JP3491896B2 - 免疫調節ペプチド - Google Patents

免疫調節ペプチド

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Description

【発明の詳細な説明】 本出願は1992年８月11日に提出され、未決済の米国特
許第07/925,460号の一部継続出願である。本発明は、国
立衛生研究所（NIH）研究助成金第5R35−CA47554号のも
とに、一部、米国政府によって資金援助された研究の間
になされたものであり、従って、米国政府は本発明に一
定の権利を保有する。
本発明の分野は、主要組織適合性遺伝子複合体（MH
C）支配の抗原である。
発明の背景 主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）の支配するクラ
スII抗原は、脊椎動物におけるすべての特異的免疫応答
を調和組織化する細胞表面受容体である。ヒトは３種の
別個のMHC支配のクラスII抗原のイソタイプを持つ、即
ち、約70の異なったアロタイプが知られているDR、33の
異なったアロタイプが知られているDQ、及び47の異なっ
たアロタイプが知られているDPとである。各個人は２乃
至４のDR対立遺伝子、２個のDQ対立遺伝子、及び２個の
DP対立遺伝子を持つ。
MHC支配の受容体（クラスＩ及びクラスIIの両方共）
は、病原体、或いは他の非宿主起源由来の小タンパク質
断片（ペプチド）を結合して、これらペプチドを免疫系
の調節細胞（Ｔ細胞）に提示することによって免疫認識
に必須である第一段階に関与する。MHCによる提示が無
い場合には、Ｔ細胞は病原性物質を認識することが出来
ない。MHCクラスII受容体を発現する細胞は抗原提示細
胞（APC）と呼ばれる。APCは病原性生物及び他の異物質
をエンドソーム小胞に封入することによって摂取し、次
いでそれらを酵素的、及び化学的分解に委ねる。APCに
よって摂取された異種タンパク質は、部分的に分解され
るか、或いは“プロセシングを受けて（processed）”
ペプチドの混合物を生じ、そのうちのあるものは、表面
への移行途上にあるMHCクラスII分子に結合する。一
旦、細胞表面に達すると、MHC分子に結合したペプチド
はＴ細胞による認識に利用される。
MHCクラスII抗原は、α鎖、β鎖、及びプロセシング
を受けたペプチドからなる３分子複合体としてAPCの表
面上に発現される。細胞表面に発現される大抵のポリペ
プチドの様に、α鎖、β鎖は共にそのNH2末端に短いシ
グナル配列を含み、両鎖を小胞体（ER）に標的指向す
る。小胞体内で、クラスIIのα／β鎖複合体はインバリ
アント鎖（Ii）と呼ばれるもう１つのタンパク質と会合
する。Iiとの会合は（MHCヘテロダイマーのペプチド結
合切込み部位封鎖することによって）時期尚早のペプチ
ド捕捉を阻害し、安定なα／β相互作用を促進して上記
複合体のエンドソーム小胞への以後の細胞内流通を指令
するものと考えられている。エンドソーム内で、Iiはタ
ンパク質分解を含むプロセスによって除去され、これに
よってペプチド結合切込みを表出し、エンドソーム内に
存在するペプチドが上記MHC分子に結合出来る様にす
る。クラスII/ペプチド複合体はエンドソームから細胞
表面に運ばれ、そこでＴ細胞による認識とそれに続く免
疫応答の活性化に利用されるようになる。クラスIIのMH
C分子は外因性（摂取された）タンパク質由来のペプチ
ドのみならず、内因性（自己の）タンパク質の分解によ
り生成されたペプチドにも結合する。クラスIIに結合す
る夫々のペプチド種の量は、その局所濃度と、所定のク
ラスII分子の結合切込みに対するその親和性によって決
定され、種々のアロタイプは異なったペプチド結合特異
性を示す。
胎児発育期間の初期には、哺乳動物の免疫系は“寛容
状態”にあり、自己のペプチドには応答しないように教
えられている。この系の安定性と維持は、動物が自己に
対して免疫応答を生じないことを保証するために重要で
ある。この系の崩壊は糖尿病、リウマチ様関節炎、及び
多発性硬化症のような自己免疫症状を引起こす。免疫系
を操作して適切な非応答性の再確立を意図する現行の技
術には、遮断性ペプチドとして合成の高親和性結合ペプ
チドの静脈内投与を含むプロトコルが取入れられてい
る。
予防接種は抗体仲介、及び／或いはＴ細胞仲介の応答
を刺激することによって病原性生物に対する保護免疫を
発生する。大抵の現行の予防接種戦略は、なお、弱毒
化、或いは不活性化したウイルスの様な比較的粗製の製
品を用いている。この様なワクチンは、しばしば、抗体
仲介、及び細胞仲介による免疫の両方を生じ、発生する
免疫応答のタイプを修飾することは出来ない。更に、多
くの疾病において、間違ったタイプの応答の発生は結果
として疾病の悪化状態を招くことがある。
発明の開示 本出願に開示された研究において、凡そ70種の既知の
ヒトのMHCクラスII DRアロタイプの内の６種（HLA−DR
1、HLA−DR2、HLA−DR3、HLA−DR4、HLA−DR7、HLA−DR
8）に結合した天然でプロセシングを受けたペプチドの
特性が決定された。これらのペプチドは、外因性のタン
パク質よりも主として自己タンパク質に由来することが
見出された。自己ペプチドファミリーの幾つかは、予期
せぬ変質した結合性を持つことが確認された。即ち、あ
る自己ペプチドが多数のHLA−DRアロタイプに結合する
ことがある。この観察は、MHCクラスIIの機能に関する
広く許容されている観念、即ち、各アロタイプは異なっ
たセットのペプチドとの結合を指令するというMHCクラ
スIIの機能に関する広く受入れられている観念に逆行す
るものである。更に、本出願に開示された自己ペプチド
のすべてでないにしてもその多くがクラスII分子に比較
的高い親和性を持って結合する。これら３つの特性、
（１）外因性よりも自己の、（２）変質した（degenera
cy）、及び（３）高親和性結合は、Ｉ型糖尿病、リウマ
チ様関節炎、及び多発性硬化症の様な自己反応性を特徴
とする病状の治療的介入に対する新規の手段を示唆す
る。更に、この様な治療法は移植拒絶を軽減するのに用
いることが出来る。
本発明の治療法においては、本発明の高親和性の免疫
調節性の自己ペプチドをモデルにした短鎖ペプチド（好
適には非対立遺伝子的に制限された）が患者のAPCに導
入される。本発明のペプチドは多様なクラスIIイソタイ
プによって結合されるので、患者によって発現される特
定のクラスII対立遺伝子を決定する組織タイプの分類は
不必要であろう。個々のペプチドが完全には変性せず、
即ち、ペプチドがすべてではなく少数のアロタイプに結
合する場合、ペプチドの“カクテル”を用いると有用か
も知れない。当該カクテルは重複した結合特異性を与え
る。一旦、APC内に入ると、ペプチドはクラスII分子に
高親和性を持って結合し、それによって、当該病状の特
徴である免疫反応の原因となる免疫原性ペプチドとの結
合を阻害する。本発明の遮断性ペプチドは個体発生の間
に寛容された正確なカルボキシ及びアミノ末端を保持す
る自己ペプチドであるので、これらは免疫的には不活性
であり、非自己の遮断性ペプチドを用いる治療を面倒に
する可能性のある免疫応答を誘発することがない。
本発明のペプチドは、例えば、一種或いはそれ以上の
ペプチドを含む溶液の静脈内注射によって、APCに直接
導入されてもよい。代わりに、大量の遮断ペプチドを細
胞内で合成する手段をAPCに提供してもよい。遮断ペプ
チド配列に融合したER（小胞体）及び／或いはエンドソ
ームの標的指向性シグナルをコードする組換え遺伝子を
適当な発現制御配列に連結してAPCに導入する。一旦、
細胞内に入ると、これらを遺伝子はハイブリッドペプチ
ドの発現を指令する。ERに標的指向されたペプチドは、
翻訳されてヘテロダイマーに組立てられるにつれてクラ
スIIのα及びβ鎖に結合するであろう。ER内に高親和性
結合ペプチドが存在するとα／β複合体のインバリアン
ト鎖との会合を防止して細胞内流通を妨害する。続い
て、クラスII分子／遮断ペプチド複合体は細胞表面に発
現される可能性があるが、Ｔ細胞は発育の初期にこの複
合体に寛容化されているので、免疫応答を引起こさな
い。ER保持シグナルを付与されたペプチドの使用もまた
ペプチドと複合したクラスII分子がERから脱離するのを
防止する可能性がある。代わりに、組換えペプチドに、
合成後それをエンドソーム分画に指向するエンドソーム
標的指向性シグナルを付与し、それによって、又、エン
ドソーム内で内部的にプロセシングを受けたペプチドの
遮断ペプチドに対する比率をずらし、ER内ではそれと結
合しなかった遮断ペプチドのクラスII分子への結合を好
適にしてもよい。いかなる患者個人に対しても、一種、
或いはそれ以上のER指向化されたペプチドを、エンドソ
ーム指向化されたペプチドと組合わせて用い、ER内で本
発明のペプチドで飽和されていないα−β複合体が次い
でエンドサイトーシス経路で遮断されることは有利なこ
とかも知れない。最終結果は、又、非免疫原性のクラス
II/ペプチド複合体の細胞表面発現である。
細胞内輸送系に共役したクラスIIの非制限性の高親和
性結合ペプチドの使用は、現行の薬理学的は戦略に伴う
多方面の副作用を引起こすことなく、クラスIIに限定さ
れた免疫応答の特異的ダウンレグレーションを可能にす
る。これらの技術の巧みな適用は自家免疫疾患の治療及
び移植拒絶反応の防止に対する重要な進歩である。
本発明の細胞内輸送系（delivery sysytem）は、又、
動物、例えば、ヒト患者、或いは口蹄疫の様な疾病に罹
り易いウシの様な商業的に重要な哺乳動物の予防接種の
新規の方法に利用することが出来る。この様な系は、以
下の諸調整により所定の状況において要求されるタイプ
の免疫応答を生じる様に作成することが出来る。（ａ）
クラスＩ或いはクラスII MHCに対するペプチドの特異
性、（ｂ）ペプチド／タンパク質の長さ及び／或いは配
列、及び（ｃ）細胞内小器官を標的指向するための特異
的標識の使用。本発明の系は、これらのペプチドが細胞
内においてのみ生成され、Ｂ細胞との接触による抗体生
産を刺激し得る細胞外には存在しないことを保証する。
これは、この様なワクチンによって引起こされる免疫応
答をＴ細胞仲介の免疫に限定し、それによって、不適切
な、或いは、潜在的に有害な応答、例えば、ヒトの免疫
不全症、マラリア、ハンセン病、及びリーシュマニア症
の原因となる（微）生物を標的指向する一般的ワクチン
で観察される様な免疫応答を制限するものである。更
に、このＴ細胞仲介の免疫に限定された応答は、免疫原
性ペプチドの長さ及び特性次第で、クラスＩ、またはク
ラスIIを基盤とするもの、或いはその両方であり得る。
即ち、MHCのクラスＩ分子は、長さ８から10残基のペプ
チドに好適に結合するが、一方、クラスII分子は、12か
ら25残基の長さの範囲のペプチドに高親和性で結合する
ことが知られている。
本発明に基く免疫感作及び治療には、本発明のペプチ
ド、即ち、天然由来のヒトのタンパク質（即ち、“自己
タンパク質”）の切片と同一のアミノ酸配列を含むペプ
チドの精製標品を用いることが出来る。この様な切片
は、10から30残基の長さであり、当該ペプチドはヒトの
MHCクラスIIアロタイプに結合し、好適には、少なくと
も２つの別個のMHCクラスIIアロタイプにに結合する
（例えば、約70種の既知のDRアロタイプ、約47種の既知
のDPアロタイプ、或いは、約33種の既知のDQアロタイプ
のいずれか）。自己ペプチド切片に対応する上記ペプチ
ドの部分を、ここでは、“自己ペプチド”と呼ぶ。“精
製標品”とは、ポリペプチド成分の少なくとも50％（重
量で）が本発明のペプチドからなる標品を意味する。好
適な適用例では、本発明のペプチドが精製標品の少なく
とも60％（更に好適には80％）を占める。天然由来のヒ
トのタンパク質は、好適には、HLA−A2（以下に広く定
義される様に）、HLA−A29、HLA−A30、HLA−B44、HLA
−B51、HLA−Bw62、HLA−Ｃ、HLA−DPβ鎖、HLA−DQα
鎖、HLQ−DQβ鎖、HLA−DQ3.2β鎖、HLA−DRα鎖、HLA
−DRβ鎖、HLA−DR4β鎖、インバリアント鎖（Ii）、Ig
κ鎖、Igκ鎖Ｃ領域、IgH鎖、Na+/K+ATPアーゼ、カリウ
ムチャンネルタンパク質、ナトリウムチャンネルタンパ
ク質、カルシウムリリーズチャンネルタンパク質、補体
C9、グルコース輸送タンパク質、CD35、CD45、CD75、ビ
ンキュリン、カルグラヌリンＢ、キナーゼＣζ鎖、イン
テグリンβ−4 gp150、ヘモグロビン、チュブリンα１
鎖、ミオシンβ−Ｈ鎖、α−エノラーゼ、トランスフェ
リン、トランスフェリン受容体、フィブロネクチン受容
体α鎖、アセチルコリン受容体、インターロイキン−８
受容体、インターフェロンα受容体、インターフェロン
γ受容体、カルシトニン受容体、LAM（リンパ球活性化
マーカー）ブラスト（Blast）−１、LAR（白血球抗原関
連）タンパク質、LIF（白血病阻止因子）受容体、4F2細
胞表面抗原（正常、及び、腫瘍形成増殖に関連する細胞
表面抗原）のＨ鎖、シスタチンSN、VLA−４（接着受容
体のインテグリンスーパーファミリーにおける細胞表面
のヘテロダイマー）、PAI−１（プラスミノゲン活性化
因子の阻害因子−１）、IP−30（インターフェロンγに
より誘導されるタンパク質）、ICAM−２、カルボキシペ
プチダーゼＥ、トロンボキサンＡシンセターゼ、NADH−
シトクロム−b5リダクターゼ、ｃ−mycトランスフォー
ミングタンパク質、Ｋ−rasトランスフォーミングタン
パク質、METキナーゼ関連トランスフォーミングタンパ
ク質、インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク
質、マンノース結合タンパク質、アポリポタンパク質Ｂ
−100、カテプシンＣ、カテプシンＥ、カテプシンＳ、
因子VIII、フォンビルブラント因子、金属プロテイナー
ゼ阻害因子１前駆体、金属プロテイナーゼ阻害因子２、
プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１、或いは熱シ
ョック・コグネイト71kDタンパク質であり、それはMHC
（支配）のクラスＩまたはIIの抗原タンパク質、或い
は、APCの細胞表面に生じるいかなる他のヒトのタンパ
ク質であってもよい。自己ペプチドは、好適には、以下
の構造形式（モティーフ）に従うものである、即ち、上
記切片のアミノ末端残基、或いはその12残基内の最初の
照合位置（Ｉ）に、正荷電残基（即ち、Lys、Arg、また
はHis）、或いは大きな疎水性残基（即ち、Phe、Trp、L
eu、Ile、Met、Tyr、またはPro）、並びに、Ｉ＋５の位
置に、水素結合提供残基（即ち、Tyr、Asn、Gln、Asp、
Glu、Cys、Arg、Ser、Trp、またはThr）を持つ。更に、
上記ペプチドは、また、Ｉ＋９、Ｉ＋１、及び／或いは
Ｉ−１の位置に、疎水性残基（即ち、Phe、Trp、Leu、I
le、Met、Pro、Ala、Val、または、Tyr）（＋記号は、
右、或いはカルボキシ末端方向への位置を、及び−記号
は、左、或いはアミノ末端方向への位置を表す）を持
つ。本発明のペプチドの典型的な例は、HLA−A2の残基3
1−40（即ち、TQFVRFDESDA、配列番号149）、または残
基106−115（即ち、DWRFLRGYHQ、配列番号150）、或い
はIiの残基107−116（即ち、RMATPLLMQA、配列番号15
1）、或いは、以下の表１−10に示されている配列のど
れか１つに本質的に同一な配列である。
本発明の治療及び免疫感作の方法は、また、本発明の
ペプチドをコードするが自己タンパク質の全配列のすべ
てではなくそれ以下の配列をコードする核酸分子（RNA
或いはDNA）を利用することも出来る。上記核酸は、自
己タンパク質（或いは他のタンパク質）から誘導された
シグナルペプチド、或いは他の流通関連の配列を任意に
含むこともあるが、好適にはMHCクラスII分子に結合す
る特定の自己ペプチド以外の自己タンパク質の非重要部
分をコードするものである。流通関連の配列は、ポリペ
プチドに結合してその細胞内流通（小器官から小器官、
或いは細胞表面への有向移動）を制御する様に機能する
アミノ酸配列である。この様な流通関連の配列は、上記
該ペプチドをER、リソソーム、或いはエンドソームに流
通し、シグナルペプチド（翻訳の間、タンパク質をER内
へ指向するアミノ酸配列）、KDEL（配列番号152）の様
なER保持ペプチド、及びKFERQ（配列番号153）、QREFK
（配列番号154）の様なリソソーム標的指向ペプチド、
並びにＫ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｖ、及びＬから選ばれ
た４残基がＱの一側に隣接しているペンタペプチドを含
む。本発明に有用なシグナルペプチドの一例は、クラス
IIのα或いはβの様なMHCサブユニットのペプチドと本
質的に同一なシグナルペプチドであり、例えば、MHCク
ラスIIαのシグナルペプチドは、配列MAISGVPVLGFFIIAV
LMSAQESWA（配列番号155）に含まれる。本発明の核酸に
よってコードされるシグナルペプチドは、もし、その部
分がポリペプチドのERへの流通を引き起こすに十分であ
れば、上記の特定の25残基配列の一部（例えば、少なく
とも10アミノ酸残基）のみを含めばよい。好適な実施例
においては、本発明の核酸は、第二の自己ペプチド及び
第二の流通配列（第一の自己ペプチド及び第一の流通配
列と同一か、或いは異なってもよい）をコードして、追
加の自己ペプチド及び流通配列をコードすることもあ
る。本発明のこの局面の更に別の変形では、自己ペプチ
ド配列（或いは、縦に並べられた複数の自己ペプチド配
列）が、本質的に無傷のIiポリペプチドにペプチド結合
により連結され、次いで、これが、クラスII分子をERか
らエンドソームへ流通する際に自己ペプチド配列を一緒
に運ぶ。
本発明の核酸は、又、発現制御配列（転写及び翻訳始
動シグナル、プロモーター、及びエンハンサーと定義さ
れ、これらが会合するコーディング配列の発現を可能に
し、及び／或いは最適にする配列）、及び／或いはファ
ージ、或いはワクシニアウイルス、アデノウイルス、エ
プスタイン・バールウイルス、またはレトロウイルスの
弱毒化、或いは非増殖、無毒化型のゲノム核酸を含むこ
ともある。
本発明のペプチド及び核酸は、それらを直接、薬剤的
に許容される担体に懸濁、或いは、リポソーム、免疫刺
激複合体（ISCOMS）またはそれらの類似体に封入するこ
とにより治療用に調製することが出来る。この用な調製
品は、患者の複数のAPCを治療用調製品と接触させてペ
プチド或いは核酸を上記APCに導入することによってヒ
ト患者における免疫応答を阻害するのに有用である。
本発明には、又、本発明の核酸分子を含む細胞（例、
組織培養細胞、或いは、人体内のＢ細胞またはAPCの様
な細胞）も包含される。本発明の核酸を含む培養細胞
は、当該細胞を上記核酸分子からの当該ペプチドの発現
を可能にする条件下での培養を含む方法において、本発
明のペプチドの製造に用いることも出来る。
ここに非対立遺伝子的に制限された免疫調節ペプチド
を確認する方法を開示する。当該方法は以下の事項を含
む。
（ａ）最初のMHCクラスIIアロタイプから溶離されたペ
プチドの混合物を分画し、 （ｂ）この混合物から自己ペプチドを確認し、及び （ｃ）当該自己ペプチドが第二のMHCクラスIIアロタイ
プに結合するかどうかを検査する。この様な結合は、当
該自己ペプチドが非対立遺伝子的に制限された免疫調節
ペプチドであることの表示である。
別の具体例では、本発明は、潜在的な免疫調節ペプチ
ドを確認する方法を含み、この方法は以下の事項を包含
する。
（ａ）MHCクラスII分子を表面に表現する細胞を提供
し、 （ｂ）当該細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導
入し、及び （ｃ）当該候補ペプチドに結合するクラスII分子の比率
が、上記核酸の存在下に、上記核酸の非存在下の結合比
率に比べて増加しているかどうかを測定する。この様な
増加は、当該候補ペプチドが潜在的な免疫調節ペプチド
であることの表示である。
本発明には、又、潜在的な免疫調節ペプチドを確認す
る方法が含まれ、この方法は以下の事項を包含する。
（ａ）MHCクラスII分子を発現する細胞を提供し、 （ｂ）当該細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導
入して、 （ｃ）当該細胞表面上のMHCクラスII分子のレベルが、
上記核酸の存在下に、上記核酸の非存在下のMHCクラスI
I分子のレベルと比較して減少しているかどうかを測定
する。この様な減少は、当該候補ペプチドが潜在的な免
疫調節ペプチドであることの表示である。
本発明には、又、非対立遺伝子的に制限された免疫調
節ペプチドを確認する方法が含まれ、この方法は以下の
事項を包含する。
（ａ）第一のMHCクラスＩ、或いはクラスIIアロタイプ
を保持する細胞を提供し、この様な細胞を病原体（例、
ヒトの免疫不全ウイルス（HIV）、Ｂ型肝炎ウイルス、
麻疹ウイルス、風疹ウイルス、インフルエンザウイル
ス、狂犬病ウイルス、Corynebacterium diphtheriae
（ジフテリア菌）、Bordetella pertussis（百日咳
菌）、Plasmodium属、Schistosoma属、Leishmania属、T
rypanasoma属、或いはMycobacterium lepre（癩菌）の
様なヒト或いは動物の病気の原因となる感染性病原体）
に感染させ、 （ｂ）当該細胞の第一のMHCアロタイプに結合するペプ
チドの混合物を溶離し、 （ｃ）当該混合物から候補ペプチドを確認し、この様な
候補ペプチドは上記病原体由来のタンパク質の断片であ
り、及び、 （ｄ）当該候補ペプチドが第二のMHCアロタイプに結合
するかを検査する。この様な結合は、上記の候補ペプチ
ドが非対立遺伝子的に制限された免疫刺激ペプチドであ
ることの表示である。病原体タンパク質のこの様な免疫
原性断片をコードする核酸は、ヒト患者に免疫応答を誘
導する方法に用いることが出来、この方法は、患者のAP
C内への核酸の導入を含む。
本発明の治療法は、合成ペプチドの静脈内注射を含む
従来の方法に伴う諸問題を解決する。（１）対立遺伝子
の特異性のために、全体の母集団内で発現される種々の
クラスIIアロタイプのすべて、或いは大抵のものに高親
和性で結合出来るペプチドは以前には確定されていなか
った。（２）静脈内に投与されたペプチドの半減期は一
般に極めて低く、高度の不便と出費を伴う反復投与が必
要であり、（３）このタイプの運搬手段は、阻害ペプチ
ドがクラスII分子、これは細胞表面にあるが、後者の結
合間隙を占拠する天然由来のペプチドを除去することが
必要で、この手段は、今では非常に非効率的なプロセス
であると信じられており、又、（４）もし、利用される
阻害ペプチドが、それ自身、免疫原性であれば、患者に
よっては有害な免疫応答が促進されることがある。
本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細な記載と特許
請求の範囲から明瞭となるであろう。
詳細な説明 先ず、図面を簡単に説明する。
図面 図1A−1Fは、夫々、パパインで消化されたHLA−DR1、
DR2、DR3、DR4、DR7及びDR8から抽出されたペプチドプ
ールのクロマトグラフ分析であり、紫外線吸収によって
検出された通りの各HLA−DRのペプチドの種目を図示す
る。210nm及び277nmの両方に対する紫外線吸収が、16分
と90分の間の保持ウインドウ（retention window）で50
0mAUのフルスケールで示されている（各マークは２分を
表す）。
図２は、分離されたHLA−DR1に結合したペプチドのサ
イズ分布の代表的な質量分析である。100質量ユニット
で測定されたペプチド質量が、質量分析によって確定さ
れた分離ペプチドの数に対してプロットされている。ペ
プチドの長さは、質量実験値を平均アミノ酸質量である
118ダルトンで割って計算された。
図3Aは、本発明のミニ遺伝子（配列番号147）を表
し、この中でHLA−DRα鎖のリーダーペプチドが、ヒト
のインバリアント鎖Iiの15残基の遮断ペプチド断片のア
ミノ酸末端に連結している。
図3Bは、本発明の第二のミニ遺伝子（配列番号148）
を表し、この中でHLA−DRα鎖のリーダーペプチドが、
ヒトのインバリアント鎖Iiの24残基の遮断ペプチド断片
のアミノ酸末端に連結している。
実験データ 方法 I. HLA−DR抗原の精製 HLA−DR分子は、ホモ接合の、エプスタイン・バール
ウイルスで形質転換されたヒトの幼弱化Ｂリンパ芽球系
から、DR1はLG−２細胞から、DR2はMST細胞から、DR3は
WT20細胞から、R4はPriess細胞から、DR7はMann細胞か
ら、及びDR8は23.1細胞から精製された。これらの細胞
系のすべては公的に入手出来る。細胞増殖、細胞収集条
件、及びタンパク質の精製は以前に記述された通りであ
った（Gorga,J.et al.,1991）。簡単に述べると、各細
胞タイプの200gを10mMのトリス−HCl、1mMのジチオトレ
イトール（DDT）、0.1mMフェニルメチルスルホニルフル
オリド（PMSF）、pH8.0に再懸濁して、Thomasホモゲナ
イザーで溶解した。核は4000 x gで５分間の遠心で除去
し、ペレットを洗浄して上清が清澄になる迄、ペレット
操作を繰り返した。すべての上清を集め、膜画分が175,
000 x gで40分の遠心によって収集された。ペレット
は、次いで、10mMのトリス−HCl、1mMのDTT、1mMのPMS
F、４％のNP−40に再懸濁された。溶解されない膜物質
は、175,000 x gで２時間の遠心で除去し、NP−40に可
溶の上清画分が免疫親和精製に使用された。
界面活性剤に可溶のHLA−DRをLB3.1−プロティンＡの
カラム（Gorga et al.,同上）に結合して、100mMのグリ
シン、pH11.5で溶離した。溶離後、サンプルにトリス−
HClを加えて直ちに中和し、次いで10mMトリス−HCl、0.
1％デオキシコール酸（DOC）に対して透析した。LB3.1
単クローン性抗体は、非多形性のHLA−DRα鎖上に存在
する立体配座決定基を認識し、この様にしてHLA−DRの
すべてのアロタイプを認識する。
DR分子の貫膜領域はパパイン消化によって除去され、
その結果得られた水溶性分子は更に10mMトリス−HCl、p
H8.0で平衡化されたＳ−200カラムのゲル濾過によって
精製された。精製されたDRサンプルは、限外濾過によっ
て濃縮され、得量をBCAアッセイで測定して、SDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分析された。
II. 結合したペプチドの抽出と分画 水溶性で、免疫アフィニイティーによって精製された
クラスII分子は、更に、25mM N−モルホリノエタンスル
ホン酸（MES）PH6.5中、高性能サイズ排除クロマトグラ
フィー（SEC）により、流速1ml/分で精製して、いかな
る残りの小分子量の夾雑物も除去した。次いで、Centri
conミクロ濃縮器（分子量分離10,000ダルトン）（Amico
n社）を、タンパク質サンプル（最終容量100−200μｌ
の間）のスピン濃縮前に、順次、SEC緩衝液及び10％の
酢酸で洗浄した。ペプチドのプールは選択したクラスII
対立遺伝子産物から1mlの10％酢酸を加え、15分間、70
℃で抽出された。これらの条件は、結合したペプチドを
クラスII分子から遊離するために十分であり、しかも、
適度に緩和でペプチドの分解を回避出来る。ペプチドの
プールは、Centricon濃縮器を介する遠心後、クラスII
分子から分離され、素通し画分に以前に結合していたペ
プチドが含まれていた。
収集された酸抽出のペプチドプールは、HPLCによる分
離に先立ち、Savant Speed−Vac中で容量50μｌに濃縮
された。ペプチドは、ミクロボアＣ−18逆相クロマトグ
ラフィー（RPC）カラム（Vydac）上、以下の非直線密度
勾配プロトコルを用い、0.15ml/分の一定流速で分離さ
れた:0−63分、５％−33％の緩衝液B;63−95分、33％−
60％の緩衝液B;95−105分、60％−80％の緩衝液Ｂ、こ
こで、緩衝液Ａは0.06％のトリフルオロ酢酸／水で、緩
衝液Ｂは、0.055％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル
であった。クロマトグラフィー分析は、多重の紫外線波
長（210、254、277、および292nm）で同時に検出して、
質量分析及び配列解析の前に、分光光度的な測定を可能
にした。図１に、解析された６種のDRペプチドプールの
各々に対するクロマトグラムが示されている。収集され
た画分は、次いで、質量分析及びエドマン配列決定法に
よって分析された。
III. ペプチドの分析 RPCの間の、ペプチドの分光光度計による測定は、ア
ミノ酸組成（芳香族アミノ酸の寄与）に関する貴重な情
報を提供し、以後の特性決定のためのスクリーニング法
として用いられる。RPC分離の間に収集された適切な画
分は、次いで、Finnegan−MAT LaserMatマトリックス−
利用のレーザー脱着質量分析計（MALD）を用いて分析
し、量的に優勢なペプチドに対する個々の質量を決定し
た。収集された画分の１％−４％をマトリックス（１μ
ｌのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）と混合し
て、抽出されたペプチドの質量決定を達成した。HLA−D
R1に対するこの分析の結果を図２に示す。次に、選択し
たペプチドサンプルは、自動エドマン分解ミクロ配列決
定法により、ABI 477Aタンパク質シークエンサー（Appl
ied Biosystems）を用い、電子スプレーイオンソースを
装着したFinnigan−MAT TSQ 700三重四重極質量分析計
を用いた質量分析により提供されたカルボキシ末端確認
と合わせて配列決定された。この平行して行われた分析
は、ペプチドの組成及び配列の完全な確認を保証する。
SWISS−PROTデータベースに保存されているタンパク質
配列とのペプチドの照合は、FASTAコンピュータデータ
ベース検索プログラムを用いて行われた。表１−10は、
検討されたDR分子の各々に対する本配列分析の結果であ
る。
結果 1.HLA−DR1. 本研究に用いられたHLA−DR1は、当該物質が結晶学的
解析、及び結合ペプチド分析に使用出来る様にパパイン
で可溶化された。DR1に結合したペプチドは、酸で抽出
され、RPCを用いて分画された（図１）。２回目の抽出/
RPC分離の後、いかなる検出可能なペプチド様物質も存
在せず、ペプチドの定量的抽出が証明された。抽出され
たペプチドプールのアミノ酸分析（ABI 420A/130Aデリ
バタイザー/HPLC）は、質量分析によって決定されたサ
イズ分布（図２参照）に対応する結合ペプチドのモル当
量により精製DR1が完全に占拠されると仮定して、70−8
0％の得量であることが判明した。いくつかの別々の標
品のDR1抽出から得られたRPCプロフィル（溶離図）は再
現性があった。更に、界面活性剤可溶性、或いはパパイ
ン可溶化DR1の溶離図は同等であった。ペプチドが、界
面活性剤可溶性、及びパパイン可溶化DR1中で、事実、
同一であることを確認するために、質量分析及びエドマ
ン配列決定分析が行われ、２つの標品からの相当する画
分に対する質量及び配列は一致することが判明した。
マトリックス利用のレーザー脱着質量分析（MALD−M
S）を用いて、平均サイズ18で15残基の様式を持つDR1の
溶離されたペプチドプール内に含まれる独自の質量を持
つ111種を同定した（図２）。13−25残基の分子量範囲
内に、更に、500以上の質量種の存在が検出された。し
かしながら、シグナルは十分ではなく、個々の質量を自
信をもって割当てるには至らなかった。単一のRPCピー
クに対応する画分に種々の質量を持つ多重種が検出され
たことは、ペプチドの共溶離を示唆する。これらのペプ
チドの特徴を更に検討するために、サンプルを、電子ス
プレーイオンソースを装備した三重四重極（triple gua
draple）質量分析計（ESI−MS）と自動エドマン分解微
量配列決定法により平行して分析した（Lane et al.,J.
Prot.Chem.10:151−160（1991））。これら２つの技法
を組み合わせることにより、単一の画分に含まれる（複
数の）ペプチドのＮ−及びＣ−末端両方のアミノ酸の重
要な確認が可能となる。DRIから分離された20種のペプ
チドに対して得られた配列及び質量のデータが表１に列
挙されている。すべての確認されたペプチドは、SWISS
−PROTデータベースに保存されているタンパク質の領域
に割り当てられて完全に確認されている。
驚くべきことに、20種の配列決定されたDR1に結合し
たペプチドの内16種が、自己タンパク質HLA−A2及びク
ラスIIと会合したインバリアント鎖（Ii）の領域に100
％同一であり、全部の抽出されたペプチド質量の少なく
とも26％に相当した。これらの分離されたペプチドは長
さが様々で、Ｎ−及びＣ−末端の両方で切断されてお
り、以下のことを示唆する:1）DR1に結合後、抗原のプ
ロセシングが両末端で起こる。或いは２）クラスII分子
が、無差別に生成されたペプチドのプールからの抗原に
結合する。ペプチドの微量配列決定からの得量は、HLA
−A2（図１）及びIiが、それぞれ、全DR1に結合したペ
プチドの少なくとも13％に当たることを示唆している。
更に驚くべき発見は、HLA−DRに結合し、HLA−A2ペプ
チドと100％相同であるにも拘らず、HLA−A2タンパク質
を発現しない細胞に由来するペプチドに関するものであ
る。明らかに、このペプチドは、HLA−A2タンパク質の
ある領域と相同の領域を含むタンパク質に由来してい
る。従って、これを明確にする目的で、“HLA−A2タン
パク質”という術語は、HLA−A2タンパク質自身、並び
に、HLA−A2由来のHLA−DR結合ペプチドと80％以上の相
同性を持つ10個或いはそれ以上のアミノ酸の長さの領域
を含むいかなる天然由来のタンパク質をも包含すると指
定される。同様に、“HLA−A2ペプチド”は、本申請中
に広く定義されている様に、いかなるHLA−A2タンパク
質にせよそれに由来するペプチドを指すことになる。
DR1の研究において確認された他の４種のペプチド
は、２つの自己タンパク質、トランスフェリン受容体、
及びNa+/K+ATPアーゼ、並びに、１つの外因性タンパク
質であるウシ血清のフェチュイン（細胞を浸す培地を強
化するために用いられる血清中に存在するタンパク質）
に由来した。これらのペプチドは、各々、全DR1母集団
の僅か0.3−0.6％を占めるに過ぎず、HLA−A2、或いはI
iペプチドよりも著しく少ない。クラスII分子は、細胞
表面への移送途上で、外部から入ってくるエンドサイト
ーシス小胞の経路と交差する。リサイクルする膜タンパ
ク質、及びエンドサイトーシスで取込まれた外因性タン
パク質は、両方共、この共通の経路を移動する。従っ
て、HLA−A2、トランスフェリン受容体、Na+/K+ATPアー
ゼ、及びウシのフェチュインに由来するペプチドは、す
べて、同じ様にDR1に遭遇する。Iiは小胞体（ER）内で
発生期のクラスIIと会合して（Jones et al.,Mol.Immun
ol.16:51−60（1978））、クラスII/Ii複合体がエンド
サイトーシス・コンパートメントに到着するまで、抗原
の結合を阻止し（Roche and Cresswell,Nature 345:615
−618（1990））、そこでIiはタンパク質分解を受け（T
homas et al.,J.Immunol.140:2670−2675（1988）;Roch
e and Cresswell,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3150−31
54（1991））、この様にしてペプチド結合の進行を可能
にする。恐らく、DR1に結合するIiペプチドは、この段
階で生成されたと思われる。
表１に報告されているペプチドの中の５つに相当する
合成ペプチドを調製してそれらのDR1に対する相対的結
合親和性を測定した。インフルエンザＡ赤血球凝集素ペ
プチド（HA）307−319（配列番号24）は、以前に、高親
和性のHLA−DR1制限ペプチドと記載されているので（Ro
che and Cresswell,J.Immunol.144:1849−1856（199
0）;Rothbard et al.,Cell 52:515−523（1988））、対
照ペプチドとして選ばれた。組替えDR1のcDNAを発現す
る昆虫細胞から精製された“empty（空の）”のDR1が、
ヒトの細胞から分離されたDR1よりも高い結合容量と10
倍速い会合動力学を示すので結合実験に用いられた（St
ern and Wiley,Cell 68:465−477（1992））。すべての
合成ペプチドがHAペプチドに対してよく（Ki〈100nM）
競合することが見出された（表２）。最初の概算で、Ii
の106−119ペプチド（配列番号156）が、測定されたす
べての競合ペプチドの中で、最高の親和性を持ち、対照
のHAペプチドについて測定された値と同等であった。Ki
測定に加えて、これらのペプチドは、SDS−PAGEで解析
した場合、SDSによって誘導される“empty"DR1のα−β
鎖解離に耐性を与え、安定なペプチド結合を示唆する
（Sadegh−Nasseri and Germain,Nature 353:167−170
（1991）;Dornmair et al.,Cold Spring Harbor Symp.Q
uant.Biol.54:409−415（1989）;Springer et al.,J.Bi
ol.Chem.252:6201−6207（1977））。２つの対照ペプチ
ド、β2m 52−64（配列番号26）、或いはIi 96−110
（配列番号25）は、いずれもSDS−誘導によるDR1の鎖解
離に耐性を与えず、DR1との結合に対してHA 307−319
（配列番号24）と競合出来なかった。これらのペプチド
は両方共、本研究に報告されている推定結合モチーフを
欠いている（以下参照）。
幾つかの自然界でプロセシングを受けたペプチドのコ
ア抗原決定基（最小限の長さ）の配列整理に基づく推定
DR1結合モチーフが表３に示されている。この表に列挙
されているペプチドには、HLA−DR1に対して本申請にお
いて決定されたものに加えて、他の研究者によって確認
され、DR1を結合することが知られているペプチドも含
まれている（本表の参考文献＃６は、O'Sullivan et a
l.,J.Immunol.145:1799−1808,1990;参考文献＃17は、R
oche ＆ Cresswell,J.Immunol.144:1849−1856;参考文
献＃25は、Guttinger et al.,Intern.Immunol.3:899−9
06,1991;参考文献＃27は、Guttinger et al.,EMBO J.7:
2555−2558,1988;及び参考文献＃28は、Harris et al.,
J.Immunol.148:2169−2174,1992である）。上記モチー
フに提唱されている基本的に重要な残基は以下の通りで
ある。正荷電グループが第一の位置に所在し、本申請で
は方向付けのための指標位（Ｉ）と呼ばれ、水素結合ド
ナーがＩ＋５に、更に、疎水性の残基がＩ＋９に位置す
る。更に、疎水性残基が、しばしば、Ｉ＋１及び／或い
はＩ−１に見出される。DR1から配列決定された、天然
でプロセシングを受けたペプチドはいずれもこのモチー
フに属する（残基Ｉ＋９を欠くHLA−A2ペプチド103−11
6（配列番号３）を例外として）。推定モチーフは第一
のアミノ酸に関して明確に定められた位置には所在せ
ず、又、結合ペプチドの長さが不規則であるために、ク
ラスＩ分子に対してされた様に、ペプチドプールの配列
からモチーフを推定することは不可能である（Falk et
al.,Nature 351:290−296（1991））。Ii 96−110ペプ
チド（配列番号25）、即ち、結合実験で用いられた負の
対照ペプチドは、その配列の中にＩ及びＩ＋５のモチー
フ残基を持つが、Ii 105−118（配列番号16）に見出さ
れる８個の追加のアミノ酸が欠けている（表3C）。
35種のこれまでに記載されているDR1に結合する合成
ペプチド（O'Sullivan et al.,J.Immunol.145:1799−18
08（1990）;Guttinger et al.,Intern.Immunol.3:899−
906（1991）;Hill et al.,J.Immunol.147:189−197（19
91）;Guttinger et al.,EMBO J.7:2555−2558（1988）;
Harris et al.,J.Immunol.,148:2169−2174（1992））
の配列の比較も、又、このモチーフを支持している。当
該35種の合成ペプチドの中で、21種（60％）は上記の正
確なモチーフを持ち、９種（30％）はＩ或いはＩ＋９位
に単一のシフト（shift）を含み、又、残りの５種（10
％）はＩ位に単一の置換を持つ（表3B及びＣ）。興味の
あることに、後に挙げたペプチドにおいては、Ｉ位の正
荷電は、常により大きな疎水性残基で置換されている
（表8C）。この正確な置換に便宜を与えることの出来る
ポケット構造がクラスＩ分子で記載されている（Latron
et al.,Porc.Natl.Acad.Sci.USA 88:11325−11329（19
91））。他の８つのアミノ酸の上記でモチーフ内、或い
はペプチドの長さの中における寄与は十分には評価され
てはいないが、これらのペプチドが示す結合において、
転位／喪失した残基の補償をしているのかも知れない。
これらの研究において引用された残り117種のDR1に結合
しないペプチド（これらのペプチドは表３に含まれてい
ない）の検討は、これらペプチドの中で99種（85％）
が、本申請で提唱されているDR1モチーフを含まないこ
とを示している。DR1に結合しないが、当該モチーフを
含む残り18種のペプチド（15％）の中で６種は（５％）
は、他のDRアロタイプに結合することが知られている。
残り12のペプチドは、結合を妨害する他の部位で不都合
な相互作用をするのかも知れない。
Ｉ−Abと呼ばれるマウスのクラスII抗体に結合する６
種のペプチド、及びマウスのＩ−Ebに結合する５種のペ
プチドに関する以前の研究において観察された正確なＮ
−末端の分裂とは対照的に（Rudensky et al.,Nature 3
565:622−627（1991））、DR1に結合する当該ペプチド
は、Ｎ−及びＣ−末端の両方において不均一（heteroge
nous）である。クラスＩ分子に結合するペプチド９量体
が支配的であるが、これらとは対照的に（Van Bleek an
d Nathenson,Nature 348:213−216（1990）;Rotzschke
et al.,Nature 348:252−254（1990）;Jardetzky et a
l.,Nature 353:326−329（1991）;Hunt et al.,Science
255:1261−1263（992））、クラスIIペプチドはよりサ
イズが大きく、又、末端の切断の長さと部位の両方にお
いて高度の不均一性を示し、クラスＩ及びクラスIIのペ
プチドに対するプロセシングの機構が相当に異なること
を意味している。更に、今回の結果は、クラスIIのプロ
セシングは、確率論的な事象であり、DRアロタイプは、
複雑で不揃いな混合物の中から種々の長さのペプチドに
結合する可能性を示唆している。観察された上記の不均
一性は、単に、結合したペプチドが更に分解するのを防
ぐためかも知れない。この様にして、クラスII分子は、
結合したペプチドが完全に分解されることから防御する
ことによって、抗原のプロセシングにおいて積極的な役
割を演じるのであろう（以前に提唱された様に（Donerm
eyer and Allen,J.Immunol.142:1063−1068（198
9））。又は、DR1に結合するものは15量体が支配的であ
るが（MALD−MS及び配列決定されたペプチドの得量の両
方から検出される様に）、これは、結合したペプチドの
剪定（trimming）の結果かも知れない。いずれにせよ、
検出可能な量の、13残基より短く、25残基より長いペプ
チドが存在しないことは、ペプチドの結合機構、或いは
抗原のプロセシングに特有の長さの制限のあることを示
唆している。DR1に結合するペプチドは、内因的に合成
されたタンパク質、特にMHCに関連したタンパク質に由
来するものが支配的であることは、自己寛容の発生に関
連して、自己ペプチド提示機構の進化の結果かも知れな
い。
II.他のHLA−DR分子 DR2、DR3、DR4、DR7及びDR8の各々から溶離された天
然でプロセシングを受けたペプチドのアミノ酸配列が、
夫々、表４−８に示されている。表４に示されているペ
プチドに加えて、DR2は、HLA−A2のβ鎖、及びHLA−DR2
bのβ鎖の長い断片、即ち、これらのタンパク質の各々
の残基１−126、或いは１−127に相当する断片、に結合
することが見出されている。恐らく、これらの長い断片
の中の短い一部のみが、実際に、DR2の溝の中に結合
し、各断片の残りの部分は上記の溝の一端、或いは両端
から突出しているのであろう。表９には、野生型のArを
持たないが、A2様のペプチドを結合した他の細胞系由来
のDR1のアミノ酸配列が示されている。表10は、ヒトの
膵臓由来の細胞に発現されるDR4及びDR11分子から溶離
したペプチドのアミノ酸配列を示す。これらのデータ
は、外因性ペプチドと比較して、結合する自己ペプチド
が大いに優勢であることを証明する。このデータは、
又、A2及びIiペプチドが、繰り返し生じることを示す。
更に、表のあるものは、エプスタイン・バールウイルス
の主要キャプシド・タンパク質の様なウイルスタンパク
質、これは、恐らく、研究に用いた細胞内に存在すると
考えられるタンパク質であるが、に由来すると思われる
ペプチドを含む。
III.ペプチドのデリバリー 遺伝的構成 本発明の免疫調節ペプチドをコードする遺伝子の生体
内投与のための遺伝的構成物を調製するために、以下の
操作が行われる。
重複した合成のオリゴヌクレオチドを用いて、図３に
示されているリーダーペプチド／遮断ペプチドのミニ遺
伝子を、ヒトのHLA−DRα及びインバリアント鎖のcDNA
鋳型から、PCR増幅によって生成した。これらのミニ遺
伝子は、Iiペプチド断片であるKMRMATPLLMQALPM（即
ち、Ii15、配列番号15）、及び、LPKPPKPVSKMRMATPLLMQ
ALPM（即ち、Ii24、配列番号７）をコードする。その結
果得られた構成物は、プラスミドpGEM−２−α−Ii15、
及びpGEM−２−α−Ii24を形成するために、pGEM−２
（Promega社）中に、以下に述べるin vitro転写／翻訳
系で用いるための上流T7プロモータと共にクローンされ
た。
in vitro発現のために、各ミニ遺伝子は、その後、pG
EM−２誘導体からトランスフェクション・ベクターであ
るpHβアクチン−１−ネオ（neo）（Gunning et al.,
（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4831）中にサブク
ローンされてプラスミドpHβアクチン−α−Ii15及びpH
βアクチン−α−Ii24を形成した。上記の挿入されたミ
ニ遺伝子は、この様にして、構成性で／強力なヒトのβ
アクチンプロモーターから生体内（in vivo）で発現さ
れる。これに加えて、上記ミニ遺伝子は、pGEM−２誘導
体からワクシニアウイルスの組替えベクターであるpSC1
1（S.Chakrabarti et al.,（1985）Mol.Cell.Biol.５,3
403−3409）中にサブクローンされてプラスミドpSC11−
α−Ii15及びpSC11−α−Ii24を形成した。ウイルスの
ゲノム中に組替え後、上記のミニ遺伝子は強力なワクシ
ニアｐ7.5プロモーターから発現される。
ペプチドに加えられる細胞内流通シグナル 短いアミノ酸配列は、タンパク質を特定の細胞内分画
（コンパートメント）に指向するためのシグナルとして
作用することが出来る。例えば、疎水性シグナルペプチ
ドが、ERに仕向けられているタンパク質のアミノ末端に
見出されるが、アミノ酸配列KFERQ（配列番号153）（及
び、他の密接に関連した配列）は細胞内ポリペプチドを
リソソームに指向することが知られており、一方、他の
配列はポリペプチドをエンドソームに指向する。更に、
ペプチド配列KDEL（配列番号152）はERに対する保持シ
グナルとして作用することが示されている。これらのシ
グナルペプチドの各々、或いは、これらを組合わせて、
本発明の免疫調節ペプチドを、希望通りの流通に用いる
ことが出来る。例えば、ER標的指向のシグナルペプチド
に連結された所定の免疫調節ペプチドをコードする構成
物は、当該ペプチドをERに指向し、そこで組立てられた
ままで、クラスII分子に結合して、流通に必須である無
傷のIiの結合を防止する。又は、上記ペプチド上のER保
持シグナルが、クラスII分子が、かりにも、ERから分離
することを防止する助けとなるような構築物を作ること
も出来る。もし、代わりに、本発明のペプチドがエンド
ソーム分画に指向されるならば、これは、インバリアン
ト鎖がプロセシングを受けたペプチドで置換される場
合、大量の当該ペプチドが存在し、それによってクラス
II複合体に組込まれたペプチドが、天然由来で潜在的に
免疫原性のペプチドよりもむしろ本発明の高親和性ペプ
チドである可能性を増大する。本発明のペプチドがクラ
スIIへの組込みに利用出来る見込みは、当該ペプチドを
無傷のIiポリペプチド配列に連結することによって増大
することが出来る。IiはクラスII分子をエンドソームへ
流通することが知られているので、ハイブリッドIiは、
本発明のペプチドの１つ、或いはそれ以上のコピーをク
ラスII分子と共に運ぶことになる。一旦、エンドソーム
内に入ると、上記ハイブリッドIiは正常のエンドソーム
のプロセスによって分解して、本発明のペプチド或い
は、それに類似の分子の多重コピー、及びクラスIIの開
放された結合間隙とを生成する。標的指向シグナルを含
む免疫調節ペプチドをコードするDNAは、PCR或いは他の
標準の遺伝子操作、または合成的技法によって生成さ
れ、これらペプチドがDR分子と会合する能力は、下記の
様に、in vitro及びin vivoで分析される。
インバリアント鎖は、クラスII分子がER内でペプチド
を結合することを防止してヘテロダイマー形成に貢献す
る可能性があると提唱されている。この会合を防止する
機構は、いかなるものでもクラスII遮断の効率を増大す
るであろう。従って、クラスIIヘテロダイマーに結合す
るIi上の部位、或いはIiに結合するヘテロダイマーのα
またはβサブユニット上の部位に対応するペプチドは、
この会合を防止し、それによって、MHCクラスIIの機能
を中断するために用いることが出来る。
In vitroにおける組立て 無細胞抽出液が真核生物のタンパク質を発現するため
日常的に使用されている（Kreig,P.＆ Melton,D.（198
4）Nucl.Acids Res.12,7057;Pelham,H.and Jackson,R.
（1976）Eur.J.Biochem.67,247）。特定のmRNAが、ウイ
ルスRNAポリメラーゼのプロモーターを含むDNAベクター
から転写されて（Melton,D.et al.（1984）Nucl.Acid R
es.12,7035）、ミクロコッカスヌクレアーゼで処理され
た細胞抽出液に加えられる。35Sメチオニン及びアミノ
酸の添加が、外因性のmRNAの翻訳を始動し、結果として
標識タンパク質が生成される。タンパク質は、次いでSD
S−PAGEにより分析され、オートラジオグラフィーによ
って検出される。シグナルペプチドの切断及びコアグル
コシル化の様なプロセシング事象は、翻訳の間にミクロ
ソーム小胞を添加することによって開始され（Walter,
P.and Blobel,G.（1983）,Meth.Enzymol.,96,50）、こ
れらの事象はSDS−PAGEゲルにおけるタンパク質の移動
度の変化によって検査される。
シグナルペプチド配列を含むペプチドが、正確にプロ
セシングを受けて、インバリアント鎖とER中でクラスII
結合に対して競合する能力は、上述のin vitro系でアッ
セイされる。とりわけ、上述のDR1のα−とβ−鎖、及
びインバリアント鎖ペプチドの構成物は、mRNAに転写さ
れ、これが哺乳動物のミクロソーム膜の存在下に翻訳さ
れるであろう。DRヘテロダイマーのIiとの会合は、DR及
びIiに対する抗血清による免疫沈降試験によって測定さ
れる。本発明のペプチドをコードするmRNAを翻訳反応に
加え、トリスートリシンゲル上のSDS−PAGEで測定する
場合、共免疫沈降するIiのレベルが減少すると同時に共
免疫沈降するペプチドが出現する結果となるはずであ
る。これらの実験は、所定の遮断ペプチドのERにおける
Ii鎖結合に対する競合剤としての潜在的有用性を決定す
るための迅速なアッセイ系を提供するであろう。この無
細胞系においてIiと有効に競合する能力のあることが判
明している本発明のこれらのペプチドは、次いで、以下
に述べる様に、無傷の細胞において検査することが出来
る。
In vivoにおける組立て ヒトのEBVで形質転換されたＢ細胞系であるLG−２とH
OM−２（HLA−DR1に対して同型接合）及びマウスのＢ細
胞ハイブリドーマであるLK35.2が、50μｇの鎖状化pHβ
アクチン−α−Ii15或いはpHβアクチン−α−Ii24、又
は（コントロールとして）pHβアクチン−１−neoで、
エレクトロポレーション（150mV、960μＦ、キュベット
幅0.2cm）によってトランスフェクトされる。エレクト
ロポレーション後、上記細胞は、G418を含まない培地中
で完全回復まで（約４日）培養される。各母集団は、次
いで、ネオマイシン耐性を表現する形質転換体母集団か
ら得られる迄G418選別にかける（約１−２ケ月）。耐性
母集団は、制限稀釈によってサブクローンし、安定な形
質転換体の遺伝的同一性は、遮断ペプチドのmRNA発現の
PCR増幅によって決定される。
遮断ペプチドのミニ遺伝子、或いは負の制御ベクター
を担載するLG−２、及びHOM−２の安定な形質転換体
を、ペレット化細胞塊20gを得る迄、大量培養条件で培
養する。各形質転換体によって発現されたHLA−DRを精
製し、結合ペプチドの量（細胞内及び細胞外両方から
の）を上記の様にして分析する。総結合ペプチドの多様
性の減少の成功が証明されれば、免疫調節ペプチドの細
胞内への運搬の確証となる。
もう一つの細胞によるアッセイは、遮断ペプチドのミ
ニ遺伝子、或いは負の制御ベクターを担載するLK35.2細
胞の安定な形質転換体を利用する。これらの細胞は、Ｔ
細胞増殖アッセイにおいてAPCとして用いられる。各形
質転換体を、種々の稀釈度の鶏卵リゾチーム（HEL）、
及びHELに特異的なＴ細胞ハイブリドーマの存在下に24
時間培養する。各アッセイに存在するＴ細胞の相対的活
性化（リンホカイン生成により測定）は、市販のリンホ
カイン依存性細胞系であるCTLL2を用いて、3H−チミジ
ンの取込みアッセイ（Vignali et al.（1992）J.E.M.17
5:925−932）で測定する。遮断ペプチドを発現する形質
転換体が、HELを特異的Ｔ細胞ハイブリドーマに提示す
る能力を減少することを成功裡に証明出来れば、免疫調
節ペプチドの細胞内への運搬の確証となるであろう。ヒ
トのTK-細胞系143（ATCC）の細胞をワクシニアウイルス
（WR株、TK+）に感染させ、感染後、２時間して、pSC11
−α−Ii15、或いはpSC11−α−Ii24を感染細胞内にリ
ン酸カルシウム沈殿法によって導入する。TK-組替え体
は、25μg/mlの濃度のブロモデオキシウリジンを用いて
選択する。組替えプラークは、ミニ遺伝子DNAの存在を
求めて、PCRによりスクリーンする。組替えウイルス
は、純粋クローンのウイルス株を生成するために、３ラ
ウンドの限界稀釈によりクローンする。
前述のトランスフェクション実験に類似の実験におい
て、ミニ遺伝子、或いはベクターのみをコードする組替
えワクシニアウイルスを用いて、EBVで形質転換された
ヒトのＢ細胞系、LG−２、及びHOM−２の大規模培養物
を感染する。感染後、HLA−DRを精製して、結合ペプチ
ドの量を上記の様にして分析する。結合ペプチド母集団
の複雑性の低下、及び結合したIiペプチドの相対的量の
著明な増大は、ワクシニアが遮断ペプチドをヒトのAPC
にデリバー出来ることの確証である。ミニ遺伝子、或い
はベクターをコードする同じ組替えワクシニアウイルス
が、実験的に導入された自己免疫を体験しているマウス
を感染するのに用いられるであろう。この様なモデルは
多数知られており、Kronenberg、Cell 65:537−542（19
91）に引用されている。
合成ペプチド、或いはミニ遺伝子構成物のリポソームに
よる運搬 リポソームは、薬物の担体として、又、最近では、ヒ
トにおけるマラリアのワクチン注射のための安全で有力
な補助戦略として成功裡に使用されている（Fries et a
l.（1992）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:358）。包膜さ
れたリポソームは、可溶性タンパク質を取込み、これら
の抗原を細胞に運搬して、in vitro及びin vivoの両方
におけるCD8+仲介の細胞溶解性（CTL）の応答をもたら
す（Reddy et al.,J.Immunol.148:1585−1589,1992;及
びCollins et al.,J.Immunol.148:3336−3341,1992）。
この様にして、リポソームは、合成ペプチドをAPC内に
運搬するための伝達体（vehicle）として用いてもよ
い。
Hardingら（Cell（1991）64,393−401）は、リポソー
ムにより運搬される抗原の、２つの細胞内のクラスII充
填分画のいずれか、即ち、初期のエンドソーム及び／或
いはリソソームへの標的指向は、リポソームの膜組成を
変えることによって達成出来ることを証明している。即
ち、酸感受性リポソームは、その内容物を初期エンドソ
ームに指向するが、一方、酸耐性のリポソームは、その
内容物をリソソームに運搬することが見出されている。
この様にして、本発明のペプチドは、エンドソームへの
運搬が望まれている場合、酸感受性のリポソームに、
又、リソソームへの運搬が望まれている場合は、酸耐性
リポソームに取込まれることになろう。
リポソームは、標準の界面活性剤透析、或いは脱水−
再水和法によって調製される。酸感受性リポソームに対
しては、ジオレオイル・ホスファチジルエタノールアミ
ン（DOPE）及びパルミトイル・ホモシステイン（PHC）
が用いられ、一方、ジオレオイル・ホスファチジルコリ
ン（DOPC）及びジオレオイル・ホスファチジルセリン
（DOPS）が、酸耐性リポソームの調製に使用される。10
-5モルの総脂質（DOPC/DOPS或いはDOPE/PHC、4:1のモル
比で）を乾燥し、0.2mlのHEPES緩衝食塩水（HBS）（150
mM NaCl、1mM EGTA、10mM HEPES pH7.4）中で水和して
超音波処理する。脂質の懸濁液を1mlのHBS中で1Mのオク
チルグルコシドを加えて可溶化する。封入されるべきペ
プチドを20％HBS中6mMのペプチド0.2mlに加える。混合
物は、次いで、凍結し、一晩凍結乾燥してから再水和す
る。これらのリポソームは、キモトリプシンで処理し
て、表面に結合したペプチドをすべて消化する。リポソ
ームのEBVで形質転換した細胞系（上述の様に）への運
搬は、37℃で12−16時間のインキュベーションにより達
成されるであろう。HLA−DRは、リポソームで処理した
細胞から精製されて、結合ペプチドは前記の様にして分
析される。
代わりに、リポソームは本発明のDNAミニ遺伝子構成
物で処方調製されて、in vitro或いはin vivoで上記構
成物をAPCに運搬するために使用される。
ヒトの免疫感作は、臨床検査のためのジョンズ・ホプ
キンス大学・合同委員会（The Johns Hopkins Universi
ty Joint Committee for Clinical Investigation）、
及び米国陸軍・軍医総監室・ヒト患者を対象とする研究
検閲評議会（Human Subject Research Review Board of
the Office of the Surgeon General of the U.S.Arm
y）の両方によって承認された手順（Fries et al.（199
2）,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:358−362）に従い、
そこに記載の用量、或いは、治療薬のリポソームを基盤
とする運搬に対する文献に記載の他の用量を用いて行わ
れるであろう。
免疫刺激複合体（ISCOMS）を介する運搬 ISCOMSはコレステロールとQuil A（サポニン）を混合
すると自発的に生成される30−40nmのサイズの負荷電の
籠形構造物である。保護免疫は、トキソプラズマ病及び
エプスタイン・バールウイルスで誘導される腫瘍を含む
種々の感染の実験モデルにおいて、ISCOMSを抗原の運搬
伝達体として用いて発生されている（Mowat and Donach
ie,Immunology Today 12:383−385,1991）。ISCOMSに封
入された１μｇ程度の低い抗原用量でもクラスＩ仲介の
CTL応答を起こすことが見出されており、ここでは、精
製した無傷のHIV−１−III B gp 160包膜糖タンパク
質、或いはインフルエンザ・赤血球凝集素が抗原である
（Takahashi et al.,Nature 344:873−875,1990）。ペ
プチドは、ISCOMSを用い、上述のリポソームに対するの
と同じ様式と用量で組織培養細胞内に運搬される。運搬
されたペプチドのクラスIIペプチド結合は、次いで、上
述の様に、抽出と特徴決定によって決定された。ISCOMS
によって運搬されて培養細胞によって効果的に利用され
る本発明のペプチドは、次いで、動物或いはヒトで検査
される。
治療用の合成ペプチドの運搬に加えて、ISCOMSは、ミ
ニ遺伝子をAPCに運搬するために構成され、この様にし
て上に概説されたワクシニア戦略に対する代替法として
役立つ。
免疫原性ペプチドの運搬（ワクチン） 免疫系をダウンレギュレーションするという特異的な
目的で、非免疫原性の自己ペプチドを運搬するために前
述の細胞内運搬システムを利用することに加えて（この
様にして自己免疫状態を軽減する）、本発明の運搬シス
テムは、代わりに、動物の免疫系の一部を刺激するため
に、予防接種の新規の方法として用いることも出来る。
後の場合、上記の運搬システムは、特定の病原体に対す
る免疫応答の刺激を意図された免疫原性で、病原体由来
のペプチドを発現するDNA構成物を、適当な細胞内に運
搬するために利用される。上記免疫原性ペプチドは標的
細胞自身の中で生成されるので、本発明のワクチン法
は、抗体生成を刺激し、それによって潜在的に有害な、
或いは不適切な免疫反応誘導に利用される様な血中を循
環する遊離の抗原は存在しないことを保証する。本発明
のワクチンによって刺激される免疫応答は、ワクチンは
APCにのみ指向されているので、もっと全般的な免疫応
答という結果になる標準のワクチンプロトコルとは対照
的に、Ｔ細胞仲介の応答に限定されている。ペプチドを
提示するAPCのあるものは、初期にホストＴ細胞によっ
て溶解されることもあるが、とりわけ、ウイルス基盤の
ワクチンは、非複製的で、即ち、各担体ウイルスは単に
１個の細胞のみを感染するので、この様な溶解は限定さ
れている。
本発明の系を完璧にして検査するために用いられるモ
デル抗原は、鶏卵のリゾチーム（HEL）である。議論は
あるものの、これは、抗原提示研究のために最もよく特
徴が検討されているタンパク質であり、それに対して
は、多数の単クローン性抗体、及びクラスＩとクラスII
に限定されたマウスのＴ細胞クローン及びハイブリドー
マが存在する。研究される一次抗原決定基は、単クロー
ン性抗体及びCD4＋Ｔ細胞ハイブリドーマの両方が入手
出来るので、ペプチドHEL 34−35であり、及び、クラス
ＩとクラスII限定Ｔ細胞クローン及びハイブリドーマが
作られ、市販されているので、ペプチドHEL46−61とで
ある。この様にして、これら２つのアミノ酸配列は、免
疫原性の抗原決定基であることが立証されている。最
初、異なったポリペプチドをコードする４種の構成物が
分析される。（ａ）分泌されるHELの全体、（Ｂ）HEL 3
4−45、（ｃ）HEL 46−61、及び（ｄ）HEL 34−61。最
後の３種は、これらの細胞内で切断されることが知られ
ているシグナル配列、例えば、IAk（MPRSRALILGVLALTTM
LSLCGG、配列番号 ）を含み、結果としてERを指向
する。すべての構成物は、次いで、pHβApr−1 neo中に
サブクローンされる。これらの構成物を作成する方法論
は、上に概説されたものと同じである。上記構成物は、
通常の真核細胞のトランスフェクション、或いは、上述
のデリバリー伝達体（例えば、ワクシニア、リポソー
ム、或いは、ISOCOMS）の１つによって、適切なAPC、例
えば、LK35.2細胞内に導入される。マウスのMHCクラスI
I制限分子であるIAk及びIEkを持ち、上記構成物の各々
でトランスフェクトされたLK35.2細胞が、適当なクラス
Ｉ及びクラスII制限Ｔ細胞ハイブリドーマ並びにクロー
ンを刺激する能力を標準技法で検査される。クラスＩ刺
激が観察されるかどうかは、クラスＩ分子との結合に適
切な８−10量体を生成するためにペプチドの翦定がER内
で起こり得るかどうかに関わると思われる。もし、これ
らの構成物がクラスＩ刺激に効果的でなければ、クラス
Ｉ結合に更に効果的なペプチドを生成するためにこれら
の構成物を修飾することが出来る。これらの構成物は、
クラスIIに限定された応答に対してより効果的でないこ
とが立証される場合には、Ｖ節に述べられた様に、これ
らに、エンドソーム及び／或いはリソソーム指向の配列
を付与することが出来る。
免疫原性ペプチドを特定の細胞内小器官に指向するた
めに用いられる標的指向シグナルの効果性は、種々の形
質転換体の免疫金染色切片の電子顕微鏡分析を用いて検
出されるであろう。この適用のため、ウサギの抗ペプチ
ド抗血清が生成され、アフィニティを利用して精製され
る。更にHEL 34−35を認識する単クローン性抗体HF10が
用いられるであろう。
一旦、形質転換体によってある構成物がin vitroで効
果的に提示出来ることが明確になれば、そのin vivoに
おける効果性が決定される。これは、上記形質転換体を
C3H/Balb/c F1マウスに腹腔内及び／或いは皮下注射す
ることにより、または、適当な運搬伝達体（例えば、リ
ポソーム、ISCOMS、レトロウイルス、ワクシニア）に取
込まれた構成物を注射することによって検査することが
出来る。この様な免疫感作注射に対する至適プロトコル
及び用量は、本出願に提供されている開示があれば、当
事者によって決定することが出来る。免疫感作の効率
は、以下の様な標準の方法によって検査出来る。（ａ）
HELを適用された（HEL pulsed）APCに応答するクラスII
に限定されたＴ細胞の増殖、（ｂ）51Crで標識された標
的に対する細胞溶解（CTL）応答、及び（ｃ）ELISAで測
定される血清の抗体価。
一旦、本発明のワクチン運搬システムの細部が至適化
されたならば、有用な免疫感作の潜在能力を持つペプチ
ドをコードする構成物を上記の系に組込むことが出来
る。この様なペプチドは、病原体由来のタンパク質上の
免疫原性抗原決定基の同定に現今用いられている標準手
段によって確認することが出来る。例えば、免疫感作の
ための候補ペプチドは、抗体及び特定の病原体で感染さ
れた動物のＴ細胞の分析から決定してもよい。保護的で
効果的な既往応答を獲得するために、予防接種に用いら
れるペプチドは、理想的には、感染すると最高の頻度と
効率で提示されるペプチドでなければならない。これ
は、感染細胞からMHCクラスII分子に結合したペプチド
を抽出して特徴決定するために、前記実験の部に概説さ
れている操作を用いて最もよく決定することが出来る。
免疫原性ペプチドに対立遺伝子制限があるならば（本発
明の自己ペプチドの変質した結合が観察されるのに対比
して）、全母集団に対して有用なワクチンを提供するた
めには数種の免疫原性ペプチドをコードするミニ遺伝子
が要求されるであろう。ワクチンの投与と用量は、天然
痘の予防接種に現在適用されているものと同様である。
配列リスト （１）一般情報： （ｉ）出願人：ロバート ジー アーバン ローマン エム チクズ ダリオ エー エー ビグナリ マリー エル ヘドレイ ローランス ジェイ ステルン ジャーク エル ストロミンガー （ii）発明の名称：免疫調節ペプチド （iii）配列数:273 （iv）対応アドレス： （Ａ）名宛人：フィッシュ アンド リチャードソ
ン （Ｂ）通り:225フランクリンストリート （Ｃ）市：ボストン （Ｄ）州：マサチューセッツ （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:02110−2804 （ｖ）コンピュータ読み出し形態： （Ａ）媒体形式:3.5"ディスク,1.44Mb （Ｂ）コンピュータ:IBM PS/2モデル50Zまたは55SX （Ｃ）作動システム:MS−DOS（バージョン5.0） （Ｄ）ソフトウェア:WordPerfect（バージョン5.
1） （vi）現出願データ： （Ａ）出願番号:08/077,255 （Ｂ）出願日:1993年６月15日 （Ｃ）分類： （vii）優先出願データ： （Ａ）出願番号:07/925,460 （Ｂ）出願日:1992年８月11日 （viii）代理人情報： （Ａ）氏名：クラーク ポール ティー （Ｂ）登録番号:30,162 （Ｃ）整理番号:00246/168JP1 （ix）遠隔通信情報： （Ａ）電話番号：（617）542−5070 （Ｂ）ファックス番号：（617）542−8906 （Ｃ）テレックス番号:200154 （２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:18 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号１の記載： （２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:15 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号２の記載： （２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:148 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号３の記載： （２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:14 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号４の記載： （２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:13 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号５の記載： （２）配列番号６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:25 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号６の記載： （２）配列番号７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:24 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号７の記載： （２）配列番号８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:24 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号８の記載： （２）配列番号９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:23 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号９の記載： （２）配列番号10の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:23 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号10の記載： （２）配列番号11の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:22 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号11の記載： （２）配列番号12の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:22 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号12の記載： （２）配列番号13の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:21 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号13の記載： （２）配列番号14の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:20 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号14の記載： （２）配列番号15の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:15 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号15の記載： （２）配列番号16の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:14 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号16の記載： （２）配列番号17の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:18 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号17の記載： （２）配列番号18の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:17 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号18の記載： （２）配列番号19の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:19 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号19の記載： （２）配列番号20の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:18 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列番号20の記載： （２）配列番号21の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:19 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 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フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 37/18 (72)発明者 チクズ ローマン エム アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ジャマイカ プレイン グレンロード 82 (72)発明者 ビグナリ ダリオ エー イギリス国 ケント州 レインハム ロ ーワー レインハム ロード 761 (72)発明者 ヘドレイ マリー リン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ケンブリッジ＃１ ワルデン ストリー ト 214 (72)発明者 ステルン ローランス ジェイ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 アーリントン ニューポート ストリー ト 181 (72)発明者 ストロミンガー ジャック エル アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 レキシントン マサチューセッツ アベ ニュー 2030 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．147，Ｎｏ．11 （1991），ｐ．3893−3900 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 7/06 - 7/08 A61K 38/00 - 38/17 C12N 15/00 - 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】天然由来ヒトタンパク質の天然でプロセシ
    ングを受けたセグメントの配列と同一なアミノ酸配列か
    ら本質的に成り、ヒト主要組織適合性遺伝子複合体（MH
    C）クラスII分子と結合するペプチドの精製調製品であ
    って、 該セグメントの長さが10から30残基であり、 該セグメントが配列番号:68、70、71、122、132〜134、
    144〜146、158〜186、188〜190、もしくは196〜273のい
    ずれかに記載の配列を含む、精製調製品。
  2. 【請求項２】ペプチドが少なくとも２つの別個のMHCク
    ラスIIアロタイプに結合する、請求項１記載の調製品。
  3. 【請求項３】ヒトタンパク質がMHCのクラスＩもしくは
    クラスII分子である、請求項１記載の調製品。
  4. 【請求項４】セグメントが配列番号:68、70、71、122、
    132〜134、144〜146、158〜186、188〜190、もしくは19
    6〜273のいずれかに記載の配列より成る、請求項１記載
    の調製品。
  5. 【請求項５】天然由来ヒトタンパク質の天然でプロセシ
    ングを受けたセグメントの配列と同一なアミノ酸配列か
    ら本質的に成るペプチドを含むリポソームであって、 該セグメントの長さが10から30残基であり、 該セグメントが配列番号:68、70、71、122、132〜134、
    144〜146、158〜186、188〜190、もしくは196〜273のい
    ずれかに記載の配列を含み、 該ペプチドがヒト主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）
    クラスII分子と結合する、リポソーム。
  6. 【請求項６】天然由来ヒトタンパク質の天然でプロセシ
    ングを受けたセグメントの配列と同一なアミノ酸配列か
    ら本質的な成るペプチドを含む免疫刺激複合体（ISCO
    M）であって、 該セグメントの長さが10から30残基であり、 該セグメントが配列番号:68、70、71、122、132〜134、
    144〜146、158〜186、188〜190、もしくは196〜273のい
    ずれかに記載の配列を含み、 該ペプチドがヒト主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）
    クラスII分子と結合する、免疫刺激複合体。
  7. 【請求項７】ポリペプチドをコードする核酸であって、 該ポリペプチドがペプチド結合によって連結された第１
    および第２のアミノ酸配列を含み、 該第１の配列が天然由来ヒトタンパク質の天然でプロセ
    シングを受けたセグメントの配列と同一であり、該セグ
    メントの長さが10から30残基であり、該セグメントが配
    列番号:68、70、71、122、132〜134、144〜146、158〜1
    86、188〜190、もしくは196〜273のいずれかに記載の配
    列を含み、該ペプチドがヒト主要組織適合性遺伝子複合
    体（MHC）クラスII分子と結合し、 該第２の配列が、その配列の付着するポリペプチドの細
    胞内流通（trafficking）を制御する配列（「流通配列
    （trafficking sequence）」）である、核酸。
  8. 【請求項８】流通配列が、KDEL（配列番号:152）、KFER
    Q（配列番号:153）、QREFK（配列番号:154）、MAISGVPV
    LGFFIIAVLMSAQESWA（配列番号:155）、一方の側にリジ
    ン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェ
    ニルアラニン、イソロイシン、バリン、およびロイシン
    から選択される４つの残基が隣接しているグルタミン酸
    を含むペンタペプチド、もしくはシグナルペプチドであ
    る、請求項７記載の核酸。
  9. 【請求項９】ペプチド結合によって連結された第１およ
    び第２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする
    核酸であって、 該第１の配列が天然由来ヒトタンパク質の天然でプロセ
    シングを受けたセグメントの配列と同一であり、該セグ
    メントの長さが10から30残基であり、該セグメントが配
    列番号:68、70、71、122、132〜134、144〜146、158〜1
    86、188〜190、もしくは196〜273のいずれかに記載の配
    列を含み、該ペプチドがヒト主要組織適合性遺伝子複合
    体（MHC）クラスIIアロタイプと結合し、 該第２の配列がインバリアント鎖（Ii）と本質的に同一
    である、核酸。
  10. 【請求項１０】請求項７記載の核酸を含む細胞。
  11. 【請求項１１】上記核酸から上記ポリペプチドの発現を
    可能にする条件下で請求項10記載の細胞を培養する段階
    を含む、ペプチドの製造方法。
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