PT87332B

PT87332B - Metodo de purificacao de produto de expressao de levedura recombinante

Info

Publication number: PT87332B
Application number: PT87332A
Authority: PT
Original assignee: Univ New York
Priority date: 1987-03-30
Filing date: 1988-04-26
Publication date: 1992-07-31
Also published as: AU1593688A; EP0309555A1; PT87332A; JPH01503514A; ZA882272B; WO1988007546A1; AU617668B2; NZ224086A; EP0309555A4; PT87137A; IL85905A0; PT87137B; ES2009587A6

Description

Método de purificação do produto de ex, pressão de levedura recombinante para que

NEW YORK UNIVERSITY e CHIRON CDRPORATION, pretendem obter privilégio de invenção em Portugal.

RESUMO invento refere-se ao método de purificação de um polipéptido consistindo essencialmente numa sequência de aminoácidos que consiste essencialmente em pelo menos duas sequências repetidas em tandem, idênticas às da região do epítopo imunod_o minante da proteína CS de esporozoíto do P. vivax, a partir de uma preparação impura do referido polipéptido, contendo também a referida preparação impura, como impurezas, um ou mais outros tipos de proteína, caracterizado por compreender os seguintes passos:

(a) submeter a referida preparação a uma temperatura de 1002C durante um período de tempo suficiente para provocar a desnaturação e precipitação do volume das referidas impurezas proteicas, deixando no entanto o referido polipéptido em solução,* (b) remover e rejeitar o referido precipitado e conservar o sobrenadante;

(c) separar do referido sobrenadante os constituintes sólidos;

(d) redissolver os referidos constituintes sólidos numa solução aquosa tamponada, iónica;

(e) submeter a referida solução a cromatografia de permuta iónica numa primeira coluna de cromatografia fazendo as67 664

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-2sim com que o referido polipêptido fique retido na referida coluna ao mesmo tempo que uma parte das impurezas restantes do referido polipêptido são expulsas no efluente, e eluição do referido polipêptido usando um gradiente iónico;

(f) diminuir a força ifinica do referido eluente contendo o referido polipêptido;

(g) submeter o referido eluente a uma cromatografia com peneiro molecular, numa segunda coluna de cromatografia, e eluir o referido polipêptido da referida coluna.

)

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-3MEMORIA descritiva

Este pedido de Patente ê uma continuação em parte, do pedido de Patente copendente U.S, N3. de série 754 645, depos_i tado em 9 de Culho de 1985 em nome de Arnot, D.E. e col., e pe dido de PCT co-pendente N2« U.S. 86/01373 depositado em 24 de Cunho de 1986, ambos atribuídos à Neiu York University. Ambos estes pedidos estão aqui incorporados como referência.

Campo do Invento

Este invento refere-se a um método para purificar um polipéptido imunogénico expresso por uma levedura recombinante e compreendendo uma sequência aminoácida incorporando uma porção da proteína de superfície da fase de esporozoíto do ciclo de vida do P. Vivax (CS) incluindo a região do epítopo imunodominante de repetição da dita proteína.

As propriedades imunogénicas da proteína CS do P, vivax e, em particular, as de uma subsequência desta proteína foram já descritas no Pedido de Arnot e col. acima identificado e em Arnot, D.E. e col. Science 230:815-818, 1985 (também incorpora do como referência).

De facto, o gene CS do P, vivax, completo, foi identificado e a sua sequência descrita nos documentos acima mencionados. Como aqui descrito, a proteína CS do P. vivax compreende uma região central de 19 repetiçães em tandem da sequência:

Asp-Arg-Ala-Asp/Ala-Gly-Gln-Pro-Ala-Gly ou, noutro sistema de notação

DRAD/AGQPAG

Esta região contém o epítopo imunodominante de repetição da proteína CS do P. vivax.

(A correspondência entre os dois sistemas de notação é a seguinte: A = alanina, C = cisteína, D = ácido aspártico,

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-4E = ácido glutàmico, F = fenilalanina, G = glicina, H = histidina, I = isoleucina, K = lisina, L = leucina, M = metionina, N = asparagina, P = prolina, Q = glutamina, R = arginina, S = serina, T = treonina, V = valina, W = triptofano, e Y = ti rosina).

Os péptidos sintáticos consistindo essencialmente de 18 resíduos de aminoácidos (i.e. duas repetições da sequência de repetição anterior e suas permutações cíclicas -- tal como Asp-Gly-Gln-Pro-Ala-Gly-Asp-Arg-Ala) são reconhecidos pelos ari ticorpos da proteína CS nativa do P. vivax e por sua vez geram anticorpos (quando injectados em mamíferos) os quais reconhecem e se ligam à proteína CS nativa. Em consequência, tais péptidos têm utilidade numa vacina contra a malária.

Uma abordagem possível na produção de uma vacina contra a malária por P. vivax seria sintetizar péptidos imunogénicos que incluem uma sequência correspondente à do epítopo imunodominante da proteína CS do P. vivax (i.e. contendo uma, e de pre ferência, duas ou mais repetições). No entanto, no caso do P. vivax devido à sequência da unidade de repetição da proteína CS ser bastante longa (em contraste com a do P, falciparum) a síntese peptidica clássica não pode ser usada de forma segura. 0 uso de técnicas de síntese clássicas para fazer péptidos mais compridos é especialmente inconveniente quando praticada em grande escala, como seria necessário na preparação de uma vacina contra a malária que seria distribuída a milhões de pessoas em todo o mundo.

Além disso, seria necessário ligar o péptido sintetizado a uma molécula maior que desempenharia o papel de transportador ou de adjuvante. Adicionalmente, na maior parte dos casos, apenas uma pequena proporção de anticorpos para um péptido sin tético, reconheceriam a mesma sequência na proteína nativa. Is. to é, mesmo que o péptido sintético ligado a uma proteína trans. portadora mostre ser imunogénico, a maior parte dos anticorpos produzidos podem não mediar a imunidade protectora contra o pja togene. Relacionado com isto, o péptido sintético (NANP)j, o qual é um candidato para a preparação de uma vacina contra o

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-5P. falciparum, é excepcional uma vez que pelo menos 70% dos a_n ticorpos anti-péptido reconhecem os esporozoítos da malária. A explicação para este facto pouco usual é, provavelmente, que o péptido (NANP)^ contém muitas prolinas (P) e asparaginas (n), aminoácidos que são frequentemente encontrados em ordens inve_r sas da molécula da proteína. Talvez, neste caso, uma configura ção preferida de (NANP)^ em solução mimetize a da mesma sequêji cia na proteína CS nativa.No entanto, da análise da sequência de aminoácidos das repetições de P. vivax, não parece provável que um péptido do P.vivax se comporte sernelhantemente a (NANP)^ .

Por estas razães pensou-se numa técnica alternativa para a manufactura de um péptido imunogénico que poderia ser usado numa vacina contra a malária por P. vivax. Ds inventores pensaram em técnicas de ADN recombinante e de engenharia genética para expressar polipéptidosimunogénicos que poderiam ser usados para conferir imunidade a mamíferos contra a malária por P. vivax.

Embora a tecnologia estivesse facilmente disponível para a construção de bactérias recombinantes que expressariam uma parte ou toda a sequência de aminoácidos de repetição da proteí. na de P. vivax, os inventores procuraram um sistema de expressão alternativo pelas seguintes razães:

Em primeiro lugar, o sistema de expressão deveria ser sje guro e capaz de produzir o polipéptido de interesse de forma consistente e com um rendimento elevado. As bactérias podem ser difíceis de manusear quando produzidas em cultura maciça, e expressarem ainda um produto proteico estranho.

Em segundo lugar, e mais importante, os produtos de expressão das bactérias são frequentemente difíceis de purificar das impurezas pirogénicas e de outros agentes inflamatórios e tóxicos que também são co-expressos pelas bactérias,ou são necessários aditivos para o meio de crescimento bacteriano.

Em terceiro lugar, os produtos de expressão das bactérias são, na maior parte dos casos, proteínas de fusão, isto é, contêm sequências não relevantes adicionais originadas pelos

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-6genes associados à bactéria.

Os inventores pensaram nos sistemas de expressão em lev_e duras que têm sido substancialmente melhorados por avanços recentes no campo da tecnologia do ADN recombinante. As leveduras são organismos mais resistentes do que as bactérias e muito mais fáceis de cultivar em cultura maciça. Além disso, avanços recentes na genética e clonação das leveduras, aumenta ram os rendimentos dos sistemas de expressão em leveduras.

A purificação dos produtos de expressão dos sistemas de leveduras recombinantes não é, à priori, mais complicada do que a purificação de produtos dos sistemas recombinantes bacterianos e depende principalmente das características da proteína particular que se pretende purificar. Contudo, esta purificação é geralmente mais complicada do que a de um péptido ou pro teina produzidos por técnicas de sínteses de péptidos clássicas.

Os inventores escolheram um sistema de expressão em levjs dura geral que é □ objecto do pedido de patente EU NS. de Série 868 639, depositado em 29 de Maio de 19Θ6 em nome de R.L. Burke e col. e transmitido a Chiron Corporation. Este pedido é incorporado aqui como referência. Escolheu-se uma parte do gene de P. vivax (para incorporação nos organismos das leveduras) que incluía a sequência repetida em tandem completa mais outro segmento precedendo a região de repetição (quando a sequência é lida do N terminal para o C terminal). Este segmento incluiu uma sequência que se apresenta altamente conservada em todas as espécies da malária, e^j^ mostrou ser imunogénica por si própria (ver pedido de Patente E.U. N9. de Série 649 903 de V. Nussenzu/eig e col. depositada em 18 de Setembro de 1984, cedida à New York University e aqui incorporado como referência).

Dbjectos do Invento

Assim, constitui um objecto do presente invento purificar um polipéptido imunogénico, obtido em leveduras por engenharia genética, imunoquimicamente reactivo com anticorpos monoclonais contra a proteína de superfície da fase de esporo67 664

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-7zoíto do ciclo do vida do P. vivax (CS), e útil na preparação de uma vacina contra a malária e em particular proporcionar um método de purificação que possa ser praticado em larga escala e com um rendimento elevado.

Constitui um outro objecto do presente invento proporcio nar um método para purificar o polipéptido construído em levedura, já mencionado, a partir de uma sua preparação impura com preendendo material celular em levedura e meios de cultura de levedura lisados.

Estes e outros objectos do invento serão evidentes para os peritos da técnica tendo em conta a presente especificação, reivindicaçães e desenhos anexos.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 é um diagrama da construção do vector de expressão em levedura usado no presente invento.

A Figura 2 é um mapa do plasmideo de levedura pAB24.

A Figura 3 é um gel de poliacrilamida obtido usando lisados de levedura transformada com pAB24/P. vivax e levedura controlo.

A Figura 4 é uma análise Western de lisados da levedura transformada como vector pAB24/P. vivax.

A Figura 5 é um gráfico (a) do perfil da densidade éptica do material purificado de acordo com o invento (linha a cheio); (b) da conductividade do tampão de eluição (linha a cheio-pontos a preto); e (c) actividade percentual das fracçães aluídas na inibição da ligação do anticorpo à proteína CS nativa.

A Figura 6 é uma auto-radiografia de um gel SDS-PAGE demonstrando a pureza do polipéptido construído quando feito e purificado de acordo com o presente invento.

A Figura 7 é uma auto-radiografia de um gel de focagem isoeléctrica apresentando o polipéptido construído do presente invento.

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-ΘΑ Figura 8 é uma curva padrão para um radioimunoensaio competitivo e mostra a inibição da ligação do polipêptido CS marcado, obtido por engenharia genética, aos anticorpos anti -proteína CS do P, vivax pela presença do polipêptido obtido por engenharia genética, não marcado, do presente invento.

A Figura 9 ê um gráfico de quantidade de IgG anti-rato de cabra radiomarcada que reconhece anti-soros de rato ligados ao polipêptido CS obtido por engenharia genética, como uma fun ção da diluição do soro de rato.

A Figura 10 é um gráfica da ligação de anti-soros de rato marcados (desenvolvidos contra o péptido construído) ao pépti do CS de vivax com 18 aminoácidos (repetição) sintético, imobilizado, em função da concentração de anticorpos.

A Figura 11 é um gráfico da inibição, pelo péptido de re petição CS vivax sintético, da ligação de anti-soros de rato ao polipêptido CS construído, imobilizado, preparado e purificado de acordo com o presente invento em função da concentração do péptido (inibidor) sintético.

A Figura 12 ê um gráfico da ligação de anti-soros de rato ao péptido não repetido, sintético, imobilizado, em função da diluição de anti-soros.

Sumário do Invento

Este invento refere-se a um método para purificar um péptido ou polipêptido, possuindo uma sequência aminoácida consistindo essencialmente de pelo menos duas sequências de repetição em tandem idênticas às da região do epítopo imunodominante da proteí. na CS do P. vivax, a partir de uma preparação impura do referi, do polipêptido, contendo também como impurezas uma ou mais outras espécies de proteínas, compreendendo o referido método os passos de:

(a) submeter a referida preparação a uma temperatura de 1002C durante um período de tempo suficiente para provocar a desnaturação e precipitação do volume das referidas impurezas

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-9proteicas, deixando no entanto o referido polipéptido em solu, ção;

(b) remover e rejeitar o referido precipitado e conservar o sobrenadante5 (c) separar do referido sobrenadante os constituintes sólidos;

(e) submeter a referida solução a cromatografia de permuta iónica numa primeira coluna de cromatografia fazendo assim com que o referido polipéptido fique retido na referida co luna ao mesmo tempo que uma parte das impurezas restantes do referido polipéptido são expulsas no efluente, e eluição do re ferido polipéptido usando um gradiente iónico;

(f) diminuir a força iónica do referido eluente contendo o referido polipéptido;

(g) submeter o referido eluente a uma cromatografia com peneiro molecular, numa segunda coluna de cromatografia, e eluir o referido polipéptido da referida coluna.

Descrição detalhada do Invento gene CS de P. vivax é apresentado a seguir (juntamente com a sequência de aminoácidos para a qual ele codifica) cTerminal ATGAAGAACTTCATTCTCTTGGCTGTTTCTTCCATCCTGTTGGTGGACTTG

MKNFILLAVSSILLVDL

TTCCCCACGCACTGCGGGCACAATGTAGATCTGTCCAAGGCCATAAACTTAAATGGAGTAAAC

FPTHCGHNVDLSKAINLNGVN

TTCAATAATGTAGACGCCAGTTCACTTGGCGCGGCACACGTAGGACAAAGTGCTAGCCGAGGCAG

FNNVDASSLGAAHVGQSASRGR

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-10AGGCCTTGGCGAGAACCCAGATGACGAGGAAGGAGATGCTAAAAAAAAAAAGGATGGAAAGAAA

GLGENPDDEEGDAKKKKDGKK

CCAGAACCAAAAAATCCACGTGAAAATAAGCTGAAGCAACCAGGAGACAGAGCAGATGGACAGC

AEPKNPRENKLKQPGDRADGQ

CAGCAGGAGACAGAGCAGATGGACAGCCAGCAGGTGATAGAGCAGATGGACAACCAGCAGGAGA

PAGDRADGQPAGDRADGQPAGD

TAGAGCAGCTGGACAACCAGCAGGAGATAGAGCAGATGGACAGCCAGCAGGAGACAGAGCAGAT RAAGQPAGDRADGQPAGDRAD

GGACAGCCAGCAGGAGACAGAGCAGATGGACAACCAGCAGGAGACAGAGCAGATGGACAACCAG

GQPAGDRADGQPAGDRADGQP

CAGGTGATAGAGCAGCTGGACAACCAGCAGGTGATAGAGCAGCTGGACAACCAGCAGGAGATAG

AGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDR

AGCAGATGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGATGGA ADGQPAGDRAAGQPAGDRADG

CAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGATGGACAGCCAGCAG qpagdraagqpagdradgqpa

GAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGC

GDRAAGQPAGDRAAGQ PAGDRA

AGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAAATGGTGCAGGTGGACAG

AGQPAGDRAAGQPAGNGAGGQ

GCAGCAGGAGGAAACGCAGGAGGACAGGGACAAAATAATGAAGGTGCGAATGCCCCAAATG

AAGGNAGGQGQNNEGANAPN

GAAAGTCTGTGAAAGAATACCTAGATAAAGTTAGAGCTACCGTTGGCACCGAATGGACTCCATG

EKSVKEYLDKVRATVGTEWTPC

CAGTGTAACCTGTGGAGTGGGTGTAAGAGTCAGAAGCAGAGTTAATGCAGCTAACAAAAAACCA

SVTCGVGVRVRSRVNAANKKP

GAGGATCTTACTTTGAATGACCTTGAGACTGATGTTTGTACAATGGATAAGTGTGCTGGCATAT

EDLTLNDLETDVCTMDKCAGI

TTAACGTTGTGAGTAATTCATTAGGGCTAGTCATATTGTTAGTCCTAGCATTATTCAATTAA FNVVSNSLGLVILLVLALFN erminal C_7 fragmento de ADN escolhido para inserção no hospedeiro levedura foi:

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-11GCAGAACCAAAAAATCCACGTGAAAATAAGCTGAAGCAACCAGGAGACAGAGCAGATGGACAGC AEPKNPRENKLKQPGDRADGQ

CAGCAGGAGACAGAGCAGATGGACAGCCAGCAGGTGATAGAGCAGATGGACAACCAGCAGGAGA pagdradgqpagdradgqpagd TAGAGCAGCTGGACAACCAGCAGGAGATAGAGCAGATGGACAGCCAGCAGGAGACAGAGCAGAT raagqpagdradgqpagdrad

GGACAGCCAGCAGGAGACAGAGCAGATGGACAACCAGCAGGAGACAGAGCAGATGGACAACCAG gqpagdradgqpagdradgqp CAGGTGATAGAGCAGCTGGACAACCAGCAGGTGATAGAGCAGCTGGACAACCAGCAGGAGATAG AGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDR AGCAGATGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGATGGA ADGQPAGDRAAGQPAGDRADG CAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGATGGACAGCCAGCAG QPAGDRAAGQPAGDRADGQPA GAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGC GDRAAGQPAGDRAAGQPAGDRA AGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAAATGGTGCAGGTGGACAG agqpagdraagqpagngaggq GCAGCAGGAGGAAACGCAGGAGGACAGGGACAAAATAATGAAGGTGCGAATGCCCCAAATG

AAGGNAGGQGQNNEGANAPN AAAAGTCTGTGAAAGAATACCTAGATAAAGTTAGAGCTACCGTTGGCACCGAATGGACTCCA EKSVKEYLDKVRATVGTEWTP

Este fragmento inclui a sequência de repetição em tandem completa mais ^^m^?egião que está substancialmente paralela à Re. gião I de Dame e col., Science 225:628 (1984) que precede a re gião de repetição e que codifica a sequência de aminoácidos AEPKNPRENKLKQPG.

Esta sequência inclui a subsequência K L K Q P que está mantida em todas as espécies de malária que foram até agora ijn vestigadas.

fragmento de ADN atrás mencionado foi obtido a partir do gene completo subclonando um fragmento BglII com 15 kb isolado como descrito por Arnot e col. (Pedido de Patente E.U. NQ. de Série 754 645 e Science 230:815-818, 15 de Novembro de 1985 ambos incorporados como referência). Foi então inserido no ADN do plasmideo de levedura modificado pAB24 como descrito a seguir no Exemplo 1.

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-12Para a expressão do antigénio do CS do P. vivax em levedura, utilizou-se um promotor híbrido compreendendo a glicerajL deído-3-fosfato desidrogenase, de levedura, forte, e o promotor de álcool desidrogenase-2 (ADH-2) regulável pela glucose. A fusão deste promotor com genes heterólogos permite o crescimejn to de culturas de levedura com elevada densidade, usando a glju cose como uma fonte de carbono. A deplecção da glucose nos meios,durante o crescimento fermentativo, conduz à concomitante indução da expressão da proteína heteróloga. A incorporação do plasmideo em plasmideos de levedura, que se replicam au tonomamente, com elevado número de cópias, e,a transformação das células de levedura gerou estirpes que são capazes de exprimir proteínas CS com níveis elevados, aquando da indução.

Desenvolveu-se a levedura por cultura em meio YEP (1% p/v de extracto de levedura, peptona a 2/) com glucose a 1/ como descrito a seguir no Exemplo 1. Obtiveram-se assim duzen tos litros de material levedura e armazenaram-se a -8Oec.

material de levedura assim obtido continha uma mistura complexa de diferentes proteínas de levedura bem como aditivos do meio de cultura. A electroforese em gel deste material, num gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio a 7,5$ deu uma indicação da sua heterogeneidade (ver Fig, 6 faixa 1). 0 procedimento de expressão e a construção do plasmideo estão sublinhados na Figura 1 e descritos no exemplo 1 a seguir.

Observou-se que todos os anticorpos da proteína CS de P. knouilesi reconheceram a região do epítopo imunodominante dBSta proteína, mesmo depois da proteína CS ter sido aquecida a 1009C durante 30 minutos ou submetida a desnaturação completa por tratamento com guanidina 6M e com [b -mercapto-etanol a 1% (Gysin, 3., e col. 3. Exp. Med. 160:935, 1984; Godson, G. N., e col., Nature 305^29. 1983).

Esta observação referia-se à proteína CS do P, knomlesi, completa,e de modo nenhum estabelecia que a proteína CS do P. vivax poderia apresentar comportamento semelhante após aquecimento, ou que os seus fragmentos, consistindo essencial67 664

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-13mente no polipéptido aqui empregue e abrangendo a região do epítopo permaneceriam reactivos imunoquimicamente com os anticorpos anti-proteína CS do P. vivax, após terem sido submetidos a condições de aquecimento que normalmente resultam na des. naturação das proteínas. Outro facto imponderável, foi, no presente invento o fragmento da proteína CS ter sido misturado com quantidades muito grandes de materiais não relevantes. 0 aquecimento da mistura pode conduzir à formulação de agregados com outros polipéptidos e a mascaramento dos epítopos e/ou co-precipitação. Também não se sabia se tais fragmentos continuariam a ser imunogénicos após terem sido submetidos ao tra^ tamento de aquecimento acima.

Apesar de tudo, os inventores usaram um passo de aquecimento como passo inicial da purificação do polipéptido CS do P. vivax obtido por engenharia em leveduras. (Quando usado neste pedido de Patentepolipéptido” referir-se-à a um fragmejn to de proteína relativamente longo, proteína referir-se-à a uma proteína completa e péptido referir-se-à a um péptido re lativamente curto, p.e. um contendo 30 resíduos de aminoácidos ou menos. Em relação ao uso da palavra sequência entender-se-à que polipéptidos e péptidos, de acordo com o presente i_n vento, serão funcionalmente equivalentes se tiverem a mesma s_e quência quer a sequência seja apresentada do terminal N para o C, quer do terminal C para o N).

A mistura foi então submetida a aquecimento a 10QQC, que resultou numa precipitação maciça do material de células de lj? vedura lisadas. Separou-se, secou-se e 1iofilizou-se o sobrenadante. 0 resíduo do sobrenadante liofilizado mostrou um melhoramento substancial em pureza em relação ao extracto de levedura (ver Fig. 6 faixa 4).

Uma solução do material liofilizado foi mais purificada sequencial mente por (a) cromatografia de permuta aniénica usari do um gradiente de electrélito para eluir o polipéptido CS construído; e (b) cromatografia com peneiro molecular.

As fracçães possuindo actividade do polipéptido CS foram identificadas com um radio-imunoensaio. Uma pequena quantidade

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-14do material de levedura muito purificado foi radio-marcado pa125 ra apresentar uma elevada actividade específica com I. Cada fracção foi testada por um radio-imunoensaio clássico em re lação à sua capacidade para inibir a ligação do material marca do com anticorpo monoclonal anti-P. vivax, imobilizado, dirig_i do contra o epítopo repetitivo da proteína CS de P. vivax.

A maior vantagem do processo de purificação do presente invento é a sua simplicidade e a sua fácil adaptabilidade à grande escala. 0 polipéptido CS de P. vivax, construído, assim purificado é homogéneo por SDS-PAGE e por focalização isoeléctri. ca e espera-se assim que esteja substancialmente isento de impjj rezas tóxicas e inflamatórias, pirogénicas, que podem ter esta do associadas com material de células de levedura e meios de cultura de leveduras lisados.

rendimento da combinação do procedimento de expressão em levedura e do processo de purificação, do presente invento, mostrou ser de 13 mg de polipéptido CS puro por litro de cultu ra de levedura. Dado que se produziram 200 litros desta cultu ra em três dias usando equipamento à escala piloto (fermentador de 250 litros), é evidente que se podem obter num curto pje ríodo de tempo grandes quantidades do polipéptido CS construído.

Um extracto obtido a partir de 200 litros de caldo de l.e vedura contém polipéptido CS construído suficiente para imunizar cerca de 25 000 seres humanos contra o P. vivax usando 100 microgramas de polipéptido por pessoa.

As principais vantagens do polipéptido CS produzido de acordo com o presente invento consistem em que o péptido construído:

(a) pode ser produzido em grande escala sem impurezas e sem antigénios não relevantes;

(b) representa um fragmento grande da molécula de CS na tiva;

(c) mostrou ser altamento imunogénica em roedores, usaji do hidróxido de alumínio como adjuvante;

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5986/23992-PG (d) os anticorpos que são produzidos reagem quer com as repetições quer com a região conservada da molécula de CS.

Anticorpos contra as repetições mostraram neutralizar muito eficazmente a infecciosidade dos parasitas. Os anticorpos contra um péptido contendo esta região conservada também neutralizaram a infecciosidade dos parasitas, mas não se pode quantificar rigorosamente a actividade inibidora (l/ergara, e col., 3, Immunol. 134;3445-3448, 1985). Além disso, o facto da sequência KLKQP, que faz parte do péptido, estar presente em todas as proteínas CS, sugere que esta região tem uma função importante.

presente invento é descrito a seguir em detalhe por meio de exemplos específicos que ilustram o invento sem limitar o seu âmbito.

EXEMPLO 1: Restrição do gene da CS de P. vivax, ligação num vector, transformação das células de levedura hojs pedeiras e expressão

Na descrição que se segue, todas as enzimas e endonucle.a ses de restrição estão disponíveis comercial mente em Pharmacia Fine Chemical Co. , (Piscataiuay, N.3.), Neui England Biolabs (Beverley, MA), Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) ou Bethesda Research Laboratories, Inc. (Gaithersburg, MD) e são usados de acordo com as instruções do fabricante.

Um vector pUC9 (Pharmacia Fine Chemical Co. , Piscataiuay, N3) contendo o gene da proteína CS de P. vivax foi derivado subclonando um fragmento BglII com 15 kb inserido nos locais BamHI do EMBLIII, um vector do bacteriófago lambda (como divul. gado em Arnot e col., pedido de Patente E.U. ΝΘ. de Série 754 645, e incorporado como referência). 0 clone pUC9Ci foi d_i gerido com BglII e XBal e purificado em gel para obter um fragmento de 4,1 kb codificando todas as sequências de repetição (Arnot e col., Science 230:815-818, 1985, incorporado como referência). Este fragmento purificado em gel foi em seguida di gerido com Fokl e Bani e ligado aos ligantes sintéticos 5’-fos_ forilados seguintes, sintetizados pelo método da fosforamidita

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-16utilizando sintetizadores 380A DNA de Applied Biosystems.

I CCTTGGAACCATGG

GGAACCTTGGTACCGTCT

Ncol Complementarmente à saliência Fokl

II GCACCGAATGGACTCCATAG ____GCTTACCTGAGGTATCCAGCT

Bani Sall

Ligante I proporciona um local Ncol enquanto que o Ligante II proporciona uma saliência Sall.

fragmento contendo o ligante foi digerido com Ncol e Sall, isolado por electroforese em gel e clonado no pBSIOO digerido com Ncol/Sall (construção descrita a seguir). 0 plasmí deo resultante foi designado por pAG/P.vivaxl. 0 pBSIOO é um plasmideo derivado do pBR322 contendo o promotor (1200 pb) GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) regulado por ADH-2, e o terminador (900 pb) GAPDH (ver Figura 1) e a sua construção é descrita a seguir.

A parte ADH-2 do promotor, foi construída por corte de um plasmideo contendo o gene ADH-2 do tipo selvagem (plasmideo pADR2, ver Beier e Young, Nature, 300:724-728, (19B2), incorp£ radc como referência) com a enzima de restrição EcoR5 que efectu a o corts na posição +66 em relação ao codão de início ATG, bem como em outros dois locais do pADR2, fora da região ADH-2. A mistura resultante de um fragmento do vector e de dois fragmeri tos mais pequenos, foi digerida com exonuclease Bal31 para remover cerca de 300 pb. Sintetizaram-se quimicamente e ligarajn -se a um ADN tratado com Bal31, ligantes sintéticos Xhol tendo a sequência

CCTCGAGG GGAGCTCC fragmento vector de ligante e ADN resultante (cerca de 5 kb) foi separado dos ligantes por cromatografia em coluna (em Sepharose CL4B de Pharmacia), cortado com a enzima de restrição Xhol, religado e usado para transformar a E. coli de mo

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-17do a ser resistente à ampicilina. As posições das adições de ligante Xhol foram determinadas por sequenciação do ADN, usando técnicas padrão bem conhecidas na técnica. Um plasmideo, que continha o ligante Xhol localizado na região não-transcrita 5', do gene do ADH-2 (posição -232 em relação a ATG), foi cortado com a enzima de restrição Xhol, tratado com nuclease 51, específica, de cadeia simples e, subsquentemente, tratado com a enzima de restrição EcoRI de modo a criar uma molécula vector, linear, tendo uma extremidade romba no local do ligante Xhol, e uma extremidade EcoRI.

A parte GAP do promotor foi construída cortando o plasmí deo pPGAP (como divulgado no Pedido de Patente Europeia ηθ. 164 556 de Chiron Corporation, depositado em 3 de Maio de 1985, incorporado como referência e de acordo com o cor respondente pedido E.U. n9. de série 609 540, depositado em 11 de Maio de 1984), com as enzimas BamHI e EcoRI, seguindo-se o isolamento do fragmento de ADN de 0,4 kpb. 0 plasmideo pPGAP é um plasmideo de levedura contendo as sequências, promotora e terminadora, GAPDH em levedura flanqueada pelos locais dos endonucleases de restrição Ncol e Sall. 0 fragmento purificado é parcialmente digerido com a enzima Alui, para produzir uma extremidade romba próximo do local BamHI, e usado para construir o plasmideo p3S104.

plasmideo p0S104 foi construído por ligação do fragmeri to promotor GAP AluI-EcoRI ao fragmento ADH-2 presente no vector linear anteriormente descrito.

fragmento promotor ADH-GAP BamHI-Ncol foi obtido a par, tir do plasmideo pJ5103, que é igual ao pJS104 (acima) excepto por o fragmento GAP do promotor ADH-GAP ter cerca de 200 pb no p3S103 e 400 pb no p3S104. A construção do pJS103 foi igual à do p3S104 excepto por o fragmento BamHI-EcoRI com 0,4 kb ter s_i do completamente digerido com Alui (em vez de parcialmente digerido, como no pJS104) e isolou-se um fragmento de 200 pb.

Toda a região acima contendo o promotor, segmento de P. vivax e terminador, (daqui em diante denominado cassete de expressão) foi excisada por digestão com BamHI, purificada por

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-18electroforese em gel e clonada em pAB24, digerido com BamHI. Está apresentado na Figura 2 um mapa de restrição deste plasm,! deo.

pAB24 é um vector de expressão em levedura (Fig. 2) o qual contém as sequências 2 mu completas necessárias para uma replicação autónoma na levedura (Broach, em: Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1,:445, Cold Spring Harbor Press, 1981) e nas sequências pBR322. Contém também o gene da levedu ra URA3 derivado do plasmideo YEp24 (Botstein, e col., Gene (1979) .8:17 aqui incorporado como referência) e o gene da lev.e dura LEU2^d derivado do plasmideo pCl/1 (ver Pedido de Patente Europeia N9. de Série 116 201 depositado em 22 de Agosto de 1984, no nome de Chiron Corporation, incorporada como referência). A inserção da cassete de expressão foi efectuada no local BamHI do pBR322, interrompendo assim o gene para a resistência bacteriana à tetraciclina.

Expressão de proteinas CS do P. vivax

A estirpe AB110 de Saccharomyces Cerevisiae isolada por Chiron Corporation (Mat, leu2-04, ou ambos leu2-3 e leu2-112, pep4-3, his4-580, cir°) foi transformada com pAB24/£. vivax 1-5 de acordo com Hinnen, e col., Proc. Natl. Açad. Sei. USA 75:1929-1933 (197Θ). As colónias de um único transformante contendo vectores regulados por GAP foram cultivadas em 2 ml de meios sei ectivos leu~ (deficiente em leucina) até à fase log tardia ou até à fase estacionária. Apenas leveduras contendo plasmideo podem crescer neste meio. As culturas foram subsequentemente diluídas a 1:20 (v/v) em YEP (extracto de levedura a 1% p/v, peptona a 2/ p/v) com 1/ de glucose e cultivadas até saturação (cerca de 36 h), neste meio. As células foram Usadas na presença de sulfato de dodecilo e sódio (SDS) e ditiotreitol (DTT) e os lisados foram clarificados por centrifugação. Os lisados límpidos foram submetidos a electroforese em gel de poliacrilamida (Laemmli, II.K., Nature, 227:680. 1970). Após coloração com azul de Comassie, observou-se nos extractos dos transformantes contendo o plasmideo de P. vivax (Figura 3) uma banda pesada de cerca de 38K0. Esta banda foi detectada

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-19nas células transformadas com o vector de expressão, estando ausente nos extractos de células contendo os plasmídeos de controlo (pCl/1). A proteína de fusão representa mais de 10% da proteína celular total. A razão da migração celular anormal (38 KD versus 23 KD previsível da construção do ADN) pode ser atribuível à ligação anormal do SDS, como previamente referido em relação às proteínas CS de P. knomlesi (Ozaki e col., Cell .34:185, 1983), devido, provavelmente, à baixa proporção de resíduos hidrofóbicos.

Para confirmar a identidade da banda de 38 KD, as protejE nas sintetizadas pela levedura foram também submetidas a análi. se Western.· Os lisados de levedura clarificados, preparados como descrito acima foram submetidos a electroforese em geles de poliacrilamida (Laemmli, supra) e as proteínas foram subsequentemente submetidos a electroblot sobre filtros de nitrocelulose (Touibin, e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 3450, 1979). 0 filtro foi pré-incubado durante 1 h com 1% (OSA) em

PBS e tratado subsequentemente com um anticorpo monoclonal para a proteína CS do P. vivax, durante 12 h a 42C. Os filtros foram lavados com BSA/PBSal%e adicionou-se um segundo antico_r po anti-rato de cabra conjugado com peroxidase de rábano (Bio Rad Laboratories, Richmond, Califórnia). Finalmente, os filda tros foram incubados com reagente revelador da cor/peroxidase de rábano (Bio-Rad Richmond, CA) e lavados. A análise Western mostrou que a proteína de fusão reagiu com os anticorpos monoclonais (Fig. 4).

EXEMPLO 2: Purificação de polipéptido do circum-eSporozoíto do Plasmodium vivax

As culturas de levedura exprimindo uma parte do polipéptido CS foram preparadas como no Exemplo 1. 0 polipéptido expresso consistia de 234 aminoácidos incluindo todo o domínio de repetição e uma região conservada, nomeadamente a Região I de Dame, 3. B., e col., Science 225:628 (1984). 0 aminoácido

N-terminal do polipéptido expresso é a alanina nas posições nucleótidas N5. 385-7 (GCA) e o aminoácido C-terminal é a pro67 664

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-20lina nas posições nucleótidas NQ. 1084-1086 (CCA); Arnot e col., Science 230:815-818, 1985. 0 primeiro passo da purifica ção do fragmento de péptido expresso pela levedura consistia em submeter os extractos a temperaturas de 100SC. A purificação foi efectuada da seguinte forma:

Os extractos de levedura pelotizados, a partir de 20 litros de cultura de levedura, foram preparados num batedor de esferas, diluindo a levedura num volume igual de tampão de fo.s fato de sódio 0,1 M, pH 7,3, 0,l/o de Triton-X, EDTA 1 mM, PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) 1 mM e 1 micrograma por ml de pepstatina. 0 extracto (370 ml) foi adicionado a 200 ml de água fervente contendo PMSF 1 mM e 1 micrograma/ml de leupeptina. A mistura foi levada a uma temperatura de 100SC e mantida durante dez minutos com agitação constante a esta tempe^ ratura. A mistura foi arrefecida para 02C e centrifugada a 18 000 rotaçães por minuto, numa ultracentrífuga Rotor TI-19 de Beckman (Beckman Instruments, Paio Alto, CA) durante quinze minutos. 0 sobrenadante foi removido e depois liofilizado.

material seco foi dissolvido em 120 ml de água, centra, fugado para remover uma pequena quantidade residual de material insolúvel, dialisado extensivamente contra água destilada, durante 48 horas, e novamente liofilizado. 0 pó foi dissolvido em tampão fosfato de sódio e potássio 3 mM pH 7,5, e a conductividade foi ajustada com água para 0,58 mS. A solução foi centrifugada para remover os materiais insolúveis e submetida a cromatografia de permuta aniónica numa coluna DEAE-Sephacel (Pharmacia Fine Chem. Co., Piscataway, N.3.) (5 cm x 24 cm) equilibrada no mesmo tampão. O caudal foi ajustado para 100 ml por hora e recolheram-se 21 ml por tubo. A colu. na foi então lavada com 500 ml do mesmo tampão, i.e., com um volume de cerca de uma coluna. A eluição foi continuada com um tampão formado num gradiente linear no qual 1.500 ml do tam pão inicial foram gradualmente misturados com 1500 ml do mesmo tampão contendo também NaCl 0,75 Μ. A presença do polipéptido CS nas diversas fracções eluindo a partir da coluna, foi detecta

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5986/23992-PG da

N9 mS

-21usando um radio-imunoansaio competitivo descrito a seguir.

As fraeçães positivas foram eluídas entre as fraeçães

65-90 num pico simétrico, com conductividades entre 2 e 10 (Fig. 5).

redissolvidas

0,3 M, do foi

Todas as fracçães de 65-90 foram 1iofilizadas, em 60 ml de NaCl 0,3 M e dialisadas contra NaCl à temperatura ambiente durante várias centrifugado para remover uma pequena insolúvel e um terço, i.e. 20 ml, foi horas. 0 dialisa quantidade de masubmetido a croma terial tografia com peneiro molecular em Sephadex G-200 (Pharmacia) equilibrada com cloreto fino e a coluna tinha 5 de sódio 0,3 M. 0 Sephadex era superem de diâmetro e 100 cm de comprimento, amostras de 21 ml por tubo. 0 poliColectaram-se da coluna péptido CS foi eluído num pico simétrico agudo entre os tubos 51-57. No entanto, os materiais com pesos moleculares res e inferiores, em quantidades mais pequenas, foram buídos em tubos precedendo e procedendo este pico. 0s dos dos tubos 51-57 foram reunidos, contra água destilada e liofilizados.

dade total de 89 mg de polipéptidos CS puros calculou-se que o rendimento de 20 litros de levedura é 89 x 3 superiq districonteúdialisados extensivamente

Recuperou-se uma quanti Sobre esta base de

i.e. 267 mg de proteína pura, ou cultura de levedura. A pureza do perado foi avaliada por e sulfato de dodecilo e sódio (SDS-PAGE) eléc trica tro de electroforese em mg por ml única cerca de 13 mg polipéptido CS gel de poliacrilamida e por focalização isç» concentraçães de 2 por li.

recudes naturantes.

por focalização isoeléctrica, uma banda

7). Por SDS-Pfl

GE das ml sob condiçães detectou-se, com um ponto isoeléctrico de 4,3 (Fig detectou-se um dupleto com um peso molecular entre 43 000 e 000 (Fig. 6) soluçães de polipéptido foi de 0,2. Uma amostra do polipéptido foi submetida a aná lise da sequência N-terminal

A 280 nanómetros o coeficiente de extinção

CS contendo 1 mg de proteína por , parcial, e a sequência principal era alanina-ácido glutâmico-prolina-lisina-asparagina-prolina, 125 como esperado. Outra amostra foi radiomarcada com I e imunoprecipitada com anticorpos monoclonais específicos da proteí. na CS do Plasmodimn vivax. Foram especificamente reconhecidas pelo anticorpo 75 a 85$ das contagens

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-22Usou-se um radio-imunoensaio competitivo de fase sólida para detectar o polipéptido CS, construído, durante o procedimento de purificação. A curva padrão referente à dose de anti génio, com o sinal obtido no radio-imunoensaio, foi preparada como se segue. 0 polipéptido de CS construído, purificado, foi radiomarcado com I para uma actividade especifica de cerca de 2 x 10⁶ contagens por minuto por micrograma de protei. na, utilizando o bem conhecido método de iodogéneo. Prepararam-se misturas contendo uma quantidade constante de polipépti do CS, construído, radiomarcado e quantidades variáveis de polipéptido CS construído, purificado, frio (i.e. não marcado) (num volume total de 100 microlitros). Trinta microlitros das misturas foram então colocados no fundo de depósitos de placas de microtitulação pré-revestidos de anticorpos monoclonais para a proteína CS do Plasmodium vivax (2F2). Este anticorpo mjo noclonal reage com o epítopo repetitivo da proteína CS. (Nardin E.H. e col., 2· CxP* Med. , 156:2 0, 1982). 0 efeito inibidor do péptido frio sobre a ligação do péptido marcado com □ fundo dos depósitos, foi proporcional à concentração do pépti. do frio. Este ensaio detectou concentrações de péptido frio tão baixas como 5 nanogramas por ml (Fig. θ). 0 ensaio das fracções da coluna e dos extractos, foi realizado exactamente como descrito acima e o grau de inibição obtido foi relacionado com a curva padrão (Fig. 8) para calcular a concentração do péptido da proteína CS. Todas as diluições e lavagens neste ensaio foram realizadas numa solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1,0/ de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% de azida de sódio.

Com base nos resultados destes ensaios, calculou-se que as culturas de levedura continham cerca de 60 mg de proteína CS por litro, e que a recuperação do material purificado era de cerca de 20% do total. Não houve perdas no passo inicial de purificação, i.e., após fervura dos extractos este passo r_e moveu mais de 90% das bandas de proteínas não relevantes obsejr vadas no SDS-PAGE dos extractos originais.

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-2 3EXEMPLO 3; Imunização de ratinhos com o polipéptido de P« vivax construído em levedura polipéptido CS construído, purificado foi usado como antigénio para imunizar ratinhos. Dez ratinhos fêmeas não consanguíneos Swiss-Webster, com 8-12 semanas de idade, foram injectados com 50 microgramas de péptido purificado adsorvido em hidróxido de alumínio. Três e seis semanas depois, os rat_i nhos foram reforçados com a mesma dose de antigénio utilizando outra vez o hidróxido de alumínio como adjuvante. Dez dias mais tarde os ratinhos foram sangrados e os soros submetidos a análise por meio de um ensaio imunorradiométrico para detectar anticorpos para o polipéptido CS. Neste ensaio os depósitos das placas de microtitulação foram revestidos com polipéptido CS construído, purificado (10 microgramas/ml em PBS) e em seguida incubaram-se os depósitos com 30 microlitros de soro de ratinho em PBS-BSA a várias diluições. Os depósitos foram em seguida lavados e re-incubados com 50 000 cpm de imunoglobulina anti-rato de cabra, purificada por afinidade, radiomarcada (10 cpm/micrograma por proteína) diluída em PBS-BSA. Os depjá seguida novamente lavados e contados.

sitos	foram	em
	T odos	os
a diluições	de
lação	dos s	oros

soros reagiram com o polipéptido CS construído 1:10000 ou maiores. 0s resultados reunidos são mostrados na Fig pelas duas experiências abaixo descritas, que de uma tituMostrou-se estes soros continham grandes quantidades de anticorpos para as repetições da proteína CS de P. vivax.

1) Um péptido de 18 aminoácidos, sintético (18-mero) compreendendo a sequência (ftsp-Gly-Gln-Pro-Ala-Gly-Asp-Arg-Ala)g e representando duas repetições em tandem da proteína C5 de P. vivax foi sintetizado como descrito em (a) pedido de Patente E.U., co-pendente N5. de Série 754 645 depositada em 9 de Oulho de 1985 e incorporada como referência no presente pedido; e (b) Arnot e col., Science, 230:815, 1985. Este péptido foi usado para revestir depósitos de placas de microti tulação e detectaram-se os teores dos soros em anticorpos pelo ensaio imunorradiométrico descrito acima. Todos os soros rea67 664

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-24giram com os títulos a 1:4000 ou mais. Os resultados das titu lações dos soros reunidos obtidos após a segunda injecção de reforço de antigénio estão mostrados na Fig. 10.

2) Usou-se também o péptido sintético de 18 aminoácidos para inibir a ligação dos anticorpos, presentes no anti-soro reunido, aos depósitos das placas de plástico revestidas com o polipéptido CS construído. Nestas experiências, incubaram-se em primeiro lugar amostras, a uma diluição de 1:3000, de soro reunido de ratos (obtidas após a rejeição do 29 reforço) com concentrações cada vez maiores do péptido de 18 aminoácidos acj. ma descrito. Como controlo, incubaram-se amostras de soro com a mesma concentração de outro péptido 18-mero com uma sequência de aminoácidos diferente e não relacionada. Após uma incu bação de uma hora à temperatura ambiente, adicionaram-se 30 mi crolitros das misturas, aos depósitos das placas pré-revestidas com o polipéptido CS construído. Os depósitos foram em s_e guida lavados, incubados com imunoglobulina anti-rato de cabra radiomarcada, como descrito acima, novamente lavados e contados. Os resultados mostrados na Fig. 11 demonstram que o péptJL do repetido (mas não □ péptido de controlo) inibia cerca de 50% da reacção entre os anticorpos e a proteína CS. Todas as diluições e lavagens nestas experiências foram realizadas com PBS-BSA.

Os mesmos soros foram também analisados em relação à po_s sível presença de anticorpos para a região 1 de Dame, e col., supra. Para este fim, usou-se como antigénio imobilizado um pequeno péptido sintético NH^-Cys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Ile-Glu-Arg-ftsn-Asn-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-COOH. Este péptido inclui uma se quência de cinco aminoácidos que são comuns a todas as proteínas CS de todos os parasitas da malária examinados até à data, Lys-Leu-Lys-Gln-Pro (Dame e col., Science, 225:593, 1984, e Enea, 1/. , comunicação pessoal). Os primeiros dois aminoácidos (Cys e Tyr) são estranhos para a proteína CS e foram adicionados para fins de ligação do péptido a uma proteína transporta125 dora e radiomarcação com I. Este péptido foi usado para rje vestir depósitos de placas de microtitulação e os conteúdos em

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5986/23992-PG anticorpo nos soros foram detectados como acima descritos* Após o segundo reforço, todos os soros reconheceram este peque no péptido a diluições de 1:2000 ou mais. Os resultados das titulações de uma recolha destes soros estab apresentados na Fig.

12.

Os soros foram também testados por imunofluorescência in directa usando o esporozoíto do P. vivax como o antigénio. To dos os soros foram positivos a diluições de l:10G0 ou mais.

Finalmente, outra experiência demonstrou que níveis rela tivamente baixos de anticorpos para a proteína CS construída, neutralizam a infecciosidade de esporozoítos de P. vivax. 0 ensaio foi efectuado como descrito no _J. Immunol. 132:909, 1984 (incorporado como referência) usando a linha celular de hepatoma humano Hep 62 como o alvo da invasão de parasita. Os resultados, apresentados no Quadro I, abaixo, mostram que se obteve um grau significativo de inibição a diluições de soro de 1:5000. As percentagens de inibições foram calculadas como 100-2f(val ores experimentais médios/média dos controlos)xl00_J7. Os controlos consistiam em esporozoítos incubados com concentrações equivalentes de soro de rato normal (pre-imune).

QUADRO I

Inibição de esporozoítos de P. vivax em hepatocitos, in vitro, através de anticorpos para a proteína CS construí da pela levedura (Diluição Sérica)'^

250

1000

5000

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.....r·'/ _r 4*^:‘

Claims

R E I U I N D I C A Ç Ώ E S

1 - Método de purificação de um polipéptido consistindo essencialmente numa sequência de aminoácidos que consiste essencialmente em pelo menos duas sequências repetidas em tandem, idênticas às da região do epítopo imunodominante da proteína

CS de esporozoito do P. vivax, a partir de uma preparação impjj ra do referido polipéptido, contendo também a referida prepara ção impura, como impurezas, um ou mais outros tipos de proteína, caracterizado por compreender os seguintes passos:

(a) submeter a referida preparação a uma temperatura de 1002C durante um período de tempo suficiente para provocar a desnaturação e precipitação do volume das referidas impurezas proteicas, deixando no entanto o referido polipéptido em solução;

(b) remover e rejeitar o referido precipitado e conservar o sobrenadantB;

(c) separar do referido sobrenadante os constituintes sólidos;

(d) redissolver os referidos constituintes sólidos numa solução aquosa tamponada, iónica;

(e) submeter a referida solução a cromatografia de permuta iónica numa primeira coluna de cromatografia fazendo assim com que o referido polipéptido fique retido na referida co luna ao mesmo tempo que uma parte das impurezas restantes do referido polipéptido são expulsas no efluente, e eluição do re ferido polipéptido usando um gradiente iónico;

(f) diminuir a força iónica do referido eluente contendo o referido polipéptido;

(g) submeter o referido eluente a uma cromatografia com peneiro molecular, numa segunda coluna de cromatografia, e elu ir o referido polipéptido da referida coluna.
2 - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza.

67 664

5986/23992-PG do por o referido polipéptido ser um polipéptido construído em levedura, tendo uma sequência de aminoácidos consistindo e_s sencialmente na região do epítopo imunodominante da proteína CS de esporozoíto do Plasmodium vivax flanqueada pelas sequências de aminoácidos contíguas à referida região.
3 - Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado ainda por compreender a separação do referido sobrenadante do referido precipitado, por centrifugação, seguida por, pe. lo menos, uma liofilização do referido sobrenadante e subsequente redissolução do material liofilizado, antes do referido primeiro passo de cromatografia.
4 - Método, de acordo com a reivindicação 3, caracteriza do ainda por compreender a eluição do referido polipéptido da referida primeira coluna usando um gradiente de NaCl linear com força iónica, crescente.
5 - Método, de acordo com a reivindicação 3, caracteriza do ainda por compreender a diminuição da força iónica do referido eluente por diálise do referido eluente contra um tampão com uma força iónica menor do que a do referido eluente.
6 - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o polipéptido ter uma sequência de aminoácidos consistin do essencialmente em:

AEPKNPRENKLKQPGDRADGQPAGDRADG QPAGDRADGQPAGDRAAGQPAGDRADGQP AGDRADGQPAGDRADGQPAGDRADGQPAG DRAAGQPAGDRAAGQPAGDRADGQPAGDR AAGQPAGDRADGQPAGDRAAGQPAGDRAD GQPAGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDRAAGQ PAGDRAAGQPAGNGAGGQAAGGNAGGQGQ NNEGANAPNEKSVKEYLDKVRATVGTEWT P.