JPH01503514A

JPH01503514A - 免疫原性ポリペプチドとその精製法

Info

Publication number: JPH01503514A
Application number: JP63503280A
Authority: JP
Inventors: ヌーセンツウェイグ，ビクター
Original assignee: ニューヨークユニバーシティ
Priority date: 1987-03-30
Filing date: 1988-03-30
Publication date: 1989-11-30
Also published as: AU1593688A; NZ224086A; PT87332A; PT87332B; IL85905A0; ES2009587A6; AU617668B2; EP0309555A4; PT87137B; ZA882272B; PT87137A; WO1988007546A1; EP0309555A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本特許出願は、アーノット（Ａｒｎｏｔ　）　、　Ｄａ　Ｅ−らの名前による１９８５年７月９日出願の係属中の米国特許出願第７５４．６４５号、および１９８６年６月２４日出願の係属中のＰＣＴ出願Ｕ　Ｓ　８６　／　０１３７３号の部分継続出願で、両出願ともにニューヨーク大学（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　）に譲渡されたものである。この両出願はともに、本文で参考文献として引用する。

ｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ　）　（ＣＳ　）タンパク質の反復免疫優性抗原決定基領域を含むこのタンパク質の一部を取り込んだアミノ酸配列より成る免疫原性ポリペプチドおよびこのポリペプチドを精製する方法に関する。

プラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）　ＣＳ　タンノ（り質の免疫原性と特にこのタンパク質によって生じる免疫原性については、上述のアーノツ）　（Ａｒｎｏｔ　）らの出願およびアーノット（Ａｒｎｏｔ　）　、　Ｄ、Ｅ、ら、サイエン、ニΔ二旦幻！旦ジニュ２３０　：　８１５−８１８　、１９８５　（参考文献として同様に引用）中に先に記載されている。

実際、プラスモジウム・ビバックス　Ｐ、　ｖｉｖａｘ　Ｃ８の全遺伝子が同定され、その配列が上述の文献に記載されている。上記で記載されたように、このグラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）　ＣＳタンパク質は、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ　／　Ａｌａ　−Ｇｌｙ　−Ｇｉｎ　−Ｐｒｏ　− Ａｌ　ａ　−Ｇｌ　ｙまたは別の表記法ではＤＲＡＤ／ＡＧＱＰＡＧの配列を１９個直列に反復した中心領域より成る。この領域は、プラスモジウム・ビバックス　Ｐ、　ｖｉｖａｘ　ＣＳタンパク質の反復免疫優性抗原決定基を含有する。

（前記二表示法の対応は以下の如くである。Ａ−アラニン、Ｃ−システィン、Ｄ −アスパラギン酸、Ｅ−グルタミン酸、Ｆ−フェニルアラニン、Ｇ−グリシン、Ｈ−ヒスチジン、ニーイソロイシン、Ｋ＝Ｉ７シン、Ｌ−ロイシン、Ｍ−メチオニン、Ｎ−アスパラギン、Ｐ−プロリン、Ｑ−グルタミン、Ｒ−アルギニン、Ｓ −七リン、Ｔ−スレオニン、■−バリン、Ｗ−）リプトファン、およびＹ−チロシン。）本質的に１８個のアミノ酸残基のみより成る合成ペプチド（すなわち、上記配列の２個反復およびＡｓ　ｐ　−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ　−Ａｌａ−Ｇｌｙ　−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａのような環状順列）は、天然のプラスモジウム、・ビバックス　Ｐ。

ｖｉｖａｘ　）　ＣＳタンパク質に対する抗体によって認識され、次いで、前記天然のＣＳタンパク質を認識し、かつ、これに結合する抗体を産生ずる（哺乳類に注入した時）。

したがって、このようなペプチドは、マラリアに対するワクチンとして有用である。

プラスモジウム・ビパツク（ｐ、　ｖｉｖａｘ　）マラリアに対するワクチンを作るひとつの可能な方法は、プラスモジウム・ビバックス（Ｐ、ｖｉｖａｘ　）　Ｃ８タンパク質の免疫優性抗原決定基の配列に該当する配列を有する免疫原性ペプチド（すなわち、配列１個な含有すること。２個以上の反復配列を含有することが好適である）を合成することである。プラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）の場合には、しかし、このＣＳタンパク質の反復単位配列がむしろ長いため（プラスモジウム・ファルシパーラム（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　）の反復単位と対照的である）古典的なペプチド合成法を信頼し用いることができない。長いペプチドを作るため古典的合成技術を用いることは、世界中の何百万という人々に分は与えるためのマラリアワクチンの製造に必要とされる大規模の合成実施時において特に不都合である。

さらに、キャリアーまたはアジュバントの役割を果たす大分子にこの合成ペプチドを結合させることが必要である。その上、はとんどの場合において、ひとつの合成ペプチドに対する抗体の一部しか、この天然のタンパク質の同配列を認識しない。すなわち、キャリアー・タンパクに結合した合成ペプチドがたとえ免疫原性を示したにしても、産生された抗体のほとんどは病原菌に対する防御免疫を仲介することができない。この観点からしてプラスモジウム・ファルシパーラム（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　）に対するワクチンを調製するためのひとつの候補である合成ペプチド（ＮＡＮＰ）３は例外であり、その理由は、抗ペプチド抗体の少なくとも７０％がマラリア小芽体を認識することである。この通常とは異なる知見は、おそらく、前記（ＮＡＮＰ）、ペプチドが多くのプロリン［Ｆ］およびアスパラギン（へ）（これらは、タンパク質分子中に上記と逆の順序で頻繁に見られるアミノ酸である）を含有することで説明される。この場合には、おそらく、溶液中における（　ＮＡＮＰ　）、の好適な立体配置が、天然のＣＳタン挙動するようには見えない。

る免疫原性ペプチドを製造する別の技術を探求した。本発明者達は、プラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）マラリアに対する免疫性を哺乳類に付与するために用いられる免疫原性ポリペプチドを発現する組換えＤＮＡ遺伝子工学技術を探求した。

プラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）タンパク質の反復性アミン駿配列の一部または全体を発現する組換え細菌を構築する技術は容易に入手できたが、本発明者達は、以下の理由から別の発現システムを探求した。

第一に、発現システムは信頼できるものであり、かつ目的のポリペプチドを連続的かつ高収率で産生できること。細菌は、大量培養で生産すると取扱いが困難で、かつ異種タンパク質産物を過剰発現する可能性があることである。

第二に、さらに重要なこととして、細菌の発現産物は、細菌によって同時に発現されるかまたは細菌増殖培地に必要な添加剤であるところの発熱性不純物および他の炎症性でかつ毒性のある物質から精製することが、しばしば困難である。

第三に、細菌の発現生成物は、融合タンパク質であることがいちばん多（、つまり、細菌に結合した遺伝子に由来しさらに無関係の配列を付加された配列を含有する。

本発明者達は、組換えＤＮＡ技術分野における最近の進歩によって実質的に改良された酵母発現系に注目した。

酵母は細菌よりも硬質の有機体で、大量培養がはるかに容易である。°さらに、酵母遺伝学とクローニングの最近の進歩によって、酵母発現系の収量が上昇した。

組換え酵母系の発現産物の精製は、細菌組換え系の発現産物の精製よりも最初から複雑であるというわけではなく、精製しようとしている特定のタンパク質の特性にほとんど依存している。それにもかかわらず、このような精製は、一般に、古典的ペプチド合成技術で産生されるペプチドまたはタンパク質の精製よりも複雑である。

本発明者達は、Ｒ，Ｌ、パーク（Ｂｕｒｋｅ　）らの名前で１９８６年５月２９日出願でキロン・コーポレーシヲン（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）に譲渡された米国特許出願第８６８．６３９号の主題である一般的な酵母発現系を選択した。

この出願は、本文に参考文献として引用する。全直列反復配列とこの反復領域に先行する別の断片（配列がＮ末端からＣ末端に読まれる時）を包含するプラスモジウム・ビバックス（Ｐ、ｖｉｖａｘ　遺伝子の一部を（酵母生物体に組み込むため）選択した。この断片には、マラリア全種で高度に保存されておりかつ、それだけで免疫原性であることが以前から判明している配列が取り込まれてイル。

（１９８４年９月１８日■、ナツセンツヴアイグ（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ　）ら出願でニューヨーク大学（Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　）に譲渡され、かつ本文で参考文献として引用されている米国特許出願第６４９，９０３号を参照。）発明の目的以上より、本発明の目的は、プラスモジウム・ビバツクｙ、　（Ｐ、　ｖ−ｉｖａｘ　）　ｌＩ状小芽体（ＣＳ）タンパク質に対するモノクローナル抗体に免疫化学的に反応性でかつマラリアのワクチン調製に有用である酵母の工学的操作による免疫原性ポリペプチドを提供することである。

本発明のもうひとつの目的は、大規模かつ高収率で実施することのできる先の免疫原性ポリペプチドの製造方法を提供することである。

別の目的は、抗マラリアワクチン調製物に組み入れるために適切な免疫原性ポリペプチドを提供することであるＯ別の目的は、キャリアーに結合することなく・、抗マラリアワクチン調製物に用いるのにふされしい免疫原性ポリペプチドを提供することである。

別の目的は、溶菌した酵母細胞材料と酵母培地から成る先の酵母の工学的操作によるポリペプチドの純粋でない調製物から前記ポリペプチドを精製する方法を提供することである。

本発明のこれらの目的およびその他の目的は、本明細書ト、付随のクレームおよび付属図面を見れば当業者に明らかであろう。

図面の簡単な説明図１、は、本発明で用いられる酵母発現ベクターの構築図である。

図２は、酵母プラスミドｐＡＢ　２４のマツプである。

図１は、プラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）／　ｐＡＢ　２４形質転換酵母および対照酵母の溶菌液を用いて得たポリアクリルアミドゲルである。

図４．は、プラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）／　ｐＡＢ　２４ベクターで形質転換した酵母の溶菌液のウェスタン分析である。

図５は、（ａ）本発明に従って精製した物質の光学濁度図（実！　）　、（ｂ）溶出緩衝液の伝導度（実線−黒丸）、および（Ｃ）天然のＣＳタンパク質に対する溶出分画の抗体結合狙害パー七／ト活性、のプロットである。

図６．は、本発明によって製造されかつ精製された工学的操作によるポリペプチドの純度を示すＳＤＳ　−ＰＡＧＥゲルのラジオオートグラフである。

図７．は、本発明の工学的操作によるポリペプチドを示す等電点電気泳動のラジオオートグラフである。

図＆は、競合的ラジオイムノアラ七イの標準曲線であり、抗ビバックス（ｖｉｖａｘ　）　ＣＳタンパク質抗体に対する工学的操作による標識ポリペプチドの結合が、本発明の非標識の工学的操作によるポリペプチドの存在によって阻害されることを示す。

図９．は、工学的操作によるＣＳポリペプチドに結合したマウス抗血清を認識する放射性標識ヤギ抗マウスＩｇＧの量を、マウス血清希釈の関数としてプロットしたものである。

図１０．は、固定化された合成アミノ＠！１８個（反復）のビバックス（ｖｉｖａｘ　）　Ｃ８ペプチドに対する標識マウス抗血清（工・学的操作によるペプチドに対して作製された）の結合を、抗体濃度の関数としてプロットしたものである。

図１１．は、本発明に従って調製・精製され固定化された工学的操作によるＣＳポリペプチドに対するマウス抗血清結合において、合成ビバックス（ｖｉｖａｘ　）　ＣＳ反復ペプチドの阻害を合成（凪害性）ペプチドの濃度関数としてプロットしたものである。

図１１は、固定化された合成非反復（反復性でない）ペプチドに対するマウス抗血清の結合を、抗血清の希釈関数としてプロットしたものである。

発明の要約本発明は、本質的に下記のアミノ酸配列ＡＢＰＫＮＰＲＥＮＫＬＫＱＰＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤｌａＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧａＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＮＧＡＧＧＱＡＡＧＧＮＡＧＧＱＧＱＮＮＥＧＡＮＡＰＮＥＫＳＶＫＥＹＬＤＫＶＲＡＴＶＧＴＥＷＴより成るアミノ酸配列を有すること、および。

（ａ）　制限エンドヌクレアーゼＢｇ／　ＩＩによる１　５　ｋｂのＤＮＡ断片を適切なベクター中に得ること、（ｂ）　前記断片を適切なベクター中にサブクローン化す（ｄ）　前記断片を酵母発現ベクター中に取り込むこと、（ｅ）　前記発現ベクターによって酵母を形質転換すること、（ｆ）　前記ベクターによってフード化されるとの夕ンパ？質を発現させることのできる条件下で酵母を培養すること、（自）前記発現タンパク質を含有する培地を採取すること、を有する段階から成る方法によって製造される酵母の工学的操作によるポリペプチドに関する。

発明の詳細な説明前記プラスモジウム・ビバックス　Ｐ．　ｖｉｖａｘ　Ｃ　Ｓ遺伝子を下記に記す（この遺伝子がコードするアミノ駿配列とともに）。

ＭＫＮＦＩＬＬＡＶＳＳＩＣＣＴＧＴＩ’ＧＧＴｍＡａｍＴＴＣＣＣＣＡＣＧＣＡ口■双追ＣＡＣＡＡＴＧＴＡＧＡＴＣＩ℃ＬＬＶＤＬＦＰＴＨＣＧＨＮＶＤＬＴＣＣＡＭｍ：ＣＡＴＡＡＡＣＴｒＡＡＡπｎ鴨ＴＡＡａＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＧｒＡＧＡＣＧＣＣＡＳＫＡ　Ｉ　ＮＬＮＧＶＮＦＮＮＶＤＡＧＴＴＣＡ　ＣＡＣＧＴＡＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＣＴＡＧＣαυ，α｝ＣＡＧＡＧＧＳＳＬＧＡＡＨＶＧＱＳＡＳＲＧＲＧＣ　ＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＩＡＧＧＡＡＧＱＡＧＡｍ口ＧＬＧＢＮＰＤＤＥＥＧＤＡＫＫＫＫＧＡτ但Ｍ但ＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣＧＴＧＭＡＡＴ■ＧＣＤＧＫＫＡＥＰＫＮＰＲＥＮＫＬＫＡＡＣＣ却蝕臥Ｃ凪唾Ｍ込ｍ屯巳ＧＣＣ却Ｇ田傾ＡＣ届却Ｑ曳π乃ＱＰＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＯＧＡＧＡｆｆ’ＡＧＡＧＣＡＱ　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｄ　Ｒ　Ａ　Ｄ　Ｇ　Ｑ　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｄ’　Ｒ　ＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＩＸ３ＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧ（シΩＧＴＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣ’ＫＫｉＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＴＯＧＡｃＡＧｃＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡ（Ｈ刀１’ＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＧＣＡＧＡＴｏＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣλン刀ｘ給ＡＣＡＧＣＣＡＧＣＪＩＸＩＡＧＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡｅＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧσｌｍＡｃＡＧｃｃＡＧｃＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡ［ＡＯＧＴ（χ玖ＣＡＧＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＮＧＡＧＧＱＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＴＡＡ罫シい０σ■Ｋ℃人ＡＡＧＧＮＡＧＧＱＧＱＮＮＥＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＴＧＴＯＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＴＡＧＡＴＡＡＡＧＴＴＡＧＡＯＣＮＡＰＮＢＫＳＶＫＥＹＬＤＫＶＲＡＴＡＣＣＧＴＩＯＧＣＡＣＣＧＡＡＴＧＧＡσｒＣＣＡＴＧＣＡＧＴＧＴＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＧ’ＩＸχＫ｝ＴＴＶＧＴＥＷＴＰＣＳＶＴＣＧＶＧＧＴＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＧＱＡＴＣＶＦＬＶＲＳＲＶＮＡＡＮＫＫＰＥＤＴＴＡＣＴＴＴＧＡＡＴＧＡＣＣ’ｎＧ　ＡＧＡＣ’■ｒ，ＴＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＴＧＧＡＴＡＡＧＴＧＴＧＣＬＴＬＮＤＬＥＴＤＶＣＴＭＤＫＣＡＴＯＧＣＡＴＡＴＴＴＡＡＣＧＴＴＧＴＧＡＧＴＡＡ’ｌ’ｒＣＡＴＴＡＧＧＧＣＴＡＧＴＣＡＴＡＴＴＧＴＴＡＧ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　Ｖ　■　Ｓ　Ｎ　Ｓ　Ｌ　Ｇ　Ｌ　Ｖ　Ｉ　Ｌ　ＬＧＴＣＣＴＡＧＣＡＴＴＡＴＩ’ＣＡＡＴＴＡＡＶＬＡＬＦＮ〔Ｃ一末端〕酵母宿主中への挿入に選択したＤＮＡ断片は、下記の如くである。

ＧＣＡＧＡＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣＧＴＧＡＡＡＡＴＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧＡＣＡＡＥＰＫＮＰＲＥＮＫＬＫＱＰＧＤＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＱＡＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣ（Ｊ３ＣＡＧＧＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＣＡＱＡＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＱＡＴＡＧＡ８ＣＡＡＣＣＡＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰ αＷ｛Ｎ法ＴＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＱＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡｍハＣＡ＝ＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＱＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＤＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＧＡｎＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＧＡＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＣ心ＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＯＯＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣ−ＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＮＩ）ＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＧＱＰＡＧＤＦＬＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧ−ＡＡＡＴＧＧ　ＴＯｃＡＧＧＴＯＧＡＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＱＡＡＧＱＰＡＧＮＧＡＧＧＱＡＡＧＧＡＡＱ３ＣＡＧＧＡＧＱＡＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＡＧＧＩＩＯｃＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＧＮＡＧＧＱＧＱＮＮＥＧＡＮＡＰＮＡＡＡＡＧＴＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＴＡＧＡＴＡＡＡＧＴＴＡＱＡＧＣＴＡＣＣＧＴＴＧＧＣＡＣＥ　Ｋ　Ｓ　Ｖ．Ｋ　Ｅ　Ｙ　Ｌ　Ｄ　Ｋ　Ｖ　Ｒ　Ａ　Ｔ　Ｖ　Ｇ　Ｔこの断片は、全直列反復配列およびデーム（　Ｄａｍｅ　）ら、サ４　ｘ　ｙ　ス（　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２５　：　６２８　（１９８４）のリージョン（　Ｒｅｇｉｏｎ　）　ｌに実質的に平行で、前記反復領域に先行しかつ、アミノ酸配列ＡＥＰＫＮＰＲＥＮＫＬＫＱＰＧをフードする領域を有する。

この配列は、現在までに研究された全てのマラリア種に保存されテイる副配列（　ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ　）　Ｋ　Ｌ　Ｋ　Ｑ　Ｐを有する。

先のＤＮＡ断片は、アーノフ）　（Ａｒｎｏｔ　）ら（米国特許出願＄　７５４，６４５号およびサイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２３０　：８１５−８１８．１１月１５日、１９８５年）（双方ともに参考文献として引用した）によって記載された如く単離されたＢｇＪ　１による１　５　ｋｂ断片をサブクローン化することによって、全遺伝子から得た。次に、これを、下記の実施例１で述べる如く修飾酵母プラスミドＰＡＢ　２４のＤＮＡ中に挿入した。

酵母中でプラスモジウム・ビバックス（Ｐ−ｖｉｖ３）（抗原を発現するために、酵母のグリセルアルデヒド三すン駿の強い脱水素酵素とグルコースで調節可能なアルコール脱水素酵素−２（ＡＤＨ−２）プロモーターから成るハイブリッドプロモーターを用いた。このプロモーターを非相同遺伝子に融合することによって、炭素源としてグルコースを用いた酵母培養を高密度に増殖させる。醗酵増殖期において、培地にグルコースが欠損することによって、非相同タンパク質の発現が誘導される。前記プラスミドを多コピー数に取り込むこと、つまり自己ｖＩ製的な酵母プラスミドおよび酵母細胞の形質転換によって、高レベルのＣＳタンパク質を誘導により発現可能な株が産生された。

以下の実施例１で述べる如＜、１％グルコースのＹＥＰ培地（１％ｗ／ｖ酵母抽出物、２％ペプトン）中の培養で酵母を増殖させた。酵母材料２００リツトルがこのようにして得られ、−８０℃に保存した。

このようにして得た酵母材料は、異なる酵母タンパク質の複雑な混合物と培地添加物を含有していた。この材料を７．５％ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル上でゲル電気泳動し、その均質性が示された（図６、レーンｌを参照）。発現操作およびプラスミド構築の全ての抗体が、このＣＳタンパク質を１００℃で３０分間加熱した後または６Ｍグアニジンと１％β−メルカプトエタノール処理による完全変性後においてさえも、このタンパク質の免疫優性抗原決定基を認識すると述べられてきた（ギシン（Ｇｙｓｉｎ　）　、　Ｊ、らジャーナル・オプタンパク質が加熱により同様の挙動を示すこと、または、本文で用いられた前記ポリペプチドのみから本質的に成り抗原決定基領域を有するこのタンパク質の断片が、通ＣＳタンパク質抗体に免疫化学的に反応性であり続けることを確立したわけでは決してない。本発明中でＣＳタンパク質断片が極めて大量の無関係の物質と混合されることは、もうひとつの不明なことであった。混合物を加熱すると、その他のポリペプチドとの凝集が形成され抗原決定基のマスキングおよび（または）共沈を生じさせることがある。また、このような断片が、上記の加熱処理後も免疫原性であり続けるかどうかも不明であった。

それにもかかわらず、本発明者達は、酵母の工学的操作によるプラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）　ＣＳポリペプチドの精製における開始処理として、加熱処理を用いた。（この特許出願で用いるように１ポリペプチド′は比較的長いタンパク質断片を言い、′タンパク質１は完全なタンパク質を言い、セして１ペプチド′は比較的短いペプチド、例えば、３０個以下のアミン敗残基な有するペプチドを言う。′配列１という用語の使用に関しては、本発明によるポリペプチドおよびペプチドは、配列がＮ末端からＣ末端に述べられていてもまたはＣ末端からＮ末端に述べられていても同一配列を有していれば機能的に同等であると理解される。）前記混合物を次いで１（）０℃に加熱した結果、溶菌した酵母細胞材料の大量沈殿が生じた。上清を分離し、乾燥後凍結乾燥した。凍結した上清残渣は、前記酵母抽出物に比し純度が実質的に向上した（図６参照、レーン４）。

凍結乾燥物質の溶液を、次に、（ａ）電解質勾配を用いる陰イオン交換クロマトグラフィによって前記工学的操作によるＣＳポリペプチドを溶出すること、（ｂ）分子ふるいクロマトグラフィによって順次さらに精製した。

ＣＳポリペプチド活性含有分画をラジオイムノアラ七イで同定した。少量の高次精製酵母材料を、高比放射能の１２５１で放射性標識した。ｚ」Ｌｌ！ｅ−）７乙法−二Ｘニー２二色ｌ。

（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）　ＣＳタンパク質の反復性抗原決定基に対し作製された固定化抗プラスモジウム・ビバックス（ムｖｉｖａｘ　）モノクローナル抗体に対する標識物質の結合狙害能について、各分画を古典的ラジオイムノアラ七イで測定した。

本発明の精製工程の主な利点は簡便であること、およびスケール・アンプが容易に出来ることである。このようにして精製された工学的操作によるプラスモジウム・ビバツクｘ　（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）　ＣＳポリペプチドは、ＳＤＳ　−ＰＡＧＥおよび等電点電気泳動で均質であり、このポリペプチドが溶菌酵母細胞材料および酵母培地に結合することのできる発熱性で炎症性かつ毒性を有する不純物を実質的に含有していないことが以上より予測される。

本発明の酵母発現操作と精製工程を組み合わせた収率は、酵母培養１リツトル当たり純粋ＣＳポリペプチド１３■であった。この培養物２００リツトルが、パイロットスケール（試験規模）の装置（醗酵槽２５０リットル）を用いて３日間で生産されたことから、大量の工学的操作によるＣＳポリペプチドが短期間に入手可能となることが明らかである。

酵母抽出物２００リツトルの原料は、ひとり当たりポリペプチド１００マイクログラムを用い約２万５千人をプラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）に対し免疫するために充分な工学的操作によるＣＳポリペプチドを含有する。

本発明によって生産されるＣＳポリペプチドの主な利点には、この工学的操作によるペプチドが、（ａ）　不純物および無関係の抗原を含有せず、大規模に生産できること、（ｂ）　天然のＣ８分子の大断片に相当すること、（Ｃ）　水酸化アルミニウムをアジュバントとして用い、げつ書類において高い免疫原性が示されたこと、（ｄ）　産生された前記抗体が、′反復単位′およびＣ８分子の保存領域の双方に反応すること、が挙げられる。

この１反復率位′に対する抗体は、寄生体注入を非常に効率的に中和することが示された。この保存領域含有ペプチドに対する抗体も、同様に、寄生体注入を中和したが、阻害活性を正確に定量化することはできなかった（バーガラ（Ｖｅｒｇａｒａ　）ら、ジャーナル・オブ・イミューノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　１３４　：　３４４５−３４４８．１９８５）。

さらに、このペプチドの一部であるＫＬＫＱＰという配列が、全てのＣＳタンパク質空中存在するという事実から、この領域が１要な機能を持っていることが示唆される。

本発明を例示するため、特定の実施例で以下に本発明を詳細に述べるが、範囲を限定するものではない。

実施例１：プラスモジウム・ビパ’７　？　ス（Ｐ、ｖｉｖ２ｘ　）Ｃ８遺伝子の制限、ベクター中への連結反応、宿主酵母細胞の形質転換および発現以下の記載で、全ての制限エンドヌクレアーゼおよび酵素は、ファルマシア・ファイン・ケミカル■（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、（ビスヵタウｚ−（Ｐｉｓｃａｔａｗａ）’）ｓニューシャーシー州（Ｎ、Ｊ、））、ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）　（ビバリー（Ｂｅｖｅｒ−１ｅｙ　）、マサチューセッツ州（ＭＡ））、ベーリンガー−マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）、（インジアナポリｘ　（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ　）　、インジアナ州（ＩＮ））またはベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−■（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ　）　（ゲイタースパークゝ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　）、メリーランド州（ＭＤ））から市販品を入手し、製造者の指示に従い用いる。

プラスモジウム・ビバックス（Ｐ、ｖｉｖａｘ　）　ＣＳタンパク質遺伝子を含有するｐＵＣ９ベクター（ファルマシア・ファイン中ケミカル■（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、　）、ビス力タウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　）　、二”−シャーシー州（ＮＪ））は、バクテリオファージ・ラムダ・ベクターであるＥＭＢＬ　３のＢａｍ　ＨＩ部位へ挿入した１５ｋｂのＢｇｌ　Ｉ！断片をサブクローン化することによって誘らの米国特許出願第７５４，６４５号に開示されている）。

ｐＵＣ９ＣｉクローンをＢｇｌ　ＩｔとＸＢａ　Ｉで消化しゲルで精製し、反復全配列をコードする４１ｋｂ断片を得た（アーノット（Ａｒｎｏｔ　）ら、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２３０　：　８１５−８１８．１９８５　、参考文献として引用）。このゲル精製断片を、次に、Ｆｏｋ　１とＢ３ｎ　ｌで消化し、アプライド・ハイ：ｔシスｆｌ−：Ｘ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　）の３８ＯＡＤＮＡシンセサイザーを用いホスホルアミダイト法によって合成された以下の５′−リン酸化合成リンカ−に連結結合さリンカ−１は、Ｎｃｏ　１部位をひとつ提供し、一方、リンカ−１は、Ｓａｌ　ｌ接着末端を提供する。

リンカ−含有断片なＮｃｏ　ｌとＳａｌ　ｌで消化し、ゲル電気泳動で単離し、Ｎｅｏ　Ｉ　／　Ｓａｌ　Ｈで消化したｐＢｓ　Ｚｏｏ上でクローン化する（以下に構築を示す）。生成したプラスミドをｐＡＧ　／　Ｐ、　ｖｉｖａｘ　１と命名する。ｐＢｓ　１００は、ＡＤＨ−２調節ＧＡＰＤＨ（グリ七ルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素）プロモーター（１２００ｂｐ　）およびＧＡＰＤＨターミネータ−（９００ｂｐ　）含有ｐＢＲ３２２由来プラスミドであり（図１参照）、その構築を以下で述べる。

このプロモーターのＡＤＨ−２部位は、野生株ＡｂＨ−２遺伝子（プラスミドＩ）ＡＤＲ２、バイヤー（Ｂｅｙｅｒ　）とヤング（Ｙｏｕｎｇ　）　、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、３００　：　７２４−７２８　（１９８２）参考文献として引用）を、ＡＴＧ開始コドンの＋６６位とＡＤＨ−２領域外のｐＡＤＲ２中の他の２部位で切断する制限酵素ＥｃｏＲ５で切断することによって構築した。

結果として生成したひとつのベクター断片と二つの小断片の混合物をＢａｌ！３１エクソヌクレアーゼで消化し、約３００　ｂｐを除去した。ＣＣＴＣＧＡＧＧの配列ＧＧＡＧＣＴＣＣを有する合成Ｘｂｏ　ｌリンカ−を化学的に合成し、Ｂａ１３１処理ＤＮＡ上に結合した。結果として生成したＤＮＡ　ＩＪンカー・ベクター断片（約５　ｋｂ　）をカラムクロマトグラフィ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）のセファｃｔ　−ｘ　（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ４Ｂ）によって、前記リンカ−から分離し、制限酵ｇ　Ｘｈｏ　ｌ　テ切断後再結合し、大腸Ｗ　（Ｅ、　ｃｏｌｊ　）をアンピシリン耐性に形質転換するために用いた。Ｘｈｏ　ｌりンカー付加の位置は、当分野で広く公知の標準的技術を用い、ＤＮＡ配列決定によって決めた。ＡＤＨ−２遺伝子の５′非転写領域（ＡＴＧから一２３２位）内に位置するＸｈｏ　Ｉ　’）ンカー含有のブ２スミド１個をｌ！１ＩｌｌｌＩ！酵素Ｘｈｏ　ｌで切断し、−重鎖に特異的なヌクレアーゼＳ１で処理後、続いて制限酵素ＥｃｏＲｌで処理し、Ｘｈｏ　ｌリンカ一部位にひとつの平滑断端とひとつのＥｃｏＲｌ端を有する直線状ペクタ−分子を創製した。

この、プロモーターのＧＡＰ部は、プラスミドｐ　ＰＧＡＰ（１９８５年５月３日出願のキロン・コーポレーション（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）の欧州特許出願第１６４，５５６号に開示、文献として引用、１９８４年５月１１日出願の該当する米国出願第６０９．５４０号の出願日を認定された）を酵素Ｂａｍ　ＨＩおよびＥｃｏ　ＲＩで切断後、０．４　Ｋｂｐ　ＤＮＡ断片を単離することによって構築した。プラスミドｐＰＧＡＰは、酵母のＧＡＰＤＨプロモーター１個とＮｃｏ　ｌおよびＳａｌ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位と隣接するターミネータ−配列を含有する酵母プラスミドである。この精製断片を酵素Ａｌｕ　ｌで部分消化しＢａｍ　ＨＩ部位近傍で平滑断端な創製後、プラスミドｐＪＳ　１０４を構築するために用いた。

プラスミドｐＪｓ　１０４は、上述の直線状ベクター上にあるＡＤＨ−２断４片にこのＡｌｕ　ｌ　−Ｅｃｏ　ＲＩ　ＧＡＰプｏモーター断片を結合することによって構築した。

Ｂａｍ　ＨＩ　−Ｎｃｏ　Ｉ　ＡＤＨ−ＧＡＰプロモーター断片は、ＡＤＨ−ＧＡＰプｅｌ　％　−ターノＧＡＰ断片がｐＪｓ　１０３　テハ約２００　ｂｐであり、ｐＪｓ　１０４では４００　ｂｐであることを除きｐＪＳ　１０４　（上記）と同一のプラスミドｐＪＳ　１０３から得た。

ｐＪＳ　１０３の構築は、このＢａｍ　ＨＩ　−Ｅｃｏ　ＲＩ断片０．４ｋｂをＡｌｕ　Ｉで完全に消化しく　ｐＪＳ　１０４で部分消化した代わりに）、ひとつの２００　ｂｐ断片を単離したことを除き、ｐＪｓ　１０４の構築と同じであった。プロモーター、工上ニモジウム・ビパッ　ス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）セグメントおよびターミネータ−を含有する上記の全領域（以後１発現カセット′と命名する）を、Ｂａｍ　ＨＩによる消化で切除後ゲル電気泳動で精製し、Ｂａｍ　ＨＩ消化ｐＡＢ２４中にクローン化した。このプラスミドの制限マツプを図２に示す。

ｐＡＢ　２４は、酵母中における自己複製に必要な完全２ｍｕ配列（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ　）　：イースト・サン力ロミ七ス（Ｙｅａｓｔ　ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）の分子生物学、１　：　４４５、コールド・スプリング・ハーバ−出版（Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　）、１９８１　）とｐＢＲ３２２配列を含有する酵母発現ベクター（図２）である。これは、また、プラスミド″ＹＥｐ　２４由来酵母ＵＲＡ　３遺伝子（ポットスタイ／（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ　）　（１９７９）旦：１７文献として引用）およびプラスミドｐｃｉ　／　ｌ由来酵母ＬＥＵ２ｄ遺伝子（キａ　７ −　：Ｉ−ボｖ　−シｗ　ン（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏ−ｒａｔｉｏｌ　）の名前による１９８４年８月２２日出願の欧州特許出願第１１６，２０１号を参照、文献として引用）を含有する。前記発現カセットは、ｐＢＩ’Ｌ　３２２のＢａｍ　ＨＩ部位に挿入され、こうすることによって、テトラサイクリン耐性細菌遺伝子を妨害する。

キＩ：ｌ　７　・：ｆｆ−ポレーシ：Ｆ　ｙ　（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）Ｋよって単離されたサン力ロマイ七ス・セリビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）株ＡＢｘｘＯ（マットω社）、Ｉｅｕ　２−０４、Ｉｅｕ２−３とＩｅｕ　２−１１２の双方、ｐｅｐ４−３、ｈｉｓ　４−５８０、ｃｉｒ”）をヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ　）ら、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）７５　：、１９２９−１９３３　（１９７８）に従ってｐＡＢ　２４　／　Ｌ二ｈａ１−５によって形質転換した。

ＧＡＰ　＠節ベクターを有する単一形質転換コロニーをＩｅｕ−（ロイシン欠損）選択培地２％を中で増殖させ、ｌｏｇ期、あるいは定常期を遅延させた。前記のプラスミドを有する酵母のみがこの培地中で増殖できる。次いで、培養物を１％グルコースＹＥＰ（酵母抽出物１％ｗ／ｖ　、ペプトン２％ｗ／ｖ　）中で１：２０（Ｖ／ｖ　）に希釈し、この培地中で飽和するまで（３６時間）増殖させた。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ　）とジチオスレイトール（ＤＴＴ　）存在下で細胞を溶菌し、この溶菌液を遠心分離によって清澄とした。透明となった溶菌液をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた（レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ　）、Ｕ、に、、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、２７７：６８０．１９７０　）。クーマーシー・ブルーで染色し、約３８　ｋＤの重いバンドがブースモジラム・ビバックス（Ｌｖｉｖａｘ　）プラスミド含有形質転換体の抽出物に観察された（図３）。このバンドは、発現ベクターで形質転換されたこれらの細胞中に検出されたが、一方、対照（ｐｃ！／１）グラスミドを有する細胞抽出物には欠損していた。

融合タンパク質は、総細胞タンパク質の１０％を超えている。細胞泳動異常（ＤＮＡ構築から予測される２　３　ｋＤに対し３８　ｋＤ　）の理由は、ブースモパ°　ム・ノーシー）　二（Ｐ、　ｋｎｏｗｌｅｓｉ　）　ＣＳタンパク質で先に報告されているように（オザキ（０ｚａｋｉ　）ら、土土（９江）Ｌ土：１８５．１９８３　）　ＳＤＳ結合員常に帰することができ、おこの３８　ｋＤバンドの本質を確認するため、酵母によって合成されたタンパク質を、同様に、ウェスタン分析した。上述の如く調製した清澄酵母溶菌液をポリアクリルアミドゲル上で電気泳動しくレム’）　（Ｌａｅｍｍｌｉ　）　、上記）、タンパク質を、次に、ニトロセルロースフィルター上で電気プロット１−だ（タウビン（Ｔｏｗｂｉｎ　）ら、エフ　６　：　３４５０．１９７９　）。このフィルターを、ＰＢＳ中１％（ＢＳＡ）で１時間プレインキコ、ベートし、次に、−二」Ｌ１１モジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）　ＣＳタンパク質に対する七／°クローナル抗体で４’Ｃで１２時間処理した。

フィルターを１％ＩＢｓＡ／ＰＢＳで洗浄後、ホースラディツシュ（西洋わさび）・ペルオキシダーゼ結合第ニャギ抗マウス抗体（バイオラド・ラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒ　ｉｅｓ　）、リフチモ、／ド（Ｒｉｅｈｍｏｎｄ　）、カリホルニア州（ＣＡ））を添加した。最後に、このフィルターヲホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ発色試薬（バイオラド（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　）、リンチ％７ド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　）、カリホルニア州（ＣＡ））とインキュベートし洗浄した。

ウェスタン分析からこの融合タンパク質が前記モノクローナル抗体と反応することが示された（図４）。

実施例２：プラスモジウム・ピバッｐ　、Ｘ　（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖ３ｘ　）の環状小芽体の精製環状小芽体ポリペプチドの一部を発現する酵母培養を実施例１の如く調製した。

発現ポリペプチドは、反復ドメイン全体および保存領域すなわちデーム（Ｄｉｍｅ　）、Ｊ、　Ｂ、らサイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２２５　：　６２８　（１９８４）のリージョン（Ｒｅｇｉｏｎ　）　■を有するアミノ酸２３４個のみより成っていた。発現ポリペプチドのＮ末アミノ酸は、ヌクレオチド位４３８５−７（ＧＣＡ）のアラニンであり、Ｃ末アミノ酸は、ヌクレオチド位１１０８４−１０８６　（αス）のプロワ／である。アーノット（Ａｒｎｏｔ　）ら、サイエｙ　ｘ　（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２３０　：　８１５−８１８．１９８５　。酵母によって発現さ、れるペプチド断片の第一段階精製は、抽出物を１００℃ 温度とすることから成っていた。精製は以下の如く行った。

酵母培養２０リツトルからのベレット状酵母の抽出物をビーズ・ビータ−中に入れ、この酵母を、等量の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，３，０，１％トリトンＸ１１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１　ｍＭ　ＰＭＳＦ　（７ｘ＝　＃／　ｆｙｘｘホ＝ｙフルオリド）へラスタチン１マイクログラム／ｇＬｔで希釈した。

この抽出物（３７０ｍ　）を、１　ｍＭ　ＰＭＳＦとＩ？イクログラム／ｇＬｔのロイペプチン含有沸とう水２００　ｗＬｔに添加した。この混合物？温度１００℃とし、常に撹拌しながら温度、１００℃に１〜０分間保った。混合液を０℃ に冷却後、ベックマン超遠心ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＵｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅＲｏｔｏｒ　）　Ｔ　Ｉ−１９（ベックマン・インストルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　）、バロアルト（Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ　）、カリホルニア州（ＣＡ））中で１８，０００回転／分で１５分間遠心した。上清を除去し、凍結乾燥した。

乾燥物質を水１２０−中に溶解し、小量の不溶性物質残渣を除去するため遠心し、蒸留水に長く４８時間透析し角度凍結乾燥した。この粉末をｐＨ７，５の３　ｍＭりン醗ナトリウムカリウム緩衝液に溶解し、その伝導度を水で０．５８　ｍｓに調整した。この溶液を遠心し不溶性物質を除去し、同緩衝液中で平衡としたＤＥＡＥ−セファ七ル（Ｓｅｐｈａ−ｃｅｌ　）　（ファルマシア・７アイ７− ケム■（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍ　Ｃｏ、）、ビス力タウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　）、ニュージャー、ジー州（ＮＪ））カラム（５ｃＩ！ＬＸ　２４　ｃｍ　）中の陰イオン交換クロマトグラフィにかけた。流速を１０１／／時間に調整し、試験管１本当たり２１−を集めた。このカラムを同緩衝液５００−すなわちおよそカラム１本分の容量で次に洗浄した。開始緩衝液１５００−を、０．７５　Ｍ　ＮａＣ１も含有する同緩衝液１５ｏＯ−と漸次混合して直線勾配を有する緩衝液で、溶出な貌けた。このカラムから溶ａする種々の分画における環状小芽体ポリペプチドの存在を下記の競合的ラジオイムノアッセイを用いて検出した。

陽性分画が、２かもｌＱｍｓの間の伝導率で、対称形のピークとして分画Ｎｏｓ、　６５　９０の間に溶出した（図５）。６５−９０の全分画を凍結乾燥し、０．３　Ｍ　ＮａＣ／６０ｇＬｔ中に再溶解後、室温下で数時間０．３　Ｍ　ＮａＣ１に透析した。透析物を遠心分離し少量の不溶性物質を除去後、３分の１すなわち２０−を０．３Ｍ塩化ナトリウムで平衡とした七７７デツクｘ　（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｇ　−２００（７アルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　）上で分子ふるいクロマトグラフィにかけた。このセファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）は超微細であり、カラムは直径５α長さｌＯＯαであった。試験管１本当たり２１−の試料なカラムから集めた。ＣＳポリペプチドが５１−５７の試験管に急峻な対称ピークとなって溶出した。しかし、管中少量の高分子量および低分子量の物質が、このピークの前後に分散していた。試験管５１−５７の内容を集め蒸留水に対し長（透析しそして凍結乾燥した。純粋環状小芽体ポリペプチド８９ｍ９を総量で回収した。これｔ基準とし、酵母抽出物２０リツトルからの収率は８９Ｘ３すなわち純粋なタンパク質２６７ダあるいは酵母培養１リツトル当たり約１３ｍ９であると我々は算出した。回収環状小芽体ポリペプチドの純度をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ　）および変性条件下の等電点電気泳動によって評価した。等電点電気泳動によって、ｌｄ当たり２ａｙの濃度で４３の等電点な有する単一バンドが検出された（図７）。ＳＤＳ　−ＰＡＧＥによって、分子量４３、０００と４５，０００の間の二重バンドが検出された（図６）。

ｌ−当たりタンパク質１■を含有するＣＳポリペプチド溶液の２８０　ｎｍにおける吸光係数は０．２であった。このポリペプチド試料を部分Ｎ未配列解析にかけた。そして主配列は、アラニン−グルタミン識−ブロリンーリシンーアスパラギン−プロリンと予測通りであった。別の試料を１２５工で放射性標識し、プラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｖｉｖａｘ　）のＣＳタンパク質に特異的なモノクローナル抗体で免疫沈降した。計数値の７５から８５％が、本抗体によつ′Ｃ特異的に認識された。

固相競合的ラジオイムノアッセイを用い精製操作中の工学的操作によるＣＳポリペプチドを検出した。ラジオイムノアッセイで得たシグナルによる抗原量に関する標準曲線を下記の如く調製した。前記の工学的操作による精製ＣＳポリペプチドを周知のヨートゲ７法を用い１２５Ｉで放射性標識し、タンパク質１マイクログラム当たり約２　Ｘ　１０’カウント／分の比放射能とした。一定量の放射性標識工学的操作によるポリペプチドおよび種々の量の精製した工学的操作によるコールド（すなわち非標識）ＣＳポリペプチドを含有する混合物（総量１００マイクロリツトル中）をａ製した。この混合物３０マイクロリフＶｉＶ２ｘ）環状小芽体タンパク質に対するモノクローナル抗体（２Ｆ２　）を先に塗付した微量力価プレートウェルの底に入れた。このモノクローナル抗体は環状小芽体りンバク質の反復抗原決定基に反応する。（ナージン（Ｎａｒ−ｄｉｎ　）　Ｂ、　Ｈ，ら、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタＡ／−メデイスン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　）、１５６　：　２０　、１９８２）。

標識ペプチドのウェル底への結合を阻害するコールドペプチドの効果は、コールドペプチド濃度に比例していた。

このアッセイでは、ｌ−当たり５ナノグラムはどの低濃度のコールドペプチドを検出した（図８）ｏカラム分画および抽出物のアッセイを上述と全く同様に行ｒ１得た阻害度を標準曲線と照らし合わせ（図８）このＣＳタンパク質ペプチド濃度を算出した。このアッセイ法において、希釈および洗浄は全て、１．０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）および０．１％アジ化ナトリウム含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ　）中で行った。

これらのアッセイの結果に基づき、酵母培養物は、１リツトル当たり６０Ｗ９の環状小芽体タンパク質を含有し、この精製物質・の回収は、生体でおよそ２０％であったと我々は算出した。精製最初の段階では全く損失がなく、すなわち抽出物煮沸後のこの段階で、出発抽出物の５ＤＳ−ＰＡＧＥで観察された無関係のタンパク質バンドの９０％を上回る量が除去された。

実施例３：酵母の工学的操作によるプラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｖｉｖａｘ　）によるマウスの免疫前記の精製された工学的操作によるＣＳポリペプチドを、次に、マウスを免疫する抗原として用いた。、ｌ、１％の雌性スイス・ウェブスター（５ｗ１ｓｓ　− Ｗｅｂｓｔｅｒ　）　８−１２週令マウスｌＯ匹に対し、水酸化アルミニウムに吸着させた前記精製ペプチド５０マイクログラムを注射した。

３週後および６週後に、水酸化アルミニウムをアジュバントとして再度用い同量の抗原でマウスをブースター投与した。１０日後、マウスを出血させ、血清をイムノラジオメトリック・アッセイで分析しＣＳポリペプチドに対する抗体を検出した。このアッセイでは、微量力価プレートのウェルを精製工学的操作によるＣＳポリペプチド（ＰＢＳ中１０マイクログラム／−）で塗布し、次いで、希釈の異なるＰＢＳ−ＢＳＡ中マウマウス血清３０マイクロリツトルのウェルをインキュベートした。次にウェルを洗浄し、ＰＢＳ　−ＢＳＡ中に希釈した放射性１１識のアフイニイテイ精製ヤギ抗マウスイムノグロブリン（ｌｏ’　ｃｐｍ／タンパク質１マイクログラム）　５０，０００　ｃｐｍで再度インキュベートした。

そして、再びウェルを洗浄し計数した。

全ての血清が、１　：　１０，０００以上希釈の、工学的操作によるＣＳポリペプチドと反応した。プール血清の力価結果を図９に示した。これらの血清がプラスモジウム・ビバックス（Ｐ、ｖｉｖａｘ　）　ＣＳタンパク質に対する大量の抗体を含有することが、下記の二実験で示された。

１）　（Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　−Ａｒｇ −Ａｌａ　）２の配列から成り、ブースモジラム・ビバッｌｘ　（Ｐ−ｖｉｖａｘ　）　ＣＳタンパク質の直列反復２個を表す１８個のアミノ酸の合成ペプチド（１８−ｍａｒ　）を、（ａ）１９８５年７月９日出願で本発明で参考文献として引用した係属中の米国特許出願第７５４．６４５号、および（ｂ）アーノット（Ａｒｎｏｔ　）ら、サイ：ｃ　７　ｘ　（５ｃｉｅｎｃｅ　）、２３０：８１５．１９８５に記載された如（合成した。このペプチドを微量力価プレートのウェルを塗付するのに用い、血清の抗体含量を上述のイムノラジオメトリックアッセイで。

検出した。１　：　４，０００以上の力価に対し、全血清が反応した。第二回抗原ブースター注射後に得たプール血清の２）１８個のアミノ酸の合成ペプチドを再び用い、プール抗血清中に存在する抗体が工学的操作によるＣＳポリペプチドを塗付したプラスチックプレートのウェルに結合することを阻害した。これらの実験では、我々は最初にマウスプール血清（第二回ブースター注射（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ））の１　：　３，０００希釈試料を上述の１８個のアミノ酸より成るペプチドの濃度を上昇させインキュベートした。対照として、血清試料を同濃度でアミノ酸配列が興なる無関係の別の１８−ｍａｒペプチドとインキュベートした。室温で１時間インキュベーション後、混合物３０マイクロリツトルを、工学的操作によるＣＳポリペプチドを前塗付したプレートウェルに添加した。このウェルを次に洗浄し、上述の如く放射性ｓ識ヤギ抗マウスイムノグロブリンとインキュベートし再度洗浄後計数した。図１１に示した結果から、′反復１ペプチド（対照ペプチドではない）が抗体とＣＳタンパク質の反応をおよそ５０％阻害することが示された。希釈および洗浄は全て、これらの実験においてＰＢＳ　−ＢＳＡで行った。

同血清を、また、デーム（Ｄａｍｅ　）ら、上記のり−ジョン（Ｒｅｇｉｏｎ　）　Ｉに対する抗体存在の可能性について分析した。この目的のため、我々は固定化抗原として、合成ペプチド団、−〇ｙｓ　−Ｔｙ　ｒ−六五一史ｕ　−１，、上−止一旦匡一戊ｌ−担−Δ巳−凪−亜−と！−Ｇｉｎ　−Ｐｒｏ　−Ｃ０ＯＨを用いた。このペプチドは、現在までに調べられているマラリア全寄生体のＣＳタンパク質金工に共通のアミノ酸５個の配列Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　− Ｇｌｎ　−Ｐｒｏ　（デーム（Ｄａｍｅ　）ら、サイｘ　７　、Ｘ　（５ｃｉｅｎｃｅ）、２２５　：　５９３．１９８４およびｘ　ニア　（Ｅｎｅａ　）　、ｖ、、私信）を有する。最初のアミノ酸２個（ＣｙｓとＴｙｒ　）は、ＣＳタンパク質に外来性であり、キャリアータンパク質に結合させ１２５工で放射性標識する目的で付加した。このペプチドを用い微量力価プレートのウェルを塗付し血清中抗体含量を上述の如く検出した。第２回ブースター後、全血清が１　：　２，０００以上の希釈でこの小ペプチドを認識した。これらの血清プールの力価結果を図１２に示した。

プラスモジウム・ビバックス（Ｐ、ｖｉｖａｘ　）小芽体を抗原として用い、間接イムノフルオレセンスによってこの血清をまた、試験した。全ての血清は、１　：　１０００以上の希釈で陽性であった。

最後に、この工学的操作によるＣＳタンパク質に対する比較的低濃度の抗体が、プラスモジウム・ビバックス（ｐ、　ｖｉｖａｘ　）小芽体の感染性を中和することが、別の実験から示された。本アッセイは、ジャーナル・オブ・イミューノロジ−（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　１３２　：　９０９．１９８４（文献として引用）に記載の如（、ヒト肝癌細胞系統Ｈｅｐ　６２を寄生体侵入の標的として用いて行った。下記の表１に示した結果から、１　：　５０００の血清希釈で有意な阻害層が得られたことがわかる。阻害のパーセントは、１００−（（実験平均値／対照群の平均値）×１００〕として算出した。対照群は、同濃度の正常（免疫前）マウス血清とインキュベートした小芽体のみより成っていた。

表　１酵母の工学的操作によるＣＳタンパク質に対する抗体によるインビトロにおけるプラスモジウム・ビバックス（Ｐ、　ｖｉｖａｘ　）小芽体の肝細胞阻害（血清　希釈）−１％阻害５．０００　４２図、２、コ、３ニジ灯保庄１１ｔｔ囚、４０．５四、７（コ）あ０β　タシへ・２す（ｑ工ε−Ｆｌ（：％’１ａＬｆｉ！谷す、（Ｘ１０””）手続補正書（自発）昭和６３年１ｚ月２２日

Claims

【特許請求の範囲】１．プラスモジウム．ピパックス（Ｐ．ｖｉｖａｘ）の環状小芽体タンパク質の免疫優性抗原決定基領域の２つの直列反復配列と同一の少なくとも２つの直列反復配列から本質的に成るアミノ酸配列から本質的に成るポリペプチドを、不純物として１種以上のタンパク質もまた含有する純粋でない調製物より精製する方法であって、（ａ）前記調製物を前記タンパク質不純物の大部分を変性し沈殿させるために充分な時間、１００℃の温度下に置き、一方、前記ポリペプチドを溶液のまま保持すること、（ｂ）前記沈殿を除去し捨てかつ上清を残しておくこと、（ｃ）前記上清の固体成分を分離すること、（ｄ）前記固体成分をイオン緩衝水溶液中に再溶解すること、（ｅ）前記溶液を最初のクロマトグラフィカラムのイオン交換クロマトグラフィにかけ、こうすることによって前記ポリペプチドを前記カラム上に保持させ、一方、前記ポリペプチドの残存不純物部分を溶出液中に排除し、かつ、前記ポリペプチドをイオン勾配を用い溶出すること、（ｆ）前記ポリペプチド含有の前記溶離液のイオン強度を減少させること、（ｇ）前記溶離液を第二クロマトグラフィカラムの分子ふるいクロマトグラフィにかけ、および、前記ポリべプチドを前記カラムから溶出すること、を有する段階より成る方法。２．前記ポリペプチドが、プラスモジウム・ピパックス（Ｐ．ｖｉｖａｘ）の環状小芽体タンパク質の免疫原性抗原決定基領域から本質的に成り前記領域に隣接するアミノ酸配列と側面を接するアミノ酸配列を有する酵母の工学的操作によるポリペプチドである請求項１に記載の方法。３．さらに、前記最初のクロマトグラフィ段階に先立ち、前記上清を遠心分離によって前記沈殿から分離した後、前記上清を少なくとも一回凍結乾燥しかつこの凍結乾燥物質を続いて再溶解することを有する請求項２に記載の方法。４．さらに、イオン強度が増加するＮａＣｌの直線勾配を用いることによって、前記ポリペプチドを前記最初のカラムから溶出することを有する請求項３に記載の方法。５．さらに、前記溶離液のイオン強度より弱い緩衝液に前記溶離液を透析することによって、前記溶離液のイオン強度を減少させることを有する請求項３に記載の方法。６．反復アミノ酸配列から成る免疫優性抗原決定基以外のプラスモジウム・ピパックス（Ｐ．ｖｉｖａｘ）環状小芽体タンパク質抗原決定基の少なくとも１個から成る合成ポリペプチドであって、該ポリペプチドは組換え生物体によって発現され、かつ（ａ）前記環状小芽体タンパク質のひとつの反復免疫優性抗原決定基領域を示す前記タンパク質の反復性アミノ酸配列および（ｂ）下記タンパク質のＮ末端に近接する下記タンパク質の反復抗原決定基直前にあり、かつ、異なるマラリア種のＣＳタンパク質に保存されているプラスモジウム・ピパックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ）の環状小芽体タンパク質のアミノ酸配列の一部を含有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。７．プラスモジウム・ピパックス（Ｐ．ｖｉｖａｘ）小芽体の感染に感受性の哺乳類宿主に対し、プラスモジウムピパックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ）小芽体に対する防御免疫を付与する性質を有する請求項６に記載のポリペプチド。８．（ｂ）の前記配列が反復単位に先行しかつアミノ酸配列ＫＬＫＱＰを含有する請求項６に記載のポリペプチド。９．前記反復性配列が（ＤＲＡＸＧＱＰＡＧ）ｒであり、ＸがＤまたはＡでかつｒが２および１９までのひとつの整数である請求項６に記載の前記ポリペプチド。１０．前記反復性配列が、天然のプラスモジウム・ピパックス（Ｐ．ｖｉｖａｘ）環状小芽体タンパク質の完全免疫原性抗原決定基領域と同一の長さである請求項９に記載のポリペプチド。１１．下記タンパク質のＣ末端に向けて下記タンパク質の反復抗原決定基領域に続くプラスモジウム・ピパックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ）環状小芽体タンパク質のアミノ酸配列のセグメントもまた有しており、このセグメントが異なるマラリア種のＣＳタンパク質に保存され、かつ、前記ポリペプチドのＣ末端に位置する請求項６に記載のポリペプチド。１２．環状小芽体タンパク質の反復免疫優性抗原決定基領域に続き、かつ前記タンパク質のＣ末端にまで伸長する前記タンパク質のアミノ酸配列の完全セグメントもまた有する請求項６に記載のポリペプチド。１３．プラスモジウム・ノーレージ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｋｎｏｗ−ｌｅｓｉ）、プラスモジウム・フアルシパーラム（Ｐｌａｓｍｏ− ｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）およびプラスモジウム・ピパックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ）のＣＳタンパク質に保存されるアミノ酸配列がＫＬＫＱＰであるアミノ酸から成る合成ペプチド。１４．（ａ）プラスモジウム・ピパックス（Ｐ．ｖｉｖａｘ）環状小芽体タンパク質の反復性免疫原性抗原決定基領域の全体または一部に該当する免疫原性反復配列および（ｂ）天然の環状小芽体タンパク質中において（１）前記タンパク質の反復免疫原性抗原決定基領域の直前に先行するか。または、これに続き、かつ、（２）異なるマラリア種間で保存され、前記反復性配列のＮ末端およびＣ末端の少なくともひとつの末端である非反復性の前記反復配列の末端に位置する非反復性アミノ酸配列から本質的に成るアミノ酸配列を有する合成ポリペプチド。１５．（ｂ）の前記配列が、前記ポリペプチドのＮ末端に位置し、かつ、非反復性の保存配列が天然の環状小芽体タンパク質の反復抗原決定基の直前に先行しかつ前記タンパク質のＮ末端に近接し位置する請求項１４に記載のポリペプチド。１６．（ａ）プラスモジウム・ピパックス（Ｐ．ｖｉｖａｘ）タンパク質の反復免疫原性抗原決定基領域に該当する免疫原性反復配列および（ｂ）天然のプラスモジウム・ピパックス（Ｐ．ｖｉｖａｘ）タンパク質において、（１）前記タンパク質の反復免疫原性抗原決定基領域の直前に先行し、かつこの領域の５′末端に位置する前記反復配列のＮ末端における非反復性アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有する合成ポリペプチド。１７．前記配列（ｂ）が、前記ポリペプチドのＮ末端に位置する請求項６に記載のポリペプチド。