JP5189094B2 - 無差別papcd4t細胞エピトープ - Google Patents
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Description
本願は、2006年8月11日に出願された米国仮特許出願第60/837,053号に対する優先権を主張するものであり、米国仮特許出願第60/837,053号の内容はその全体が本明細書中に参考として援用される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
15〜18アミノ酸よりなり、配列番号1のアミノ酸配列を含む単離されたペプチド。
(項目2)
非相同ポリペプチドに融合した項目1記載のペプチドを含む融合ペプチド。
(項目3)
項目1に記載のペプチドがペプチド結合を介して非相同ポリペプチドに融合されている項目2記載の融合ペプチド。
(項目4)
少なくとも10個の異なるHLA−DR対立遺伝子の抗原提示細胞により提示された場合にヒト前立腺性酸性ホスファターゼ(PAP)蛋白に対して特異的なT細胞免疫応答を誘導する項目1又は2記載のペプチド。
(項目5)
少なくとも15個の異なるHLA−DR対立遺伝子の抗原提示細胞により提示された場合にPAP蛋白に対して特異的なT細胞免疫応答を誘導する項目4記載のペプチド。
(項目6)
HLA−DR対立遺伝子が0101、0102、0103、1503、160201、0301、0302、0401、0402、040301、040501、1101、1102、1103、1104、110401、1201、1301、1302、1401、1402、0701、080101、080201及び0901よりなる群から選択される項目4記載のペプチド。
(項目7)
配列番号1のアミノ酸配列を有する項目1記載のペプチド。
(項目8)
前記非相同ポリペプチドが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)である項目2記載のペプチド。
(項目9)
項目1又は3に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
(項目10)
前記ポリヌクレオチド配列が項目7又は8に記載のペプチドをコードする項目9記載の核酸。
(項目11)
項目9に記載の核酸を含む発現カセット。
(項目12)
組み換えウィルスベクターである項目11記載の発現カセット。
(項目13)
項目7又は8に記載のペプチドの発現を指向する項目11記載の発現カセット。
(項目14)
項目11又は12に記載の発現カセットを含む宿主細胞。
(項目15)
項目1又は2に記載のペプチド及び生理学的に許容しうる賦形剤を含む組成物。
(項目16)
前記ペプチドが配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する項目15記載の組成物。
(項目17)
非相同ポリペプチドが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)である項目15記載の組成物。
(項目18)
細胞の表面上の主要組織適合性複合体(MHC)分子と複合体を形成する項目1記載のペプチドを有する抗原提示細胞を更に含む項目15記載の組成物。
(項目19)
ヒト前立腺性酸性ホスファターゼ(PAP)蛋白に対して特異的なT細胞免疫応答を患者において誘導するための方法であって、該方法が該患者に項目15に記載の組成物の有効量を投与する工程を含む方法。
(項目20)
非相同ポリペプチドが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)である項目19記載の方法。
(項目21)
ヒト前立腺性酸性ホスファターゼ(PAP)蛋白に対して特異的なT細胞免疫応答を患者において検出するための方法であって、該方法は、(a)患者から抗原提示細胞及びT細胞を得る工程;(b)該抗原提示細胞及びT細胞を項目1又は2記載のペプチドに接触させる工程;及び(c)T細胞応答を検出する工程であって、ここでT細胞応答の該検出は該患者における該PAP蛋白に対して特異的なT細胞免疫応答の存在を示すものである工程、を含む方法。
(項目22)
工程(c)がELISPOT、増殖試験、又はフローサイトメトリーにより実施される項目21記載の方法。
(項目23)
前記ペプチドが配列番号1のアミノ酸配列を有する項目21記載の方法。
「単離された」という用語は、核酸又は蛋白に適用する場合、核酸又は蛋白が、それが天然の状態で会合している他の細胞成分を本質的に含有しないことを指す。それは乾燥又は水溶液の何れかであることもできるが、好ましくは均質な状態である。純度及び均質性は典型的には分析化学の手法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを用いて測定する。調製品中に存在する主な物質種である蛋白は実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は該遺伝子の側面に位置し目的の遺伝子以外の蛋白をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は核酸又は蛋白が電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じさせることを指す。特にこのことは核酸又は蛋白が少なくとも85%純粋、より好ましくは少なくとも95%純粋、そして最も好ましくは少なくとも99%純粋であることを意味する。
I.序論
本発明者等はヒトの前立腺性酸性ホスファターゼ(PAP)蛋白に由来する新規な無差別性のT細胞エピトープを発見した。これらのペプチドエピトープは、それらが少なくとも9種の異なるHLA−DR血清学的ファミリーおよび少なくとも15種の異なるHLA−DRβ1対立遺伝子に関して提示され得ることから、顕著なHLA無差別性を呈している。そのような広範なHLA−DRβ1対立遺伝子によるこれらのエピトープの提示のため、これらのエピトープは、一般的なヒトの集団におけるPAP蛋白を過剰発現する前立腺癌の治療のためのワクチン製造又は免疫療法におけるユニバーサルCD4 ヘルパーT細胞エピトープとして極めて価値あるものとなっている。
II.ペプチドの化学合成
本発明のペプチド、特に比較的短鎖のもの(例えば50〜100アミノ酸以下)は従来のペプチド合成又は当該分野で良く知られている他のプロトコルを用いて化学合成してよい。
III.ペプチドの組み換え生産
A.一般的な組み換え技術
組み換え遺伝子学の分野における一般的な方法及び手法を開示している基礎的なテキストはSambrook and Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3rd ed.2001);Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990);及びAusubel等編、Current Protocols in Molecular Biology(1994)を包含する。
B.発現カセットの構築
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の獲得
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は化学合成により得ることができ、あるいは、市販元より購入することができ、そしてこれを次に分子クローニングの標準的な手法を用いながらさらに操作してよい。
宿主生物における好ましいコドン使用のための核酸の修飾
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は場合により特定の宿主における好ましいコドンの使用に合致するように任意に改変することができる。例えば、細菌細胞の1つの系統における好ましいコドンの使用は、本発明のペプチドをコードし、この系統により好まれるコドンを包含するポリヌクレオチドを誘導するために使用できる。宿主細胞により示される好ましいコドンの使用の頻度は、宿主細胞により発現される遺伝子の大多数における好ましいコドンの使用の頻度を平均することにより計算できる(計算サービスはKazusa DNA Research Institute,Japanのウエブサイトから利用できる)。この分析は好ましくは宿主細胞により高度に発現される遺伝子に限定される。
C.発現系
本発明のペプチドをコードする核酸の高レベルの発現を実現するためには、典型的には、転写を指向する強力なプロモーター、転写/翻訳ターミネーター、及び翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクター内にペプチドをコードするポリヌクレオチドをサブクローニングする。適当な細菌プロモーターは当該分野で周知であり、上記したSambrook and Russell及び上記したAusubel等において説明されている。本発明のペプチドを発現させるための細菌の発現系は例えばE.coli、バチルス種、サルモネラ及びカウロバクターにおいて入手できる。そのような発現系のためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母及び昆虫細胞に対する真核生物の発現系は当該分野で周知であり、やはり市販されている。1つの実施形態において、真核生物発現ベクターはアデノウィルスベクター、アデノ関連ベクター、又はレトロウィルスベクターである。
C.トランスフェクション法
標準的なトランスフェクション法を用いて本発明のペプチドを大量に発現する細菌、哺乳類、酵母、昆虫、又は植物の細胞系統を作成し、それを次に標準的な手法で精製する(例えばColley等、J.Biol.Chem.264:17619−17622(1989);Guide to Protein Purification,in Methods in Enzymology,vol.182(Deutscher,ed.,1990)参照)。真核生物及び原核生物の細胞の形質転換は標準的手法に従って実施する(例えばMorrison,J.Bact.132:349−351(1977);Clark−Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology 101:347−362(Wu等編、1983)参照)。
D.宿主細胞内のペプチドの組み換え発現の検出
適切な宿主細胞内に発現ベクターを導入した後、トランスフェクトした細胞を本発明のペプチドの発現に好都合な条件下で培養する。次に組み換えペプチドの発現に関して細胞をスクリーニングし、これはその後、標準的方法を用いて培地から回収する(例えばScopes,Protein Purification:Principles and Practice(1982);米国特許第4,673,641号明細書;Ausubel等、上出;及びSambrook and Russell,上出参照)。
IV.ペプチドの精製
A.化学的に合成されたペプチドの精製
合成ペプチドの精製はクロマトグラフィーの種々の方法、例えば逆相HPLC、ゲル透過、イオン交換、サイズエクスクルージョン、アフィニティー、分配、又は向流分配を用いて実施される。適切なマトリックス及び緩衝物質の選択は当該分野で周知である。
B.組み換え生産されたペプチドの精製
1.細菌封入体からのペプチドの精製
発現は構成的なものとなるが、典型的にはプロモーター導入後に大量の形質転換された細菌から本発明のペプチドを組み換えにより製造する場合、ペプチドは不溶性の凝集塊を形成する場合がある。蛋白封入体の精製のために適当である数種のプロトコルが存在する。例えば凝集塊蛋白(以下、封入体と称する)の精製では典型的には例えば約100〜150μg/mlリゾチーム及び0.1% Nonidet P40(非イオン系界面活性剤)の緩衝液中のインキュベーションによる細菌細胞の破壊により、封入体の抽出、分離及び/又は精製を行う。細胞懸濁液はポリトロン粉砕機(Brinkman Instruments,Westbury,NY)を用いて粉砕できる。或いは、細胞は氷上で超音波処理できる。細菌を溶解する代替方法はともに上出のAusubel等、及びSambrook and Russellに記載されており、当業者に明らかである。
2.精製のための標準的な蛋白分離手法
組み換えポリペプチド、例えば本発明のペプチドを可溶性形態で宿主細胞内に発現させる場合、その精製は以下に記載する標準的な蛋白精製操作法に従うことができる。この標準的精製操作法は又、化学合成により得られたペプチドを精製するためにも適している。
i.溶解度分画
多くの場合初期工程として、そして蛋白混合物が複合体である場合、初期の塩分画は目的の組み換え蛋白、例えば本発明のペプチドから望ましくない宿主細胞蛋白(又は細胞培養用の培地から誘導される蛋白)の多くを分離することができる。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは蛋白混合物中の水の量を効果的に低減することにより蛋白を沈殿させる。次に蛋白がその溶解度に基づいて沈殿する。蛋白が疎水性であるほど、より低い硫酸アンモニウム濃度において沈殿する可能性が高まる。典型的なプロトコルは結果として生じる硫酸アンモニウム濃度が20〜30%となるように蛋白溶液に飽和硫酸アンモニウムを添加することである。これにより大部分の疎水性蛋白が沈殿することになる。沈殿を廃棄(目的の蛋白が疎水性でない限り)し、目的蛋白を沈殿させることが分かっている濃度となるまで硫酸アンモニウムを上澄みに添加する。次に沈殿を緩衝液中に可溶化し、必要に応じて過剰な塩を透析又は透析濾過により除去する。蛋白の溶解度に依存している他の方法、例えば低温エタノール沈殿等は当業者に周知であり、複合体蛋白混合物を分画するために使用できる。
ii.サイズ示差濾過
計算された分子量に応じて、より大きい及び小さいサイズの蛋白を異なる孔径の膜(例えばAmicon又はMilliporeメンブレン)を通過させる限外濾過を用いて単離できる。第1の工程として、目的の蛋白、例えば本発明のペプチドの分子量より低値の分子量カットオフを有する孔径の膜を通過させて蛋白混合物を限外濾過する。次に限外濾過の保持物を、目的のペプチドの分子量より大きい分子カットオフを有する膜に対して限外濾過する。組み換え蛋白は膜を通過して濾液中に入ることになる。次に濾液を後述する通りクロマトグラフィーに付すことができる。
iii.カラムクロマトグラフィー
目的の蛋白(例えば本発明のペプチド)は又そのサイズ、実質的表面電荷、疎水性、又はリガンドに対する親和性に基づいて他の蛋白から分離できる。更に又、本発明のペプチドに対して作成された抗体をカラムマトリックスに結合し、ペプチドを免疫精製することもできる。これらの方法は全て当該分野で周知である。
C.ペプチド配列の確認
本発明のペプチドのアミノ酸配列は多くの十分に確立された方法により確認できる。例えばEdman分解の従来法を用いてペプチドのアミノ酸配列を決定できる。Edman分解に基づく配列決定法の数種の変形例、例えばマイクロ配列決定、及び質量分析に基づく方法がこの目的のために頻繁に使用されている。
D.ペプチドの修飾
本発明のペプチドはより望ましい特性を達成するために修飾できる。化学修飾されたペプチド及び蛋白分解酵素による分解に対して抵抗性であるか向上した溶解性又は結合能力を有するペプチド模倣体の設計はよく知られている。
V.非相同ポリペプチドとのPAPエピトープの融合
本発明の1つの態様において、無差別PAPエピトープに相当するペプチドは、T細胞応答を誘導するPAPエピトープの能力が増強されるように共有結合を介して非相同ポリペプチドに結合させることにより、融合ペプチドを形成する。頻繁にはこの共有結合はペプチド結合であり、そしてPAPエピトープ及び非相同ポリペプチドは新しいポリペプチドを形成する。このペプチド結合はPAPエピトープと非相同ポリペプチドの間の直接のペプチド結合であってよく、或いはそれはPAPエピトープと非相同ポリペプチドの間のペプチドリンカーを用いて与えられる間接のペプチド結合であってよい。
VI.機能的試験
本発明の無差別PAPエピトープ(又はPAPペプチドと非相同ポリペプチドを含む融合ペプチド)は、少なくとも10種の異なるHLA−DR対立遺伝子、より好ましくは少なくとも12、13、14又は15種の異なるHLA−DR対立遺伝子の1つを有する場合がある抗原提示細胞によりエピトープが提示される場合に、PAP蛋白に特異的なT細胞免疫応答を誘導するその能力のために有用である。種々の機能的試験を用いることにより、種々の異なるHLA−DR対立遺伝子の抗原提示細胞に関して無差別性の態様におけるそのようなPAP特異的T細胞免疫応答を誘導する無差別PAPエピトープの能力を確認することができ、例えば増殖試験及びフローサイトメトリー試験によりT細胞受容体とペプチドエピトープの間の結合又はT細胞によるサイトカインの生産を検出する方法などが挙げられる。
VII.組成物及び投与
本発明は更に有効量の(1)無差別PAPペプチド;又は(2)PAPペプチドと非相同ポリペプチドを含む融合ペプチド;又は(3)予防及び治療の両方の用途におけるPAP蛋白に対して特異的なT細胞免疫応答を誘導するための細胞表面上のMHC分子との複合体を形成する(1)又は(2)のペプチドを伴った抗原提示細胞(APC)を含む組成物を提供する。本発明の医薬組成物は種々の薬物送達系における使用に適している。本発明で使用するための適当な製剤はRemington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA,17th ed.(1985)に記載されている。薬物送達方法に関する簡単な考察については、Langer,Science 249:1527−1533(1990)を参照されたい。
VIII.PAPに対して特異的なT細胞応答を検出するための方法
本発明は更にPAP蛋白に対して特異的なT細胞免疫応答が患者に存在するかどうかを検出するための方法を提供する。この方法は以下の工程を含む:第1に、リンパ球、例えば少なくともT細胞、及び抗原提示細胞を患者から入手する。そのようなリンパ球が得られる適当な試料は血液、腫瘍浸潤液、及びリンパ節又はリンパ液を包含する。第2にT細胞に対する抗原提示細胞によってT細胞エピトープの適切な提示を可能とする条件下で、本発明の無差別PAPペプチド(又はPAPペプチドと非相同ペプチドを含む融合ペプチド)にT細胞及び抗原提示細胞を曝露する。第3に、T細胞応答のサインを、当該分野で周知の手段、例えばELISPOT、増殖試験、又はフローサイトメトリーによりインビトロで計測する。T細胞応答がこれらの方法の何れかにより検出される場合、患者においてPAP蛋白に対して特異的なT細胞免疫応答が存在すると結論付けることができる。
(実施例1)
材料及び方法
組み換え蛋白及び合成ペプチド。PA2024は、治験細胞免疫療法sipuleucel−TのためにDendreon Corporationにより製造された、PAPおよびGM−CSF配列を含むDendreon Corporationが所有する組換え融合蛋白である。PA2024は、バキュロウイルスの系において発現させた。CHOPA2024およびhPAPGMは、PA2024に同一の配列であるが、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞(CHO)および293Ebnaをそれぞれ用いる哺乳動物系において発現させた。iPAPはバキュロウイルス発現系において生成される組換え蛋白であり、そしてCHOPAPは哺乳動物細胞において生成される組換え蛋白であり、両者をDendreon Corporationが生成、そして精製した。インビトロにおけるPAP特異的免疫応答を定義するために、PAP蛋白配列から94ペプチドを作成した。これらのペプチドは15アミノ酸長であり、11アミノ酸分オーバーラップしている(Genemed Synthesis,South San Francisco,CA)。全てのPAPペプチドを配列決定し、そして分析用HPLCおよび質量スペクトル分析により>95%純度であることが測定された。
図1〜3に示した実験結果は、ペプチドPAP257−271が、前立腺性酸性ホスファターゼ(PAP)の、天然にプロセスされたMHCクラスII制限無差別エピトープであることを示した。このペプチドは、配列番号1に示したアミノ酸配列(RLQGGVLVNEILNHM)を有し、15を超える異なるHLA−DRβ1対立遺伝子を有する9つの異なるHLA−DR血清学的ファミリー(β鎖;DR1、DR4、DR7、DR8、DR11、DR12、DR13、DR14、およびDR15)を示すリンパ芽球細胞系統により提示される場合、T細胞活性化を誘導することができる。
配列表
配列番号1 (ヒトPAP蛋白の残基257−271)
RLQGGVLVNEILNHM
配列番号2 (ヒトPAP蛋白の残基254−274)
EKSRLQGGVLVNEILNHMKRA
Claims (23)
- 15〜18アミノ酸よりなり、配列番号1のアミノ酸配列を含む単離されたペプチド。
- 非相同ポリペプチドに融合した請求項1記載のペプチドを含む融合ペプチド。
- 請求項1に記載のペプチドがペプチド結合を介して非相同ポリペプチドに融合されている請求項2記載の融合ペプチド。
- 少なくとも10個の異なるHLA−DR対立遺伝子の抗原提示細胞により提示された場合にヒト前立腺性酸性ホスファターゼ(PAP)蛋白に対して特異的なT細胞免疫応答を誘導する請求項1又は2記載のペプチド。
- 少なくとも15個の異なるHLA−DR対立遺伝子の抗原提示細胞により提示された場合にPAP蛋白に対して特異的なT細胞免疫応答を誘導する請求項4記載のペプチド。
- HLA−DR対立遺伝子が0101、0102、0103、1503、160201、0301、0302、0401、0402、040301、040501、1101、1102、1103、1104、110401、1201、1301、1302、1401、1402、0701、080101、080201及び0901よりなる群から選択される請求項4記載のペプチド。
- 配列番号1のアミノ酸配列からなる請求項1記載のペプチド。
- 前記非相同ポリペプチドが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)である請求項2記載のペプチド。
- 請求項1又は3に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
- 前記ポリヌクレオチド配列が請求項7又は8に記載のペプチドをコードする請求項9記載の核酸。
- 請求項9に記載の核酸を含む発現カセット。
- 組み換えウィルスベクターである請求項11記載の発現カセット。
- 請求項7又は8に記載のペプチドの発現を指向する請求項11記載の発現カセット。
- 請求項11又は12に記載の発現カセットを含む宿主細胞。
- 請求項1又は2に記載のペプチド及び生理学的に許容しうる賦形剤を含む組成物。
- 前記ペプチドが配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する請求項15記載の組成物。
- 非相同ポリペプチドが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)である請求項15記載の組成物。
- 細胞の表面上の主要組織適合性複合体(MHC)分子と複合体を形成する請求項1記載のペプチドを有する抗原提示細胞を更に含む請求項15記載の組成物。
- ヒト前立腺性酸性ホスファターゼ(PAP)蛋白に対して特異的なT細胞免疫応答を患者において誘導するための組成物であって、有効量の請求項15に記載の組成物を含む組成物。
- 非相同ポリペプチドが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)である請求項19記載の組成物。
- ヒト前立腺性酸性ホスファターゼ(PAP)蛋白に対して特異的なT細胞免疫応答を検出するための方法であって、該方法は、(a)患者試料由来の抗原提示細胞及びT細胞を請求項1又は2記載のペプチドに接触させる工程;及び(b)T細胞応答を検出する工程であって、ここでT細胞応答の該検出は該PAP蛋白に対して特異的なT細胞免疫応答の存在を示すものである工程、を含む方法。
- 工程(b)がELISPOT、増殖試験、又はフローサイトメトリーにより実施される請求項21記載の方法。
- 前記ペプチドが配列番号1のアミノ酸配列を有する請求項21記載の方法。
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