CZ425398A3 - Způsob výroby a čištění rekombinantního, nelipidovaného proteinu Osp - Google Patents
Způsob výroby a čištění rekombinantního, nelipidovaného proteinu Osp Download PDFInfo
- Publication number
- CZ425398A3 CZ425398A3 CZ984253A CZ425398A CZ425398A3 CZ 425398 A3 CZ425398 A3 CZ 425398A3 CZ 984253 A CZ984253 A CZ 984253A CZ 425398 A CZ425398 A CZ 425398A CZ 425398 A3 CZ425398 A3 CZ 425398A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ospc
- protein
- osp
- recombinant
- vaccine
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 66
- 108700023315 OspC Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 71
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 71
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 claims description 66
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 53
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 48
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 46
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 claims description 38
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 37
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 37
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 37
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 claims description 27
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical class CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 19
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical class CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical class CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 13
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 13
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 13
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N butan-2-ol Chemical class CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 11
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 10
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 10
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical class CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical class C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical class CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 7
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 5
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 4
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 claims description 4
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 claims description 4
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical group [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 50
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 18
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 15
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 14
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 14
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 14
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 6
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 101150107995 ACA1 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 206010061591 Borrelia infection Diseases 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 3
- 101710194180 Alcohol oxidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000908522 Borreliella Species 0.000 description 2
- 241001148604 Borreliella afzelii Species 0.000 description 2
- 241001148605 Borreliella garinii Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 101001104102 Homo sapiens X-linked retinitis pigmentosa GTPase regulator Proteins 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 102100040092 X-linked retinitis pigmentosa GTPase regulator Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,4s,4ar,6ar,6bs,8r,8ar,12as,14ar,14br)-8a-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-[(3s,5s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC(C)(C)CC[C@@]5([C@@H](C[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)O)C(=O)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H]([C@@H]([C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@](O)(CO)CO3)O)[C@H](O)CO2)O)[C@H](C)O1)O)O)OC(=O)C[C@@H](O)C[C@H](OC(=O)C[C@@H](O)C[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](CO)O1)O)[C@@H](C)CC)C(O)=O)[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N 0.000 description 1
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 1
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 1
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000276440 Borrelia burgdorferi B31 Species 0.000 description 1
- 238000011735 C3H mouse Methods 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 101100437089 Drosophila melanogaster ATPsynO gene Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108700020482 Maltose-Binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000011957 budget and coverage analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 239000012051 hydrophobic carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940099789 ospa protein Drugs 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010301 surface-oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 150000000552 thionines Chemical class 0.000 description 1
- 208000016523 tick-borne infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- -1 ΐ-butanol Chemical compound 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
Oblast techniky
Předložený vynález se týká způsobu výroby a čištění rekombinantního proteinu Osp, obzvláště rekombinantího OspC a rekombinantního nelipidovaného OspC. Vynález se dále týká očkovací látky obsahující rekombinantní nelipidovaný OspC a použití očkovací látky k imunizaci obratlovců.
Dosavadní stav techniky
Lymská borrelioza je infekční onemocnění obratlovců přenášené klíšťaty a vyvolané spirochetou Borrelia burgdorferi sensu lato. Ve středních zemských šířkách (Severní Amerika, střední Evropa) je lymská borrelioza nejčastější infekční nemoc přenášená klíšťaty. Vysoký podíl nakažených klíšťat (až 60 %) v určitých oblastech způsobuje, že lymská borrelioza se v poslední době stává epidemiologickým problémem .
Symptomy nejčastěji spojované s lymskou borreliozou zahrnují částečně těžká onemocnění kůže, nervového systému, srdce a kloubů. Lymská borrelioza se obvykle ošetřuje antibiotiky, způsob, který je v časném stadiu stadiu infekce velmi účinný. Na základě heterogenity rozličných kmenů Borrelia je však včasné rozpoznání infekce Borrelia velmi obtížné. Pokud onemocnění pokročí až do chronického stadia, je léčba antibiotiky obtížnější a ne vždy úspěšná. S dobou • · trvání infekce se také zvyšuje pravděpodobnost onemocnění s těžkými následky. Proto existují silné snahy o nalezení účinného, preventivního očkování proti lymské borrelioze.
Pojem Borrelia, jak se zde používá, odpovídá Borrelia burgdorferi sensu lato a zahrnuje původce lymské borreliozy, příkladně B.burgdorferisensu stricto, B. garinii sp. nov. a B. afzelii.
Pro povrchové lipoproteiny OspA a OspC Borrelii se popisuje, že při pokusech na zvířatech chrání před infekcí Borrelii. Proto se OspA a OspC považují za vynikající kandidáty jako očkovací antigeny proti lymské borrelioze (EP 418 827, Fikrig a spol. (1990), Science 250:553-6, PreacMursic a spol., (1992), Infection 20:342-9). OspA a OspC j sou oba plasmidem kódovanými proteiny (Barbour a spol. (1987), Science, 237:409-11, Marconi a spol. (1993) J. Bacteriol. 175:926-32), na jejichž N-terminus se při posttranslačním procesu navěsí lipidový podíl. Tento lipidový podíl slouží jako membránová kotva, která lipoprotein zakotví do vnější membrány bakterie. Část Osp proteinu nezakotvená do membrány je na povrchu buňky vystavena oxpozici (Howe a spol. (1985), Science 227:645-6, Bergstrom a spol. (1989) Mol.Microbiol. 3:479:86). Geny kódované pro OspA a OspC se vyskytují téměř ve všech kmenech Borrelia a oba povrchové proteiny se vyskytují v mnoha serologicky rozdílných formách (Vilske a spol. (1988), Ann. New York Acad. Sci 539:126-43, Livey a spol. (1995), Mol.Microbiol. 18:25769). Serologicky rozdílné formy znamenají, že v různých kmenech Borrelia se vyskytují různé varianty jednotlivých povrchových proteinů (příkladně OspA, OspB, OspC), přičemž jejich rozdílnost se projevuje v chybějící křížové reaktivitě s protilátkami a v rozdílných vzorcích RFLP (RFLP = Rest* · riktionsfragment - Lángenpolymorphismus). Livey a spol. (1995), Mol.Microbiol. 18:257-69) popsali 35 rozdílných RFLP-typů OspC, které v tomto textu odpovídají zmíněným serologickým variantám OspC.
Existence mnoha serologicky rozdílných forem ztěžuje vývoj očkovací látky založené na tomto lipoproteinu. Tak příkladně ukázali Fikrig a spol. (1992, J.Immunol. 148: 2256-60) , že imunizace serologickou variantou OspA nechrání před infekcí kmenem, který nese jinou variantu OspA. V důsledku toho se v literatuře převážně vyskytuje mínění, že je nutné vyvinout očkovací látku, která bude obsahovat směs serologicky rozdílných forem antigenu a umožní ochranu očkováním proti pokud možno mnoha rozdílným kmenům Borrelia. Pro účinnou a reprodukovatelnou výrobu to vyžaduje, aby byl způsob získávání a čištění jednotně použitelný pro všechny varianty .
Hlavní zájem ve vývoji očkovací látky proti lymské borrelioze dosud patřil lipoproteinu OspA, u něhož bylo popsáno sedm rozdílných serotypů. Ale také lipoprotein OspC je během přirozené infekce imunogení a v pokusu na zvířatech chrání před homologem Challlenge (VO 94/25596, Probert a spol. (1994), Infect. Immun. 62:1920-26).
Pojmy homologový a heterologový se zde používají v souvislosti s ochranou očkováním a Challenge (infikování savce virulentní nákazou). V tomto kontextu znamená homolog pocházející ze stejné serologické varianty nakažlivého zárodku a heterolog znamená nepocházející ze stejné serologické varianty nakažlivého zárodku. Homologová ochrana znamená, že očkovací antigen pochází z nakažlivých zárodků nesoucích antigen, který patří ke stejné serologické varian• · » · · · • · · · 4 • · <
• · « · tě jako očkovací antigen. Heterologová ochrana znamená, že očkovací antigen zprostředkujme také křížovou ochranu, to znamená, že ochrana je účinná také proti nakažlivým zárodkům, které nesou antigeny jiných serologických variant. Doposud byly sledovány následující strategie k produkci lipoproteinů Osp (OspA, OspB, OspC Borrelii) : na jedné straně byl izolován divoký typ lipoproteinu Osp přímo z buněčné stěny bakterie Borrelia, na druhé straně byly geny, které kódují pro lipoproteiny, rekombinantně exprimovány do E.coli nebo kvasnic Pichia pastoris. Dále byly exprimovány různé rekombinantnífuzní proteiny Osp do E.coli.
Divoké typy lipoproteinu Osp jsou jejich membránami integrovány do buněčné stěny Borrelii. Aby se mohly izolovat, musí se nejprve preparovat membránová frakce, následně se z membrány extrahují Osp lipoproteiny. Toho se může účinným způsobem dosáhnout pouze s detergenty nebo s látkami, které působí jako detergenty (příkladně EP 522 560, VO 94/25596,
VO 93/08299, Belisle a spol. (1994), J. Bacteriol. 176: 2151-57). Detergenty mají vlastnost, že se vážou na lipoproteiny a uvolňují je tak z obklopující membrány. Mohou se ale jen velmi těžko a za velkých ztrát produktu oddělit od lipoproteinů. K aplikaci na lidích je však nutné úplné oddělení detergentů. Dále se s lipoproteiny na základě jejich špatné rozpustnosti v nepřítomnosti detergentů velmi špatně zachází. V nepřítomnosti detergentů mají lipoproteiny sklon ke tvorbě agregátů, což příkladně ztěžuje sterilní filtraci a přesné dávkování. Použití detergentů je tedy pro účinnou výrobu očkovacích látek spojeno s mnoha obtížemi.
Gondolf a spol. (1993, Infect. Immun. 61:3843-53) vylučují použití detergentů tím, že lipoproteiny OspA a OspB extrahují n-butanolem. n-Butanol přitom splňuje funkce obdob• ·
né detergentům, aniž by ale byl pravým detergentem. Borrelie se přitom po sonifikaci podrobí extrakci n-butanolem. Následující centrifugace vede k vytvoření tří fází, butanolové fáze, mezifáze a vodné fáze. Lipoproteiny OspA a OspB se nacházejí částečně ve vodné fázi, ze které se po dialýze vyčisti chromatografickými metodami.
E. coli je hostitelský organismus, který se používá v genové technice nejčastěji k výrobě rekombinantních proteinů. E. coli je možné snadno kultivovat a obvykle poskytuje velmi vysoké výtěžky. E. coli se může jako hostitelský organismus používat ve všech případech, kdy není třeba k získání funkčního proteinu provádět žádné posttranslatorické modifikace nebo jen takové, které mohou být provedeny také na E. coli.
Osp proteiny Borrelie se přirozeně lipidují, to znamená že se posttranslatoricky na N-terminus proteinu pověsí lipidový podíl. Mnoho autorů již poukázalo na to, že lipidace je pro imunogenitu Osp lipoproteinu Borrelie podstatná (VO 93/ 08299, Erdile a spol. (1993), Infect Immun. 61:81-90, Belisle a spol. (1994), J. Bacteriol 176:2151-57, Veis a spol. (1994), Infect. Immun. 62:4632-36). Zjištění, že E. coli korektně lipiduje rekombinantní proteiny Osp vedlo k tomu, že rekombinantní exprese Osp proteinů Borrelie v E. coli v mnoha případech odbourala přímou izolaci Osp proteinů z Borrelie (VO 93/08299, Veis a spol. (1994), Infect. Immun. 62:4632-36).
Jako v Borrelii je lipidovaný protein Osp v E. coli příliš asociován a buněčnou membránou. Stejně jako v případě Borrelie se musí Osp protein následně extrahovat z buněčné membrány pomocí detergentů. Exprese rekombinantních Osp
proteinů v E. coli nedodstraňuje tedy již popsaný problém přídavku detergentu. Použití E. coli k expresi proteinů Osp ovšem umožňuje zavádět do rekombinantních genů případně proteinů modifikace.
Varianty OspA zkrácené na N- konci, které se již nemohou dále lipidovat, nejsou již dále zakotveny v buněčné membráně. Dunn a spol. (1990, Prot. Expr. Purif. 1:159-68) exprimoval rekombinantní OspA, které chybělo prvních 17 aminokyselin divokého typu, v E. coli. N-terminus zkrácené Osp-A nebyl lipidován a následně rozpustný v nepřítomnosti detergentů. Tato nelipidovaná konstrukce OspA byla detekovatelná séry pacientů s lymskou borreliozou. To znamená, že v nelipidované OspA se zkráceným N-terminusem byla k dispozici nejméně jedna epitopa Borrelia, která v pacientech vyvolala imunní odpověď. Další rekombinantní nelipidovaná OspA, které chyběla první aminokyselina divokého typu, se v testu na zvířatech neprokázala jako imunogenní. (Erdile a spol. (1993), Infect Immun. 61:81-90). Chybějící imunogenita byla Erdilem a spol. experimentálně přisuzována jednoznačně chybějícímu lipidovému podílu. Nelipidovaný protein OspA se zkráceným N-terminusem z E. coli poskytuje podle toho nedostatečnou imunogenitu, než aby jej bylo možno použít v očkovací látce.
Fusní proteiny jsou podle stavu techniky další cestou, jak exprimovat Osp proteiny v E. coli. Fuse OspA s NS-1 (Nicht-Strukturelles Protein von Influenza, Gern a spol (1994), Immunol. Lett. 39:249-58, Telford III a spol.
(1995), J. Infect. Dis. 171:1368-70, OspA, OspB a OspC s glutathion-S-transferázou (Padula a spol. (1993), Infect. Immun. 61:5097-105, Telford III a spol. (1993), J. Exp. Med. 178:755-58) a OspC s maltose-binding-proteinem (Probert
a spol. (1994) Infect. Immun. 62:1920-26) jsou již popsány.
V těchto případech není daný protein Osp na základě blokády N-konce anfusovaným proteinem lipidován. Fusní partneři zmínění podle stavu techniky mají buďto stimulující účinek na imunní systém nebo usnadňují expresi nebo čištění fušního proteinu. Myšlenka fušního proteinu je tak další pokus, vyřešit dva velké problémy při výrobě proteinů Osp : silně sníženou imunogenitu nelipidovaných proteinů Osp a obtížnost čištění lipoproteinů Osp na očkovací látku použitelnou pro člověka. Protože fusní proteiny nejsou lipidovány, nejsou asociovány s buněčnou membránou, takže k isolaci daného fušního proteinu Osp není potřeba žádného detergentu. Fuse s glutathion-S-transferázou a maltose-binding-proteiny umožňuje čistit fusní proteiny pomocí specifických afinit daných nafusovaných proteinů.
Pro fusi OspA s N-koncem NS-1 dlouhým 81 aminokyselin lze doložit, že je možné dosáhnout jak relativně vysokých expresních poměrů v E. coli, tak i že fusní protein reaguje s homologovým imunním šerem (VO 93/04175). Z reakce s homologovým imunním šerem vyvozují autoři, že tento fusní protein má schopnost chránit před infekcí virulentním B. burgdorferi. Tetno předpoklad však nebyl ve VO 93/04175 doložen experimentálními daty.
Při fusích, které blokují N-terminus proteinu Osp se předpokládá, že fusní produkt není lipidován. Imunogenita těchto nelipidovaných fusních proteinů Osp se na jedné straně odvozuje od možného imunostimulujícího účinku nafusovaného proteinu'nebo části proteinu, na druhé straně se podle literatury (VO 93/08299) odvozuje od vysokých dávek adjuvans. Navíc mají takové fusní proteiny nevýhodu, že se v imunogenu vyskytují nejenom specifické antigeny Osp pro• ·
I <
• · teinu. Vysoké dávky adjuvancia se musí používat tehdy, jestliže očkovací antigeny mají špatnou imunogenitu. Protože vysoké dávky adjuvancia silně zvyšují riziko vedlejších účinků očkovací látky, nejsou očkovací antigeny, které vyžadují vysoké dávky adjuvans příznivé pro humánní použití (Gupta a spol. (1995), Vaccine 13:1263-76). Také ve VO 93/08299 se výslovně poukazuje na to, že je požadována očkovací látka neobsahující adjuvans. Proto dávají při vývoji očkovacích látek autoři VO 93/08299 přednost nativním, tedy lipidovaným proteinům Osp před nelipidovanými.
Probert a spol. popisují jinou cestu, která představuje především řešeni problematiky čištění. Exprimují fusní protein OspC-MBP (Maltose Binding Protein) v E. coli a využívají afinity MBP k amylose, aby specificky obohatili fusní protein, čímž jej váží na nosič obsahující amylosu. Po specifické isolaci fusního proteinu se z něj odštěpí podíl MBP, takže v konečném produktu se již vyskytuje pouze OspC.
V protikladu k nativnímu OspC chybí takto připravenému konečnému produktu N-koncový cystein. Na úrovni DNA se mezi MBP a OspC zavede přechodové místo místo pro faktor Xa, takže oba proteiny mohou být štěpeny aktivitou faktoru Xa. Nevýhodou této metody je, že jsou potřebné dodatečné kroky, totiž štěpící reakce s faktorem Xa a následující oddělení faktoru Xa a odštěpeného podílu MBP. Proti použití takové dodatečné štěpící reakce je nebezpečí, že stopy obou nebo jedné z těchto látek se vyskytnou v očkovací látce. Použití proteázy je ale problematické také proto, že dodatečná místa štěpení v proteinu Osp se mohou vyskytovat samy o sobě. Reakce proteázy by v takovém případě zničila konečný produkt.
Ve VO 94/25596 se kromě jiného popisuje výroba rekombinantní OspC v kvasinkách Pichia pastoris. Takto získaný OspC se vykazuje jako imunogenní a chrání v pokusech na zvířatech před homologovými Challenge. Preparace OspC z Pichia se provádí bez použití detergentů Buňky se mechanicky rozmělní v isotonickém pufrovacím roztoku, filtrují a centrifugují. OspC vyskytující se v přebytku se následně obohatí několika čisticími kroky pomocí chromatografie. Nevýhoda této metody vyplývá z toho, že centrifugace nevykazuje žádnou specificitu pro OspC. Proto se nachází také část proteinu pocházejícího z hostitelských buněk a z media v přebytku. Tyto proteiny jsou nežádoucí a musí se od produktu oddělit v několika na sebe navazujících krocích pomocí chromatografie. S každým tímto chromatografickým krokem je ale spojena vysoká ztráta produktu. Kromě toho nelze s naprostou jistotou zajistit, aby v konečném produktu nezůstaly stopy kontaminujících proteinů nebo jiných látek jako jsou lipidy, nukleové kysleiny a uhlohydráty.
Ve VO 95/21928 se popisuje exprese heterologových proteinů v methylotrofních kvasinkách, mezi jiným Pichia. Jako příklad heterologového proteinu se popisuje mezi jiným OspA. Ve VO 95/21928 jde především o vysoké výtěžky, které jsou v případě OspA po desintegraci buněk pomocí French press určeny ELISA. OspA se zvlášť nečistí a není také specificky charakterizována.
Přes existenci metod známých podle stavu techniky k výrobě očkovací látky proti lymské borrelioze tedy stále přetrvává potřeba vysoce čisté očkovací látky, která by bez pochyb mohla být použita pro člověka a která by vyvolala rosáhlou ochranu očkováním proti různým kmenům lymské borreliozy.
Je tedy úkolem předloženého vynálezu dát k dispozici zlepšený způsob k získávání a čištění rekombinantního proteinu Osp, který umožní jednoduché a účinné čištění imunologicky aktivní, rekombinantní Osp.
Podstata vynálezu
Předložený vynález poskytuje způsob výroby a čištění rekombinantního Osp odvozeného od Osp-Borrelia z eukaryontických hostitelských buněk, s výhodou kvasinkových buněk. Způsob podle vynálezu se vyznačuje tím, že se hostitelské buňky lysují a lysát se smísí s organickým rozpouštědlem za podmínek, za nichž buněčné proteiny v podstatě úplně vypadnou a rekombinantní protein Osp zůstane selektivně v roztoku, a protein Osp z roztoku se čistí a získává. Na základě mimořádného chování rekombinantního proteinu OspC v roztoku, obzvláště rekombinantního OspC, který se od jiných proteinů silně odlišuje, je tento krok velmi selektivní.
Organická rozpouštědla použitá ve způsobu podle vynálezu jsou jako rozpouštědla srážející proteiny známá : alkoholy, ketony s krátkým řetězcem, sulfoxidy a nitrily, s výhodou methanol, isomery propanolu, isomery butanolu, DMSO, acetonitril, dioxan, aceton a obzvláště výhodně ethanol. Organická rozpouštědla srážející proteiny se obvykle používají k tomu, vysrážet proteiny z roztoku a tyto dále v roztoku neudržovat. Organické rozpouštědlo se může v takovém případě použít jako účinné srážecí činidlo pro znečišťující látky. Většina proteinů vypadává za podmínek vytvořených podle předloženého způsobu; asociaci s proteiny vypadávají také nukleinové kyseliny z 99,99 %.
Tím poskytuje způsob podle vynálezu vysokou selektivitu již v prvním čistícím kroku. Vysoké obohacení rekombinantního proteinu Osp, obzvláště rekombinantního OspC a výrazné odstranění kontaminuj ících látek v roztoku snižuj i počet nutných následných čisticích kroků, takže vysoké výtěžky exprese v Pichia v dalším průběhu čištění se jen minimálně snižují a náklad na další čištění tak může zůstat minimální.
Přidání organického rozpouštědla vede k vypadávání znečisťujících proteinů a většiny nukleinových kyselin. Oddělení vysrážených látek příkladně z roztoku obsahujícího rekombinantní OspC se může podle předloženého vynálezu provádět sedimentací nebo filtrací. Sedimentace se s výhodou urychluje centrifugací, může se ale také provádět delším stáním, přičemž se vypadlé látky v důsledku přitažlivosti země shromažďuji na dně nádoby obsahující roztok. Po sedimentaci se může roztok obsahuj ící rekombinantní Osp z vysráženého sedimentu odebrat.
Při filtraci se roztok obsahující rekombinantní OspC od vysrážených látek odděluje pomocí filtru. K filtraci se používají příkladně sterilní filtry. Filtrace se s výhodou provádí ve dvou krocích. K předfiltraci se použije relativně hrubý filtr s relativně velkými póry, příkladně sterilní filtr 1 μπι. Následně se pro hlavní filtraci použije jemnější filtr s menšími póry, příkladně sterilní filtr 0,2 pm.
Po vysrážení organickým rozpouštědlem a sedimentaci nebo filtraci obsahuje roztok obsahující rekombinantní OspC ještě fosfolipidy, barviva a nepatrné stopy proteinů a nukleinových kyselin z hostitelských buněk. Ve srovnání s roztokem před srážením zbývá po vysrážení ještě asi 10 % prote12 inů z hostitelských buněk a media, asi 0,001 % nukleinových kyselin a asi 5 % lipidů. Ty se mohou s výhodou velmi účinně oddělit od rekombinantniho proteinu Osp, obzvláště OspC navazující chromatografií s obrácením fází.
Podle dalšího aspektu vynálezu se může chromatografie s obrácením fází použít k čištění výchozího materiálu obsahujícího Osp i bez předcházejícího čisticího stupně, jako je třeba vysrážení znečisťujících proteinů nebo nukleinových kyselin pomocí organických rozpouštědel (jak se popisuje výše). Předložený vynález proto zahrnuje také způsob čištění proteinů Osp z výchozího materiálu obsahujícího Osp, při němž se Osp protein selektivně váže na pevný nosič vhodný ke chromatografií s obrácením fází, případně se promyje a eluuje se. Vhodnými materiály mohou přitom být silikátové nosiče, s výhodou Spherisorb 5C18, nebo polymery z plastických hmot, s výhodou Source PR151 (Pharmacia) nebo Amberchromé CG 300 (Tosohaas).
Princip chromatografie s obrácením fázi spočívá v tom, že se molekuly v závislosti na jejich specifické afinitě rozdělují mezi pevnou hydrofobní a kapalnou hydrofilní fázi. Osp proteiny podle vynálezu, obzvláště OspC, mají vysokou afinitu k pevným hydrofobním nosičům, zatímco kontaminující látky - zbývající proteiny z hostitelských buněk a media, nukleinové kyseliny, fosfolipidy a barviva - zůstávají v kapalné hydrofilní fázi a oddělí se od pevného nosiče, na němž je vázán protein Osp. Obvykle se pevný nosič imobilizuje na sloupci, takže kapalná fáze, která obsahuje kontaminující látky, sloupcem protéká. Jestliže je nosič ve volné formě, oddělí se částice nosiče od kapalné fáze a promyje se elučním prostředkem s nízkou eluční aktivitou. Protein Osp má za těchto podmínek vyšší afinitu k nosiči než k roztoku. Ve • ·
způsobu podle vynálezu je tento krok obzvláště účinný při eliminaci nežádoucích proteinů z hostitelských buněk a media, nukleinových kyselin, fosfolipidů a barviv, tedy eliminaci, která při srážení organickými rozpouštědly neprobíhá úplně. Chromatografie s obrácením fází využívá obzvláště chování roztoků rekombinantního Osp proteinu získaného podle vynálezu, obzvláště OspC v organických rozpouštědlech. Při chromatografií s obrácením fází se podle vynálezu používá organické rozpouštědlo k eluci proteinu Osp. Nejprve se příkladně roztok obsahující rekombinantní OspC zředí vodným pufrovacím roztokem a uvede se do kontaktu s pevným nosičem. Podmínky se přitom stanoví tak, že se Osp protein selektivně váže na pevný nosič. Aby se protein Osp podle vynálezu vázal na nosič, zředí se roztok obsahuj ící Osp protein organickým rozpouštědlem tak, aby střední koncentrace roztoku měla nízkou eluční aktivitu.
Osp protein vyrobený podle vynálezu má za těchto podmínek k nosiči vyšší afinitu než k roztoku. Nosič může být ze silikátu, výhodný je přitom Spherisorb 5C18, nebo z polymerů ’Τ’Μ z plastických hmot, s výhodou Source RP15lfl (Pharmacia) nebo Amberchrome^ CG 300 (Tosohaas). Nosič může být uložen ve sloupci, může se ale také použít ve volné formě jako směs s roztokem. Rekombinantní protein Osp vyskytující se ve zředěném roztoku se selektivně váže na nosič, zatímco kontaminující fosfolipidy, barviva, proteiny a nukleinové kyseliny se neváží. Selektivita je zde určena použitými koncentracemi v koncentračním gradientu a druhem organického rozpouštědla.
Ve výhodné formě provedení předloženého vynálezu se jako rozpouštědlo použije ethanol, s výhodou v koncentraci okolo 45 %. Po vyčištění nosiče promytím elučním prostředkem s nízkou eluční aktivitou, příkladně fyziologickým puf• 4 rovacim roztokem s 35 %, 40 % nebo 45 % ethanolu se ze sloupce selektivně eluuje organickým rozpouštědlem použitým ve vysoké koncentraci, případně s vysokou eluční intenzitou protein Osp, obzvláště OspC. Rozpouštědlo s vysokou eluční aktivitou způsobí, že se protein Osp vázaný na nosiči, obzvláště OspC od nosiče uvolní a přechází pomocí rozpouštědla do roztoku.
V další formě provedení předloženého vynálezu se použije ethanol v koncentraci mezi 50 % a 60 %, s výhodou mezi 52 % a 57 %, obzvláště výhodně 55 %. Organické rozpouštědlo použité k eluci může být stejné rozpouštědlo, které se použije v prvním kroku ke srážení, může to být ale také jiné organické rozpouštědlo. Může se použít ve zvolené koncentraci nebo jako gradient mezi dvěma rozdílnými koncentracemi. V každém případě je koncentrace v oblasti od 10 % do 90 %, s výhodou od 20 % do 70 % a obzvláště výhodně v oblasti od 40 do 60 %. Organické rozpouštědlo se podle požadované koncentrace zředí ve vodném pufrovacim roztoku. Vodný pufrovací roztok může být příkladně roztok chloridu sodného pufrovaný fosforečnany, tris-pufr nebo citrátový pufr.
Výhodná organická rozpouštědla v rámci předloženého vynálezu se vyberou ze skupiny substancí srážejících proteiny, obzvláště jedno- nebo vícesytných alkoholů, ketonů s krátkým řetězcem, sulfoxidů nebo nitrilů, s výhodou je to methanol, n-propanol, 2-propanol a další isomery propanolu, t-butanol, 2-butanol a další isomery butanolu, DMSO, acetonitril, dioxan nebo aceton a obzvláště výhodně ethanol.
Organické rozpouštědlo může představovat jediné organické rozpouštědlo ve vodném, pufrovaném roztoku nebo to může být směs různých organických rozpouštědel. Organické rozpouštědlo použité v různých čisticích krocích podle vynálezu může být ve všech krocích stejné, mohou se ale při jednom čisticím procesu použít v různých krocích rozdílná organická rozpouštědla.
Jak již bylo výše uvedeno, měla by očkovací látka, která zprostředkuje efektivní ochranu před lymskou borreliozou, chránit přede všemi serologickými subtypy lymské borreliozy. Proto je účelné dát k dispozici polyvalentní směsnou vakcínu se širokou účinností. Polyvalentní směsná vakcína zde znamená, že očkovací látka obsahuje různé serologické subtypy proteinu Osp, obzvláště OspC. K provozní výrobě takové polyvalentní očkovací látky je žádoucí, mít k dispozici jednotné výrobní a čistící metody pro rozdílné složky. Dosavadní používané chromatografické postupy však musely být velmi specificky upraveny pro každou variantu Osp, aby se tento protein Osp oddělil od kontaminujících látek. Již minimální rozdíly v sekvenci aminokyselin, které se vyskytují u různých serologických variant proteinů Osp mohou změnit chování proteinu ve vysoce specifickém chromatografickém procesu tak, že se účinnost čištění negativně ovlivní.
Mnohé z již známých chromatografických procesů jsou založeny na skutečnosti, že Osp, obzvláště OspC se neváží vůbec, nebo jen velmi slabě na nosné materiály používané klasicky k čištění proteinů, které se používají v iontoměničích a hydrofohních interakčních gelech. Čisticí proces v důsledku toho probíhá jako tak zvaná negativní chromatograf ie , to znamená, že se postupně eliminované látky vazbou na různé nosiče odstraňují z roztoku obsahujícího Osp (OspC), zatímco Osp (OspC) se stále nalézá v průtočné fázi. Po řadě takových kroků by již pak měl být Ospo (OspC) ve vy16 čištěné formě. Tato metoda je však velmi pracná, kromě toho existuje nebezpečí, že kontaminující látka bude výrazně stržena do průtočné fáze. Negativní chromatografie musí být vždy přizpůsobena dané variantě Osp, přičemž již ale také byly objeveny varianty Osp, na které se takový proces nedá použít.
Metody, které je třeba upravit pro danou variantu Osp jsou pracné a drahé a proto nejsou pro oblast velkoprovozních výrob uspokojivé. Každý procesní krok se musí ověřit a validovat z hlediska obohacovacího účinku kontaminujících látek. Mnohé po sobě následuj ící procesní kroky vedou dále k velkým ztrátám produktu, protože při každém z těchto kroků je třeba počítat s určitými ztrátami.
Způsob výroby a čištění rekombinantního Osp, obzvláště OspC podle vynálezu je maximálně selektivní při minimu procesních kroků, čímž se redukují ztráty produktu. Způsob podle vynálezu je použitelný pro všechny serotypické varianty Osp, obzvláště OspC a tak je jej možné realizovat pro velkoprovozní měřítka. Minimální počet procesních kroků podmiňuje dále minimum možností kontaminace. Osp (OspC) čištěný postupem popsaným ve VO 94/25596 obsahuje až do 20 % zlomků a produktů odbourání. Způsob podle vynálezu vede na základě malého počtu potřebných procesních kroků maximálně jen k 5 % obsahu zlomků a produktů odbourání.
Ve zvláštní formě provedení postupu podle vynálezu se buňky kvasinek, obzvláště Pichia pastoris, které exprimují rekombinantní OspC podle vynálezu suspendují v Tris-pufru (pH 7,5) a desintegrují se v homogenizátoru Manton-Gaulin. Pevné součásti buněk se z roztoku oddělí centrifugací.
K roztoku se přidá ethanol až do konečné koncentrace 50 %.
Po jednohodinové inkubaci při teplotě místnosti se vzniklá sraženina oddělí z roztoku centrifugací. Rotzok se pomocí Tris-pufru (pH 7,5) zředí na koncentraci ethanolu 45 % a vnese se na chromatografický sloupec s náplní Source RC15TM (Pharmacia). S ethanolovým gradientem mezi 45 % a 75 % se ze sloupce eluuje OspC, přičemž se kontinuálně měří UV-absorpce eluentu. Za těchto podmínek eluuje rekombinantní OspC při koncentraci ethanolu mezi 52 % a 57 %.
Frakce obsahující OspC se sjednotí a pomocí gelové filtrace, příkladně přes Sephadex G25 se přepufruji proti fyziologicky snášenlivému pufru, příkladně fosfátovému pufru. Potom se provádí koncentrace pomocí ultrafiltrace přes membránu s hraniční propustností 5000 Da, příkladně Omega 5K (Filtron) .
Podle dalšího aspektu předloženého vynálezu se dává k dispozici rekombinantní OspC, který se vyznačuje tím, že není lipidován a sestává pouze s proteinického podílu B.burgdorferi lipoproteinu OspC. Tento nelipidovaný protein OspC podle toho představuje apoprotein OspC, tedy lipoprotein, kterému zcela chybí lipidový podíl. OspC podle tohoto aspektu vynálezu je proto kompletní, nefusovaný OspC. Překvapivě bylo objeveno, že rekombinantní OspC podle vynálezu z Pichia pastoris není lipidován a je vysoce imunogenní.
Toto bylo překvapivé obzvláště proto, že pro nelipidovaný OspA bylo zjištěno, že jeho imunogenita je ve srovnání s lipidovaným OspA silně snížena (Veis a spol., 1994, Infect. Immun. 62:4632-36). OspC podle vynálezu se dále vyznačuje tím, že je rozpustný v organických rozpouštědlech, které způsobují srážení proteinů, jako příkladně v 50 % ethanolu.
V rámci předloženého vynálezu se ukazuje, že exprese genu kódujícího pro nezkrácený OspC v kvasinkách, obzvláště • · v Pichia pastoris, překvapivě vede k proteinu OspC, jemuž chybí lipidový podíl. Nezkrácený znamená, že rekombinantní OspC odpovídá na úrovni aminokyselin procesovanému, přirozenému OspC a je zde N-terminální cystein. Důvodem pro absenci lipidového podílu je, že v Pichia pastoris chybí pro tuto posttranslační modifikaci OspC nutný enzymový systém, jaký se vyskytuje příkladně v bakteriích (Borrelia, E. coli). Jako důsledek absence lipidového podílu není protein OspC podle předloženého vynálezu asociován s membránou hostitelské buňky, nýbrž se nachází v cytosolu hostitelské buňky.
Překvapivě slouží rozpouštědla, která se používají podle předloženého vynálezu k tomu, aby se jimi vysrážely proteiny z roztoku. 0 to překvapivější proto je, že rekombinantní OspC podle vynálezu nevypadává s jinými proteiny, příkladně buněčnými proteiny nebo proteinovými složkami media jestliže se přidá organické rozpouštědlo, nýbrž je v organických rozpouštědlech rozpustný. Tato zvláštní vlastnost nebyla dosud nikdy spojována s OspC. Pro vyvinutí nového čisticího procesu pro OspC je tato neobvyklá forma rozpustnosti velmi důležitá. Důležité pro produkci očkovací látky je dále skutečnost, že se tato vlastnost týká všech dosud testovaných, serologických variant OspC.
Rekombinantní OspC čištěný podle vynálezu zprostředkuje vysoce účinnou ochranu očkováním před homologovými challenge a také překvapivě účinnou očkovací ochranu před heterologovými challenge. Imunogenita rekombinantního, ne1ipidováného OspC čištěného podle vynálezu je o to překvapivější, jestliže v dostupné literatuře je popsáno, že proteiny OspC od Borrelia jsou imunogení pouze tehdy, jestliže nesou lipidový podíl. Rekombinantní OspC čištěný podle vy• · nálezu je dále vysoce čistý a neobsahuje žádné kontaminanty nebezpečné pro člověka, jako proteiny hostitelských buněk, proteiny ze živného media, nukleinové kyseliny, pyrogení a toxické látky a lipidy. Na základě způsobu podle vynálezu k jeho výrobě a čištění je rekombinantní OspC podle vynálezu ze 100 % zbaven detergentů. OspC čištěný podle vynálezu se v testu na zvířatech podle USP (United States Pharmacopoia) prokázal jako úplně nepyrogení. Jeho snášenlivost byla dále prokázána v anomálnich testech toxicity podle USP a testu na dermoreaktivitu podle USP. Bez nebezpečí může být obsažen v očkovacích preparátech používaných pro člověka. Na základě jeho vysoké imunogenity vyžaduje OspC podle vynálezu jen nepatrné přídavky adjuvans.
Podle dalšího aspektu se týká předložený vynález přípravku OspC, který se získá způsobem čištění podle vynálezu.
K výrobě rekombinantního OspC podle předloženého vynálezu se zavede molekula polynukleotidu, který kóduje pro OspC do odpovídajícího vektoru v hostitelské buňce. Molekula polynukleotidu, která kóduje pro OspC se zde dále označuje jako gen OspC.
Gen OspC se může metodami, které j sou odborníkům známé preparovat z Borrelia a inzerovat do vektorové molekuly (PCR, Screening von Genbanken, Klonierung;, příkladně Maniatis a spol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratories (1982). Gen OspC se ale může vyrobit také syntetickou cestou s pomocí tak zvaného genového asembleru. Gen OspC inseruje 3 sekvence řídící expresi (promotor, enhancer, spojovací místo pro ribosomy) do vektorové molekuly. Sekvence řídící expresi ovlivňují
• ·
transkripci a translaci odpovídajícího genu, mohou také transkripci nebo translaci posilovat. Sekvence řídící experesi se na základě kriterií odborníkům známým volí tak, aby poskytovaly vysoké produkční dávky ve zvolené hostitelské buňce. Produkční dávky ve způsobu podle vynálezu leží v oblasti od 0,1 mg/g hmoty vlhké buňky (FZM) až 100 mg/g FZM, s výhodou v oblasti 1 mg/g FZM.
Hostitelské buňky použité ve způsobu podle vynálezu jsou eukaryontické buňky, s výhodou kvasinkové buňky.
S výhodu se kvasinkové buňky volí z následujících skupin : Hansenula sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomysec pombe, obzvláště výhodný je Pichia pastoris. Podle vynálezu se sekvence řídící expresi volí tak, aby byly vhodné pro expresi rekombinantního proteinu Osp, obzvláště OspC, v buňkách kvasinek. K expresi se mohou použít jak konstitutivní tak i indukovatelné promotory. Indukovatelné promotory se aktivují teprve přídavkem molekul induktoru, jsou řízené aktivovatelné k výrobě. Indukovatelné promotory jsou příkladně promotory ADH2, AOX, Isocytochrom C, azidfosfatáza, enzymy, které jsou asociovány s metabolismem dusíku, kovové thioniny, glyceraldehyd-3-fosfatázy, dehydrogenázy a enzymy, které jsou aktivní při metabolismu galaktosy a maltosy. Konstitutivními promotory jsou příkladně PGK1a ADH1-promotory a promotory 3-fosfoglycerátkinasy a dalších glykolitických enzymů jako příkladně enolasa, hexokinasa, pyruvát-dekarboxylasa, fosfofruktokinasa, glukosa-6-fosfát isomerasa, pyruvátkinasa a glukokinasa.
Vektorová molekula k expresi Osp (OspC) se může v buňkách kvasinek vyskytovat v cytoplasmě, příkladně jako YEp, YRp, YCp nebo YAC nebo může být v genomu kvasinkové buňky integrována případně jako YIp. Dále jsou vhodné tak zvané
Shuttle-Vektoren, které se mohou rozmnožovat jak v buňkách kvasinek, tak i v bakteriích, příkladně E. coli. Příkladem pro Shuttle-Vektor je pHIL-Al (Phillips Petroleum), který se může rozmnožovat v Pichia pastoris a v E. coli (VO
94/25596).
Gen OspC kóduje pro molekulu OspC, která je identická s variantou divokého typu Borrelia nebo je od ní odvozena. Odvozena zde znamená, že gen kóduje pro rekombinantní protein OspC, který je natolik identický s původní variantou, že protilátky orientované proti původní variantě respektují rekombinantní OspC. Gen se může modifikovat genovými technikami, může obsahovat mutace zavedené genovými technikami a může v oblasti 5 a 3 obsahovat nukleotidové sekvence, které ovlivňují jeho expresi požadovaným způsobem. Pokud je hostitelskou buňkou Pichya pastoris, může gen, příkladně zařízení promotorem specifickým pro Pichia, příkladně upravit pro methanolem indukovatelný promotor AOX-1. Transformaci, a pokud je nutné také k expresi v hostitelské buňce je gen obsažen také ve vektoru. Druh vektoru zde závisí především na hostitelské buňce, a výběr správného vektoru se provádí podle kritérií známých odborníkům. Podle vynálezu má použitý vektor připustit účinnou expresi po dlouhou dobu. Pokud je hostitelskou buňkou Pychia pastoris, je vektor s výhodou pHIL-Al (Phillips Petroleum) a gen OspC se řídí promotorem AOX-1 indukovatelným methanolem. Ve zvláštní formě provedení se konstruují konstrukty pHIL-Al jako ve VO 94/25596, případně pPC-PP4. Inzerovaný gen OspC pochází jako ve VO 94/25596 od kmenů B. burgdorferi B31,
PKO, ZS7, KL10 nebo E61, může ale také pocházet od jakéhokoli jiného kmene popsaného v Livey a spol., (1995, Mol. Microbiol. 18: 257 - 69) typu RFLP, případně být od něj odvozen .
Předložený vynález dává k dispozici novou metodu k získávání a čištění rekombinantního proteinu OscP, který je odvozen od Borrelia - OspC. Odvozený znamená, že rekombinantní OspC podle vynálezu je natolik podobný přirozenému OspC Borrelia, že ještě vyvolá produkci ochranných protilátek proti lymské borrelioze u savců, případně, že ještě reaguje s protilátkami proti OspC produkovanými u savců homologovými zárodky lymské borreliozy. OspC podle vynálezu může být především odvozen od všech serologických subtypů Borrelia-OscP. V případě Borrelia se jedná podle vynálezu o zárodky lymské borreliozy, s výhodou B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii sp. nov. a B. afzelii.
Předložený vynález dává k dispozici nový rekombinantní protein odvozený od Borrelia-OspC, který se vyznačuje tím, že není lipidován. Není lipidován znamená, že žádný podíl lipidu není kovalentně vázán na N-terminální cystein OspC. Rekombinantní OspC podle vynálezu může představovat každá serologická varianta Borrelia-OspC, ale také OspC odvozený od serologických variant.
Rekombinantní OspC podle vynálezu je dále charakterizován tím, že je v organickém rozpouštědle rozpustný za podmínek, za nichž vypadávají kontaminující proteiny a nukleinové kyseliny asociované s proteiny. Organické rozpouštědlo se podle vynálezu volí ze skupiny látek srážejících proteiny, obzvláště ze skupiny jedno- nebo vícesytných alkoholů, ketonů s krátkým řetězcem, sulfoxidů nebo nitrilů. Organickým rozpouštědlem je s výhodou methanol, n-propanol, 2-propanol nebo jiný isomer propanolu, ΐ-butanol, 2-butanol nebo jiný isomer butanolu, DMSO, acetonitril, dioxan nebo aceton a obzvláště výhodně ethanol. Organické rozpouštědlo
1» 99 ΦΦ ·Φ • ΦΦΦ ·ΦΦ·
Φ φ Φ Φ ΦΦ
Φ φ Φ ΦΦΦ Φ Φ
Φ Φ ΦΦΦ
ΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ Φ·
ΦΦ * • · ·· φ φ
Λ Φ
Φ Φ
ΦΦΦΦ ΦΦΦ je ve vodném pufrovacím roztoku. Organickým rozpouštědlem může být jediné organické rozpouštědlo ve vodném pufrovacím roztoku nebo může být směsí různých organických rozpouštědel. Vodný pufrovací roztok může být příkladně fosfáty pufrovaný roztok chloridu sodného, Tris-pufr nebo citrátový pufr. Podle vynálezu je organické rozpouštědlo v koncentraci od 10 % do 90 %, s výhodou od 20 % do 70 % a obzvláště výhodně 40 % až 60 %. ve vodném roztoku pufru. Vodný roztok pufru může být příkladně fosfáty pufrovaný roztok chloridu sodného, Tris-pufr nebo citrátový pufr.
Ve výhodné formě provedení je organické rozpouštědlo jedno- nebo vícesytný alkohol, obzvláště výhodně ethanol. Ethanol je ve vodném roztoku pufru v koncentrace mezi 40 % a 60 %, s výhodou mezi 45 % a 55 %.
Rekombinantní OspC podle vynálezu se s výhodou preparuje způsobem podle vynálezu k získávání a čištění Osp. Neobsahuje buněčné proteiny, pyrogenní a toxické látky, nukleinové kyseliny a lipidy. Protože rekombinantní OspC podle vynálezu se preparuje bez přídavku detergentů, neobsahuje tedy detergenty vůbec.
Rekombinantní OspC vyrobený podle vynálezu je vysoce čistý. Vykazuje čistotu nejméně 90 %, s výhodou 95 %, obzvláště výhodně 98 %. Čistota se demonstruje běžnými, biochemickými metodami (HPLC, elektroforéza a hmotová spektroskopie) (viz příklad 3).
Rekombinantní OspC podle vynálezu může být jedinou serologickou variantou, může být ale také směsí složenou z několika různých variant OspC. Obvykle se různé serologické varianty preparuji způsobem podle vynálezu odděleně. Protože způsob pro všechny serologické varianty OspC je možné použít jednotně, je ale také možné zároveň čistit různé varianty. Výhodou způsobu podle vynálezu zde není jenom to, že se způsob nemusí přizpůsobovat daným serotypům, nýbrž také to, že se různé varianty mohou bez problému mísit před nebo po preparaci. To je velmi užitečné především pro účinnou a jednotnou výrobu polyvalentní očkovací látky, která je nutná k prevenci lymské boreliosy.
Ve funkčních studiích je možné ukázat, že rekombinantní OspC podle vynálezu je vysoce imunogenní. Rekombinantni OspC podle vynálezu indukuje na myších vytvoření protilátek. Dále chrání nelipidovaný OspC podle vynálezu myši 100 %-ně před homologovými challenge. Překvapivě ale také zprostředkuje účinnou ochranu před heterologovými challenge, to znamená zprostředkuje ochranu před kmeny Borrelia, jejichž varianty OspC nebyly obsaženy v očkovací látce. Pokud se jednotlivá varianta OspC použije jako očkovací antigen, je možné pozorovat až 70 %-ní ochranu (viz Příklad 5). Pokud se jako očkovací antigen podá směs ze 3 rozdílných variant OspC, je heterologová ochrana 80 %-ní (viz Příklad 6). Tyto výsledky naznačují, že očkovací látka chránící účinně před lymskou borreliozou by měla s výhodou obsahovat několik rozdílných variant OspC. Způsob čištění OspC podle vynálezu je na základě jeho široké použitelnosti obzvláště příznivý k výrobě polyvalentních směsných vakcin. Vysoká imunogenita nelipidovaného OspC podle vynálezu uvedená v příkladech 5 a 6, je dále v protikladu k široce rozšířenému předpokladu odpovídajícímu stavu techniky, podle nějž proteiny Osp Borrelia mohou vykazovat účinnou imunogenitu pouze tehdy, pokud nesou lipidový podíl (VO 93/08299, Veis a spol. (1994), Infect. Immun. 62:4632-36; Erdile a spol. (1993), Infect. Immun. 61: 81-90).
• · • ·
Rekombinantní OspC podle vynálezu se může vyrábět způsobem podle vynálezu v obzvlášť vysoké čistotě a bez obsahu veškerých nebezpečných kontaminantů pro člověka jako jsou proteiny hostitelských buněk, proteiny ze živného media, nukleinové kyseliny, pyrogenní a toxické látky, lipidy a detergenty. Při pokusech na zvířatech (test pyrogenity, test anomální toxicity, dermoreaktivita) byl podán také důkaz snášenlivosti. Rekombinantní OspC podle vynálezu může být bez nebezpečí obsažen v preparátech očkovacích látek používaných pro člověka. Je tedy velmi vhodný k farmaceutickému použití. Farmaceutické použití zde znamená, že se v odpovídajícím fyziologickém nosiči a případně s přidanými látkami podá savcům, obzvláště člověku a má profylaktický nebo terapeutický účinek. Profylaktický nebo terapeutický účinek OspC spočívá v tom, že na základě jeho imunogenity představuje očkovací antigen. Očkovací antigen je antigen, který u savců vyvolává specifickou imunní odpověď. Tato imunní odpověď vede k humorální a/nebo celulární imunitě. Imunita znamená, že savec je chráněn před infekcí Borrelia nebo u něj infekce Borrelia probíhá snadněji než u savců, kteří nejsou imunní. Profylaktický účinek se projevuje při imunizaci zdravých savců. OspC je přitom obsažen v očkovací látce, který zdravým savcům propůjčuje imunologickou ochranu před lymskou borreliozou. Terapeutický účinek se může využít, jestliže již savec trpí infekcí Borrelia a OspC obsažený v očkovací látce posiluje imunní reakci proti Borrelia a tak podporuje proces léčení. OspC podle vynálezu se na základě jeho vysoké čistoty hodí také velmi dobře jako očkovací antigen pro děti.
Rekombinantní OspC podle vynálezu se může vhodným způsobem používat jako imunogen k výrobě protiser případně protilátek. K tomu se mohou probandy imunisovat imunologicky účinnou dávkou očkovacího antigenu a imunoglobulin se může izolovat a čistit způsobem známým podle stavu techniky. Jako informace o úspěchu očkování se může podat důkaz o tvorbě protilátek proti rekombinantnímu proteinu OspC.
Jako fyziologické nosiče se obvykle používají pufrovací roztoky, jako fosfátový pufr nebo citrátový pufr.
K eventuelně přidávaným látkám patří adjuvancia, příkladně sloučeniny hliníku, jako hydroxid hlinitý a fosforečnan hlinitý, Freundovo adjuvans, nebo jiné emulze minerálních olejů nebo rostlinných olejů, lipopolysacharidy, lipid A, saponin, Quil A, QS21 a ISCOMS. Výhodným adjuvans je hydroxid hlinitý. Vedle adjuvans se mohou k očkovací látce přidávat také carrier. Typickými carriery jsou liposomy, částice latexu nebo bentonit. K zesílení imunogenity očkovací látky se mohou přidávat také další látky stimulující imunitu, jako interleukiny, příkladně IL-1 nebo IL-2.
Dále patří k eventuelně přidávaným látkám také jiné antigeny, příkladně jiné antigeny Borrelia nebo virální antigeny. Jiné antigeny Borrelia mohou být příkladně OspA, OspB, OspE nebo OspF (Nguyen a spol., (1994); Infect. Immun. 62:2079-84) nebo jejich deriváty. Jiné virální antigeny mohou být příkladně antigeny viru TBE. Protože jak virus TBE tak i Boorrelia jsou přenášeny klíšťaty, nabízí se taková kombinace pro očkování lidí, kteří žijí v oblastech zamořených klíšťaty. Dále se mohou k očkovací látce přidat tak zvané nosné látky. Nosné látky jsou příkladně Tuberculin PPD, Serumalbin, Ovalbumin nebo Keyhole-Limpet- Hemocyanin.
Všechny látky přítomné v očkovací látce vedle očková27 • · · · • · t cích antigenů jsou s výhodou netoxické a nealergenní.
Formulace očkovacích látek je odborníkům známá. Očkovací antigen podle předloženého vynálezu se může lyofilizovat a teprve k použití se rozpustit ve fyziologicky přijatelném pufrovacím roztoku. Jako pufrovaci roztoky jsou vhodné fyziologické roztoky solí nebo jiné fyziologické roztoky. Očkovací antigen se smísí s fyziologickým pufrovacím roztokem k získání požadované koncentrace očkovacího antigenu. Požadovaná koncentrace je imunologicky účinná; leží v oblasti od 1 pg do 100 pg daného očkovacího antigenu na dávku, s výhodou v oblasti od 10 pg do 50 pg. Dávka očkovacího antigenu se může případně v dětské vakcíně redukovat, příkladně na dávku v rozmezí mezi 5 a 30 pg.
Konečně poskytuje předložený vynález k dispozici očkovací látku, která obsahuje nelipidovaný, rekombinantní OspC podle vynálezu. Očkovací látka je vhodná k podávání savcům, s výhodou lidem. Podle oblastí a požadovaného rozsahu ochrany očkováním obsahuje očkovací látka jednu nebo několik serologicky rozdílných variant OspC podle vynálezu. Serologické varianty odpovídají 35 typům RFLP popsaným Livey a spol (1995, Mol. Microbiol. 18: 257-69). Složení očkovacích látek může ale také odpovídat specifickým složením pro regiony popsaným ve VO 94/25596, které obsahují rozdílné varianty OspC.
V jedné formě provedení obsahuje očkovací látka tři až osm rozdílných serologických variant OspC podle vynálezu a poskytuje širokou heterologovou ochranu proti serotypům Borrelia, které se vyskytují v určité oblasti. V jedné zvláštní formě provedení obsahuje očkovací látka tři rozdílné serologické varianty OspC, příkladně složení RFLP-varianty • · 9
Orth, PKO a E61 nebo RFLP-variant ZS7, PKO a E61. Je ale možné každé složení dvou nebo více variant RFLP podle Livey a spol. (1995, Mol. Microbiol. 18: 257-69).
Předložený vynález bude blíže vysvětlen následujícími příklady a zobrazeními, aniž by se však na ně omezoval.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. | 1 až 3 | zobrazují optimalizaci srážení; |
Obr. | 4 | optimalizaci eluce a |
Obr. | 5 až 8 | šetření čistoty konvenčně získaných proteinů OspC případně proteinů OspC získaných podle vynálezu |
Příklady provedení vvnálezu
Příklad 1
Exprese rekombinantního OspC (rOspC) v Pichia pastoris
Kmen Pichia pastoris GS115 NRRL-Z 11430 (Cregg a spol. (1985); Mol. Cell. Biol. 5:3376-85) se metodou podle Dohmen a spol. (1991; Yeast 7:691-92) transformuje vektorem pPCPP4 (popsán ve VO 94/25596), který obsahuje gen OspC Borrelia burgdorferi kmene Orth, kmene ACA1 nebo kmene ZS7. Transformanty se pěstují při teplotě 30 °C v mediu MD až k dosažení optické hustoty (OD 600) 2-10. Indukce a analýza exprese OspC se provádí způsobem popsaným ve VO 94/25596.
• · · • · · · · • · · • « · »
• · · · ·
Příklad 2
Čištění rOspC z Pichia pastoris (podle názoru přihlašovatele je příklad 2 toho času nej lepší formou provádění vynálezu).
500 g vlhké buněčné hmoty transformované rOspC (kmen Orth nebo ZS7) exprimující kvasinkové buňky Pichia se suspenduje v 500 ml Tris-pufru (20 mM Tris-HCl, pH 9,0) a dezintegruje se v homogenizátoru Manton-Gaulin. Pevné součásti kvasinkových buněk se ze suspenze odstraní centrifugací (15 minut při 10.000 g).
Za míchání se přidává 95 %-ní ethanol, dokud se nedosáhne konečné koncentrace 50 % ethanolu. Po jednohodinové inkubaci při teplotě 4 °C se vzniklá sraženina odstraní centrifugací (15 minut při 20.000 g). Čirý zbytek neobsahující buňky se zředí Tris-pufrem (20 mM Tris-HCl, pH 9,0) na koncentraci ethanolu 45 % a následně se vnese na chromatografický sloupec, plněný Source RP151 (Pharmacia). Sloupec se promývá 45 %-ním ethanolem v roztoku chloridu sodného pufrovaném fosfátovým pufrem.
S gradientem ethanolu 45 % až 70 % v roztoku chloridu sodného ve fosfátovém pufru se ze sloupce eluuje rOspC. UV-absorbce eluentu se kontinuálně měří při vlnové délce 214 nM. rOspC se eluuje při koncentraci ethanolu okolo 55 %. OspC-pozitivní frakce se sjednotí. Pufr se pomocí gelové filtrace přes Sephadex G25 nahradí pufrem Tris-HCl + 0,9 % NaCl (pH 7,4). Následně se roztok koncentruje ultrafiltrací pomocí membrány Omega 5K (Filtron).
Příklad 3
Analýza rOspC čištěného podle Příkladu 2
Výtěžky a čistota rOspC podle Přikladu 2 se stanoví podle metody BCA, HPLC, SDS-PAGE,
Limulus-Amoebozyten-Lysat, plynovou chromatografií a metodou fenol/H2S04· Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 1 (kmen Orth) a v Tabulce 2 (kmen ZS7). Příklad ukazuje, že se metodou podle vynálezu mohou účinně čistit proteiny rOspC velmi rozdílných podtypů (Orth, ZS7 : homologie = 69,2 %). Hodnoty popsané v tabulkách demonstrují vysokou čistotu daného rOspC.
Tabulka 1
Analýza rOspC kmene Orth čištěného podle Příkladu 2
Vlastnost | použitá metoda | |
Obsah proteinů | metoda BCA | 1,5 mg/ml |
Čistota | HPLC | 98 % |
Čistota | SDS-PAGE | > 95 % |
Obsah endotoxinů | LAL | <1,5 EU/ml |
Lipidy | plynová chromatografie | < 0,01 mg/ml |
Uhlohydráty | fenol/H2S04 | < 0,02 mg/ml |
fe ·
Tabulka 2
Analýza rOspC kmene ZS7 čištěného podle Příkladu 2
Vlastnost | použitá metoda | |
Obsah proteinů | metoda BCA | 0,9 mg/ml |
Čistota | HPLC | 98 % |
Čistota | SDS-PAGE | > 95 % |
Obsah endotoxinů | LAL | <1,5 EU/ml |
Lipidy | plynová chromatografie | < 0,01 mg/ml |
Uhlohydráty | fenol/H2S04 | < 0,02 mg/ml |
Příklad 4
Srovnání různých organických rozpouštědel k čištění rOspC z Pichia pastoris
Vždy 1 ml suspenze desintegrovaných kvasinkových buněk podle Příkladu 2, které exprimují rOspC kmene Orth se smísí s různými organickými rozpouštědly na koncentrace uvedené v Tabulce 3. Po jednohodinové inkubaci při teplotě 4 °C se vzniklá sraženina odcentrifuguje (15 minut, 20.000).
Alikvot zbytku se podrobí proteinové analýze pomocí SDSPAGE. Výtěžky rOspC se stanoví densitometrickým vyhodnocením gelu SDS-PAGE vybarveného pomocí Coomassie-Blau. Výtěžky se přitom vztáhnou ná hodnotu srážení ethanolem. Příklad ukazuje, že se vedle ethanolu mohou jako srážecí činidlo pro znečišťující látky používat také jiná organická rozpouštědla, příkladně terč.-butanol, 2-butanol, acetonitril a dio« · · · · xan, přičemž rOspC se v převažující části získá jako rozpustný protein ze zbytku po srážení.
Tabulka 3 :
Rozpouštědlo | Výtěžek (v %) | Čistota (v %) |
Konečná konc. v % | po 1. srážení | po 1. srážení |
Ethanol (50 %) | 100 | 80 |
2-propanol (50 %) | 70 | 25 |
t-butanol (50 %) | 80 | 65 |
acetonitril (40 %) | 80 | 60 |
dioxan (50 %) | 70 | 60 |
Příklad 5
Imunizace myší pomocí rOspC
Laboratorní myši C3H/HeJ se dvakrát imunizují dávkou 3 pg rOspC ve formulaci s hydroxidem hlinitým (0,2 %) . Titr protilátky proti imunizačním antigenům se stanovuje pomocí ELISA za použití Borrelia-OspC. Dva týdny po druhé imunizaci se zvířata podrobí dávce 10^ infekčních Borrelií (10 i.d. 50) homologového nebo heterologového kmenu (Challenge). Po dalším týdnu se myším odebere krev a další orgány (srdce, močový měchýř, ledvina, slezina) k diagnose infekce. Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 4; dokládají vynikající ochranný účinek, kterého se dosáhne rOspC čištěným podle příkladu 2 proti homologovému Challenge. Všechny tři testované antigeny OspC (kmeny Orth, ZS7 a ACA1) způsobuji stoprocentní ochranu před homologovým Challenge. Tabulka 4 dále ukazuje, že v heterologovém Challenge lze dosáhnout částečného ochranného účinku do 70 %.
Tabulka 4
Antigen | Challenge | Titr před | Infikovaná |
(kmen) | (104 zárodků) | Challenge | zvířata (%) |
žádný | Orth | > 1:1000 | 100 |
Orth | Orth | 1:50000 | 0 |
ZS7 | ZS7 | 1:50000 | 0 |
ACA1 | ACA1 | 1:50000 | 0 |
Orth | ZS7 | 1:50000 | 80 |
ZS7 | Orth | 1:50000 | 30 |
Příklad 6
Imunizace myší různými směsemi rekombinantního OspC
Jak se popisuje v příkladu 5, imunizují se myši C3H, v tomto pokusu se však místo 3 gg jedné jediné varianty rOspC podávají různé varianty rOspC. Složení různých směsí je uvedeno v Tabulce 5. Celková dávka antigenu činí ve všech případech 9 gg. Challenge se zde provádí různými kmeny Borrelia (jedním homologovým a jedním heterologovým kmenem). Výsledky těchto experimentů jsou shrnuty v Tabulce 5. Výsledky ukazuji, že směsná vakcína, která byla složena ze třech různých variant OspC, chrání nejenom před kmeny Borrelia, jejichž varianty OspC byly obsaženy v očkovací látce, nýbrž v neočekávaně vysokém procentním podílu (80 %) také před heterologovými kmeny Borrelia.
Tabulka 5
Antigen | Titr (xlOOO) | Infikovaná zvířata v % po Challenge s | ||||
Orth | ZS7 | E61 | PKO | Orth | ZS7 | |
žádný | neg. | neg. | neg. | neg. | 100 | 100 |
Orth | 50 | <1 | <1 | <1 | 0 | 80 |
ZS7 | 6 | 50 | 15 | 16 | 30 | 0 |
Orth/PKO/E61 | 60 | 25 | 55 | 50 | 0 | 20 |
ZS7/PKO/E61 | 11 | 70 | 50 | 60 | 20 | 0 |
Příklad 7
Optimalizace srážení pro OspC
Optimální podmínky pro srážení se mohou měnit podle druhu použitého rozpouštědla, zejména pokud se týká množství použitého organického rozpouštědla. Jako optimální koncentrace příslušného organického rozpouštědla se podle vynálezu volí taková koncentrace, při které buněčné proteiny v podstatě úplně vypadnou, avšak proteiny Osp ještě ne, případně vypadnou jen v nepatrné míře.
Ke stanovení optimální koncentrace srážení různými organickými rozpouštědly se proto vyrobená rekombinantní kapalina s kulturou rOspC jako výchozí roztok zpracuje s methanolem, 2-propanolem, t-butanolem, DMSO, acetonitrilem a dioxanem jako rozpouštědly s rozdílnými koncentracemi (10 %, %, 40 % a 50 %) a výsledek se šetří pomocí gelové
elektroforézy (viz obrázek 1 a 2).
Ukazuje se, že optimálního oddělení doprovodných proteinů od proteinu Osp se dosáhne srážením methanolem při 40 %, 2-propanolem při 50 %, t-butanolem při 50 %, DMSO při 40 %, acetonitrilem při 40 % a dioxanem při 50 %.
Příklad 8
Optimalizace srážení ethanolem
Výchozí roztok obsahuj ící rekombinantní OspC se zpracuje s 30 %, 40 %, 45 % a 50 % a získané roztoky se zkoumají pomocí gelové elektroforézy SDS a analýzou Western Blot.
Výsledky j sou uvedeny na Obrázku 3 a ukazuj i, že s ethanolem o koncentraci mezi 40 % a 50 % je možné dosáhnout optimálního srážení rOspC.
Příklad 9
Optimalizace zpracování adsorpcí
K optimalitaci zpracování adsorpcí se zkoumá eluce proteinu Osp adsorbovaného na pevném nosiči pomocí lineárního ethanolového gradientu mezi 45 % a 70 %.
Výsledky jsou uvedeny na obrázku 4 a v dále uvedených tabulkách.
• · • · • ·
Tabulka 6
Peak # | RT [min] | Typ | Šířka [min] | Plocha [mAO x s] ____________|- | Výška [mAO] ------------1- | Plocha % |
1 | 7.129 | |------ W | 1 1 0.080 | 8.27969 | 1.62639 | 0.1677 |
2 | 7.666 | PV | 0.070 | 25.54446 | 4.91349 | 0.5174 |
3 | 7.883 | w | 0.099 | 4851.37891 | 684.38525 | 98.2665 |
4 | 8.449 | VB | 0.049 | 5.95952 | 1.73231 | 0.1207 |
5 | 9.556 | W | 0.118 | 45.79729 | 5.07893 | 0.9276 |
Celkem | 4936.95996 | 697.73639 |
Příklad 10
Srovnávací příklad k VO 94/25596
Ke srovnání přípravy OspC podle VO 94/25596 a podle vynálezu se čistí rekombinantní OspC kmene Orth/F17 a kmene ACA1 s pomocí konvenčního postupu podle VO 94/25596 a způsobem podle vynálezu. Výsledky jsou uvedeny na obrázcích 5 a 6 a v tabulkách 7 a 8 (pro postup podle VO 94/25596) a na obrázcích 7 a 8 případně tabulkách 9 a 10 (pro způsob podle vynálezu).
Ukazuje se, že se obvyklými postupy čištění může dosáhnout rozdílného stupně čistoty produktu OspC, která může kolísat mezi čistotou 56 % a 80 %. Tak byl způsobem podle VO 94/25596 získán rekombinantní OspC kmene Orth/F17 s čistotou 80 % a kmene ACA1 s čistotou 56 %.
Oproti tomu se může způsobem čištění podle vynálezu získat výrazně lepší čistota přípravku rekombinantního nelipidovaného OspC, která činí nejméně 95 % a může dosáhnou hodnoty dokonce 99 % (viz Obrázek 8 a Tabulka 10).
• ·
Navíc je nutno zdůraznit, že způsoby čištění podle vynálezu jsou použitelné pro všechny dosud známé varianty Osp, přičemž pro všechny varianty se může získat jednotný stupeň vyčištění antigenu, což dosud známými metodami nebylo možné. Získáním rozdílných variant Osp s jednotným stupněm vyčištění je proto také poprvé možné vyrobit přípravky o čistotě nejméně 90 %, přičemž obzvláště se směsí nejméně 3 rozdílných serologických variant Osp se může vyrobit očkovací přípravek, který chrání i proti challenge s heterologovými kmeny Borrelia. Tím je dosaženo zásadního zlomu při výrobě očkovacích látek proti Borrelia s širokým rozsahem ochrany.
Oproti tomu bylo srovnávací studií podle VO 94/25596 zjištěno, že přípravky OspC získané z kvasinek chrání pouze proti infekci homologovými kmeny.
Tabulka 7
Peak | RT | Typ | Šířka | Plocha | Výška | Plocha |
# 1____I | [min] | I___ | [min] . I _____I | [mAO x s] ___________I | [mAO] __________I . | % |
1 I 1 | 4.628 | 1 PV | 1 1 0.229 | 1 177.69142 | 1 10.31256 | 3.6800 |
2 | 5.075 | w | 0.076 | 23.25017 | 3.97309 | 0.4815 |
3 | 5.131 | w | 0.051 | 17.73720 | 4.89392 | 0.3673 |
4 | 5.180 | w | 0.068 | 23.47639 | 4.70628 | 0.4862 |
5 | 5.410 | w | 0.071 | 102.99156 | 20.97543 | 2.1329 |
6 | 6.296 | w | 0.054 | 16.66883 | 4.29893 | 0.3452 |
7 | 6.456 | w | 0.102 | 27.91520 | 3.57525 | 0.5781 |
8 | 7.124 | w | 0.102 | 96.15434 | 12.05207 | 1.9913 |
9 | 7.340 | w | 0.102 | 51.24856 | 6.48721 | 1.0614 |
10 | 7.456 | w | 0.077 | 36.35993 | 6.25955 | 0.7530. |
11 | 7.634 | w | 0.072 | 2449.22803 | 516.16937 | 50.7232 |
12 | 7.721 | w | 0.092 | 1456.86633 | 237.46468 . | 30.1715 |
13 | 8.150 | w | 0.063 | 32.59999 | 7.25347 | 0.6751 |
14 | 8.247 | w | 0.065 | 69.71961 | 15.43299 | 1.4439 |
15 | 8.748 | w | 0.082 | 37.33817 | 6.13417 | 0.7733 |
16 | 8.847 | w | 0.055 | 110.15652 | 29.61396 | 2.2813 |
17 | 9.413 | w | 0.051 | 35.14756 | 10.23840 | 0.7279 |
18 | 10.066 | BV | 0.056 | 41.27703 | 10.55653 | 0.8548 |
19 | 10.310 | w | 0.058 | 22.78672 | 5.92479 | 0.4719 |
4828.61377 916.32269
Celkem
Tabulka 8
Peak RT Typ Šířka Plocha
Výška
Plocha
# | [min] | [min] | [mAO x s] i____________i | [mAO] | % | |
----I 1 | 3.666 | |------ w | i 0.104 | 76.72591 | 11.26516 | 1.8058 |
2 | 3.776 | w | 0.035 | 13.63044 | 6.43005 | 0.3208 |
3 | 3.840 | w | 0.051 | 32.56386 | 9.11639 | 0.7664 |
4 | 3.891 | w | 0.067 | 44.94176 | 8.83538 | 1.0577 |
5 | 4.117 | w | 0.095 | 136.84679 | 18.46668 | 3.2207 |
6 | 4.216 | w | 0.049 | 32.40656 | 9.43964 | 0.7627 |
7 | 4.293 | w | 0.059 | 42.06274 | 9.72205 | 0.9900 |
8 | 4.708 | w | 0.271 | 1011.13867 | 49.68585 | 23.7974 |
9 | ·. 5.124 | w | 0.151 | 153.73065 | 13.06296 | 3.6181 |
10 | 5.327 | w | 0.083 | 60.29200 | 10.13262 | 1.4190 |
11 | 5.421 | w | 0.086 | 76.35560 | 11.45869 | 1.7970 |
12 | 5.664 | w | 0.073 | 29.88213 | 5.62164 | 0.7033 |
13 | 6.072 | w | 0.070 | 48.29964 | 9.32081 | 1.1367 |
14 | 6.461 | w | 0.055 | 14.11311 | 3.63805 | 0.3322 |
15 | 6.801 | w | 0.076 | 10.21406 | 2.13184 | 0.2404 |
16 | 7.689 | PV | 0.078 | 34.36339 | 6.54271 | 0.8087 |
17 | 7.854 | w | 0.086 | 2392.88062 | 403.43259 | 56.3169 |
18 | 8.257 | w | 0.090 | 23.96358 | 3.49553 | 0.5640 |
19 | 8.854 | w | 0.044 | 9.72101 | 3.31730 | 0.2288 |
20 | 9.415 | BV | 0.050 | 4.82040 | 1.36065 | 0.1134 |
4248.95313. 596.47662
Tabulka 9
Peak | RT [min] | Typ | Šířka [min] | Plocha [mAO x s] ____________i | Výška [mAO] ............1. | Plocha % |
|----| 1 | 4.670 | |------ BV | 0.197 | 1 53.18630 | 3.46254 | 1.9235 |
2 | 5.028 | W | 0.034 | 1.48847e-l | 7.31092e-2 | 0.0054 |
3 | 5.423 | W | 0.036 | 5.55494 | 2.34552 | 0.2009 |
4 | 6.457 | W | 0.073 | 5.84710 | 1.07350 | 0.2115 |
5 | 6.629 | PV | .'0.041 | 9.57081e-l | 3,55412e-l | 0.0346 |
6 | 7.124 | W | 0.056 | 3.70759 | 9.01566e-l | 0.1341 |
7 | 7.364 | BV | 0.066 | 10.94985 | 2.37225 | 0.3960 |
8 | .7.503 | W | 0.046 | 9.87367 | 3.15355 | 0.3571 |
9 | 7.640 | W | 0.069 | 1879.25562 | 418.27679 | 67.9650 |
10 | 7.760 | W | 0.087 | 671.17523 | 113.45638 | 24.2737 |
11 | 7.982 | W | 0.116 | 99.16217 | 11.69299 | 3.5863 |
12 | 8.259 | W | 0.057 | 8.63425 | 2.11423 | 0.3123 |
13 | 8.855 | W | 0.046 | 9.47382 | 3.07899 | 0.3426 |
14 | 10.070 | W | 0.068 | 7.10788 | 1.47169 | 0.2571 |
2765.03442
563.82855
Celkem • ·
Tabulka 10
Peak | RT | Typ | Šířka | Plocha | Výška | Plocha | |
# | | | [min] | [min] | [mAO x s] ____________I | [mAO] ____________1 | % | ||
1 — 1 1 | 7.823 | |------ PV | 0.085 | ------------| 3995.36450 | 1 690.66522 | 99.3560 | |
2 | 8.424 | VB | 0.147 | 25.89507 | 2.92927 | 0.6440 |
4021.25952
693.59448
Celkem
Claims (16)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob výroby a čištění nelipidovaného rekombinantního proteinu Osp odvozeného od povrchového lipoproteinu Borrelia z eukaryontických hostitelských buněk, vyznačující se tím, že se lysat hostitelských buněk smísí s organickým rozpouštědlem srážejícím proteiny za podmínek, za nichž buněčné proteiny v podstatě úplně vypadnou a nelipidovaný rekombinantní protein Osp zůstane selektivně v roztoku a protein Osp se z organického rozpouštědla čistí a získává.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se vysrážené buněčné proteiny sedimentací oddělí od rekombinantního proteinu Osp a rekombinantní protein Osp zůstane v roztoku.
- 3. Způsob podle některého z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se roztok obsahující protein Osp uvede v kontakt s pevným nosičem za podmínek, při nichž se protein Osp selektivně váže na nosič a že se následně eluuje organickým rozpouštědlem.
- 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se protein Osp selektivně váže na pevný nosič vhodný ke chromatografií s obrácením fází, případně se promyje a eluuje.
- 5. Způsob podle některého z nároků 3 nebo 4, vyznačující se tím, že pevný nosič je silikát, s výhodou Spherisorb 5C18, nebo polymer z plastu,TM R s výhodou Source PR15 nebo Amberchrome .» · · · ·
- 6. Způsob podle některého z nároků 3 až 5, vyznačuj ící se tím, že se eluce provádí pomocí gradientu organického rozpouštědla.
- 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že se organické rozpouštědlo vybere ze skupiny substancí srážejících proteiny, obzvláště jednosytných nebo vícesytných alkoholů, ketonů s krátkým řetězcem, sulfoxidů nebo nitrilů, s výhodou methanol, n-propanol, 2-propanol a další isomery propanolu, t-butanol, 2-butanol a další isomery butanolu, dimethylsulfoxid, acetonitril, dioxan nebo aceton a obzvláště výhodně ethanol.
- 8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že se použije směs různých organických rozpouštědel.
- 9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že se organické rozpouštědlo použije v koncentraci 10 % až 90 %, s výhodou 20 % až 70 % a obzvláště výhodně 40 % až 60 % ve vodném pufrovacím roztoku.
- 10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se použij i eukaryontické hostitelské buňky ze skupiny kvasinek, s výhodou Hansenula sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomysec pombe a obzvláště výhodně Pichia pastoris.
- 11.Způsob podle některého z nároků 1 až 10, • · • · · · · · · · • ·· · ······· • · · · · · « ···· ··· ··· ···· »· «· vyznačující se tím, že se jako protein Osp získá OspC.
- 12. OspC-Preparát, získatelný podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že obsahuje nelipidovaný rekombinantní OspC v čistotě nejméně 90 %, s výhodou 95 % a obzvláště výhodně 98 % , přičemž OspC zahrnuje kompletní aminokyselinovou sekvenci OspC, není fusionován a sestává pouze z proteinového podílu OspC-proteinu B. burgdorferi.
- 13. OspC-Preparát podle nároku 12, vyznačující se tím, že má obsah lipidů nižší než 0,01 mg/ml a obsah endotoxinů nižší než 1,5 EU/ml a prakticky neobsahuje nukleové kyseliny a .
- 14. OspC-Preparát podle některého z nároků 12 nebo 13, vyznačující se tím, že přídavně obsahuje antigen vybraný ze skupiny antigenů B. burgdorferi OspA, OspB, OspD, OspE nebo OspF nebo virus TBE.
- 15. Použití OspC-preparátu podle některého z nároků 12 až 14 k výrobě očkovací látky pro imunizaci savců proti lymské borrelioze.
- 16. Způsob výroby očkovací látky, obsahující rekombinantní OspC-protein, odvozený od povrchového lipoproteinu Borrelia, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky- výrobu a čištění nelipidovaného rekombinantního proteinu OspC podle některého z nároků 1 až 11 ,- formulaci dávky, obsahující vyčištěný OspC, která je dostatečná k tomu, aby indukovala imunitní odezvu u savců,- přičemž formulace popřípadě obsahuje hliník jako adjuvans.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AT0110696A AT405940B (de) | 1996-06-21 | 1996-06-21 | Verfahren zur gewinnung und reinigung von rekombinantem, nicht-lipidiertem osp-protein |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ425398A3 true CZ425398A3 (cs) | 1999-03-17 |
Family
ID=3506722
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ984253A CZ425398A3 (cs) | 1996-06-21 | 1997-06-19 | Způsob výroby a čištění rekombinantního, nelipidovaného proteinu Osp |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0973909A2 (cs) |
JP (1) | JP2000516444A (cs) |
AT (1) | AT405940B (cs) |
CA (1) | CA2259636A1 (cs) |
CZ (1) | CZ425398A3 (cs) |
NO (1) | NO985902L (cs) |
WO (1) | WO1997049812A2 (cs) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1645283A1 (en) * | 2004-10-08 | 2006-04-12 | Chiron Behring GmbH & Co. KG | Combination vaccine |
PL2199303T3 (pl) | 2008-12-12 | 2013-11-29 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag | Polipeptydy i sposoby swoistego wykrywania przeciwciał u pacjentów z zakażeniem krętkami Borrelia |
CN114295745B (zh) * | 2021-12-23 | 2023-09-08 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 一种水痘减毒活疫苗中二甲基亚砜残留量的检测方法 |
CN115267027B (zh) * | 2022-08-29 | 2023-05-02 | 上海市精神卫生中心(上海市心理咨询培训中心) | 一种用于检测精神类药物的试剂盒和检测方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE162550T1 (de) * | 1993-04-29 | 1998-02-15 | Immuno Ag | Ospc-antigen-impfstoffe immunogene zusammensetzung zur vorbeugung und behandlung von lyme-krankheit und rekombinante verfahren zur herstellung von derartige antigene |
US5620862A (en) * | 1993-11-24 | 1997-04-15 | University Of Connecticut | Methods for diagnosing early Lyme disease |
-
1996
- 1996-06-21 AT AT0110696A patent/AT405940B/de not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-06-19 JP JP10501944A patent/JP2000516444A/ja active Pending
- 1997-06-19 WO PCT/AT1997/000136 patent/WO1997049812A2/de not_active Application Discontinuation
- 1997-06-19 EP EP97926912A patent/EP0973909A2/de not_active Withdrawn
- 1997-06-19 CZ CZ984253A patent/CZ425398A3/cs unknown
- 1997-06-19 CA CA002259636A patent/CA2259636A1/en not_active Abandoned
-
1998
- 1998-12-16 NO NO985902A patent/NO985902L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2259636A1 (en) | 1997-12-31 |
EP0973909A2 (de) | 2000-01-26 |
NO985902D0 (no) | 1998-12-16 |
WO1997049812A2 (de) | 1997-12-31 |
WO1997049812A3 (de) | 1999-11-04 |
ATA110696A (de) | 1999-05-15 |
NO985902L (no) | 1999-02-19 |
AT405940B (de) | 1999-12-27 |
JP2000516444A (ja) | 2000-12-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4180590B2 (ja) | クレブシエラ・ニューモニエ由来の免疫アジュバントタンパク質 | |
SU1746887A3 (ru) | Способ получени гибридного полипептида, содержащего НВ @ А @ | |
FI107334B (fi) | Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen taudin estämiseksi | |
CN111050795B (zh) | 基于合成的多肽表位的疫苗组合物 | |
AU594400B2 (en) | Major iron-regulated protein of neisseria gonorrhoeae and its use as vaccine | |
JPH09500538A (ja) | ナイセリア・メニンギチジス外膜グループbポーリンタンパク質の高レベル発現、精製および再生 | |
CA2677023A1 (en) | Method of purification of hydrophobic proteins | |
CN114929877A (zh) | 突变型rsv f蛋白及其利用 | |
WO2010149657A1 (en) | Method for the purification of hbha | |
JPS6237A (ja) | ワクチン | |
Cullen et al. | Construction and evaluation of a plasmid vector for the expression of recombinant lipoproteins in Escherichia coli | |
CZ425398A3 (cs) | Způsob výroby a čištění rekombinantního, nelipidovaného proteinu Osp | |
EP0491859A1 (en) | TREPONEMA HYODYSENTERIAE ANTIGENS HAVING A MOLECULAR WEIGHT OF 39kDa AND DNA ENCODING THEREFOR | |
US20130183330A1 (en) | Recombinant avian infectious coryza vaccine and process for preparing same | |
EP0620860A1 (en) | Preparation of recombinant borrelia proteins | |
WO2011000058A1 (en) | A method of preparation of a biological particulate structure | |
PT96132A (pt) | Processo de preparacao de polipeptidos de vectores e de vacinas contra a malaria | |
WO1998014585A1 (en) | Nucleocapsid gene of seoul virus r22, recombinant plasmid, transformed e. coli and diagnostic agent and vaccine for haemorrhagic fever with renal syndrome | |
JPH01503514A (ja) | 免疫原性ポリペプチドとその精製法 | |
RU2102081C1 (ru) | Иммуногенная композиция против боррелиоза лайма, способ иммунизации млекопитающего против боррелиоза лайма, способ получения белка pc borrelia burgdorferi, диагностический агент для обнаружения b.burgdorferi и способ обнаружения антител к b.burgdorferi | |
JP2022511995A (ja) | C9orf72に由来するジペプチドリピートタンパク質に対して指向化されたペプチド免疫原コンストラクト | |
CN113631186A (zh) | 肺炎球菌表面蛋白 | |
CA3231514A1 (en) | Peptides for metabolic syndrome |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |