KR20180101417A - 항원-특이적 cd8+ t 세포의 제조에서 인터루킨-10 및 이의 사용 방법 - Google Patents

항원-특이적 cd8+ t 세포의 제조에서 인터루킨-10 및 이의 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20180101417A
KR20180101417A KR1020187021225A KR20187021225A KR20180101417A KR 20180101417 A KR20180101417 A KR 20180101417A KR 1020187021225 A KR1020187021225 A KR 1020187021225A KR 20187021225 A KR20187021225 A KR 20187021225A KR 20180101417 A KR20180101417 A KR 20180101417A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
tcr
cell
beta
alpha
Prior art date
Application number
KR1020187021225A
Other languages
English (en)
Inventor
존 브라이언 멈
이반 호 찬
스코트 맥컬리
스코트 오그
마틴 오프트
Original Assignee
아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드 filed Critical 아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드
Publication of KR20180101417A publication Critical patent/KR20180101417A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2066—IL-10
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464401—Neoantigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/49—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/50—Colon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 명세서는 질병 항원-특이적 T 세포 수용체를 발현시키는 단리된 CD8+ T 세포, 뿐만 아니라 이러한 질병 항원-특이적 T 세포의 T 세포 수용체들 (TCRs)의 Vα및 Vβ 폴리펩티드 쌍을 인코딩하는 핵산과 관련된 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포는 IL-10 제제로 치료하기 쉬운 질병에 걸린 대상체의 말초부 (예컨대, 혈액)로부터 얻을 수 있다. 본 명세서는 또한 대상체에 대한 단리된 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포의 투여에 관련된 치료 방법 및 조성물, 뿐만 아니라 질병 항원-특이적 TCR 및/또는 키메라 항원 수용체를 발현시키도록 유전자 변형된 CD8+ T 세포에 관련된 치료 방법 및 조성물을 고려한다.

Description

항원-특이적 CD8+ T 세포의 제조에서 인터루킨-10 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 1월 11일 출원된 미국 가특허출원 제 62/277,442호의 우선권의 이익을 주장하며, 이 출원은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 항원-특이적 CD8+ T 세포를 유도하기 위해 IL-10 제제를 사용하는 방법에 관한 것이다.
도입
사이토카인 인터루킨-10 (IL-10)은 T 세포, B 세포, 대식세포, 및 항원 제시 세포 (APC)에 대한 작용을 통해 다수의 면역 반응들을 조절하는 다면발현성 사이토카인이다. IL-10은 활성화된 단핵구 및 활성화된 대식세포에서 IL-1α, IL-1β, GM-CSF 및 G-CSF의 발현을 억제함으로써 면역 반응들을 억제할 수 있으며, 이는 또한 NK 세포에 의한 IFN-γ생성을 억제한다. IL-10은 대식세포에서 우세하게 발현되지만, 활성화된 T 세포, B 세포, 비만 세포, 및 단핵구에서의 발현 또한 검출된 바 있다. 면역 반응들을 억제하는 것 이외에도, IL-10은 IL-2 - 및 IL-4 - 처리된 흉선세포의 증식 자극, B 세포의 생존력 향상, 및 MHC 클래스 II 발현의 자극을 비롯한 면역-자극 성질들을 보여준다.
인간 IL-10은 동종이량체로서 2개의 단량체 소단위들 사이의 비-공유적 상호작용들의 파괴시 생물학적으로 불활성이 된다. 공개된 IL-10의 결정 구조로부터 얻은 데이터는 기능적 이량체가 IFN-γ와 특정한 유사성을 보여줌을 나타낸다 (Zdanov 외, (1995) 구조 (Lond) 3:591-601).
IL-10은 분류적으로 면역 억제성 사이토카인으로 정의되어 왔다 (de Waal Malefyt 외. J Exp Med, 1991. 174(5): p. 1209-20; de Waal Malefyt 외., J Exp Med, 1991. 174(4): p. 915-24). 최근의 증거는 이러한 사이토카인의 페길화 형태가 면역-종양학과 관련하여 면역자극 효과를 발휘함을 명확하게 보여준다 (Emmerich 외. Cancer Res, 2012. 72(14): p. 3570-81; Mumm 외., Cancer Cell, 2011. 20(6): p. 781-96). 이러한 항-종양 효과의 특이적 메커니즘은 CD8+ T 세포 및 내인성 IFNγ 모두를 필요로 하는 것으로 밝혀졌다 (Mumm 외., supra). 구체적으로, IL-10/PEG-IL-10에 대한 CD8+ T 세포 노출은 IFNγ, 그랜자임 B 및 퍼포린 분비의 강화작용을 초래한다. IFN 및 그랜자임 B 모두의 분비는 동족 MHC I/항원 복합체와 함께 T 세포 수용체 참여여부에 따라 달라진다 (Chan 외, J 인터페론 Cytokine Res, 2015, 35(12): 948-955).
그 다면발현 활성으로 인해, IL-10은 염증성 병태, 면역-관련 장애, 섬유증 장애, 대사 장애 및 암을 비롯한 광범위한 질병, 장애 및 병태와 연관되어 왔다. 이러한 수많은 질병, 장애 및 병태에 대한 IL-10의 임상 및 전-임상 평가는 이의 치료가능성을 확고히 하였다.
PEG-rHuIL-10 (AM0010) 단일요법을 이용한 인간 암 환자들의 치료는 그랜자임 B+ 종양내 CD8+ T 세포 침윤의 실질적 증가로 특징되는 실질적인 항-종양 반응들울 초래한다. 이러한 활성화된 CD8+ 종양내 T 세포 침윤에 부수적으로, 혈청 사이토카인 IFNγ, IL-18, IL-7, IL-4, GM-CSF 및 활성화된 T 세포 표지자 FasL은 재생가능하게 증가한다 (Infante, 외., ASCO 발표회 초록, 2015. 33(15_suppl): p. 3017). 이들 사이토카인들은 광범위한 스펙트럼의 면역 활성화의 특징이다.
요약
본 명세서는 질병 항원-특이적 T 세포 수용체를 발현시키는 단리된 CD8+ T 세포, 뿐만 아니라 이러한 질병 항원-특이적 T 세포의 T 세포 수용체들 (TCRs)의 Vα및 Vβ 폴리펩티드 쌍을 인코딩하는 핵산과 관련된 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포는 IL-10 제제로 치료하기 쉬운 질병에 걸린 대상체의 말초부 (예컨대, 혈액)로부터 얻을 수 있다. 본 명세서는 또한 대상체에 대한 단리된 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포의 투여에 관련된 치료 방법 및 조성물, 뿐만 아니라 질병 항원-특이적 TCR 및/또는 키메라 항원 수용체를 발현시키도록 유전자 변형된 CD8+ T 세포에 관련된 치료 방법 및 조성물을 고려한다.
본 명세서는 다음 단계를 포함하는, 질병 항원-특이적 T 세포의 TCR의 가변 알파 (Vα) T 세포 수용체 (TCR) 폴리펩티드 및/또는 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드를 식별하는 방법을 제공한다: IL-10 제제 요법이 잘 듣는 질병에 걸린 대상체에게 IL-10 제제를 투여하는 단계; 대상체로부터 얻은 하나 이상의 CD8+ T 세포를 내포하는 샘플의 핵산들을 시퀀싱(sequencing)하는 단계, 이 때 상기 시퀀싱 단계는 가변 알파 (Vα) TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들 및/또는 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들을 시퀀싱하는 단계를 포함하며; 그리고 Vα TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들의 존재량을, IL-10 제제 요법 전 또는 IL-10 제제 요법을 하는 중 조기 시점에 IL-10 제제 요법이 잘 듣는 질병에 걸린 하나 이상의 환자들로부터 얻은 기준 샘플에서의 Vα TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들의 존재량과 비교하는 단계; 여기서 기준 샘플에서보다 많은 존재량으로 샘플에 존재하는 Vα 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드들은 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포에 특이적인 Vα/Vβ TCR 폴리펩티드 쌍을 나타낸다.
또한 본 명세서는 다음 단계를 포함하는, 질병 항원-특이적 T 세포의 TCR의 가변 알파 (Vα) T 세포 수용체 (TCR) 폴리펩티드 및 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터의 생성 방법을 제공한다: IL-10 제제 치료가 잘 듣는 질병을 위해 IL-10 제제 요법을 투여받았던 대상체로부터 얻은 하나 이상의 CD8+ T 세포를 내포하는 샘플의 핵산들을 시퀀싱하는 단계, 여기서 CD8+ T 세포는 가변 알파 (Vα) TCR 폴리펩티드 및 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 질병 항원-특이적 T 세포 수용체 (TCR)를 발현시키며; 그리고 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포의 TCR의 Vα 및 Vβ TCR 폴리펩티드 쌍을 인코딩하는 핵산들을 하나 이상의 작제물들에 클로닝하여, 질병 항원-특이적 TCR의 Vα 및 Vβ TCR 폴리펩티드들 중 하나 또는 모두를 인코딩하는 벡터를 생성하는 단계, 여기서 IL-10 제제 요법 전 또는 IL-10 제제 요법 중 조기 시점에 IL-10 제제 요법이 잘 듣는 질병에 걸린 하나 이상의 환자들로부터 얻은 기준 샘플에서 보다 더 많은 존재량으로 샘플에 존재하는 Vα 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드들은 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포의 Vα/Vβ TCR 폴리펩티드 쌍을 나타낸다.
임의의 구체예에서, 대상체는 IL-10 제제 요법에 대해 최소한 안정성 질병 또는 최소한 부분 반응을 나타낼 수 있다. 일부 구체예들에서, 대상체는 IL-10 제제 요법에 대해 최소한 부분 반응을 나타낸다.
임의의 구체예들에서, 샘플에 PD1+, CD8+ T 세포가 풍부할 수 있다. 일부 구체예들에서, PD1+, CD8+ T 세포는 세포 표면 PD1을 최소한 PD1+ 중간 수준으로 발현시킨다. 일부 구체예들에서, PD1+, CD8+ T 세포는 세포 표면 PD1을 최소한 PD1+ 고 수준으로 발현시킨다.
임의의 구체예에서, 샘플에 CD45RO+, CD8+ T 세포가 풍부할 수 있다. 임의의 구체예에서, 샘플에 IFNγ+,CD8+ T 세포가 풍부할 수 있다. 일부 구체예들에서, 샘플에 IFN γ+,CD45RO+, CD8+ T 세포가 풍부할 수 있다. 일부 구체예들에서, 샘플에 IFN γ+,PD1+, CD8+ T 세포가 풍부할 수 있다. 일부 구체예들에서, 샘플에 PD1+, CD45RO+, CD8+ T 세포가 풍부할 수 있다. 일부 구체예들에서, 샘플에 IFN γ+,CD45RO+, PD1+, CD8+ T 세포가 풍부할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 IFN γ+발현을 자극하기 위하여 CD8+ T 세포를 CD3 효능제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, CD3 효능제는 항-CD3 항체이다.
임의의 구체예에서, 샘플은 대상체의 말초 혈액, 림프, 또는 종양으로부터 유래한 것일 수 있다.
임의의 구체예에서, 샘플에 PD1+, IFN γ+, CD45RO+, 그랜자임 B+, 및/또는 퍼포린+인 CD8+ T 세포가 풍부할 수 있다.
임의의 구체예에서, 하나 이상의 환자들은 대상체를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 환자들은 대상체이다.
임의의 구체예에서, 상기 방법은 Vα TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 시퀀싱하는 단계; Vα TCR 폴리펩티드 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드의 최소한 상보성 결정 영역들 (CDRs)의 아미노산 서열들을 결정하는 단계; 및 Vα TCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들의 존재량을, IL-10 제제 요법 전 또는 IL-10 제제 요법을 하는 중 조기 시점에 IL-10 제제 요법이 잘 듣는 질병에 걸린 하나 이상의 환자들로부터 얻은 기준 샘플에서의 Vα TCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들의 존재량과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
임의의 구체예에서, 상기 방법은 질병 항원-특이적 T 세포의 TCR의 가변 알파 (Vα) T 세포 수용체 (TCR) 폴리펩티드 및/또는 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드를 식별하는 상기 어느 하나의 방법의 한 구체예에 따라 단리된 CD8+ T 세포에서 발현된 TCR의 항원 특이성을, 상기 Vα 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드들의 아미노산 서열과 기준 샘플에서의 Vα 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들을 비교함으로써 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
또한 본 명세서는 질병 항원-특이적 T 세포의 t 세포 수용체 (TCR)의 아미노산 서열들을 얻는 방법을 제공하는데, 이 방법은 인터루킨 (IL)-10 제제 요법이 잘 듣는 질병에 걸린 대상체에게 IL-10 제제를 투여하는 단계, 여기서 상기 투여 단계는 대상체에서 최소한 부분 반응을 제공함에 유효하며; IL-10 제제 요법에 최소한 부분 반응을 보이는 대상체의 말초 혈액 림프구 (PBLs)를 얻는 단계; PBLs로부터 PD1+, CD8+ T 세포를 단리하는 단계; 가변 알파 (Vα) TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및/또는 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 시퀀싱하는 단계, 여기서 Vα TCR 폴리펩티드 및 베타 TCR 폴리펩티드는 단리된 PD1+, CD8+ T 세포 표면에서 발현되는 TCR의 Vα/Vβ TCR 쌍이며; 그리고 상기 시퀀싱된 핵산들에 의해 인코딩되는 Vα TCR 폴리펩티드 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들을 결정하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 Vα 및 Vβ TCR 폴리펩티드들은 상기 질병의 항원에 대해 특이적인 Vα/Vβ TCR 폴리펩티드 쌍을 나타낸다.
또한 본 명세서는 다음 단계를 포함하는 질병 항원-특이적 T 세포의 TCR의 가변 알파 (Vα) T 세포 수용체 (TCR) 폴리펩티드 및 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터의 생성 방법을 제공한다: IL-10 제제 치료가 잘 듣는 질병을 위한 IL-10 제제 요법에 대해 최소한 부분 반응을 보이는 대상체의 말초 혈액 림프구 (PBLs)로부터 PD1+, CD8+ T 세포를 단리하는 단계, 여기서 PD1+, CD8+ T 세포는 Vα TCR 폴리펩티드 및 Vβ TCR 폴리펩티드를 내포하는 질병 항원-특이적 TCR을 발현시키며; 그리고 단리된 PD1+, CD8+ T 세포의 TCR의 Vα 및 Vβ TCR 폴리펩티드 쌍을 인코딩하는 핵산들을 하나 이상의 작제물에 클로닝하여, 질병 항원-특이적 TCR의 Vα 및 Vβ TCR 폴리펩티드 중 하나 또는 모두를 인코딩하는 벡터를 생성하는 단계. 일부 구체예들에서, 상기 벡터는 Vα 및 Vβ TCR 폴리펩티드 쌍의 CD8+ T 세포 촉진 발현의 안정한 형질감염에 적합하다. 일부 구체예들에서, Vα TCR 폴리펩티드 및 Vβ TCR 폴리펩티드는 동일한 벡터에 클로닝된다. 일부 구체예들에서, Vα TCR 폴리펩티드 및 VβTCR 폴리펩티드는 전장 알파 TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 그리고 전장 베타 TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공하기 위한 벡터에 클로닝된다. 일부 구체예들에서, Vα TCR 폴리펩티드 및 VβTCR 폴리펩티드는 단쇄 T 세포 수용체 (scTv)를 인코딩하는 핵산을 제공하기 위한 벡터에 클로닝된다. 일부 구체예들에서, scTv는 N-말단으로부터 C-말단으로, VβTCR 폴리펩티드, 링커, 및 Vα TCR 폴리펩티드를 내포한다. 일부 구체예들에서, 벡터는 발현 벡터이다. 일부 구체예들에서, PD1+, CD8+ T 세포의 질병 항원-특이적 TCRs의 Vα 및 VβTCR 폴리펩티드 쌍을 인코딩하는 작제물들의 라이브러리를 제조하기 위하여, 단리된 PD1+, CD8+ T 세포의 TCR의 복수의 Vα/Vβ쌍들의 Vα 및 VβTCR 폴리펩티드를 인코딩하는 복수의 핵산들이 복수의 벡터들에 클로닝된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조된 핵산 벡터들의 라이브러리 또한 제공된다.
임의의 구체예에서, 단리 단계는 IFNγCD45RO+, PD1+, CD8+ T 세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 PBLs 또는 단리된 PD1+, CD8+ T 세포를 CD3 효능제와 접촉시켜 IFNγ발현을 자극하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, CD3 효능제는 항-CD3 항체이다.
임의의 구체예에서, 단리 단계는 CD45RO+, PD1+, CD8+ T 세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다.
임의의 구체예에서, PD1+, CD8+ T 세포는 세포 표면 PD1을 최소한 PD1+ 중간 수준으로 발현시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, PD1+, CD8+ T 세포는 세포 표면 PD1을 최소한 PD1+ 고 수준으로 발현시킨다.
임의의 구체예에서, PD1+, CD8+ T 세포는 IFNγ, CD45RO, 그랜자임 B, 및 퍼포린 중 하나 이상을 발현시킬 수 있다.
임의의 구체예에서, 대상체는 종양을 가질 수 있으며, PD1+, CD8+ T 세포는 종양 항원에 특이적일 수 있다. 일부 구체예들에서, PD1+, CD8+ T 세포는 종양 침윤 림프구일 수 있다. 일부 구체예들에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 구체예들에서, 종양은 자궁, 자궁경부, 유방, 전립선, 고환, 위장관, 신장, 콩팥 세포, 방광, 골, 골수, 피부, 두경부, 간, 쓸개, 심장, 폐, 이자, 침샘, 부신, 갑상선, 뇌, 신경절, 중추신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS)의 암, 또는 조혈계, 비장, 또는 흉선의 암에서 선택된 암의 종양이다. 일부 구체예들에서, 종양은 식도, 입인두, 위, 소장, 대장, 결장, 또는 직장의 암의 종양이다. 일부 구체예들에서, 종양은 흑색종, 결장직장 암, 또는 콩팥 암이다.
임의의 구체예에서, 대상체는 바이러스 감염될 수 있고, PD1+, CD8+ T 세포는 감염 바이러스의 항원에 대해 특이적일 수 있다. 일부 구체예들에서, 바이러스는 헤파드나바이러스, 플라비바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스이다. 일부 구체예들에서, 바이러스는 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV) 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)이다.
임의의 구체예에서, IL-10 제제는 인간 IL-10 일 수 있다.
임의의 구체예에서, IL-10 제제는 페길화 IL-10 (PEG-IL-10) 일 수 있다. 일부 구체예들에서, PEG-IL-10은 IL-10의 최소한 하나의 단량체의 N-말단 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된 최소한 하나의 PEG 분자를 포함한다. 일부 구체예들에서, PEG-IL-10은 모노-페길화 IL-10 및 다이-페길화 IL-10의 혼합물을 포함한다. 일부 구체예들에서, PEG-IL-10의 PEG 요소는 5kDa 내지 30kDa의 분자량을 가진다.
임의의 구체예에서, IL-10 제제는 대상체에 피하 투여될 수 있다.
임의의 구체예에서, 대상체는 인간 대상체 일 수 있다.
임의의 구체예에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다: Vα TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들을 시퀀싱하는 단계; Vα TCR 폴리펩티드 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들을 결정하는 단계; 그리고 Vα TCR 폴리펩티드 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들을 분석하여 Vα TCR 폴리펩티드 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드의 상보성 결정 영역들 (CDRs)을 식별하는 단계.
임의의 구체예에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다: 상기 Vα 및/또는 VβTCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들을, IL-10 제제 투여 이전에 질병 조직에 존재하는 T 세포 상에서 발현된 TCR의 Vα 및/또는 VβTCR 폴리펩티드들의 아미노산 서열과 비교함으로써 단리된 PD1+, CD8+ T 세포 상에서 발현된 TCR의 항원 특이성을 평가하는 단계.
본 출원은 또한 유전자 변형된 T 세포의 생성 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기와 같은 가변 알파 (Vα) T 세포 수용체 (TCR) 폴리펩티드 및 가변 베타 (VβTCR 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터의 생성 방법 중 어느 한 구체예에 의해 얻어진 작제물에 CD8+ T 세포를 도입시켜, 질병 항원-특이적 TCR의 Vα 및 VβTCR 폴리펩티드 쌍을 발현시키는 유전자 변형된 T 세포를 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, Vα TCR 폴리펩티드 및 VβTCR 폴리펩티드는 동일하거나 상이한 발현 작제물 상의 별도의 발현 카세트들로부터 인코딩된다. 일부 구체예들에서, 상기 작제물에 의해 인코딩된 Vα TCR 폴리펩티드는 그 C-말단에서 불변 알파 TCR 폴리펩티드에 작동적으로 연결된다. 일부 구체예들에서, 상기 작제물에 의해 인코딩된 VβTCR 폴리펩티드는 그 C-말단에서 불변 베타 TCR 폴리펩티드에 작동적으로 연결된다. 일부 구체예들에서, 상기 작제물은 VβTCR 폴리펩티드 및 Vα TCR 폴리펩티드를 내포하는 단쇄 TCR (scTv)를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예들에서, scTv는 N-말단으로부터 C-말단으로, VβTCR 폴리펩티드, 링커, 및 Vα TCR 폴리펩티드를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 유전자 변형된 CD8+ T 세포의 모집단 또한 제공된다.
또한 본 출원은 다음 단계를 포함하는, CD8+ T 세포 요법이 잘 듣는 질병에 걸린 대상체의 치료 방법을 제공한다: 유전자 변형된 CD8+ T 세포를 대상체에 투여하는 단계, 여기서 T 세포는 대상체 질병의 항원에 특이적인 질병 항원-특이적 TCR의 Vα/Vβ쌍의 Vα TCR 폴리펩티드 및 VβTCR 폴리펩티드를 내포하는 재조합 TCR을 발현시키기 위해 유전자 변형되며; 여기서 상기 투여는 대상체의 질병을 치료함에 유효하다. 일부 구체예들에서, Vα TCR 폴리펩티드의 CDRs 및 VβTCR 폴리펩티드의 CDRs의 아미노산 서열들은, 상기와 같은 질병 항원-특이적 T 세포의 T 세포 수용체 (TCR)의 아미노산 서열들을 얻는 방법의 임의의 구체예에 따라 식별된다. 일부 구체예들에서, Vα TCR 폴리펩티드 및 VβTCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들은, Vα TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들 및/또는 VβTCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들을 시퀀싱하는 단계; Vα TCR 폴리펩티드 및/또는 VβTCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들을 결정하는 단계; 그리고 Vα TCR 폴리펩티드 및/또는 VβTCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들을 분석하여 Vα TCR 폴리펩티드 및/또는 VβTCR 폴리펩티드의 상보성 결정 영역들 (CDRs)을 식별하는 단계를 포함하는 방법에 따라 식별되었다.
임의의 구체예에서, 유전자 변형된 T 세포의 Vα TCR 폴리펩티드 및 VβTCR 폴리펩티드는 동일하거나 상이한 발현 작제물들의 별도의 발현 카세트들로부터 인코딩 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 유전자 변형된 T 세포의 Vα TCR 폴리펩티드는 그 C-말단에서 불변 알파 TCR 폴리펩티드에 작동적으로 연결된다. 일부 구체예들에서, 유전자 변형된 T 세포의 VβTCR 폴리펩티드는 그 C-말단에서 불변 베타 TCR 폴리펩티드에 작동적으로 연결된다. 일부 구체예들에서, 유전자 변형된 T 세포의 VβTCR 폴리펩티드 및 Vα TCR 폴리펩티드는 VβTCR 폴리펩티드 및 Vα TCR 폴리펩티드를 내포하는 단쇄 TCR (scTv)을 인코딩하는 핵산을 내포하는 작제물에 의해 인코딩된다. 일부 구체예들에서, scTv는 N-말단으로부터 C-말단으로, VβTCR 폴리펩티드, 링커, 및 Vα TCR 폴리펩티드를 내포한다.
임의의 구체예에서, CD8+ T 세포 요법이 잘 듣는 질병은 암 일 수 있으며 유전자 변형된 CD8+ T 세포의 질병 항원-특이적 TCR은 이러한 암의 항원에 대해 특이적일 수 있다. 일부 구체예들에서, 암은 고형 종양이다. 일부 구체예들에서, 종양은 자궁, 자궁경부, 유방, 전립선, 고환, 위장관, 신장, 콩팥 세포, 방광, 골, 골수, 피부, 두경부, 간, 쓸개, 심장, 폐, 이자, 침샘, 부신, 갑상선, 뇌, 신경절, 중추신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS)의 암, 또는 조혈계, 비장, 또는 흉선의 암에서 선택된 암의 종양이다. 일부 구체예들에서, 암은 식도, 입인두, 위, 소장, 대장, 결장, 또는 직장의 암이다. 일부 구체예들에서, 암은 흑색종, 결장직장 암, 또는 콩팥 암이다.
임의의 구체예에서, CD8+ T 세포 요법이 잘 듣는 질병은 바이러스 감염일 수 있으며 유전자 변형된 CD8+ T 세포의 질병 항원-특이적 TCR은 이러한 바이러스의 항원에 대해 특이적일 수 있다. 일부 구체예들에서, 바이러스는 헤파드나바이러스, 플라비바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스이다. 일부 구체예들에서, 바이러스는 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV) 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)이다.
임의의 구체예에서, 상기 방법은 추가의 치료 제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 치료 제제는 IL-10 제제이다. 일부 구체예들에서, CD8+ T 세포 요법이 잘 듣는 질병은 암이며 상기 치료 제제는 화학치료 제제이다. 일부 구체예들에서, CD8+ T 세포 요법이 잘 듣는 질병은 바이러스 감염이며 상기 치료 제제는 항바이러스 제제이다.
임의의 구체예에서, 상기 투여 단계는 복수의 유전자 변형된 CD8+ T 세포를 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 복수의 유전자 변형된 CD8+ T 세포는 상이한 질병 항원-특이적 TCRs을 내포하는 유전자 변형된 CD8+ T 세포들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 유전자 변형된 CD8+ T 세포는 대상체에 대해 자가유래이다.
본 명세서의 개시 내용에 기초하여 숙련된 기술자들은 그 외 구체예들을 명확히 알 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1 (패널 A-D)은 시험관 내 테스트한, 쥐과 CD8+ T 세포 기능 (패널 A-B) 및 인간 CD8+ T 세포 기능 (패널 C-D)에 대한 IL-10의 효과를 도시한다.
도 2는 6 일 (패널 A), 10 일 (패널 B), 또는 15 일 (패널 C) 동안 종양 항원-특이적 종양내 CD8+ T 세포 (종양 침윤 림프구, 또는 “TILs”로도 지칭됨)에 대한 종양-보유 마우스의 치료 효과를 도시한다.
도 3은 PD1 양성인 IFNγ 양성 CD8+ T 세포 종양 침윤 림프구 (TILs)의 비율에 대한 종양-보유 마우스의 장기적 IL-10 치료 (21-28일) 효과를 도시한다.
도 4는 IL-10 단일요법에 부분 반응을 보였던 흑색종 환자의 말초부로부터 얻은 PD1+ CD8+ T 세포에 대한 (패널 A) 그리고 IL-10 단일요법에 부분 반응을 보였던 RCC 환자의 말초부로부터 얻은 PD1+ CD8+ T 세포에 대한 (패널 B) CD45RO의 발현을 도시한다.
도 5는 지정된 일일 용량의 AM0010 투여 후 환자 종양 반응 및 암 환자들의 말초 혈액 중, 확장(expanded) 및 축소(contracted)된 T 세포 클론들의 상대수를 보여준다. 환자 종양 반응은 괄호에 표시한 치료 후 일차에 분석하였다. 확장 및 축소된 T 세포 클론들의 수는 표시된 치료 후 일차에 존재하는 T 세포 클론들을 AM0010 투여 전 1일 이전과 비교하여 분석하였다. Mel = 흑색종; CRC = 결장직장 암; RCC = 콩팥 세포 암종; PD = 진행성 질병; SD = 안정성 질병; PR = 부분 반응; “항-PD1 mAb” = 항-PD1 단클론 항체.
도 6은 PEG-rHuIL-10 단일요법 후 진행성 질병 (패널 A)을 보였던 또는 최소한 부분 반응 (패널 B)을 보였던 콩팥 세포 암종 환자들의 말초 T 세포에 관한 평가 결과를 보여준다.
도 7은 IL-10 제제로 치료받은 대상체로부터 얻은 PD1+, CD8+ 질병 항원-특이적 T 세포의 제조에 관한 도식이다.
상세한 설명
본 출원을 더욱 설명하기에 앞서, 본 출원은 본 명세서에 제시된 특정 구체예들에 제한되지 않으며, 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 구체예들을 오직 설명하기 위한 것이며, 제한을 하고자 하는 것이 아님을 또한 이해하여야 한다.
수치 범위가 제공될 경우, 내용상 명백히 달리 언급이 없는 한 상기 범위의 상한과 하한 사이에 개입되어 있는 각 수치는 하한 단위의 10분의 1까지, 그리고 상기 언급된 범위 내의 그 외 임의의 언급된 또는 개입되어 있는 수치는 본 발명에 포함됨을 이해하여야 한다. 이러한 보다 작은 범위들의 상한과 하한은 독립적으로 보다 작은 범위들에 포함될 수 있으며, 또한 언급된 범위에서 명시적으로 제외되는 한도값에 따라 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 한도값 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함되는 이들 한도값들 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위 또한 본 발명에 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, 단수형 "하나" 및 "그것"은 문맥에서 달리 명확히 언급이 없는 한 복수형을 포함함을 유념하여야 한다. 또한 청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외시키도록 작성될 수 있음을 유념하여야 한다. 그러므로 이러한 표현은 청구범위 구성들을 언급하는 것과 관련하여 “단독으로”, “오직” 등과 같은 제외 의미의 용어를 사용하기 위한 또는 “부정적” 제한를 사용하기 위한 선행사로서의 기능을 한다.
본 출원에서 논의되는 간행물들은 본 출원의 출원일 이전에 이들이 공개되었음을 위해서만 제공된다. 또한, 제공된 문헌의 공개일자는 실제 공개 일자와 상이할 수 있으며 따로 확인할 필요가 있을 수 있다.
개요
유전자 변형된 CD8+ T 세포를 이용하는 요법, 가령, CAR-T T 세포 요법은, 예를 들면, 암-관련 (예컨대, B 및 T 세포 림프종) 및 면역-관련 악성종양의 치료를 위한 치료적 접근법이다. CAR-T T 세포는 일반적으로, 예를 들면, 관심 종양 상에 존재하는 공지된 항원에 특이적인 재조합 T 세포 수용체를 발현시키기 위해 유전자 변형된 환자-유래 기억 CD8+ T 세포를 포함한다. 본 출원은 일반적으로 암 치료를 위해 CAR-T 세포 요법을 사용하는 것과 관련하여 기재되어 있으나, 이러한 요법은 또한 그 외 적응증, 가령, 바이러스 감염 (예컨대, HBV, HCV, HIV, CMV)의 치료에서도 유용성이 발견됨을 이해하여야 한다.
CAR-T T 세포 치료 개발에 있어 하나의 시도는 유전자 변형된 CD8+ T 세포의 TCR의 원하는 항원 특이성을 제공하기 위하여 CAR-T 폴리펩티드에서 사용하기에 적합한, Vα/Vβ TCR 쌍의 가변 알파 (Vα) 및 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드를 식별하는 것이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, PEG-IL-10을 이용한 암 환자들의 치료는 종양 항원-특이적, PD1+ CD8+ T 세포의 말초 혈액 내 축적을 가져온다. 이러한 현상은 그랜자임 B+, CD8+ 종양 침윤 림프구, (TILs)의 증가에 수반되는 일이다. PEG-IL-10을 이용한 암 환자들의 치료는 세포독성, 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포의 축적을 가져온다. 이 모집단 중에서, PD1+ 중간 내지 PD1+ 고 말초 CD8+ T 세포는 종양 관련 특이적 항원들을 인지하는 독특한 알파 베타 TCR 서열들을 나타낸다. PEG-IL-10을 이용한 치료에 대해 반응하는 암 환자들로부터 단리된 이러한 세포들은 쥐과 종양 모델로부터의 모델링을 통해 구현될 수 없는 종양들 (예컨대, 고형 종양들)에 대하여, 선택된 높은 친화성의 성숙을 TCR 서열들에 제공한다. 동일한 종양 적응증 및 동일한 MHC 일배체형에서 PEG-IL-10을 이용한 치료 (단일요법으로서 또는 면역 체크포인트 요법 및/또는 화학요법과 병용으로)에 의해 생성되는 서열들의 조사는 현재 공지되지 않은 종양 항원들에 특이적이고, 생산적인 항-종양 면역 반응을 유도할 수 있는 Vα/Vβ TCR 쌍들을 제공할 것이다.
본 출원은 IL-10 제제를 이용한 치료 후 환자들의 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포 생성 및 단리 방법, 뿐만 아니라 이러한 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포의 TCRs의 Vα/Vβ TCR 쌍의, 가변 알파 (Vα) 및 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드들의 아미노산 서열들, 및/또는 가변 알파 (Vα) 및 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드들의 CDRs 식별 방법을 제공한다. 일부 구체예들에서, 항원-특이적 CD8+ T 세포들은 또한 PD1+인 말초 CD8+ T 세포이다. 인코딩 핵산들 및/또는 이들로부터 얻은 정보는 이러한 Vα/Vβ TCR 쌍들을 인코딩하는, 개개의 작제물들 및/또는 작제물들의 라이브러리를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 핵산들, 및/또는 이들로부터 얻은 정보는, 이러한 Vα/Vβ TCR 폴리펩티드 쌍 (또는 최소한 이러한 Vα/Vβ TCR 폴리펩티드들의 CDRs)을 포함하는 재조합 TCR을 발현시키는 유전자 변형된 CD8+ T 세포를 제조하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 재조합 TCR은 Vα 폴리펩티드에, 예컨대, 링커를 통해 작동적으로 연결된 Vβ 폴리펩티드를 포함하는 단쇄 T 세포 수용체 (scTv)를 포함하는 CAR-T가 될 수 있다. 본 출원은 또한 암 환자들 또는 CD8+ T 세포 요법이 잘 듣는 질병에 걸린 환자들, 가령, 만성 바이러스 감염 환자들 (예컨대, HBV 감염 환자들)의 치료 방법을 고려한다.
정의
달리 언급이 없는 한, 다음 용어들은 하기 설명되는 의미를 가지는 것으로 한다. 다른 용어들은 명세서의 다른 부분에 정의된다.
용어 “환자” 또는 “대상체”는 인간 또는 비-인간 동물 (예컨대, 포유동물)을 지칭하기 위하여 호환적으로 사용된다.
용어 “투여”, 투여하다” 등은, 예를 들면, 대상체, 세포, 조직, 장기, 또는 생물학적 유체에 사용될 때, 예를 들면, IL-10 또는 PEG-IL-10, 핵산 (예컨대, 음성 인간 IL-10을 인코딩하는 핵산); 전술한 것을 포함하는 제약학적 조성물, 또는 대상체, 세포, 조직, 장기, 또는 생물학적 유체에 대한 진단 제제의 접촉을 지칭한다. 세포에 관한 내용에서, 투여는 세포에 대한 시약의 접촉 (예컨대, 시험관내 또는 생체외), 뿐만 아니라 유체에 대한 시약의 접촉을 포함하며, 이 때 유체는 세포와 접촉된다.
용어 “치료하다”, “치료하는 것", "치료” 등은 질병, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상이 진단, 관찰 등이 된 후, 대상체를 괴롭히는 질병, 장애, 또는 병태의 근본 원인 중 최소한 하나, 또는 대상체를 괴롭히는 질병, 장애, 병태와 연관된 증상들 중 최소한 하나를 일시적으로 또는 영구적으로 제거, 감소, 억제, 완화 또는 개선하기 위하여 개시되는 활동 과정 (가령, IL-10 또는 IL-10을 포함하는 제약학적 조성물을 투여하는 것)을 지칭한다. 그러므로, 치료는 활동 중인 질병을 억제 (예컨대, 질병, 장애 또는 병태 또는 이와 관련된 임상 증상들의 발병이나 추가 발병을 저지)하는 것을 포함한다. 상기 용어들은 또한 다른 내용과 관련하여, 가령, IL-10 또는 PEG-IL-10이 예를 들면, 유체 상태 또는 콜로이드 상태의 IL-10 수용체를 접촉하는 상황에서 사용될 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료를 필요로 하는"은 의사 또는 그 외 의료진이 대상체가 치료를 필요로 함을 또는 치료로부터 이점을 얻게 됨을 판단하는 것을 지칭한다. 이러한 판단은 의사 또는 의료진의 경험 영역에 존재하는 다양한 요인들에 근거하여 이루어진다.
용어 “예방하다”, “예방하는 것”, “예방” 등은 일반적으로 특정 질병, 장애 또는 병태에 잘 걸리게 되는 대상체에 관한 내용에서 대상체의 질병, 장애, 병태 등의 발병 (예를 들면, 임상 증상들이 없는 것으로 결정됨) 위험을 일시적으로 또는 영구적으로 예방, 억제, 저해 또는 감소시키기 위한 방식으로 (예컨대, 질병, 장애, 병태 또는 이의 증상의 발병 이전에) 개시되는 (가령, IL-10 또는 IL-10을 포함하는 제약학적 조성물을 투여) 또는 이의 발병을 지연시키는 활동 과정을 지칭한다. 특정 예들에서, 상기 용어들은 또한 질병, 장애 또는 병태의 진행을 늦추는 것 또는 이의 유해한 또는 그 외 원하지 않는 상태로의 진행을 억제하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방을 필요로 하는"은 의사 또는 그 외 의료진이 대상체가 예방을 필요로 함을 또는 예방으로부터 이점을 얻게 됨을 판단하는 것을 지칭한다. 이러한 판단은 의사 또는 의료진의 경험 영역에 존재하는 다양한 요인들에 근거하여 이루어진다.
어구 “치료적 유효량”은 대상체에 제제 투여시 제약학적 조성물 단독 또는 이의 일부분으로서, 그리고 단일 투여 또는 연속 투여로, 질병, 장애 또는 병태의 임의의 증상, 양상, 또는 특성에 대한 임의의 검출가능한 긍정적인 효과를 줄 수 있는 양의, 대상체에 대한 제제의 투여를 지칭한다. 치료적 유효량은 관련 생리학적 효과들을 측정함으로써 확인될 수 있으며, 투여법 및 대상체의 병태 진단 분석 등과 관련하여 조절될 수 있다. 예로서, 투여 후 생성되는 염증성 사이토카인 양의 측정치는 치료적 유효량이 사용되었는지 여부를 나타낼 수 있다.
어구 “변화를 일으키기에 충분한 양으로”는 특정 요법의 투여 이전 (예컨대, 기준선 수준) 및 이후에 측정된 지표 수준 사이에 검출가능한 차이가 존재함을 의미한다. 지표들에는 임의의 객관적 파라미터 (예컨대, IL-10의 혈청 농도) 또는 주관적 파라미터 (예컨대, 대상체의 행복감)가 포함된다.
본 출원은 일부 구체예들에서 유세포측정을 사용한, 표지자들, 예컨대, 세포 표면 표지자들의 발현 분석을 수반한다. 세포는 표지자-특이적 시약 (예컨대, 형광-라벨된 항체)으로 염색한 후 유세포측정으로 평가된 검출가능한 라벨 (예컨대, 형광)의 상대 강도에 근거하여 "양성" 또는 "음성"으로 분류 될수 있다. 일반적으로, 상기 세포들은 이정점 (bimodally) 분포 표지자, 예컨대, CD8, PD1, IFNγCD45RO, 그랜자임 B, 퍼포린 등의 염색에 있어서 용이하게 식별가능한 차이에 근거하여 이들의 발현 수준에 따라 구별된다. 일부 구체예들에서, 모든 세포에 대해 표지자 염색의 도수 분포를 얻고 모집단 곡선을 보다 높은 염색 및 낮은 염색 모집단에 적합시키고, 각각의 모집단 분포들의 통계적 분석의 관점에서 세포들이 대부분 통계적으로 속하게 되는 모집단에 세포들을 할당한다. 일부 구체예들에서, 모든 세포에 대해 표지자 염색의 도수 분포를 얻고 모집단 곡선을 보다 높은 염색, 중간-수준 염색 및 낮은 염색 모집단에 적합시키고, 각각의 모집단 분포들의 통계적 분석의 관점에서 세포들이 대부분 통계적으로 속하게 되는 "고", "중", 및 또는 "저" 모집단에 세포들을 할당한다. T 세포들을 + 및 - 범주, 뿐만 아니라 “고”, “중”, 및 또는 “저" 범주로 구분하는 방법들은, 해당 분야의 통상의 숙련된 기술자에게 공지이다.
그러므로, 예를 들면, 본 출원은 T 세포에서의 PD1 발현 분석을 고려한다. T 세포는 실질적으로 이정점 분포의 PD1 (CD279로도 공지됨) 세포 표면 발현을 보이는데, 여기서 보다 높은 PD1 세포 표면 발현 피크 주변의 세포는 “PD1고” (또는 “PD1+”)로 분류될 수 있고 보다 낮은 PD1 세포 표면 발현 피크 주변의 세포는 “PD1저” (또는 “PD1-")로 분류될 수 있다. 활성화된 CD8+ T 세포를 포함하는 CD8+ T 세포 모집단은 또한 PD1고 및 PD1저 세포들 사이에 중간 세포 모집단 ("PD1중”)을 포함할 수 있으며, 여기서 PD1중 세포는 PD1 저 세포 보다는 높지만, PD1 고 세포 보다는 낮은 PD1 세포 표면 발현 수준을 가진다. 그러므로, 관심대상인 활성화된 CD8+ T 세포는 중간 (“중”)-내지-고 수준의 PD1 세포 표면 발현 (“PD1중-고”)을 포함할 수 있다. 다시 말하면, 활성화된 CD8+ T 세포는 세포 표면상에서 낮은 PD1 발현을 가지지 않는 (즉, “PD1저”가 아닌) CD8+ T 세포 모집단이 될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 “PD1중”은 세포 모집단에서 최저 PD1 발현 수준 (“PD1저”)의 최소한 약 100 - 150배이며, 세포 모집단에서 최고 PD1 발현 수준 (“PD1고”)의 약 1/3 미만인 PD1의 세포 표면 발현 수준을 지칭하며, 여기서 세포 표면 PD1 발현은 유세포측정에 의해 검출된다. 예를 들면, “PD1 중” 세포는 유세포측정시 대략 3000의 평균 채널 형광 검출값을 생성하는 수준의 세포 표면 PD1을 발현시킬 수 있고, 낮은 PD1 발현 (“PD1저”)은 대략 200의 평균 채널 형광 검출값으로 나타내어지며 “PD1고” 발현은 대략 9000의 평균 채널 형광 검출값으로 나타내어진다. “PD1저” 세포는, PD1+ 또는 PD1으로 세포를 특성화하는 경우, “PD1저”는 PD1 음성 (“PD1-“)으로 고려됨을 유념하여야 한다.
용어 “소분자”는 약 10kDa 미만, 약 2kDa 미만, 또는 약 1kDa 미만인 분자량을 가지는 화학적 화합물을 지칭한다. 소분자들에는, 무기 분자, 유기 분자, 무기 성분을 내포하는 유기 분자, 방사능 원자를 포함하는 분자, 및 합성 분자가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 치료적으로, 소분자는 대형 분자에 비해 세포에 대한 투과성이 더 크고, 분해에 대한 취약성이 더 적고, 그리고 면역 반응을 유도할 가능성이 더 적을 수 있다.
용어 “리간드”는 수용체의 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있는, 분자 또는 이의 복합체를 지칭한다. 용어 “리간드”는 항체 유래의 천연 및 합성 리간드, 예컨대, 사이토카인, 사이토카인 변이체, 유사체, 변이단백질(muteins), 및 결합 조성물을 포함한다. 용어 “리간드”는 또한 소분자, 예컨대, 사이토카인의 펩티드 모방체 및 항체의 펩티드 모방체를 포함한다. 이 용어는 또한 효능제도 길항제도 아니지만, 수용체의 생물학적 성질들, 예컨대, 신호전달 또는 부착에 현저히 영향을 주지 않고 수용체에 결합할 수 있는 제제를 포함한다. 용어 “리간드”는 또한, 예컨대, 화학적 또는 재조합 방법들에 의해, 용해가능한 형태의 막-결합 리간드로 변화되어 있는 막-결합된 리간드를 포함한다. 수용체는 세포내 일 수 있다, 즉, 수용체는 세포질, 핵, 또는 그 외 일부 세포내 구획에 존재할 수 있고 또는 세포막과 결합되어, 세포막을 경유할 수 있으나 여전히 세포막의 세포내 표면 상에 리간드 결합 부위를 가질 수 있다. 리간드와 수용체의 복합체를 “리간드-수용체 복합체”로 명명한다.
용어 “억제제" 및 "길항제", 또는 "활성화제" 및 "효능제"는, 각각, 예컨대, 리간드, 수용체, 보조인자, 유전자, 세포, 조직 또는 장기를 억제 또는 활성화시키는 분자들을 지칭한다. 억제제는 생물학적 분자, 예컨대, 유전자, 단백질, 리간드, 수용체, 또는 세포의 활성을 감소, 차단, 저해, 활성화 지연, 불활성화, 탈감작화 또는 하향 조절하는 분자이다. 활성화제는 생물학적 분자, 예컨대, 유전자, 단백질, 리간드, 수용체, 또는 세포의 활성을 증가, 활성화, 촉진, 활성화 증대, 감작화, 또는 상향 조절하는 분자이다. 억제제는 또한 항시 활성을 감소, 차단 또는 불활성화시키는 분자로서 정의될 수 있다. “효능제”는 표적의 활성 증가를 유발 또는 촉진시키기 위해 표적과 상호작용하는 분자이다. “길항제”는 효능제의 작용(들)에 대항하는 분자이다. 길항제는 효능제의 활성을 저해, 감소, 억제, 또는 중화시키며, 심지어 확인된 효능제가 없는 경우에도 길항제는 표적, 예컨대, 표적 수용체의 항시 활성을 저해, 억제 또는 감소시킬 수 있다.
용어 “조절하다”, “조절” 등은 단독으로 또는 다른 인자들과 조합하여, 또 다른 생물학적 분자의 기능 또는 활성을, 직접적으로 또는 간접적으로 조절, 증가 또는 감소시키는 분자의 능력을 지칭한다. 용어 “조절제”는 상기 활성들을 조절할 수 있는 분자를 광범위하게 지칭하는 것이다. 예로서, 예컨대, 유전자, 수용체, 리간드, 또는 세포의 조절제는, 유전자, 수용체, 리간드, 또는 세포의 활성을 변화시키는 분자이며, 여기서 분자의 조절 성질들에 있어서 활성은 활성화, 억제 또는 변화될 수 있다. 조절제는 단독으로 작용할 수 있거나, 또는 보조인자, 예컨대, 단백질, 금속 이온, 또는 소분자를 사용할 수 있다.
분자의 “활성”은, 예를 들면, 다음을 기재 또는 지칭할 수 있다: (a) 리간드 또는 수용체에 대한 분자의 결합; (b) 수용체에 결합시 리간드의 촉매 활성에 대한 반응 수준; (c) 유전자 발현 또는 세포 신호전달, 분화, 또는 성숙을 자극하는 능력; 및/또는 (d) 항원 활성; 및/또는 (e) 그 외 분자들의 활성 조절. 상기 용어는 또한 세포-대-세포 상호작용들 (예컨대, 부착)을 조절 또는 유지함에 있어서의 활성, 또는 세포의 구조 (예컨대, 세포막)를 유지함에 있어서의 활성을 지칭한다. “활성”은 또한 특이적 활성, 예컨대, [촉매 활성]/[mg 단백질], 또는 [면역학적 활성]/[mg 단백질], 생물학적 구획에서의 농도 등을 의미할 수 있다. 용어 “증식 활성”은, 예를 들면, 세포 분열을 촉진시키거나, 이에 필요하거나 이에 특이적으로 관련된 활성을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, “비슷한”, “비슷한 활성”, “~와 비슷한 활성”, “비슷한 효과”, “~와 비슷한 효과”, “유사한” 및 “실질적으로 유사한”은 정량적 및/또는 정성적 관점에서 보아 관련되는 용어들이다. 이 용어들의 의미는 이들이 사용되는 내용에 따라 종종 달라진다. 예로서, 모두가 수용체를 활성화시키는 두 개의 제제들은, 해당 기술분야에서 인정되는 분석법 (예컨대, 용량-반응 분석법) 또는 해당 기술분야에서 인정되는 모델에서 결정하였을 때 하나의 제제가 다른 하나의 제제 활성의 20%만을 구현할 수 있는 경우, 정성적 관점으로부터 비슷한 효과를 가지는 것으로 볼 수 있으나, 이들 두 개의 제제들은 정량적 관점에서 비슷한 효과가 없는 것으로 볼 수 있다. 하나의 결과를 또 다른 결과와 비교할 때 (예컨대, 비교 표준에 대한 하나의 결과), “비슷한”은 종종 하나의 결과가 참조 표준으로부터 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 7% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만만큼 벗어남을 의미한다. 특정 구체예들에서, 하나의 결과가 참조 표준으로부터 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만만큼 벗어나는 경우 이는 참조 표준과 비슷하다. 예로서, 활성 또는 효과는 효능, 안정성, 용해도, 또는 면역원성을 지칭할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들면, 세포, 조직, 장기, 또는 유기체의 용어 "반응"은, 생화학적 또는 생리학적 거동, 예컨대, 농도, 밀도, 부착, 또는 생물학적 구획 내에서의 이동, 유전자 발현율, 또는 분화 상태의 변화를 포함하며, 여기서 변화는 활성화, 자극, 또는 치료와, 또는 내부 메커니즘, 가령, 유전자 프로그래밍과 상관된다. 특정 내용에서, 용어 “활성화”, “자극”, 등은 내부 메커니즘들에 의해, 뿐만 아니라 외부적 또는 환경적 요인들에 의해 조절되는 세포 활성화를 지칭하며; 이에 반해 용어 “억제”, “하향 조절” 등은 반대의 효과를 지칭한다.
본 명세서에서 호환적으로 사용되는 용어 “폴리펩티드,” “펩티드,” 및 “단백질”은, 임의의 길이의 아미노산들의 폴리머 형태를 지칭한다. 폴리펩티드는 유전자적으로 코드된 그리고 유전자적으로 코드되지 않은 아미노산들, 화학적으로 변형된 아미노산들, 및 변형된 폴리펩티드 골격을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 예들에는, 이종 아미노산 서열과의 융합 단백질; 이종 및 동종 리더 서열과의 융합 단백질; N-말단 메티오닌 잔기와의 또는 이러한 잔기없는 융합 단백질; 면역학적으로 태그된 단백질과의 융합 단백질; 등을 비롯한 융합 단백질들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서 전반에 걸쳐 하나의 글자 또는 세 개의 글자 코드에 따라 유전자적으로 코드된 L-아미노산들을 참조함이 이해될 것이다. 독자의 편의를 위해, 하나 및 세 개의 글자의 아미노산 코드를 하기 제공한다:
Figure pct00001
본 명세서에서 사용되는 용어 “변이체”는 자연-발생 변이체 및 비-자연-발생 변이체를 포함한다. 자연-발생 변이체는 동족체 (하나의 종과 다른 종들 간에, 각각 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 상이한 폴리펩티드 및 핵산들), 및 대립형질 변이체 (하나의 종 안에서 하나의 개체와 다른 개체 간에, 각각 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 상이한 폴리펩티드 및 핵산들)를 포함한다. 비-자연-발생 변이체는 각각 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 변화를 포함하는 폴리펩티드 및 핵산들을 포함하며, 여기서 서열의 변화는 인공적으로 도입되며 (예컨대, 변이단백질); 예를 들면, 이러한 변화는 인간이 개입하여 (“사람의 손”) 실험실에서 이루어진다. 용어 “변이단백질”은 하나 또는 다수의 아미노산 치환들에 의해 변형된 단백질을 지칭한다. 변이단백질은 부위-지시된 또는 무작위 돌연변이유발을 거친 클론된 유전자들로부터, 또는 완전히 합성 유전자들로부터 빈번히 유도된다.
용어 “DNA”,“핵산”, “핵산 분자”, “폴리뉴클레오티드” 등은 본 명세서에서 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인 임의의 길이의 뉴클레오티드들의 폴리머 형태 또는 이의 유사체를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오티드들의 비-제한적 예들에는 선형 및 원형 핵산들, 전령 RNA (mRNA), 상보적 DNA (cDNA), 재조합 폴리뉴클레오티드, 벡터, 탐색자, 프라이머 등이 포함된다.
폴리펩티드 구조에 관한 내용에서 본 명세서에서 사용되는, “N-말단” (또는 “아미노 말단”) 및 “C-말단” (또는 “카르복실 말단”)은 각각 폴리펩티드의 맨끝 아미노 및 카르복실 단부를 지칭하며, 용어 “N-말단” 및 “C-말단”은 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 각각 N-말단 및 C-말단을 향한 상대적 위치를 지칭하며, 각각 N-말단 및 C-말단에서의 잔기들을 포함할 수 있다. “N-말단 바로 옆” 또는 “C-말단 바로 옆”은 첫 번째 및 두 번째 아미노산 잔기들이 공유 결합하여 인접 아미노산 서열을 제공하는 경우 두 번째 아미노산 잔기에 상대적인 첫 번째 아미노산 잔기의 위치를 지칭한다.
폴리펩티드 및 핵산들과 관련하여 사용되는 용어 “~로부터 유래한"은, 참조 폴리펩티드 또는 핵산 (예컨대, 자연 발생 폴리펩티드 또는 핵산)으로부터 유래한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭하며, 참조 분자의 출처에도 참조 분자를 변형시키는 방법에도 제한되지 않는다. 예로서, 용어 “~로부터 유래한”은 참조 아미노산 또는 DNA 서열들의 동족체 또는 변이체를 포함한다.
폴리펩티드 또는 핵산의 내용에서, 용어 “단리된”은, 자연 발생의 경우, 자연적으로 발생할 수 있는 환경과 상이한 환경에 있는 관심 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭한다. “단리된”은 관심 폴리펩티드가 실질적으로 풍부한 샘플들 및/또는 관심 폴리펩티드가 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 샘플들 내부에 존재하는 폴리펩티드 또는 핵산을 포함하는 것으로 한다. 폴리펩티드가 자연 발생이 아닌 경우, “단리된”은, 합성 또는 재조합 수단들에 의해 폴리펩티드가 제조되었던 환경으로부터 폴리펩티드가 분리되어 있음을 나타낸다.
“풍부한”은 샘플이 비-자연적으로 조작되어 (예컨대, 과학자에 의해) 관심 분자가 출발 샘플 내 관심 분자의 농도보다 큰 (예컨대, 최소한 3-배 더 큰, 최소한 4-배 더 큰, 최소한 8-배 더 큰, 최소한 64-배 더 큰, 또는 그 이상) 농도로 a)에 존재하게 됨을 의미한다. 출발 샘플은 생물학적 샘플 (예컨대, 관심 분자가 자연적으로 나타나는 또는 관심 분자가 투여 후 존재하는 샘플)이거나, 또는 관심 분자의 농도가 주위환경에서보다 큰 원료로부터 (예컨대 폴리펩티드가 발현되었던 재조합 세균 세포로부터) 얻은 것일 수 있다.
용어 “실질적으로 순수한”은 관심 성분 (예컨대, 폴리펩티드)이 총 조성물 함량의 약 50% 이상, 그리고 전형적으로 총 조성물 함량의 약 60% 이상을 구성하는, 관심 성분을 내포하는 조성물을 지칭한다. 더욱 전형적으로, “실질적으로 순수한”은 총 조성물의 최소한 75%, 최소한 85%, 최소한 90% 또는 그 이상이 관심 성분인 조성물을 지칭한다. 일부 경우에서, 관심 성분은 총 조성물 함량의 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상을 구성할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “특이적으로 결합하는” 또는 “선택적으로 결합하는”은, 리간드와 이의 수용체, 항체와 이의 항원, 또는 그 외 결합 쌍의 상호작용을 지칭한다. 선택적 결합은 비균질 혼합물 내 리간드의 존재를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 그러므로, 지정된 조건하에서, 리간드는 이의 수용체에 선택적으로 결합하는 것으로 생각되며, 이 때 리간드는 비균질 혼합물 중 이의 수용체에 결합하고 다른 성분들에는 실질적인 정도로 결합하지 않는다. 면역글로불린에 있어서, 일정 항원에 선택적으로 결합하는 면역글로불린은 이의 항원, 또는 변이체 또는 이의 변이단백질에 대해 일정한 친화성으로 결합하며, 이 때 친화성은 임의의 그 외 항원에 대한 친화성보다 최소한 2-배 더 큰, 최소한 10배 더 큰, 최소한 20-배 더 큰, 또는 최소한 100-배 더 크다. 한 특정 구체예에서, 일정 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린은, 예컨대, Scatchard 분석법 (Munsen, 외. 1980 Analyt. Biochem. 107:220-239)으로 결정시, 약 109 리터/mol 보다 큰 친화성을 가질 것이다.
본 출원의 폴리펩티드 및 핵산 분자와 관련하여 "인간"에 대한 임의의 언급은 폴리펩티드 또는 핵산을 얻는 방식 또는 원료를 제한함을 의미하는 것이 아니라, 그보다는 자연 발생 아이소형을 비롯한 자연 발생 인간 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 서열에 상응가능할 때 그 서열을 참고하는 것임을 유념하여야 한다.
본 명세서에서 사용되는 “~에서 발현되는”은, 통상적으로 세포 내에서 세포 모이어티, 또는 이의 전구물질을 생성하고 세포 모이어티 또는 이의 전구물질이 세포 형질막의 세포외 표면으로 자리옮김(translocation)한 결과, 세포 표면 상에 존재하는 세포 모이어티 (예컨대, 단백질 또는 이의 복합체)를 기재하기 위하여 사용될 수 있다.
“세포예정사 단백질 1” 또는 “PD1”은 림프구의 부분집합 상에 발현되는 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 세포 표면 수용체를 지칭하며, CD279로도 공지되어 있다. 인간 PD1 (유전자 ID: 5133)은 PDCD1 유전자에 의해 인코딩된다.
“CD45RO”은 림프구의 부분집합 상에서 발현되는, 수용체형 단백질 티로신 포스파타제 패밀리 구성원인 CD45의 아이소형을 지칭한다. CD45의 그 외 아이소형들에는 CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RAB, CD45RAC, CD45RBC, 및 CD45R (ABC)이 포함된다. CD45RO은 그 외 아이소형들보다 짧고 RA, RB 및 RC로 공지된 CD45 엑손들이 없는 CD45의 아이소형이다. 인간 CD45 (유전자 ID: 5788)는 PRPRC 유전자에 의해 인코딩된다.
본 명세서에서 사용되는 “항원-특이적 T 세포” 및 “항원에 특이적인 T 세포”는, 그 세포 표면 상에서 TCR 폴리펩티드들의 구조, 가령, 가변 영역들을 내포하는 α 및 β폴리펩티드 사슬에 의해 일정 항원에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현시키는 T 세포를 지칭한다. 그 TCR이 일정 항원에 특이적인 T 세포는 성숙하는 동안 TCR 게놈 좌위의 재조합이 일어났을 수 있으며, 및/또는 하나 이상의 TCR 폴리펩티드 또는 유전공학적 TCR-유사 수용체 (가령, 키메라 항원 수용체)를 발현시키기 위해 유전자 변형되었을 수 있다.
“질병 항원” 또는 “질병-관련 항원”은 면역 반응, 가령, T-세포 매개 면역 반응을 유도하는 에피토프 (예컨대, 항원 펩티드, 지질, 다당류, 핵산, 등)을 지칭한다. 질병이 종양인 경우, 종양 항원 또는 종양-관련 항원은 종양 세포에서 발현되는 에피토프일 수 있다. 종양 항원은 종양 세포에 특유할 수 있으며 신체, 특히 동일한 계통의 다른 세포에서는 일반적으로 발현되지 않는다. 일부 경우에서, 종양 항원은 신체의 다른 세포에서 일반적으로 발현되는 에피토프일 수 있으나 이는 비-종양관련 내용에서의 면역 반응을 유도하지 않는다. 종양 항원은 면역 시스템이 미숙하여 반응할 수 없을 때 태아 발달 동안 일반적인 세포에서 전형적으로 발현되는 하나 이상의 에피토프들을 보유할 수 있다. 종양 항체는 정상 세포에서 극히 낮은 수준으로 일반적으로 존재하지만 종양 세포에서 상당히 더 높은 수준으로 발현되는 하나 이상의 에피토프들을 보유할 수 있다.
질병 항원 특이적 CD8+ T 세포의 제조방법의 개요
본 출원은, 한 구체예에서, IL-10 제제 요법으로 치료가능한 질병에 걸린 환자의 말초부로 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포의 확장(expansion)을 유도하는 방법을 제공하며 , 이 방법은 IL-10 제제를 이러한 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포의 유도를 이끌어내기에 효과적인 양으로 환자에게 투여하여, 환자로부터 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포 (예컨대, 환자의 조직 샘플, 가령, 말초 혈액 샘플 내 CD8+ T 세포)를 얻는 것을 포함한다. 따라서, 본 출원은 IL-10 제제, IL-10 제제의 제조 방법, 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포의 제조 및 IL-10 제제 요법을 위한 투여법, 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포의 제조 방법, 이러한 T 세포의 TCRs 분석, TCR 알파 및 베타 서열들 및 핵산들의 라이브러리 제조, 이러한 T 세포의 TCRs의 항원 특이성 분석, 유전자 변형된 T 세포의 질병 항원-특이적 TCRs의 TCR 알파 및 베타 서열들을 포함하는 재조합 TCR을 발현시키는 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T)의 제조, 유전자 변형된 T 세포 조성물 및 이의 제조 방법과 요법에 있어서의 용도, 그리고 제약학적 조성물 및 키트를 제공한다. 일부 구체예들에서, 항원-특이적 CD8+ T 세포들은 또한 PD1+인 말초 CD8+ T 세포이다. 본 출원의 이러한 특징들을 하기 설명한다.
IL-10 제제 (예컨대, PEG-IL-10)
인간 사이토카인 합성 억제 인자 (CSIF)로도 공지된 항-염증성 사이토카인 IL-10은, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 (Mda-7), 및 IL-26, 인터페론 (IFN-α, -β, -γ, -δ, -ε, -κ, -Ω, 및 -τ) 및 인터페론-유사 분자 (리미틴, IL-28A, IL-28B, 및 IL-29)를 포함하는 한 세트의 사이토카인인 유형(클래스)-2 사이토카인으로 분류된다.
IL-10은 면역조절 및 염증에서 다면발현성 효과를 가지는 사이토카인이다. 이것은 비만 세포에 의해 생성되며, 이들 비만 세포가 알러지 반응 부위에서 가지는 염증 효과를 상쇄시킨다. 전-염증성 사이토카인, 가령IFN-γ, IL-2, IL-3, TNFα 및 GM-CSF, IL-10의 합성을 억제할 수 있는 반면, 특정 T 세포 및 비만 세포에 대해 자극성이기도 하고 B-세포 성숙, 증식 및 항체 생성을 자극한다. IL-10은 NF-κ 활성을 차단할 수 있으며 JAK-STAT 신호전달 경로의 조절에 관여한다. 이것은 또한 CD8+ T-세포의 세포독성 활성 및 B-세포의 항체 생성을 유도하며, 대식세포 활성 및 종양-촉진 염증을 억제한다. CD8+ T-세포의 조절은 용량-의존적이며, 여기서 용량이 높아질 수록 더 강한 세포독성 반응들을 유도한다.
인간 IL-10은 37kDa의 분자량을 가지는 동종이량체이며, 여기서 각각의 18.5kDa 단량체는 178개의 아미노산들을 포함하는데, 이들 중 처음 18개는 신호 펩티드, 및 분자내 2개의 이황화 결합들을 형성하는 2개의 시스테인 잔기들을 포함한다. IL-10 이량체는 두 개의 단량체 소단위 사이의 비-공유적 상호작용들을 파괴시 생물학적으로 불활성이 된다.
본 출원은 80% 상동성을 나타내는 인간 IL-10 (NP_000563) 및 쥐과 IL-10 (NP_034678), 그리고 이의 용도를 고려한다. 또한, 본 출원의 범위는, 래트 (수탁번호 NP_036986.2; GI 148747382); 소 (수탁번호 NP_776513.1; GI 41386772); 양 (수탁번호 NP_001009327.1; GI 57164347); 개 (수탁번호 ABY86619.1; GI 166244598); 및 토끼 (수탁번호 AAC23839.1; GI 3242896)를 비롯한, 그 외 포유동물 종들로부터 얻은 IL-10 오르토로그(orthologs), 및 이의 변형된 형태들을 포함한다.
용어 “IL-10”, “IL-10 폴리펩티드(들), “IL-10 분자(들)”, “IL-10 제제(들)” 등은 광범위하게 해석되어야 하며, 예를 들면, 동족체, 변이체 (변이단백질 포함), 및 이의 단편들을 비롯한 인간 및 비-인간 IL-10 - 관련 폴리펩티드들, 뿐만 아니라 예를 들면, 리더 서열을 가지는 IL-10 폴리펩티드 (예컨대, 신호 펩티드), 및 전술한 것들의 변형된 형태를 포함한다. 추가의 특정 구체예들에서, IL-10, IL-10 폴리펩티드(들), 및 IL-10 제제(들)는 효능제이다.
제2형 사이토카인 수용체인 IL-10 수용체는 알파 및 베타 소단위로 구성되는데, 이들을 또한 각각 R1 및 R2로도 지칭된다. 수용체 활성화는 알파 및 베타 모두에 대한 결합을 필요로 한다. IL-10 폴리펩티드 중 하나의 동종이량체는 알파에 결합하고 동일한 IL-10 폴리펩티드의 다른 하나의 동종이량체는 베타에 결합한다.
재조합 인간 IL-10의 이용은 종종 그 상대적으로 짧은 혈청 반감기에 의해 제한되는데, 이는, 예를 들면, 콩팥 청소율, 단백질가수분해적 분해 및 혈류내 단량체화로 인한 것일 수 있다. 결과로서, IL-10의 이량체 구조를 파괴하여 그 활성에 유해한 영향을 주지 않고 IL-10의 약동학적 프로파일을 개선하기 위하여 다양한 접근방법들을 시험한 바 있다. IL-10의 페길화는 특정 약동학적 파라미터들 (예컨대, 혈청 반감기)의 개선 및/또는 활성의 증강을 가져온다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “페길화 IL-10” 및 “PEG-IL-10”은 IL-10 단백질의 최소한 하나의 아미노산 잔기에, 일반적으로 링커를 통해 공유 부착되고 이러한 부착이 안정한 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 가지는 IL-10 분자를 지칭한다. 용어 “모노페길화 IL-10” 및 “모노-PEG-IL-10”은 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자가 IL-10 이량체의 하나의 소단위 상의 하나의 아미노산 잔기에 일반적으로 링커를 통해 공유 부착됨을 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 “다이페길화 IL-10” 및 “다이-PEG-IL-10”은 최소한 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자가 IL-10 이량체의 각 소단위 상의 하나의 잔기에, 일반적으로 링커를 통해 부착됨을 나타낸다.
특정 구체예들에서, 본 출원에서 사용되는 PEG-IL-10은 1 내지 9개의 PEG 분자들이 IL-10 이량체의 소단위의 N-말단에 있는 아미노산 잔기의 알파 아미노 그룹에 링커를 통해 공유 부착되어 있는 모노-PEG-IL-10이다. 하나의 IL-10 소단위에서의 모노페길화는 일반적으로 소단위 셔플링으로 인해 비-페길화, 모노페길화 및 다이페길화 IL-10의 비-균질 혼합물을 생성한다. 더욱이, 페길화 반응이 진행시켜 완결되도록 하는 것은 비-특이적인 다중-페길화 IL-10을 생성할 것이므로, 그 생물활성을 감소시킬 것이다. 그러므로, 본 출원의 특정 구체예들은 본 명세서에 기재된 방법들에 의해 생성된 모노- 및 다이-페길화 IL-10의 혼합물의 투여를 포함한다.
특정 구체예들에서, PEG 모이어티의 평균 분자량은 약 5kDa 내지 약 50kDa 이다. IL-10에 대한 PEG 부착 방법 또는 부착 부위가 중요한 것은 아니지만, 특정 구체예들에서 페길화는 IL-10 제제의 활성을 변화시키지 않거나, 단지 최소한으로만 변화시킨다. 특정 구체예들에서, 반감기의 증가는 생물학적 활성의 임의의 감소 보다 더 크다. PEG-IL-10의 생물학적 활성은 전형적으로 미국 특허 제 7,052,686에 기재된 바와 같이, 세균 항원 (지질다당질 (LPS))로 감염시키고 PEG-IL-10로 치료한 대상체의 혈청 내 염증성 사이토카인 (예컨대, TNF-α 또는 IFN-γ) 수준을 평가하고 함으로써 측정된다.
IL-10 변이체는 혈청 반감기 증강, IL-10에 대한 면역 반응 감소, 정제 또는 준비의 용이, IL-10의 그 단량체 소단위로의 전환 감소, 치료 효능의 개선, 및 치료 사용 중의 부작용의 중증도 또는 발생의 감소를 비롯한 다양한 목적들을 염두에 두고 제조될 수 있다. 아미노산 서열 변이체는, 일부는 번역 후 변이체, 예컨대, 당화 변이체일 수 있으나 통상적으로 자연적으로 발견되지 않는 예정된 변이체이다. IL-10의 임의의 변이체는 적합한 IL-10 활성 수준을 유지하는 한 사용될 수 있다.
어구 “보존적 아미노산 치환”은 단백질 내 아미노산(들)을 유사한 측쇄 산도, 염기도, 전하, 극성, 또는 크기의 측쇄를 가지는 아미노산으로 치환함으로써 단백질의 활성을 보존하는 치환을 지칭한다. 보존적 아미노산 치환들은 일반적으로 다음 그룹들에 속하는 아미노산 잔기들의 치환을 수반한다: 1) L, I, M, V, F; 2) R, K; 3) F, Y, H, W, R; 4) G, A, T, S; 5) Q, N; 및 6) D, E. 치환, 삽입, 또는 결실의 유도는 상이한 변이체 단백질 또는 상이한 종들의 단백질들의 아미노산 서열들의 정렬에 기초할 수 있다. 그러므로, 임의의 자연-발생 IL-10 폴리펩티드 이외에, 본 출원은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개, 일반적으로 20, 10, 또는 5개 이하의 아미노산 치환들을 가지는 것을 고려하며, 여기서 치환은 일반적으로 보존적 아미노산 치환이다.
본 출원은 또한 성숙 IL-10에서 유래한 인접 아미노산 잔기들을 내포하는 성숙 IL-10의 활성 단편들 (예컨대, 하위서열)을 고려한다. 펩티드 또는 폴리펩티드 하위서열의 인접 아미노산 잔기들의 길이는 하위서열이 유래되는 특이적 자연-발생 아미노산 서열들에 따라 달라진다. 일반적으로, 펩티드 및 폴리펩티드는 약 20개 아미노산 내지 약 40개 아미노산, 약 40개 아미노산 내지 약 60개 아미노산, 약 60개 아미노산 내지 약 80개 아미노산, 약 80개 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 약 100개 아미노산 내지 약 120개 아미노산, 약 120개 아미노산 내지 약 140개 아미노산, 약 140개 아미노산 내지 약 150개 아미노산, 약 150개 아미노산 내지 약 155개 아미노산, 약 155개 아미노산 내지 전장 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다.
또한, IL-10 폴리펩티드는 정의된 길이의 인접 아미노산들에 대해 참조 서열과 비교한, 정의된 서열 동일성을 가질 수 있다 (예컨대, “비교 윈도우"). 비교를 위한 서열 정렬 방법은 해당 분야에 잘 공지되어 있다. 비교용 최적의 서열 정렬은 예컨대, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘; Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 방법의 조사; 이들 알고리즘의 자동화 시행 (Wisconsin Genetics Software Package, Madison, WI의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA); 또는 수작업 정렬 및 시각적 감찰(예컨대, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 보충 참고))로 실행될 수 있다.
한 예로서, 적합한 IL-10 폴리펩티드는 약 20개 아미노산 내지 약 40개 아미노산, 약 40개 아미노산 내지 약 60개 아미노산, 약 60개 아미노산 내지 약 80개 아미노산, 약 80개 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 약 100개 아미노산 내지 약 120개 아미노산, 약 120개 아미노산 내지 약 140개 아미노산, 약 140개 아미노산 내지 약 150개 아미노산, 약 150개 아미노산 내지 약 155개 아미노산, 약 155개 아미노산 내지 전장 펩티드 또는 폴리펩티드의 인접 스트레치에 대해 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%, 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
하기에서 더욱 논의되는 바와 같이, IL-10 폴리펩티드는 자연 공급원 (예컨대, 그 자연-발생 환경 이외의 환경)으로부터 단리될 수 있으며 (예컨대, 유전자 변형된 숙주 세포, 가령, 세균, 효모, 피치아, 곤충 세포 등에서) 재조합하여 제조될 수도 있는데, 여기서 유전자 변형된 숙주 세포는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 사용하여 변형된다. IL-10 폴리펩티드는 또한 (예컨대, 무세포 화학적 합성에 의해) 합성하여 제조될 수도 있다.
IL-10 제제들을 인코딩하는 핵산 분자가 본 출원에 의해 고려되는데, 자연-발생 및 비-자연 발생 아이소형, 대립형질 변이체 및 스플라이스 변이체가 포함된다. 본 출원은 자연-발생 DNA 서열로부터 하나 이상의 염기들이 달라지지만 유전자 코드의 퇴행성으로 인해 IL-10 폴리펩티드에 상응하는 아미노산 서열로 여전히 번역되는 핵산 서열들을 포함한다.
IL-10의 생성 방법
본 출원의 폴리펩티드는 비-재조합 (예컨대, 화학적 합성) 및 재조합 방법들을 비롯한 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다.
화학적 합성
폴리펩티드가 화학적으로 합성되는 경우, 합성은 액체상 또는 고체상에 의해 진행될 수 있다. 고체상 펩티드 합성 (SPPS)은 비자연 아미노산 및/또는 펩티드/단백질 골격 변형을 포함하게 할 수 있다. 본 출원의 폴리펩티드들을 합성하기 위해, 다양한 형태의 SPPS, 가령, 9-플루오렌일메톡시카르보닐 (Fmoc) 및 t-부틸옥시카르보닐 (Boc)을 사용할 수 있다. 이러한 화학적 합성에 관한 상세는 해당 분야에 공지이다 (예컨대, Ganesan A. (2006) Mini Rev. Med. Chem. 6:3-10; 및 Camarero J.A. 외., (2005) Protein Pept Lett. 12:723-8).
고체상 펩티드 합성은 이후 기재하는 바에 따라 실시될 수 있다. 알파 작용기 (Nα) 및 임의의 반응성 측쇄들을 산-분해성 또는 염기-분해성 그룹들로 보호한다. 이러한 보호 그룹들은 아마이드 결합을 연결시키는 조건하에서 안정하지만 형성되어 있는 펩티드 사슬을 손상시키지 않고 용이하게 절단될 수 있다. α-아미노 작용기에 적합한 보호 그룹들에는 다음이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다: Boc, 벤질옥시카르보닐 (Z), O-클로르벤질옥시카르보닐, 바이-페닐아이소프로필옥시카르보닐, tert-아밀옥시카르보닐 (Amoc), α, α-다이메틸-3,5-다이메톡시-벤질옥시카르보닐, o-나이트로설페닐, 2-사이아노-t-부톡시-카르보닐, Fmoc, 1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사일로헥스-1-일리덴)에틸 (Dde) 등.
적합한 측쇄 보호 그룹들에는 다음이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다: 아세틸, 알릴 (All), 알릴옥시카르보닐 (Alloc), 벤질 (Bzl), 벤질옥시카르보닐 (Z), t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 벤질옥시메틸 (Bom), o-브로모벤질옥시카르보닐, t-부틸 (tBu), t-부틸다이메틸실릴, 2-클로로벤질, 2-클로로벤질옥시카르보닐, 2,6-다이클로로벤질, 사이클로헥실, 사이클로펜틸, 1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸 (Dde), 아이소프로필, 4-메톡시-2,3-6-트라이메틸벤질설폰일 (Mtr), 2,3,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설폰일 (Pmc), 피발릴, 테트라하이드로피란-2-일, 토실 (Tos), 2,4,6-트라이메톡시벤질, 트라이메틸실릴 및 트라이틸 (Trt).
고체상 합성에서, C-말단 아미노산은 적합한 지지재에 결합된다. 적합한 지지재는 합성 과정의 단계식 축합 및 절단 반응에 관한 시약 및 반응 조건들에 대해서는 비활성이며 사용되는 반응 매질에서 용해하지 않는 재료이다. 상업적으로 구입가능한 지지재의 예들에는, 반응성 그룹들 및/또는 폴리에틸렌 글리콜; 클로로메틸화 스타이렌/다이비닐벤젠 코폴리머; 하이드록시메틸화 또는 아미노메틸화 스타이렌/다이비닐벤젠 코폴리머; 등으로 변형되어 있는 스타이렌/다이비닐벤젠 코폴리머가 포함된다. 펩티드 산의 준비가 필요한 경우, 4-벤질옥시벤질-알콜 (왕-앵커, Wang-anchor) 또는 2-클로로트라이틸 클로라이드를 이용하여 유도된 폴리스타이렌 (1%)-다이비닐벤젠 또는 TentaGel®이 사용될 수 있다. 펩티드 아마이드의 경우, 5-(4'-아미노메틸)-3',5'-다이메톡시페녹시)발레르산 (PAL-앵커) 또는 p-(2,4-다이메톡시페닐-아미노 메틸)-페녹시 그룹 (링크 아마이드 앵커, Rink amide anchor)을 이용하여 유도된 폴리스타이렌 (1%) 다이비닐벤젠 또는 TentaGel®이 사용될 수 있다.
폴리머 지지체로의 연결은, 에탄올, 아세토니트릴, N,N-다이메틸포름아마이드 (DMF), 다이클로로메탄, 테트라하이드로푸란, N-메틸피롤리돈 또는 유사한 용매중에서, 활성화제를 첨가하여 C-말단 Fmoc-보호된 아미노산을 지지재와 실온 또는 승온 (예컨대 40 ℃ 내지 60 ℃)에서, 예컨대, 2 내지 72 시간의 반응시간으로 반응시킴으로써 이루어질 수 있다.
Nα-보호된 아미노산 (예컨대, Fmoc 아미노산)과 PAL, 왕 또는 링크 앵커와의 커플링은, 예를 들어, HOBt가 첨가된 TBTU가 보조된 1-하이드록시벤조트라이아졸 또는 1-하이드록시-7-아자벤조트라이아졸의 존재하에 또는 부재하에서, 예컨대, 다이이소프로필에틸아민 (DIEA), 트라이에틸아민 또는 N-메틸모르폴린, 예컨대, 다이아이소프로필에틸아민과 같은 염기가 첨가되거나 또는 첨가되지 않은 채로, 2 내지 72 시간 (예컨대, 3 시간의 반응시간동안 1.5 배 내지 3 배 과량의 아미노산 및 커플링제하에, 예를 들어, 2 배 과량의 아미노산 및 커플링제하에, 약 10 ℃ 내지 50 ℃, 예를 들어, 25 ℃의 온도에서, 다이메틸포름아마이드, N-메틸피롤리돈 또는 다이클로로 메탄, 예컨대, 다이메틸포름아마이드와 같은 용매중에서), N,N'-다이사이클로헥실카르보다이이미드 (DCC), N,N'-다이아이소프로필카르보다이이미드 (DIC) 또는 기타 카르보다이이미드, 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU) 또는 기타 우로늄염, o-아실우레아, 벤조트라이아졸-1-일-트리스피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP) 또는 기타 포스포늄염, N-하이드록시숙신이미드, 기타 N-하이드록시이미드 또는 옥심과 같은 커플링제의 보조하에 수행될 수 있다.
상기 조건하에서 커플링 시약 대신, 활성 에스터 (예컨대, 펜타플루오로페닐, p-나이트로페닐 등), Nα-Fmoc-아미노산의 대칭성 무수물, 이의 산 염화물 또는 산 불소화물 또한 사용할 수 있다.
Nα-보호된 아미노산 (예컨대, Fmoc 아미노산)은 DIEA를 추가한 다이클로로메테인에서 2-클로로트라이틸 수지에 10 내지 120분, 예컨대, 20분의 반응 시간으로 커플링되지만, 이러한 용매 및 이러한 염기의 사용에 제한되는 것은 아니다.
종래의 펩티드 합성 방법들에 따라, 전형적으로 자동화된 펩티드 합성장치에서 보호된 아미노산들의 연속 커플링이 실시될 수 있다. 5 내지 20 분 동안 다이메틸포름아마이드에서 예컨대, 피페리딘 (10% 내지 50%)으로, 예컨대, DMF에서 50% 피페리딘으로 2 x 2 분 그리고 DMF에서 20% 피페리딘으로 1 x 15 분으로 처리함으로써, 고체상에서 커플링된 아미노산의 Nα-Fmoc 보호 그룹을 절단 후, 3 배 내지 10 배 과량, 예컨대, 10 배 과량인 그 다음 보호된 아미노산을 비활성, 비수성, 극성 용매, 가령, 다이클로로메테인, DMF 또는 둘의 혼합물 중에서 약 10 ℃ 내지 50 ℃, 예컨대, 25 ℃ 의 온도에서 이전 아미노산에 커플링시킨다. PAL, 왕 또는 링크 앵커에 첫 번째 Nα-Fmoc 아미노산을 커플링하기 위해 이미 언급된 시약들이 커플링제로써 적합하다. 보호된 아미노산의 활성 에스터, 그 염화물 또는 불소화물 또는 대칭성 무수물이 또한 대체물로서 사용될 수 있다.
고체상 합성의 종료시, 펩티드는 지지재로부터 절단되며 동시에 측쇄 보호그룹이 절단된다. 절단은 5 % - 20 % v/v 스캐빈저, 가령, 다이메틸설파이드, 에틸메틸설파이드, 티오아니솔, 티오크레졸, m-크레졸, 아니솔 에탄다이티올, 페놀 또는 물, 예컨대, 15% v/v 다이메틸설파이드/에탄다이티올/m-크레졸 1:1:1이 첨가된 기타 강산성 매질 또는 트라이플루오로아세트산으로 0.5 내지 3 시간, 예컨대, 2 시간 동안 수행될 수 있다. 완전히 보호된 측쇄들의 펩티드들은 2-클로로트라이틸 앵커를 빙초산/트라이플루오로에탄올/다이클로로메테인 2:2:6으로 절단하여 얻는다. 이렇게 보호된 펩티드는 실리카 겔 상의 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 펩티드가 왕 앵커에 의해 고체상에 연결되는 경우, 그리고 C-말단 알킬아마이드화된 펩티드를 얻고자 하는 경우, 절단은 알킬아민 또는 플루오로알킬아민의 아미노분해에 의해 실시될 수 있다. 아미노분해는 약 -10°C 내지 50°C (예컨대, 약 25°C)의 온도, 및 약 12 내지 24 시간 (예컨대, 약 18 시간)의 반응 시간에서 실시된다. 또한 펩티드는 예컨대, 메탄올과의 재-에스터화에 의해 지지체로부터 절단될 수 있다.
펩티드를 침전시켜 에터에 남아있는 스캐빈저 및 절단된 보호 그룹들을 분리하기 위하여, 얻어진 산성 용액은 냉온 에터 또는 n-헥세인의 3 내지 20배량, 예컨대, 다이에틸 에터의 10배 과량과 혼합될 수 있다. 빙초산으로부터 여러번 펩티드를 재-침전시킴으로써 추가 정제를 실시할 수 있다. 얻어진 침전물을 물 또는 tert-부탄올 또는 이 두 용매의 혼합물, 예컨대, tert-부탄올/물의 1:1 혼합물에 용해시켜 동결건조시킬 수 있다.
얻어진 펩티드를, 아세테이트 형태의 약 염기성 수지를 통한 이온 교환; 비-유도성 폴리스타이렌/다이비닐벤젠 코폴리머 (예컨대, Amberlite®XAD) 에서의 소수성 흡착 크로마토그래피; 실리카 겔에서의 흡착 크로마토그래피; 예컨대, 카르복시메틸 셀룰로오스에서의 이온 교환 크로마토그래피; 예컨대, Sephadex®G-25에서의 분배 크로마토그래피; 역류 분배 크로마토그래피; 또는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 예컨대, 옥틸 또는 옥타데실실릴실리카 (ODS) 상들에서의 역상 HPLC를 비롯한 다양한 크로마토그래피법으로 정제할 수 있다.
B. 재조합 생성
인간 및 마우스 IL-10의 준비를 설명하는 방법들은, 예를 들면, 미국 특허 제 5,231,012호에서 찾을 수 있으며, 이 문헌은 재조합 및 그 외 합성 기법들을 비롯하여, IL-10 활성을 가지는 단백질들의 생성 방법들을 개시한다. IL-10은 바이러스에서 유래할 수 있으며, 엡스타인 바 바이러스로부터 바이러스 IL-10의 클로닝 및 발현은 (BCRF1 단백질) Moore 외., (1990) Science 248:1230에 개시되어 있다. IL-10은 해당 기술분야에 공지된 표준 기법들, 가령, 본 명세서에 기재된 기법들을 사용하여 수많은 방식으로 얻을 수 있다. 재조합 인간 IL-10은 또한, 예컨대, PeproTech, Inc.사, Rocky Hill, N.J로부터 상업적으로 구입가능하다.
재조합 기법들을 사용하여 폴리펩티드를 제조하는 경우, 폴리펩티드는 임의의 적합한 작제물 및 임의의 적합한 숙주 세포를 사용하여 세포내 단백질로서 또는 분비된 단백질로서 제조될 수 있고, 이 때 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포, 가령, 각각 세균 (예컨대, 대장균) 또는 효모 숙주 세포일 수 있다. 숙주 세포로서 사용될 수 있는 그 외 진핵 세포의 예들에는 곤충 세포, 포유동물 세포, 및/또는 식물 세포가 포함된다. 포유동물 숙주 세포가 사용되는 경우, 이들은 인간 세포 (예컨대, HeLa, 293, H9 및 Jurkat 세포); 마우스 세포 (예컨대, NIH3T3, L 세포, 및 C127 세포); 영장류동물 세포 (예컨대, Cos 1, Cos 7 및 CV1); 및 햄스터 세포 (예컨대, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포)를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 발현에 적합한 다양한 숙주-벡터 시스템들이 해당 기술 분야에 공지된 표준 절차에 따라 사용될 수 있다. 예컨대, Sambrook 외., 1989 Current Protocols in Molecular Biology Cold Spring Harbor Press, New York; 및 Ausubel 외. 1995 Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Wiley 및 Sons를 참고하라. 숙주 세포로의 유전자 재료 도입 방법들에는, 예를 들면, 형질전환, 전기천공, 접합, 칼슘 포스페이트 방법 등이 포함된다. 전달 방법은 도입되는 폴리펩티드-인코딩 핵산의 안정한 발현을 제공하도록 선택될 수 있다. 폴리펩티드-인코딩 핵산은 유전되는 에피좀-요소 (예컨대, 플라스미드)로서 제공될 수 있으며 게놈상 통합될 수 있다. 관심 폴리펩티드 생성에 사용하기에 적절한 다양한 벡터들은 상업적으로 구입가능하다.
벡터들은 숙주 세포 내 에서 염색체외 유지를 제공할 수 있으며 또는 숙주 세포 게놈으로의 통합을 제공할 수 있다. 발현 벡터는 전사 및 번역 조절 서열들을 제공하며, 전사 개시 영역 그리고 전사 및 번역 종결 영역의 전사 조절하에 코딩 영역이 작동가능하게 연결되는 경우 유도 또는 항시 발현을 제공할 수 있다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열들은, 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 시작 및 정지 서열, 번역 시작 및 정지 서열, 및 인핸서 또는 활성인자 서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 프로모터는 항시성 또는 유도성일 수 있고, 강한 항시성 프로모터 (예컨대, T7) 일 수 있다.
발현 작제물들은 일반적으로 관심 단백질들을 인코딩하는 핵산 서열들의 삽입을 제공하기 위하여 프로모터 서열 근방에 위치한 편리한 제한 부위들을 가진다. 상기 벡터를 내포하는 세포의 선별을 용이하게 하기 위해 발현 숙주에서 작동가능한 선별 표지자가 제공될 수 있다. 더욱이, 발현 작제물은 추가 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 하나 또는 두 개의 복제 시스템들을 가질 수 있어서, 유기체, 예를 들면, 포유동물 또는 곤충 세포에서 발현을 위해 그리고 원핵 숙주에서 클로닝 및 증폭을 위해 유지될 수 있게 한다. 또한, 발현 작제물은 형질전환된 숙주 세포의 선별을 가능하게 하는 선별 표지자 유전자를 내포할 수 있다. 선별 유전자들은 해당 기술 분야에 널리 공지되어 있으며 사용되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.
단백질의 단리 및 정제는 해당 기술 분야에 공지된 방법들에 따라 이루어질 수 있다. 예를 들면, 단백질은 항시적으로 및/또는 유도시에 단백질을 발현시키도록 유전자 변형된 세포의 용해물로부터, 또는 합성 반응 혼합물로부터 면역친화성 정제에 의해 단리될 수 있는데, 면역친화성 정제는 일반적으로 샘플을 항- 단백질 항체와 접촉시키는 단계, 비-특이적으로 결합된 물질을 제거하기 위해 세정하는 단계, 그리고 특이적으로 결합된 단백질을 용리시키는 단계를 수반한다. 단리된 단백질은 투석 및 단백질 정제에 일반적으로 사용되는 그 외 방법들에 의해 추가 정제될 수 있다. 한 구체예에서, 단백질은 금속 킬레이트 크로마토그래피 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 단백질들은 단리를 촉진시키기 위한 변형을 내포할 수 있다.
폴리펩티드는 실질적으로 순수한 또는 단리된 형태 (예컨대, 그 외 폴리펩티드들이 없음)로 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 존재할 수 있는 다른 성분들 (예컨대, 다른 폴리펩티드 또는 다른 숙주 세포 성분)에 비해 해당 폴리펩티드가 풍부한 조성물로 제공될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드가 발현된 다른 단백질들이 실질적으로 없는, 예컨대, 약 90% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 1% 미만인 조성물로 제공되도록 정제된 폴리펩티드가 제공될 수 있다.
IL-10 폴리펩티드를 인코딩할 수 있는 작제물들을 제공하기 위해 해당 기술 분야에 공지된, 상이한 IL-10 - 관련 핵산들을 조작하는 재조합 기법들을 사용하여 IL-10 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 특정 아미노산 서열이 제공되는 경우, 통상의 기술자들은, 예를 들면, 분자 생물학의 배경지식 및 경험에 비추어 이러한 아미노산 서열을 인코딩하는 다양한 상이한 핵산 분자를 알고 있을 것임이 이해될 것이다.
아마이드 결합 치환
일부 경우, IL-10은 펩티드 결합 이외 하나 이상의 링키지들을 포함하는데, 예컨대, 최소한 두 개의 인접 아미노산들은 아마이드 결합 이외의 하나의 링키지를 통해 결합된다. 예를 들면, 원하지 않는 단백질분해 또는 그 외 분해 수단들을 감소 또는 제거하기 위해, 및/또는 혈청 안정성을 증가시키기 위해, 및/또는 입체형태 유연성을 제한 또는 증가시키기 위해, IL-10의 골격 내 하나 이상의 아마이드 결합이 치환될 수 있다.
또 다른 예에서, IL-10에서 하나 이상의 아마이드 링키지 (-CO-NH-)는 아마이드 링키지의 동배체인 링키지, 가령, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 또는 -CH2SO-로 치환될 수 있다. IL-10의 하나 이상의 아마이드 링키지는 또한, 예를 들면, 감소된 동배체 슈도펩티드 결합으로 치환될 수도 있다. Couder 외. (1993) Int. J. Peptide Protein Res. 41:181-184를 참고하라. 이러한 치환 및 치환 방법은 해당 기술 분야의 통상의 기술자들에게 공지되어 있다.
아미노산 치환
하나 이상의 아미노산 치환들이 IL-10 폴리펩티드 내에서 이루어질 수 있다. 다음은 비-제한적 예들이다:
a) 알라닌, 류신, 아이소류신, 발린, 노르류신, (들)-2-아미노부티르산, (들)-사이클로헥실알라닌 또는, 측쇄, 고리쇄 및 직쇄의 알킬, 알켄일 또는 알킨일 치환을 비롯한 C1-C10개 탄소의 지방족 측쇄로 치환된 그 외 단순 알파-아미노산을 포함하는, 알킬-치환된 소수성 아미노산의 치환;
b) 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 설포티로신, 바이페닐알라닌, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 2-벤조티엔일알라닌, 3-벤조티엔일알라닌, 히스티딘을 비롯한, 방향족-치환된 소수성 아미노산의 치환, 상기 열거된 방향족 아미노산의 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 아자, 할로겐화 (플루오로, 클로로, 브로모, 또는 아이오도) 또는 알콕시 (C1-C4의)-치환된 형태들을 포함, 이들의 예시적 예들은 다음과 같다: 2-, 3- 또는 4-아미노페닐알라닌, 2-, 3- 또는 4-클로로페닐알라닌, 2-, 3- 또는 4-메틸페닐알라닌, 2-, 3- 또는 4-메톡시페닐알라닌, 5-아미노-, 5-클로로-, 5-메틸- 또는 5-메톡시트립토판, 2'-, 3'-, 또는 4'-아미노-, 2'-, 3'-, 또는 4'-클로로-, 2, 3, 또는 4-바이페닐알라닌, 2'-, 3'-, 또는 4'-메틸-, 2-, 3- 또는 4-바이페닐알라닌, 및 2- 또는 3-피리딜알라닌;
c) 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴, 2,3-다이아미노프로피온산, 호모아르기닌을 비롯한, 염기성 측쇄를 내포하는 아미노산의 치환, 전술한 아미노산들의 알킬, 알켄일, 또는 아릴-치환된 (C1-C10의 분지형, 선형, 또는 고리형) 유도체들을 포함, 예를 들면, 치환은 헤테로원자에 존재하거나 (가령, 알파 질소, 또는 원위 질소 또는 질소들) 또는 프로-R 위치 (pro-R position)의 알파 탄소에 존재함. 예시적인 예들로서 제공되는 화합물들은 다음을 포함한다: N-엡실론-아이소프로필-리신, 3-(4-테트라하이드로피리딜)-글리신, 3-(4-테트라하이드로피리딜)-알라닌, N,N-감마, 감마'-다이에틸-호모아르기닌. 또한 알킬 그룹이 알파-탄소의 프로-R 위치를 차지하고 있는 알파-메틸-아르기닌, 알파-메틸-2,3-다이아미노프로피온산, 알파-메틸-히스티딘, 알파-메틸-오르니틴과 같은 화합물들도 포함된다. 또한 알킬, 방향족, 헤테로방향족 (이 ? 헤테로방향족 그룹은 하나 이상의 질소, 산소 또는 황 원자들을 단독으로 또는 조합하여 보유함), 카르복시산 또는 임의의 많은 공지된 활성화 유도체들, 가령, 산 염화물, 활성 에스터, 활성 아졸라이드 및 관련 유도체들, 및 리신, 오르니틴, 또는 2,3-다이아미노프로피온산으로부터 형성된 아마이드도 포함됨;
d) 아스파르트산, 글루탐산, 호모글루탐산, 티로신, 2,4-다이아미노프로피온산, 오르니틴 또는 리신의 알킬, 아릴, 아릴알킬, 및 헤테로아릴 설폰아마이드 및 테트라졸-치환된 알킬 아미노산들을 비롯한, 산성 아미노산들의 치환;
e) 아스파라긴, 글루타민, 및 아스파라긴 또는 글루타민의 알킬 또는 방향족 치환된 유도체들을 비롯한 측쇄 아마이드 잔기들의 치환; 및
f) 세린, 트레오닌, 호모세린, 2,3-다이아미노프로피온산, 및 세린 또는 트레오닌의 알킬 또는 방향족 치환된 유도체들을 비롯한, 하이드록실-내포 아미노산들의 치환.
일부 경우들에서, IL-10은 유전자 인코딩되지 않은 자연 발생 L-아미노산, 합성 L-아미노산, 또는 아미노산의 D-광학이성질체를 하나 이상 포함한다. 예를 들면, IL-10은 D-아미노산들만을 포함할 수 있다. 예를 들면, IL-10 폴리펩티드는 다음 잔기들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 하이드록시프롤린, β-알라닌, o-아미노벤조산, m-아미노벤조산, p-아미노벤조산, m-아미노메틸벤조산, 2,3-다이아미노프로피온산, α-아미노아이소부티르산, N-메틸글리신 (사르코신), 오르니틴, 시트룰린, t-부틸알라닌, t-부틸글리신, N-메틸아이소류신, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, 노르류신, 나프틸알라닌, 피리딜알라닌 3-벤조티엔일 알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 페니실라민, 1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린-3-카르복시산, β-2-티엔일알라닌, 메티오닌 설폭사이드, 호모아르기닌, N-아세틸 리신, 2,4-다이아미노 부티르산, rho-아미노페닐알라닌, N-메틸발린, 호모시스테인, 호모세린, ε-아미노 헥산산, ω-아미노헥산산, ω-아미노헵탄산, ω-아미노옥탄산, ω-아미노데칸산, ω-아미노테트라데칸산, 사이클로헥실알라닌, α,γ-다이아미노부티르산, α,β-다이아미노프로피온산, δ-아미노 발레르산, 및 2,3-다이아미노부티르산.
추가 변형
다이설파이드 링키지를 통해 또 다른 펩티드에 링키지를 제공하기 위해 또는 IL-10 폴리펩티드의 고리화를 제공하기 위해 시스테인 잔기 또는 시스테인 유사체가 IL-10 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 시스테인 또는 시스테인 유사체의 도입 방법들이 해당 분야에 공지되어 있다; 예컨대, 미국 특허 제 8,067,532를 참고하라.
IL-10 폴리펩티드는 고리화 될 수 있다. 하나 이상의 시스테인 또는 시스테인 유사체가 IL-10 폴리펩티드에 도입될 수 있으며, 여기서 도입되는 시스테인 또는 시스테인 유사체는 두 번째 도입되는 시스테인 또는 시스테인 유사체와 다이설파이드 결합을 형성할 수 있다. 다른 고리화 수단은 옥심 링커 또는 란티오닌 링커의 도입을 포함한다; 예컨대, 미국 특허 제 8,044,175를 참고하라. 고리화 결합을 형성할 수 있는 아미노산들 (또는 비-아미노산 모이어티들)의 임의의 조합이 사용 및/또는 도입될 수 있다. 고리화 결합은 다리(bridge)의 도입을 가능하게 하는 작용기와 아미노산들의 임의의 조합으로 (또는 아미노산 및 -(CH2)n-CO- 또는 -(CH2)n-C6H4-CO-으로) 생성될 수 있다. 일부 예들은 다이설파이드, 다이설파이드 모방체, 가령, -(CH2)n- 카르바 다리, 티오아세탈, 티오에터 다리 (시스타티오닌 또는 란티오닌) 및 에스터 및 에터를 내포하는 다리이다. 이들 예에서, n은 임의의 정수일 수 있으나, 종종 10 미만이다.
그 외 변형들에는, 예를 들면, N-알킬 (또는 아릴) 치환 (ψ또는 락탐 및 그 외 고리 구조들을 만들기 위한 골격 가교결합이 포함된다. 그 외 유도체들은 치환된 아마이드, 가령, 알킬아마이드 및 하이드라지드를 포함하는 C-말단 하이드록시메틸 유도체, o-변형된 유도체 (예컨대, C-말단 하이드록시메틸 벤질 에터), N-말단 변형된 유도체를 포함한다.
일부 경우들에서, IL-10 폴리펩티드 내 하나 이상의 L-아미노산들은 하나 이상의 D-아미노산들로 치환된다.
일부 경우에서, IL-10 폴리펩티드는 레트로인버소 (retroinverso) 유사체이다 (예컨대, Sela 및 Zisman (1997) FASEB J. 11:449를 참고하라). 레트로-인버소 펩티드 유사체는 아미노산 서열의 방향이 역방향이고 (레트로) 내부의 하나 이상의 아미노산들의 키랄성, D- 또는 L-이 역전된 (인버소), 예컨대, L-아미노산 대신 D-아미노산을 사용하는, 선형 폴리펩티드들의 이성질체이다 [ 예컨대, Jameson 외. (1994) Nature 368:744; 및 Brady 외. (1994) Nature 368:692 참고].
IL-10 폴리펩티드는 “단백질 형질도입 도메인” (PTD)을 포함할 수 있는데, 이는 지질 이중층, 마이셀, 세포막, 소기관 막, 또는 수포 막을 경유하는 것을 용이하게 하는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 또는 유기 또는 무기 분자를 지칭한다. 또 다른 분자에 부착되는 PTD는 분자가 막을 경유하는 것, 예를 들면, 세포외 공간으로부터 세포내 공간으로, 또는 세포질로부터 소기관 내부로 가는 것을 용이하게 한다. 일부 구체예들에서, PTD는 IL-10 폴리펩티드의 아미노 말단에 공유 결합되는 반면, 다른 구체예들에서, PTD는 IL-10 폴리펩티드의 카르복실 말단에 공유 결합된다. 예시적인 단백질 형질도입 도메인들에는, 최소 운데카펩티드 단백질 형질도입 도메인 (YGRKKRRQRRR; 서열 번호: 1을 포함하는 HIV-1 TAT의 47-57 잔기들에 해당); 세포 내부로 직접 유입하기에 충분한 여러 아르기닌 잔기들 (예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10-50개 아르기닌)을 포함하는 폴리아르기닌 서열; VP22 도메인 (Zender 외. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96); 드로소필라 안테나피디아 단백질 형질도입 도메인 (Noguchi 외. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737); 절두된 인간 칼시토닌 펩티드 (Trehin 외. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256); 폴리리신 (Wender 외. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR (서열 번호: 2); Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (서열 번호: 3); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (서열 번호: 4); 및 RQIKIWFQNRRMKWKK (서열 번호: 5)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 PTD들에는, YGRKKRRQRRR (서열 번호:6), RKKRRQRRR (서열 번호:7); 3개 아르기닌 잔기 내지 50개 아르기닌 잔기들의 아르기닌 호모폴리머가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니며; 예시적인 PTD 도메인 아미노산 서열들에는 다음 중 어느 하나가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다: YGRKKRRQRRR (서열 번호: 8); RKKRRQRR (서열 번호:9 ); YARAAARQARA (서열 번호: 10); THRLPRRRRRR (서열 번호: 11); 및 GGRRARRRRRR (서열 번호: 12).
IL-10 폴리펩티드의 C-말단 단부의 아미노산의 카르복실 그룹 COR3은 유리 형태로 (R3 = OH) 또는 생리학적으로-허용되는 알칼리 또는 알칼리 토류 염, 가령, 예컨대, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염의 형태로 존재할 수 있다. 카르복실 그룹은 또한 1차, 2차 또는 3차 알콜, 가령, 예컨대, 메탄올, 분지형 또는 비분지형 C1-C6-알킬 알콜, 예컨대, 에틸 알콜 또는 tert-부탄올과 에스터화 될 수 있다. 카르복실 그룹은 또한 1차 또는 2차 아민, 가령, 암모니아, 분지형 또는 비분지형 C1-C6-알킬아민 또는 C1-C6 다이-알킬아민, 예컨대, 메틸아민 또는 다이메틸아민과 아마이드화 될 수 있다.
IL-10 폴리펩티드의 N-말단에 있는 아미노산 NR1R2의 아미노 그룹은 유리 형태로 (R1 = H 및 R2 = H) 또는 생리학적으로-허용되는 염, 가령, 예컨대, 염화물 또는 아세테이트의 형태로 존재할 수 있다. 아미노 그룹은 또한 산으로 아세틸화될 수 있고, 그리하여 R1 = H이고 R2 = 아세틸, 트라이플루오로아세틸, 또는 아다만틸이다. 아미노 그룹은 펩티드 화학에서 통상적으로 사용되는 아미노-보호 그룹, 가령, 상기 제시된 그룹들 (예컨대, Fmoc, 벤질옥시-카르보닐 (Z), Boc, 및 Alloc)에 의해 보호된 형태로 존재할 수 있다. 아미노 그룹은 N-알킬화될 수 있으며 여기서 R1 및/또는 R2 = C1-C6 알킬 또는 C2-C8 알켄일 또는 C7-C9 아랄킬이다. 알킬 잔기들은 직쇄, 분지형 또는 고리형 (예컨대, 각각, 에틸, 아이소프로필 및 사이클로헥실)일 수 있다.
IL-10 기능을 증대 및/또는 모방하기 위한 특수한 변형
본 출원에 개시된 치료방법들 (예컨대, IL-10)의 더욱 물리적인 성질들 중 하나 및/또는 이러한 치료방법들이 투여되는 방식을 개선하는 것이 종종 유익하고 때때로 긴요하다. 물리적 성질들의 개선에는, 예를 들면, 면역원성을 조절하는 것; 수 용해도, 생체이용률, 혈청 반감기, 및/또는 치료 반감기를 증가시키는 방법들; 및/또는 생물학적 활성을 조절하는 것이 포함된다. 예를 들면, 검출 분석법에 사용하기 위한 항체들 (예컨대, 에피토프 태그) 을 높이기 위해 그리고 단백질 정제의 용이성을 제공하기 위해 특정한 변형들이 또한 유용할 수 있다. 이러한 개선은 일반적으로 치료 방법의 생물활성에 부정적인 영향을 미치거나 및/또는 면역원성을 증가시키지 않고 부여되어야 한다.
IL-10의 페길화는 본 출원에 의해 고려되는 하나의 특수한 변형이나, 그 외 다른 변형들에는 당화 (N- 및 O-연결된); 폴리시알화; 혈청 알부민을 포함하는 알부민 융합 분자 (예컨대, 인간 혈청 알부민 (HSA), 시노(cyno) 혈청 알부민, 또는 소 혈청 알부민 (BSA)); 예를 들면, 접합된 지방산 사슬을 통한 알부민 결합 (아실화); 및 Fc-융합 단백질들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
페길화: 단백질 치료들의 임상 효율은 종종 짧은 혈장 반감기 및 프로테아제 분해에 대한 취약성에 의해 제한된다. 다양한 치료 단백질들 (예컨대, 필그라스팀)에 관한 연구는 폴리펩티드 서열을 다양한 비단백질성 폴리머들 , 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중 어느 하나에 접합 또는 연결하는 것을 비롯한 다양한 변형들에 의해 이러한 어려움들이 해결될 수 있음을 보여주었다. 이는 종종 단백질 및 비단백질성 폴리머 모두에 공유 결합되는 연결 모이어티, 예컨대, PEG에 의해 이루어진다. 이러한 PEG-접합된 생체분자는 보다 우수한 물리적 및 열적 안정성을 비롯한 임상적으로 유용한 성질들, 효소적 분해되기 쉬운 취약성에 대한 보호, 증가된 용해도, 보다 긴 생체내 순환 반감기 및 감소된 청소율, 감소된 면역원성 및 항원성, 그리고 감소된 독성을 보유하는 것으로 밝혀졌다.
약동학적 파라미터에 대한 페길화의 유익한 효과들 이외에도, 페길화 자체는 활성을 증대시킬 수 있다. 예를 들면, PEG-IL-10은 페길화되지 않은 IL-10 보다 특정 암들에 대하여 보다 효능있는 것으로 밝혀졌다 (예컨대, EP 206636A2를 참고하라).
폴리펩티드 서열에 접합하기에 적합한 PEG들은 일반적으로 실온에서 수용성이고, 일반식 R(O-CH2-CH2)nO-R을 가지는데, 여기서 R은 수소 또는 보호 그룹, 가령, 알킬 또는 알칸올 그룹이며, n은 1 내지 1000의 정수이다. R이 보호 그룹일 때, 이는 일반적으로 1 내지 8개의 탄소를 가진다. 폴리펩티드 서열에 접합된 PEG는 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 PEG 유도체, “star-PEG”및 다중 분지형 (multi-armed) PEG들이 본 출원에서 고려된다. 본 출원에서 사용되는 PEG의 분자량은 임의의 특정 범위에 한정되지 않으며, 그 예들이 본 명세서의 다른 부분에 제시되어 있다; 예로서, 특정 구체예들은 5kDa 내지 20kDa의 분자량을 가지지만, 그 외 구체예들은 4kDa 내지 10kDa의 분자량을 가진다.
본 출원은 또한, PEG들이 상이한 n 값을 가지고 그리하여 다양한 상이한 PEG들이 특정 비율로 존재하는, 접합체들의 조성물들을 고려한다. 예를 들면, 일부 조성물들은 n=1, 2, 3 및 4인 접합체들의 혼합물을 포함한다. 일부 조성물들에서, n=1인 접합체들의 백분율은 18-25%이고, n=2인 접합체들의 백분율은 50-66%이고, n=3인 접합체들의 백분율은 12-16%이고, n=4인 접합체들의 백분율은 최대 5%이다. 이러한 조성물들은 해당 기술 분야에 공지된 반응 조건 및 정제 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예시적인 반응 조건들이 본 명세서 전반에 기재되어 있다. 접합체들을 분리하기 위해 양이온 교환 크로마토그래피가 사용될 수 있으며, 이 때 예를 들면, 원하는 수의 PEG들이 부착된, 비변형된 단백질 서열들 및 다른 수의 PEG들이 부착된 접합체들이 없도록 정제된 접합체를 내포하는 분획이 식별된다.
페길화는 폴리펩티드의 N-말단에 있는 알파 아미노 그룹, 리신 잔기들의 측쇄 상의 엡실론 아미노 그룹 및 히스티딘 잔기들의 측쇄 상의 이미다졸 그룹에서 가장 빈번하게 발생한다. 대부분의 재조합 폴리펩티드들은 하나의 알파 및 수많은 엡실론 아미노 및 이미다졸 그룹을 보유하기 때문에, 링커 화학에 따라 수많은 위치 이성질체들이 생성될 수 있다. 해당 기술 분야에 공지된 일반적인 페길화 전략들이 본 출원에 적용될 수 있다.
두 가지 널리 사용되는 제 1 세대 활성화 모노메톡시 PEG들 (mPEG들)은 숙신이미딜 카보네이트 PEG (SC-PEG; 예컨대, Zalipsky, 외. (1992) Biotehnol. Appl. Biochem 15:100-114; 및 Miron 및 Wilcheck (1993) Bio-conjug. Chem. 4:568-569 참조) 및 벤조트라이아졸 카보네이트 PEG (BTC-PEG; 예컨대, Dolence, 외. 미국 특허 제 5,650,234 참조)이며, 이들은 우선적으로 리신 잔기들과 반응하여 카바메이트 링키지를 형성하지만, 히스티딘 및 티로신 잔기들과 반응하는 것으로도 공지되어 있다. 특정 분자 (예컨대, IFNα) 상의 히스티딘 잔기에 대한 링키지는 가수분해적으로 불안정한 이미다졸카바메이트 링키지임이 밝혀졌다 (예컨대, Lee 및 McNemar, 미국 특허 제 5,985,263호 참조). 제 2 세대 페길화 기술은 이러한 불안정한 링키지들을 제거할 뿐만 아니라 잔기 반응성에 있어서 선택성이 없도록 설계되었다. PEG-알데하이드 링커의 사용은 환원적 아미노화를 통하여 폴리펩티드의 N-말단 상의 하나의 부위를 표적한다.
PEG는 폴리펩티드 서열 및 폴리에틸렌 글리콜의 하나 이상의 유리 아미노 또는 카르복실 그룹들 사이의 결합을 매개하는 말단 반응성 그룹 (“스페이서")을 통해 본 출원의 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 유리 아미노 그룹에 결합될 수 있는 스페이서를 가지는 PEG는 N-하이드록시숙시닐이미드 폴리에틸렌 글리콜을 포함하며, 이는 N-하이드록시숙시닐이미드로 폴리에틸렌 글리콜의 숙신산 에스터를 활성화시킴으로써 제조될 수 있다. 유리 아미노 그룹에 결합될 수 있는 또 다른 활성화된 폴리에틸렌 글리콜은 2,4-비스(O-메톡시폴리에틸렌글리콜)-6-클로로-s-트라이아진이며, 이는 사이아누르산 염화물과 폴리에틸렌 글리콜 모노에틸 에터를 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 유리 카르복실 그룹에 결합되는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜은 폴리옥시에틸렌다이아민을 포함한다.
스페이서를 가지는 PEG에 대한 본 출원의 폴리펩티드 서열들의 하나 이상의 접합은 다양한 종래의 방법들에 의해 실시될 수 있다. 예를 들면, 접합 반응은 5 내지 10의 pH 용액에서, 4°C 내지 실온의 온도에서, 30 분 내지 20 시간 동안, 4:1 내지 30:1의 시약 대 단백질의 몰비를 사용하여 실시될 수 있다. 반응 조건은 원하는 치환도를 우세하게 생성하는 쪽으로 반응을 유도하도록 선택될 수 있다. 일반적으로, 저온, 낮은 pH (예컨대, pH=5), 및 짧은 반응 시간은 부착된 PEG들의 수를 감소시키는 경향이 있는 반면, 고온, 중성 내지 높은 pH (예컨대, pH≥7), 및 보다 긴 반응 시간은 부착된 PEG들의 수를 증가시키는 경향이 있다. 반응을 종결시키기 위해 해당 기술 분야에 공지된 다양한 수단들이 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서 반응은 반응 혼합물을 산성화시키고, 예컨대, -20°C에서 동결시킴으로써 종결된다. 다양한 분자의 페길화는, 예를 들면, 미국 특허 제 5,252,714; 5,643,575; 5,919,455; 5,932,462; 및 5,985,263호에 논의되어 있다. PEG-IL-10은 예컨대, 미국 특허 제 7,052,686호에 기재되어 있다. 본 출원에서 사용하기 위해 고려되는 구체적인 반응 조건들은 실험 부분에서 제시된다.
본 출원은 또한 PEG 모방체의 사용을 고려한다. PEG의 속성 (예컨대, 향상된 혈청 반감기)을 보유하면서도 몇 가지 추가적인 이로운 성질들을 부여하는 재조합 PEG 모방체가 개발되었다. 예로서, PEG와 유사한 연장 형태를 형성할 수 있는 (예를 들면, Ala, Glu, Gly, Pro, Ser 및 Thr을 포함하는) 단순한 폴리펩티드 사슬들은 관심 펩티드 또는 단백질 약물에 미리 재조합적으로 용해시켜 생성될 수 있다 (예컨대, Amunix's XTEN technology; Mountain View, CA). 이는 제작 과정 동안 추가 접합 단계를 필요없게 한다. 더욱이, 확립된 분자 생물학 기법들은 폴리펩티드 사슬들의 측쇄 조성을 조절할 수 있게 하여, 면역원성 및 제작 성질들을 최적화시킬 수 있다.
당화: 본 출원의 목적을 위하여, "당화”는 넓게는 단백질, 지질 또는 그 외 유기 분자에 글리칸을 부착시키는 효소적 과정을 지칭하는 의미이다. 본 출원과 관련하여 용어 “당화”의 사용은 일반적으로 하나 이상의 탄수화물 모이어티들을 추가 또는 제거하는 것 (기저 당화 부위를 제거함으로써 또는 화학적 및/또는 효소적 수단에 의해 당화를 제거함으로써), 및/또는 고유 서열에 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 하나 이상의 당화 부위들을 추가하는 것을 의미하고자 한다. 또한 이 문구는 존재하는 다양한 탄수화물 모이어티들의 성질 및 비율들의 변화를 수반하는 고유 단백질들의 당화에서의 정성적 변화를 포함한다.
당화는 폴리펩티드, 가령, IL-10의 물리적 성질들 (예컨대, 용해도)에 현저하게 영향을 줄 수 있으며 단백질 안정성, 분비, 및 하위세포 국소화에 중요할 수도 있다. 당화된 폴리펩티드들은 또한 향상된 안정성을 나타낼 수 있거나, 하나 이상의 약동학적 성질들, 가령, 반감기를 개선할 수 있다. 또한, 용해도 개선은, 예를 들면, 비-당화된 폴리펩티드를 포함하는 제제들보다 제약학적 투여에 보다 적합한 제제들을 생성할 수 있게 한다.
당화 부위의 추가는 아미노산 서열을 변화시킴으로써 이루어질 수 있다. 폴리펩티드에 대한 변화는, 예를 들면, 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기들 (O-연결된 당화 부위) 또는 아스파라긴 잔기들 (N-연결된 당화 부위들)의 부가에 의해 또는 이 잔기들에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다. N-연결된 및 O-연결된 올리고당류의 구조 및 각 유형에서 발견되는 당 잔기들은 상이할 수 있다. 둘 모두에서 통상적으로 발견되는 한 유형의 당은 N-아세틸뉴라민산이다 (이하 시알산으로 지칭됨). 시알산은 통상적으로 N-연결된 및 O-연결된 올리고당류 모두의 말단 잔기이며, 이의 음전하로 인해, 당단백질에 산성 성질들을 부여할 수 있다. 본 출원의 특정 구체예는 N-당화 변이체의 생성 및 사용을 포함한다.
본 출원의 폴리펩티드 서열들은 핵산 수준의 변화를 통해, 특히, 미리 선택된 염기들에서 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 돌연변이 시킴에 의해 선택적으로 변형될 수 있으며, 그 결과 원하는 아미노산들로 번역될 코돈들이 생성된다.
폴리시알화: 본 출원은 또한 폴리펩티드들의 안정성 및 생체내 약동학을 개선시키기 위하여, 자연 발생, 생분해가능한 α-(2→8) 연결된 폴리시알산 (“PSA”)에 대한 폴리펩티드의 접합인 폴리시알화의 사용을 고려한다. PSA는 매우 친수성인, 생분해가능한, 비-독성 자연 폴리머로서, 혈액 중에서 뚜렷한 높은 분자량을 제공하여 그 혈청 반감기를 증가시킨다. 또한, 일정 범위의 펩티드 및 단백질 치료제의 폴리시알화는 현저히 감소된 단백질분해, 생체내 활성의 유지, 및 면역원성 및 항원성의 감소를 초래하였다 ( 예컨대, G. Gregoriadis 외., Int. J. Pharmaceutics 300(1-2):125-30 참조). 부위-특이적 폴리시알화를 위한 다양한 기법들을 이용할 수 있다 (예컨대, T. Lindhout 외., PNAS 108(18)7397-7402 (2011) 참조).
알부민 융합: 접합에 적합한 또 다른 성분들 및 분자들은 알부민, 가령, 인간 혈청 알부민 (HSA), 시노(cyno) 혈청 알부민, 및 소 혈청 알부민 (BSA)을 포함한다.
본 출원에 따르면, 알부민은 카르복실 말단, 아미노 말단, 카르복실 및 아미노 말단 모두에서, 내부적으로 약물 분자 (예컨대, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드)에 접합될 수 있다 (예컨대, USP 5,876,969 및 USP 7,056,701 참조).
본 출원에서 고려되는 HSA - 약물 분자 접합체들에서, 다양한 형태의 알부민, 가령, 알부민 분비 이전-서열 및 이의 변이체, 단편들 및 이의 변이체, 및 HSA 변이체가 사용될 수 있다. 이러한 형태는 일반적으로 하나 이상의 원하는 알부민 활성들을 보유한다. 추가 구체예들에서, 본 출원은 알부민, 알부민 단편, 및 알부민 변이체 등에 직접 또는 간접적으로 융합된 폴리펩티드 약물 분자를 포함하는 융합 단백질들을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 융합되지 않은 약물 분자보다 높은 혈장 안정성을 가지며 및/또는 융합 단백질은 융합되지 않은 약물 분자의 치료 활성을 유지한다. 일부 구체예들에서, 간접적인 융합은 링커, 가령, 펩티드 링커 또는 이의 변형된 형태에 의해 이루어진다.
상기 시사된 바와 같이, 본 출원의 하나 이상의 폴리펩티드들에 대한 알부민의 융합은, 예를 들면, 유전자 조작에 의해 수행될 수 있으며, 그 결과 HSA, 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산은, 하나 이상의 폴리펩티드 서열들을 코딩하는 핵산에 결합된다.
대안적 알부민 결합 전략: 여러 알부민 - 결합 전략들이 융합을 유도하기 위한 대안으로서 개발되었으며 본 명세서에 기재된 IL-10 제제들과 함께 사용될 수 있다. 예로서, 본 출원은 접합된 지방산 사슬 (아실화)을 통해 결합하는 알부민 및 알부민 결합 도메인 (ABD) 폴리펩티드 서열 및 본 출원에 기재된 폴리펩티드들 중 하나 이상의 서열을 포함하는 융합 단백질들을 고려한다.
다른 분자와의 접합: 접합에 적합한 추가 성분들 및 분자들은, 예를 들면, 갑상선글로불린; 파상풍 톡소이드; 디프테리아 톡소이드; 폴리아미노산들, 가령, 폴리(D-리신:D-글루탐산); 로타바이러스의 VP6 폴리펩티드; 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 인플루엔자 바이러스 핵단백질; 키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH); 및 B형 간염 바이러스 코어 단백질 및 표면 항원; 또는 전술한 것들의 임의의 조합을 포함한다.
그러므로 본 출원은 폴리펩티드 서열의 N- 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 추가 성분들 또는 분자들, 가령, 또 다른 폴리펩티드 (예컨대, 대상 폴리펩티드에 이종인 아미노산을 가지는 폴리펩티드), 또는 담체 분자의 접합을 고려한다. 그러므로 예시적인 폴리펩티드 서열은 또 다른 성분 또는 분자와의 접합체로서 제공될 수 있다.
IL-10 폴리펩티드는 또한 대형의, 서서히 대사되는 거대분자들, 가령, 단백질; 다당류, 가령, 세파로스, 아가로스, 셀룰로오스, 또는 셀룰로오스 비드; 폴리머 아미노산, 가령, 폴리글루탐산, 또는 폴리리신; 아미노산 코폴리머; 불활성화된 바이러스 입자들; 불활성화된 세균 독소, 가령, 디프테리아, 파상풍, 콜레라, 또는 류코톡신 분자의 톡소이드; 불활성화된 세균; 및 수지상 세포에 접합될 수 있다. 이러한 접합된 형태들은, 필요에 따라, 본 출원의 폴리펩티드에 대한 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
접합을 위한 추가적인 후보 성분들 및 분자들은 단리 또는 정제에 적합한 것들이 포함된다. 특정한 비-제한적 예들에는, 예를 들면, 플라스틱 또는 폴리스타이렌 비드, 플레이트 또는 비드, 자성 비드, 테스트 스트립, 및 막을 비롯한 고체 지지체를 포함하는 결합 분자, 가령, 비오틴 (비오틴-아비딘 특이적 결합 쌍), 항체, 수용체, 리간드, 렉틴, 또는 분자가 포함된다.
Fc-융합 분자: 특정 구체예들에서, 본 출원의 폴리펩티드 서열의 아미노- 또는 카르복실- 말단은 면역글로불린 Fc 영역 (예컨대, 인간 Fc)과 융합되어 융합 접합체 (또는 융합 분자)를 형성할 수 있다. Fc 융합 접합체들은 생물의약품의 전신 반감기를 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀졌으므로, 생물의약품의 필요 투여 빈도는 더 적어질 수 있다.
Fc는 혈관들 내부를 둘러싸고 있는 내피 세포에서 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 결합하며, 결합시, Fc 융합 분자는 분해로부터 보호되고 순환으로 재방출되어, 분자가 더 오래 순환되게 한다. 이러한 Fc 결합은 내인성 IgG가 긴 혈장 반감기를 유지하게 하는 메커니즘인 것으로 생각된다. 보다 최근의 Fc-융합 기술은 생물의약품의 약동학적 및 약물역학적 성질들을 종래의 Fc-융합 접합체들에 비해 최적화시키기 위하여 생물의약품의 단일 복제본을 항체의 Fc 영역에 연결시킨다.
그 외 변형들: 본 출원은 하나 이상의 성질들을 개선하기 위하여, 현재 공지이거나 장래에 개발될 IL-10의 그 외 변형들의 사용을 고려한다. 예들에는, 예를 들면, 미국 특허 출원 제 2007/0134197 및 2006/0258607호에 다양한 양상들이 기재되어 있는 헤실화, 및 융합 태그로서 SUMO를 포함하는 융합 분자가 포함된다 (LifeSensors, Inc.; Malvern, PA).
링커: 링커 및 이의 용도는 상기 기재되어 있다. 본 출원의 폴리펩티드 서열들을 변형시키기 위해 사용되는 임의의 전술한 성분들 및 분자들은 선택적으로 링커에 의해 접합될 수 있다. 적합한 링커들에는 일반적으로 변형된 폴리펩티드 서열들과 연결된 성분들 및 분자들 간에 어느 정도 이동을 가능하게 하기에 충분한 길이인 “유연 링커 (flexible linker)”가 포함된다. 링커 분자는 일반적으로 약 6-50개 원자 길이이다. 링커 분자는 또한, 예를 들면, 아릴 아세틸렌, 2-10개 단량체 단위를 내포하는 에틸렌 글리콜 올리고머, 다이아민, 이가산, 아미노산, 또는 이의 조합이 될 수 있다. 적합한 링커들을 용이하게 선택할 수 있으며 임의의 적합한 길이, 가령, 1개 아미노산 (예컨대, Gly), 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50개 또는 50개 이상의 아미노산들 일 수 있다.
유연 링커들의 예들에는 글리신 폴리머 (G)n, 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머, 글리신-세린 폴리머 (예를 들면, (GmSo)n, (GSGGS)n (서열 번호: 13), (GmSoGm)n (서열 번호: 14), (GmSoGmSoGm)n (서열 번호: 15), (GSGGSm)n (서열 번호: 16), (GSGSmG)n (서열 번호:17) 및 (GGGSm)n (서열 번호: 18), 및 이의 조합) 및 그 외 유연 링커들을 포함하며, 여기서 m, n, 및 o는 각각 독립적으로 최소한 1 내지 20, 예컨대, 1-18, 2-16, 3-14, 4-12, 5-10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 정수에서 선택된다. 글리신 및 글리신-세린 폴리머는 상대적으로 구조화된 것이 아니므로, 성분들 사이의 중성 테더(tether)로 기능할 수 있다. 유연 링커들의 예들에는, GGSG (서열 번호:19), GGSGG (서열 번호: 20), GSGSG (서열 번호: 21), GSGGG (서열 번호: 22), GGGSG (서열 번호: 23), 및 GSSSG (서열 번호: 24)가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
유연 링커들의 또 다른 예들에는 글리신 폴리머 (G)n 또는 글리신-세린 폴리머 (예컨대, (GS)n, (GSGGS)n (서열 번호:25), (GGGS)n (서열 번호: 26) 및 (GGGGS)n (서열 번호: 27), 여기서 n=1 내지 50, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50임)가 포함된다. 예시적인 유연 링커들에는 GGGS (서열 번호: //), GGGGS (서열 번호: 28), GGSG (서열 번호: 29), GGSGG (서열 번호: 30), GSGSG (서열 번호: 31), GSGGG (서열 번호: 32), GGGSG (서열 번호: 33), 및 GSSSG (서열 번호: 34)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 링커 서열들의 멀티머 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 또는 30-50)는 함께 연결되어, 본 명세서에 개시된 IL-10 제제들에 대한 이종 아미노산 서열을 접합시키기 위해 사용될 수 있는 유연 링커들을 제공할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이종 아미노산 서열은 신호 서열 및/또는 융합 파트너, 가령, 알부민, Fc 서열 등일 수 있다.
PD1+, CD8+ T 세포의 생성 및 치료요법을 위한 IL-10 제제 투여
말초 PD1+, CD8+, 질병 항원-특이적 T 세포를 유도하기 위하여, IL-10 제제 (예컨대, PEG-IL-10)이 치료적 유효량으로 대상체에 투여된다. 치료적 유효량은 인자들, 가령, 치료될 질병, 해당 요법에 의해 구현하고자 하는 목적, 대상체에 투여되는 그 외 치료 제제들, 뿐만 아니라 치료될 대상체에 관해 통상적으로 평가되는 다양한 성질들, 가령, 대상체의 연령, 체중, 성별, 및 건강 및 신체 조건, 투여되는 IL-10 제제의 제형, 및 투여 경로를 고려하여 숙련된 의과 전문의에 의해 용이하게 결정될 수 있다. IL-10 제제들의 치료적 유효량은, 예를 들면, 안정성 및 용량-증가 시험, 생체내 연구 (예컨대, 동물 모델), 및 숙련된 기술자에게 공지된 그 외 방법들로부터 용이하게 결정될 수 있다.
다른 부분에서 상세히 논의된 바와 같이, 본 출원은 IL-10의 투여가 특정 혈청 최저 (trough) 농도를 구현하고 및/또는 특정 평균 혈청 최저 농도를 유지시키는 구체예들을 고려한다.
일반적으로, 용량 파라미터들은 치료적 유효량이 대상체에 비가역적으로 독성이 될 수 있는 양 (즉, 최대 허용 용량, “MTD”) 보다 작고 대상체에 측정가능한 효과를 생성하는데 필요한 양 이상임을 따른다. 이러한 양은 예를 들면, 투여 경로 및 그 외 요인들을 고려하여, ADME와 연관된 약동학적 및 약물역학적 파라미터들에 의해 결정된다.
치료적 유효량 (ED)은 제제를 섭취하는 대상체의 일부 분획에서 치료 반응 또는 원하는 효과를 생성하는 제제의 용량 또는 양이다. 제제의 “중간 유효량” 또는 ED50은 제제가 투여되는 모집단의 50%에서 치료 반응 또는 원하는 효과를 생성하는 제제의 용량 또는 양이다. ED50은 제제의 효과에 관한 합리적인 기대 측정치로서 통상적으로 사용되지만, 반드시 임상의사가 모든 관련 요인들을 고려하여 적절한 것으로 생각할 수 있는 용량인 것은 아니다. 그러므로, 일부 상황들에서는 유효량은 계산된 ED50 보다 클 수 있고, 그 외 상황들에서 유효량은 계산된 ED50 보다 작을 수 있으며, 그리고 또 다른 상황들에서는 유효량은 계산된 ED50과 동일할 수 있다.
PEG-IL-10의 치료적 유효량의 예는 약 0.01 내지 약 100 μg PEG-IL-10/체중 kg/일, 약 0.1 내지 20 μg PEG-IL-10/체중 kg/일, 약 0.5 내지 10 μg PEG-IL-10/체중 kg/일, 또는 약 1 내지 4 μg PEG-IL-10/체중 kg/일 범위일 수 있다. 일부 구체예들에서, PEG-IL-10은 약 50 내지 800 μg 단백질/체중 kg/일 (예컨대, 약 1 내지 16 μg 단백질/체중 kg/일의 PEG-IL-10)을 전달하기 위해 연속 주입으로 투여된다. 주입 속도는, 예를 들면, 혈액 세포 계수 및 유해 효과 평가에 기초하여 변화시킬 수 있다. IL-10 제제들에 관한 그 외 구체적인 투약 파라미터들은 본 명세서의 다른 부분에 기재된다.
특정 구체예들에서, IL-10 제제의 용량은 "단위 투약 형태"로 제공된다. 어구 “단위 투약 형태”는, 각각의 단위들이 원하는 효과를 생성하기에 충분한 예정된 양의 IL-10 제제를, 단독으로 또는 하나 이상의 추가 제제들과 조합으로 내포하는, 물리적으로 구별된 단위들을 지칭한다. 단위 투약 형태의 파라미터들은 특정 제제 및 구현되는 효과에 따라 달라짐이 이해될 것이다.
IL-10 제제의 전신 수준은 다음을 비롯한, 여러 방식으로 특성화될 수 있다: (1) 일부 특정된 수준 이상 또는 일정 범위 수준의 평균 IL-10 혈청 최저 농도; (2) 일정양의 시간 동안 일부 특정된 수준 이상의 평균 IL-10 혈청 최저 농도; (3) 일부 특정된 수준 이상 또는 미만 또는 일정 범위의 수준의 정상 상태 IL-10 혈청 농도 수준; 또는 (4) a 일부 특정된 수준 이상 또는 미만 또는 일정 범위의 수준의 C최대 농도 프로파일. 본 출원에 제시된 바와 같이, IL-10 제제의 투여 기간에 걸친 평균 혈청 최저 IL-10 농도의 유지는 특정 질병 상태들의 치료에 특히 유일한 것으로 밝혀졌다.
본 출원의 일부 구체예들에서, IL-10 제제 요법 과정에 따른 IL-10 제제들의 유용한 혈액 혈장 및/또는 혈청 수준 농도 프로파일들은 다음을 포함한다: 약 1.0 pg/mL 초과, 약 10.0 pg/mL 초과, 약 20.0 pg/mL 초과, 약 30 pg/mL 초과, 약 40 pg/mL 초과, 약 50.0 pg/mL 초과, 약 60.0 pg/mL 초과, 약 70.0 pg/mL 초과, 약 80.0 pg/mL 초과, 약 90 pg/mL 초과, 약 0.1 ng/mL 초과, 약 0.2 ng/mL 초과, 약 0.3 ng/mL 초과, 약 0.4 ng/mL 초과, 약 0.5 ng/mL 초과, 약 0.6 ng/mL 초과, 약 0.7 ng/mL 초과, 약 0.8 ng/mL 초과, 약 0.9 ng/mL 초과, 약 1.0 ng/mL 초과, 약 1.5 ng/mL 초과, 약 2.0 ng/mL 초과, 약 2.5 ng/mL 초과, 약 3.0 ng/mL 초과, 약 3.5 ng/mL 초과, 약 4.0 ng/mL 초과, 약 4.5 ng/mL 초과, 약 5.0 ng/mL 초과, 약 5.5 ng/mL 초과, 약 6.0 ng/mL 초과, 약 6.5 ng/mL 초과, 약 7.0 ng/mL 초과, 약 7.5 ng/mL 초과, 약 8.0 ng/mL 초과, 약 8.5 ng/mL 초과, 약 9.0 ng/mL 초과, 약 9.5 ng/mL 초과, 또는 약 10.0 ng/mL 초과의 평균 IL-10 혈장 및/또는 혈청 최저 농도.
본 출원의 특정 구체예들에서, IL-10 제제들은 IL-10 치료 과정에 걸쳐 평균 IL-10 혈청 최저 농도를 구현하기 위해 대상체에 1.0 pg/mL 내지 10 ng/mL 범위로, 택일적으로 1.0 pg/mL 내지 100 pg/mL 범위로, 택일적으로 0.1 ng/mL 내지 1.0 ng/mL 범위로, 택일적으로 1.0 ng/mL 내지 10 ng/mL 범위로 투여된다. 본 출원은 본 명세서에 제시된 농도들에 포함되는 임의의 농도를 포함하는 범위들을, 비록 명확히 언급되지 않은 경우라 하더라도, 고려함을 이해하여야 한다. 예로서, 한 구체예에서 평균 혈청 IL-10 농도는 0.5 ng/mL 내지 5 ng/mL 범위일 수 있다. 또 다른 예들로서, 본 출원의 특정 구체예들은 약 0.5 ng/mL 내지 약 10.5 ng/mL, 약 1.0 ng/mL 내지 약 10.0 ng/mL, 약 1.0 ng/mL 내지 약 9.0 ng/mL, 약 1.0 ng/mL 내지 약 8.0 ng/mL, 약 1.0 ng/mL 내지 약 7.0 ng/mL, 약 1.5 ng/mL 내지 약 10.0 ng/mL, 약 1.5 ng/mL 내지 약 9.0 ng/mL, 약 1.5 ng/mL 내지 약 8.0 ng/mL, 약 1.5 ng/mL 내지 약 7.0 ng/mL, 약 2.0 ng/mL 내지 약 10.0 ng/mL, 약 2.0 ng/mL 내지 약 9.0 ng/mL, 약 2.0 ng/mL 내지 약 8.0 ng/mL, 및 약 2.0 ng/mL 내지 약 7.0 ng/mL 범위의 평균 IL-10 혈청 최저 농도를 포함한다. 특정 구체예들에서, 1 - 2 ng/mL의 평균 IL-10 혈청 최저 농도가 치료 기간에 걸쳐 유지된다.
본 출원은 또한 평균 IL-10 혈청 최고 (peak) 농도가 IL-10 제제 치료 기간에 걸쳐 약 10.0 ng/mL 이하인 구체예들을 고려한다. 추가 구체예들은 약 1.0 pg/mL 이상의 평균 IL-10 혈청 최저 농도를 고려한다. 최적 평균 혈청 농도는 일반적으로 원하지 않는 유해 효과들이 생기지 않고 원하는 치료 효과가 구현되는 농도이다.
본 출원의 특정 구체예들은 다음 단계를 포함하는, IL-10 요법을 투여받은 대상체를 모니터하여 유해 효과를 예측하고, 그리하여 유해 효과를 가능하게는 없애는 방법을 제공한다: (1) 대상체의 최고 IL-10 농도를 측정하는 단계; (2) 대상체의 최저 IL-10 농도를 측정하는 단계; (3) 최고-최저 변동값을 계산하는 단계; 그리고, (4) 계산된 최고-최저 변동값을 사용하여 대상체에서 가능한 유해 효과를 예측하는 단계. 특정 대상체 모집단에서, 보다 작은 최고-최저 변동값은 대상체가 IL-10-관련 유해 효과를 경험하게 될 확률이 보다 낮음을 나타낸다. 또한, 일부 구체예들에서, 특히 최고-최저 변동값들은 특정 투약 파라미터를 사용하여 특정 질병, 장애 및 병태의 치료를 위해 결정되며, 이러한 변동값들은 참조 표준으로 사용된다.
대다수의 약물들에 있어서, 혈장 약물 농도는 다중-지수 방식으로 저하된다. 정맥내 투여 직후, 약물은 초기 공간 (혈장 부피로 최소한으로 정의됨) 전체에 걸쳐 신속하게 분포된 다음, 혈관외 공간들 (예컨대, 특정 조직들)로 보다 서서히 균등하게 분포된다. 정맥내 IL-10 투여는 2-분획 운동 모델과 관련되어 있다 (Rachmawati, H. 외. (2004) Pharm. Res. 21(11):2072-78 참조). 피하 재조합 hIL-10의 약동학 또한 연구된 바 있다 (Radwanski, E. 외. (1998) Pharm. Res. 15(12):1895-1901 참조). 그러므로, 적절한 IL-10 투약-관련 파라미터를 평가시 분포 부피를 고려하는 것이 적절하다. 더욱이, 특정 세포 유형들에 대해 IL-10 제제를 표적화하기 위한 시도들이 이루어져왔다(예컨대, Rachmawati, H. (May 2007) Drug Met. Dist. 35(5):814-21 참조).
본 출원은 상기 제시된 바와 같이 치료된 대상체에서 임의의 IL-10 혈청 최저 농도들 유지시키는 IL-10 제제의 임의의 용량 및 투여법의 투여를 고려한다. 예로서, 대상체가 인간인 경우, 비-페길화 hIL-10은 0.5 μg/kg/일 초과, 1.0 μg/kg/일 초과, 2.5 μg/kg/일 초과, 5 μg/kg/일 초과, 7.5 μg/kg 초과, 10.0 μg/kg 초과, 12.5 μg/kg 초과, 15 μg/kg/일 초과, 17.5 μg/kg/일 초과, 20 μg/kg/일 초과, 22.5 μg/kg/일 초과, 25 μg/kg/일 초과, 30 μg/kg/일 초과, 또는 35 μg/kg/일 초과의 용량으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 예로서, 대상체가 인간인 경우, 비교적 작은 PEG를 포함하는 페길화 hIL-10은 (예컨대, 5kDa 모노- 다이-PEG-hIL-10) 0.5 μg/kg/일 초과, 0.75 μg/kg/일 초과, 1.0 μg/kg/일 초과, 1.25 μg/kg/일 초과, 1.5 μg/kg/일 초과, 1.75 μg/kg/일 초과, 2.0 μg/kg/일 초과, 2.25 μg/kg/일 초과, 2.5 μg/kg/일 초과, 2.75 μg/kg/일 초과, 3.0 μg/kg/일 초과, 3.25 μg/kg/일 초과, 3.5 μg/kg/일 초과, 3.75 μg/kg/일 초과, 4.0 μg/kg/일 초과, 4.25 μg/kg/일 초과, 4.5 μg/kg/일 초과, 4.75 μg/kg/일 초과, 또는 5.0 μg/kg/일 초과의 용량으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 IL-10 혈청 농도 등을 구현하는데 필요한 IL-10 혈청 농도, 용량 및 치료 프로토콜에 관한 전술한 논의는 IL-10 제제 (예컨대, PEG-IL-10)를 이용한 단일요법에 관한 것이지만, 숙련된 기술자 (예컨대, 약리학자)는 또한 IL-10 제제 (예컨대, PEG-IL-10)가 하나 이상의 추가 치료제와 함께 투여되는 경우 최적의 투여법(들)을 결정할 수 있다.
투여 경로
본 출원은 IL-10 제제 (예컨대, PEG-IL-10), 및 이의 조성물들의, 임의의 적절한 방식으로의 투여를 고려한다. 적합한 투여 경로들에는 비경구 (예컨대, 근육내, 정맥내, 피하 (예컨대, 주사 또는 이식), 복강내, 수조내, 관절내, 복강내, 대뇌내 (뇌실질내) 및 뇌혈관내), 경구, 비강, 질, 설하, 안구내, 직장, 국부 (예컨대, 경피), 설하 및 흡입이 포함된다. 정의된 시기에 걸쳐 본 출원에 개시된 IL-10 제제들을 방출하기 위하여 일반적으로 피하 또는 근육내 투여되는 데포 주사 (Depot injections)가 또한 사용될 수 있다.
질병 항원-특이적 PD1+ CD8+ 말초 T 세포를 생성하는 방법
상기와 같이, 본 출원은, 한 구체예에서, 치료적 유효량의 IL-10 제제를 환자에게 투여함으로써 IL-10 제제 요법으로 치료가능한 질병에 걸린 대상체의 말초부로 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포의 확장을 유도하는 방법을 제공한다. 또한, 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포는 상기 대상체에게 치료적 유효량의 IL-10 제제의 투여 후 대상체로부터 조직 샘플을 얻음으로써 단리될 수 있다. 한 구체예에서, 항원-특이적 CD8+ T 세포는 PD1+ (예컨대, PD1중-고)이며, CD8+ T 세포는 IL-10 제제의 치료적 유효량으로 치료된 대상체로부터 대상체의 말초 혈액 샘플을 얻음으로써 얻는다.
도 7을 보면, 본 출원의 방법의 일반적 실시에 관한 예는 IL-10 제제 요법, 예컨대, PEG-IL-10 요법을, IL-10 제제에 의한 치료가 잘 듣는 질병에 걸린 환자에게 투여하는 단계 (710)를 포함할 수 있다. 환자가 예정된 양의 시간 동안 IL-10 제제 요법을 제공받은 후, 림프구를 내포하는 조직 샘플 (예컨대, 말초 혈액 림프구 (PBLs)를 내포하는 말초 혈액 샘플)을 상기 환자로부터 수집한다 (720). 선택적으로, 환자는 IL-10 제제 요법에 대한 반응에 대해 모니터될 수 있다. 일부 경우에서, IL-10 제제 요법에 대해 최소한 안정성 질병 상태 또는 최소한 부분 반응을 나타내는 경우 환자로부터 조직 샘플을 수집한다. 일부 경우에서, 환자가 최소한 안정성 질병 또는 최소한 부분 반응을 보이지 않는 경우, 조직 샘플을 수집하지 않고 IL-10 제제 요법을 지속한다.
환자로부터 조직 샘플을 수집 (720) 후, 조직 샘플들 내 핵산들을 핵산 시퀀싱 (740)에 의해 분석하여 TCR 서열들을 얻는다 (예컨대, 가변 알파 (Vα) TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들 및/또는 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들). 상기 서열들을 분석하여 CD8+ T 세포 상에서 발현되는 TCR들에 대한, Vα TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들의 [상대적] 존재량의 추정치를 얻을 수 있다. 샘플내 CD8+ T 세포에서 발현되는 TCR들에 대한 Vα TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들의 존재량을, IL-10 제제 요법이 잘 듣는 질병에 걸린 하나 이상의 환자들로부터 IL-10 제제 요법 전 또는 IL-10 제제 요법 동안 조기 시점에 얻은 기준 샘플 내 Vα TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들의 존재량과 비교함으로써, (a 사슬 및 b 사슬 TCR 쌍 서열들에 의해 정의된) 항원-특이적 TCR을 발현시키는 특정 T 세포 모집단이 IL-10 제제 요법에 대한 반응으로 클론 확장되었는지, 클론 축소되었는지, 또는 새로이 생성되었는지 여부를 결정할 수 있다.
샘플내 Vα TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들의 존재량은 임의의 적합한 측정법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 경우에서, 이러한 존재량은, 참조 핵산에 대한, Vα TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들의 도수이다. 일부 경우에서, 이러한 존재량은, 참조 핵산에 대한, Vα TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들의 수 또는 생물정보학적으로 얻은 이의 추정치이다.
확장은 대상체로부터 얻은 샘플 내 Vα TCR 폴리펩티드 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들의 존재량을 기준 샘플과 비교시 3 배 또는 그 이상, 예컨대, 5 배 또는 그 이상, 10 배 또는 그 이상, 20 배 또는 그 이상, 또는 30 배 또는 그 이상의 변화를 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 관심 항원-특이적 CD8+ T 세포를 단리하기 위하여, 샘플은 세포 표면 표지자 발현에 기초하여 분획될 수 있는 PBL을 내포한다. 관심 CD8+ T 세포는 세포 표면 표지자들, 가령, PD1 (CD279) 및/또는 LAG3의 상승된 발현에 기초하여 식별되는, 활성화된, 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 말초 혈액 샘플로부터 PD1+CD8+ T 세포 및/또는 PD-1+ Lag3+ CD8+ T 세포를 식별 및 분리하는 단계를 선택적으로 포함할 수 있다. 한 구체예에서, T 세포는 PD1중-고, CD8+, 뿐만 아니라 IFNγ, CD45RO, 그랜자임 B, 및 퍼포린 중 하나 이상의 발현에 대해 양성인 것으로 식별 및 단리된다. 단리된 CD8+ T 세포, 예컨대, PD1+ CD8+ T 세포는, 질병-관련 항원들에 특이적인 활성화된 T 세포들에서 풍부할 수 있으며, 이러한 질병 항원 특이성은 결과적으로 a 사슬 및 b 사슬 TCR 쌍 서열들에 의해 결정된다.
이들 TCR 쌍 아미노산 서열들은 T 세포에 질병 항원 특이성을 부여하는 서열들을 포함할 수 있다. 그러므로 일부 구체예들에서, 본 출원의 방법은 전장 a 사슬 및 b 사슬 TCR 쌍 아미노 서열들을 인코딩하는 핵산 작제물, 또는 a 사슬 및 b 사슬 TCR 쌍 아미노 서열들의 가변 영역들을 내포하는 키메라 항원 수용체를 형질도입함으로써 재조합 질병 항원-특이적 T 세포를 생성하는 단계 (750)를 포함하며, a 사슬 및 b 사슬 TCR 쌍 아미노산 서열들은 IL-10 제제로 치료받은 환자로부터 얻은 질병 항원-특이적 T 세포-내포 조직 샘플들로부터 유래한 것이었다. 그 후 이러한 유전자조작된 질병 항원-특이적 T 세포는 유전자 조작된 질병 항원-특이적 T 세포에서 발현된 TCR에 의해 특이적으로 결합된 항원들의 발현으로 특성화되는 질병에 대한 치료를 필요로하는 적합한 환자에게 투여될 수 있다.
본 출원의 방법은 병태를 치료하기 위해 IL-10 제제를 투여하였던 환자로부터 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포의 모집단을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 환자는 병태, 예컨대, IL-10 제제 요법에 반응성인 질병, 즉, CD8+ T 세포의 항원-반응성 세포독성 활성이 해당 병태의 개선에 기여하는 병태를 가지는 임의의 개체가 될 수 있다.
환자는, 암; 콜레스테롤 관련 질병, 및 세포내 생활 주기를 가지는 감염성 물질들, 가령, 바이러스, 세균, 진균, 원생동물 및 기생생물에 의해 유발되는 질병을 포함하는 (그러나 이에 제한되는 것은 아님), IL-10 제제 요법에 대해 반응성인 임의의 병태를 가질 수 있다.
본 출원에 기재된 방법들에 따르면, 병태 또는 질병은 증식 장애, 가령, 암 또는 암-관련 장애일 수 있다. 특정 암들에 제한되지는 않지만, 암은 결장 암, 흑색종, 및 편평세포 암종과 연관된 종양들을 비롯한 고형 종양일 수 있으며, 또는 암은 혈액학적 장애일 수 있다. 환자는 자궁, 자궁경부, 유방, 전립선, 고환, 위장관 (예컨대, 식도, 입인두, 위, 소장 또는 대장, 결장, 또는 직장), 신장, 콩팥 세포, 방광, 골, 골수, 피부, 두경부, 피부, 간, 쓸개, 심장, 폐, 이자, 침샘, 부신, 갑상선, 뇌 (예컨대, 교종), 신경절, 중추신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS)의 암; 및 조혈계 및 면역계 (예컨대, 비장 또는 흉선)의 암을 비롯한 증식 병태 또는 질병을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예들에서, 종양 또는 암은 결장 암, 난소 암, 유방 암, 흑색종, 폐 암, 교모세포종, 또는 백혈병이다. 용어(들) 암-관련 질병, 장애 및 병태의 사용은 광범위하게 암과 직접 또는 간접적으로 관련되는 병태를 지칭하는 의미이며, 예컨대, 혈관신생 및 전암성 병태, 가령, 이형성증을 포함한다. 일부 구체예들에서, 암은 전이성이다.
바이러스 감염 물질은 단일-가닥 DNA (ssDNA), 이중-가닥 DNA (dsDNA) 및 RNA 바이러스를 포함한다. 일부 구체예들에서, 바이러스는 헤파드나바이러스, 플라비바이러스, 레트로바이러스, 또는 헤르페스 바이러스이다. 일부 경우에서, 환자는, 제한없이, A형 간염, B형 간염 (HBV), C형 간염 (HCV), 인플루엔자, 수두 대상포진 바이러스 (VZV), 아데노바이러스, 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 제1형 단순 헤르페스 (HSV-I), 제2형 단순 헤르페스 (HSV-II), 리노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 유두종 바이러스 (HPV), 파포바 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV), 에키노바이러스, 아르보바이러스, 훈타바이러스, 콕사키 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 폴리오 바이러스, 제1형 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-I), 및 제2형 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-II), 인간 T 림프친화 바이러스 (HTLV-1 및 HTLV-2), 코로나바이러스, 회색질척수염 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6 (HHV-6), 등에 의해 유발되는 바이러스 감염에 걸린다.
일부 구체예들에서, 환자는 하기 상세히 기재된 바와 같이 IL-10 제제를 투여받았으며 그 병태는 IL-10 제제 치료에 대해 최소한 부분 임상 반응을 보이는 대상체이다. 치료에 대한 임상 반응은 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있으며, 치료되는 병태에 따라 달라질 것이다.
예를 들면, 병태가 종양인 경우, IL-10 제제 치료에 대한 대상체의 반응은 예를 들면, 치료 전과 후의 종양 부하 (예컨대, 종양 질량, 종양 부피, 종양 생물표지자들의 양, 등) 및/또는 종양 분포를 측정함으로써 얻는다. 암에 걸린 대상체의 IL-10 제제 치료에 대한 "부분 임상 반응"은 일반적으로 환자 신체 내 종양 크기, 또는 암의 정도의 감소를 지칭하며, 치료 전에 비해 치료 후 측정된 임상 변수 (예컨대, 종양 부피 및/또는 종양 질량)의 10% 또는 그 이상, 예컨대, 20% 또는 그 이상, 30% 또는 그 이상, 40% 또는 그 이상 (50% 또는 그 이상을 포함)이고 99% 또는 그 미만, 예컨대, 90% 또는 그 미만, 80% 또는 그 미만, 70% 또는 그 미만 (60% 또는 그 미만을 포함) 감소를 포함할 수 있으며, 여기서 100% 감소는 측정된 임상 변수의 검출불가능한 수준 및/또는 배경 수준으로의 감소를 나타낼 수 있다. 병태의 배경 수준은 해당 병태를 가지지 않는 것으로 공지된 개체들에서 얻은, 병태에 대한 임상 변수의 평균 측정값이 될 수 있다. 대조적으로, 암 대상체는, 암이 선택된 임상 변수 (예컨대, 가령, 종양 부피 및/또는 종양 질량)에 의해 측정된 정도 또는 중증도를 감소시키지도 증가시키지도 않는 경우, IL-10 제제 요법 후 "안정성 질병"을 나타내는 것으로 지칭된다. 암 대상체는 선택된 임상 변수 (예컨대, 가령, 종양 부피 및/또는 종양 질량)에 의해 측정된 정도 또는 중증도를 증가시키는 경우 IL-10 제제 요법 후 요법에 대해 "비-반응자"로 분류된다.
일부 구체예들에서, IL-10 제제 치료에 대한 바이러스 감염 질병의 반응은 IL-10 제제 치료 전과 후의 관련 임상 측정값들, 예를 들면, 바이러스 역가 (예컨대, 혈액 중), 항-바이러스 항체 (예컨대, 혈액 중), 바이러스-유래 핵산들의 수준 (예컨대, 혈액 또는 조직 중, 예컨대, PCR로 검출시)을 비교함으로써 얻는다. IL-10 제제 치료에 대한 바이러스 감염의 "부분 임상 반응"은 치료 전에 비해 치료 후 측정된 임상 변수 (예컨대, 바이러스 역가, 바이러스-특이적 항체 역가 및/또는 바이러스 단백질 역가)의 10% 또는 그 이상, 예컨대, 20% 또는 그 이상, 30% 또는 그 이상, 40% 또는 그 이상 (50% 또는 그 이상을 포함)이고 99% 또는 그 미만, 예컨대, 90% 또는 그 미만, 80% 또는 그 미만, 70% 또는 그 미만 (60% 또는 그 미만을 포함) 감소를 포함할 수 있으며, 여기서 100% 감소는 측정된 임상 변수의 검출불가능한 수준 및/또는 배경 수준으로의 감소를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, IL-10 제제 요법에 대한 최소한 부분 임상 반응은 혈액 또는 혈액 분획 (혈청/혈장)에서 qPCR에 의해 검출가능한 바이러스 핵산의 최소한 90% 감소; 공지된 바이러스 항원(들)에 대한 최소한 90%의 항체 감소; 혈청 내 바이러스 단백질의 최소한 90% 감소 (예컨대, ELISA로 검출시) 중 하나 이상이 될 수 있다. 병태의 배경 수준은 해당 병태를 가지지 않는 것으로 공지된 개체들에서 얻은, 병태에 대한 임상 변수의 평균 측정값이 될 수 있다.
IL-10 제제 요법은 상기 병태를 치료하기 위해 상기 기재된 임의의 적합한 IL-10 제제 요법일 수 있으며, 환자에게 치료적 유효량의 IL-10 제제를 투여하는 것을 포함한다. 적합한 IL-10 제제들에는 재조합 인간 IL-10 및 페길화 IL-10이 포함되며, 예컨대, US 6,217,857; US 2008/0317707; 및 US 8,691,205에 기재되어 있다. 일부 구체예들에서, IL-10 제제는 페길화 IL-10, 가령, 예컨대, US 8,691,205에 기재된 모노-페길화 IL-10 및 다이-페길화-IL10의 혼합물이다. 투여 요법은 상기 병태, 예컨대, 암 또는 감염성 질병에 대하여 치료 효과를 구현하기에 적합한 임의의 용량, 투약 간격, 및 투약 기간을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 투여 요법은 0.1 μg/Kg 또는 그 이상, 예컨대, 0.5 μg/Kg 또는 그 이상, 1.0 μg/Kg 또는 그 이상, 2.0 μ μg/Kg 또는 그 이상, 5.0 μg/Kg 또는 그 이상 (10 μg/Kg 또는 그 이상을 포함)의 용량이고 50 μg/Kg 또는 그 미만, 예컨대, 40 μg/Kg 또는 그 미만, 30 μg/Kg 또는 그 미만 (20 μg/Kg 또는 그 미만을 포함)의 용량인 IL-10 제제를 포함한다. 일부 경우에서, 투여 요법은 0.1 내지 50 μg/Kg, 0.5 내지 40 μg/Kg, 1.0 내지 40 μg/Kg (10 내지 40 μg/Kg 포함) 범위의 IL-10 제제 용량을 포함한다.
일부 경우에서, IL-10 제제의 투여 요법은 주 1회 또는 그보다 짧은, 예컨대, 3일에 1회 또는 그보다 짧은, 2일에 1회 또는 그보다 짧은 (1일 1회 또는 그보다 짧은 포함) 간격, 그리고 1일 3회 또는 그보다 긴, 예컨대, 1일 2회 또는 그보다 긴 (1일 1회 또는 그보다 긴 포함) 간격의 투약을 포함한다. 일부 경우에서, 투여 요법은 1일 3회 내지 주 1회, 예컨대, 1일 2회 내지 3일에 1회 (1일 2회 내지 2일에 1회 포함) 범위 간격의 투약을 포함한다. 일부 경우에서, IL-10 요법은 최소한 1 -150 일, 최소한 5- 100 일, 최소한 10 - 50 일, 최소한 15 - 45 일, 최소한 20 - 40 일, 최소한 30 일 또는 그 이상 동안 환자에게 투여되었으며, 1 일, 2 일, 3, 일, 4, 일, 5, 일 6, 일, 7, 일, 8 일, 9, 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 21 일, 22 일, 23 일, 24 일, 25 일, 26 일 27 일, 28 일, 또는 29 일 또는 그 이상 동안 투여되었을 수 있다. 일부 경우에서, IL-10 제제는 수 주 동안, 예컨대, 3 주 또는 그 이상, 4 주 또는 그 이상, 5 주 또는 그 이상, 6 주 또는 그 이상, 2 개월 또는 그 이상 (3 개월 또는 그 이상 포함), 그리고 5 년 또는 그 미만, 예컨대, 1 년 또는 그 미만, 9 개월 또는 그 미만, 6 개월 또는 그 미만 (3 개월 또는 그 미만 포함) 동안 투여될 것이다. 일부 구체예들에서, IL-10 요법은 2 주 내지 5 년, 예컨대, 3 주 내지 1 년, 4 주 내지 9 개월 (4 주 내지 6 개월 포함) 동안 환자에게 투여되었다.
상기와 같이 IL-10 제제 요법으로 치료받은 환자로부터 얻은 조직 샘플은, CD8+ T 세포를 내포하는 임의의 적합한 조직 샘플이 될 수 있다. 일부 경우에서, 조직 샘플은 종양 샘플, 가령, 1차 종양 또는 이의 전이로부터 얻은 샘플이다. 일부 구체예들에서, 샘플은 말초 혈액 샘플이다. 일부 구체예들에서, 말초 CD8+ T 세포는 샘플, 예컨대, 환자로부터 얻은 말초 혈액 샘플로부터 단리된다. 본 명세서에서 사용되는 “말초 혈액”은 개체의 순환계 내에서 순환하는 혈액을 지칭한다. 말초 혈액 샘플은 순환하는 혈액 풀로부터 직접 얻을 수 있다. 본 출원의 양상들에 따르면, 말초 CD8+ T 세포의 모집단은 임의의 적합한 방법을 사용하여 상기한 바와 같은 IL-10 제제로 치료받은 환자로부터 얻을 수 있다 (예컨대, Fuss 외. (2009) Current Protocols in Immunology, Unit 7.1, John Wiley, Inc. NY 참조). 일부 구체예들에서, 샘플은 림프절 샘플, 또는 림프 샘플이다.
CD8+ T 세포를 내포하는 환자의 테스트 샘플, 뿐만 아니라 임의의 적합한 환자의 기준 샘플은 임의의 적합한 시간에 환자로부터 얻을 수 있다. 일부 구체예들에서, IL-10 제제 요법 개시 전에 기준 샘플을 그리고 이 요법의 개시 후 테스트 샘플을 얻는 것이 관심의 대상일 수 있다. 환자의 병태가 존재한 후의 시점에서 얻은 테스트 샘플들은 IL-10 제제 요법에 대해 최소한 안정하거나 (안정성 질병) 또는 최소한 부분 임상 반응 (PR)을 보인다. 테스트 샘플들 (및/또는 지속적인 IL-10 제제 요법의 T 세포 확장에 대한 효과 분석이 관심의 대상인 경우 기준 샘플들)을 얻는 시점은 다음을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다: 요법 개시 후 1 일, 2 일, 3 일, 4, 일, 5, 일 6, 일, 7, 일, 8 일, 9, 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 21 일, 22 일, 23 일, 24 일, 25 일, 26 일 27 일, 28 일, 또는 29 일 또는 그 이상 이내 또는 이후일 수 있으며, 예를 들면, 요법 개시 후 1- 200 일, 10-190 일, 20-180 일이 될 수 있음. 일부 경우에서, CD8+ T 세포를 내포하는 샘플을, 수 주 동안, 예컨대, 3 주 또는 그 이상, 4 주 또는 그 이상, 5 주 또는 그 이상, 6 주 또는 그 이상, 2 개월 또는 그 이상 (3 개월 또는 그 이상 포함), 그리고 5 년 또는 그 미만, 예컨대, 1 년 또는 그 미만, 9 개월 또는 그 미만, 6 개월 또는 그 미만 (3 개월 또는 그 미만 포함) 동안 IL-10 제제를 투여한 후 환자로부터 얻을 수 있다. 일부 구체예들에서, IL-10 요법은 CD8+ T 세포를 내포하는 샘플을 얻기 전 2 주 내지 5 년, 예컨대, 3 주 내지 1 년, 4 주 내지 9 개월 (4 주 내지 6 개월 포함) 동안 환자에게 투여되었다.
일부 경우에서, 환자로부터 얻은 샘플은 CD8+ T 세포, 예컨대, 말초 CD8+ T 세포를 단리하기에 편리한 임의의 방식으로 가공될 수 있다. 일부 경우에서, 샘플 중의 림프구, 예컨대, 말초 혈액 림프구 (PBLs)는 림프구, 예컨대, PBLs 에서의 세포-표면 표지자들의 발현에 근거하여, 특정한 CD8+ T 세포 하위유형 (예컨대, PD1중-고, CD8+ T 세포)이 풍부한 CD8+ T 세포 모집단을 내포하는 하나 이상의 샘플들을 제공하기 위해 분류 또는 분획된다. 분류 또는 분획은 임의의 적합한 방법, 예컨대, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 자성 비드에 기반한 분리법 등을 사용하여 실시될 수 있다.
환자로부터 얻은 샘플 내 내포된 및/또는 샘플에서 단리된 CD8+ T 세포의 모집단에는 활성화되고 항원-특이적인 임의의 적합한 CD8+ T 세포가 풍부할 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, T 세포는 실질적으로 이정점 분포인 세포 표면 표지자 발현, 예컨대, PD1 (또한 CD279로도 공지됨) 세포 표면 발현을 나타낼 수 있다. 그러므로, 활성화된 T 세포가 PD1의 표면 발현에 근거하여 식별되는 경우, 보다 높은 PD1 세포 표면 발현 피크 주변의 세포는 “PD1고”로 분류될 수 있고 보다 낮은 PD1 세포 표면 발현 피크 주변의 세포는 “PD1저”로 분류될 수 있다. 활성화된 CD8+ T 세포를 포함하는 CD8+ T 세포 모집단은 또한 PD1고 및 PD1저 세포들 사이에 중간 세포 모집단 ("PD1중”)을 포함할 수 있으며, 여기서 PD1중 세포는 PD1 저 세포 보다는 높지만, PD1 고 세포 보다는 낮은 PD1 세포 표면 발현 수준을 가진다. 그러므로, 관심대상인 활성화된 항원-특이적 CD8+ T 세포는 중간-내지-고 수준의 PD1 세포 표면 발현 (“PD1중-고”)을 포함할 수 있다. 다시 말하면, 활성화된 항원-특이적 CD8+ T 세포는 세포 표면상에서 낮은 PD1 발현을 가지지 않는 (즉, “PD1저”가 아닌) CD8+ T 세포 모집단이 될 수 있다.
세포 표면 표지자, 예컨대, PD1의 발현 수준을 측정할 수 있으며, 원하는 범위에 속하는, 세포 표면 표지자 발현 수준을 가지는 세포는 임의의 적합한 방법, 가령, 세포 표면 표지자에 대하여 형광-검출가능한 항체로 세포를 표지 후 FACS; 또는 자성 비드에 기반한 분리법 등 (그러나 이에 제한되는 것은 아님)을 사용하여 단리될 수 있다.
항원-특이적 CD8+ T 세포는 항원-특이적 CD8+ T 세포에 적합한 임의의 그 외 표지자에 의해 정의될 수 있다. 일부 구체예들에서, 항원-특이적 CD8+ T 세포는 CD45RO의 상승된 세포 표면 발현을 나타낸다 (“CD45RO+”). 일부 구체예들에서, 항원-특이적 CD8+ T 세포는 높은 수준의 인터페론 (IFN) γ 발현을 가진다 (“IFNγ+”). 일부 구체예들에서, 항원-특이적 CD8+ T 세포는 T 세포 활성화에 관한 표지자들인 그랜자임 B 및/또는 퍼포린 발현의 상승을 나타낸다. 그러므로 본 출원은, 예를 들면, 다음과 같은, PD1 및 CD8 세포 표면 발현, 뿐만 아니라 그 외 표지자들의 임의의 조합이 풍부한 샘플들을 고려한다:
1) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, CD45RO+;
2) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, IFNγ+;
3) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, CD45RO+, 그랜자임 B+;
4) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, CD45RO+, 퍼포린+;
5) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, CD45RO+, 그랜자임 B+, 퍼포린+;
6) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, IFNγ그랜자임 B+;
7) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, IFNγ퍼포린+;
8) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, IFNγ+, 그랜자임 B+, 퍼포린+;
9) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, 그랜자임 B +;
10) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, 그랜자임 B+, 퍼포린+;
11) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, 퍼포린+; 또는
12) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, IFNγ+, CD45RO+, 그랜자임 B+, 퍼포린+.
13) LAG3+ (예컨대, LAG3 중-고), CD8+, CD45RO+;
14) LAG3+ (예컨대, LAG3 중-고), CD8+, IFNγ+;
15) LAG3+ (예컨대, LAG3 중-고), CD8+, CD45RO+, 그랜자임 B+;
16) LAG3+ (예컨대, LAG3 중-고), CD8+, CD45RO+, 퍼포린+;
17) LAG3+ (예컨대, LAG3 중-고), CD8+, CD45RO+, 그랜자임 B+, 퍼포린+;
18) LAG3+ (예컨대, LAG3 중-고), CD8+, IFNγ그랜자임 B+;
19) LAG3+ (예컨대, LAG3 중-고), CD8+, IFNγ퍼포린+;
20) LAG3+ (예컨대, LAG3 중-고), CD8+, IFNγ+, 그랜자임 B+, 퍼포린+;
21) LAG3+ (예컨대, LAG3 중-고), CD8+, 그랜자임 B +;
22) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, 그랜자임 B+, 퍼포린+;
23) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, 퍼포린+; 또는
24) PD1+ (예컨대, PD1중-고), CD8+, IFNγ+, CD45RO+, 그랜자임 B+,
25) PD1+, LAG3+, CD8+, CD45RO+;
26) PD1+, LAG3+,, CD8+, IFNγ
27) PD1+, LAG3+,, CD8+, CD45RO+, 그랜자임 B+;
28) PD1+, LAG3+,, CD8+, CD45RO+, 퍼포린+;
29) PD1+, LAG3+, CD8+, CD45RO+, 그랜자임 B+, 퍼포린+;
30) PD1+, LAG3+,, CD8+, IFNγ그랜자임 B+;
31) PD1+, LAG3+,, CD8+, IFNγ퍼포린+;
32) PD1+, LAG3+,, CD8+, IFNγ+, 그랜자임 B+, 퍼포린+;
33) PD1+, LAG3+,, CD8+, 그랜자임 B +;
34) PD1+, LAG3+,, CD8+, 그랜자임 B+, 퍼포린+;
35) PD1+, LAG3+,, CD8+, 퍼포린+; 또는
36) PD1+, LAG3+,, CD8+, IFNγ+, CD45RO+, 그랜자임 B+,
그 발현을 사용하여 분류할 수 있고 활성화된 및/또는 항원-특이적 CD8+ T 세포에 풍부한 그 외 적합한 세포 표면 표지자들에는, LAG-3, TIM-3, 4-1BB, CTLA-4 및 ICOS 중 하나 이상이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다 (예컨대, Gros 외., J Clin Invest. 2014 May;124(5):2246-59 참조).
질병 항원-특이적, CD8+ T 세포의 TCR 분석 및 라이브러리의 생성
시퀀싱(Sequencing). 한 추가 양상에서, 본 출원의 방법은 항원-특이적 (예컨대, PD1+ 및/또는 LAG3+) CD8+ T 세포를 내포하는 샘플로부터 얻은 T 세포 수용체 (TCR)의 알파 및 베타 사슬들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 내포하는 핵산들을 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 이러한 시퀀싱 단계는 CD8+ T 세포, 예컨대, 단리된 CD8+ T 세포를 내포하는 샘플에서 발현된 기능적인 항원-특이적 TCR을 구성하는, 알파 및 베타 사슬쌍의 가변 영역들 내 최소한 상보성 결정 영역들 (CDRs)의 아미노산 서열을 결정할 수 있는 임의의 적합한 방법을 사용하여 실시될 수 있다. 적합한 방법들은 예컨대, US 20140322716, US 20130273647, US 20150031043에 기재되어 있다. (예컨대, Howie 외. "High-throughput pairing of T cell receptor α and β sequences." Science translational medicine 7.301 (2015): 301ra131-301ra131 또한 참조.)
일부 구체예들에서, 시퀀싱 단계는 개개의 CD8+ T 세포, 예컨대, 단리된 CD8+ T 세포에서 발현된 알파 및 베타 사슬들의 쌍을 결정하기 위하여, 고-처리율 시퀀싱 플랫폼 (가령, Roche 454 (예컨대, Roche 454 GS FLX); Applied Biosystems사의 SOLiD®시스템 (예컨대, SOLiD®Illumina사의 GAIIx, HiSeq®2000 및 MiSeq®시퀀싱장치; Life Technologies사의 Ion Torrent®반도체 시퀀싱 플랫폼, Pacific Biosciences사의 PacBio RS 및 Sanger사의 3730xl); 다양한 TCR 서열들을 증폭시키기 위해 설계된 적합한 프라이머 쌍들; 및 적합한 자동화 알고리즘을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 방법들은, 예컨대, US 20140322716, US 20150031043에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
일부 구체예들에서, 시퀀싱은 CD8+ T 세포, 예컨대, 단리된 CD8+ T 세포의 모집단의 개개 세포들을 분류하는 단계, 및 개개 분류된 CD8+ T 세포, 예컨대, 단리된 CD8+ T 세포에서 발현된 TCR의 알파 및 베타 사슬들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들의 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다 (예컨대, US 20130273647; Kobayashi 외., Nat Med. 2013 Nov;19(11):1542-6 참조).
일부 구체예들에서, CD8+ T 세포, 예컨대, 단리된 PD1+ CD8+ T 세포는, T 세포로부터 얻은 핵산들을 시퀀싱하기 전에 환자로부터 얻은 단리된 CD8+ T 세포 모집단을 확장 및/또는 선별하기 위하여 시험관내 배양될 수 있다. 배양물에서 단리된 항원-특이적 CD8+ T 세포 모집단을 확장 및/또는 선별하기 위한 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다.
CD8+ T 세포, 예컨대, 단리된 CD8+ T 세포의 표면에서 발현된 TCR의 알파 및 베타 사슬쌍을 인코딩하는 핵산들을 시퀀싱한 후, 각 사슬의 CDR 영역들을 비롯한 알파 및 베타 사슬들의 아미노산 서열이 결정될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 출원의 방법은 상기한 바와 같이, 일정 방법에 의해 결정된, CD8+ T 세포, 예컨대, 단리된 CD8+ T 세포 표면에서 발현된 TCR의 알파 및 베타 사슬쌍들의 아미노산 서열들을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이러한 분석 단계는 IL-10 제제-치료된 환자들의 말초 혈액에서 유래한 TCR 서열들의 알파 및 베타 사슬쌍들을 IL-10 제제 치료 전 환자의 환부에서 유래한 TCR 서열들의 유사한 알파 및 베타 사슬쌍과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 분석은 IL-10 제제 치료로 인해 우선적으로 확장되는 T 세포에서 발현된 하나 이상의 항원-특이적 TCR들을 밝혀낼 수 있다. 환부는 예컨대, 종양, 또는 감염 부위일 수 있으며, 환부를 침윤시킨 T 세포는 IL-10 제제 치료 전 환자로부터 얻은 생검에서 얻을 수 있다.
일부 경우에서, 상기 분석 단계는 하나 이상의 환자들로부터 얻은 복수의 클론 알파 및/또는 베타 사슬 아미노산 서열들을 비교하는 단계, 및 공지된, 또는 공지되지 않은, 질병-관련 항원에 특이적인 TCR들에 대한 알파 및/또는 베타 사슬의 공통 1차 구조를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 공통 1차 구조는 이러한 1차 구조 내 아미노산 위치에 따라 달라지는, 아미노산 서열에 관한 임의의 특징을 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 특징은 항원 특이성과 관련된 것일 수 있다. 관심 대상인 공통 1차 구조들에는, 알파 및/또는 베타 사슬의 길이에 따른 공통 전하 분포, 및 알파 및/또는 베타 사슬의 공통 아미노산 서열이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 경우에서, CD8+ T 세포, 예컨대, 단리된 CD8+ T 세포 표면에서 발현된 TCR의 알파 및 베타 사슬쌍들의 아미노산 서열을 분석하는 단계는, 복수의 환자들로부터 얻은 복수의 클론 알파 및/또는 베타 사슬 아미노산 서열들을 비교하는 단계, 및 상기 샘플의 하나 이상의 파라미터들에 근거하여 TCR에 관한 알파 및/또는 베타 사슬의 공통 1차 구조를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 파라미터들은 환자의 일배체형, 환자가 걸린 질병 유형 (예컨대, 암의 유형, 감염의 유형) 등을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 임의의 적합한 샘플 파라미터일 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에서, 아미노산 서열들을 분석하는 단계는 환자가 해당 환자에게 특유한 질병 또는 질병 항원에 대한 클론 알파 및/또는 베타 사슬 아미노산 서열을 가짐을 밝힐 수 있다 (즉, “개별항원 (priVαte)”T 세포 반응). 일부 경우에서, 아미노산 서열들을 분석하는 단계는 둘 또는 그 이상의 환자들 각각이 질병 또는 질병 항원과 유사한 클론 알파 및/또는 베타 사슬 아미노산 서열들을 가짐을 밝힐 수 있다 (즉, “공통항원 (public)”T 세포 반응).
CD8+ T 세포, 예컨대, 단리된 CD8+ T 세포 표면에서 발현된 TCR의 알파 및 베타 사슬쌍들의 아미노산 서열들 중에서 공통 서열들을 분석하는 단계는 임의의 편한 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 적합한 방법들이 예컨대, Khan, 외. Journal of Infectious Diseases 185.8 (2002): 1025-1034; Trautmann, 외. European journal of immunology 32.11 (2002): 3181-3190에 기재되어 있다. 전형적으로 아미노산 서열들의 분석은 TCR의 항원 특이성에 원인이 되는 TCR의 알파 및 베타 사슬들의 영역에 대해 수행된다. 일부 경우에서, 상기 분석 단계는 TCR의 알파 및 베타 사슬 (Vα 및 Vβ중 하나 또는 둘 모두의 가변 영역들의 하나 이상의 상보성 결정 영역들 (CDRs, 가령, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)에 대해 수행된다. 일부 경우에서, 상기 분석 단계는 TCR의 알파 및 베타 사슬들의 가변 영역들에 대해 수행된다. 일부 경우에서, 상기 분석 단계는 가변 및 불변 영역들을 포함하는 TCR의 알파 및 베타 사슬들의 영역들 (즉, 전장 알파 및 베타 사슬 TCR 폴리펩티드들)에 대해 수행된다. 일부 경우에서, 상기 분석 단계는 TCR의 전장 알파 및 베타 사슬들에 대해 수행된다.
항원 특이성의 분석. 일부 구체예들에서, CD8+ T 세포, 예컨대, 단리된 CD8+ T 세포는, T 세포를 얻었던 환자의 질병 조직에 존재하는 새로운 항원에 특이적인 또는 공지된 항원, 예컨대, 공지된 질병 항원에 특이적인 세포들을 식별 및 단리하기 위하여 추가로 분류될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 출원의 방법들은 새로운 질병 항원-특이적 TCR 알파/베타 쌍 및/또는 새로운 질병-특이적 항원들을 식별하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 구체예들에서, 질병 항원 특이성은 IL-10 제제 치료 전에 환자로부터 얻은 환자의 CD8+ T 세포를 내포하는 질병 조직 샘플 (예컨대, 고형 종양 생검)을 얻음으로써 평가될 수 있다. 이러한 치료전 샘플은 아카이브(archiVαl) 샘플로 기능할 수 있다. 이러한 치료전 샘플을 본 출원에 기재된, 치료후 샘플들과 동일한 치료 및 분석 처리하여, 치료전 샘플 내 TCR 알파 및 베타 서열을 얻을 수 있다. 이후 치료전 샘플에 존재하는 TCR 서열들을 (예컨대, IL-10 제제 요법 개시 후 상이한 시점들에서 얻은) 치료후 샘플(들)의 TCR 서열들과 비교하여, IL-10 제제 요법 이전과 IL-10 제제 요법 이후 질병 조직 T 세포에 존재하는 TCR 알파 및 베타 서열들을 식별할 수 있다 (예컨대, 상이한 시점들에서, 예컨대, 1일차를 1일차, 5일차, 10일차, 15일차, 20일차, 30일차 등 중에서 하나 이상과 비교). IL-10 제제 요법 후 도수가 증가된 TCR 알파 및/또는 베타 서열들은 IL-10 제제 요법에 대해 반응하여 확장된 그리고 질병 조직의 항원에 특이적인 (예컨대, 종양 항원-특이적) CD8+ T 세포의 TCR들로 식별된다.
질병 항원 결합 특이성은, 예를 들면, IL-10 제제 요법 후 확장된, 환자의 T 세포에 존재하는 TCR들을 식별함으로써 분석될 수 있다. 예를 들면, 환자의 CD8+ T 세포를 내포하는 질병 조직 또는 질병 관련 조직 (예컨대, 고형 종양 생검, 바이러스-감염된 조직, 등)의 샘플에 존재하는 Vα 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드들의 아미노산 서열들, 또는 인코딩 핵산 서열들을 IL-10 제제 치료 전 환자로부터 얻는다. 이러한 치료전 샘플은 아카이브(archiVαl) 샘플로 기능할 수 있다. 치료전 샘플은 TCR-관련 서열들의 공급원으로 사용되기 때문에, 이 샘플을 T 세포 선별 대상으로 할 필요는 없음을 유념하여야 한다.
치료전 및 치료후 샘플들에 존재하는 Vα 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드들의 인코딩 핵산 서열 또는 아미노산 서열들을 결정할 수 있다. Vβ TCR 폴리펩티드 서열들은 일반적으로 Vα TCR 폴리펩티드 보다 TCR들 사이에서 더 큰 변이성을 나타내기 때문에, 이 단계에서 서열 분석은 치료전과 치료후 샘플들 내 Vβ TCR 폴리펩티드들 (이의 단편들, 가령, Vβ TCR의 CDR3 포함)의 아미노산 서열, 또는 인코딩 핵산들에 대해서만 수행될 수 있다. 이후 TCR 알파 및/또는 베타 서열들을 비교하여 IL-10 제제 요법 전 질병 조직에 존재하는 T 세포에 존재하였던 TCR 알파 및/또는 베타 서열들, 그리고 IL-10 제제 요법 후 도수가 증가하였던 이들 서열들을 결정할 수 있다. IL-10 제제 요법 후 선택된 배경 수준 이상으로 도수가 증가하는 TCR 서열들은 질병 조직의 항원에 특이적인 (예컨대, 종양 항원-특이적, 바이러스 항원 특이적) TCR과 관련되는 것으로 식별되며, IL-10 제제 요법에 의해 확장된 T 세포 클론들에 존재하는 TCR들을 나타낸다.
식별된 질병 항원- 특이적 TCR들의 Vα 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드들의 (예컨대, TCR의 Vα/Vβ 폴리펩티드 쌍을 비롯한 Vα 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드의) 아미노산 서열들, 인코딩 핵산 서열들, 뿐만 아니라 이러한 인코딩 핵산들을 내포하는 작제물들은, 특히, 핵산들 및/또는 클론들의 라이브러리에, 뿐만 아니라 핵산 서열 및/또는 아미노산 서열 정보의 데이터베이스에 포함시킬 대상이 된다. 유사하게, 본 출원은 최소한 Vβ 폴리펩티드들에 대한 핵산 및/또는 아미노산 서열 정보의 데이터베이트 구축을 제공하며, 선택적으로 치료전 샘플들에 존재하는 T 세포의 Vα 폴리펩티드 서열 정보, 뿐만 아니라 Vα/Vβ 폴리펩티드 쌍의 서열 정보를 포함할 수 있다.
질병 항원 결합 특이성은 환자의 치료전 질병 조직에 대한 특이적 결합을 평가함으로써, 예컨대, IL-10 제제 요법에 대해 반응하여 상향조절되거나 유도됨에 의해 식별된 TCR 알파/베타 쌍을 포함하는 재조합 TCR (예컨대, CAR-T)를 발현시키도록 유전자 변형된 CD8+ T 세포의 특이적 결합을 테스트함으로써 분석될 수 있다. 이러한 재조합 TCR들에 의해 결합되는 질병 항원들, 및/또는 이러한 항원들의 T 세포 에피토프들은 해당 기술 분야에 공지된 방법들에 따라 식별될 수 있다.
항원이 공지된 항원인 경우, 공지된 항원의 에피토프에 결합하는 새로운 T 세포 에피토프들 및/또는 새로운 알파/베타 TCR 폴리펩티드 쌍을 식별하기 위해 본 출원의 방법들이 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 공지된 항원에 특이적인 CD8+ T 세포, 예컨대, 단리된 CD8+ T 세포를 지지체, 예컨대, 자성 비드, 컬럼, 등에 접합된 공지의 항원과 접촉시킴으로써, 공지된 항원에 특이적인 세포들을 특이적이지 않은 세포들로부터 분리할 수 있다. 일부 경우에서, 공지된 항원에 특이적인 CD8+ T 세포, 예컨대, 단리된 CD8+ T 세포를 형광 모이어티에 접합된 공지 항원과 접촉시키고, 이 세포들을 형광 수준을 기준으로, 예컨대, FACS로 분류하여, 항원-특이적 T 세포를 단리할 수 있다. 적합한 방법들이 예컨대, US 2006013470에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다. 임의의 적합한 공지 항원이 사용될 수 있다. 일부 경우에서, IL-10 제제 요법을 투여받았던 환자가 암에 걸린 경우, 유도된 CD8+ T-세포가 지시하는 항원은 공지된 종양-관련 항원이다. 제한없이, CBX2, PLAC1, CLDN6, SPANX, MAGEA3, TPTE, ACTL8, ANKRD30A, CDKN2A, MAD2L1, CTAG1B, MAGEA4, MAGEA5, SUNC1, MAGEA10, LRRN1, MAGEA9, WT1, 암배아 항원 (CEA), 알파태아단백질 (AFP), CA19-9, CA125, PSA, CA72-4, SCC, MK-1, MUC-1, p53, HER2, G250, gp-100, 흑색종-관련 항원 (MAGE)-1, -2 및 -3, BAGE, SART, MART, MYCN, BCR-ABL, TRP, LAGE, GAGE, 티로시나아제, 상피 종양 항원 (ETA), Her-2/Neu, 혈청 전립선 특이적 항원 (PSA), 및 NY-ESO1을 비롯한 널리 다양한 종양 관련 항원들이 해당 기술 분야에 공지되어 있다. 일부 구체예들에서, IL-10 제제 요법을 투여받았던 환자가 감염성 질병에 걸린 경우, 공지된 항원은 상기 기재된 바와 같이, 바이러스 항원, 가령, CMV pp65, HIV gp120, 등, 또는 세포내 병원체로부터의 그 외 공지된 임의의 항원성 펩티드이다.
라이브러리. 또한 본 출원은 핵산 작제물, 예컨대, 벡터들의 라이브러리를 제공하며, 여기서 라이브러리는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 얻은, 복수의 항원-특이적 TCR α 및 β사슬 쌍 서열들, 또는 최소한 하나 이상의 이의 가변 영역들에 해당한다. 일부 경우에서, 라이브러리의 각각의 작제물은 항원-특이적 TCR α 및 β사슬 쌍 서열, 또는 예컨대, 다중시스트론 작제물과 같은, 또는 CAR과 같은 최소한 하나 또는 그 이상의 이의 가변 영역들을 내포할 수 있다.
유전자 변형된 T 세포의 생성. CD8+ T 세포, 예컨대, 단리된 CD8+ T 세포 표면에서 발현된 TCR의 알파 및 베타 사슬쌍의 환자-특이적 서열들 및/또는 공통 서열들의 용도는, 하기 추가로 기재하는 바와 같이, 필요로 하는 개체 (유도된 CD8+ T-세포를 단리하였던 환자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아님)에게 투여시 질병-특이적 항원들을 표적하여 치료 효과를 제공하는 유전자변이 CD8+ T 세포 모집단을 생성하는 것에서 발견된다.
본 발명의 방법의 양상들은 질병 항원-특이적 Vα 및 Vβ TCR 쌍들 각각을 T 세포에서 TCR 또는 TCR-유사 수용체 (가령, 하기 추가로 설명하는 바와 같은 키메라 항원 수용체 (CAR))를 발현시키도록 구성된 하나 이상의 벡터들로 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 내포하는 핵산들을 클로닝하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 핵산들의 클로닝 단계는 임의의 적합한 방법을 사용하여 실시될 수 있다. 벡터는 T 세포에서 TCR 소단위, 또는 TCR-유사 수용체, 예컨대, CAR을 클로닝 및/또는 발현시키기에 적합한 임의의 벡터가 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 벡터는 발현 벡터이다. 발현 벡터는 수많은 공지된 임의의 유전자 전달 시스템들 (예컨대, 자연능, 화학적으로 매개된 형질전환, 프로토플라스트 형질전환, 전기천공, 유전자총 형질전환, 형질감염, 또는 접합)에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 선택되는 유전자 전달 시스템은 사용되는 숙주 세포 및 벡터 시스템들에 따라 달라진다. 일부 경우에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터이다 (예컨대, Jones 외., Hum Gene Ther. 2009 Jun;20(6):630-40 참조).
일부 경우에서, 하기 추가로 설명하는 바와 같이, TCR의 α 및 β사슬들 모두, 또는 최소한 이의 가변 영역들을 내포하는 유전자 산물을, 예컨대, 전장 TCR로서, 또는 단쇄 T 세포 수용체 (scTv)를 내포하는 키메라 항원 수용체로서 발현시키기 위한 단일 벡터가 구성된다.
유전자 변형된 T 세포, 이의 생성, 및 치료요법에서의 사용방법
본 출원은 재조합, 질병 항원-특이적 TCR을 발현시키는 새로운 유전자 변형된 T 세포의 생성, 식별, 확장, 제조, 뿐만 아니라 이의 요법에서의 사용 방법을 고려한다.
유전자 변형된 T 세포의 생성
본 출원은 유전자 변형된 T 세포를 제공하는데, 상기 T 세포는 재조합 T 세포 수용체 (TCR)를 발현시키도록 변형되고, 상기 TCR은 Vα/ Vβ TCR 쌍의 가변 알파 (Vα) T 세포 수용체 (TCR) 폴리펩티드의 하나, 둘 및/또는 세 개의 상보성 결정 영역들 (CDR) 및 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드의 하나, 둘 및/또는 세 개의 CDR들을 포함하며, 상기 Vα/ Vβ TCR 쌍은 IL-10 제제 투여에 반응하여 포유동물에서 유도된 PD1+, CD8+ 말초 T 세포의 질병 항원-특이적 TCR로부터 유래한다. 한 구체예에서, 유전자 변형된 T-세포에서 발현된 TCR은 IL-10 제제의 투여에 반응하여 포유동물에서 유도된 CD8+ 말초 T 세포의 질병 항원-특이적 TCR에서 유래한 Vα/ Vβ TCR 쌍의 전장 Vα 및 Vβ 폴리펩티드들을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 유전자 변형된 T 세포는 키메라 항원 수용체 T 세포이다. 키메라 항원 수용체 T 세포 (CARs; 또한 인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 및 키메라 면역수용체로도 공지됨)는 암 (예컨대, B 및 T 세포 림프종의 치료) 및 그 외 악성종양에 대한 새로운 치료법을 나타낸다. CAR T 세포는 공지된 질병 항원 (예컨대, 항원, 예를 들면, 관심 대상의 종양에 존재하는 항원)에 특이적인 재조합 T 세포 수용체를 발현시키도록 변형된 자가 (환자-유래) 또는 동계 공여자 기억 CD8+ T 세포 (예컨대, CD45RO+, CD8+ T 세포)를 포함할 수 있다. 동계 공여자 T 세포가 사용되는 경우, 이러한 T 세포는 내인성 TCR의 발현을 파괴 (예컨대, 녹아웃)하기 위해 추가로 유전자 변형될 수 있음을 유념하여야 한다. 본 출원에서 고려되는 그 외 T 세포 유형들은 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 효과기 기억 T 세포 또는 이의 조합을 포함한다. 본 출원은 일반적으로 암 치료에 관하여 CAR T 세포 요법을 사용하는 내용을 기재하고 있으나, 이러한 요법에 제한되지 않음을 이해하여야 한다. CAR T 세포 요법은 CD8+ T 세포 요법이 잘 듣는 임의의 질병, 예컨대, 바이러스 감염을 치료함에 있어서 그 용도를 찾을 수 있다.
CAR T 세포 요법은 입양 세포 전달 (ACT)의 이용을 수반할 수 있다. 환자 자신의 배양된 T 세포를 사용하는 ACT는 환자-특이적 암 요법으로서의 가능성을 보여주었다 (Snook 및 Waldman (2013) Discov Med 15(81):120-25). 결정된 특이성의 항원-표적화 수용체들을 T 세포에 삽입하기 위한 유전자 공학적 접근방법의 사용은 가능한 ACT의 능력을 상당히 확장시켰다. 대부분의 경우에서, 이들 유전자조작된 키메라 항원 수용체들은 단클론 항체의 특이성을 T 세포에 이식하기 위해 사용된다.
CAR T 세포 요법의 시작은 환자로부터 또는 환자와 충분한 MHC 적합성을 가지는 공여자로부터 T 세포를 제거하는 것을 포함한다. 이후 T 세포는 공지된 암 (예컨대, 종양)에 특이적인 항원에 대해 지시된 CAR들을 발현시키기 위해 유전자 조작된다. 충분한 수로 생체외 증폭 후, 자가 세포는 환자에게 다시 주입되어, 암을 항원-특이적 파괴시킨다.
CAR들은 가장 통상적으로 단클론 항체로부터의 단일-사슬 가변 단편들 (scFvs)인 세포외 항원-결합 모이어티들에 일반적으로 융합된 세포내 T-세포 신호전달 도메인들로 구성된 한 유형의 항원-표적화 수용체이다. CAR들은 MHC-매개된 제시에 관계없이 세포 표면 항원들을 직접 인지하므로, 다수의 환자들에서 주어지는 임의의 항원에 특이적인 단일 수용체 작제물을 사용할 수 있게 한다.
키메라 항원 수용체들은 일반적으로 몇 가지 주요 구성요소들을 포함하며, 이들 중 일부는 하기에 설명한다. 항원 결합 특이성이 Vα/ Vβ TCR 쌍의 가변 알파 (Vα) T 세포 수용체 (TCR) 폴리펩티드의 상보성 결정 영역들 (CDRs) 및 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드의 CDRs에 의해 제공되는 키메라 항원 수용체들은 본 명세서에서 CAR-T로 지칭되며, 이러한 CAR-T 작제물들을 포함하는 유전자 변형된 T 세포는 CAR-T T 세포로 지칭된다. 이러한 CAR-T 작제물들의 항원 결합 부위는 본 명세서에서 단쇄 T 세포 수용체, 또는 “scTv”로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 어구 “항원-특이적 표적 영역” (ASTR)은 CAR을 특이적 항원들에 대해 지시하는 영역을 지칭한다. CAR의 표적 영역들은 세포외에 존재한다. 본 출원의 특정 구체예들에서, CARs은 최소한 두 개의 상이한 항원들을 표적하는 최소한 두 개의 표적 영역들을 포함한다. 추가 구체예들에서, CARs은 최소한 셋 또는 그 이상의 상이한 항원들을 표적하는 셋 또는 그 이상의 표적 영역들을 포함한다.
본 출원의 내용에서, CAR-T의 ASTR은, IL-10 제제 투여에 반응하여 포유동물에서 유도된 CD8+ 말초 T 세포의 질병 항원-특이적 TCR의 Vα/ Vβ TCR 쌍의, 가변 알파 (Vα) T 세포 수용체 (TCR) 폴리펩티드의 CDR에 상응하는 서열을 가지는 하나, 둘 또는 세 개의 CDR들, 및 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드의 CDR에 상응하는 서열을 가지는 하나, 둘 또는 세 개의 CDR들을 포함한다. 한 구체예에서, CAR-T의 ASTR은 IL-10 제제의 투여에 반응하여 포유동물에서 유도된 CD8+ 말초 T 세포의 질병 항원-특이적 TCR에서 유래한 Vα/ Vβ TCR 쌍의 전장 Vα 및 Vβ 폴리펩티드들을 포함한다. 또 다른 구체예에서, CAR-T의 ASTR은 IL-10 제제의 투여에 반응하여 포유동물에서 유도된 CD8+ 말초 T 세포의 질병 항원-특이적 TCR에서 유래한 Vα/ Vβ TCR 쌍과 90% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 Vα 및 Vβ 폴리펩티드들을 포함한다.
일반적으로, ASTR은 단쇄 TCR (scTv)의 ASTR을 제공하기 위하여 (예컨대, 펩티드 링커를 통해) Vα 폴리펩티드에 작동적으로 연결되는 Vβ 폴리펩티드를 포함하는 단쇄 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, scTv의 ASTR은 N-말단에서 C-말단으로, Vβ 폴리펩티드-링커-Vα 폴리펩티드의 일반 구조를 가질 수 있다. scTv의 ASTR의 Vα 폴리펩티드의 C-말단은 scTV의 또 다른 성분들, 예컨대, N-말단에서 C-말단으로, 세포외 스페이서 도메인, 막경유 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인에 작동적으로 융합되며, 이들 각각의 예들이 하기 제공된다. scTV의 제조 방법은 해당 기술 분야에서 설명되어 있으며, 예컨대, US 2012/0252742를 참조하라. 본 출원은 또한 scTv의 ASTR을 포함하는 가용성 폴리펩티드를 고려한다 (“가용성 scTv”). 이러한 예들에서, 이들 폴리펩티드들은 scTv의 ASTR의 Vβ 폴리펩티드의 N-말단에 융합된, 용해성을 촉진시키기 위한 폴리펩티드, 예컨대, 인간 혈청 알부민을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “세포외 스페이서 도메인” (ESD)은 항원-특이적 표적 영역과 막경유 도메인 사이의 친수성 CAR 영역을 지칭한다. 본 출원은 CAR-T들이 ESD를 포함하는 구체예들을 고려하는데, ESD의 예들에는 CD8의 힌지 영역 및 예를 들면, US 2012/0252742에 기재된 그 외 도메인들; Gly3 또는 IgGs (가령, 인간 IgG4)의 CH1 및 CH3 도메인들을 비롯한 인공 스페이서 서열들; 또는 전술한 것들의 조합이 포함된다. 해당 기술 분야의 통상의 기술자는 본 출원에서 고려되는 그 외 ESD들을 잘 알고 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “막경유 도메인” (TMD)은 형질막을 경유하는 CAR 영역을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 막경유 영역은 막경유 단백질 (예컨대, 제1형 막경유 단백질), 인공 소수성 서열, 또는 이의 조합이다. 숙련된 기술자는 본 출원에 개시된 내용과 관련하여 사용될 수 있는 그 외 막경유 도메인들을 알고 있을 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “세포내 신호전달 도메인” (ISD) 및 “세포질 도메인”은 효과기 기능 신호를 형질도입시켜 세포가 그 특수화된 기능을 수행하도록 지시하는 CAR 부분을 지칭한다. ISD의 예들에는 T-세포 수용체 복합체의 제타 사슬 또는 이의 임의의 동족체 (예컨대, 에타 사슬, FcεR1γ 및 β 사슬들, MB1 (Igα) 사슬, B29 (Igβ) 사슬 등), 인간 CD3 제타 사슬, CD3 폴리펩티드 (δ, Δ 및 ε), syk 패밀리 티로신 키나아제 (Syk, ZAP 70, 등), src 패밀리 티로신 키나아제 (Lck, Fyn, Lyn, 등) 및 T-세포 형질도입에 관여하는 그 외 분자들, 가령, CD2, CD5 및 CD28이 포함된다. 숙련된 기술자는 본 출원의 개시 내용과 관련하여 사용될 수 있는 그 외 ISD를 알고 있을 것이다.
용어 “보조-자극 도메인” (CSD)은 기억 세포의 증식, 생존 또는 발달을 향상시키는 CAR 부분을 지칭한다. 본 명세서의 다른 부분에 나타난 바와 같이, 본 출원의 CAR들은 하나 이상의 보조-자극 도메인들을 포함할 수 있다. 본 출원의 일부 구체예들에서, CSD는 TNFR 수퍼패밀리, CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 또는 이의 조합 중 하나 이상의 요소들을 포함한다. 통상의 숙련된 기술자는 숙련된 기술자는 본 출원의 개시 내용과 관련하여 사용될 수 있는 그 외 보조-자극 도메인을 알고 있을 것이다.
본 명세서에 기재된 CAR-T T 세포 기술과 관련하여 사용되는 용어 “링커”, “링커 도메인” 및 “링커 영역”은 약 1 내지 100개 아미노산 길이의 올리고- 또는 폴리펩티드 영역을 지칭하며, 이는 본 출원의 CAR의 임의의 도메인들/영역들을 함께 연결시킨다. 링커들은 글리신 및 세린과 같은 유연 잔기들로 구성될 수 있으며, 그리하여 인접한 단백질 도메인들은 또 다른 도메인에 대해 자유로이 이동한다. 특정 구체예들은 두 개의 인접 도메인들이 서로 간 입체적으로 방해하지 않도록 하는 것이 바람직한 경우 보다 긴 길이의 링커들을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 링커들은 비-절단성인 반면, 그 외 구체예들에서 링커들은 절단가능한 (예컨대, 2A 링커들 (예를 들면 T2A)), 2A-유사 링커 또는 이의 기능적 균등물, 그리고 전술한 것들의 조합이다. 본 출원은 링커들이 피코르나바이러스 2A-유사 링커, 돼지 테스코바이러스 (porcine teschovirus) (P2A)의 CHYSEL 서열들, 토세아 아시나 (Thosea asigna) 바이러스 (T2A), 또는 이의 조합, 변이체 및 기능적 균등물을 포함하는 구체예들을 고려한다. 또한 추가 구체예들에서, 링커 서열들은 Asp-Vαl/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)-pro(2B) 모티프를 포함하며, 이는 2A 글리신과 2B 프롤린 사이를 절단시킨다. 그 외 링커들을 숙련된 기술자들은 용이하게 알 수 있을 것이며 본 출원에 개시된 내용과 함께 사용하기 위하여 고려된다.
치료요법에서 유전자 변형된 T 세포의 사용 방법
상기 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포)들은 CD8+ 세포 치료요법이 잘 듣는 질병의 치료에서 단독으로 또는 그 외 치료 제제들과 함께 유용하다. 일반적으로, 유전자 변형된 T 세포(들) (예컨대, CAR-T T 세포)은 치료될 질병에 따라 선택된다.
본 출원의 방법들은 CD8+ 세포 요법을 이용한 치료가 잘 듣는 질병에 걸린 포유동물 대상체에 하나 이상의 선택된 유전자 변형된 CD8+ T 세포를 투여하는 단계를 고려한다.
한 구체예에서, CD8+ 세포 요법을 이용한 치료가 잘 듣는 질병에 걸린 포유동물 대상체에 투여되는 유전자 변형된 CD8+ T 세포는 동일한 재조합 TCR을 발현시키는 유전자 변형된 CD8+ T 세포의 모집단이다. 또 다른 구체예에서, CD8+ 세포 요법을 이용한 치료가 잘 듣는 질병에 걸린 포유동물 대상체에게 투여되는 유전자 변형된 CD8+ T 세포는 세포 표면에서 발현된 질병 항원-특이적 TCR에 대해 이종이다. 이러한 후자의 접근방법에서, 모집단 내 유전자 변형된 CD8+ T 세포의 상이한 Vα/Vβ TCR 쌍들은 동일한 질병 항원 (예컨대, 동일한 항원의 상이한 에피토프들) 또는 상이한 질병 항원들에 결합하도록 선택될 수 있다.
본 출원에서 고려되는, 선택적으로 병용 요법으로, 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포)의 투여를 포함하는 치료는, 암, 예를 들면, 자궁, 자궁경부, 유방, 전립선, 고환, 위장관 (예컨대, 식도, 입인두, 위, 소장 또는 대장, 결장, 또는 직장), 신장, 콩팥 세포, 방광, 골, 골수, 피부, 두경부, 간, 쓸개, 심장, 폐, 이자, 침샘, 부신, 갑상선, 뇌 (예컨대, 교종), 신경절, 중추신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS)의 암, 및 조혈계 및 면역계 (예컨대, 비장 또는 흉선)의 암을 비롯한 증식성 질병, 장애 또는 병태의 치료 또는 예방을 포함한다. 본 출원은 또한, 예를 들면, 면역원성 종양, 비-면역원성 종양, 휴면 종양, 바이러스-유도된 암 (예컨대, 상피 세포 암, 내피 세포 암, 편평세포 암종 및 파필로마바이러스), 아데노암종, 림프종, 암종, 흑색종, 백혈병, 골수종, 육종, 기형암종, 화학적으로-유도된 암, 전이, 및 혈관신생을 비롯한 그 외 암-관련 질병, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법들을 제공한다. 본 출원은 예컨대, 조절 T-세포 및/또는 CD8+ T-세포의 활성을 조절함으로써, 종양 세포 또는 암 세포 항원의 내성을 감소시키는 것을 고려한다 (예컨대, Ramirez-Montagut, 외. (2003) Oncogene 22:3180-87; 및 Sawaya, 외. (2003) New Engl. J. Med. 349:1501-09 참조). 특정 구체예들에서, 종양 또는 암은 결장 암, 난소 암, 유방 암, 흑색종, 폐 암, 교모세포종, 또는 백혈병이다. 용어(들) 암-관련 질병, 장애 및 병태의 사용은 광범위하게 암과 직접 또는 간접적으로 관련되는 병태를 지칭하는 의미이며, 예컨대, 혈관신생 및 전암성 병태, 가령, 이형성증을 포함한다.
본 출원은 또한, 바이러스 감염에 의해 유발되는 질병을 치료 또는 예방하기 위하여, 선택적으로 병용 요법으로, 본 출원에 기재된 유전자 변형된 T 세포 요법 (가령, CAR-T 세포 요법)의 사용을 고려한다. 예시적인 바이러스 제제들에는 단일-가닥 DNA (ssDNA), 이중-가닥 DNA (dsDNA) 및 RNA 바이러스가 포함된다. 일부 구체예들에서, 바이러스는 헤파드나바이러스, 플라비바이러스, 레트로바이러스, 또는 헤르페스 바이러스이다. 일부 경우에서, 질병은, 제한없이, A형 간염, B형 간염 (HBV), C형 간염 (HCV), 인플루엔자, 수두 대상포진 바이러스 (VZV), 아데노바이러스, 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 제1형 단순 헤르페스 (HSV-I), 제2형 단순 헤르페스 (HSV-II), 리노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 유두종 바이러스 (HPV), 파포바 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV), 에키노바이러스, 아르보바이러스, 훈타바이러스, 콕사키 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 폴리오 바이러스, 제1형 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-I), 및 제2형 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-II), 인간 T 림프친화 바이러스 (HTLV-1 및 HTLV-2), 코로나바이러스, 회색질척수염 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6 (HHV-6), 등에 의해 유발될 수 있다.
병용 치료
본 출원은 또한 유전자 변형된 T 세포 단일요법 뿐만 아니라 병용 요법 모두를 고려한다. 예를 들면, 본 발명의 유전자 변형된 T 세포는 포유동물 대상체에 단독으로 또는 하나 이상의 활성 제제들 (예컨대, 화학치료 제제)과 병용하여 투여될 수 있으며 또는 그 외 예방적 또는 치료적 비-약리학적 방법들 (예컨대, 국소 방사선 요법 또는 전신 방사선 요법)이 유전자 변형된 T 세포와의 병용 요법에서 사용될 수 있다. 예로서, 본 출원은 방사선 단계가 본 명세서에 기재된 하나 이상의 추가 치료 (예컨대, CAR-T T 세포 요법 및, 선택적으로, IL-10 제제의 투여) 또는 제제들을 이용한 치료에 선행되거나 이러한 치료에 후속하여 수반되는 치료법(regimen)을 고려한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 추가로 골수 이식, 말초 혈액 줄기 세포 이식, 또는 그 외 유형의 이식 요법과 병용하여 CAR-T T 세포 요법 및 IL-10 제제 (예컨대, PEG-IL-10)를 사용하는 것을 고려한다.
본 명세서에서 사용되는 "병용 요법"은 별도로 투여되거나 도입될 수 있는, 예를 들면, 별도 투여를 위해 별도로 제제화될 수 있는 (예컨대, 키트로 제공될 수 있는 경우) 치료법, 및 함께 투여되거나 도입될 수 있는 치료법을 포함하는 의미이다. 특정 구체예들에서, 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포), 및/또는 그 외 제제(들)은 순차적으로 투여되거나 적용되는데, 예컨대, 하나의 제제는 하나 이상의 다른 제제들 이전에 투여된다. 그 외 구체예들에서, 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포) 및 그 외 제제(들)은 동시에 투여되는데, 예컨대, 둘 또는 그 이상의 제제들은 동시에 또는 대략 동시에 투여되고; 둘 또는 그 이상의 제제들은 둘 또는 그 이상의 별도의 제제들로 제공되거나 단일 제제 (즉, 공동-제제)로 조합될 수 있다. 제제들이 순차적으로 또는 동시에 투여되는지 여부와 관계없이, 이들은 본 출원의 목적을 위해 병용 투여될 수 있는 것으로 고려된다.
본 출원의 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포)는 최소한 하나의 그 외 활성 제제와 병용하여 일정 환경하에서 적절한 임의의 방식으로 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 선택적으로 IL-10 제제 및/또는 그 외 제제(들)과 함께 상기 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포)를 이용한 치료가 일정 시기에 걸쳐 유지된다. 또 다른 구체예에서, 최소한 하나의 그 외 제제(들)을 이용한 치료는 감소되거나 중단되는 반면 (예컨대, 대상체가 안정한 경우), 선택적으로 IL-10 제제 (예컨대, PEG-IL-10)와 함께 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포)를 이용한 치료는 일정한 투여법으로 유지된다. 한 추가 구체예에서, 그 외 제제(들)을 이용한 치료는 감소되거나 중단되는 반면 (예컨대, 대상체가 안정한 경우), 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포), 및 선택적으로 IL-10 제제를 이용한 치료는 감소된다 (예컨대, 보다 낮은 용량, 보다 적은 빈도의 투약 또는 보다 짧은 치료법). 또한 또 다른 구체예에서, 그 외 제제(들)을 이용한 치료는 감소되거나 중단되며 (예컨대, 대상체가 안정한 경우), 선택적으로 IL-10 제제와 함께 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포)를 이용한 치료는 증가된다 (예컨대, 보다 높은 용량, 보다 많은 빈도의 투약 또는 보다 긴 치료법). 또한 또 다른 구체예에서, 그 외 제제(들)을 이용한 치료는 유지되며 (예컨대, 대상체가 안정한 경우), 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포), 및 선택적으로 IL-10 제제를 이용한 치료는 감소 또는 중단된다 (예컨대, 보다 낮은 용량, 보다 적은 빈도의 투약 또는 보다 짧은 치료법). 또한 또 다른 구체예에서, 그 외 제제(들)을 이용한 치료 및 본 출원의 IL-10 제제 (예컨대, PEG-IL-10)를 이용한 치료는 감소되거나 중단되며 (예컨대, 보다 낮은 용량, 보다 적은 빈도의 투약 또는 보다 짧은 치료법), 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포)를 이용한 치료는 유지된다.
본 명세서에 기재된 유전자 변형된 T 세포 요법 (가령, CAR-T T 세포 요법)와 함께, 본 출원은 증식성 병태, 암, 종양, 또는 전암성 질병, 장애 또는 병태의 항원에 특이적인 TCR을 가지는 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포), 및 선택적으로 IL-10 제제 (예컨대, PEG-IL-10), 그리고 선택적으로, 원하는 활성을 보이는 최소한 하나의 추가 치료 또는 예방적 제제(들) 또는 진단 제제를 이용하여 증식성 병태, 암, 종양 또는 전암성 질병, 장애 또는 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 출원의 일부 구체예들은 전통적인 화학치료 제제들 (예컨대, 알킬화 제제, 질소 머스터드, 니트로소우레아, 항생제, 항-대사물질, 엽산 유사체, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 항호르몬 제제 및 탁소이드)의 사용을 고려한다. 본 출원의 그 외 구체예들은 종양 성장의 추가적 또는 상승작용적 억제를 구현하기 위한 신호 형질도입 억제제 (예컨대, 글리벡 또는 헤르셉틴) 또는 면역조절제와 함께 본 명세서에 기재된 IL-10 제제의 투여를 포함하는 종양 억제 또는 종양 성장 방법을 고려한다.
본 명세서에 기재된 CAR-T T 세포 요법과 같은 유전자 변형된 T 세포 요법 (가령, CAR-T T 세포 요법)과 함께, 본 출원은 또한 바이러스를 감염시키는 항원에 특이적인 TCR을 가지는 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포)를 투여함으로써 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 치료는 IL-10 제제 (예컨대, PEG-IL-10), 및/또는 항바이러스 제제의 투여를 포함할 수 있다.
제약학적 조성물
치료 제제, 가령, 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포) 또는 IL-10 제제가 대상체에 투여되는 경우, 본 출원은 대상체에 투여하기에 적합한 임의의 조성물 형태의 사용을 고려한다. 일반적으로, 이러한 조성물들은 치료 제제 (예컨대, 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포) 또는 IL-10) 및 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 또는 생리학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 “제약학적 조성물”이다. 이러한 제약학적 조성물들은 본 출원의 방법들에서 사용될 수 있다; 그러므로, 예를 들면, 제약학적 조성물들은 본 명세서에 기재된 치료 및 예방적 방법들 그리고 용도들을 실시하기 위하여 대상체에 생체외 또는 생체내 투여될 수 있다.
본 출원의 제약학적 조성물은 의도한 투여 방법 또는 투여 경로에 적합하도록 제제화될 수 있다; 예시적인 투여 경로들이 본 명세서에 제시되어 있다. 더욱이, 제약학적 조성물들은 본 출원에서 고려되는 질병, 장애 및 병태를 치료 또는 예방하기 위하여 본 명세서에 기재된 그 외 치료적 활성 제제들, 또는 화합물들과 병용하여 사용될 수 있다.
제약학적 조성물들은 전형적으로 본 출원에서 고려되는 치료적 유효량의 치료 제제 (예컨대, 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포) 또는 IL-10 제제) 및 하나 이상의 제약학적으로 그리고 생리학적으로 허용가능한 제형 제제들을 포함한다. 적합한 제약학적으로 허용가능한 또는 생리학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제에는, 항산화제 (예컨대, 아스코르브산 및 소듐 바이설페이트), 보존제 (예컨대, 벤질 알콜, 메틸 파라벤, 에틸 또는 n-프로필, p-하이드록시벤조에이트), 유화제, 현탁제, 분산제, 용매, 충전제, 벌크화제, 세제, 완충액, 운반체, 희석제, 및/또는 보강제가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 적합한 운반체는 가능하게는 비경구 투여를 위한 제약학적 조성물들에 통상적인 그 외 물질들로 보충된, 생리학적 식염수 용액 또는 시트레이트 완충 식염수일 수 있다. 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수는 추가적인 예시 운반체이다. 해당 기술 분야의 숙련된 기술자들은 본 명세서에서 고려되는 제약학적 조성물 및 투약 형태들에서 사용될 수 있는 다양한 완충액을 용이하게 알고 있을 것이다. 전형적인 완충액에는, 제약학적으로 허용가능한 약산, 약염기, 또는 이의 혼합물이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 한 예로서, 완충 성분들은 수용성 물질, 가령, 인산, 타르타르산, 락트산, 숙신산, 시트르산, 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 글루탐산, 및 이의 염이 될 수 있다. 허용가능한 완충제들에는, 예를 들면, 트리스 완충액, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에테인설포닉 애시드) (HEPES), 2-(N-모르폴리노)에테인설포닉 애시드 (MES), 2-(N-모르폴리노)에테인설포닉 애시드 소듐 염 (MES), 3-(N-모르폴리노)프로페인설포닉 애시드 (MOPS), 및 N-트리스[하이드록시메틸]메틸-3-아미노프로페인설포닉 애시드 (TAPS)가 포함된다.
제약학적 조성물을 제제화 한 후, 이를 무균 용기, 가령, 바이얼 또는 주사기에 보관할 수 있다. 일부 구체예들에서, 그리고 적절한 경우, 제약학적 조성물은 1회용 용기 (예컨대, 1회용 바이얼, 앰플, 주사기, 또는 자동주사장치 (예컨대, EpiPen®와 유사))로 제공되는 반면, 그 외 구체예들에서는 다회용 용기 (예컨대, 다회용 바이얼)가 제공된다. IL-10 제제들에 있어서, 이식물 (예컨대, 이식가능한 펌프) 및 카테터 시스템들, 저속 주사 펌프 및 장치를 비롯한 임의의 약물 전달 장치가 IL-10을 전달하기 위해 사용될 수 있으며, 이들 모두는 숙련된 기술자들에게 널리 공지되어 있다. 정의된 시기에 걸쳐 본 출원에 개시된 폴리펩티드들을 방출하기 위하여 일반적으로 피하 또는 근육내 투여되는 데포 주사 (Depot injections)가 또한 사용될 수 있다. 데포 주사는 통상적으로 고체- 또는 오일-계이며 일반적으로 본 명세서에 제시된 제형화 성분들 중 최소한 하나를 포함한다. 해당 기술 분야의 통상의 기술자는 가능한 데포 주사의 제형들 및 용도를 알고 있다.
제약학적 조성물들은 주사가능한 무균 수성 또는 유성(oleagenous) 현탁액의 형태일 수 있다. (이러한 현탁액은 본 명세서에서 언급된 적합한 분산화제 또는 습윤화제 및 현탁제를 사용하여 공지 기술에 따라 제제화될 수 있다. 주사가능한 무균 제재는 또한, 예를 들면, 1,3-부탄 다이올 중의 용액과 같은, 비-독성인 비경구적으로-허용가능한 희석제 또는 용매 중의 주사가능한 무균 용액 또는 현탁액이 될 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 희석제, 용매 및 분산 매질에는 물, 링거 용액, 등장성 염화 나트륨 용액, 크레모포어 EL™(BASF, Parsippany, NJ) 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS), 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 이의 적합한 혼합물이 포함된다. 또한, 용매 또는 현탁 매질로서 무균성 고정유가 통상적으로 사용된다. 이러한 목적으로 합성 모노- 또는 다이글리세라이드를 비롯한 임의의 무자극성 고정유가 사용될 수 있다. 더욱이, 지방산, 가령, 올레산의 용도는 주사 제재에서 발견된다. 특정한 주사가능 제제들의 장기적(Prolonged) 흡수는 흡수를 지연시키는 제제 (예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴)를 포함시킴으로써 구현될 수 있다.
제제들은 또한 조절 방출 제형과 같이, 신속한 분해 또는 신체로부터의 제거에 대해 조성물을 보호하기 위한 담체를 포함할 수 있으며, 담체에는 이식물, 리포좀, 하이드로겔, 전구약물 및 미세캡슐화된 전달 시스템들이 포함된다.
키트
본 출원은 또한, 선택적으로 IL-10 제제 (예컨대, PEG-IL-10)와 함께, 표적 질병의 항원에 특이적인 TCR을 가지는 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포), 및 이의 제약학적 조성물들을 포함하는 키트를 고려한다. 이러한 키트들은 일반적으로 하기 기재된 다양한 요소들을 수용하는 물리적 구조물의 형태이며, 예를 들면, 상기 설명한 방법들을 실시함에 이용될 수 있다.
키트는 본 명세서에 개시된 유전자 변형된 T 세포의 생성에 사용하기 위한, 원하는 질병 항원-특이적 TCR을 인코딩하는 유전자 변형된 T 세포 (예컨대, CAR-T T 세포), 및/또는 작제물(들) (예컨대, 무균 용기에 제공됨)을 포함할 수 있으며, 이는 대상체에 투여하기 적합한 제약학적 조성물의 형태가 될 수 있다. 제공되는 경우, IL-10 제제는 사용준비된 형태 또는, 예를 들면,투여에 앞서 재구성 또는 희석을 필요로 하는 형태로 제공될 수 있다. IL-10 제제가 사용자에 의한 재구성을 필요로 하는 형태인 경우, 키트는 또한 IL-10 제제와 함께 또는 이와 별도로 포장된 완충액, 제약학적으로 허용가능한 부형제, 등을 포함할 수 있다. 키트는 또한 사용될 특이적 CAR-T T 세포 요법의 IL-10 제제 및/또는 성분들 모두를 내포할 수 있으며; 키트는 여러 제제들을 별도로 내포할 수 있고 또는 이러한 제제들은 키트안에 이미 조합되어 있을 수 있다. 본 출원의 키트는 내부에 수용되는 성분들을 적절하게 유지시키는데 필요한 상태에 대해 설계될 수 있다 (예컨대, 냉장 또는 냉동).
키트는 내부의 성분들에 관한 정보 및 이들의 사용에 관한 지시사항 (예컨대, 투약 파라미터, 작용 메커니즘(들), 약동학 및 약물역학, 유해 효과, 금기사항, 등을 비롯한 활성 성분(들)의 임상 약리학)을 확인하는 것 포함하는 라벨 또는 포장용 삽입물을 내포할 수 있다. 키트의 각 성분을 개개의 용기에 넣을 수 있으며, 모든 다양한 용기들을 단일 패키지에 존재할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체 정보, 가령, 로스 번호 및 유통 기한을 포함할 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은, 예컨대, 요소들을 수용하는 물리적 구조물 안에 넣거나, 물리적 구조물 안에 별도로 포함시키거나, 또는 키트의 한 요소 (예컨대, 앰플, 주사기 또는 바이얼)에 고정될 수 있다.
라벨 또는 삽입물들은 추가적으로 컴퓨터 판독가능한 매체, 가령, 디스크 (예컨대, 하드 디스크, 카드, 기억 디스크), 광학 디스크, 가령, CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, 자성 테이프, 또는 전기 저장 매체, 가령, RAM 및 ROM 또는 이들의 하이브리드, 가령, 자성/광학 저장 매체, FLASH 매체 또는 메모리형 카드를 포함하거나 이들 내부에 포함될 수 있다. 일부 구체예들에서, 실제 지시사항들은 키트에 제공되어 있지 않지만, 원격 출처로부터, 예컨대, 인터넷 사이트를 통해 지시사항을 얻는 수단이 제공된다.
실시예
다음의 실시예들은 본 발명을 제조하는 방법 및 사용하는 방법에 관한 완전한 개시 및 설명을 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 제공하기 위해 제시되며, 발명자들이 자신의 발명이라고 간주하는 것의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니며 또한 다음의 실험들이 실시되었음을 그리고 실시될 수 있는 모든 실험들임을 나타고자 하는 것도 아니다. 현재 시제로 기재된 실시예 기재들은 반드시 실시되었다기 보다는, 그 기재내용이 본 명세서에 기재된 데이터 등을 생성하기 위해 실시될 수 있다는 것으로 이해하여야 한다. 사용되는 값들 (예컨대, 양, 온도, 등)에 관하여 정확도를 보장하기 위하여 노력을 하였으나, 일부 실험 오차 및 편차를 고려하여야 한다.
달리 언급이 없는 한, 부분은 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 그리고 압력은 대기압 또는 대기압 근방이다. 다음을 포함하는 표준 약어들이 사용된다: s 또는 sec = 초(들); min = 분(들); h 또는 hr = 시간(들); aa = 아미노산(들); bp = 염기쌍(들); kb = 킬로베이스(들); nt = 뉴클레오티드(들); ng = 나노그램; μg = 마이크로그램; mg = 밀리그램; g = 그램; kg = 킬로그램; dl 또는 dL = 데시리터; μl 또는 μL = 마이크로리터; ml 또는 mL = 밀리리터; l 또는 L = 리터; nM = 나노몰; μM = 마이크로몰; mM = 밀리몰; M = 몰; kDa = 킬로달톤; i.m. = 근육내(로); i.p. = 복강내(로); SC 또는 SQ = 피하(로); HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피; BW = 체중; U = 유닛; ns = 통계적으로 유의하지 않음; PMA = 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트; PBS = 포스페이트-완충 식염수; DMEM = 둘베코사 이글 변형 배지; PBMCs = 1차 말초 혈액 단핵 세포; FBS = 우태 혈청; FCS = 우아 혈청; HEPES = 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에테인설포닉 애시드; LPS = 지질다당질; RPMI = Roswell Park Memorial Institute 배지; APC = 항원 제시 세포; FACS = 형광-활성화 세포 분류.
재료 및 방법.
하기 일반 재료들과 방법들이 사용되었으며, 지시에 따라 하기 실시예들에서 사용될 수 있다:
분자 생물학 절차. 분자 생물학에서의 표준 방법들이 과학 문헌에 기재되어 있다 (예컨대, Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; 및 Ausubel, 외. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley 및 Sons, Inc. New York, N.Y. 참조, 이 문헌은 세균 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이유발 (1권), 포유동물 세포 및 효모에서의 클로닝 (2권), 당접합체들 및 단백질 발현 (3권), 및 생물정보학 (4권)을 기술하고 있다).
다클론 및 단클론 항체의 생성, 정제 및 단편화가 기재되어 있으며 (예컨대, Harlow 및 Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY); 리간드/수용체 상호작용들을 특성화하기 위한 표준 기법들을 찾을 수 있고 (예컨대, Coligan 외. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., NY 참조); 형광-활성화 세포 분류 (FACS)를 비롯한 유세포측정법을 찾을 수 있고 (예컨대, Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ 참조); 그리고, 예컨대, 진단 시약으로 사용하기 위하여 핵산 프라이머를 비롯한 핵산들을 변형시키기에 적합한 형광 시약들 및 탐색자, 폴리펩티드, 및 항체를 찾을 수 있다 (Molecular Probes (2003) 카탈로그, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.; Sigma-Aldrich (2003) 카탈로그, St. Louis, MO.). 항체에 관한 추가 논의는 본 명세서의 다른 부분에서 제공된다.
소프트웨어. 예컨대, 항원성 단편들, 리더 서열, 단백질 폴딩, 기능적 도메인, 당화 부위, 및 서열 정렬을 결정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스를 사용할 수 있다 (예컨대, GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); 및 DeCypher™(TimeLogic Corp., Crystal Bay, NV) 참조).
페길화. 본 명세서에 기재된 페길화 IL-10은 숙련된 기술자에게 공지된 임의의 수단에 의해 합성될 수 있다. 모노-PEG-IL-10 및 모노-/다이-PEG-IL-10 혼합물을 제조하기 위한 예시적 합성 도식들은 이미 설명되어 있다 (예컨대, 미국 특허 제 7,052,686; 미국 공개 특허출원 제 2011/0250163; WO 2010/077853 참조). 본 출원의 특정 구체예들은 선택적으로 페길화 모노- 및 다이-PEG-IL-10의 혼합물을 포함한다. 본 출원의 실시에 적합한 PEG들의 생성 및 사용 (및 그 외 약물 전달 기술들)에 있어서 숙련된 기술자가 자신의 기술을 이용하는 것 이외에도, 숙련된 기술자는 PEG-관련 기술의 많은 시판 공급업체들 (예컨대, NOF America Corp사 (Irvine, CA) 및 Parchem사 (New Rochelle, NY))을 알고 있을 것이다.
동물. 숙련된 기술자에게 공지된 다양한 마우스 및 그 외 동물 균주들이 본 출원의 개시내용과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들면, ME, Bar Harbor의 The Jackson Lab.사로부터 면역적격 Balb/C 또는 B-세포 -결핍 Balb/C 마우스를 얻어 표준 절차에 따라 사용될 수 있다 (예컨대, Martin 외 (2001) Infect. Immun., 69(11):7067-73 및 Compton 외. (2004) Comp. Med. 54(6):681-89 참조).
IL-10 농도. 혈청 IL-10 농도 수준 및 노출 수준은 해당 기술 분야에서 사용되는 표준 방법들에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 실험 대상체가 마우스인 경우, 마우스 꼬리를 가위질하여 전 혈액 (~50 mL/마우스)을 일반 모세 시험관에 수집하고, 혈청 및 혈액 세포를 원심분리하여 분리하고, 표준 ELISA 키트 및 기법들로 IL-10 노출 수준들을 결정함으로써 혈청 노출 수준 분석을 실시할 수 있다.
FACS 분석. FACS 분석을 위한 수많은 프로토콜, 재료 및 시약들을 상업적으로 구입할 수 있으며 본 명세서에 개시된 내용과 관련하여 사용할 수 있다 (예컨대, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ; Cell Signaling Technologies, Danford, MA; Abcam, Cambridge, MA; Affymetrix, Santa Clara, CA). 직접 유세포측정 (즉, 접합된 1차 항체 사용) 및 간접 유세포측정 (즉, 1차 항체 및 접합된 2차 항체 사용) 모두가 사용될 수 있다. 예시적인 직접 유세포측정 프로토콜은 다음과 같다: 수집한 세포들을 세정하고 세포 현탁액을 냉온 PBS, 10% FCS, 1% 소듐 아지드에서 1-5 x 106 세포/mL 농도로 조절한다. 세포들을 폴리스타이렌 둥근 바닥 12 x 75 mm2 Falcon 시험관들에서 염색할 수 있다. 세포들을 충분히 원심분리하여 세포를 거의 손실시키지 않고 상청액을 제거할 수 있으나, 세포들을 재현탁시키기 어려운 정도는 아니다. 1차 표지된 항체가 추가될 수 있으며 (0.1-10 μg/mL), 필요에 따라 3% BSA/PBS에서 희석이 이루어질 수 있다. 4°C에서 최소한 30 min 동안 배양 후, 세포들을 5 min 동안 400 g에서 원심분리하여 3x 세정한 후 0.5 - 1 mL의 냉온 PBS, 10% FCS, 1% 소듐 아지드에서 재현탁시킬 수 있다. 세포들을 분석시까지 (바람직하게는 동일한 날 이내) 얼음위 암실에 보관할 수 있다. 또한 세포들을 수 일 동안 보존시키기 위하여 표준 방법들을 사용하여 고정시킬 수 있으며; 상이한 항원들에 대한 고정은 항원-특이적 최적화를 필요로 할 수 있다.
하기 설명하는 분석법들은 대표적인 것이며 다른 분석법을 배제하고자 하는 것은 아니다.
재조합 쥐과 IL-10 (rMuIL-10), 페길화-rMuIL-10 (PEG-rMuIL-10), 페길화 rHuIL-10 (PEG-rHuIL-10). 하기 실시예들에서 사용되는 페길화 IL-10은 특허 문헌 (예컨대, US 8,691,205)에 기재된 바와 같은 모노-/다이-PEG-IL-10 혼합물이었다. 모노/다이-PEG-IL-10 혼합물을 제조하기 위한 합성 도식들의 두 가지 예들을 하기 제공한다:
페길화 IL-10 합성 도식 1번. IL-10 (예컨대, 쥐과 또는 인간)을 pH 범위 5-7.4의 50 mM 소듐 포스페이트, 100 mM 소듐 클로라이드에 대해 투석한다. 1:1-1:7 몰비의 5kDa PEG-프로필알데하이드를 0.75-30 mM 소듐 사이아노보로하이드라이드의 존재하에서 1-12 mg/mL 농도의 IL-10과 반응시킨다. 대안적으로 반응은 유사한 방식으로 피콜린 보레인을 사용하여 활성화될 수 있다. 반응을 5-30˚C에서 3-24 시간 동안 배양한다. 페길화 반응의 pH를 6.3으로 조절하고, 7.5 mg/mL의 hIL-10을 PEG와 반응시켜 IL-10 대 PEG 링커의 비율을 1:3.5로 만든다. 사이아노보로하이드라이드의 최종 농도는 ~25 mM이며, 반응을 15˚C에서 12-15 시간 동안 수행한다. 모노- 및 다이-PEG IL-10이 가장 대부분의 반응 생성물이며, 반응 종결시 각각의 농도는 ~50%이다. 아미노산, 가령, 글리신 또는 리신 또는, 대안적으로, 트리스 완충액을 사용하여 반응을 퀀칭할 수 있다. 다수의 정제 방법들, 가령, 겔 여과, 음이온 및 양이온 교환 크로마토그래피, 및 크기 배제 HPLC (SE-HPLC)를 사용하여 원하는 페길화 IL-10 분자를 분리할 수 있다.
페길화 IL-10 합성 도식 2번. IL-10 (예컨대, 쥐과 또는 인간)을 pH 7.0의 10 mM 소듐 포스페이트, 100 mM NaCl에 대해 투석한다. 투석시킨 IL-10을 투석 완충액을 사용하여 약 0.5 내지 12 mg/mL 농도로 3.2배 희석한다. 링커를 추가하기 전에, SC-PEG-12 kDa (Delmar Scientific Laboratories, Maywood, Ill.) 및 pH 9.1의 100 mM Na-테트라보레이트 1 부피를 희석시킨 IL-10 9 부피에 추가하여 IL-10 용액의 pH를 8.6으로 올린다. SC-PEG-12K 링커를 투석 완충액에 용해시키고 적절한 부피의 링커 용액 (IL-10 1 몰당 1.8 내지 3.6 몰 링커)을 희석시킨 IL-10 용액에 추가하여 페길화 반응이 개시되게 한다. 속도를 제어하기 위하여 5˚C에서 반응을 실시하며, 반응 용액을 부드럽게 교반한다. 크기 배제 HPLC (SE-HPLC)로 결정하여 40%에 가까운 모노-PEG-IL-10이 산출될 때, 1M 글리신 용액을 30 mM의 최종 농도까지 추가함으로써 반응을 중단시킨다. 반응 용액의 pH를 HCl 용액을 사용하여 서서히 7.0으로 조절하고, 반응물을 0.2 마이크론 여과시키고 -80˚C에서 보관한다. 10 mM HEPES, pH 6.5, 0.05% MSA를 함유하는 100 mM NaCl 중에서 0.75-1.0 mg/mL의 PEG-IL-10이 제제화되었다.
본 명세서에서 사용되는 모노- 및 다이-페길화-rHuIL-10의 혼합물은 AM0010로 지칭될 수 있으며, 5kDa PEG 및 PPA 링커를 사용하여 합성되었고, 상기 도식 1에 제시된 바에 따라 합성될 수 있다.
쥐과 CD8+ T 세포의 분리 및 IL-10 치료: OT1 마우스 (C56Bl/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)로부터 쥐과 CD8+ T 세포를 자성 단리하였으며 (Miltenyi, Auburn, CA) 7-10 일 동안 100-1000 IU/mL rMuIL-2, (R&D Systems, Minneapolis, MN)에서 배양하였다. OT1 T 세포들을 1 μg/mL LPS, (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)로 활성화된 자가 골수 세포를 이용하여 3 일 동안 재-자극하고 SIINFEKL (서열 번호: 35) 펩티드 (InvivoGen, San Diego, CA)를 사용하여 외인성 펄스처리하였다. 재자극 후 3일에, 세포들을 지정된 농도의 rMuIL-10에 5 일 동안 노출시켰다. 그 후 세포들을 세정하고 SIINFEKL 펩티드 펄스처리된 PDV6 세포에 노출시켰다 (Merck Research Labs, Palo Alto, CA). 제조업체의 지시사항에 따라 CellTiter Glo (Promega, Madison, WI)에서 세포 용해 백분율을 결정하였다.
인간 CD8+ T 세포의 분리 및 IL-10 치료: 인간 CD8+ T 세포들을 정상의, “건강한” 인간 흑색종 종양 생검들로부터 자성 분리하였다 (Miltenyi). 종양 세포들을 6-웰 플레이트 (Nunclon, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 배양시키고 T 세포들을 별도로 24-웰 플레이트 (Nunclon)에서 배양시켰다. CD8+ T 세포들을 100-1000 IU/mL IL-2 (Chiron, Emeryville, CA)를 보충시킨 완전 RPMI, (Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Logan, UT)에서 배양시키고 5-7일 마다 재공급하였다. 항원 제시 세포로 작용하는 TT 세포 (ATCC CRL-1803, Manassas, Vα)에 외부적으로 추가되었던 열-용해된 종양 세포 항원들을 이용하여 10-12 일 마다 T 세포들을 재자극하였다. 재자극 후 3일에, CD8+ T 세포들을 세정하고 지정된 농도의 rHuIL-10에 5 일 동안 노출시켰다. 세포들을 세정하여 지정된 표적에 대한 효과기에 있는 표지된 동족 종양 세포 Cr51 (Perkin Elmer, Waltham, MA), A375 종양 세포 (ATCC CRL-1619, Manassas, Vα) 또는 K562 세포 (ATCC CCL-243)에 추가하였으며, 표준 4-시간 크롬 방출 분석법을 실시하였다.
ELISPOT: 언급된 바와 같이 PEG-rMuIL-10 (Merck Research Labs)로 투약 후 CT26, (ATCC CRL-2638) 종양 보유 마우스로부터 자성 비드 분리 (Miltenyi)하여 쥐과 CD8+ T 세포를 분리하였다. 세포들을 세정하고 ELISPOT (R&D systems, Minneapolis, MN) 1회 당 1000 - 5000개의 세포를 3회 도말하였다. 10 ng/mL IFNγ(R&D systems, Minneapolis, MN)에 1시간 동안 예비-노출시킨 1 μg/mL 항-CD3 (eBioscience, San Diego, CA), 100 - 500 CT26, 또는 100 - 500 4T1 (ATCC CRL-2539)을 제외하고 웰에는 아무것도 포함되어 있지 않았다. 플레이트들을 37℃ 5% CO2로 24 동안 배양하고 제조업체의 지시사항에 따라 전개시켰다. 플레이트 이미지들을 CTL (Shaker Heights, OH) Immunospot 분석장치를 사용하여 캡쳐하고, 스팟들을 Immunospot ELISPOT 분석 소프트웨어를 사용하여 정량하였다.
qPCR: 제조업체의 지시사항에 따라 Qiagen's RNeasy 키트 및 RT2 First Strand 키트를 각각 사용하여 RNA를 추출하고 단리된 CD8+ T 세포로부터 cDNA를 합성한다. 제조업체의 프로토콜에 따라 RT² SYBR Green qPCR Mastermix 및 Qiagen사의 프라이머를 사용하여 cDNA 주형에 대한 정량적 PCR을 실시한다. Ct 값들을 하우스키핑 유전자들, GUSB 및 GAPDH의 평균 Ct 값에 대해 정규화한다.
CT26 종양 모델: 4-내지-6 주령의 암컷 C57BL/6J 마우스 (Jackson Laboratory)들에게 동물의 오른쪽 옆구리 하부에 100 μL 부피의 1 x 105 CT26 세포 (CRL-2638; ATCC)를 피하 이식하였다. 촉진이 가능할 때, 종양들의 성장을 주 2회 측정하였다. 공식 (너비2 x 길이/2)을 사용하여 종양 부피를 계산하였으며, 이 공식에서 길이는 보다 긴 치수이다. 종양들이 75 mm3 평균 부피에 도달하였을 때, 동물들을 계층화시켰다. 5개의 마우스/코호트에 운반체 또는 페길화 재조합 IL-10 (Schering-Plough, Palo Alto, CA)을, 매일 28일 동안 피하 투여하였다. 투약 28일 후, 각 그룹의 마우스들을 조직 및 종양 분석을 위해 희생시켰다.
4T1 종양 모델: 4-내지-6 주령의 암컷 BALB/c 마우스 (Jackson Laboratory)들에게 동물의 오른쪽 옆구리 하부에 100 μL 부피의 1 x 104 4T1 세포 (CRL-2539; ATCC)를 피하 이식하였다. 촉진이 가능할 때, 종양들의 성장을 주 2회 측정하였다. 공식 (너비2 x 길이/2)을 사용하여 종양 부피를 계산하였으며, 이 공식에서 길이는 보다 긴 치수이다. 종양들이 75 mm3 평균 부피에 도달하였을 때, 동물들을 계층화시켰다. 5개의 마우스/코호트에 운반체 또는 페길화 재조합 IL-10 (ARMO Biosciences, Redwood City, CA)을, 매일 28일 동안 피하 투여하였다. 투약 28일 후, 각 그룹의 마우스들을 조직 및 종양 분석을 위해 희생시켰다.
종양 침윤 림프구의 단리: 종양 침윤 림프구 (TILs)를 단리하기 위하여, 종양을 5 mL의 분해 완충액 (RPMI (Life Technologies), 10% 우태 혈청 (Hyclone Thermo Fisher Scientific), 10 mM HEPES (Life Technologies), 2 mg/mL 제I형 콜라겐분해효소 (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ), 30 U/mL DNaseI (Worthington Biochemical)와 함께 갈고, 분해 완충액으로 35 mL의 최종 부피가 되게 하였다. 종양 슬러리를 37°C에서 45 분 동안 회전시켰다. 이후 종양 슬러리를 70 마이크론의 세포 여과장치에 통과시킴으로써 종양 슬러리를 기계적으로 파쇄하였다. 세포들을 RPMI로 2회 세정한 다음 25 mL의 HBSS (Life Technologies)로 재현탁시켰다. 세포 현탁액들을 15 mL Histopaque (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)와 함께 기저에 깔고 브레이크를 끈 상태로 1000 rpm에서 30 분 동안 실온에서 원심분리하였다. 원심분리 후, TIL들을 내포하는 세포 경계면들을 수집하고 완전 RPMI로 2회 세정하였다. 이후 제조업체의 프로토콜에 따라 CD8+ T 세포들을 MACS 세포 분리 기술 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 CD8+ T 세포들을 단리하였다. 항체 염색 및 유세포분석에 앞서 단리된 CD8+ T 세포들을 1mL 세포 당 1 μg/mL 항-CD3 및 1 μL GolgiPlug (BD Biosciences, San Jose, CA)로 10 시간 동안 처리하였다.
활성화 유도 세포 사멸 분석: 다음과 같은 프로토콜을 사용하여 예시적인 활성화 유도 세포 사멸 분석을 실시할 수 있다. 인간 1차 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)들을 표준 프로토콜에 따라 단리하였다 (예컨대, Fuss 외. (2009) Current Protocols in Immunology, Unit 7.1, John Wiley, Inc., NY 참조). CD45RO+ CD8 T 세포들을 제조업체의 프로토콜에 따라 Miltenyi Biotec사의 항-CD45RO MACS 비드 및 MACS 세포 분리 기술을 사용하여 분리하였다 (Miltenyi Biotec). CD45RO는 기억 T 세포의 표지자이다. 세포를 활성화시키기 위하여, 1 mL의 단리된 세포 (3x106 세포/mL의 밀도)를 AIM V 배지에서 3 일 동안 (Life Technologies), 항-CD3 및 항-CD28 항체 (Affymetrix eBioscience, San Diego, CA)로 예비-코팅시킨 표준 24-웰 플레이트 (BD; Franklin Lakes, NJ)에서 배양하였다. 24-웰 플레이트를 항-CD3 및 항-CD28 항체로 예비-코팅하기 위하여, 10 μg/mL 항-CD3 및 2 μg/mL 항-CD28 항체를 내포하는 300 μL의 카보네이트 완충액 (0.1 M NaHCO3 (Sigma-Aldrich), 0.5 M NaCl (Sigma-Aldrich), pH 8.3)을 각 웰에서 2 시간 동안 37°C에서 배양한 후 각 웰을 AIM V 배지로 세정하였다. 3-일 활성화 후, 세포들을 수집하고, 계수하고, 표준 24-웰 플레이트에서 1 mL의 AIM V 배지에 재도말하고 (2x106 세포/mL의 밀도) 100 ng/mL 인간 페길화 IL-10으로 3 일 동안 처리하였다. 다음으로, 상기 활성화 및 인간 페길화 IL-10 처리를 반복한 후, 제조업체의 절차 (Life Technologies)에 따라 생존가능한 세포들을 Trypan Blue 배제법으로 계수하거나 유세포 측정 분석을 위해 염색하였다.
유세포측정: 제조업체의 프로토콜에 따라 BD Cytofix/Cytoperm Plus 고정/막투과 키트 (BD Biosciences)를 사용하여 단리된 마우스 종양 침윤 CD8+ T 세포들을 항-마우스 IFNγ (BioLegend, San Diego, CA, USA), CD8 (BioLegend), 및 PD1 (BioLegend) 항체와 함께 염색하였다. 하기 실험에서 분석을 위해, “PD1+중” 세포는 일반적으로 유세포측정시 대략 3000의 평균 채널 형광 검출값을 생성하는 수준의 세포 표면 PD1을 발현시킬 수 있고, 낮은 PD1 발현 (“PD1+저”)은 대략 200의 평균 채널 형광 검출값으로 나타내어지며 “PD1+고” 발현은 대략 9000의 평균 채널 형광 검출값으로 나타내어진다.
PEG-rHuIL-10 치료 및 종양 반응의 평가. 인간 흑색종 환자들에게 PEG-rHuIL-10 (AM0010)을 매일 복부에 자가 주사하여 피하 치료하였다. 치료적 활성 용량 범위는 5 - 20 g/kg/일이다. 진행성 질병 (PD), 안정성 질병 (SD) 및 부분 반응들 (PR)을 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캔하여 평가하였다. 환자들을 1일차, AM0010 투여 전 및 투약 개시 후 6-7 주 간격으로 스캔하였다. 전신 CT 스캔을 사용하여 종양 위치 및 종양 크기의 변화를 평가하였다. 표적 병소들을 결정하고 각 스캔 시점에서 종양 덩어리의 최대 횡단면을 측정하였다. 영상의학과의사 및 치료 종양전문의 모두가 표적 평소들을 평가한다. 최대 횡단면 총 부피 (2차원으로 측정)가 한 스캔에서 다음 스캔으로 25% 이상 증가한 환자들은 진행성 질병 지정을 받았다. 최대 횡단면 총 부피 (2차원으로 측정)가 한 스캔에서 다음 스캔으로 25% 이상 증가하지도 않고 50% 이상으로 감소하지도 않은 환자들은 안정성 질병 지정을 받았다. 최대 횡단면 총 부피 (2차원으로 측정)가 한 스캔에서 다음 스캔으로 50% 이상 감소한 환자들은 부분 반응 질병 지정을 받았다.
실시예 1: 쥐과 CD8+ 세포의 IL-10 처리는 기능을 향상시킨다.
단리된 쥐과 CD8+ T 세포 기능에 대한 IL-10의 효과를 시험관내 평가하였다. 쥐과 CD8+ T 세포들을 단리하고 상기와 같이 재조합 쥐과 IL-10 (rMuIL-1)로 처리하거나 대조군은 rMuIL-10으로 처리하지 않았다. 세포독성 표지자들 그랜자임 A, 그랜자임 B, 퍼포린 및 사이토카인 IFNγ의 유전자 발현을 qPCR 분석하여 T 세포 활성화를 평가하였다. 상기와 같이 SIINFEKL (서열 번호:35)로 펄스처리된 PDV6 세포를 용해시키는, IL-10 처리된, SIINFEKL-프라이밍된 CD8+ T 세포의 능력으로 T 세포 세포독성을 평가하였다.
도 1, 패널 A에 도시된 바와 같이, 쥐과 IL-10으로 시험관내 자극받은 쥐과 CD8+ 세포는 세포독성 표지자들 그랜자임 A, 그랜자임 B, 퍼포린 및 사이토카인 IFNγ의 발현 향상을 보여주었다. 도 1, 패널 B에 도시된 바와 같이, 쥐과 OT1 CD8+T 세포의 처리는 SIINFEKL 펄스처리된 종양 세포 표적들에 대한 세포독성을 향상시킨다.
실시예 2: 종양 생검들로부터 단리된 인간 CD8+ 세포의 IL-10 처리는 기능을 향상시킨다
배양에서 확장된 흑색종 종양 환자의 생검들로부터 인간 CD8+ T 세포를 얻고, 열-용해된 종양 세포 항원들로 재자극시킨 다음, IL-10의 부재하에 또는 상기와 같은 지정된 농도의 재조합 인간 IL-10 (rHuIL-10) 존재하에 배양시켰다. 세포독성 표지자들 그랜자임 A, 그랜자임 B, 퍼포린 및 사이토카인 IFNγ의 유전자 발현을 qPCR 분석하여 T 세포 활성화를 평가하였다. 동족 흑색종 종양 세포, A375 세포 (인간 무색소성 흑색종 세포주), 또는 K562 세포 (인간 골수성 백혈병 세포주)를 용해시키는 능력을 평가함으로써 T 세포 세포독성을 평가하였다.
도 1, 패널 C에 도시된 바와 같이, 자극시킨 종양내 유래 인간 CD8+T 세포의 시험관내 rHuIL-10 처리는 그랜자임 A, B, 퍼포린 및 IFNγ의 발현을 향상시켰다. 또한, 도 1, 패널 D에 도시된 바와 같이, rHuIL-10 처리는 또한 동족 종양 세포 표적들의 세포독성을 향상시켰으며, 인간 CD8+ T 세포의 rHuIL-10 처리는 A375 세포 또는 K562 세포에 대한 세포독성을 두드러지게 증가시키지 않았는데, 이는 세포독성 증가가 항원-특이적임을 나타낸다.
실시예 3: 종양 보유 마우스의 연속 처리는 종양 항원 특이적 종양내 CD8+ T 세포들을 증가시킨다
CT26 종양 보유 마우스들을 매일 6, 10 또는 15 일 동안 1 mg/kg PEG-rMuIL-10으로 처리하거나, 대조군으로 운반체 처리하였으며 CD8+ 종양내 T 세포들을 단리하였다. PBMC 또는 기계적으로 파쇄되어 효소 분해된 CT26 (ATCC) 종양들로부터 1,000개의 CD8+ T 세포를 자성 (Miltenyi) 비드 단리하여 ELISPOTs (R&D systems)을 생성하였다. CD8+ T 세포들을 2차 자극 없이 (w/o), 1 mg/mL 가용성 항-CD3 (eBiosciences), 100 CT26 세포 (ATCC, 마우스 편평 종양) 또는 4T1 세포 (ATCC, 마우스 유방 종양) (음성 대조군) 종양 세포에 24 hrs 동안 노출시켰다. 스팟들을 Immunospot 소프트웨어로 정량하였다.
항-CD3에 노출될 때 IFNγ를 분비하였던 CD8+ T 세포들은 PEG-rMuIL-10 처리 그룹에서 증가된다 (도 2, 패널 A). 이는 PEG-rMuIL-10 처리가 TCR 결찰에 대한 CD8+ T 세포 반응들을 강력하게 함을 나타낸다. 유사하게, 동족 CT26 종양 세포에 노출될 때 IFNγ를 분비하였던 CD8+ T 세포 또한 시간에 따라 증가하며 (도 2, 패널 B), 그리하여 처리 15일차까지, 항-CD3과 TCR 결찰시 IFNγ를 분비하였던 세포들 모두는 또한 동족 종양 세포에 노출될 때도 IFNγ를 분비하였다 (도 2, 패널 C).
이러한 결과들은 PEG-rMuIL-10 처리에 의해 활성화되어 IFNγ를 분비할 수 있는 CD8+ T 세포들이 종양 항원들에 대해 특이적임을 나타낸다. 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포들이 시간에 따라 증가한다는 관찰결과는 PEG-rIL-10의 연속 처리에 의해 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포의 점진적 축적이 유발됨을 나타내며, 이 때 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포의 알파 베타 TCR 서열들은 고형 조직 종양들에 특이적인 새로운 CART TCR 작제물들을 나타낸다.
실시예 4: 연속 IL-10 처리는 CD8+ T 세포에서의 PD1 발현을 조절한다
실시예 3에 기재된 바와 같이 PD1 및 IFNγ 발현 수준에 대한 PEG-rMuIL-10의 15일 처리 효과를 평가하였다. PD1은 CD8+ T 세포 활성화의 표지자이다 (Agata, 외., Int Immunol, 1996. 8(5): p. 765-72). PD1의 발현은 또한 활성화 유도 세포 사멸 (Fang 외., Mol Vis, 2015. 21: p. 901-10) 및 T 세포 탈진 (Jiang 외., Cell Death Dis, 2015. 6: p. e1792)과 관련된다.
실시예 3에 기재된 PEG-rMuIL-10의 연속 처리는 활성화된 CD8+ T 세포 TIL들에서 PD1의 발현 수준을 변화시켰다. 마우스에서, PEG-rMuIL-10로 연속 처리는 CD8+ T 세포를 운반체 처리된 마우스에 비해 PD1+ 중-수준 발현 상태로 유지시키기 위해 PD1 발현을 하향 조절하였다. 운반체 처리된 마우스에서 PD1+-고 CD8+ T 세포 TIL들의 백분율은 51.6%였으며; PD1+-고 CD8+ T 세포 TIL들은 PEG-rMuIL-10으로 15일 동안 처리된 마우스에서 단지 9.78%였다. 대조적으로, PD1+-중 CD8+ T 세포의 백분율은 운반체 처리된 마우스에서 17.9%였으나, PEG-rMuIL-10로 15일 동안 처리된 마우스에서 31.2%로 증가하였다.
또한, 장기 치료 또한 PD1 양성인 IFNγ양성 CD8+ TILs의 비율을 변화시켰다. 도 2에 상기 도시된 바와 같이, IFNγ양성 CD8+ TIL들은 종양 내부의 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포를 나타낸다. 그러므로 이러한 IFNγ양성, PD1 양성 세포는 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포의 풀을 나타낸다. 도 3, 패널 A는 운반체 처리된 마우스로부터 얻은 TIL들의 풀 및 IFNγ양성인 PD1+/-, CD8+의 양을 보여준다. 운반체-처리된 마우스에서 PD1-, CD8+, IFNγ백분율은 약 2.41%인 반면, 15 일 동안 PEG-rMuIL-10 처리된 마우스에서 PD1+, CD8+, IFNγ백분율은 약 3.7%이다. 도 3, 패널 B는 PEG-rMuIL-10을 이용한 장기 처리가 이들 백분율을 각각 15.1% 및 12.8%로 변화시킴을 보여준다.
그러므로, 이들 데이터는 이러한 IFNγ양성, PD1 양성 세포가, 항원-특이적 TCR 서열들 (예컨대, 알파 및 베타 TCR 서열들)을 얻을 수 있었던 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포의 풀에 해당함을 나타낸다.
실시예 5: IL-10 요법에 의해 유도된 PD1+ CD8+ 말초 T 세포는 CD45RO+ T 세포 (기억 T 세포)이다
정상적인 건강한 공여자들의 PD1+ CD8+ 말초 T 세포를 추가로 분석하여 이들의 표현형을 평가하였다. 활성화-유도 세포 사멸 모델을 사용하여 이들 T 세포들을 평가하였으며, 이러한 T 세포들에서 말초 CD8+ T 세포는 다회 주기의 항-CD3/항-CD28 재자극에 노출되고, 활성화된 세포는 휴지 상태 동안 PEG-rHuIL-10 (AM0010) 또는 운반체 (대조군)에 노출된다. 이후 세포들을 T 기억 세포의 표지자인 PD1 및 CD45RO 모두의 표면 발현에 대해 분석하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 이러한 방식으로 IL-10을 이용한 CD8+T 세포 처리는 PD1+ 기억 CD8+ T 세포의 축적을 가져온다.
도 4의 패널 A 및 B는 2명의 상이한 공여자들로부터 얻은 말초 T 세포를 사용한 결과를 나타낸다. 패널 A는 정상적인, 건강한 공여자들로부터 얻은 말초 CD8+ T 세포의 분석 결과를 제공한다. CD8+ T 세포들을 단리하고, 3일 동안 활성화시키고, 3 일동안 AM0010에 노출시켰다. 3 일의 휴지 기간 후 세포들을 유세포측정으로 분석하여 PD1 및 CD45RO 세포 표면 발현을 결정하였다 (B의 마지막). 이후 이들 세포들을 3 일 동안 재자극한 다음 3일 동안 AM0010에 노출시켰다. 3 일의 휴지 기간 후 세포들을 유세포측정으로 분석하여 PD1 및 CD45RO 세포 표면 발현을 결정하였다 (D의 마지막). 다수회의 재자극 후, 이들 세포의 AM0010에 대한 노출은 더욱 생존가능한 PD1+ 세포를 생성하며, 이는 AM0010이 활성화 유도 세포 사멸을 예방함을 암시한다. 이들 세포들은 이들의 기억 표현형 (CD45RO+)으로 인해 항원 특이적이며, 이들은 이들의 PD1 발현 수준으로 인해 활성화된다. 자극 조건들이 유사하기 때문에, 동일한 세포들은 Chan 외 (J Interferon Cytokine (2015) 35(12): 948-955)에 기재된 IFNγ 양성 세포가 되기 쉽다.
이들 데이터는 IL-10 요법에 의해 유도되는 PD1+, CD8+ 말초 CD8+ T 세포가 이들 환자들에서 활성화된, 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포에 해당함을 나타낸다.
실시예 6: IL-10-처리된 환자들에서 말초 T 세포 확장의 평가
말초 PD1+ CD8+ T 세포에 대한 환자들의 IL-10 치료 효과를 평가하였다 (도 5). 흑색종 (Mel), 콩팥 세포 암종 (RCC), 또는 결장직장 암 (CRC)에 걸렸으며 상기와 같은 PEG-IL-10 (AM0010) 단일요법 또는 항-PD1 단클론 항체와 병용한 PEG-IL-10 (AM0010) 요법을 투여받았던 암 환자들로부터 PBMC들을 얻었다. PEG-IL-10 요법 개시 이전 얻은 말초 혈액 샘플들은 기준 샘플로 기능하였다. 도 5의 괄호안에 표시된 일차에 환자들로부터 샘플들을 얻었으며; 투여되는 PEG-IL-10 (AM0010)의 용량을 도 5의 X-축에 표시한다. 환자들을 진행성 질병 (PD), 안정성 질병 (SD), 또는 최소한 부분 반응 (PR)을 가지는 것으로 분류하였다. 테스트 샘플 및 기준 샘플 내 최소한 V베타 TCR 폴리펩티드들을 인코딩하는 핵산들을 시퀀싱하였으며, 테스트 샘플 내 최소한 V베타 TCR 폴리펩티드 서열들을 인코딩하는 핵산의 도수를 기준 샘플에서 동일한 V베타 TCR을 인코딩하는 핵산의 도수와 비교하였다 도수가 기준 샘플에 비해 테스트 샘플에서 증가하였던 경우, 이 서열은 “확장된" T 세포 클론으로 표현하여 분류되었다. 도수가 기준 샘플에 비해 테스트 샘플에서 감소하였던 경우, 이 서열은 “축소된" T 세포 클론으로 표현하여 분류되었다. “확장된” 클론들은 질병 항원-특이적 T 세포에 해당한다. 결과들을 도 5에 도시한다.
PEG-rHuIL-10 (AM0010) 치료된 환자에서 말초 T 세포의 확장을 평가하였다. 도 6은 10 μg/kg PEG-rHuIL-10 (AM0010)으로 매일 피하 치료된 (패널 A) 또는 20 μg/kg PEG-rHuIL-10 (AM0010)으로 매일 피하 치료된(패널 B)의 두 콩팥 세포 암종 환자들에서 말초 T 세포 클론들의 확장 대 축소에 관한 대표적인 분석을 제공한다. “패널 A” 환자는 진행성 질병 (RCC PD)을 나타냈던 반면, “패널 B”는 종양 질량의 93% 감소를 보였으므로, 최소한 부분 반응 (RCC PR)을 나타냈다. 첫 번째 용량의 PEG-rHuI 투여 전 1일차:-10 및 치료 29일차 모두에서 말초 T 세포들을 얻었다. 도 6의 검은색 원은 1일차부터 치료 일차까지 클론들의 확장을 나타내고 흰색 원은 클론들의 축소를 나타낸다. 도 6의 회색 원들은 확장되지도 축소되지도 않은 말초부의 클론들을 나타낸다.
패널 A에서 평가된 RCC PD 환자는 치료 29일차 이후 1일차에 비해 2개의 확장 말초 클론들 및 4개의 축소 클론들을 보여주었다. 패널 B의 RCC PR 환자는 치료 113일 후 1일차에 비해 899개의 확장 클론들 대 47개의 축소 클론들을 보여준다.
이들 실험 데이터는 IL-10 제제를 이용한 치료에 최소한 부분 반응을 보이는 질병에 걸린 환자들의 말초부가 질병 항원-특이적, PD1+, CD8+ T 세포의 풍부한 출처가 되며, 이들을 사용하여 항원-특이적 CD8+ T 세포의 클론 모집단 생성을 용이하게 할 수 있음을 나타낸다. 이러한 클론 모집단들은 단리되고, 시험관내 확장되어, 세포-기반 요법으로 사용될 수 있다 (예컨대, 동일한 유형의 질병 (예컨대, 동일한 유형의 종양)에 걸린 암 환자에게 투여됨). PD1+, CD8+ 말초 T 세포를 IL-10 제제를 이용한 치료에 최소한 부분 반응을 가지는 질병 환자들의 말초로부터 얻고, T 세포 수용체들 (TCRs)의 서열들을 얻고, 그리고 이러한 서열들을 사용하여, 유전자 변형된 T 세포, 예컨대, 키메라 항원 수용체를 가지는 T 세포 (CAR-T 세포)의 생성에 사용하기에 적합한 알파 TCR 및 베타 TCR 서열들의 라이브러리를 제조할 수 있다.
실시예 7: IL-10 제제 요법에 반응성인 환자들의 말초부로부터 얻은 PD1+, CD8+ T 세포의 TCR 알파 및/또는 베타 서열들의 라이브러리 제조
상기 설명한 바와 같이, IL-10 제제를 이용한 치료가 잘 듣는 질병에 걸린 그리고 IL-10 제제 요법을 제공받았던 환자들의 (예컨대, 말초 혈액으로부터 얻은) 조직 샘플들은, 항원-특이적 CD8+ T 세포의 공급원을 제공한다. 도 7은 이러한 항원-특이적 CD8+ T 세포의 TCR들의 서열들을 얻기 위해 이러한 공급원이 어떻게 사용될 수 있는지에 관한 예시 도식을 제공한다.
먼저, 환자 테스트 샘플로서 사용하기 위한 CD8+ T 세포들의 공급원을 식별하거나 얻는다. 이러한 공급원은, 예를 들면, 환자로부터 얻은 혈액 샘플 (또는 혈액 샘플의 분획)이 될 수 있다. 이러한 환자들은 일반적으로 IL-10 요법이 잘 듣는 임의의 질병을 가지며, 이러한 질병에는, 암 (예컨대, 고형 종양, 가령, 흑색종, RCC, 또는 림프종) 및 바이러스 (예컨대, HBV, HCV, HIV) 감염에 의해 유발되는 질병이 포함되나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. IL-10 제제 치료법은 수많은 요인들, 가령, 치료될 질병, 투여될 IL-10 제제 (예컨대, rHuIL-10, 페길화-rHuIL-10) 등에 따라 달라질 것이다. 이러한 치료법은 IL-10 제제 단일요법일 수 있거나 해당 병태를 위한 그 외 치료들을 수반할 수 있다 (예컨대, 병용 요법으로서). IL-10 제제 단일요법으로 치료 후 최소한 부분 반응을 보이는 환자들이 특히 관심의 대상이 될 수 있다.
바람직할 수 있는 임의의 적합한 환자 테스트 샘플 가공처리후, 샘플 내 존재하는 최소한 V베타 TCR 폴리펩티드 서열들을 인코딩하는 핵산들을 얻고 시퀀싱한다. 선택적으로, 이러한 핵산 가공처리 및 시퀀싱에 앞서 T 세포가 풍부해지도록 샘플을 가공처리할 수 있다. 예를 들면, 샘플 내 세포들을 FACS로 분류하여 PD1+ CD8+ T 세포의 모집단을 얻을 수 있다. 이러한 세포는 선택적으로 PD1-중 발현 수준에 관해 선별될 수 있으며 및/또는 선택적으로 CD45RO+ 및/또는 세포내 IFNγ+ 및/또는 그랜자임 B+ 및/또는 퍼포린+인 것을 선별할 수 있다. 세포내 IFNγ+ 및/또는 그랜자임 B+ 및/또는 퍼포린+에 대한 선별은 활성화된, 항원 특이적 세포의 선별을 용이하게 한다. 관심의 대상인 경우, IFNγ는 이러한 선별에 앞서 1-10 g/ml의 가용성 항-CD3와 함께 2-4시간 배양을 통해 유도될 수 있다. PD1+, CD8+ T 세포 (또는, 예컨대, PD1-중, CD8+ T 세포; CD45RO+ PD1+, CD8+ T 세포; CD45RO+, PD1-중+, CD8+ T 세포)는 선택적으로 분류되어 단일 세포 모집단을 제공할 수 있다. PD1+, CD8+ T 세포들을 임의의 적합한 방법(예컨대, US 20060134704; US 20150275296 참조)을 사용하여 그 항원 특이성을 기준으로 선택적으로 분류하여, 정의된 항원 특이성을 가지는 T 세포의 모집단을 제공할 수 있다. 관심의 대상인 경우, PD1+ CD8+ T 세포 하나 또는 이의 모집단을 이후 선택적으로 해당 기술 분야에 널리 공지된 방법들에 따라 확장시킬 수 있다.
알파 및/또는 베타 TCR 유전자들을, 예를 들면, 상업적 공급업체, 가령, Adaptive Biotechnologies사에 의해 제공되는 방법론 또는 유사한 방법론들 (예컨대, US 20140322716; US 20150275296; US 9043160 참조)을 사용하여 단리하거나 시퀀싱할 수 있다.
그 후 환자 테스트 샘플로부터 얻은 TCR 서열들을 분석하여 환자 테스트 샘플에 존재하는 V베타 및/또는 V알파 서열들의 도수를 기준 샘플 내 이러한 동일한 V베타 및/또는 V알파 서열들의 도수와 비교하여 결정할 수 있다. 기준 샘플은 IL-10 제제 요법에 앞서 환자로부터 얻은 동일한 조직 유형의 샘플이 될 수 있다. 대안적으로, 또는 이외에도, 기준 샘플은 샘플 분석 시점 이전인, 요법 개시 후 일정 시점에 동일한 환자로부터 얻은 동일한 조직 유형의 샘플이 될 수 있다. 이러한 기준 샘플들에 대한 서열 데이터를 컴퓨터 데이터베이스에 제공할 수 있으며, 서열 비교를 가상실험으로 (in silico) 수행할 수 있는 것으로 이해된다. 기준 샘플과 비교하여 환자 테스트 샘플에서 도수가 증가된 V베타 및/또는 V알파 TCR 서열들은 IL-10 제제 요법 및/또는 연속 IL-10 제제 요법에 반응하여 확장된 클론들의 TCR들에 해당한다.
임의의 아미노산 공통 서열들을 식별하고, 환자의 일배체형 및 질병 유형 (예컨대, 암 유형) 모두와 관련된 아미노산 공통 서열들을 식별하기 위해 V베타 및/또는 V알파 서열들을 선택적으로 분석할 수 있다. 이러한 알파 베타 TCR 유전자들은, IL-10 제제를 장기간 투약하여 특이적으로 유도되며 강력한 항-질병 세포 기능을 초래하는, 내인적으로 생성된, 새로운, 질병 항원 특이적 T 세포 수용체 서열들에 해당한다.
수득된 TCR 핵산들을 사용하여 전체 알파 및/또는 베타 TCR 서열들을 인코딩하는 다수의 작제물들 (예컨대, 레트로바이러스 작제물들)을 내포하는 라이브러리를 생성할 수 있다. 이러한 작제물들은, 단클론 또는 다클론 CD8+ T 세포 모집단을 유도하기 위하여 하나 또는 다수의 TCR-인코딩 작제물들에 자가 환자 말초 CD8+ T 세포의 풀을 형질도입하기 위해 사용된다. 이러한 단클론 또는 다클론 CD8+ T 세포 모집단은 단리되고, 치료를 위해 환자에게 다시 재주입될 수 있다.
일부 구체예들에서, IL-10 제제 치료에 앞서 환자로부터 환자 CD8+ T 세포 (예컨대, 고형 종양 생검)를 내포하는 질병 조직의 샘플을 얻는다. 이러한 치료전 샘플은 아카이브(archiVαl) 샘플로 기능할 수 있다. 이러한 치료전 샘플을 상기 기재된 치료후 샘플들과 동일하게 처리한다. 핵산 (예컨대, DNA)이 추출되고, 치료전 및 치료후 샘플들 내 TCR 알파 및/또는 베타 서열들을 결정한다. Vβ TCR 폴리펩티드 서열들은 일반적으로 Vα TCR 폴리펩티드들 보다 TCR들 사이에서 더 큰 변이성을 나타내기 때문에, 이 단계에서 서열 분석은 Vβ TCR 폴리펩티드들을 인코딩하는 핵산들에 대해서만 수행될 수 있다. 이후 TCR 알파 및/또는 베타 서열들을 비교하여 IL-10 제제 요법 전 질병 조직에 존재하는 T 세포에 존재하였던 TCR 알파 및/또는 베타 서열들, 그리고 IL-10 제제 요법 후 도수가 증가하였던 이들 서열들을 결정할 수 있다. IL-10 제제 요법 후 도수가 증가하는 TCR 서열들은 질병 조직의 항원에 특이적 (예컨대, 종양 항원-특이적)일 수 있는 것으로 식별되며, IL-10 제제 요법으로 확장된 T 세포 클론들에 존재하는 TCR들에 해당한다. 이러한 TCR 서열들은 특히 핵산들 및/또는 클론들의 라이브러리에 포함시킬 관심의 대상이 된다.
실시예 8. PEG-rhIL-10을 이용한 인간 암 대상체들의 치료는 항-종양 효과와 상관관계를 가지는 CD8+ T 세포 클론들의 증식을 유도한다:
PEG-rhIL10 (AM0010)-치료된 환자들에서 면역 반응을 평가하고 객관적 종양 반응들에 대한 면역 상관성을 확인하기 위하여, 83개의 면역-관련 사이토카인, 케모카인 및 혈청 단백질들을 28 일 동안 매일 20μg/kg AM0010 치료받은 30명의 인간 대상체들에서 반복 측정하였다.
AM0010은 Th1과 Th2 조절 및 CD8+ T 세포 활성화에 대해 편향된 면역 활성화를 유도하였다 . Th1 사이토카인 (IFNγ, IL-18, TNFα) 뿐만 아니라 활성화된 Th2 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 생성물인 IL-3 및 IL-4는 일관되게 증가하였다. IL-7 또한 현저히 유도되었다. AM0010은 또한 세포독성 효과기 분자 (FasL, 림프독소 B)를 증가시켰으며 만성 염증 및 종양 관련 염증을 매개하는 Th17-관련 사이토카인들 및 면역 억제성 사이토카인 TGF을 감소시켰다. IL-23, IL-17 및 동종이량체 IL-12p40은 대략 40% 감소된 반면 IL-6은 일관되게 변화되지 않았다. 혈청 내 면역 자극성 사이토카인들의 증가는 치료 기간 전반에 걸쳐 최소한 400일까지의 기간 동안 유지되었다. AM0010은 종양 유형 또는 방사선사진 종양 반응에 관계없이 IL-18에서와 동일한 일관된 변화를 유도하였다.
관찰된 사이토카인 프로파일은 AM0010-치료받은 환자들에서 CD8+ T 세포의 활성화를 나타내므로, 혈액 중 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 분석하였다. 면역 체크포인트, 가령, PD-1, Lag-3 또는 Tim-3은 유도성이며, 이의 활성화시 T 세포에서 발현된다 또한, 면역 체크포인트 발현이 증가된 CD8+ T 세포는 종양 항원들을 인식하는 T 세포 레퍼토리를 나타낸다. AM0010 치료에 대한 반응에서 표현형 변화는 말초 혈액에서 얻은 T 세포에서 체크포인트 발현과 관련하여 평가되었다. AM0010 치료는 지속성있는 종양 반응을 보였던 콩팥 세포 환자의 혈액 중 Lag-3+ CD8+ T 세포를 증가시켰다. 현저한 Lag-3+ CD8+ T 세포의 비율 또한 PD-1을 발현시켰다. 평가된 모든 환자들에서, 총 PD-1+ T 세포 및 증식성 (KI-67+) PD-1+ CD8+ T 세포의 백분율은 치료 기간 전반에 걸쳐 증가하였으며, 이는 혈청 사이토카인에 의하여 제시되는 지속적인 면역 활성화를 확인시켜 주는 것이다.
세포의 증가된 활성화는 다수의 체크포인트들의 상향 조절을 가져온다. Lag-3를 발현시키는 CD8+ T 세포 및 증식성 Lag-3+ CD8+ T 세포의 수는 현저히 그리고 지속적으로 증가되었다. 그러나 Lag-3+ CD4+ T 세포는 증가하지 않았는데, 이는 면역 활성화가 CD8+ T 세포 반응들에 초점을 두고 있음을 나타내는 것이다. 또 다른 면역 체크포인트, Tim-3은, T 세포 세포사멸을 유도하고 암 환자들에서 탈진된 T 세포와 관련된다. Tim-3 (또는 CTLA-4)는 작은 비율의 CD8+ T 세포에서만 발현되었으며 현저히 상향조절되지 않았다. PD-1+ Lag-3+ 이중-양성 CD8+ T 세포 및 이의 증식은 AM0010 치료 동안 지속적으로 증가하였으며 이는 이러한 세포들의 탈진 보다는 지속적 활성화를 나타낸다.
이러한 활성화 프로파일은 임상 반응과 상관성이 있었다. 지연된 반응을 보인 한 RCC 환자에서, PD-1+ Lag-3+ CD8+ T 세포의 증식은 객관적 종양 반응과 동시에 일어났으며, 이는 이러한 반응에서 이들의 관여를 암시한다. 실제로, 치료 2개월 후 환자에서 Lag-3+ PD-1+ CD8+ T 세포의 만연 및 이의 증식은 객관적 종양 반응과 관련이 있었다. 또한 혈액 중 활성화된 CD8+ T 세포의 만연 증가를 초래하는 것 이외에도, AM0010은 또한 환자들의 종양에서 활성화된 CD8+ T 세포의 수 및 그랜자임B+ CD8+ T 세포의 수를 증가시켰다.
실시예 9: 확장 T-세포 클론들의 서열 확인 및 특성화
환자들의 Lag-3+ PD-1+ CD8+ T 세포의 증식 및 확장 증가는 뚜렷한, 항원 접종된 클론 T 세포 모집단의 확장 및/또는 기존의 말초 T 세포의 부분집합의 기능적 성숙을 나타낸다. 각 모집단의 기여도를 평가하기 위하여, 우리는 말초 혈액으로부터 얻은 TCR-심층 시퀀싱으로 AM0010-치료받은 환자들의 T 세포 레퍼토리의 조성을 분석하였다. DNeasy 키트 (Qiagen)를 사용하여 EDTA 혈액 샘플들로부터 DNA를 단리하였으며 TCR 심층 시퀀싱법을 실시하였다. 확장 및 축소 클론들은 치료전과 치료시 샘플 사이에 10배 이상의 변화가 있는 T 세포 클론들로 정의되었다.
치료전 및 치료시 클론 T 세포 레퍼토리를 비교한 결과 AM0010상의 환자들은 T 세포 클론들이 강력하게 확장되었음이 드러났다. 시퀀싱은 2,952개의 특유한 TCR CDR3 Vβ 확장 서열들의 존재를 나타내었다. T 세포 확장은 치료전 또는 치료후 레퍼토리에서 검출가능했던 클론들 및 치료전 환자들에서 검출불가능하였던 클론들 (새로운 클론들)을 포함하였다. 새로운 확장이 널리 다양한 암 유형들을 가지는 환자들에서 관찰되었다.
기준선에서 10배 이상 변화된 클론들을 분석하였다. AM0010은 환자 한 명 당 240개 T 세포 클론들(17-786 범위)의 중앙값을 10배 이상 확장시켰던 반면, 환자 한 명 당 18개 T 세포 클론들 (0-150)의 중앙값은 10배 이상 축소되었다. 평균적으로, 치료 전 환자들의 T 세포 레퍼토리의 0.06%를 나타내었던 T 세포 클론들은, 전체 말초 T 세포 레퍼토리의 6%까지 확장하였다. 혈액에서 T 세포의 확장 백분율은 반응과 상관성이 있었다. 안정성 질병의 환자들에서 단지 2.9% (0.99-4.3)이고 진행성 질병을 가졌던 환자들에서 1.8% (0.78-3.1) 였던 것에 비해, 객관적 종양 반응을 보였던 환자들은 T 세포 클론들의 확장 중앙값이 15%였다 (범위 4.3-43%; > 10-배 증식/클론). 더욱이, 안정성 질병의 환자들에서 194개 클론들 (81-519) 및 진행성 질병의 환자들에서 164개의 클론들 (17-328)에 비해, 객관적 종양 반응을 보였던 환자들은 761개 (524-786) 중앙값의 확장성 개별 클론들을 가졌다.
항-PD-1에 대한 종양 반응들은 종양에서의 높은 돌연변이 부담과 관련되어 있으며, 이는 생성된 신생 항원들에 대한 기존의 T 세포 반응이 종양 반응을 촉진시킬 수 있음을 암시한다. 드물거나 새로운 T 세포의 클론 확장이 모든 종양 유형들에서 관찰되었는데- 이는 종양 조직에서 높은 또는 낮은 예상 돌연변이 부담 및 높은 또는 낮은 기존 CD8+ T 세포인 것이다. 새로운 T 세포 확장 규모기는 AM0010 단일요법에서 환자들의 종양 반응과 상관관계가 있었던 반면 자가면역-관련 AE는 관찰되지 않았다. 항-CTLA-4 요법을 투여받은 전립선 암 환자들에서, 환자 당 55개 이상의 CD8+ T 세포 클론들의 확장에 앞서 심각한 면역-관련 유해 사례 (irAEs)가 있었는데, 이는 이들 확장하는 T 세포 클론들의 자가-반응성을 암시하는 것이다 (Subudhi, S. K. 외. (2016) PNAS(USA) 113(42): 11919-11924).
본 발명을 실시하기 위하여 발명자들에게 알려진 가장 우수한 방식을 비롯하여 본 발명의 특정 구체예들을 본 명세서에 기재하였다. 전술한 설명을 읽으면, 개시된 구체예들에 관한 변형예는 해당 기술 분야의 숙련된 기술자 개개인에게 자명해질 수 있을 것이며, 이러한 숙련된 기술자들은 이러한 변형예들을 적절히 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 기재한 바와 다른 방식으로 실시되고, 적용가능한 법률이 허용하는 바에 따라 본 명세서에 첨부된 청구범위에 언급된 주제의 모든 변형예 및 균등예를 포함하고자 한다. 더욱이, 상기 설명한 구성들의 모든 가능한 변형들에 속하는 이 구성들의 임의의 조합은 본 출원에서 달리 언급하지 않는 한 또는 달리 명확하게 본 내용에 대조되는 것으로 언급되지 않는 한 본 발명에 포함된다.
본 명세서에서 인용된 모든 문헌들, 특허 출원들, 승인 번호 및 그 외 참고사항들은 각 개개의 문헌 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고문헌으로 포함되는 것으로 기재된 것과 같이 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Mumm, John B Chan, Ivan Ogg, Scott Oft, Martin McCauley, Scott <120> INTERLEUKIN-10 IN PRODUCTION OF ANTIGEN-SPECIFIC CD8+ T CELLS AND METHODS OF USE OF SAME <130> ARMO-023WO <140> US 17/012882 <141> 2017-01-10 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 1 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 2 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 3 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 4 Lys Ala Leu Ala Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala 1 5 10 15 Leu Ala Lys His Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Cys Glu 20 25 30 Ala <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 5 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 6 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 7 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 8 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 9 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 10 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 11 Thr His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 12 Gly Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> The sequence is repeated n times, where n is selected from an integer of at least 1 to 20. <400> 13 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> The amino acid is repeated m times, where m is selected from an integer of at least 1 to 20. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> The sequence is repeated n times, where n is selected from an integer of at least 1 to 20. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> The amino acid is repeated o times, where o is selected from an integer of at least 1 to 20. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> The amino acid is repeated m times, where m is selected from an integer of at least 1 to 20. <400> 14 Gly Ser Gly 1 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> The amino acid is repeated m times, where m is selected from an integer of at least 1 to 20. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> The sequence is repeated n times, where n is selected from an integer of at least 1 to 20. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> The amino acid is repeated o times, where o is selected from an integer of at least 1 to 20. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> The amino acid is repeated m times, where m is selected from an integer of at least 1 to 20. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> The amino acid is repeated o times, where o is selected from an integer of at least 1 to 20. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> The amino acid is repeated m times, where m is selected from an integer of at least 1 to 20. <400> 15 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> The sequence is repeated n times, where n is selected from an integer of at least 1 to 20. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> The amino acid is repeated m times, where m is selected from an integer of at least 1 to 20. <400> 16 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> The sequence is repeated n times, where n is selected from an integer of at least 1 to 20. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> The amino acid is repeated m times, where m is selected from an integer of at least 1 to 20. <400> 17 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> The sequence is repeated n times, where n is selected from an integer of at least 1 to 20. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> The amino acid is repeated m times, where m is selected from an integer of at least 1 to 20. <400> 18 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 19 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 20 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 21 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 22 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 23 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 24 Gly Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> The sequence is repeated n times, where n is selected from an integer of at least 1 to 50. <400> 25 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 26 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> The sequence is repeated n times, where n is selected from an integer of at least 1 to 50. <400> 26 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> The sequence is repeated n times, where n is selected from an integer of at least 1 to 50. <400> 27 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 28 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 29 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 30 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 31 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 32 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 33 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 34 Gly Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 35 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 36 Gly Gly Gly Ser 1

Claims (95)

  1. 다음 단계를 포함하는, 질병 항원-특이적 T 세포의 TCR의 가변 알파 (Vα) T 세포 수용체 (TCR) 폴리펩티드 및/또는 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드 식별 방법:
    IL-10 제제 요법이 잘 듣는 질병에 걸린 대상체에 IL-10 제제를 투여하는 단계;
    상기 대상체로부터 얻은 하나 이상의 CD8+ T 세포를 내포하는 샘플의 핵산들을 시퀀싱하는 단계, 여기서 상기 시퀀싱 단계는 가변 알파 (Vα) TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들 및/또는 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들을 시퀀싱하는 것을 포함하며; 및
    Vα TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들의 존재량을, IL-10 제제 요법 전 또는 IL-10 제제 요법을 하는 중 조기 시점에 IL-10 제제 요법이 잘 듣는 질병에 걸린 하나 이상의 환자들로부터 얻은 기준 샘플에서의 Vα TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들의 존재량과 비교하는 단계;
    여기서 기준 샘플에서보다 많은 존재량으로 샘플에 존재하는 Vα 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드들은 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포에 특이적인 Vα/Vβ TCR 폴리펩티드 쌍을 나타냄.
  2. 청구항 1에 있어서, 대상체는 IL-10 제제 요법에 대해 최소한 안정성 (stable) 질병 또는 최소한 부분 반응 (partial response)을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 대상체는 IL-10 제제 요법에 대해 최소한 부분 반응을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1-3 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 PD1+, CD8+ T 세포가 풍부함을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, PD1+, CD8+ T 세포는 최소한 PD1+ 중 수준으로 세포 표면 PD1을 발현시킴을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, PD1+, CD8+ T 세포는 최소한 PD1+ 고 수준으로 세포 표면 PD1을 발현시킴을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 1-6 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 CD45RO+, CD8+ T 세포가 풍부함을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 1-7 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 IFNγ+CD8+ T 세포가 풍부함을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 방법은 IFNγ발현을 자극하기 위하여 CD8+ T 세포를 CD3 효능제와 접촉시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, CD3 효능제는 항-CD3 항체임을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 1-3 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 PD1+, IFNγ+, CD45RO+, 그랜자임 B+, 및/또는 퍼포린+인 CD8+ T 세포가 풍부함을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 1-11 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 환자들은 대상체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 1-12 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 종양을 가지며, CD8+ T 세포는 종양 항원에 특이적임을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 1-12 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 종양을 가지며, CD8+ T 세포는 종양 침윤 림프구임을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 13 또는 14에 있어서, 종양은 고형 종양임을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 13 또는 14에 있어서, 종양은 자궁, 자궁경부, 유방, 전립선, 고환, 위장관, 신장, 콩팥 세포, 방광, 골, 골수, 피부, 두경부, 간, 쓸개, 심장, 폐, 이자, 침샘, 부신, 갑상선, 뇌, 신경절, 중추신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS)의 암, 또는 조혈계, 비장, 또는 흉선의 암에서 선택되는 암의 종양임을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 13 또는 14에 있어서, 종양은 식도, 입인두, 위, 소장, 대장, 결장, 또는 직장의 암의 종양임을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 13 또는 14에 있어서, 종양은 흑색종, 결장직장 암, 또는 콩팥 암임을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 1-12 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 바이러스 감염을 가지며, CD8+ T 세포는 바이러스 감염 항원에 특이적임을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 바이러스는 헤파드나바이러스, 플라비바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 바이러스는 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV) 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)임을 특징으로 하는 방법.
  22. 청구항 1-21 중 어느 한 항에 있어서, IL-10 제제는 인간 IL-10임을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 1-22 중 어느 한 항에 있어서, IL-10 제제는 페길화 IL-10 (PEG-IL-10)임을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, PEG-IL-10은 IL-10의 최소한 하나의 단량체의 N-말단 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된 최소한 하나의 PEG 분자를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 23에 있어서, PEG-IL-10은 모노-페길화 IL-10 및 다이-페길화 IL-10의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 23-25 중 어느 한 항에 있어서, PEG-IL-10의 PEG 성분은 5kDa 내지 30kDa의 분자량을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 1-26 중 어느 한 항에 있어서, IL-10 제제는 대상체에 피하 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 청구항 1-27 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간 대상체임을 특징으로 하는 방법.
  29. 청구항 1-28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법:
    Vα TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 시퀀싱하는 단계; 및
    Vα TCR 폴리펩티드 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드의 최소한 상보성 결정 영역들 (CDRs)의 아미노산 서열들을 결정하는 단계;
    Vα TCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들의 존재량을, IL-10 제제 요법 전 또는 IL-10 제제 요법을 하는 중 조기 시점에 IL-10 제제 요법이 잘 듣는 질병에 걸린 하나 이상의 환자들로부터 얻은 기준 샘플에서의 Vα TCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들의 존재량과 비교하는 단계.
  30. 청구항 1-29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법:
    Vα 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드들의 아미노산 서열과 기준 샘플의 Vα 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드들의 아미노산 서열들을 비교함으로써, 청구항 1-29 중 어느 한 항의 방법에 따라 단리된 CD8+ T 세포에서 발현된 TCR의 항원 특이성을 평가하는 단계.
  31. 다음 단계를 포함하는, 질병 항원-특이적 T 세포의 TCR의 가변 알파 (Vα) T 세포 수용체 (TCR) 폴리펩티드 및 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터의 생성 방법:
    IL-10 제제 치료가 잘 듣는 질병을 위해 IL-10 제제 요법을 투여받았던 대상체로부터 얻은 하나 이상의 CD8+ T 세포를 내포하는 샘플의 핵산들을 시퀀싱하는 단계, 여기서 CD8+ T 세포는 가변 알파 (Vα) TCR 폴리펩티드 및 가변 베타 (Vβ) TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 질병 항원-특이적 T 세포 수용체 (TCR)를 발현시키며; 그리고
    질병 항원-특이적 CD8+ T 세포의 TCR의 Vα 및 Vβ TCR 폴리펩티드 쌍을 인코딩하는 핵산들을 하나 이상의 작제물들에 클로닝하여, 질병 항원-특이적 TCR의 Vα 및 Vβ TCR 폴리펩티드들 중 하나 또는 모두를 인코딩하는 벡터를 생성하는 단계, 여기서 IL-10 제제 요법 전 또는 IL-10 제제 요법 중 조기 시점에 IL-10 제제 요법이 잘 듣는 질병에 걸린 하나 이상의 환자들로부터 얻은 기준 샘플에서 보다 더 많은 존재량으로 샘플에 존재하는 Vα 및/또는 Vβ TCR 폴리펩티드들은 질병 항원-특이적 CD8+ T 세포의 Vα/Vβ TCR 폴리펩티드 쌍을 나타냄.
  32. 청구항 31에 있어서, 벡터는 Vα 및 Vβ TCR 폴리펩티드 쌍의 CD8+ T 세포 촉진 발현의 안정한 형질감염에 적합함을 특징으로 하는 방법.
  33. 청구항 31 또는 32에 있어서, 대상체는 IL-10 제제 요법에 대해 최소한 안정성 질병 또는 최소한 부분 반응을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  34. 청구항 33에 있어서, 대상체는 IL-10 제제 요법에 대해 최소한 부분 반응을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  35. 청구항 31-34 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 PD1+, CD8+ T 세포가 풍부함을 특징으로 하는 방법.
  36. 청구항 35에 있어서, PD1+, CD8+ T 세포는 최소한 PD1+ 중 수준으로 세포 표면 PD1을 발현시킴을 특징으로 하는 방법.
  37. 청구항 35에 있어서, PD1+, CD8+ T 세포는 최소한 PD1+ 고 수준으로 세포 표면 PD1을 발현시킴을 특징으로 하는 방법.
  38. 청구항 31-37 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 CD45RO+, CD8+ T 세포가 풍부함을 특징으로 하는 방법.
  39. 청구항 31-38 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 IFN γ+ CD8+ T 세포가 풍부함을 특징으로 하는 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 방법은 IFN γ 발현을 자극하기 위하여 CD8+ T 세포를 CD3 효능제와 접촉시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  41. 청구항 40에 있어서, CD3 효능제는 항-CD3 항체임을 특징으로 하는 방법.
  42. 청구항 31-34 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 PD1+, IFN γ+, CD45RO+, 그랜자임 B+, 및/또는 퍼포린+인 CD8+ T 세포가 풍부함을 특징으로 하는 방법.
  43. 청구항 31-42 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 환자들은 대상체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  44. 청구항 31-43 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 종양을 가지며, CD8+ T 세포는 종양 항원에 특이적임을 특징으로 하는 방법.
  45. 청구항 31-43 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 종양을 가지며, CD8+ T 세포는 종양 침윤 림프구임을 특징으로 하는 방법.
  46. 청구항 44 또는 45에 있어서, 종양은 고형 종양임을 특징으로 하는 방법.
  47. 청구항 44 또는 45에 있어서, 종양은 자궁, 자궁경부, 유방, 전립선, 고환, 위장관, 신장, 콩팥 세포, 방광, 골, 골수, 피부, 두경부, 간, 쓸개, 심장, 폐, 이자, 침샘, 부신, 갑상선, 뇌, 신경절, 중추신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS)의 암, 또는 조혈계, 비장, 또는 흉선의 암에서 선택되는 암의 종양임을 특징으로 하는 방법.
  48. 청구항 44 또는 45에 있어서, 종양은 식도, 입인두, 위, 소장, 대장, 결장, 또는 직장의 암의 종양임을 특징으로 하는 방법.
  49. 청구항 44 또는 45에 있어서, 종양은 흑색종, 결장직장 암, 또는 콩팥 암임을 특징으로 하는 방법.
  50. 청구항 31-43 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 바이러스 감염을 가지며, PD1+, CD8+ T 세포는 바이러스 감염 항원에 특이적임을 특징으로 하는 방법.
  51. 청구항 50에 있어서, 바이러스는 헤파드나바이러스, 플라비바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  52. 청구항 51에 있어서, 바이러스는 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV) 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)임을 특징으로 하는 방법.
  53. 청구항 31-52 중 어느 한 항에 있어서, IL-10 제제는 인간 IL-10임을 특징으로 하는 방법.
  54. 청구항 31-52 중 어느 한 항에 있어서, IL-10 제제는 페길화 IL-10임을 특징으로 하는 방법.
  55. 청구항 54에 있어서, PEG-IL-10은 IL-10의 최소한 하나의 단량체의 N-말단 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된 최소한 하나의 PEG 분자를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  56. 청구항 54에 있어서, PEG-IL-10은 모노-페길화 IL-10 및 다이-페길화 IL-10의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  57. 청구항 54-56 중 어느 한 항에 있어서, PEG-IL-10의 PEG 성분은 5kDa 내지 30kDa의 분자량을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  58. 청구항 31-57 중 어느 한 항에 있어서, IL-10 제제는 대상체에 피하 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  59. 청구항 31-58 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간 대상체임을 특징으로 하는 방법.
  60. 청구항 31-59 중 어느 한 항에 있어서, CD8+ T 세포의 TCR들의 복수의 Vα/Vβ TCR 쌍들의 Vα 및 Vβ TCR 폴리펩티드들을 인코딩하는 복수의 핵산들은 CD8+ T 세포의 질병 항원-특이적 TCR들의 Vα 및 Vβ TCR 폴리펩티드 쌍들을 인코딩하는 작제물들의 라이브러리를 제조하기 위해 복수의 벡터들에 클로닝됨을 특징으로 하는 방법.
  61. 청구항 31-59 중 어느 한 항에 있어서, Vα TCR 폴리펩티드 및 Vβ TCR 폴리펩티드는 동일한 벡터로 클로닝됨을 특징으로 하는 방법.
  62. 청구항 61에 있어서, Vα TCR 폴리펩티드 및 Vβ TCR 폴리펩티드는, 전장 알파 TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 그리고 전장 베타 TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공하기 위한 벡터에 클로닝됨을 특징으로 하는 방법.
  63. 청구항 61에 있어서, Vα TCR 폴리펩티드 및 Vβ TCR 폴리펩티드는 단쇄 T 세포 수용체 (scTv)를 인코딩하는 핵산을 제공하기 위한 벡터에 클로닝됨을 특징으로 하는 방법.
  64. 청구항 63에 있어서, scTv는 N-말단으로부터 C-말단으로, Vβ TCR 폴리펩티드, 링커, 및 Vα TCR 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  65. 청구항 31-64 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 발현 벡터임을 특징으로 하는 방법.
  66. 청구항 60의 방법에 의해 제조된 핵산 벡터들의 라이브러리.
  67. 다음 단계를 포함하는, 유전자 변형된 T 세포의 생성 방법:
    청구항 31-59 중 어느 한 항의 방법으로 얻은 작제물을 CD8+ T 세포에 도입시켜 질병 항원-특이적 TCR의 Vα 및 Vβ TCR 폴리펩티드 쌍을 발현시키는 유전자 변형된 T 세포를 제조하는 단계.
  68. 청구항 67에 있어서, Vα TCR 폴리펩티드 및 Vβ TCR 폴리펩티드는 동일하거나 상이한 발현 작제물들 상의 별도의 발현 카세트들로부터 인코딩됨을 특징으로 하는 방법.
  69. 청구항 67 또는 68에 있어서, 상기 작제물에 의해 인코딩된 Vα TCR 폴리펩티드는 그 C-말단에서 불변 알파 TCR 폴리펩티드에 작동적으로 연결됨을 특징으로 하는 방법.
  70. 청구항 67 또는 68에 있어서, 상기 작제물에 의해 인코딩된 Vβ TCR 폴리펩티드는 그 C-말단에서 베타 불변 TCR 폴리펩티드에 작동적으로 연결됨을 특징으로 하는 방법.
  71. 청구항 67에 있어서, 상기 작제물은 Vβ TCR 폴리펩티드 및 Vα TCR 폴리펩티드를 포함하는 단쇄 TCR (scTv)을 인코딩하는 핵산을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  72. 청구항 71에 있어서, scTv는 N-말단으로부터 C-말단으로, Vβ TCR 폴리펩티드, 링커, 및 Vα TCR 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  73. 청구항 67-72 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 유전자 변형된 CD8+ T 세포의 모집단.
  74. 다음 단계를 포함하는, CD8+ T 세포 요법이 잘 듣는 질병에 걸린 대상의 치료 방법:
    유전자 변형된 CD8+ T 세포를 대상체에 투여하는 단계, 여기서 T 세포는 대상체의 질병 항원에 특이적인 질병 항원-특이적 TCR의 Vα/Vβ 쌍의 Vα TCR 폴리펩티드 및 a Vβ TCR 폴리펩티드를 포함하는 재조합 TCR을 발현시키기 위해 유전자 변형되며;
    상기 투여 단계는 대상체의 질병을 치료함에 효과적임.
  75. 청구항 74에 있어서, Vα TCR 폴리펩티드의 CDR들 및 Vβ TCR 폴리펩티드의 CDR들의 아미노산 서열들은 청구항 1-26 중 어느 한 항의 방법에 따라 식별되었음을 특징으로 하는 방법.
  76. 청구항 74에 있어서, Vα TCR 폴리펩티드 및 Vβ TCR 폴리펩티드의 아미노산 서열들은 청구항 25의 방법에 따라 식별되었음을 특징으로 하는 방법.
  77. 청구항 74-76 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변형된 T 세포의 Vα TCR 폴리펩티드 및 Vβ TCR 폴리펩티드는 동일하거나 상이한 발현 작제물의 별도의 발현 카세트들로부터 인코딩됨을 특징으로 하는 방법.
  78. 청구항 74-77 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변형된 T 세포의 Vα TCR 폴리펩티드는 그 C-말단에서 불변 알파 TCR 폴리펩티드에 작동적으로 연결됨을 특징으로 하는 방법.
  79. 청구항 74-78 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변형된 T 세포의 Vβ TCR 폴리펩티드는 C-말단에서 베타 불변 TCR 폴리펩티드에 작동적으로 연결됨을 특징으로 하는 방법.
  80. 청구항 74-76 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변형된 T 세포의 Vβ TCR 폴리펩티드 및 Vα TCR 폴리펩티드는 Vβ TCR 폴리펩티드 및 Vα TCR 폴리펩티드를 포함하는 단쇄 TCR (scTv)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 작제물에 의해 인코딩됨을 특징으로 하는 방법.
  81. 청구항 80에 있어서, scTv는 N-말단으로부터 C-말단으로, Vβ TCR 폴리펩티드, 링커, 및 Vα TCR 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  82. 청구항 74-81 중 어느 한 항에 있어서, CD8+ T 세포 요법이 잘 듣는 질병은 암이며 유전자 변형된 CD8+ T 세포의 질병 항원-특이적 TCR은 이러한 암의 항원에 대해 특이적임을 특징으로 하는 방법.
  83. 청구항 82에 있어서, 암은 고형 종양임을 특징으로 하는 방법.
  84. 청구항 82 또는 83에 있어서, 종양은 자궁, 자궁경부, 유방, 전립선, 고환, 위장관, 신장, 콩팥 세포, 방광, 골, 골수, 피부, 두경부, 간, 쓸개, 심장, 폐, 이자, 침샘, 부신, 갑상선, 뇌, 신경절, 중추신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS)의 암, 또는 조혈계, 비장, 또는 흉선의 암에서 선택되는 암의 종양임을 특징으로 하는 방법.
  85. 청구항 82 또는 83에 있어서, 암은 식도, 입인두, 위, 소장, 대장, 결장, 또는 직장의 암임을 특징으로 하는 방법.
  86. 청구항 82 또는 83에 있어서, 암은 흑색종, 결장직장 암, 또는 콩팥 암임을 특징으로 하는 방법.
  87. 청구항 74-81 중 어느 한 항에 있어서, CD8+ T 세포 요법이 잘 듣는 질병은 바이러스- 감염이며 유전자 변형된 CD8+ T 세포의 질병 항원-특이적 TCR은 이러한 바이러스의 항원에 대해 특이적임을 특징으로 하는 방법.
  88. 청구항 87에 있어서, 바이러스는 헤파드나바이러스, 플라비바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  89. 청구항 87에 있어서, 바이러스는 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV) 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)임을 특징으로 하는 방법.
  90. 청구항 74-89 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 추가 치료 제제를 투여하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  91. 청구항 90에 있어서, 상기 치료 제제는 IL-10 제제임을 특징으로 하는 방법.
  92. 청구항 90 또는 91에 있어서, CD8+ T 세포 요법이 잘 듣는 질병은 암이며 치료 제제는 화학치료 제제임을 특징으로 하는 방법.
  93. 청구항 90 또는 91에 있어서, CD8+ T 세포 요법이 잘 듣는 질병은 바이러스 감염이며 치료 제제는 항바이러스 제제임을 특징으로 하는 방법.
  94. 청구항 74-93 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계는 복수의 유전자 변형된 CD8+ T 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 복수의 유전자 변형된 CD8+ T 세포는 상이한 질병 항원-특이적 TCRs을 내포하는 유전자 변형된 CD8+ T 세포들을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  95. 청구항 74-94 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변형된 CD8+ T 세포는 대상체에 대해 자가유래성(autologous)임을 특징으로 하는 방법.
KR1020187021225A 2016-01-11 2017-01-10 항원-특이적 cd8+ t 세포의 제조에서 인터루킨-10 및 이의 사용 방법 KR20180101417A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662277442P 2016-01-11 2016-01-11
US62/277,442 2016-01-11
PCT/US2017/012882 WO2017123557A1 (en) 2016-01-11 2017-01-10 Interleukin-10 in production of antigen-specific cd8+ t cells and methods of use of same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180101417A true KR20180101417A (ko) 2018-09-12

Family

ID=59311424

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187021225A KR20180101417A (ko) 2016-01-11 2017-01-10 항원-특이적 cd8+ t 세포의 제조에서 인터루킨-10 및 이의 사용 방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US11814679B2 (ko)
EP (1) EP3402512A4 (ko)
JP (1) JP7082051B2 (ko)
KR (1) KR20180101417A (ko)
CN (1) CN108697776A (ko)
AU (1) AU2017207282A1 (ko)
CA (1) CA3008287A1 (ko)
MX (1) MX2018007295A (ko)
WO (1) WO2017123557A1 (ko)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017009852A1 (en) 2015-07-16 2017-01-19 Yeda Research And Development Co. Ltd. Use of anti third party central memory t cells
WO2018081621A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating urothelial carcinoma using an anti-pd-1 antibody
JP7039582B2 (ja) 2016-11-03 2022-03-22 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 活性化可能な抗ｃｔｌａ－４抗体およびその使用
WO2018134824A1 (en) 2017-01-18 2018-07-26 Yeda Research And Development Co. Ltd. Genetically modified veto cells and use of same in immunotherapy
KR20190133213A (ko) 2017-03-31 2019-12-02 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
CA3065304A1 (en) 2017-05-30 2018-12-06 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising an anti-lag-3 antibody or an anti-lag-3 antibody and an anti-pd-1 or anti-pd-l1 antibody
AU2018277559A1 (en) 2017-05-30 2019-10-17 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising a combination of an anti-LAG-3 antibody, a PD-1 pathway inhibitor, and an immunotherapeutic agent
HUE065242T2 (hu) 2017-05-30 2024-05-28 Bristol Myers Squibb Co LAG-3-pozitív tumorok kezelése
US11566073B2 (en) 2017-06-01 2023-01-31 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor using an anti-PD-1 antibody
US20200239577A1 (en) 2017-10-15 2020-07-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
JP2021502344A (ja) 2017-11-06 2021-01-28 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 腫瘍を処置する方法
WO2019143607A1 (en) 2018-01-16 2019-07-25 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating cancer with antibodies against tim3
BR112020014574A2 (pt) 2018-01-22 2020-12-08 Bristol-Myers Squibb Company Composições e métodos para o tratamento do câncer
CA3096287A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Pascal Biosciences Inc. Cannabinoids and derivatives for promoting immunogenicity of tumor and infected cells
AU2019240370B2 (en) * 2018-03-23 2024-03-07 Gavish-Galilee Bio Applications Ltd. Genetically reprogrammed Tregs expressing membrane-bound IL-10
MX2020009861A (es) 2018-03-23 2020-10-08 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra el complejo principal de histocompatibilidad relacionado con las cadenas a y b clase i (mica) y/o (micb) y sus usos.
WO2019191676A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
CN112292399A (zh) 2018-04-04 2021-01-29 百时美施贵宝公司 抗cd27抗体及其用途
US20210347842A1 (en) 2018-06-19 2021-11-11 Eli Lilly And Company Compositions and methods of use of il-10 agents in conjunction with chimeric antigen receptor cell therapy
EP3826660A1 (en) 2018-07-26 2021-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 combination therapy for the treatment of cancer
US20210301324A1 (en) * 2018-08-24 2021-09-30 Repertoire Genesis Incorporation Method for analyzing functional subunit pair gene of t cell receptor and b cell receptor
WO2020076799A1 (en) 2018-10-09 2020-04-16 Bristol-Myers Squibb Company Anti-mertk antibodies for treating cancer
JP2022512750A (ja) 2018-10-19 2022-02-07 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 黒色腫に対する併用療法
EP3870609A1 (en) 2018-10-23 2021-09-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
WO2020102501A1 (en) 2018-11-16 2020-05-22 Bristol-Myers Squibb Company Anti-nkg2a antibodies and uses thereof
CA3121265A1 (en) * 2018-12-05 2020-06-11 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for cancer immunotherapy
CN116479022A (zh) * 2018-12-12 2023-07-25 中南大学 一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用
KR20210146348A (ko) 2019-03-28 2021-12-03 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
CN113891748A (zh) 2019-03-28 2022-01-04 百时美施贵宝公司 治疗肿瘤的方法
EP3976831A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures for suitability to immuno-oncology therapy
KR20220016155A (ko) 2019-05-30 2022-02-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 면역-종양학 (i-o) 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법
US20220233691A1 (en) 2019-05-30 2022-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and combination therapy
JP7337373B2 (ja) * 2019-07-29 2023-09-04 サイアス株式会社 抗原特異的ｔ細胞の製造方法
JP2022549273A (ja) 2019-09-22 2022-11-24 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｌａｇ－３アンタゴニスト治療のための定量的空間プロファイリング
BR112022005655A2 (pt) 2019-09-25 2022-09-06 Bristol Myers Squibb Co Biomarcador compósito para terapia para câncer
CN115298549A (zh) 2019-11-05 2022-11-04 百时美施贵宝公司 M蛋白测定及其用途
WO2021092220A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject with a tumor suitable for a checkpoint inhibitor therapy
WO2021092221A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject with a tumor suitable for a checkpoint inhibitor therapy
US20220411499A1 (en) 2019-11-08 2022-12-29 Bristol-Myers Squibb Company LAG-3 Antagonist Therapy for Melanoma
EP4058465A1 (en) 2019-11-14 2022-09-21 Cohbar Inc. Cxcr4 antagonist peptides
JP2023510108A (ja) 2019-12-19 2023-03-13 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｄｇｋ阻害剤およびチェックポイントアンタゴニストの組み合わせ
CN115397859A (zh) 2020-01-30 2022-11-25 Ona疗法有限公司 治疗癌症和癌症转移的联合疗法
EP4100426A1 (en) 2020-02-06 2022-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Il-10 and uses thereof
IL295979A (en) 2020-03-06 2022-10-01 Ona Therapeutics S L Anti-cd36 antibodies and their use for cancer treatment
JP2023519254A (ja) 2020-03-23 2023-05-10 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー がんを処置するための抗ｃｃｒ８抗体
US20210393743A1 (en) * 2020-06-21 2021-12-23 Ketan Desai Use of IL13 for prevention and treatment of COVID19
WO2022047189A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 antagonist therapy for hepatocellular carcinoma
JP2023538955A (ja) 2020-08-31 2023-09-12 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 細胞局在シグネチャーおよび免疫療法
JP2023544410A (ja) 2020-10-05 2023-10-23 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー タンパク質を濃縮するための方法
WO2022087402A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 antagonist therapy for lung cancer
EP4236960A1 (en) 2020-10-28 2023-09-06 Ikena Oncology, Inc. Combination of an ahr inhibitor with a pdx inhibitor or doxorubicine
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
US20220233689A1 (en) 2020-12-28 2022-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumors
JP2024503265A (ja) 2020-12-28 2024-01-25 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 抗体組成物およびその使用の方法
BR112023019847A2 (pt) 2021-03-29 2023-11-07 Juno Therapeutics Inc Métodos para dosagem e tratamento com uma combinação de uma terapia com inibidor de ponto de verificação e uma terapia com célula t car
JP2024514530A (ja) 2021-04-02 2024-04-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 切断型ｃｄｃｐ１に対する抗体およびその使用
KR20240042476A (ko) 2021-07-30 2024-04-02 오엔에이 테라퓨틱스 에스.엘. 항-cd36 항체 및 암을 치료하기 위한 이의 용도
CN118176214A (zh) 2021-10-29 2024-06-11 百时美施贵宝公司 血液癌症的lag-3拮抗剂疗法
WO2023147371A1 (en) 2022-01-26 2023-08-03 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for hepatocellular carcinoma
WO2023164638A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for colorectal carcinoma
WO2023168404A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor
WO2023170606A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Alentis Therapeutics Ag Use of anti-claudin-1 antibodies to increase t cell availability
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023196987A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
US20230326022A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Bristol-Myers Squibb Company Machine Learning Identification, Classification, and Quantification of Tertiary Lymphoid Structures
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
EP4310197A1 (en) 2022-07-21 2024-01-24 Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario Puerta de Hierro Majadahonda Method for identifying lung cancer patients for a combination treatment of immuno- and chemotherapy
WO2024069009A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Alentis Therapeutics Ag Treatment of drug-resistant hepatocellular carcinoma
WO2024116140A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Medimmune Limited Combination therapy for treatment of cancer comprising anti-pd-l1 and anti-cd73 antibodies
WO2024137776A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for lung cancer

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1324779B1 (en) 2000-09-29 2011-07-20 Schering Corporation Pegylated interleukin-10
AU2007314501B2 (en) 2006-09-28 2013-05-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Use of pegylated IL-10 to treat cancer
US8691205B2 (en) 2008-12-17 2014-04-08 Merck Sharp & Dohme Corporation Mono- and di-PEG IL-10 production; and uses
AU2012230780B2 (en) * 2011-03-23 2016-10-27 Fred Hutchinson Cancer Center Method and compositions for cellular immunotherapy
WO2013074916A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Car+ t cells genetically modified to eliminate expression of t- cell receptor and/or hla
RU2671897C2 (ru) * 2013-03-01 2018-11-07 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари, Департмент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Способы получения из опухоли обогащенных популяций реактивных в отношении опухоли т-клеток
US9943568B2 (en) 2013-04-18 2018-04-17 Armo Biosciences, Inc. Methods of using pegylated interleukin-10 for treating cancer
GB201319160D0 (en) * 2013-10-30 2013-12-11 Imcyse Sa Methods for induction of antigen-specific regulatory t cells
WO2015070060A1 (en) 2013-11-11 2015-05-14 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
WO2015108785A1 (en) 2014-01-15 2015-07-23 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
WO2015112626A1 (en) 2014-01-21 2015-07-30 June Carl H Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
AU2015336101A1 (en) 2014-10-22 2017-04-20 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
US10618970B2 (en) 2015-02-03 2020-04-14 Armo Biosciences, Inc. Method of treating cancer with IL-10 and antibodies that induce ADCC
EP3302547A1 (en) 2015-05-28 2018-04-11 Armo Biosciences, Inc. Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer
WO2017048614A1 (en) * 2015-09-15 2017-03-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of isolating tumor-reactive t cell receptors from tumor or peripheral blood

Also Published As

Publication number Publication date
JP7082051B2 (ja) 2022-06-07
EP3402512A4 (en) 2019-09-25
JP2019506843A (ja) 2019-03-14
MX2018007295A (es) 2019-03-28
WO2017123557A1 (en) 2017-07-20
US11814679B2 (en) 2023-11-14
CN108697776A (zh) 2018-10-23
EP3402512A1 (en) 2018-11-21
US20190032134A1 (en) 2019-01-31
AU2017207282A1 (en) 2018-07-05
CA3008287A1 (en) 2017-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11814679B2 (en) Interleukin-10 production of antigen-specific CD8+ T cells and methods of use of same
US10195274B2 (en) Method of modulating a chimeric antigen receptor t cell immune response by administering IL-10
EP3068425B1 (en) Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
JP2016519108A (ja) インターロイキン−１０を疾病及び疾患の治療に用いる方法
CA2963995A1 (en) Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
CN113286609A (zh) 多聚体t细胞调节多肽及其使用方法
JP2021501221A (ja) 免疫チェックポイント経路阻害剤と併用したインターロイキン−１０の組成物および使用方法
JP5189094B2 (ja) 無差別ｐａｐｃｄ４ｔ細胞エピトープ
EP3810189A1 (en) Compositions and methods of use of il-10 agents in conjunction with chimeric antigen receptor cell therapy
KR20180038553A (ko) 질환 및 장애를 치료하기 위한 인터류킨-10을 사용하는 방법
US20190307849A1 (en) Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
JP2019505493A (ja) 疾患及び障害を治療するためにインターロイキン１０を使用する方法