JP2003289887A - 免疫調節ペプチド - Google Patents
免疫調節ペプチドInfo
- Publication number
- JP2003289887A JP2003289887A JP2003035576A JP2003035576A JP2003289887A JP 2003289887 A JP2003289887 A JP 2003289887A JP 2003035576 A JP2003035576 A JP 2003035576A JP 2003035576 A JP2003035576 A JP 2003035576A JP 2003289887 A JP2003289887 A JP 2003289887A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- sequence
- seq
- nucleic acid
- class
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 大抵の現行の予防接種戦略は、なお、弱毒
化、或いは不活性化したウイルスの様な比較的粗製の製
品を用いている。この様なワクチンは、しばしば、抗体
仲介、及び細胞仲介による免疫の両方を生じ、発生する
免疫応答のタイプを修飾することは出来ない。 【解決手段】 本発明の治療法においては、本発明の高
親和性の免疫調節性の自己ペプチドをモデルにした短鎖
ペプチド（好適には非対立遺伝子的に制限された）が患
者のAPC に導入される。本発明のペプチドは多様なクラ
スIIイソタイプと結合するので、患者によって発現され
る特定のクラスII対立遺伝子を決定ずる組織タイプの分
類は不必要であろう。
化、或いは不活性化したウイルスの様な比較的粗製の製
品を用いている。この様なワクチンは、しばしば、抗体
仲介、及び細胞仲介による免疫の両方を生じ、発生する
免疫応答のタイプを修飾することは出来ない。 【解決手段】 本発明の治療法においては、本発明の高
親和性の免疫調節性の自己ペプチドをモデルにした短鎖
ペプチド（好適には非対立遺伝子的に制限された）が患
者のAPC に導入される。本発明のペプチドは多様なクラ
スIIイソタイプと結合するので、患者によって発現され
る特定のクラスII対立遺伝子を決定ずる組織タイプの分
類は不必要であろう。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の分野は、主要組織適
合性複合体（MHC）抗原である。
合性複合体（MHC）抗原である。
【０００２】
【従来の技術】主要組織適合性複合体（MHC）クラスII
抗原は、脊椎動物におけるすべての特異的免疫応答を統
合する細胞表面受容体である。ヒトは３種の別個のMHC
クラスII抗原のイソタイプを持つ、即ち、約70の異なっ
たアロタイプが知られているDR、33の異なったアロタイ
プが知られているDQ、及び47の異なったアロタイプが知
られているDPとである。各個人は２乃至４のDR対立遺伝
子、２個のDQ対立遺伝子、及び２個のDP対立遺伝子を持
つ。
抗原は、脊椎動物におけるすべての特異的免疫応答を統
合する細胞表面受容体である。ヒトは３種の別個のMHC
クラスII抗原のイソタイプを持つ、即ち、約70の異なっ
たアロタイプが知られているDR、33の異なったアロタイ
プが知られているDQ、及び47の異なったアロタイプが知
られているDPとである。各個人は２乃至４のDR対立遺伝
子、２個のDQ対立遺伝子、及び２個のDP対立遺伝子を持
つ。
【０００３】MHC受容体（クラスＩ及びクラスIIの両方
共）は、病原体、或いは他の非宿主起源山来の小タンパ
ク質断片（ペプチド）を結合して、これらペプチドを免
疫系の調節細胞（Ｔ細胞）に提示することによって免疫
認識に必須である第一段階に関与する。MHCによる提示
が無い場合には、Ｔ細胞は病原性物質を認識することが
出来ない。MHC クラスII受容体を発現する細胞は抗原提
示細胞（APC）と呼ばれる。APC は病原性生物及び他の
異物質をエンドソーム小胞に封入することによって摂取
し、次いでそれらを酵素的、及び化学的分解に委ねる。
APC によって摂取された異種タンパク質は、部分的に分
解されるか、或いは“プロセシングを受けて（processe
d）”ペプチドの混合物を生じ、そのうちのあるもの
は、表面への移行途上にあるMHC クラスII分子に結合す
る。一旦、細胞表面に達すると、MHC 分子に結合したペ
プチドはＴ細胞による認識をうける。
共）は、病原体、或いは他の非宿主起源山来の小タンパ
ク質断片（ペプチド）を結合して、これらペプチドを免
疫系の調節細胞（Ｔ細胞）に提示することによって免疫
認識に必須である第一段階に関与する。MHCによる提示
が無い場合には、Ｔ細胞は病原性物質を認識することが
出来ない。MHC クラスII受容体を発現する細胞は抗原提
示細胞（APC）と呼ばれる。APC は病原性生物及び他の
異物質をエンドソーム小胞に封入することによって摂取
し、次いでそれらを酵素的、及び化学的分解に委ねる。
APC によって摂取された異種タンパク質は、部分的に分
解されるか、或いは“プロセシングを受けて（processe
d）”ペプチドの混合物を生じ、そのうちのあるもの
は、表面への移行途上にあるMHC クラスII分子に結合す
る。一旦、細胞表面に達すると、MHC 分子に結合したペ
プチドはＴ細胞による認識をうける。
【０００４】MHC クラスII抗原は、α鎖、β鎖、及びプ
ロセシングを受けたペプチドからなる３分子複合体とし
てAPC の表面上に発現される。細胞表面に発現される大
抵のポリペプチドの様に、α鎖、β鎖は共にそのNH2 末
端に短いシグナル配列を含み、両鎖を小胞体（ER）に標
的指向する。小胞体内で、クラスIIのα／β鎖複合体は
インバリアント鎖（Ii）と呼ばれるもう１つのタンパク
質と会合する。Iiとの会合は（MHC ヘテロダイマーのペ
プチド結合切込み部位を封鎖することによって）時期尚
早のペプチド捕捉を阻害し、安定なα／β相互作用を促
進して上記複合体のエンドソーム小胞への以後の細胞内
流通を指令するものと考えられている。エンドソーム内
で、Iiはタンパク質分解を含むプロセスによって除去さ
れ、これによってペプチド結合切込みを暴露し、エンド
ソーム内に存在するペプチドが上記 MHC分子に結合出来
る様にする。クラスII／ペプチド複合体はエンドソーム
から細胞表面に運ばれ、そこで T細胞による認識とそれ
に続く免疫応答の活性化に利用されるようになる。クラ
スIIのMHC 分子は外因性（摂取された）タンパク質由来
のペプチドのみならず、内因性（自己の）タンパク質の
分解により生成されたペプチドにも結合する。クラスII
に結合する夫々のペプチド種の量は、その局所濃度と、
所定のクラスII分子の結合切込みに対するその親和性に
よって決定され、種々のアロタイプは異なったペプチド
結合特異性を示す。
ロセシングを受けたペプチドからなる３分子複合体とし
てAPC の表面上に発現される。細胞表面に発現される大
抵のポリペプチドの様に、α鎖、β鎖は共にそのNH2 末
端に短いシグナル配列を含み、両鎖を小胞体（ER）に標
的指向する。小胞体内で、クラスIIのα／β鎖複合体は
インバリアント鎖（Ii）と呼ばれるもう１つのタンパク
質と会合する。Iiとの会合は（MHC ヘテロダイマーのペ
プチド結合切込み部位を封鎖することによって）時期尚
早のペプチド捕捉を阻害し、安定なα／β相互作用を促
進して上記複合体のエンドソーム小胞への以後の細胞内
流通を指令するものと考えられている。エンドソーム内
で、Iiはタンパク質分解を含むプロセスによって除去さ
れ、これによってペプチド結合切込みを暴露し、エンド
ソーム内に存在するペプチドが上記 MHC分子に結合出来
る様にする。クラスII／ペプチド複合体はエンドソーム
から細胞表面に運ばれ、そこで T細胞による認識とそれ
に続く免疫応答の活性化に利用されるようになる。クラ
スIIのMHC 分子は外因性（摂取された）タンパク質由来
のペプチドのみならず、内因性（自己の）タンパク質の
分解により生成されたペプチドにも結合する。クラスII
に結合する夫々のペプチド種の量は、その局所濃度と、
所定のクラスII分子の結合切込みに対するその親和性に
よって決定され、種々のアロタイプは異なったペプチド
結合特異性を示す。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】胎児発育期間の初期に
は、哺乳動物の免疫系は“寛容状態”にあり、自己のペ
プチドには応答しないように教えられている。この系の
安定性と維持は、動物が自己に対して免疫応答を生じな
いことを保証するために重要である。この系の崩壊は糖
尿病、リウマチ様関節炎、及び多発性硬化症のような自
己免疫症状を引起こす。免疫系を操作して適切な非応答
性の再確立を意図する現行の技術には、遮断性ペプチド
として、合成の高親和性結合ペプチドの静脈内投与を含
むプロトコルが取入れられている。
は、哺乳動物の免疫系は“寛容状態”にあり、自己のペ
プチドには応答しないように教えられている。この系の
安定性と維持は、動物が自己に対して免疫応答を生じな
いことを保証するために重要である。この系の崩壊は糖
尿病、リウマチ様関節炎、及び多発性硬化症のような自
己免疫症状を引起こす。免疫系を操作して適切な非応答
性の再確立を意図する現行の技術には、遮断性ペプチド
として、合成の高親和性結合ペプチドの静脈内投与を含
むプロトコルが取入れられている。
【０００６】予防接種は抗体仲介、及び／或いはT 細胞
仲介の応答を刺激することによって病原性生物に対する
保護免疫を発生する。大抵の現行の予防接種戦略は、な
お、弱毒化、或いは不活性化したウイルスの様な比較的
粗製の製品を用いている。この様なワクチンは、しばし
ば、抗体仲介、及び細胞仲介による免疫の両方を生じ、
発生する免疫応答のタイプを修飾することは出来ない。
更に、多くの疾病において、間違ったタイプの応答の発
生は結果として疾病の悪化状態を招くことがある。
仲介の応答を刺激することによって病原性生物に対する
保護免疫を発生する。大抵の現行の予防接種戦略は、な
お、弱毒化、或いは不活性化したウイルスの様な比較的
粗製の製品を用いている。この様なワクチンは、しばし
ば、抗体仲介、及び細胞仲介による免疫の両方を生じ、
発生する免疫応答のタイプを修飾することは出来ない。
更に、多くの疾病において、間違ったタイプの応答の発
生は結果として疾病の悪化状態を招くことがある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本出願に開示された研究
において、凡そ70種の既知のヒトのMHC クラスIIDRアロ
タイプの内の６種（HLA-DRI、HLA-DR2、HLA-DR3、HLA-D
R4、HLA-DR7、HLA-DR8）に結合した天然でプロセシング
を受けたペプチドの特性が決定された。これらのペプチ
ドは、外因性のタンパク質よりも主として自己タンパク
質に由来することが見出だされた。自己ペプチドファミ
リーの幾つかは、予期せぬ変質した結合性を持つことが
確認された。即ち、ある自己ペプチドが多数のHLA-DRア
ロタイプに結合することがある。この観察は、MHC クラ
スIIの機能に関する広く許容されている観念、即ち、各
アロタイプは異なったセットのペプチドとの結合を指令
するというMHC クラスIIの機能に関する広く受入れられ
ている観念に逆行するものである。更に、本出願に開示
された自己ペプチドのすべてでないにしてもその多くが
クラスII分子に比較的高い親和性を持って結合する。こ
れら３つの特性、（1）外因性よりも自己の、（2）変質
した（degeneracy）、及び（3）高親和性結合は、Ｉ型
糖尿病、リウマチ様関節炎、及び多発性硬化症の様な自
己反応性を特徴とする病状の治療的介入に対する新規の
手段を示唆する。更に、この様な治療法は移植拒絶を軽
減するのに用いることが出来る。
において、凡そ70種の既知のヒトのMHC クラスIIDRアロ
タイプの内の６種（HLA-DRI、HLA-DR2、HLA-DR3、HLA-D
R4、HLA-DR7、HLA-DR8）に結合した天然でプロセシング
を受けたペプチドの特性が決定された。これらのペプチ
ドは、外因性のタンパク質よりも主として自己タンパク
質に由来することが見出だされた。自己ペプチドファミ
リーの幾つかは、予期せぬ変質した結合性を持つことが
確認された。即ち、ある自己ペプチドが多数のHLA-DRア
ロタイプに結合することがある。この観察は、MHC クラ
スIIの機能に関する広く許容されている観念、即ち、各
アロタイプは異なったセットのペプチドとの結合を指令
するというMHC クラスIIの機能に関する広く受入れられ
ている観念に逆行するものである。更に、本出願に開示
された自己ペプチドのすべてでないにしてもその多くが
クラスII分子に比較的高い親和性を持って結合する。こ
れら３つの特性、（1）外因性よりも自己の、（2）変質
した（degeneracy）、及び（3）高親和性結合は、Ｉ型
糖尿病、リウマチ様関節炎、及び多発性硬化症の様な自
己反応性を特徴とする病状の治療的介入に対する新規の
手段を示唆する。更に、この様な治療法は移植拒絶を軽
減するのに用いることが出来る。
【０００８】本発明の治療法においては、本発明の高親
和性の免疫調節性の自己ペプチドをモデルにした短鎖ペ
プチド（好適には非対立遺伝子的に制限された）が患者
のAPC に導入される。本発明のペプチドは多様なクラス
IIイソタイプと結合するので、患者によって発現される
特定のクラスII対立遺伝子を決定ずる組織タイプの分類
は不必要であろう。個々のペプチドが完全には変性せ
ず、即ち、ぺプチドがすべてではなく少数のアロタイブ
に結合する場合、ペプチドの“カクテル”を用いると有
用かも知れない。当該カクテルは重複した結合特異性を
与える。一旦、APC内に入ると、ペプチドはクラスII分
子に高親和性を持って結合し、それによって、当該病状
の特徴である免疫反応の原因となる免疫原性ペプチドと
の結合を阻害する。本発明の遮断性ペプチドは個体発生
の間に寛容された正確なカルボキシ及びアミノ末端を保
持する自己ペプチドであるので、これらは免疫的には不
活性であり、非自己の遮断性ペプチドを用いる治療を面
倒にする可能性のある免疫応答を誘発することがない。
和性の免疫調節性の自己ペプチドをモデルにした短鎖ペ
プチド（好適には非対立遺伝子的に制限された）が患者
のAPC に導入される。本発明のペプチドは多様なクラス
IIイソタイプと結合するので、患者によって発現される
特定のクラスII対立遺伝子を決定ずる組織タイプの分類
は不必要であろう。個々のペプチドが完全には変性せ
ず、即ち、ぺプチドがすべてではなく少数のアロタイブ
に結合する場合、ペプチドの“カクテル”を用いると有
用かも知れない。当該カクテルは重複した結合特異性を
与える。一旦、APC内に入ると、ペプチドはクラスII分
子に高親和性を持って結合し、それによって、当該病状
の特徴である免疫反応の原因となる免疫原性ペプチドと
の結合を阻害する。本発明の遮断性ペプチドは個体発生
の間に寛容された正確なカルボキシ及びアミノ末端を保
持する自己ペプチドであるので、これらは免疫的には不
活性であり、非自己の遮断性ペプチドを用いる治療を面
倒にする可能性のある免疫応答を誘発することがない。
【０００９】本発明のペプチドは、例えば、一種或いは
それ以上のペプチドを含む溶液の静脈内注射によって、
APC に直接導入されてもよい。代わりに、大量の遮断ペ
プチドを細胞内で合成する手段をAPC に提供してもよ
い。遮断ペプチド配列に融合したER（小胞体）及び／或
いはエンドソームへの標的指向性シグナルをコードする
組換え遺伝子を適当な発現制御配列に連結して APCに導
入する。一旦、細胞内に入ると、これらの遺伝子はハイ
ブリッドペプチドの発現を指令する。ERに標的指向され
たペプチドは、翻訳されてヘテロダイマーに組立てられ
るにつれてクラスIIのα及びβ鎖に結合するであろう。
ER内に高親和性結合ペプチドが存在するとα／β複合体
のインバリアント鎖との会合を防止して細胞内流通を妨
害する。続いて、クラスII分子／遮断ペプチド複合体は
細胞表面に発現される可能性があるが、T 細胞は発育の
初期にこの複合体に寛容化されているので、免疫応答を
引起こさない。ER保持シグナルを付与されたペプチドの
使用もまたペプチドと複合したクラスII分子がERから脱
離するのを防止する可能性がある。代わりに、組換えペ
プチドに、合成後それをエンドソーム分画に指向するエ
ンドソーム標的指向性シグナルを付与し、それによっ
て、又、エンドソーム内で内部的にプロセシングを受け
たペプチドの遮断ペプチドに対する比率をずらし、ER内
ではそれと結合しなかった遮断ペプチドのクラスII分子
への結合を好適にしてもよい。いかなる患者個人に対し
ても、一種、或いはそれ以上のER指向化されたペプチド
を、エンドソームに指向化されたペプチドと組合わせて
用い、ER内で本発明のペプチドで飽和ざれていないα−
β複合体が次いでエンドサイトーシス経路で遮断される
ことは有利なことかも知れない。最終結果は、又、非免
疫原性のクラスII／ペプチド複合体の細胞表面発現であ
る。
それ以上のペプチドを含む溶液の静脈内注射によって、
APC に直接導入されてもよい。代わりに、大量の遮断ペ
プチドを細胞内で合成する手段をAPC に提供してもよ
い。遮断ペプチド配列に融合したER（小胞体）及び／或
いはエンドソームへの標的指向性シグナルをコードする
組換え遺伝子を適当な発現制御配列に連結して APCに導
入する。一旦、細胞内に入ると、これらの遺伝子はハイ
ブリッドペプチドの発現を指令する。ERに標的指向され
たペプチドは、翻訳されてヘテロダイマーに組立てられ
るにつれてクラスIIのα及びβ鎖に結合するであろう。
ER内に高親和性結合ペプチドが存在するとα／β複合体
のインバリアント鎖との会合を防止して細胞内流通を妨
害する。続いて、クラスII分子／遮断ペプチド複合体は
細胞表面に発現される可能性があるが、T 細胞は発育の
初期にこの複合体に寛容化されているので、免疫応答を
引起こさない。ER保持シグナルを付与されたペプチドの
使用もまたペプチドと複合したクラスII分子がERから脱
離するのを防止する可能性がある。代わりに、組換えペ
プチドに、合成後それをエンドソーム分画に指向するエ
ンドソーム標的指向性シグナルを付与し、それによっ
て、又、エンドソーム内で内部的にプロセシングを受け
たペプチドの遮断ペプチドに対する比率をずらし、ER内
ではそれと結合しなかった遮断ペプチドのクラスII分子
への結合を好適にしてもよい。いかなる患者個人に対し
ても、一種、或いはそれ以上のER指向化されたペプチド
を、エンドソームに指向化されたペプチドと組合わせて
用い、ER内で本発明のペプチドで飽和ざれていないα−
β複合体が次いでエンドサイトーシス経路で遮断される
ことは有利なことかも知れない。最終結果は、又、非免
疫原性のクラスII／ペプチド複合体の細胞表面発現であ
る。
【００１０】細胞内輸送系に共役したクラスIIの非制限
性の高親和性結合ペプチドの使用は、現行の薬理学的な
戦略に伴う多方面の副作用を引起こすことなく、クラス
IIに限定された免疫応答の特異的ダウンレグレーション
を可能にする。これらの技術の巧みな適用は自家免疫疾
患の治療及び移植拒絶反応の防止に対する重要な進歩で
ある。
性の高親和性結合ペプチドの使用は、現行の薬理学的な
戦略に伴う多方面の副作用を引起こすことなく、クラス
IIに限定された免疫応答の特異的ダウンレグレーション
を可能にする。これらの技術の巧みな適用は自家免疫疾
患の治療及び移植拒絶反応の防止に対する重要な進歩で
ある。
【００１１】本発明の細胞内輸送系（dclivery syste
m）は、又、動物、例えば、ヒト患者、或いは口蹄疫の
様な疾病に罹り易いウシの様な商業的に重要な哺乳動物
の予防接種の新規の方法に利用することが出来る。この
様な系は、以下の諸調整により所定の状況において要求
されるタイプの免疫応答を生じる様に作成することが出
来る。（a）クラスＩ或いはクラスII MHCに対するペプ
チドの特異性、（b）ペプチド／タンパク質の長さ及び
／或いは配列、及び（c）細胞内小器官を標的指向する
ための特異的標識の使用。本発明の系は、これらのペプ
チドが細胞内においてのみ生成され、B細胞との接触に
よる抗体生産を刺激し得る細胞外には存在しないことを
保証する。これは、この様なワクチンによって引起こさ
れる免疫応答を T細胞仲介の免疫に限定し、それによっ
て、不適切な、或いは、潜在的に有害な応答、例えば、
ヒトの免疫不全症、マラリア、ハンセン病、及びリーシ
ュマニア症の原因となる生物を標的指向する一般的ワク
チンで観察される様な免疫応答を制限するものである。
更に、この T細胞仲介の免疫に限定された応答は、免疫
原性ペプチドの長さ及び特性次第で、クラスＩ、または
クラスIIを基盤とするもの、或いはその両方であり得
る。即ち、MHC のクラスＩ 分子は、長さ８から10残基
のペプチドに好適に結合するが、一方、クラスII分子
は、12から25残基の長さの範囲のペプチドに高親和性で
結合することが知られている。
m）は、又、動物、例えば、ヒト患者、或いは口蹄疫の
様な疾病に罹り易いウシの様な商業的に重要な哺乳動物
の予防接種の新規の方法に利用することが出来る。この
様な系は、以下の諸調整により所定の状況において要求
されるタイプの免疫応答を生じる様に作成することが出
来る。（a）クラスＩ或いはクラスII MHCに対するペプ
チドの特異性、（b）ペプチド／タンパク質の長さ及び
／或いは配列、及び（c）細胞内小器官を標的指向する
ための特異的標識の使用。本発明の系は、これらのペプ
チドが細胞内においてのみ生成され、B細胞との接触に
よる抗体生産を刺激し得る細胞外には存在しないことを
保証する。これは、この様なワクチンによって引起こさ
れる免疫応答を T細胞仲介の免疫に限定し、それによっ
て、不適切な、或いは、潜在的に有害な応答、例えば、
ヒトの免疫不全症、マラリア、ハンセン病、及びリーシ
ュマニア症の原因となる生物を標的指向する一般的ワク
チンで観察される様な免疫応答を制限するものである。
更に、この T細胞仲介の免疫に限定された応答は、免疫
原性ペプチドの長さ及び特性次第で、クラスＩ、または
クラスIIを基盤とするもの、或いはその両方であり得
る。即ち、MHC のクラスＩ 分子は、長さ８から10残基
のペプチドに好適に結合するが、一方、クラスII分子
は、12から25残基の長さの範囲のペプチドに高親和性で
結合することが知られている。
【００１２】本発明に基く免疫感作及び治療には、本発
明のペプチド、即ち、天然由来のヒトのタンパク質（即
ち、“自己タンパク質”）の切片と同一のアミノ酸配列
を含むペプチドの精製標品を用いることが出来る。この
様な切片は、10から30残基の長さであり、当該ペプチド
はヒトのMHC クラスIIアロタイプに結合し、好適には、
少なくとも２つの別個のMHC クラスIIアロタイプにに結
合する（例えば、約70種の既知のDRアロタイプ、約47種
の既知のDPアロタイプ、或いは、約33種の既知のDQアロ
タイプのいずれか）。自己ペプチド切片に対応する上記
ペプチドの部分を、ここでは、“自己ペプチド”と呼
ぶ。“精製標品”とは、ポリペプチド成分の少なくとも
50%（重量で）が本発明のペプチドからなる標品を意味
する。好適な適用例では、本発明のペプチドが精製標品
の少なくとも60%（更に好適には80%）を占める。天然由
来のヒトのタンパク質は、好適には、HLA-A2（以下に広
く定義される様に）、HLA-A29、HLA-Bw62、HLA-C、HLA-
DRα、HLA-DRβ、インバリアント鎖（Ii）、Igκ鎖 C領
域、Ig H鎖、Na+／K+ ATPアーゼ、トランスフェリン、
トランスフェリン受容体、カルシトニン受容体、カルボ
キシペプチダーゼ E、MET キナーゼ関連形質転換タンパ
ク質、グアニル酸結合タンパク質、マンノース結合タン
パク質、アポリポタンパク質 B-100、カテプシン C、カ
テプシン S、金属プロテイナーゼ阻害因子１前駆体、或
いは熱ショック・コグネイト71KDタンパク質であり、そ
れは MHC（支配）のクラスＩまたはIIの抗原タンパク
質、或いは、APC の細胞表面に生じるいかなる他のヒト
のタンパク質であってもよい。自己ペプチドは、好適に
は、以下の構造形式（モティーフ）に従うものである、
即ち、上記切片のアミノ末端残基、或いはその12残基内
の最初の照合位置（I）に、正荷電残基（即ち、Lys、Ar
g、またはHis）、或いは大きな疎水性残基（即ち、Ph
e）Trp、Leu、Ile、Met、Tyr、またはPro）、並びに、I
+5 の位置に、水素結合提供残基（即ち、Tyr、Asn、Gl
n、Cys、Asp、Glu、Arg、Ser、TrP、またはThr）を持
つ。更に、上記ペプチドは、また、I+9、I+1、及び／或
いはI-1の位置に、疎水性残基（即ち、Phe、Trp、Leu、
Ile、Met、Pro、Ala、Val、または、Tyr）（+記号は、
右、或いはカルボキシ末端方向への位置を、及び - 記
号は、左、或いはアミノ末端方向への位置を表す）を持
つ。本発明のペプチドの典型的な例は、HLA-A2の残基 3
1-40（即ち、TQFVRFDSDA）、または残基 106-115（即
ち、DWRFLRGYHQ）、或いはIiの残基 107-116（即ち、RM
ATPLLMQA）、或いは、以下の表 1-10 に示されている配
列のどれか１つに本質的に同一な配列である。
明のペプチド、即ち、天然由来のヒトのタンパク質（即
ち、“自己タンパク質”）の切片と同一のアミノ酸配列
を含むペプチドの精製標品を用いることが出来る。この
様な切片は、10から30残基の長さであり、当該ペプチド
はヒトのMHC クラスIIアロタイプに結合し、好適には、
少なくとも２つの別個のMHC クラスIIアロタイプにに結
合する（例えば、約70種の既知のDRアロタイプ、約47種
の既知のDPアロタイプ、或いは、約33種の既知のDQアロ
タイプのいずれか）。自己ペプチド切片に対応する上記
ペプチドの部分を、ここでは、“自己ペプチド”と呼
ぶ。“精製標品”とは、ポリペプチド成分の少なくとも
50%（重量で）が本発明のペプチドからなる標品を意味
する。好適な適用例では、本発明のペプチドが精製標品
の少なくとも60%（更に好適には80%）を占める。天然由
来のヒトのタンパク質は、好適には、HLA-A2（以下に広
く定義される様に）、HLA-A29、HLA-Bw62、HLA-C、HLA-
DRα、HLA-DRβ、インバリアント鎖（Ii）、Igκ鎖 C領
域、Ig H鎖、Na+／K+ ATPアーゼ、トランスフェリン、
トランスフェリン受容体、カルシトニン受容体、カルボ
キシペプチダーゼ E、MET キナーゼ関連形質転換タンパ
ク質、グアニル酸結合タンパク質、マンノース結合タン
パク質、アポリポタンパク質 B-100、カテプシン C、カ
テプシン S、金属プロテイナーゼ阻害因子１前駆体、或
いは熱ショック・コグネイト71KDタンパク質であり、そ
れは MHC（支配）のクラスＩまたはIIの抗原タンパク
質、或いは、APC の細胞表面に生じるいかなる他のヒト
のタンパク質であってもよい。自己ペプチドは、好適に
は、以下の構造形式（モティーフ）に従うものである、
即ち、上記切片のアミノ末端残基、或いはその12残基内
の最初の照合位置（I）に、正荷電残基（即ち、Lys、Ar
g、またはHis）、或いは大きな疎水性残基（即ち、Ph
e）Trp、Leu、Ile、Met、Tyr、またはPro）、並びに、I
+5 の位置に、水素結合提供残基（即ち、Tyr、Asn、Gl
n、Cys、Asp、Glu、Arg、Ser、TrP、またはThr）を持
つ。更に、上記ペプチドは、また、I+9、I+1、及び／或
いはI-1の位置に、疎水性残基（即ち、Phe、Trp、Leu、
Ile、Met、Pro、Ala、Val、または、Tyr）（+記号は、
右、或いはカルボキシ末端方向への位置を、及び - 記
号は、左、或いはアミノ末端方向への位置を表す）を持
つ。本発明のペプチドの典型的な例は、HLA-A2の残基 3
1-40（即ち、TQFVRFDSDA）、または残基 106-115（即
ち、DWRFLRGYHQ）、或いはIiの残基 107-116（即ち、RM
ATPLLMQA）、或いは、以下の表 1-10 に示されている配
列のどれか１つに本質的に同一な配列である。
【００１３】本発明の治療及び免疫感作の方法は、ま
た、本発明のペプチドをコードするが自己タンパク質の
全配列のすべてではなくそれ以下の配列をコードする核
酸分子（RNA 或いは DNA）を利用することも出来る。上
記核酸は、自己タンパク質（或いは他のタンパク質）か
ら誘導されたシグナルペプチド、或いは他の流通関連の
配列を任意に含むこともあるが、好適には MHCクラスII
分子に結合する特定の自己ペプチド以外の自己タンパク
質の非重要部分をコードするものである。流通関連の配
列は、ポリペプチドに結合してその細胞内流通（小器官
から小器官、或いは細胞表面への右向移動）を制御する
様に機能するアミノ酸配列である。この様な流通関連の
配列は、上記該ペプチドをER、リソソーム、或いはエン
ドソームに流通し、シグナルペプチド（翻訳の間、タン
パク質をER内へ指向するアミノ酸配列）、KDELの様なER
保持ペプチド、及びKFERQ 、QREFK の様なリソソーム標
的指向ペプチド、並びにK、R、D、E、F、I、V、及び L
から選ばれた４残基がQの一側に隣接しているペンタペ
プチドを含む。本発明に有用なシグナルペプチドの一例
は、クラスIIのα或いはβの様な MHCサブユニットのペ
プチドと本質的に同一なシグナルペプチドであり、例え
ば、 MHCクラスIIαのシグナルペプチドは、配列MAISGV
PVLGFFIIAVLMSAQESWAに含まれる。本発明の核酸によっ
てコードされるシグナルペプチドは、もし、その部分が
ポリペプチドのERへの流通を引き起こすのに十分であれ
ば、上記の特定の25残基配列の一部（例えば、少なくと
も10アミノ酸残基）のみを含めばよい。好適な実施例に
おいては、本発明の核酸は、第二の自己ペプチド及び第
二の流通配列（第一の自己ペプチド及び第一の流通配列
と同一か、或いは異なってもよい）をコードして、追加
の自己ペプチド及び流通配列をコードすることもある。
本発明のこの局面の更に別の変形では、自己ペプチド配
列（或いは、縦に並べられた複数の自己ペプチド配列）
が、本質的に無傷のIiポリペプチドにペプチド結合によ
り連結され、次いで、これが、クラスII分子をERからエ
ンドソームヘ流通する際に自己ペプチド配列を一緒に運
ぶ。
た、本発明のペプチドをコードするが自己タンパク質の
全配列のすべてではなくそれ以下の配列をコードする核
酸分子（RNA 或いは DNA）を利用することも出来る。上
記核酸は、自己タンパク質（或いは他のタンパク質）か
ら誘導されたシグナルペプチド、或いは他の流通関連の
配列を任意に含むこともあるが、好適には MHCクラスII
分子に結合する特定の自己ペプチド以外の自己タンパク
質の非重要部分をコードするものである。流通関連の配
列は、ポリペプチドに結合してその細胞内流通（小器官
から小器官、或いは細胞表面への右向移動）を制御する
様に機能するアミノ酸配列である。この様な流通関連の
配列は、上記該ペプチドをER、リソソーム、或いはエン
ドソームに流通し、シグナルペプチド（翻訳の間、タン
パク質をER内へ指向するアミノ酸配列）、KDELの様なER
保持ペプチド、及びKFERQ 、QREFK の様なリソソーム標
的指向ペプチド、並びにK、R、D、E、F、I、V、及び L
から選ばれた４残基がQの一側に隣接しているペンタペ
プチドを含む。本発明に有用なシグナルペプチドの一例
は、クラスIIのα或いはβの様な MHCサブユニットのペ
プチドと本質的に同一なシグナルペプチドであり、例え
ば、 MHCクラスIIαのシグナルペプチドは、配列MAISGV
PVLGFFIIAVLMSAQESWAに含まれる。本発明の核酸によっ
てコードされるシグナルペプチドは、もし、その部分が
ポリペプチドのERへの流通を引き起こすのに十分であれ
ば、上記の特定の25残基配列の一部（例えば、少なくと
も10アミノ酸残基）のみを含めばよい。好適な実施例に
おいては、本発明の核酸は、第二の自己ペプチド及び第
二の流通配列（第一の自己ペプチド及び第一の流通配列
と同一か、或いは異なってもよい）をコードして、追加
の自己ペプチド及び流通配列をコードすることもある。
本発明のこの局面の更に別の変形では、自己ペプチド配
列（或いは、縦に並べられた複数の自己ペプチド配列）
が、本質的に無傷のIiポリペプチドにペプチド結合によ
り連結され、次いで、これが、クラスII分子をERからエ
ンドソームヘ流通する際に自己ペプチド配列を一緒に運
ぶ。
【００１４】本発明の核酸は、又、発現制御配列（転写
及び翻訳始動シグナル、プロモーター、及びエンハンサ
ーと定義され、これらが会合するコーディング配列の発
現を可能にし、及び／或いは最適にする配列）、及び／
或いはファージ、或いはワクシニアウイルス、アデノウ
イルス、エプスタイン・バールウイルス、またはレトロ
ウイルスの弱毒化、或いは非増殖、無毒化型のゲノム核
酸を含むこともある。
及び翻訳始動シグナル、プロモーター、及びエンハンサ
ーと定義され、これらが会合するコーディング配列の発
現を可能にし、及び／或いは最適にする配列）、及び／
或いはファージ、或いはワクシニアウイルス、アデノウ
イルス、エプスタイン・バールウイルス、またはレトロ
ウイルスの弱毒化、或いは非増殖、無毒化型のゲノム核
酸を含むこともある。
【００１５】本発明のペプチド及び核酸は、それらを直
接、薬剤的に許容される担体に懸濁、或いは、リポソー
ム、免疫刺激複合体（ISCOMS）またはそれらの類似体に
封入することにより治療用に調製することが出来る。こ
の様な調製品は、患者の複数のAPCを治療用調製品と接
触させてペプチド或いは核酸を上記 APCに導入すること
によってヒト患者における免疫応答を阻害するのに有用
である。
接、薬剤的に許容される担体に懸濁、或いは、リポソー
ム、免疫刺激複合体（ISCOMS）またはそれらの類似体に
封入することにより治療用に調製することが出来る。こ
の様な調製品は、患者の複数のAPCを治療用調製品と接
触させてペプチド或いは核酸を上記 APCに導入すること
によってヒト患者における免疫応答を阻害するのに有用
である。
【００１６】本発明には、又、本発明の核酸分子を含む
細胞（例、組織培養細胞、或いは、人体内の B細胞また
は APCの様な細胞）も包含される。本発明の核酸を含む
培養細胞は、当該細胞を上記核酸分子からの当該ペプチ
ドの発現を可能にする条件下での培養を含む方法におい
て、本発明のペプチドの製造に用いることも出来る。
細胞（例、組織培養細胞、或いは、人体内の B細胞また
は APCの様な細胞）も包含される。本発明の核酸を含む
培養細胞は、当該細胞を上記核酸分子からの当該ペプチ
ドの発現を可能にする条件下での培養を含む方法におい
て、本発明のペプチドの製造に用いることも出来る。
【００１７】ここに非対立遺伝子的に制限された免疫調
節ペプチドを同定する方法を開示する。当該方法は以下
の事項を含む。 （a）最初の MHCクラスIIアロタイプから溶離されたペ
プチドの混合物を分画し、（b）この混合物から自己ペ
プチドを同定し、及び（c）当該自己ペプチドが第二の
MHCクラスIIアロタイプに結合するかどうかを検査す
る。この様な結合は、当該自己ペプチドが非対立遺伝子
的に制限された免疫調節ペプチドであることの表示であ
る。
節ペプチドを同定する方法を開示する。当該方法は以下
の事項を含む。 （a）最初の MHCクラスIIアロタイプから溶離されたペ
プチドの混合物を分画し、（b）この混合物から自己ペ
プチドを同定し、及び（c）当該自己ペプチドが第二の
MHCクラスIIアロタイプに結合するかどうかを検査す
る。この様な結合は、当該自己ペプチドが非対立遺伝子
的に制限された免疫調節ペプチドであることの表示であ
る。
【００１８】別の具体例では、本発明は、潜在的な免疫
調節ペプチドを同定する方法を含み、この方法は以下の
事項を包含する。 （a）MHCクラスII分子を表面に発現する細胞を提供し、
（b）当該細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導
入し、及び（c）当該候袖ペプチドに結合するクラスII
分子の比率が、上記核酸の存在下に、上記核酸の非存在
下の結合比率に比べて増加しているかどうかを測定す
る。この様な増加は、当該候補ペプチドが潜在的な免疫
調節ペプチドであることの表示である。
調節ペプチドを同定する方法を含み、この方法は以下の
事項を包含する。 （a）MHCクラスII分子を表面に発現する細胞を提供し、
（b）当該細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導
入し、及び（c）当該候袖ペプチドに結合するクラスII
分子の比率が、上記核酸の存在下に、上記核酸の非存在
下の結合比率に比べて増加しているかどうかを測定す
る。この様な増加は、当該候補ペプチドが潜在的な免疫
調節ペプチドであることの表示である。
【００１９】本発明には、又、潜在的な免疫調節ペプチ
ドを確認する方法が含まれ、この方法は以下の事項を包
含する。 （a）MHCクラスII分子を発現する細胞を提供し、（b）
当該細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導入し
て、（c）当該細胞表面上の MHCクラスII分子のレベル
が、上記核酸の存在下に、上記核酸の非存在下の MHCク
ラスII分子のレベルと比較して減少しているかどうかを
測定する。この様な減少は、当該候補ペプチドが潜在的
な免疫調節ペプチドであることの表示である。
ドを確認する方法が含まれ、この方法は以下の事項を包
含する。 （a）MHCクラスII分子を発現する細胞を提供し、（b）
当該細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導入し
て、（c）当該細胞表面上の MHCクラスII分子のレベル
が、上記核酸の存在下に、上記核酸の非存在下の MHCク
ラスII分子のレベルと比較して減少しているかどうかを
測定する。この様な減少は、当該候補ペプチドが潜在的
な免疫調節ペプチドであることの表示である。
【００２０】本発明には、又、非対立遺伝子的に制限さ
れた免疫調節ペプチドを確認する方法を含み、この方法
は以下の事項を包含する。（a）第一の MHCクラスＩ、
或いはクラスIIアロタイプを保持する細胞を提供 し、この様な細胞を病原体（例、ヒトの免疫不全ウイル
ス（HIV）、 B型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウ
イルス、インフルエンザウイルス、狂人病ウイルス、Co
rynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌）、Bordete
lla pertussis（百日咳菌）、P1asmodium属、Schistoso
ma 属、Leishmania属、Trypanasoma 属、或いは Mycoba
cterium lepre（癩菌）の様なヒト或いは動物の病気の
原因となる感染性病原体）に感染させ、（b）当該細胞
の第一の MHCアロタイプに結合するペプチドの混合物を
溶離し、（c）当該混合物から候補ペプチドを確認し、
この様な候補ペプチドは上記病原体由来のタンパク質の
断片であり、及び、（d）当該候補ペプチドが第二の MH
Cアロタイプに結合するかを検査する。この様な結合
は、上記の候補ペプチドが非対立遺伝子的に制限された
免疫刺激ペプチドであることの表示である。病原体タン
パク質のこの様な免疫原性断片をコードする核酸は、ヒ
ト患者に免疫応答を誘導する方法に用いることが出来、
この方法は、患者の APC内への核酸の導入を含む。
れた免疫調節ペプチドを確認する方法を含み、この方法
は以下の事項を包含する。（a）第一の MHCクラスＩ、
或いはクラスIIアロタイプを保持する細胞を提供 し、この様な細胞を病原体（例、ヒトの免疫不全ウイル
ス（HIV）、 B型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウ
イルス、インフルエンザウイルス、狂人病ウイルス、Co
rynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌）、Bordete
lla pertussis（百日咳菌）、P1asmodium属、Schistoso
ma 属、Leishmania属、Trypanasoma 属、或いは Mycoba
cterium lepre（癩菌）の様なヒト或いは動物の病気の
原因となる感染性病原体）に感染させ、（b）当該細胞
の第一の MHCアロタイプに結合するペプチドの混合物を
溶離し、（c）当該混合物から候補ペプチドを確認し、
この様な候補ペプチドは上記病原体由来のタンパク質の
断片であり、及び、（d）当該候補ペプチドが第二の MH
Cアロタイプに結合するかを検査する。この様な結合
は、上記の候補ペプチドが非対立遺伝子的に制限された
免疫刺激ペプチドであることの表示である。病原体タン
パク質のこの様な免疫原性断片をコードする核酸は、ヒ
ト患者に免疫応答を誘導する方法に用いることが出来、
この方法は、患者の APC内への核酸の導入を含む。
【００２１】本発明の治療法は、合成ペプチドの静脈内
注射を含む従来の方法に伴う諸問題を解決する。（1）
対立遺伝子の特異性のために、全体の母集団内で発現さ
れる種々のクラスIIアロタイプのすべて、或いは大抵の
ものに高親和性で結合出来るペプチドは以前には確定さ
れていなかった。（2）静脈内に投与されたペプチドの
半減期は一般に極めて低く、高度の不便と出費を伴う反
復投与が必要であり、（3）このタイプの運搬手段は、
阻害ペプチドがクラスII分子、これは細胞表面にある
が、の結合間隙を占拠する天然由来のペプチドを除去す
ることが必要で、この手段は、今では非常に非効率的な
プロセスであると信じられており、又、（4）もし、利
用される阻害ペプチドが、それ自身、免疫原性であれ
ば、患者によっては右害な免疫応答が促進されることが
ある。
注射を含む従来の方法に伴う諸問題を解決する。（1）
対立遺伝子の特異性のために、全体の母集団内で発現さ
れる種々のクラスIIアロタイプのすべて、或いは大抵の
ものに高親和性で結合出来るペプチドは以前には確定さ
れていなかった。（2）静脈内に投与されたペプチドの
半減期は一般に極めて低く、高度の不便と出費を伴う反
復投与が必要であり、（3）このタイプの運搬手段は、
阻害ペプチドがクラスII分子、これは細胞表面にある
が、の結合間隙を占拠する天然由来のペプチドを除去す
ることが必要で、この手段は、今では非常に非効率的な
プロセスであると信じられており、又、（4）もし、利
用される阻害ペプチドが、それ自身、免疫原性であれ
ば、患者によっては右害な免疫応答が促進されることが
ある。
【００２２】本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細な
記載と特許請求の範囲から明瞭となるであろう。
記載と特許請求の範囲から明瞭となるであろう。
【００２３】
【実施例】実験データ
方法
Ｉ．HLA-DR抗原の精製
HLA-DR分子は、ホモ接合の、エプスタイン・バールウイ
ルスで形質転換されたヒトの幼弱化 Bリンパ芽球系か
ら、DR1 はLG-2細胞から、DR2 はMST 細胞から、DR3 は
WT20細胞から、DR4 はPriess細胞から、DR7 はMann細胞
から、及びDR8 は23.1細胞から精製された。これらの細
胞系のすべては公然と入手出来る。細胞増殖、細胞収集
条件、及びタンパク質の精製は以前に記述ざれた通りで
あった（Gorga，J. et al.，1991）。簡単に述べると、
各細胞タイプの200 gを10 mMのトリス-HCI、１ mMのジ
チオトレイトール（DDT）、0.1 mMフェニルメチルスル
ホニルフルオリド（PMSF）、pH 8.0に再懸濁して、Thom
asホモゲナイザーで溶解した。核は4000 x gで５分間の
遠心で除去し、ペレットを洗浄して上清が清澄になる
迄、ペレット操作を繰り返した。すべての上清を集め、
膜画分が175,000 x gで40分の遠心によって収集され
た。ペレットは、次いで、10 mMのトリス-HC1、１ mMの
DTT、１mMのPMSF、４%のNP-40 に再懸濁された。溶解さ
れない膜物質は、175,000ｘｇで２時間の遠心で除去
し、NP-40 に可溶の上清画分が免疫親和精製に使用され
た。
ルスで形質転換されたヒトの幼弱化 Bリンパ芽球系か
ら、DR1 はLG-2細胞から、DR2 はMST 細胞から、DR3 は
WT20細胞から、DR4 はPriess細胞から、DR7 はMann細胞
から、及びDR8 は23.1細胞から精製された。これらの細
胞系のすべては公然と入手出来る。細胞増殖、細胞収集
条件、及びタンパク質の精製は以前に記述ざれた通りで
あった（Gorga，J. et al.，1991）。簡単に述べると、
各細胞タイプの200 gを10 mMのトリス-HCI、１ mMのジ
チオトレイトール（DDT）、0.1 mMフェニルメチルスル
ホニルフルオリド（PMSF）、pH 8.0に再懸濁して、Thom
asホモゲナイザーで溶解した。核は4000 x gで５分間の
遠心で除去し、ペレットを洗浄して上清が清澄になる
迄、ペレット操作を繰り返した。すべての上清を集め、
膜画分が175,000 x gで40分の遠心によって収集され
た。ペレットは、次いで、10 mMのトリス-HC1、１ mMの
DTT、１mMのPMSF、４%のNP-40 に再懸濁された。溶解さ
れない膜物質は、175,000ｘｇで２時間の遠心で除去
し、NP-40 に可溶の上清画分が免疫親和精製に使用され
た。
【００２４】界面活性剤に可溶のHLA-DRをLB3.1-プロテ
ィンA のカラム（Gorga et al.，同上）に結合して、10
0 mMのグリシン、pH 11.5 で溶離した。溶離後、サンプ
ルにトリス-HC1を加えて直ちに中和し、次いで10 mMト
リス-HC1、0.1%デオキシコール酸（DOC）に対して透析
した。LB3.1 単クローン性抗体は、非多形性のHLA-DRα
鎖上に存在する立体配座決定基を認識し、この様にして
HLA-DRのすべてのアロタイプを認識する。DR分子の貫膜
領域はパパイン消化によって除去され、その結果得られ
た水溶性分子は更に10 mM トリス-HC1、pH 8.0で平衡化
されたS-200 カラムのゲル濾過によって精製された。精
製されたDRサンプルは、限外濾過によって濃縮され、得
量をBCA アッセイで測定され、SDS ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分析された。
ィンA のカラム（Gorga et al.，同上）に結合して、10
0 mMのグリシン、pH 11.5 で溶離した。溶離後、サンプ
ルにトリス-HC1を加えて直ちに中和し、次いで10 mMト
リス-HC1、0.1%デオキシコール酸（DOC）に対して透析
した。LB3.1 単クローン性抗体は、非多形性のHLA-DRα
鎖上に存在する立体配座決定基を認識し、この様にして
HLA-DRのすべてのアロタイプを認識する。DR分子の貫膜
領域はパパイン消化によって除去され、その結果得られ
た水溶性分子は更に10 mM トリス-HC1、pH 8.0で平衡化
されたS-200 カラムのゲル濾過によって精製された。精
製されたDRサンプルは、限外濾過によって濃縮され、得
量をBCA アッセイで測定され、SDS ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分析された。
【００２５】II．結合したペプチドの抽出と分画
水溶性で、免疫アフィニイティーによって精製されたク
ラスII分子は、更に、25 mM N-モルホリノエタンスルホ
ン酸（MES）PH 6.5中、高性能サイズ排除クロマトグラ
フィー（SEC）により、流速１ ml／分で精製して、いか
なる残りの小分子量の夾雑物をも除去した。次いで、Ce
ntricon ミクロ濃縮器（分子量分離10,000ダルトン）
（Amicon社）を、タンパク質サンプル（最終容量 100-2
00 μlの間）のスピン濃縮前に、順次、SEC 緩衝液及
び10% の酢酸で洗浄した。ペプチドのプールは、選択し
たクラスII対立遺伝子産物から１ mlの10%酢酸を加え、
15分間、70℃で抽出された。これらの条件は、結合した
ペプチドをクラスII分子から遊離するために十分であ
り、しかも、適度に緩和でペプチドの分解を回避出来
る。ペプチドのプールは、centricon 濃縮器を介する遠
心後、クラスII分子から分離され、素通し画分に以前に
結合していたペプチドが含まれていた。
ラスII分子は、更に、25 mM N-モルホリノエタンスルホ
ン酸（MES）PH 6.5中、高性能サイズ排除クロマトグラ
フィー（SEC）により、流速１ ml／分で精製して、いか
なる残りの小分子量の夾雑物をも除去した。次いで、Ce
ntricon ミクロ濃縮器（分子量分離10,000ダルトン）
（Amicon社）を、タンパク質サンプル（最終容量 100-2
00 μlの間）のスピン濃縮前に、順次、SEC 緩衝液及
び10% の酢酸で洗浄した。ペプチドのプールは、選択し
たクラスII対立遺伝子産物から１ mlの10%酢酸を加え、
15分間、70℃で抽出された。これらの条件は、結合した
ペプチドをクラスII分子から遊離するために十分であ
り、しかも、適度に緩和でペプチドの分解を回避出来
る。ペプチドのプールは、centricon 濃縮器を介する遠
心後、クラスII分子から分離され、素通し画分に以前に
結合していたペプチドが含まれていた。
【００２６】収集された酸抽出のペプチドプールは、HP
LCによる分離に先立ち、Savant Speed-Vac中で容量 50
μl に濃縮された。ペプチドは、ミクロボアC-18逆相ク
ロマトグラフィー（RPC）カラム（Vydac）上、以下の非
直線密度勾配プロトコルを川い、0.15 ml／分の一定流
速で分離された： 0-63分、5%-33%の緩衝液 B；63-95
分、33%-60% の緩衝液 B； 95-105分、60%-80% の緩衝
液 B、ここで、緩衝液 Aは0.06% のトリフルオロ酢酸／
水で、緩衝液 Bは、0.055%トリフルオロ酢酸／アセトニ
トリルであった。クロマトグラフィー分析は、多重の紫
外線波長（210、254、277、および 292 nm）で同時に検
出して、質量分析及び配列解析の前に、分光光度的な測
定を可能にした。図１に、解析された６種のDRペプチド
プールの各々に対するクロマトグラムが示されている。
収集された画分は、次いで、質量分析及びエドマン配列
決定法によって分析された。
LCによる分離に先立ち、Savant Speed-Vac中で容量 50
μl に濃縮された。ペプチドは、ミクロボアC-18逆相ク
ロマトグラフィー（RPC）カラム（Vydac）上、以下の非
直線密度勾配プロトコルを川い、0.15 ml／分の一定流
速で分離された： 0-63分、5%-33%の緩衝液 B；63-95
分、33%-60% の緩衝液 B； 95-105分、60%-80% の緩衝
液 B、ここで、緩衝液 Aは0.06% のトリフルオロ酢酸／
水で、緩衝液 Bは、0.055%トリフルオロ酢酸／アセトニ
トリルであった。クロマトグラフィー分析は、多重の紫
外線波長（210、254、277、および 292 nm）で同時に検
出して、質量分析及び配列解析の前に、分光光度的な測
定を可能にした。図１に、解析された６種のDRペプチド
プールの各々に対するクロマトグラムが示されている。
収集された画分は、次いで、質量分析及びエドマン配列
決定法によって分析された。
【００２７】III．ペプヂドの分析
RPCの間の、ペプチドの分光光度計による測定は、アミ
ノ酸組成（芳香族アミノ酸の寄与）に関する貴重な情報
を提供し、以後の特性決定のためのスクリーニング法と
して用いられる。RPC 分離の間に収集された適切な画分
は、次いで、Finnegan-MAT LaserMatマトリックス−利
用のレーザー脱着質量分析計（MALD）を用いて分析し、
量的に優勢なペプチドに対する個々の質量を決定した。
収集された画分の1%-4% をマトリックス（１μｌのα-
シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸）と混合して、抽出され
たペプチドの質量決定を達成した。HLA-DR1 に対するこ
の分析の結果を図２に示す。次に、選択したペプチドサ
ンプルは、自動エドマン分解ミクロ配列決定法により、
ABI 477A タンパク質シークエンザー（Applied Biosys
tems）を用い、電子スプレーイオンソースを装着したFi
nnigan-MAT TSQ 700三重四重極質量分析計を用いた質量
分析により提供されたカルボキシ末端確認と合わせて配
列決定された。この平行して行われた分析は、ペプチド
の組成及び配列の完全な確認を保証する。SWISS-PROTデ
ータベースに保存されているタンパク質配列とのペプチ
ドの照合は、FASTA コンピュータデータベース検索プロ
グラムを用い、て行われた。表1-10は、検討されたDR分
子の各々に対する本配列分析の結果である。
ノ酸組成（芳香族アミノ酸の寄与）に関する貴重な情報
を提供し、以後の特性決定のためのスクリーニング法と
して用いられる。RPC 分離の間に収集された適切な画分
は、次いで、Finnegan-MAT LaserMatマトリックス−利
用のレーザー脱着質量分析計（MALD）を用いて分析し、
量的に優勢なペプチドに対する個々の質量を決定した。
収集された画分の1%-4% をマトリックス（１μｌのα-
シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸）と混合して、抽出され
たペプチドの質量決定を達成した。HLA-DR1 に対するこ
の分析の結果を図２に示す。次に、選択したペプチドサ
ンプルは、自動エドマン分解ミクロ配列決定法により、
ABI 477A タンパク質シークエンザー（Applied Biosys
tems）を用い、電子スプレーイオンソースを装着したFi
nnigan-MAT TSQ 700三重四重極質量分析計を用いた質量
分析により提供されたカルボキシ末端確認と合わせて配
列決定された。この平行して行われた分析は、ペプチド
の組成及び配列の完全な確認を保証する。SWISS-PROTデ
ータベースに保存されているタンパク質配列とのペプチ
ドの照合は、FASTA コンピュータデータベース検索プロ
グラムを用い、て行われた。表1-10は、検討されたDR分
子の各々に対する本配列分析の結果である。
【００２８】
【発明の効果】１．HLA-DR1．
本研究に用いられたHLA-DR1 は、当該物質が結晶学的解
析、及び結合ペプチド分析に使用出来る様にパパインで
可溶化された。DR1 に結合したペプチドは、酸で抽出さ
れ、RPC を用いて分画された（図１）。２回目の抽出／
RPC 分離の後、いかなる検出可能なペプチド様物質も存
在せず、ペプチドの定量的抽出が証明された。抽出され
たペプチドプールのアミノ酸分析（ABI 420A/130Aデリ
バタイザー／HPLC）は、質量分析によって決定されたサ
イズ分布（図２参照）に対応する結合ペプチドのモル当
量によって精製DR1 が完全に占拠されると仮定して、70
-80%の得量であることが判明した。いくつかの別々の標
品のDR1 抽出から得られたRPC プロフィル（溶離図）は
再現性があった。更に、界面活性剤可溶性、或いはパパ
イン可溶化DR1 の溶離図は同等であった。ペプチドが、
界面活性剤可溶性、及びパパイン可溶化DR1 中で、事
実、同一であることを確認するために、質量分析及びエ
ドマン配列決定分析が行われ、２つの標品からの相当す
る画分に対する質量及び配列は一致することが判明し
た。
析、及び結合ペプチド分析に使用出来る様にパパインで
可溶化された。DR1 に結合したペプチドは、酸で抽出さ
れ、RPC を用いて分画された（図１）。２回目の抽出／
RPC 分離の後、いかなる検出可能なペプチド様物質も存
在せず、ペプチドの定量的抽出が証明された。抽出され
たペプチドプールのアミノ酸分析（ABI 420A/130Aデリ
バタイザー／HPLC）は、質量分析によって決定されたサ
イズ分布（図２参照）に対応する結合ペプチドのモル当
量によって精製DR1 が完全に占拠されると仮定して、70
-80%の得量であることが判明した。いくつかの別々の標
品のDR1 抽出から得られたRPC プロフィル（溶離図）は
再現性があった。更に、界面活性剤可溶性、或いはパパ
イン可溶化DR1 の溶離図は同等であった。ペプチドが、
界面活性剤可溶性、及びパパイン可溶化DR1 中で、事
実、同一であることを確認するために、質量分析及びエ
ドマン配列決定分析が行われ、２つの標品からの相当す
る画分に対する質量及び配列は一致することが判明し
た。
【００２９】マトリックス利用のレーザー脱着質量分析
（MALD-MS）を用いて、平均サイズ18で15残基の様式を
持つDR1 の溶離されたペプチドプール内に含まれる独自
の質量を持つ111 種を同定した（図２）。13-25 残基の
分子量範目内に、更に、500以上の質量種の存在が検出
された。しかしながら、シグナルは十分ではなく、個々
の質量を自信をもって割当てるには至らなかった。単一
の RPCピークに対応する画分に種々の質量を持つ多重種
が検出されたことは、ペプチドの共溶離を示唆する。こ
れらのペプチドの特徴を更に検討するために、サンプル
を、電子スプレーイオンソースを装備した三重四重極
（triplo quadruple）質量分析計（ESI-MS）と自動エド
マン分解微量配列決定法により平行して分析した（Lane
et al.，J．Prot．Chem．10:151-160（1991））。これ
ら２つの技法を組み合わせることにより、単一の画分に
含まれる（複数の）ペプチドのN-及びC-末端両方のアミ
ノ酸の重要な確認が可能となる。DR1 から分離された20
種のペプチドに対して得られた配列及び質量のデータが
表１に列挙されている。すべての確認されたペプチド
は、SWISS-PROTデータベースに保存されているタンパク
質の領域に割り当てられて完全に確認されている。
（MALD-MS）を用いて、平均サイズ18で15残基の様式を
持つDR1 の溶離されたペプチドプール内に含まれる独自
の質量を持つ111 種を同定した（図２）。13-25 残基の
分子量範目内に、更に、500以上の質量種の存在が検出
された。しかしながら、シグナルは十分ではなく、個々
の質量を自信をもって割当てるには至らなかった。単一
の RPCピークに対応する画分に種々の質量を持つ多重種
が検出されたことは、ペプチドの共溶離を示唆する。こ
れらのペプチドの特徴を更に検討するために、サンプル
を、電子スプレーイオンソースを装備した三重四重極
（triplo quadruple）質量分析計（ESI-MS）と自動エド
マン分解微量配列決定法により平行して分析した（Lane
et al.，J．Prot．Chem．10:151-160（1991））。これ
ら２つの技法を組み合わせることにより、単一の画分に
含まれる（複数の）ペプチドのN-及びC-末端両方のアミ
ノ酸の重要な確認が可能となる。DR1 から分離された20
種のペプチドに対して得られた配列及び質量のデータが
表１に列挙されている。すべての確認されたペプチド
は、SWISS-PROTデータベースに保存されているタンパク
質の領域に割り当てられて完全に確認されている。
【００３０】驚くべきことに、20種の配列決定されたDR
1 に結合したペプチドの内16種が、自己タンパク質HLA-
A2及びクラスIIと会合したインバリアント鎖（Ii）の領
域に100%同一であり、全部の抽出されたペプチド質量の
少なくとも26% に相当した。これらの分離されたペプチ
ドは長さが様々で、N-及びC-末端の両方で切断されてお
り、以下のことを示唆する：１）DR1 に結合後、抗原の
プロセシングが両末端で起こる。或いは２）クラスII分
子が、無差別に生成されたペプチドのプールからの抗原
に結合する。ペプチドの微量配列決定からの得量は、HL
A-A2（図１）及びIiが、それぞれ、全DR1 に結合したペ
プチドの少なくとも13%に当たることを示唆している。
1 に結合したペプチドの内16種が、自己タンパク質HLA-
A2及びクラスIIと会合したインバリアント鎖（Ii）の領
域に100%同一であり、全部の抽出されたペプチド質量の
少なくとも26% に相当した。これらの分離されたペプチ
ドは長さが様々で、N-及びC-末端の両方で切断されてお
り、以下のことを示唆する：１）DR1 に結合後、抗原の
プロセシングが両末端で起こる。或いは２）クラスII分
子が、無差別に生成されたペプチドのプールからの抗原
に結合する。ペプチドの微量配列決定からの得量は、HL
A-A2（図１）及びIiが、それぞれ、全DR1 に結合したペ
プチドの少なくとも13%に当たることを示唆している。
【００３１】更に驚くべき発見は、HLA-DRに結合し、HL
A-A2ペプチドと100%相同であるにも拘らず、HLA-A2タン
パク質を発現しない細胞に由来するペプチドに関するも
のである。明らかに、このペプチドは、HLA-A2タンパク
質のある領域と相同の領域を含むタンパク質に由来して
いる。従って、これを明確にする目的で、“HLA-A2タン
パク質”という術語は、HLA-A2タンパク質自身、並び
に、HLA-A2由来のHLA-DR結合ペプチドと80%以上の相同
性を持つ10個或いはそれ以上のアミノ酸の長さの領域を
含むいかなる天然由来のタンパク質をも包含することを
意味する。同様に、“HLA-A2ペプチド”は、本申請中に
広く定義されている様に、いかなるHLA-A2タンパク質に
せよそれに由来するペプチドを指すことになる。
A-A2ペプチドと100%相同であるにも拘らず、HLA-A2タン
パク質を発現しない細胞に由来するペプチドに関するも
のである。明らかに、このペプチドは、HLA-A2タンパク
質のある領域と相同の領域を含むタンパク質に由来して
いる。従って、これを明確にする目的で、“HLA-A2タン
パク質”という術語は、HLA-A2タンパク質自身、並び
に、HLA-A2由来のHLA-DR結合ペプチドと80%以上の相同
性を持つ10個或いはそれ以上のアミノ酸の長さの領域を
含むいかなる天然由来のタンパク質をも包含することを
意味する。同様に、“HLA-A2ペプチド”は、本申請中に
広く定義されている様に、いかなるHLA-A2タンパク質に
せよそれに由来するペプチドを指すことになる。
【００３２】DR1 の研究において確認された他の４種の
ペプチドは、２つの自己タンパク質、トランスフェリン
受容体、及びNa+ /K+ ATP アーゼ、並びに、１つの外因
性タンパク質であるウシ血清のフェチュイン（細胞を浸
す培地を強化するために用いられる血清中に存在するタ
ンパク質）に由来した。これらのペプチドは、各々、全
DR1 母集団の僅か0.3-0.6%を占めるに過ぎず、HLA-A2、
或いはIiぺプチドよりも著しく少ない。クラスII分子
は、細胞表面への移送途上で、外部から入ってくるエン
ドサイトーシス小胞の経路と交差する。リサイクルする
膜タンパク質、及びエンドサイトーシスで取込まれた外
因性タンパク質は、両方共、この共通の経路を移動す
る。従って、HLA-A2、トランスフェリン受容体、Na+/K+
ATPアーゼ、及びウシのフェチュインに由来するペプチ
ドは、すべて、同じ様にDR1 に遭遇する。Iiは小胞体
（ER）内で発生期のクラスIIと会合して（Jones et a
l.，Mol．Imminol．16:51-60（1978））、クラスII/Ii
複合体がエンドサイトーシス画分に到着するまで、抗原
の結合を阻止し（Roche and Cresswell，Nature 345:61
5-618（1990））、そこでIiはタンパク質分解を受け（T
homas et al.，J．Immunol．140:2670-2675（1988）；
Roche and Cresswell，Proc．Natl．Acad．Sci．USA88:
3150-3154（1991））、この様にしてペプチド結合の進
行を可能にする。恐らく、DR1 に結合するIiペプチド
は、この段階で生成されたと思われる。
ペプチドは、２つの自己タンパク質、トランスフェリン
受容体、及びNa+ /K+ ATP アーゼ、並びに、１つの外因
性タンパク質であるウシ血清のフェチュイン（細胞を浸
す培地を強化するために用いられる血清中に存在するタ
ンパク質）に由来した。これらのペプチドは、各々、全
DR1 母集団の僅か0.3-0.6%を占めるに過ぎず、HLA-A2、
或いはIiぺプチドよりも著しく少ない。クラスII分子
は、細胞表面への移送途上で、外部から入ってくるエン
ドサイトーシス小胞の経路と交差する。リサイクルする
膜タンパク質、及びエンドサイトーシスで取込まれた外
因性タンパク質は、両方共、この共通の経路を移動す
る。従って、HLA-A2、トランスフェリン受容体、Na+/K+
ATPアーゼ、及びウシのフェチュインに由来するペプチ
ドは、すべて、同じ様にDR1 に遭遇する。Iiは小胞体
（ER）内で発生期のクラスIIと会合して（Jones et a
l.，Mol．Imminol．16:51-60（1978））、クラスII/Ii
複合体がエンドサイトーシス画分に到着するまで、抗原
の結合を阻止し（Roche and Cresswell，Nature 345:61
5-618（1990））、そこでIiはタンパク質分解を受け（T
homas et al.，J．Immunol．140:2670-2675（1988）；
Roche and Cresswell，Proc．Natl．Acad．Sci．USA88:
3150-3154（1991））、この様にしてペプチド結合の進
行を可能にする。恐らく、DR1 に結合するIiペプチド
は、この段階で生成されたと思われる。
【００３３】表１に報告されているペプチドの中の５つ
に相当ずる合成ペプチドを調製して、それらのDR1 に対
する相対的結合親和性を測定した。インフルエンザ A
赤血球凝集素ペプチド（HA）307-319は、以前に、高親
和性のHLA-DR1 制限ペプチドと記載されているので（Ro
che and Cresswell，J．Immunol．144:1849-1856（199
0）；Rothbard et al.，Cell 52:515-523（1988））、
対照ペプチドとして選ばれた。組換えDR1 のcDNAを発現
する昆虫細胞から精製された“空の（EmPty）”のDR1
が、ヒトの細胞から分離されたDR1 よりも高い結合容量
と10倍速い会合動力学を示すので結合実験に用いられた
（Stern and Wiley，Cell 68:465-477（1992））。すべ
ての合成ペプチドがHAペプチドに対してよく（Ki<100 n
M）競合することが見出された（表２）。最初の概算
で、Iiの106-119ペプチドが、測定されたすべての競合
ペプチドの中で、最高の親和性を持ち、対照のHAペプチ
ドについて側定された値と同等であった。Ki測定に加え
て、これらのペプチドは、SDS-PAGEで解析した場合、SD
S によって誘導される“空の”DR1 のα−β鎖解離に耐
性を与え、安定なペプチド結合を示唆する（Sadegh-Nas
sori and Germain，Nature 353:167-170（1991）； Dor
nmair et al.，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Bio
l．54:409-415（1989）； SPringer et al.，J．Bio1．
Chem．252:6201-62-7（1977））。２つの対照ペブチ
ド、β2 m 152-64、或いはIi 96-110 は、いずれもSDS-
誘導によるDR1 の鎖解離に耐性を与えず、DR1 との結合
に対してHA 307-319と競合出来なかった。これらのペプ
チドは両方共、本研究に報告されている推定結合モチー
フを欠いている（以下参照）。
に相当ずる合成ペプチドを調製して、それらのDR1 に対
する相対的結合親和性を測定した。インフルエンザ A
赤血球凝集素ペプチド（HA）307-319は、以前に、高親
和性のHLA-DR1 制限ペプチドと記載されているので（Ro
che and Cresswell，J．Immunol．144:1849-1856（199
0）；Rothbard et al.，Cell 52:515-523（1988））、
対照ペプチドとして選ばれた。組換えDR1 のcDNAを発現
する昆虫細胞から精製された“空の（EmPty）”のDR1
が、ヒトの細胞から分離されたDR1 よりも高い結合容量
と10倍速い会合動力学を示すので結合実験に用いられた
（Stern and Wiley，Cell 68:465-477（1992））。すべ
ての合成ペプチドがHAペプチドに対してよく（Ki<100 n
M）競合することが見出された（表２）。最初の概算
で、Iiの106-119ペプチドが、測定されたすべての競合
ペプチドの中で、最高の親和性を持ち、対照のHAペプチ
ドについて側定された値と同等であった。Ki測定に加え
て、これらのペプチドは、SDS-PAGEで解析した場合、SD
S によって誘導される“空の”DR1 のα−β鎖解離に耐
性を与え、安定なペプチド結合を示唆する（Sadegh-Nas
sori and Germain，Nature 353:167-170（1991）； Dor
nmair et al.，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Bio
l．54:409-415（1989）； SPringer et al.，J．Bio1．
Chem．252:6201-62-7（1977））。２つの対照ペブチ
ド、β2 m 152-64、或いはIi 96-110 は、いずれもSDS-
誘導によるDR1 の鎖解離に耐性を与えず、DR1 との結合
に対してHA 307-319と競合出来なかった。これらのペプ
チドは両方共、本研究に報告されている推定結合モチー
フを欠いている（以下参照）。
【００３４】幾つかの自然界でプロセシングを受けたペ
プチドのコア抗原決定基（最小限の長さ）の配列整理に
基ずく推定DR1 結合モチーフが表３に示されている。こ
の表に列挙されているペプチドには、HLA-DR1 に対して
本申請において決定されたものに加えて、他の研究者に
よって確認され、DR1 を結合することが知られているペ
プチドも含まれている（本表の参考文献#6は、O'Sulliv
an et al.，J．Immuno１．145:1799-1808，1990；参考
文献#17は、Roche & Cresswoll，J．Immunol．144:1849
-1856； 参考文献#25は、Guttinger et al.，Inten. I
mmunol．3:899-906，1991；参考文献#27は、Guttinger
et al.，EMBO J．7:2555-2558，1988；及び、参考文献#
28は、Harris et al.，J．Immunol．148:2169-2174，19
92である。）。上記モチーフに提唱されている基本的に
重要な残基は以下の通りである。正荷電グループが第一
の位置に所在し、本申請では方向付けのための指標位
（I）ど呼ばれ、水素結合ドナーが I+5に、更に、疎水
性の残基が I+9に位置する。更に、疎水性残基が、しば
しば、I+1 及び／或いは I-1に見出される。DR1 から配
列決定された、天然でプロセシングを受けたペプチドは
いずれもこのモチーフに属する（残基 I+9を欠くHLA-A2
ペプチド 103-116を例外として）。推定モチーフは、第
一のアミノ酸に関して明確に定められた位置には所在し
ないため、又、結合ペプチドの長さが不規則であるため
に、クラスＩ分子に対してされた様に、ペプチドプール
の配列からモチーフを推定することは不可能である（Fa
lk et al.，Nature 351:290-299（1991））。li 96-110
ぺプチド、即ち、結合実験で用いられた負の対照ぺプチ
ドは、その配列の中にI及びI+5のモチーフ残基を持つ
が、li 105-118に見出される８個の追加のアミノ酸が欠
けている（表 3C）。
プチドのコア抗原決定基（最小限の長さ）の配列整理に
基ずく推定DR1 結合モチーフが表３に示されている。こ
の表に列挙されているペプチドには、HLA-DR1 に対して
本申請において決定されたものに加えて、他の研究者に
よって確認され、DR1 を結合することが知られているペ
プチドも含まれている（本表の参考文献#6は、O'Sulliv
an et al.，J．Immuno１．145:1799-1808，1990；参考
文献#17は、Roche & Cresswoll，J．Immunol．144:1849
-1856； 参考文献#25は、Guttinger et al.，Inten. I
mmunol．3:899-906，1991；参考文献#27は、Guttinger
et al.，EMBO J．7:2555-2558，1988；及び、参考文献#
28は、Harris et al.，J．Immunol．148:2169-2174，19
92である。）。上記モチーフに提唱されている基本的に
重要な残基は以下の通りである。正荷電グループが第一
の位置に所在し、本申請では方向付けのための指標位
（I）ど呼ばれ、水素結合ドナーが I+5に、更に、疎水
性の残基が I+9に位置する。更に、疎水性残基が、しば
しば、I+1 及び／或いは I-1に見出される。DR1 から配
列決定された、天然でプロセシングを受けたペプチドは
いずれもこのモチーフに属する（残基 I+9を欠くHLA-A2
ペプチド 103-116を例外として）。推定モチーフは、第
一のアミノ酸に関して明確に定められた位置には所在し
ないため、又、結合ペプチドの長さが不規則であるため
に、クラスＩ分子に対してされた様に、ペプチドプール
の配列からモチーフを推定することは不可能である（Fa
lk et al.，Nature 351:290-299（1991））。li 96-110
ぺプチド、即ち、結合実験で用いられた負の対照ぺプチ
ドは、その配列の中にI及びI+5のモチーフ残基を持つ
が、li 105-118に見出される８個の追加のアミノ酸が欠
けている（表 3C）。
【００３５】35種のこれまでに記載されているDRIに結
合する合成ぺプチド（O'Sulllvan etal.，J．Immunol．
145:1799-1808（1990）; Guttinger et al.，Intern．I
mmunol．3:899-906（1991）; Hill et al.，J．Immuno
l．147:189-197（1991）; Guttinger et al.，EMBO J．
7:2555-2558（1988）; Harris et al.，J．Immunol.，1
48:2169-2174（1992））の配列の比較も、又、このモチ
ーフを支持している。上記35種の合成ぺプチドの中で、
21種（60%）は上記の正確なモチーフを持ち、９種（30
%）はＩ或いはI+9位に単一のシフト（sllift）を含み、
又、残りの５種（10%）はＩ位に単一の置換を持つ（表
3B及び C）。興昧のあることに、後に挙げたペプチドに
おいては、Ｉ位の市荷電は、常により大きな疎水性残基
で置換されている（表 8C）。この正確な置換に便宜を
与えることの出来るポケット構造がクラスＩ分子で記載
されている（Latron et al.， Porc．Natl．Acad．Sc
i．USA88:11325-11329（1991））。他の８つのアミノ酸
の上記モチーフ内、或いはペプチドの長さの中における
寄与は十分には評価されてはいないが、これらのペプチ
ドが示す結合において、転位／喪失した残基の補償をし
ているのかも知れない。これらの研究において引川され
た残り 117種のDR1 に結合しないベプチド（これらのペ
プチドは表３に含まれていない）の検討は、これらペプ
チドの中で99種（85%）が、本申請で提唱されているDR1
モチーフを含まないことを示している。DR1 に結合し
ないが、当該モチーフを含む残り18種のペプチド（15
%）の中で６種は（5%）は、他のDRアロタイプに結合す
ることが知られている。残り12種のペブヂドは、結合を
妨害する他の部位で不都合な相互作用をするのかも知れ
ない。
合する合成ぺプチド（O'Sulllvan etal.，J．Immunol．
145:1799-1808（1990）; Guttinger et al.，Intern．I
mmunol．3:899-906（1991）; Hill et al.，J．Immuno
l．147:189-197（1991）; Guttinger et al.，EMBO J．
7:2555-2558（1988）; Harris et al.，J．Immunol.，1
48:2169-2174（1992））の配列の比較も、又、このモチ
ーフを支持している。上記35種の合成ぺプチドの中で、
21種（60%）は上記の正確なモチーフを持ち、９種（30
%）はＩ或いはI+9位に単一のシフト（sllift）を含み、
又、残りの５種（10%）はＩ位に単一の置換を持つ（表
3B及び C）。興昧のあることに、後に挙げたペプチドに
おいては、Ｉ位の市荷電は、常により大きな疎水性残基
で置換されている（表 8C）。この正確な置換に便宜を
与えることの出来るポケット構造がクラスＩ分子で記載
されている（Latron et al.， Porc．Natl．Acad．Sc
i．USA88:11325-11329（1991））。他の８つのアミノ酸
の上記モチーフ内、或いはペプチドの長さの中における
寄与は十分には評価されてはいないが、これらのペプチ
ドが示す結合において、転位／喪失した残基の補償をし
ているのかも知れない。これらの研究において引川され
た残り 117種のDR1 に結合しないベプチド（これらのペ
プチドは表３に含まれていない）の検討は、これらペプ
チドの中で99種（85%）が、本申請で提唱されているDR1
モチーフを含まないことを示している。DR1 に結合し
ないが、当該モチーフを含む残り18種のペプチド（15
%）の中で６種は（5%）は、他のDRアロタイプに結合す
ることが知られている。残り12種のペブヂドは、結合を
妨害する他の部位で不都合な相互作用をするのかも知れ
ない。
【００３６】I-Abと呼ばれるマウスのクラスII抗原に結
合する６種のぺプチド、及びマウスのI-Ebに結合する５
種のペプチドに関する以前の研究において観察された正
確なN-末端の分裂とは対照的に（Rudensky et al.，Nat
ure 3565:622-627（1991））、DR1 に結合する当該ペプ
チドは、N-及びC-末端の両方において不均一である。ク
ラスＩ分子に結合するべプチドは９量体が支配的である
が、これらとは対照的に（Van Bleek and Nathenson，N
atUre 348:213-216（1990）; Rotzschke et al.，Natur
e 348:252-254（1990）; Jardetzky et al.，Nature 35
3:326-329（1991）; Hunt et al.，Science 255:1261-1
263（1992））、クラスIIペプチドはよりサイズが大き
く、又、末端の切断の長さと部位の両方において高度の
不均一性を示し、クラスＩ及びクラスIIのペプチドに対
するプロセシングの機構が相当に異なることを意昧して
いる。更に、今回の結果は、クラスIIのプロセシング
は、確率論的な事象であり、DRアロタイプは、複雑で不
揃いな混合物の中から種々の長さのベプチドに結合する
可能性を示唆している。観察された上記の不均一性は、
単に、結合したペプチドが更に分解するのを防ぐためか
も知れない。この様にして、クラスII分子は、結合した
ぺプチドが完全に分解されることから防御ずることによ
って、抗原のプロセシングにおいて積極的な役割を演じ
るのであろう（以前に提唱された様に（Donermeyer and
Allen，J．Immunol．142:1063-1068（1989）））。又
は、DRI に結合するものは15量体が支配的であるが（MA
LD-MS 及び配列決定されたペプチドの得量の両方から検
出される様に）、これは、結合したペプチドの剪定（tr
imming）の結果かも知れない。いずれにせよ、検出可能
な量の、13残基より短く、25残基より長いペプチドが存
在しないことは、ペプチドの結合機構、或いは抗原のプ
ロセシングに特有の長さ制限があることを示唆してい
る。DR１に結合するペプチドは、内因的に合成されたタ
ンパク質、特にMHC に関連したタンパク質に由来するも
のが支配的であることは、自己寛容の発生に関連して、
自己ペプチド提示機構の進化の結果かも知れない。
合する６種のぺプチド、及びマウスのI-Ebに結合する５
種のペプチドに関する以前の研究において観察された正
確なN-末端の分裂とは対照的に（Rudensky et al.，Nat
ure 3565:622-627（1991））、DR1 に結合する当該ペプ
チドは、N-及びC-末端の両方において不均一である。ク
ラスＩ分子に結合するべプチドは９量体が支配的である
が、これらとは対照的に（Van Bleek and Nathenson，N
atUre 348:213-216（1990）; Rotzschke et al.，Natur
e 348:252-254（1990）; Jardetzky et al.，Nature 35
3:326-329（1991）; Hunt et al.，Science 255:1261-1
263（1992））、クラスIIペプチドはよりサイズが大き
く、又、末端の切断の長さと部位の両方において高度の
不均一性を示し、クラスＩ及びクラスIIのペプチドに対
するプロセシングの機構が相当に異なることを意昧して
いる。更に、今回の結果は、クラスIIのプロセシング
は、確率論的な事象であり、DRアロタイプは、複雑で不
揃いな混合物の中から種々の長さのベプチドに結合する
可能性を示唆している。観察された上記の不均一性は、
単に、結合したペプチドが更に分解するのを防ぐためか
も知れない。この様にして、クラスII分子は、結合した
ぺプチドが完全に分解されることから防御ずることによ
って、抗原のプロセシングにおいて積極的な役割を演じ
るのであろう（以前に提唱された様に（Donermeyer and
Allen，J．Immunol．142:1063-1068（1989）））。又
は、DRI に結合するものは15量体が支配的であるが（MA
LD-MS 及び配列決定されたペプチドの得量の両方から検
出される様に）、これは、結合したペプチドの剪定（tr
imming）の結果かも知れない。いずれにせよ、検出可能
な量の、13残基より短く、25残基より長いペプチドが存
在しないことは、ペプチドの結合機構、或いは抗原のプ
ロセシングに特有の長さ制限があることを示唆してい
る。DR１に結合するペプチドは、内因的に合成されたタ
ンパク質、特にMHC に関連したタンパク質に由来するも
のが支配的であることは、自己寛容の発生に関連して、
自己ペプチド提示機構の進化の結果かも知れない。
【００３７】II．他のHLA-DRＲ分子
DR2、DR3、DR4、DR7及びDR8の各々から溶離された天然
でプロセシングを受げたペプチドのアミノ酸配列が、夫
々、表4-8に示されている。表9には、野生型のArを持た
ないが、A2様のペプチドを結合した他の細胞系由来のDR
1のアミノ酸配列が示されている。表10は、ヒトの牌臓
由来の細胞に発現されるDR4及びDR11分子から溶離した
ペプチドのアミノ酸配列を示す。これらのデータは、外
因性ペプチドと比較して、結合する自己ペプチドが大い
に優勢であることを証明する。このデータ、又、A2及び
liペプチドが、繰り返し生じることを示す。
でプロセシングを受げたペプチドのアミノ酸配列が、夫
々、表4-8に示されている。表9には、野生型のArを持た
ないが、A2様のペプチドを結合した他の細胞系由来のDR
1のアミノ酸配列が示されている。表10は、ヒトの牌臓
由来の細胞に発現されるDR4及びDR11分子から溶離した
ペプチドのアミノ酸配列を示す。これらのデータは、外
因性ペプチドと比較して、結合する自己ペプチドが大い
に優勢であることを証明する。このデータ、又、A2及び
liペプチドが、繰り返し生じることを示す。
【００３８】III．ペプチドの運搬
遺伝的構成
本発明の免疫調節ペプチドをコードする遺伝子のin viv
o投与のための遺伝的構成物を調製するために、以下の
操作が行行われる。重複した合成のオリゴヌクレオチド
を用いて、図３に示されているリーダーペプチド／遮断
ペプチドのミニ遺伝子を、ヒトのHLA-DRα及びインバリ
アント鎖のcDNA鋳型から、PCR 増幅によって生成した。
これらのミニ遺伝子は、Iiペプチド断片である KMRMATP
LLMQALPM（即ち、li15）、及び、LPKPPKPVSKMRMATPLLMQ
ALPM（即ち、Ii24 ）をコードする。その結果得られた構
成物は、プラスミドpGEM-2-α-li15、及びpGEM-2-α-li
24を形成するために、pGEM-2（Promega社）中に、以下
に述べるin vitro転写／翻訳系で用いるための上流T7プ
ロモーターと共にクローンされた。in vivo発現のため
に、各ミニ遺伝子は、その後、pGEM-2誘導体からトラン
スフェクション・ベクターであるpHβアクチン-1-ネオ
（neo）（Gunning et al.，（1987）Proc．Natl．Aca
d．Sci．USA 84:4831）中にザブクローンされてプラス
ミドpHβアクチン-α-Ii15及びpHβアクチン-α-Ii24を
形成した。上記の挿入されたミニ遺伝子は、この様にし
て、構成的で／強力なヒトのβアクチンブロモーターか
ら生体内（in vivo）で発現される。これに加えて、上
記ミニ遺伝子は、pGEM-2誘導体からワクシニアウイルス
の組換えベクターであるpSC11（S.Chakrabarti et a
l.，（1985）Mol．Cell．Biol．5，3403-3409）中にサ
ブクローンされてプラスミドpSCll-α-Ii15及びpSCll-
α-Ii24を形成した。ウイルスのゲノム中に組換え後、
上記のミニ遺伝子は強力なワクシニアp7.5プロモーター
から発現される。
o投与のための遺伝的構成物を調製するために、以下の
操作が行行われる。重複した合成のオリゴヌクレオチド
を用いて、図３に示されているリーダーペプチド／遮断
ペプチドのミニ遺伝子を、ヒトのHLA-DRα及びインバリ
アント鎖のcDNA鋳型から、PCR 増幅によって生成した。
これらのミニ遺伝子は、Iiペプチド断片である KMRMATP
LLMQALPM（即ち、li15）、及び、LPKPPKPVSKMRMATPLLMQ
ALPM（即ち、Ii24 ）をコードする。その結果得られた構
成物は、プラスミドpGEM-2-α-li15、及びpGEM-2-α-li
24を形成するために、pGEM-2（Promega社）中に、以下
に述べるin vitro転写／翻訳系で用いるための上流T7プ
ロモーターと共にクローンされた。in vivo発現のため
に、各ミニ遺伝子は、その後、pGEM-2誘導体からトラン
スフェクション・ベクターであるpHβアクチン-1-ネオ
（neo）（Gunning et al.，（1987）Proc．Natl．Aca
d．Sci．USA 84:4831）中にザブクローンされてプラス
ミドpHβアクチン-α-Ii15及びpHβアクチン-α-Ii24を
形成した。上記の挿入されたミニ遺伝子は、この様にし
て、構成的で／強力なヒトのβアクチンブロモーターか
ら生体内（in vivo）で発現される。これに加えて、上
記ミニ遺伝子は、pGEM-2誘導体からワクシニアウイルス
の組換えベクターであるpSC11（S.Chakrabarti et a
l.，（1985）Mol．Cell．Biol．5，3403-3409）中にサ
ブクローンされてプラスミドpSCll-α-Ii15及びpSCll-
α-Ii24を形成した。ウイルスのゲノム中に組換え後、
上記のミニ遺伝子は強力なワクシニアp7.5プロモーター
から発現される。
【００３９】ペプチドに加えられる細胞内流通シグナル
短いアミノ酸配列は、タンパク質を特定の細胞内分画
（コンパートメント）に指向するためのシグナルとして
作用することが出来る。例えば、疎水性シグナルペプチ
ドは、ERに仕向けられているタンパク質のアミノ末端に
見出されるが、アミノ酸配列KFERQ（及び、他の密接に
関連した配列）は細胞内ポリペプチドをリソソームに指
向することが知られており、一方、他の配列はポリペプ
チドをエンドソームに指向する。更に、ペプチド配列KD
ELはERに対する保持シグナルとして作用することが示さ
れている。これらのシグナルペプチドの各々、或いは、
これらを組合わせて、本発明の免疫調節ペプチドを、希
望通りの流通に用いることが出来る。例えば、ER標的指
向のシグナルペプチドに連結された所定の免疫調節ペプ
チドをコードする構成物は、当該ペプチドをERに指向
し、そこで組立てられたままで、クラスII分子に結合し
て、流通に必須である無傷のIiの結合を防止する。又
は、上記ペプチド上のER保持シグナルは、クラスII分子
が、仮にも、ERから分離することを防止する助けとなる
ような構築物を作ることも出来る。もし、代わりに、本
発明のペプチドがエンドソーム分画に指向されるなら
ば、これは、インバリアント鎖がプロセシングを受けた
ペプチドで置換される場合、大量の当該ペプチドが存在
し、それによってクラスII複合体に組込まれたペプチド
が、天然由来で潜在的に免疫原性のペプチドよりもむし
ろ本発明の高親和性ペブチドである可能性を増大する。
本発明のペプチドがクラスIIへの組込みに利用出来る見
込みは、当該ペプチドを無傷のIiポリペプチド配列に連
結することによって増大することが出来る。Iiはクラス
II分子をエンドソームヘ流通することが知られているの
で、ハイブリッドIiは、本発明のペプチドの１つ、或い
はそれ以上のコピーをクラスII分子と共に運ぶことにな
る。一旦、エンドソーム内に入ると、上記ハイブリッド
Iiは正常のエンドソームのプロセスによって分解して、
本発明のペプチド或いは、それに類似の分子の多重コピ
ー、及びクラス１１の開放された結合間隙とを生成す
る。標的指向シグナルを含む免疫調節ペプチドをコード
するDNAは、PCR或いは他の標準の遺伝子操作、または合
成的技法によって生成され、これらペプチドがDR分子と
会合する能力は、下記の様に、in vitro及びin vivoで
分析される。
（コンパートメント）に指向するためのシグナルとして
作用することが出来る。例えば、疎水性シグナルペプチ
ドは、ERに仕向けられているタンパク質のアミノ末端に
見出されるが、アミノ酸配列KFERQ（及び、他の密接に
関連した配列）は細胞内ポリペプチドをリソソームに指
向することが知られており、一方、他の配列はポリペプ
チドをエンドソームに指向する。更に、ペプチド配列KD
ELはERに対する保持シグナルとして作用することが示さ
れている。これらのシグナルペプチドの各々、或いは、
これらを組合わせて、本発明の免疫調節ペプチドを、希
望通りの流通に用いることが出来る。例えば、ER標的指
向のシグナルペプチドに連結された所定の免疫調節ペプ
チドをコードする構成物は、当該ペプチドをERに指向
し、そこで組立てられたままで、クラスII分子に結合し
て、流通に必須である無傷のIiの結合を防止する。又
は、上記ペプチド上のER保持シグナルは、クラスII分子
が、仮にも、ERから分離することを防止する助けとなる
ような構築物を作ることも出来る。もし、代わりに、本
発明のペプチドがエンドソーム分画に指向されるなら
ば、これは、インバリアント鎖がプロセシングを受けた
ペプチドで置換される場合、大量の当該ペプチドが存在
し、それによってクラスII複合体に組込まれたペプチド
が、天然由来で潜在的に免疫原性のペプチドよりもむし
ろ本発明の高親和性ペブチドである可能性を増大する。
本発明のペプチドがクラスIIへの組込みに利用出来る見
込みは、当該ペプチドを無傷のIiポリペプチド配列に連
結することによって増大することが出来る。Iiはクラス
II分子をエンドソームヘ流通することが知られているの
で、ハイブリッドIiは、本発明のペプチドの１つ、或い
はそれ以上のコピーをクラスII分子と共に運ぶことにな
る。一旦、エンドソーム内に入ると、上記ハイブリッド
Iiは正常のエンドソームのプロセスによって分解して、
本発明のペプチド或いは、それに類似の分子の多重コピ
ー、及びクラス１１の開放された結合間隙とを生成す
る。標的指向シグナルを含む免疫調節ペプチドをコード
するDNAは、PCR或いは他の標準の遺伝子操作、または合
成的技法によって生成され、これらペプチドがDR分子と
会合する能力は、下記の様に、in vitro及びin vivoで
分析される。
【００４０】インバリアント鎖は、クラスII分子がER内
でペプチドを結合することを防市してヘテロダイマー形
成に貢献する可能性があると提唱されている。この会合
を防止する機構は、いかなるものでもクラスII遮断の効
率を増大するであろう。従って、クラスIIヘテロダイマ
ーに結合するIi上の部位、或いはIiに結合するヘテロダ
イマーのαまたはβサブユニット上の部位に対応するペ
プチドは、この会合を防止し、それによって、MHCクラ
スIIの機能を中断するために用いることが出来る。
でペプチドを結合することを防市してヘテロダイマー形
成に貢献する可能性があると提唱されている。この会合
を防止する機構は、いかなるものでもクラスII遮断の効
率を増大するであろう。従って、クラスIIヘテロダイマ
ーに結合するIi上の部位、或いはIiに結合するヘテロダ
イマーのαまたはβサブユニット上の部位に対応するペ
プチドは、この会合を防止し、それによって、MHCクラ
スIIの機能を中断するために用いることが出来る。
【００４１】In vitro における組立て
無細胞抽出液が真核生物のタンパク質を発現するため日
常的に使用されている（Kreig，P．& Melton，D.（198
4）Nucl．Acid Res．12，7057；Pelham，II．and Jacks
on，R．（1976）Eur．J．Biochem．67，247）。特定のm
RNAが、ウイルスRNA ポリメラーゼのプロモーターを含
むDNAベクターから転写されて（Melton，D. et al．（1
984）Nucl．Acid Res．12，7035）、ミクロコッカスヌ
クレアーゼで処理された細胞抽出液に加えられる。35Ｓ
メチオニン及びアミノ酸の添加が、外因性のmRNAの翻訳
を始動し、結果として標識タンバク質が生成される。タ
ンパク質は、次いでSDS-PAGEにより分析され、オートラ
ジオグラフィーによって検出される。シグナルペプチド
の切断及びコアグリコシル化の様なプロセシング事象
は、翻訳の間にミクロソーム小胞を添加することによっ
て開始され（Walter，P．and Blobel，G．（1983），Me
th. Enzymol.，96，50）、これらの事象はSDS-PAGEゲル
におけるタンパク質の移動度の変化によって検査され
る。
常的に使用されている（Kreig，P．& Melton，D.（198
4）Nucl．Acid Res．12，7057；Pelham，II．and Jacks
on，R．（1976）Eur．J．Biochem．67，247）。特定のm
RNAが、ウイルスRNA ポリメラーゼのプロモーターを含
むDNAベクターから転写されて（Melton，D. et al．（1
984）Nucl．Acid Res．12，7035）、ミクロコッカスヌ
クレアーゼで処理された細胞抽出液に加えられる。35Ｓ
メチオニン及びアミノ酸の添加が、外因性のmRNAの翻訳
を始動し、結果として標識タンバク質が生成される。タ
ンパク質は、次いでSDS-PAGEにより分析され、オートラ
ジオグラフィーによって検出される。シグナルペプチド
の切断及びコアグリコシル化の様なプロセシング事象
は、翻訳の間にミクロソーム小胞を添加することによっ
て開始され（Walter，P．and Blobel，G．（1983），Me
th. Enzymol.，96，50）、これらの事象はSDS-PAGEゲル
におけるタンパク質の移動度の変化によって検査され
る。
【００４２】シグナルペプチド配列を含むペプチド正確
にプロセシングを受けて、インバリアント鎖とER中でク
ラスII結合に対して競合する能力は、上述のin vitro系
でアッセイされる。とりわけ、上述のDRIのα-とβ-
鎖、及びインバリアント鎖ペプチドの構成物は、mRNAに
転写され、これが哺乳動物のミクロソーム膜の存在下に
翻訳されるであろう。DRヘテロダイマーのIiとの会合、
DR及びIiに対する抗血清による免疫沈降試験によって測
定される。本発明のペプチドをコードするmRNAを翻訳反
応に加え、トリスートリシンゲル上のSDS-PAGEで測定す
る場合、共免疫沈降するIiのレベルが減少すると同時に
共免疫沈降するペプチドが出現する結果となるはずであ
る。これらの実験は、所定の遮断ペプチドのERにおける
Ii鎖結合に対する競合剤としての潜在的有川性を決定す
るための迅速なアッセイ系を提供するであろう。この無
細胞系においてIiと有効に競合する能力のあることが判
明している本発明のこれらのペプチドは、次いで、以下
に述べる様に、無傷の細胞において検査することが出来
る。
にプロセシングを受けて、インバリアント鎖とER中でク
ラスII結合に対して競合する能力は、上述のin vitro系
でアッセイされる。とりわけ、上述のDRIのα-とβ-
鎖、及びインバリアント鎖ペプチドの構成物は、mRNAに
転写され、これが哺乳動物のミクロソーム膜の存在下に
翻訳されるであろう。DRヘテロダイマーのIiとの会合、
DR及びIiに対する抗血清による免疫沈降試験によって測
定される。本発明のペプチドをコードするmRNAを翻訳反
応に加え、トリスートリシンゲル上のSDS-PAGEで測定す
る場合、共免疫沈降するIiのレベルが減少すると同時に
共免疫沈降するペプチドが出現する結果となるはずであ
る。これらの実験は、所定の遮断ペプチドのERにおける
Ii鎖結合に対する競合剤としての潜在的有川性を決定す
るための迅速なアッセイ系を提供するであろう。この無
細胞系においてIiと有効に競合する能力のあることが判
明している本発明のこれらのペプチドは、次いで、以下
に述べる様に、無傷の細胞において検査することが出来
る。
【００４３】In vivo における組立て
ヒトのEBVで形質転換されたB細胞系であるLG-2とHOM-2
（HLA-DR1に対して同型接合）及びマウスの B細胞ハイ
ブリドーマであるLK35.2が、50μｇの鎖状化pHβアクチ
ン-α-Ii15或いはpHβアクチン-α-Ii24、又は（コント
ロールとして）PHβアクチン-1-neoで、エレクトロポレ
ーション（150 mV、960μF、キュベット幅0.2cm）によ
ってトランスフェクトされる。エレクトロポレーション
後、上記細胞は、G418を含まない培地中で完全回復まで
（約4日）培養される。各母集団は、次いで、ネオマイ
シン耐性を表現する形質転換体母集団が得られる迄 G41
8 選別にかける（約 1-2ケ月）。耐性母集団は、制限稀
釈によってサブクローンし、安定な形質転換体の遺伝的
同一性は、遮断ペプチドのmRNA発現のPCR増幅によって
決定される。
（HLA-DR1に対して同型接合）及びマウスの B細胞ハイ
ブリドーマであるLK35.2が、50μｇの鎖状化pHβアクチ
ン-α-Ii15或いはpHβアクチン-α-Ii24、又は（コント
ロールとして）PHβアクチン-1-neoで、エレクトロポレ
ーション（150 mV、960μF、キュベット幅0.2cm）によ
ってトランスフェクトされる。エレクトロポレーション
後、上記細胞は、G418を含まない培地中で完全回復まで
（約4日）培養される。各母集団は、次いで、ネオマイ
シン耐性を表現する形質転換体母集団が得られる迄 G41
8 選別にかける（約 1-2ケ月）。耐性母集団は、制限稀
釈によってサブクローンし、安定な形質転換体の遺伝的
同一性は、遮断ペプチドのmRNA発現のPCR増幅によって
決定される。
【００４４】遮断ペプチドのミニ遺伝子、或いは負の制
御ベクターを担載するLG-2、及びHOM-2の安定な形質転
換体を、ペレット化細胞塊20ｇを得る迄、大規模培養条
件で培養する。各形質転換体によって発現されたHLA-DR
を精製し、結合ペプチドの量（細胞内及び細胞外両方か
らの）を上記の様にして分析する。総結合ペプチドの多
様性の減少の成功が証明されれば、免疫調節ペプチドの
細胞内への運搬の表示となる。
御ベクターを担載するLG-2、及びHOM-2の安定な形質転
換体を、ペレット化細胞塊20ｇを得る迄、大規模培養条
件で培養する。各形質転換体によって発現されたHLA-DR
を精製し、結合ペプチドの量（細胞内及び細胞外両方か
らの）を上記の様にして分析する。総結合ペプチドの多
様性の減少の成功が証明されれば、免疫調節ペプチドの
細胞内への運搬の表示となる。
【００４５】もう一つの細胞によるアッセイは、遮断ペ
プチドのミニ遺伝子、或いは負の制御ベクターを担載す
るLK35.2細胞の安定な形質転換体を利用する。これらの
細胞は、T細胞増殖アッセイにおいてAPCとして用いられ
る。各形質転換体を、種々の稀釈度の鶏卵リゾチーム
（HEL）、及びHELに特異的な T細胞ハイブリドーマの存
在下に24時間培養する。各アッセイに存在する T細胞の
川対的活性化（リンホカイン生成により測定）は、市販
のリンホカイン依存性細胞系であるCTLL2 を用いて、3H
-チミジンの取込みアッセイ（Vignali et al．（1992）
J.E.M. 175：925-932）で測定する。遮断ペプチドを発
現する形質転換体が、HEL を特異的Ｔ細胞ハイブリドー
マに提示する能力を減少することを成功裡に証明出来れ
ば、免疫調節ペプチドの細胞内への運搬の確証となるで
あろう。ヒトのTK-細胞系143（ATCC）の細胞をワクジニ
アウイルス（WR株、TK+）（ATCC）に感染させ、感染後
２時間して、pSCll-α-Ii15、或いはpSCll-α-Ii24を感
染細胞内にリン酸カルシウム沈殿法によって導入する。
TK~組換え体は、25μｇ/mlの濃度のブロモデオキシウリ
ジンを用いて選択する。組換えプラークは、ミニ遺伝子
DNA の存在を求めて、PCR によりスクリーンする。組換
えウイルスは、純粋クローンのウイルス株を生成するた
めに、3ラウンドの限界稀釈によりクローンする。
プチドのミニ遺伝子、或いは負の制御ベクターを担載す
るLK35.2細胞の安定な形質転換体を利用する。これらの
細胞は、T細胞増殖アッセイにおいてAPCとして用いられ
る。各形質転換体を、種々の稀釈度の鶏卵リゾチーム
（HEL）、及びHELに特異的な T細胞ハイブリドーマの存
在下に24時間培養する。各アッセイに存在する T細胞の
川対的活性化（リンホカイン生成により測定）は、市販
のリンホカイン依存性細胞系であるCTLL2 を用いて、3H
-チミジンの取込みアッセイ（Vignali et al．（1992）
J.E.M. 175：925-932）で測定する。遮断ペプチドを発
現する形質転換体が、HEL を特異的Ｔ細胞ハイブリドー
マに提示する能力を減少することを成功裡に証明出来れ
ば、免疫調節ペプチドの細胞内への運搬の確証となるで
あろう。ヒトのTK-細胞系143（ATCC）の細胞をワクジニ
アウイルス（WR株、TK+）（ATCC）に感染させ、感染後
２時間して、pSCll-α-Ii15、或いはpSCll-α-Ii24を感
染細胞内にリン酸カルシウム沈殿法によって導入する。
TK~組換え体は、25μｇ/mlの濃度のブロモデオキシウリ
ジンを用いて選択する。組換えプラークは、ミニ遺伝子
DNA の存在を求めて、PCR によりスクリーンする。組換
えウイルスは、純粋クローンのウイルス株を生成するた
めに、3ラウンドの限界稀釈によりクローンする。
【００４６】前述のトランスフェクション実験に類似の
実験において、ミニ遺伝子、或いはベクターのみをコー
ドする組換えワクシニアウイルスを用いて、EBVで形質
転換されたヒトのB細胞系である、LG-2、及びHOM-2 の
大規模培養物を感染する。感染後、HLA-DRを精製して、
結合ペプチドの量を上記の様にして分析する。結合ペプ
チド母集団の複雑性の低下、及び結合したIiペプチドの
相対的量の著明な増大は、ワクシニアが遮断ペプチドを
ヒトのAPC に運搬出来ることの確証である。
実験において、ミニ遺伝子、或いはベクターのみをコー
ドする組換えワクシニアウイルスを用いて、EBVで形質
転換されたヒトのB細胞系である、LG-2、及びHOM-2 の
大規模培養物を感染する。感染後、HLA-DRを精製して、
結合ペプチドの量を上記の様にして分析する。結合ペプ
チド母集団の複雑性の低下、及び結合したIiペプチドの
相対的量の著明な増大は、ワクシニアが遮断ペプチドを
ヒトのAPC に運搬出来ることの確証である。
【００４７】ミニ遺伝子、或いはベクターをコードする
同じ組換えワクシニアウイルスが、実験的に導入された
自己免疫を体験しているマウスを感染するのに用いられ
るであろう。この様なモデルは多数知られており、Kron
enberg、Cell 65:537-542（1991）に引用されている。
同じ組換えワクシニアウイルスが、実験的に導入された
自己免疫を体験しているマウスを感染するのに用いられ
るであろう。この様なモデルは多数知られており、Kron
enberg、Cell 65:537-542（1991）に引用されている。
【００４８】合成ペプチド、或いはミニ遺伝子構成物の
リポソームによる運搬 リポソームは、薬物の担体として、又、最近では、ヒト
におけるマラリアのワクチン注射のための安全で有力な
補助戦略として成功裡に使川されている（Fries et a
l．（1992），Proc. Natl．Acad．Sci．USA 89:358）。
包膜されたリポソームは、可溶性タンパク質を取込み、
これらの抗原を細胞に運搬して、in vitro及びin vivo
の両方における CD 8+仲介の細胞溶解性（CTL）の応答
をもたらす（REddy et al., J. Immunol. 148:1585-158
9，1992；及びCollins et al., J.Immunol. 148:3336-3
341，1992）。この様にして、リポソームは、合成ペプ
チドをAPC内に運搬するための伝達体（vehicle）として
用いてもよい。
リポソームによる運搬 リポソームは、薬物の担体として、又、最近では、ヒト
におけるマラリアのワクチン注射のための安全で有力な
補助戦略として成功裡に使川されている（Fries et a
l．（1992），Proc. Natl．Acad．Sci．USA 89:358）。
包膜されたリポソームは、可溶性タンパク質を取込み、
これらの抗原を細胞に運搬して、in vitro及びin vivo
の両方における CD 8+仲介の細胞溶解性（CTL）の応答
をもたらす（REddy et al., J. Immunol. 148:1585-158
9，1992；及びCollins et al., J.Immunol. 148:3336-3
341，1992）。この様にして、リポソームは、合成ペプ
チドをAPC内に運搬するための伝達体（vehicle）として
用いてもよい。
【００４９】Harding ら（Cell（1991）64，393-401）
は、リポソームにより運搬される抗原の、２つの細胞内
のクラスII充填分画（loading compartments）のいずれ
か、即ち、初期のエンドソーム及び／或いはリソソーム
への標的指向は、リポソームの膜組成を変えることによ
って達成出来ることを証明している。即ち、酸感受性リ
ポソームは、その内容物を初期エンドソーム、に指向す
るが、一方、酸耐性のリポソームは、その内容物をリソ
ソームに運搬することが見出だされている。この様にし
て、本発明のペプチドは、エンドソームへの運搬が望ま
れている場合、酸感受性のリポソームに、又、リソソー
ムへの運搬が望まれている場合は、酸耐性リポソームに
取込まれることになろう。
は、リポソームにより運搬される抗原の、２つの細胞内
のクラスII充填分画（loading compartments）のいずれ
か、即ち、初期のエンドソーム及び／或いはリソソーム
への標的指向は、リポソームの膜組成を変えることによ
って達成出来ることを証明している。即ち、酸感受性リ
ポソームは、その内容物を初期エンドソーム、に指向す
るが、一方、酸耐性のリポソームは、その内容物をリソ
ソームに運搬することが見出だされている。この様にし
て、本発明のペプチドは、エンドソームへの運搬が望ま
れている場合、酸感受性のリポソームに、又、リソソー
ムへの運搬が望まれている場合は、酸耐性リポソームに
取込まれることになろう。
【００５０】リポソームは、標準の界面活性剤透析、或
いは脱水−再水和法によって調製される。酸感受性リポ
ソームに対しては、ジオレオイル・ホスファチジルエタ
ノールアミン（DOPE）及びパルミトイル・ホモシステイ
ン（PHC）が用いられ、一方、ジオレオイル・ホスファ
チジルコリン（DOPC）及びジオレオイル・ホスファチジ
ルセリン（DOPS）が、酸耐性リポソームの調製に使用さ
れる。10-5モルの総脂質（DOPC/DOPS或いはDOPE/PHC、
4:1 のモル比で）を乾燥し、0.2 mlのHEPES 緩衝食塩水
（HBS）（150 mM Nacl、1 mM EGTA、10 mM HEPES ｐH
7.4）中で水和して超音波処理する。脂質の懸濁液を0.1
mlのHBSに溶かした1 M のオクチルグルコシドを加えて
可溶化する。封入されるべきぺプチドを20% HBS 中 6 m
M のペプチド0.2 mlに加える。混合物は、次いで、凍結
し、一晩凍結乾燥してから再水和する。これらのリポソ
ームは、キモトリプシンで処理して、表面に結合したペ
プチドをすべて消化する。リポソームのEBV で形質転換
した細胞系（上述の様に）への運搬は、37℃で12-16 時
間のインキュベーションにより達成されるであろう。HL
A-DRは、リポソームで処理した細胞から精製されて、結
合ペプチドは前記の様にして分析される。代わりに、リ
ポソームは本発明のDNA ミニ遺伝子構成物で処方調製さ
れて、invitro或いはin vivoで上記構成物をAPCに運搬
するために利用される。ヒトの免疫感作は、臨床検査の
ためのジョンズ・ホプキンス大学・合同委員会（The Jo
hns Hopkins University Joint Committee for Clinica
l Investigation）、及び米国陸軍・軍医総監室・ヒト
患者の研究検閲評議会（Human Subject Research Revie
w Board of the Office of the Surgeon General of th
e U.S. Army）の両方によって承認された手順（Fries e
t al. （1992），Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．89:3
58-362）に従い、そこに記載の用量、或いは、治療薬の
リポソームを基盤とする運搬に対する文献に記載されて
いるの他の用量を用いて行われるであろう。
いは脱水−再水和法によって調製される。酸感受性リポ
ソームに対しては、ジオレオイル・ホスファチジルエタ
ノールアミン（DOPE）及びパルミトイル・ホモシステイ
ン（PHC）が用いられ、一方、ジオレオイル・ホスファ
チジルコリン（DOPC）及びジオレオイル・ホスファチジ
ルセリン（DOPS）が、酸耐性リポソームの調製に使用さ
れる。10-5モルの総脂質（DOPC/DOPS或いはDOPE/PHC、
4:1 のモル比で）を乾燥し、0.2 mlのHEPES 緩衝食塩水
（HBS）（150 mM Nacl、1 mM EGTA、10 mM HEPES ｐH
7.4）中で水和して超音波処理する。脂質の懸濁液を0.1
mlのHBSに溶かした1 M のオクチルグルコシドを加えて
可溶化する。封入されるべきぺプチドを20% HBS 中 6 m
M のペプチド0.2 mlに加える。混合物は、次いで、凍結
し、一晩凍結乾燥してから再水和する。これらのリポソ
ームは、キモトリプシンで処理して、表面に結合したペ
プチドをすべて消化する。リポソームのEBV で形質転換
した細胞系（上述の様に）への運搬は、37℃で12-16 時
間のインキュベーションにより達成されるであろう。HL
A-DRは、リポソームで処理した細胞から精製されて、結
合ペプチドは前記の様にして分析される。代わりに、リ
ポソームは本発明のDNA ミニ遺伝子構成物で処方調製さ
れて、invitro或いはin vivoで上記構成物をAPCに運搬
するために利用される。ヒトの免疫感作は、臨床検査の
ためのジョンズ・ホプキンス大学・合同委員会（The Jo
hns Hopkins University Joint Committee for Clinica
l Investigation）、及び米国陸軍・軍医総監室・ヒト
患者の研究検閲評議会（Human Subject Research Revie
w Board of the Office of the Surgeon General of th
e U.S. Army）の両方によって承認された手順（Fries e
t al. （1992），Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．89:3
58-362）に従い、そこに記載の用量、或いは、治療薬の
リポソームを基盤とする運搬に対する文献に記載されて
いるの他の用量を用いて行われるであろう。
【００５１】免疫刺激複合体（ISCOMS）を介する運搬
ISCOMSはコレステロールとQuil A（サポニン）を混合す
ると自発的に生成されるサイズ30-40 nmの負荷電の籠形
構造物である。保護免疫は、トキソプラズマ病及びエプ
スタイン・バールウイルスで誘発される腫瘍を含む種々
の感染の実験モデルにおいて、ISCOMSを抗原の運搬伝達
体として用いて発生されている（Mowatand Donachie, I
mmunology Today 12:383-385，1991）。ISCOMSに封入さ
れた１μｇ程度の低い抗原用量でもクラスＩ仲介のCTL
応答を起こすことが見出だされており、ここでは、精製
した無傷のIIIV-1-IIIB gp 160 包膜糖タンパク質、或
いはインフルエンザ赤血球凝集素が抗原である（Takaha
shi et al.，Nature 344:873-875, 1990）。ペプチド
は、ISCOCOMSを用い、上述のリポソームに対するのと同
じ様式と用量で組織培養細胞内に運搬される。運搬され
たペプチドのクラスIIペプチド結合は、次いで、上述の
様に、抽出と特徴決定によって決定される。ISCOMSによ
って運搬され培養細胞によって効果的に利用される本発
明のペプチドは、次いで、動物或いはヒトで検査され
る。治療用の合成ペブチドの運搬に加えて、ISCOMSは、
ミニ遺伝子をAPC に運搬するために構成され、この様に
して上に概説されたワクシニア戦略に対する代替法とし
て役立つ。
ると自発的に生成されるサイズ30-40 nmの負荷電の籠形
構造物である。保護免疫は、トキソプラズマ病及びエプ
スタイン・バールウイルスで誘発される腫瘍を含む種々
の感染の実験モデルにおいて、ISCOMSを抗原の運搬伝達
体として用いて発生されている（Mowatand Donachie, I
mmunology Today 12:383-385，1991）。ISCOMSに封入さ
れた１μｇ程度の低い抗原用量でもクラスＩ仲介のCTL
応答を起こすことが見出だされており、ここでは、精製
した無傷のIIIV-1-IIIB gp 160 包膜糖タンパク質、或
いはインフルエンザ赤血球凝集素が抗原である（Takaha
shi et al.，Nature 344:873-875, 1990）。ペプチド
は、ISCOCOMSを用い、上述のリポソームに対するのと同
じ様式と用量で組織培養細胞内に運搬される。運搬され
たペプチドのクラスIIペプチド結合は、次いで、上述の
様に、抽出と特徴決定によって決定される。ISCOMSによ
って運搬され培養細胞によって効果的に利用される本発
明のペプチドは、次いで、動物或いはヒトで検査され
る。治療用の合成ペブチドの運搬に加えて、ISCOMSは、
ミニ遺伝子をAPC に運搬するために構成され、この様に
して上に概説されたワクシニア戦略に対する代替法とし
て役立つ。
【００５２】免疫原性ペブチドの運搬（ワクチン）
免疫系をダウンレギュレーションするという特異的な目
的で、非免疫原性の自己ペプチドを運搬するために前述
の細胞内運搬システムを利用することに加えて（この様
にして自己免疫状態を軽減する）、本発明の運搬システ
ムは、代わりに、動物の免疫系の一部を刺激するため
に、予防接種の新規の方法として用いることも出来る。
後の場合、上記の運搬システムは、特定の病原体に対す
る免疫応答の刺激を意図して、免疫原性で病原体由来の
ペプチドを発現するDNA 構成物を、適当な細胞内に運搬
するために利用される。上記免疫原性ペプチドは標的細
胞自身の中で生成されるので、本発明のワクチン法は、
抗体生成を刺激し、それによって潜在的に有害な、或い
は不適切な免疫反応誘導に利用される様な血中を循環す
る遊離の抗原は存在しないことを保証する。本発明のワ
クチンによって刺激される免疫応答は、ワクチンはAPC
にのみ指向されているので、もっと全般的な免疫応答と
いう結果になる標準のワクチンプロトコルとは対照的
に、T 細胞仲介の応答に限定されている。ペプチドを提
示するAPC のあるものは、初期に宿主のホストT 細胞に
よって溶解されることもあるが、とりわけ、ウイルス基
盤のワクチンは、非複製的で、即ち、各担体ウイルスは
単に 1個の細胞のみを感染するので、この様な溶解は限
定されている。
的で、非免疫原性の自己ペプチドを運搬するために前述
の細胞内運搬システムを利用することに加えて（この様
にして自己免疫状態を軽減する）、本発明の運搬システ
ムは、代わりに、動物の免疫系の一部を刺激するため
に、予防接種の新規の方法として用いることも出来る。
後の場合、上記の運搬システムは、特定の病原体に対す
る免疫応答の刺激を意図して、免疫原性で病原体由来の
ペプチドを発現するDNA 構成物を、適当な細胞内に運搬
するために利用される。上記免疫原性ペプチドは標的細
胞自身の中で生成されるので、本発明のワクチン法は、
抗体生成を刺激し、それによって潜在的に有害な、或い
は不適切な免疫反応誘導に利用される様な血中を循環す
る遊離の抗原は存在しないことを保証する。本発明のワ
クチンによって刺激される免疫応答は、ワクチンはAPC
にのみ指向されているので、もっと全般的な免疫応答と
いう結果になる標準のワクチンプロトコルとは対照的
に、T 細胞仲介の応答に限定されている。ペプチドを提
示するAPC のあるものは、初期に宿主のホストT 細胞に
よって溶解されることもあるが、とりわけ、ウイルス基
盤のワクチンは、非複製的で、即ち、各担体ウイルスは
単に 1個の細胞のみを感染するので、この様な溶解は限
定されている。
【００５３】本発明の系を完璧にして検査するために用
いられるモデル抗原は、鶏卵のリゾチーム（HEL）であ
る。議論はあるものの、これは、抗原提示研究のために
最もよく特徴が検討されているタンパク質であり、それ
に対しては、多数の単クローン性抗体、及びクラスIと
クラスIIに限定されたマウスの T細胞クローン及びハイ
ブリドーマが存在する。研究される一次抗原決定基は、
単クローン性抗体及びCD4+ T細胞ハイブリドーマの両方
が入手出来るので、ペプチドHEL34-45であり、及び、ク
ラス IとクラスII限定 T細胞クローン及びハイブリドー
マが作られ、市販されているので、ペプチドHEL46-61と
である。この様にして、これら 2つのアミノ酸配列は、
免疫原性の抗原決定基であることが立証されている。最
初、異なったポリペプチドをコードする 4種の構成物が
分析される。（a）分泌されるHELの全体、（B）HEL 34-
45、（c）HEL 46-61、及び（d）HEL 34-61。最後の 3種
は、これらの細胞内で切断されることが知られているシ
グナル配列、例えば、1Aｋ（MPRSRALILGVLALTTMLSLCG
G）を含み、結果としてERを指向する。すべての構成物
は、次いで、pHβApr-1 neo 中にサブクローンされる。
これらの構成物を作成する方法論は、上に概説されたも
のと同じである。上記構成物は、通常の真核細胞のトラ
ンスフェクション、或いは、上述の運搬伝達体（例え
ば、ワクシニア、リポソーム、或いは、ISCOMS）の１つ
によって、適切なAPC、例えば、LK35.2細胞内に導入さ
れる。マウスのMHC クラスII制限分子であるIAk及びIEk
を持ち、上記構成物の各々でトランスフェクトされたLK
35.2細胞が、適当なクラスI 及びクラスII制限 T細胞ハ
イブリドーマ並びにクローンを刺激する能力を標準技法
で検査される。クラス I刺激が観察されるかどうかは、
クラス I分子との結合に適切な 8-10 量体を生成するた
めにペプチドの剪定がER内で起こり得るかどうかに係る
と思われる。もし、これらの構成物がクラス I刺激に効
果的でないならば、クラス I結合に対して更に効果的な
ペプチドを生成するために、これらの構成物を修飾する
ことが出来る。これらの構成物は、クラスII限定応答に
対してより効果的でないことが立証される場合には、V
節に述べられた様に、これらにエンドソーム及び／或い
はリソソーム指向の配列を付与することが出来る。免疫
原性ペプチドを特定の細胞内小器官に指向するために用
いられる標的指向シグナルの効果性は、種々の形質転換
体の免疫金染色切片の電子顕微鏡分析を用いて検出され
るであろう。この適用のため、ウサギの抗ペプチド抗血
清を生成し、アフィニティを利用して精製する。更にHE
L 34-45を認識する抗体HF10が川いられるであろう。
いられるモデル抗原は、鶏卵のリゾチーム（HEL）であ
る。議論はあるものの、これは、抗原提示研究のために
最もよく特徴が検討されているタンパク質であり、それ
に対しては、多数の単クローン性抗体、及びクラスIと
クラスIIに限定されたマウスの T細胞クローン及びハイ
ブリドーマが存在する。研究される一次抗原決定基は、
単クローン性抗体及びCD4+ T細胞ハイブリドーマの両方
が入手出来るので、ペプチドHEL34-45であり、及び、ク
ラス IとクラスII限定 T細胞クローン及びハイブリドー
マが作られ、市販されているので、ペプチドHEL46-61と
である。この様にして、これら 2つのアミノ酸配列は、
免疫原性の抗原決定基であることが立証されている。最
初、異なったポリペプチドをコードする 4種の構成物が
分析される。（a）分泌されるHELの全体、（B）HEL 34-
45、（c）HEL 46-61、及び（d）HEL 34-61。最後の 3種
は、これらの細胞内で切断されることが知られているシ
グナル配列、例えば、1Aｋ（MPRSRALILGVLALTTMLSLCG
G）を含み、結果としてERを指向する。すべての構成物
は、次いで、pHβApr-1 neo 中にサブクローンされる。
これらの構成物を作成する方法論は、上に概説されたも
のと同じである。上記構成物は、通常の真核細胞のトラ
ンスフェクション、或いは、上述の運搬伝達体（例え
ば、ワクシニア、リポソーム、或いは、ISCOMS）の１つ
によって、適切なAPC、例えば、LK35.2細胞内に導入さ
れる。マウスのMHC クラスII制限分子であるIAk及びIEk
を持ち、上記構成物の各々でトランスフェクトされたLK
35.2細胞が、適当なクラスI 及びクラスII制限 T細胞ハ
イブリドーマ並びにクローンを刺激する能力を標準技法
で検査される。クラス I刺激が観察されるかどうかは、
クラス I分子との結合に適切な 8-10 量体を生成するた
めにペプチドの剪定がER内で起こり得るかどうかに係る
と思われる。もし、これらの構成物がクラス I刺激に効
果的でないならば、クラス I結合に対して更に効果的な
ペプチドを生成するために、これらの構成物を修飾する
ことが出来る。これらの構成物は、クラスII限定応答に
対してより効果的でないことが立証される場合には、V
節に述べられた様に、これらにエンドソーム及び／或い
はリソソーム指向の配列を付与することが出来る。免疫
原性ペプチドを特定の細胞内小器官に指向するために用
いられる標的指向シグナルの効果性は、種々の形質転換
体の免疫金染色切片の電子顕微鏡分析を用いて検出され
るであろう。この適用のため、ウサギの抗ペプチド抗血
清を生成し、アフィニティを利用して精製する。更にHE
L 34-45を認識する抗体HF10が川いられるであろう。
【００５４】一旦、ある構成物が、形質転換体によって
in vitroで効果的に提示出来ることが明確になれば、そ
のin vivo における効果性が決定される。これは、上記
形質転換体をC3H/Balb/c F1 マウスに腹腔内及び／或い
は皮下注射することにより、または、適当な運搬伝達体
（例えば、リポソーム、ISCOMS、レトロウイルス、ワク
シニア）に取込まれた構成物を注射することによって検
査することが出来る。この様な免疫感作注射に対する至
適プロトコル及び用量は、本出願に提供されている開示
があれば、当事者によって決定することが出来る。免疫
感作の効率は、以下の様な標準の方法によって検査出来
る。（a）HEL を適用された（HEL pulsed）APCに応答す
るクラスIIに限定された T細胞の増殖、（b）51Crで標
識された標的に対する CTL応答、及び（c）ELISA で測
定される血清の抗体価。
in vitroで効果的に提示出来ることが明確になれば、そ
のin vivo における効果性が決定される。これは、上記
形質転換体をC3H/Balb/c F1 マウスに腹腔内及び／或い
は皮下注射することにより、または、適当な運搬伝達体
（例えば、リポソーム、ISCOMS、レトロウイルス、ワク
シニア）に取込まれた構成物を注射することによって検
査することが出来る。この様な免疫感作注射に対する至
適プロトコル及び用量は、本出願に提供されている開示
があれば、当事者によって決定することが出来る。免疫
感作の効率は、以下の様な標準の方法によって検査出来
る。（a）HEL を適用された（HEL pulsed）APCに応答す
るクラスIIに限定された T細胞の増殖、（b）51Crで標
識された標的に対する CTL応答、及び（c）ELISA で測
定される血清の抗体価。
【００５５】一旦、本発明のワクチン運搬システムの細
部が至適化されれば、有用な免疫感作の潜在能力を持つ
ペプチドをコードする構成物を上記の系に組込むことが
出来る。この様なペプチドは、病原体由来のタンパク質
上の免疫原性抗原決定基の同定に現今用いられている標
準手段によって確認することが出来る。例えば、免疫感
作のための候補ペプチドは、抗体及び特定の病原体で感
染された動物の T細胞の分析から決定してもよい。保護
的で効果的な既往（記憶）応答を獲得するために、予防
接種に川いられるペプチドは、理想的には、感染すると
最高の頻度と効率で提示されるペプチドでなければなら
ない。これは、感染細胞から MHCクラスII分子に結合し
たペプチドを抽出して特徴決定するために、前記実験の
部に概説されている操作を用いて最もよく決定すること
が出来る。免疫原性ペプチドに対立遺伝子制限があるな
らば（本発明の自己ペブチドで観察された変質した結合
と対比して）、全母集団に対して有用なワクヂ〕／を提
供するためには数種の免疫原性ペブチドをコードするミ
ニ遺伝子が要求されるであろう。ワクチンの投与と用量
は、天然痘の予防接種に現在適用されているものと同様
である。
部が至適化されれば、有用な免疫感作の潜在能力を持つ
ペプチドをコードする構成物を上記の系に組込むことが
出来る。この様なペプチドは、病原体由来のタンパク質
上の免疫原性抗原決定基の同定に現今用いられている標
準手段によって確認することが出来る。例えば、免疫感
作のための候補ペプチドは、抗体及び特定の病原体で感
染された動物の T細胞の分析から決定してもよい。保護
的で効果的な既往（記憶）応答を獲得するために、予防
接種に川いられるペプチドは、理想的には、感染すると
最高の頻度と効率で提示されるペプチドでなければなら
ない。これは、感染細胞から MHCクラスII分子に結合し
たペプチドを抽出して特徴決定するために、前記実験の
部に概説されている操作を用いて最もよく決定すること
が出来る。免疫原性ペプチドに対立遺伝子制限があるな
らば（本発明の自己ペブチドで観察された変質した結合
と対比して）、全母集団に対して有用なワクヂ〕／を提
供するためには数種の免疫原性ペブチドをコードするミ
ニ遺伝子が要求されるであろう。ワクチンの投与と用量
は、天然痘の予防接種に現在適用されているものと同様
である。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【００５６】
【配列表】
（１）一般情報：
（ｉ）出願人： ロバート ジー アーバン
ローマン エム チクビ
ダリオ エー エー ビグナリ
マリー エル ヘドレイ
ローランス ジェイ ステルン
ジャック エル ストロミンガー
（ii）発明の名称：免疫調節ペプチド
（iii）配列数：157
（iv）対応アドレス：
（A）名宛人：フィッシュ アンド リチャードソン
（B）通り：225フランクリンストリート
（C）市：ボストン
（D）州：マサチューセッツ
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：０２１１０−２８０４
（ｖ）コンピュータ読み出し形態：
（A）媒体形式： 3.5”ディスク，1.44Mb
（B）コンピュータ：IBM PS/2モデル50Zまたは55SX
（C）作動システム：MS-DOS（バージョン5.0）
（D）ソフトウェア：ワードパーフェクト（バージョン5.1）
（vi）現出願データ：
（A）出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ９２／０６６９２
（B）出願日：１９９３年８月１１日
（C）分類：
（vii）優先出願データ：
（A）出願番号：０７／９２５，４６０
（B）出願日：１９９２年８月１１日
（viii）代理人情報：
（A）氏名：クラーク ポール ティー
（B）登録番号：３０，１６２
（C）整理番号：００２４６／１６２００１
（ix）遠隔通信情報：
（A）電話番号：（６１７）５４２−５０７０
（B）ファックス番号：（６１７）５４２−８９０６
（C）テレックス番号：２００１５４
（２）配列番号１の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 18
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号１の記載 ：
（２）配列番号２の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号２の記載 ：
（２）配列番号３の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 14
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号３の記載 ：
（２）配列番号４の情報 ：
（ｉ）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 14
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号４の記載 ：
（２）配列番号５の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 13
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号５の記載 ：
（２）配列番号６の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 25
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号６の記載 ：
（２）配列番号７の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 24
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号７の記載 ：
（２）配列番号８の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 24
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号８の記載 ：
（２）配列番号９の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 23
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号９の記載 ：
（２）配列番号10の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 23
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー： 直鎖状
（xi）配列番号10の記載 ：
（２）配列番号11の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 22
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー： 直鎖状
（xi）配列番号11の記載 ：
（２）配列番号12の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 22
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー： 直鎖状
（xi）配列番号12の記載 ：
（２）配列番号13の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 21
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号13の記載 ：
（２）配列番号14の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D））トボロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号14の記載 ：
（２）配列番号15の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号15の記載
（２）配列番号16の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 14
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号16の記載 ：
（２）配列番号17の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 18
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号17の記載 ：
（２）配列番号18の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号18の記載 ：
（２）配列番号19の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 19
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号19の記載 ：
（２）配列番号20の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 18
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号20の記載 ：
（２）配列番号21の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 19
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号21の記載 ：
（２）配列番号22の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号22の記載 ：
（２）配列番号23の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号23の記載 ：
（２）配列番号24の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 13
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号24の記載 ：
（２）配列番号25の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号25の記載 ：
（２）配列番号26の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 13
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号26の記載 ：
（２）配列番号27の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 18
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号27の記載 ：
（２）配列番号28の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 18
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号28の記載 ：
（２）配列番号29の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号29の記載 ：
（２）配列番号30の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号30の記載 ：
（２）配列番号31の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 14
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号31の記載 ：
（２）配列番号32の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー： 直鎖状
（xi）配列番号32の記載 ：
（２）配列番号33の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号33の記載 ：
（２）配列番号34の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号34の記載 ：
（２）配列番号35の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号35の記載 ：
（２）配列番号36の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号36の記載 ：
（２）配列番号37の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号37の記載 ：
（２）配列番号38の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号38の記載 ：
（２）配列番号39の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号39の記載 ：
（２）配列番号40の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 13
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号40の記載 ：
（２）配列番号41の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号41の記載 ：
（２）配列番号42の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号42の記載 ：
（２）配列番号43の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 22
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号43の記載 ：
（２）配列番号44の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 25
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号44の記載 ：
（２）配列番号45の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号45の記載 ：
（２）配列番号46の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 24
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号46の記載 ：
（２）配列番号47の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 13
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号47の記載 ：
（２）配列番号48の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号48の記載 ：
（２）配列番号49の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号49の記載 ：
（２）配列番号50の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号50の記載 ：
（２）配列番号51の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 14
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号51の記載 ：
（２）配列番号52の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 13
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号52の記載 ：
（２）配列番号53の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号53の記載 ：
（２）配列番号54の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号54の記載 ：
（２）配列番号55の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 23
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号55の記載 ：
（２）配列番号56の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号56の記載 ：
（２）配列番号57の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号57の記載 ：
（２）配列番号58の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号58の記載 ：
（２）配列番号59の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号59の記載 ：
（２）配列番号60の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号60の記載 ：
（２）配列番号61の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 18
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号61の記載 ：
（２）配列番号62の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号62の記載 ：
（２）配列番号63の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号63の記載 ：
（２）配列番号64の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 19
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号64の記載 ：
（２）配列番号65の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 23
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号65の記載 ：
（２）配列番号66の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号66の記載 ：
（２）配列番号67の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号67の記載 ：
（２）配列番号68の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 27
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号68の記載 ：
（２）配列番号69の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 27
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D））トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号69の記載 ：
（２）配列番号70の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 27
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号70の記載 ：
（２）配列番号71の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 27
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号71の記載 ：
（２）配列番号72の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 18
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号72の記載 ：
（２）配列番号73の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号73の記載 ：
（２）配列番号74の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 19
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号74の記載 ：
（２）配列番号75の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 19
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号75の記載 ：
（２）配列番号76の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号76の記載 ：
（２）配列番号77の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号77の記載 ：
（２）配列番号78の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号78の記載 ：
（２）配列番号79の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 18
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号79の記載 ：
（２）配列番号80の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 21
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号80の記載 ：
（２）配列番号81の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号81の記載 ：
（２）配列番号82の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 18
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号82の記載 ：
（２）配列番号83の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号83の記載 ：
（２）配列番号84の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号84の記載 ：
（２）配列番号85の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号85の記載 ：
（２）配列番号86の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号86の記載 ：
（２）配列番号87の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号87の記載 ：
（２）配列番号88の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号88の記載 ：
（２）配列番号89の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー： 直鎖状
（xi）配列番号89の記載 ：
（２）配列番号90の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 14
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号90の記載 ：
（２）配列番号91の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号91の記載 ：
（２）配列番号92の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 21
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号92の記載 ：
（２）配列番号93の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号93の記載 ：
（２）配列番号94の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 19
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号94の記載 ：
（２）配列番号95の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 19
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号95の記載 ：
（２）配列番号96の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 19
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号96の記載 ：
（２）配列番号97の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号97の記載 ：
（２）配列番号98の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号98の記載 ：
（２）配列番号99の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号99の記載 ：
（２）配列番号100の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 12
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号100の記載 ：
（２）配列番号101の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 23
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号101の記載 ：
（２）配列番号102の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 22
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー： 直鎖状
（xi）配列番号102の記載 ：
（２）配列番号103の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 21
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号103の記載 ：
（２）配列番号104の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号104の記載 ：
（２）配列番号105の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 19
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号105の記載 ：
（２）配列番号106の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 18
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号106の記載 ：
（２）配列番号107の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 18
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号107の記載 ：
（２）配列番号108の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号108の記載 ：
（２）配列番号109の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号109の記載 ：
（２）配列番号110の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 14
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号110の記載 ：
（２）配列番号111の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 12
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号111の記載 ：
（２）配列番号112の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 21
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号112の記載 ：
（２）配列番号113の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号113の記載 ：
（２）配列番号114の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号114の記載 ：
（２）配列番号115の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トボロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号115の記載 ：
（２）配列番号116の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号116の記載 ：
（２）配列番号117の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号117の記載 ：
（２）配列番号118の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号118の記載 ：
（２）配列番号119の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号119の記載 ：
（２）配列番号120の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号120の記載 ：
（２）配列番号121の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号121の記載 ：
（２）配列番号122の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 14
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号122の記載 ：
（２）配列番号123の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号123の記載 ：
（２）配列番号124の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号124の記載 ：
（２）配列番号125の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号125の記載 ：
（２）配列番号126の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 22
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号126の記載 ：
（２）配列番号127の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 18
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号127の記載 ：
（２）配列番号128の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 14
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号128の記載 ：
（２）配列番号129の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号129の記載 ：
（２）配列番号130の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 23
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号130の記載 ：
（２）配列番号131の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 21
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号131の記載 ：
（２）配列番号132の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 17
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号132の記載 ：
（２）配列番号133の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号133の記載 ：
（２）配列番号134の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号134の記載 ：
（２）配列番号135の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号135の記載 ：
（２）配列番号136の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号136の記載 ：
（２）配列番号137の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号137の記載 ：
（２）配列番号138の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 15
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号138の記載 ：
（２）配列番号139の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 14
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号139の記載 ：
（２）配列番号140の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 24
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号140の記載 ：
（２）配列番号141の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 21
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号141の記載 ：
（２）配列番号142の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 20
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号142の記載 ：
（２）配列番号143の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 16
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号143の記載 ：
（２）配列番号144の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 26
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号144の記載 ：
（２）配列番号145の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 24
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号145の記載 ：
（２）配列番号146の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 14
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号146の記載 ：
（２）配列番号147の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 123
（B）配列の型 ： 核酸
（C）鎖の数 ： 一本鎖
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号147の記載 ：
（２）配列番号148の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 150
（B）配列の型 ： 核酸
（C）鎖の数 ： 一本鎖
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号148の記載 ：
（２）配列番号149の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 10
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号149の記載 ：
（２）配列番号150の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 10
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号150の記載 ：
（２）配列番号151の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 10
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D））トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号151の記載 ：
（２）配列番号152の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ：4
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号152の記載 ：
（２）配列番号153の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ：5
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号153の記載 ：
（２）配列番号154の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ：5
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号154の記載 ：
（２）配列番号155の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 25
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号155の記載 ：
（２）配列番号156の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 14
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号156の記載 ：
（２）配列番号157の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 23
（B）配列の型 ： アミノ酸
（C）鎖の数 ：
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号157の記載 ：
【図１】 図1A-1Fは、夫々、パパインで消化されたHL
A-DR1、DR2、DR3、DR4、DR7及びDR8 から抽出されたペ
プチドプールのクロマトグラフ分析であり、紫外線吸収
によって検出された通りの各HLA-DRのペプチドの種目を
図示する。 210nm及び 277 nmの両方に対する紫外線吸
収が、16分と90分の間の保持ウインドウ（retention wi
ndow）で500 mAUのフルスケールで示されている（各マ
ークは２分を表す）。
A-DR1、DR2、DR3、DR4、DR7及びDR8 から抽出されたペ
プチドプールのクロマトグラフ分析であり、紫外線吸収
によって検出された通りの各HLA-DRのペプチドの種目を
図示する。 210nm及び 277 nmの両方に対する紫外線吸
収が、16分と90分の間の保持ウインドウ（retention wi
ndow）で500 mAUのフルスケールで示されている（各マ
ークは２分を表す）。
【図２】 図２は、分離されたHLA-DR1に結合したペプ
チドのサイズ分布の代表的な質量分析である。100 質量
ユニットで測定されたペプチド質量が、質量分析によっ
て確定された分離ペプチドの数に対してプロットされて
いる。ペプチドの長さは、質量実験値を平均アミノ酸質
量である118 ダルトンで割って計算された。
チドのサイズ分布の代表的な質量分析である。100 質量
ユニットで測定されたペプチド質量が、質量分析によっ
て確定された分離ペプチドの数に対してプロットされて
いる。ペプチドの長さは、質量実験値を平均アミノ酸質
量である118 ダルトンで割って計算された。
【図３】 図３は、本発明の２つのミニ遺伝子を表し、
この中でHLA-DRα鎖のリーダーペプチドが、ヒトのイン
バリアント鎖Iiの15残基（A）或いは、24残基（B）の遮
断ペプチド断片のアミノ酸末端に連結している。
この中でHLA-DRα鎖のリーダーペプチドが、ヒトのイン
バリアント鎖Iiの15残基（A）或いは、24残基（B）の遮
断ペプチド断片のアミノ酸末端に連結している。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１５年２月１７日（２００３．２．１
７）
７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 37/06 ４Ｃ０７６
37/04 Ｃ０７Ｋ 14/74 ４Ｃ０８４
37/06 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５
Ｃ０７Ｋ 14/74 Ｃ１２Ｑ 1/02
Ｃ１２Ｎ 5/10 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ
1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ｂ
33/50 Ａ６１Ｋ 37/02
(72)発明者 チクズ ローマン エム
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ジ
ャマイカ プレイン グレンロード 82
(72)発明者 ビグナリ ダリオ エー エー
イギリス国 ケント州 ローワー レイン
ハム ロード 761
(72)発明者 ヘドレイ マリー リン
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ケ
ンブリッジ＃１ ワルデン ストリート
214
(72)発明者 ステルン ローランス ジェイ
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ア
ーリントン ニューポート ストリート
181
(72)発明者 ストロミンガー ジャック エル
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 レ
キシントン マサチューセッツ アベニュ
ー 2030
Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB03 BB20 CB01 CB21
DA12 DA13 DA14 DA36
4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 EA02
EA04 GA14 GA30 HA01
4B063 QA01 QA05 QA18 QQ08 QQ79
QR32 QR77 QS25 QS33 QS40
QX07
4B064 AG20 CA10 CA19 CC24 DA01
DA13
4B065 AA90X AA91X AA94X AA94Y
AA95X AB01 BA03 CA24
CA44 CA46
4C076 AA19 CC07 DD63H EE59
FF16 FF21
4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08
BA18 BA19 BA23 MA01 MA24
MA55 NA14 ZB052 ZB072
ZB082 ZB092 ZB352
4H045 AA10 AA20 AA30 BA15 BA16
BA17 BA18 BA41 CA40 DA50
EA20 EA50 FA74
Claims (44)
- 【請求項１】 天然由来のヒトのタンパク質の切片と同
一のアミノ酸配列からなるペプチドの精製標品であっ
て、当該切片は長さ10から30残基までであり、上記ペプ
チドがヒトの主要組織適合性複合体（MHC）のクラスII
アロタイプに結合することを特徴とする。 - 【請求項２】 請求項１に記載の調製品であって、上記
ペプチドが少なくとも２つの別個の MHCクラスIIアロタ
イプに結合することを特徴とする。 - 【請求項３】 請求項１に記載の調製品であって、上記
のヒトタンパク質が、HLA-A2、HLA-A29、HLA-Bw62、HLA
-C、HLA-DRα、HLA-DRβ、インバリアント鎖（Ii）、Ig
κ鎖 C領域、Ig H鎖、Na+/K+ ATP アーゼ、トランスフ
ェリン、トランスフェリン受容体、カルシトニン受容
体、カルボキシペプチダーゼ E、MET キナーゼ関連形質
転換タンパク質、グアニル酸結合タンパク質、マンノー
ス結合タンパク質、アポリポタンパク質 B-100、カテプ
シンＣ、カテプシンＳ、金属プロテイナーゼ阻害因子
１ 前駆体、或いは、熱ショック・コグネイト 71 kD
タンパク質である。 - 【請求項４】 請求項１に記載の調製品であって、上記
ヒトタンパク質がMHC のクラスI或いはクラスII分子で
あることを特徴とする。 - 【請求項５】 請求項１に記載の調製品であって、上記
切片が以下のモチーフに属することを特徴とする。当該
切片のアミノ末端、或いはその12残基内の最初の照合点
(I)に、正荷電残基、又は大きな疎水性残基を、及びI+5
位に、水素結合供与残基を含む。 - 【請求項６】 請求項５に記載の調製品であって、上記
モチーフが I+9 位に疎水性残基を含むことを特徴とす
る。 - 【請求項７】 請求項６に記載の調製品であって、上記
モチーフが、更に、I+1 或いはI-1 位に疎水性残基を
含むことを特徴とする。 - 【請求項８】 請求項１に記載の調製品であって、上記
切片がHLA-A2の残基29-40、或いは残基 106-115を含む
ことを特徴とする。 - 【請求項９】 請求項１に記載の調製品であって、上記
切片がIiの残基 107-116を含むことを特徴とする。 - 【請求項１０】 治療用組成品が、 （a）天然由来のヒトのタンパク質の切片と同一のアミ
ノ酸配列からなるペプチドであって、上記切片は10から
30残基の長さであり、上記ペプチドがヒトの主要組織適
合性複合体（MHC）のクラスIIアロタイプに結合し、及
び、 （b）薬剤学的に許容される担体からなることを特徴と
する。 - 【請求項１１】 天然由来のヒトのタンパク質の切片と
同一のアミノ酸配列からなるペプチドを含むリポソーム
であって、上記切片は10から30残基の長さであり、上記
ペブチドがヒトの主要組織適合性複合体（MHC）のクラ
スIIアロタイプに結合することを特徴とする。 - 【請求項１２】 天然由来のヒトのタンパク質の切片の
アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドを
含む免疫刺激複合体（ISCOM）であって、上記切片は10
から30残基の長さであり、上記ペプチドがヒトの主要組
織適合性複合体（MHC）クラスIIアロタイプに結合する
ことを特徴とする。 - 【請求項１３】 ヒト患者における免疫応答を阻害する
方法であって、上記方法が、患者の抗原提示細胞（AP
C）を請求項１０に記載の治療用組成物と接触させるこ
とからなることを特徴とする。 - 【請求項１４】 ヒト患者における免疫応答を阻害する
方法であって、上記方法が、患者のAPCを請求項１１に
記載のリポソームと接触させることからなることを特徴
とする。 - 【請求項１５】 ヒト患者における免疫応答を阻害する
方法であって、上記方法が、患者のAPCを請求項１２に
記載のISCOMと接触させることからなることを特徴とす
る。 - 【請求項１６】 ポリペプチドをコードする核酸であっ
て、上記ポリペブチドがペプチド結合で連結された第一
と第二のアミノ酸配列からなり、上記第一の配列は天然
由来のヒトのタンパク質の切片の配列と同一であり、当
該切片がヒトのMHCのクラスIIアロタイプに結合して、1
0から30残基の長さであり、又、第二の配列は、それが
付着するポリペプチドの細胞内流通を制御する配列（流
通配列）であることを特徴とする。 - 【請求項１７】 請求項１６に記載の核酸であって、上
記の流通配列が上記ポリペプチドを小胞体（ER）、リソ
ソーム、或いはエンドソームに流通することを特徴とす
る。 - 【請求項１８】 請求項１６に記載の核酸であって、上
記の第二の配列が MHCサブユニットのシグナルペプチド
と本質的に同一であることを特徴とする。 - 【請求項１９】 請求項１８に記載の核酸であって、上
記サブユニットがMHCクラスIIα或いはβサブユニット
であることを特徴とする。 - 【請求項２０】 請求項１６に記載の核酸であって、上
記の流通配列が KDEL、 KFERQ、 QREFK 、 MAISGVPVLGF
FIIAVLMSAQESWA 、Qの一側にK 、R 、D 、E、F 、I 、V
及びＬから選ばれた４残基が隣接しているペンタペプ
チド、或いはシグナルペプチドであることを特徴とす
る。 - 【請求項２１】 請求項１６に記載の核酸を含むリポソ
ーム、或いはISCOMを特徴とする。 - 【請求項２２】 ペプチド結合で連結された第一と第二
のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸
であって、上記第一の配列が天然由来のヒトのタンパク
質の切片の配列と同一であり、上記切片がヒトのMHCク
ラスIIアロタイプに結合して、10から30残基の長さであ
り、又、第二の配列がヒトのIiと本質的に同一であるこ
とを特徴とする。 - 【請求項２３】 請求項２２に記載の核酸であって、上
記ポリペプチドが、上記の第二配列に縦に連結した上記
第一配列の複数のコピーからなることを特徴とする。 - 【請求項２４】 天然由来のヒトのタンパク質の切片と
同一のアミノ酸からなる自己ペプチドをコードする核酸
分子であって、上記切片は10から30残基の長さであり、
上記自己ペプチドがヒトの主要組織適合性複合体（MH
C）クラスIIアロタイプに結合し、上記核酸分子が上記
タンパク質の全配列よりも少ない配列をコードすること
を特徴とする。 - 【請求項２５】 請求項２４に記載の核酸分子であっ
て、上記分子が、更に、それが付着するポリペブチドの
細胞内流通を制御するペプチド配列をコードすることを
特徴とする（流通配列）。 - 【請求項２６】 請求項２５に記載の核酸分子であっ
て、上記分子が、更に、第二の自己ペプチド及び第二の
流通配列をコードすることを特徴とする。 - 【請求項２７】 請求項２４に記載の核酸分子であっ
て、上記分子が、更に、発現制御因子を含むことを特徴
とする。 - 【請求項２８】 請求項２４に記載の核酸分子であっ
て、上記分子がプラスミド、或いはウイルスのゲノム、
配列を含むことを特徴とする。 - 【請求項２９】 請求項２８に記載の核酸分子であっ
て、上記分子が非増殖性で非毒性のワクシニアウイル
ス、アデノウイルス、エプスタイン・バールウイルス、
或いはレトロウイルスのゲノムであることを特徴とす
る。 - 【請求項３０】 請求項２４に記載の核酸分子を含むリ
ポソーム、或いはISCOMを特徴とする。 - 【請求項３１】 請求項２７に記載の核酸分子を含む細
胞を特徴とする。 - 【請求項３２】 請求項３１に記載の細胞であって、上
記細胞がヒトの B細胞、或いはAPCであることを特徴と
する。 - 【請求項３３】 請求項３１に記載の細胞であって、上
記核酸がウイルスのゲノム核酸からなることを特徴とす
る。 - 【請求項３４】 ペプチド調製の方法であって、当該方
法が、上記核酸分子からの上記ペプチドの発現を可能に
する条件下に請求項３１に記載の細胞を培養することか
らなることを特徴とする。 - 【請求項３５】 ヒト患者における免疫応答を阻害する
方法であって、上記方法が、請求項２４に記載の核酸
を、上記患者の複数の APCに導入することからなること
を特徴とする。 - 【請求項３６】 薬剤学的に許容される担体中の請求項
２４に記載の核酸からなる治療用組成物を特徴とする。 - 【請求項３７】 ヒト患者に免疫応答を誘発する方法で
あって、上記方法が、上記患者の APC内に、ヒト起源以
外のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸分子を
導入し、上記断片が MHCのクラスＩ或いはII分子に結合
することを特徴とする。 - 【請求項３８】 請求項３７に記載の方法であって、上
記タンパク質が、ヒト、或いは動物の病気の原因となる
感染性作用物質に関するものであることを特徴とする。 - 【請求項３９】 請求項３８に記載の方法であって、上
記感染性作用物質が、ヒトの免疫不全症ウイルス（HI
V）、B型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、
インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、 Corynebac
tcm diphtheriae（ジフテリア菌）、Bordetella pertus
sis（百日咳菌）、Plasmodium属、Schistosoma属、Leis
hmania属、Trypanasoma属、或いは Mycobacterium lepr
e（癩菌）であることを特徴とする。 - 【請求項４０】 請求項１に記載の調製品であって、上
記切片が、本質的に表1-10のいずれかに提示されている
配列の１つからなることを特徴とする。 - 【請求項４１】 非対立遺伝子的制限の免疫調節ペプチ
ドの同定方法であって、上記方法が以下の事項からなる
ことを特徴とする。 （a）第一のMHC クラスIIアロタイプから溶離されるペ
プチドの混合物を分画し、 （b）上記混合物から自己ペプチドを同定して、 （C）上記自己ペプチドが第二の MHCクラスIIアロタイ
プに結合するかどうかを検査し、当該結合は、自己ペプ
チドが非対立遺伝子的制限の免疫調節ペプチドであるこ
との表示である。 - 【請求項４２】 潜在的な免疫調節ペプチドを同定する
方法であって、上記方法が以下の事項からなることを特
徴とする。 （a）MHC のクラスII分子を表面上に発現する細胞を提
供し、 （b）上記細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導
入し、 （c）上記の候補ペプチドに結合する上記クラスII分子
の比率が、上記核酸の非存在下に結合する比率と比較し
て、上記核酸の存在下に増大するかどうかを測定し、上
記増大は、上記候補ペプチドが潜在的な免疫調節ペプチ
ドであることの表示である。 - 【請求項４３】 潜在的な免疫調節ペプチドを同定する
方法であって、上記方法が以下の事項からなることを特
徴とする。 （a）MHC のクラスII分子を表面上に発現する細胞を提
供し、 （b）上記細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導
入し、 （c）上記細胞の表面上の MHCのクラスII分子のレベル
が、上記核酸の非存在下の上記分子のレベルと比較し
て、上記核酸の存在下に減少するかどうかを測定し、上
記減少は、上記候補ペプチドが潜在的な免疫調節ペプチ
ドであることの表示である。 - 【請求項４４】 非対立遺伝子的に制限された免疫調節
ペプチドを同定する方法であって、上記方法が以下の事
項からなることを特徴とする。 （a）第一のMHCのクラスＩ、或いはクラスIIアロタイプ
を保持する細胞を提供し、上記細胞が病原体で感染さ
れ、 （b）上記細胞の第一のMHCアロタイプに結合するペプチ
ドの混合物を溶離し、 （c）上記混合物から候補ペプチドを同定し、上記候補
ペプチドが上記病原体からのタンパク質の断片であり、 （d）上記候補ペプチドが第二のMHCアロタイプに結合す
るかどうかを検査し、上記結合は、上記候補ペプチドが
非対立遺伝子的に制限された免疫調節ペプチドであるこ
との表示である。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003035576A JP2003289887A (ja) | 2003-02-13 | 2003-02-13 | 免疫調節ペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003035576A JP2003289887A (ja) | 2003-02-13 | 2003-02-13 | 免疫調節ペプチド |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6506181A Division JPH08502244A (ja) | 1992-08-11 | 1992-08-11 | 免疫調節ペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003289887A true JP2003289887A (ja) | 2003-10-14 |
Family
ID=29244425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003035576A Pending JP2003289887A (ja) | 2003-02-13 | 2003-02-13 | 免疫調節ペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003289887A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010500308A (ja) * | 2006-08-11 | 2010-01-07 | ライフ・サイエンシーズ・リサーチ・パートナーズ・フェレニゲング・ゾンデル・ウィンストーメルク | 免疫原性ペプチドおよび免疫障害におけるその使用 |
-
2003
- 2003-02-13 JP JP2003035576A patent/JP2003289887A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010500308A (ja) * | 2006-08-11 | 2010-01-07 | ライフ・サイエンシーズ・リサーチ・パートナーズ・フェレニゲング・ゾンデル・ウィンストーメルク | 免疫原性ペプチドおよび免疫障害におけるその使用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3491896B2 (ja) | 免疫調節ペプチド | |
| EP0671926B1 (en) | Immunomodulatory peptides | |
| JPH08502244A (ja) | 免疫調節ペプチド | |
| WO1994004171A9 (en) | Immunomodulatory peptides | |
| EP3352782B1 (en) | Improved methods and compounds for eliminating immune responses to therapeutic agents | |
| US9861661B2 (en) | Elimination of immune responses to viral vectors | |
| JP2002520000A (ja) | 免疫応答を刺激するための発現ベクターおよびそのベクターの使用方法 | |
| JP2003510094A (ja) | Ｍｕｃ−１由来のペプチド | |
| EP0762891A1 (en) | Immunogenic pharmaceuticals | |
| JP5189094B2 (ja) | 無差別ｐａｐｃｄ４ｔ細胞エピトープ | |
| US6156316A (en) | Oncogene fusion protein peptide vaccines | |
| JPH10212300A (ja) | ペプチドワクチン | |
| JP2003289887A (ja) | 免疫調節ペプチド | |
| JP5189593B2 (ja) | 無差別ＨＥＲ−２／ＮｅｕＣＤ４Ｔ細胞エピトープ | |
| JP7505788B2 (ja) | Ｃ９ｏｒｆ７２に由来するジペプチドリピートタンパク質に対して指向化されたペプチド免疫原コンストラクト | |
| JP2004508340A (ja) | Ｈｌａ結合ペプチドおよびその使用方法 | |
| MXPA98007702A (en) | Location peptides of locus hla-a2.1 and its u | |
| AU2013263773A1 (en) | Elimination of immune responses to viral vectors | |
| EP1562622A2 (en) | Immunogenic epitopes for fibroblast growth factor 5 (fgf-5) presented by hla-a3 and hla-a2 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20031127 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040226 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050413 |