80 65 Acetonitril (40 %) 80 60 Dioxan (50 %) 70 60
Beispiel 5: Immunisierung von Mäusen mit rOspC. C3H/HeJ-Labormäuse wurden mit einer Dosis von 3 ug rOspC in einer Formulierung mit AI(OH)3 -(0,2%) zweimal immunisiert. Der Antikörpertiter gegen das Immunisierungsantigen wurde mittels ELISA, unter Verwendung von Borrelien-OspC, bestimmt. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Tiere mit einer Dosis von 104 infektiösen Borrelien (10 i.d. 50) des homologen oder eines heterologen Stammes belastet (Challenge). Nach einer weiteren Woche wurden den Mäusen Blut und mehrere Organe (Herz, Harnblase, Niere, Milz) zur Infektionsdiagnose entnommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt; sie zeigen die ausgezeichnete Schutzwirkung, die mit nach Beispiel 2 gereinigtem rOspC gegenüber einem homologen Challenge erreicht wird. Alle drei getesteten rOspC-Antigene (der Stämme Orth, ZS7 und ACA1) bewirkten einen hundertprozentigen Schutz vor homologem Challenge. Tabelle 4 zeigt weiters, daß im heterologen Challenge eine teilweise Schutzwirkung von bis zu 70% erzielt werden konnte.
Tabelle 4; ANTIGEN CHALLENGE TITER INFIZIERTE TIERE (Stamm) (104 KEIME) vor Challenge (%) . kein Orth <1:1000 100 Orth Orth 1:50000 0 ZS7 ZS7 150000 0 ACA1 ACA 1 1:50000 0 Orth ZS7 1:50000 80 ZS7 Orth 1:50000 30
Beispiel 6: Immunisierung von Mäusen mit verschiedenen Mischungen von rekombinanten OspCs.
Wie in Beispiel 5 beschrieben, wurden C3H-Mäuse immunisiert, anstelle von 3 ug einer einzelnen rOspC-Variante wurden in diesem Versuch aber Mischungen unterschiedlicher rOspC-Varianten verabreicht. Die Zusammensetzung der verschiedenen Mischungen ist in Tabelle 5 zusammengefaßt. Die Gesamtdosis 13
Claims (17)
- AT 405 940 B an Antigen betrug in allen Fällen 9 ug. Der Challenge erfolgte hier mit verschiedenen Borrelienstämmen (einem homologen und einem heterologen Stamm). Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Mischvakzine, die aus drei verschiedenen OspC-Varianten zusammengesetzt waren, nicht nur vor den Borrelienstämmen schützten, deren OspC-Varianten im Impfstoff vorhanden waren, sondern zu einem unerwartet hohen Prozentsatz (80%) auch vor einem heterologen Borrelia-Stamm. Tabelle 5: ANTIGEN TITER (x 1000) INFIZIERTE TIERE (in %) nach Challenge mit Orth |ZS7 !E61 PKO Orth ZS7 kein neg. ! neg. j neg. neg. 100 100 Orth ^4 V V o <1 0 80 ZS7 6 ] 50 j 15 16 30 0 Orth/PKO/E61 60 | 25 | 55 50 0 20 ZS7/PKO/E61 11 1 70 j 50 60 20 0 Patentansprüche 1. Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von rekombinantem, von Borrelien-Oberflächen-Lipoproteinen abgeleitetem Osp-Protein aus eukaryontischen Wirtszellen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Wirtszell-Lysat mit einem proteinfällenden organischen Lösungsmittel versetzt wird, unter Bedingungen, bei denen zelluläre Proteine im wesentlichen vollständig ausgefällt werden und rekombinantes Qsp-Protein selektiv in Lösung bleibt, und das Osp-Protein aus der Lösung gereinigt und gewonnen wird .
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ausgefällten, zellulären Proteine durch Sedimentation vom rekombinanten Osp-Protein abgetrennt werden und rekombinantes Osp-Protein in Lösung bleibt.
- 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Osp-Protein enthaltende Lösung mit einem festen Träger in Kontakt gebracht wird unter Bedingungen, bei denen das Osp-Protein selektiv an den Träger bindet und daß es anschließend mit einem organischen Lösungsmittel eluiert wird.
- 4. Verfahren zur Reinigung von Osp-Proteinen aus einem Osp-haltigen Ausgangsmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß das Osp-Protein selektiv an einen festen, zur Umkehrphasen-Chromatographie geeigneten Träger gebunden wird, gegebenenfalls gewaschen, und eluiert wird.
- 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger ein Silikat ist.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Osp-Protein mittels eines Gradienten zwischen zwei verschiedenen Konzentrationen eines organischen Lösungsmittels eluiert wird.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel aus der Gruppe der proteinfällenden Substanzen ausgewählt ist, insbesondere ein- oder 14 AT 405 940 B mehrwertige Alkohole, kurzkettige Ketone, Sulfoxide oder Nitrile, vorzugsweise Methanol, n-Propanol, 2-Propanol und andere Isomere des Propanols, t-Butanol, 2-Butanol und andere Isomere des Butanols, DMSO, Acetonitril, Dioxan oder Aceton und besonders bevorzugt Ethanol.
- 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch aus verschiedenen organischen Lösungsmitteln verwendet wird.
- 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel in einer Konzentration von 10 bis 90 Vol%, vorzugsweise 20% bis 70 Vol% und besonders bevorzugt 40% bis 60 Vol% in wäßriger Pufferlösung verwendet wird.
- 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine eukaryontische Wirtszelle aus der Gruppe der Hefen, vorzugsweise Hansenula sp„ Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe und besonders bevorzugt Pichia pastoris, verwendet wird.
- 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Osp-Protein OspC gewonnen wird.
- 12. Präparation enthaltend rekombinantes OspC, dadurch gekennzeichnet, daß sie rekombinantes OspC in einer Reinheit von mindestens 90%, vorzugsweise 95% und besonders bevorzugt von 98% enthält, wobei das OspC die komplette OspC-Aminosäuresequenz umfaßt, nicht fusioniert und nicht-lipidiert ist und lediglich aus dem Proteinanteil des B. burgdorferi OspC-Proteins besteht.
- 13. Präparation nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Lipidgehalt von < 0,01 mg/ml und einen Endotoxingehalt von <1,5 EU/ml aufweist und im wesentlichen frei ist von Nukleinsäuren.
- 14. Präparation nach Anspruch 12 oder 13, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
- 15. Präparation nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 3 verschiedene serologische Varianten von OspC enthält.
- 16. Präparation nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen physiologisch akzeptablen Träger enthält.
- 17. Verwendung einer Präparation nach einem der Ansprüche 12 bis 16 zur Herstellung eines Impfstoffes zur Immunisierung von Säugern gegen Lyme-Borreliose. 15
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