PT87137B - Processo de preparacao do produto de expressao de levedura recombinante - Google Patents
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Description
Campo do invento
Este invento refere-se a um polipéptido imunogénico expresso por uma levedura recombinante e compreendendo uma sequência aminoácida incorporando uma porção da proteína de superfície da fase de esporozoíto do ciclo de vida do P. vivax (CS) incluindo a região do epítopo imunodominante de repetição da dita proteína.
As propriedades imunogénicas da proteína CS do P, vivax e, em particular, as de uma subsequência desta proteína foram já descritas no Pedido de Arnot e cal» acima identificado e em Arnot, D.E. e col. Science 230;815-818, 1985 (também incorpora; do como referência).
De facto, o gene CS do P, vivax, completo, foi identificado e a sua sequência descrita nos documentos acima mencionados. Como aqui descrito, a proteína CS do P. vivax compreende uma região central de 19 repetições em tandem da sequência:
Asp-Arg-Ala-Asp/Ala-Gly-Gln-Pro-Ala-Gly ou, noutro sistema de notação
DRAD/AGQPAG
Esta região contém o epítopo imunodominante de repetição da proteína CS do P> vivax.
(A correspondência entre os dois sistemas de notação é a seguinte: A = alanina, C = cisteína, D = ácido aspártico,
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X
-4E = ácido glutãmico, F = fenilalanina, G = glicina, H = histidina, I = isoleucina, K = lisina, L = leucina, M = metionina, N = asparagina, P = prolina, Q = glutamina, R = arginina, S = sarina, T = treonina, V » valina, W = triptofano, e Y = ti rosina).
Os péptidos sintéticos consistindo essencialmente de 18 resíduos de aminoácidos (i.e. duas repetições da sequência de repetição anterior e suas permutações cíclicas — tal como Asp-Gly-Gln-Pro-Ala-Gly-Asp-Arg-Ala) são reconhecidos pelos an ticorpos da proteína CS nativa do P. vivax e por sua vez geram anticorpos (quando injectados em mamíferos) os quais reconhecem e se ligam à proteína CS nativa. Em consequência, tais péptidos têm utilidade numa vacina contra a malária.
Uma abordagem possível na produção de uma vacina contra a malária por P. vivax seria sintetizar péptidos imunogénicos que incluem uma sequência correspondente à do epítopo imunodominante da proteína CS do P, vivax (i.e. contendo uma, e de pre ferência, duas ou mais repetições). No entanto, no caso do P. vivax devido à sequência da unidade de repetição da proteína CS ser bastante longa (em contraste com a do P. falciparum) a síntese peptídica clássica não pode ser usada de forma segura. 0 uso de técnicas de síntese clássicas para fazer péptidos mais compridos é especialmente inconveniente quando praticada em grande escala, como seria necessário na preparação de uma vacina contra a malária que seria distribuída a milhões de pessoas em todo o mundo.
Além disso, seria necessário ligar o pêptido sintetizado a uma molécula maior que desempenharia o papel de transportador ou de adjuvante. Adicionalmente, na maior parte dos casos, apenas uma pequena proporção de anticorpos para um pêptido siji tético, reconheceriam a mesma sequência na proteína nativa. Is to é, mesmo que o pêptido sintético ligado a uma proteína trans portadora mostre ser imunogénico, a maior parte dos anticorpos produzidos podem não mediar a imunidade protectora contra o p£ togene. Relacionado com isto, o pêptido sintético (NANP)j, o qual é um candidato para a preparação de uma vacina contra o
P. falciparum, é excepcional uma vez que pelo menos 70% dos ari ticorpos anti-péptido reconhecem os esporozoítos da malária. A explicação para este facto pouco usual é, provavelmente, que o péptido (NANP)3 contém muitas prolinas (P) e asparaginas (N), aminoácidos que são frequentemente encontrados em ordens invejr sas da molécula da proteína. Talvez, neste caso, uma configura ção preferida de (NANP)^ em solução mimetize a da mesma sequên cia na proteína CS nativa.No entanto, da análise da sequência de aminoácidos das repetições de P. vivax, não parece provável que um péptido do P.vivax se comporte seroelhantemente a (NANP)3 .
Por estas razões pensou-se numa técnica alternativa para a manufactura de um péptido imunogénico que poderia ser usado numa vacina contra a malária por P. vivax. Os inventores pensaram em técnicas de ADN recombinante e de engenharia genética para expressar polipéptidosimunogénicos que poderiam ser usados para conferir imunidade a mamíferos contra a malária por P. vivax.
Embora a tecnologia estivesse facilmente disponível para a ccnstrução de bactérias recombinantes que expressariam uma parte ou toda a sequência de aminoácidos de repetição da prote_í na de P. vivax, os inventores procuraram um sistema de expressão alternativo pelas seguintes razães:
Em primeiro lugar, o sistema de expressão deveria ser s£ guro e capaz de produzir o polipéptido de interesse de forma consistente e com um rendimento elevado. As bactérias podem ser difíceis de manusear quando produzidas em cultura maciça, e expressarem ainda um produto proteico estranho.
Em segundo lugar, e mais importante, os produtos de expressão das bactérias são frequentemente difíceis de purificar das impurezas pirogénicas e de outros agentes inflamatórios e tóxicos que também são co-expressos pelas bactérias,ou são necessários aditivos para □ meio de crescimento bacteriano.
Em terceiro lugar, os produtos de expressão das bactérias são, na maior parte dos casos, proteínas de fusão, isto é, contêm sequências não relevantes adicionais originadas pelos
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-6genes associados àsbactérias.
Os inventores pensaram nos sistemas de expressão em lev.e duras que têm sido substancialmente melhorados por avanços recentes no campo da tecnologia do ADN recombinante. As leveduras são organismos mais resistentes do que as bactérias e muito mais fáceis de cultivar em cultura maciça. Além disso, avanços recentes na genética e clonação das leveduras, aumenta ram cs rendimentos das sistemas de expressão em leveduras.
A purificação dos produtos de expressão dos sistemas de leveduras recombinantes não é, à priori, mais complicada do que a purificação de produtos dos sistemas recombinantes bacterianos e depende principalmente das características da proteína particular que se pretende purificar. Contudo, esta purificação é geralmente mais complicada do que a de um péptido ou pro teína produzidos por técnicas de síntese de péptidos clássicas.
Os inventores escolheram um sistema de expressão em levei dura geral que é o objecto do pedido de patente EU Ns. de Série 868 639, depositado em 29 de Maio de 1986 em nome de R.L. Burke e col. e transmitido a Chiron Corporation. Este pedido é incorporado aqui como referência. Escolheu-se uma parte do gene de P. vivax (para incorporação nos organismos das leveduras) que incluía a sequência repetida em tandem completa mais outro segmento precedendo a região de repetição (quando a sequência é lida do N terminal para o C terminal). Este segmento incluiu uma sequência que se apresenta altamente conservada que em todas as espécies da malária, e/já mostrou ser imunogénica por si própria (ver pedido de Patente E.U. Na. de Série 649 903 de V. Nussenzu/eig e col. depositada em 18 de Setembro de 1984, cedida à New York University e aqui incorporado como referência).
Objectos do Invento
Assim, constitui um objecto do presente invento proporcionar um polipéptido imunogénico, obtido em leveduras por engenharia genética, imunoquimicamente reactivo com anticorpos monoclonais contra a proteína de superfície da fase de esporo67 516 ,......
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-7zoíto do ciclo de vida do P. vivax (CS), e útil na preparação de uma vacina contra a malária.
Constitui um outro objecto do presente invento proporcionar um método para produzir o polipéptido imunogénico já mencionado que poderá ser posto em prática em grande escala e com um rendimento elevado.
Outro objecto é proporcionar um polipéptido imunogénico adequado para incorporação numa preparação de vacina anti-malá ria.
Outro objecto é proporcionar um polipéptido imunogénico adequado para o uso numa preparação de vacina anti-malária sem estar ligado a um transportador.
Estes e outros objectos do invento serão evidentes para os peritos da técnica tendo em conta a presente especificação, reivindicações e desenhos anexos.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 é um diagrama da construção do vector de expressão em levedura usado no presente invento.
A Figura 2 é um mapa do plasmídeo de levedura pAB24.
A Figura 3 é um gel de poliacrilamida obtido usando lisados de levedura transformada com pAB24/P, vivax e levedura controlo.
A Figura 4 é uma análise Western de lisados da levedura transformada como vector pAB24/P, vivax.
A Figura 5 é um gráfico (a) do perfil da densidade óptica do material purificado de acordo com o invento (linha a cheio); (b) da conductividade do tampão de eluição (linha a cheio-pontos a preto); e (c) actividade percentual das fracções eluídas na inibição da ligação do anticorpo à proteína CS
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-8nativa.
A Figura 6 é uma auto-radiografia de um gal SDS-PAGE demonstrando a pureza do polipéptido construído quando feito de acordo com o presente invento e em seguida purificadoo
A Figura 7 é uma auto-radiografia de um gel de focagem isoeléctrica apresentando o polipéptido construído do presente invento.
A Figura 8 é uma curva padrão para um radioimunoensaio competitivo e mostra a inibição da ligação do polipéptido CS marcado,obtido por engenharia genética^os anticorpos anti-proteína CS do P. vivax pela presença do polipéptido obtido por engenharia genética, não marcado, do presente invento.
A Figura 9 é um gráfico de quantidade de IgG anti-rato de cabra radiomarcada que reconhece anti-sorosde rato ligados ao polipéptido CS obtido por engenharia genética, como uma fun ção da diluição do soro de rato.
A Figura 10 é um gráfico da ligação do anti-sorosde rato marcados(desenvolvidos contra o péptido construído) ao péptido CS de vivax com 18 aminoácidos (repetição) sintético, imobilizado, em função da concentração de anticorpos.
A Figura 11 é um gráfico da inibição, pelo péptido de re petição CS vivax sintético, da ligação de anti-sorosde rato ao polipéptido CS construído, imobilizado, preparado e purificado de acordo com o presente invento em função da concentração do péptido (inibidor) sintético.
A Figura 12 é um gráfico da ligação de anti-sorosde rato ao péptido não repetido, sintético, imobilizado, em função da diluição de anti-soros .
Sumário do Invento
Este invento refere-se a um polipéptido construído por engenharia em leveduras,possuindo uma sequência aminoácida consistindo essencialmente na sequência aminoácida:
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A | E | P | K | N | P | R | E | N | K L | K | Q | P | G | D | R | A | D | G | Q | P | A | G | D | R | A | D | G |
Q | P | A | G | D | R | A | D | G | Q P | A | G | D | R | A | A | G | Q | P | A | G | D | R | A | D | G | Q | P |
A | G | D | R | A | D | G | q | P | A G | D | R | A | D | G | Q | P | A | G | D | R | A | D | G | Q | P | A | G |
D | R | A | A | G | Q | P | A | G | D R | A | A | G | Q | P | A | G | D | R | A | D | G | Q | P | A | G | D | R |
A | A | G | Q | P | A | G | D | R | A D | G | Q | P | A | G | D | R | A | A | G | Q | P | A | G | D | R | A | D |
G | Q | P | A | G | D | R | A | A | G Q | P | A | G | D | R | A | A | G | Q | P | A | G | D | R | A | A | G | Q |
P | A | G | D | R | A | A | G | Q | P A | G | N | G | A | G | G | Q | A | A | G | G | N | A | G | G | Q | G | q |
N | N | E | G | A | N | A | P | N | Ε K | S | V | K | E | Y | L | D | K | V | R | A | T | V | G | T | E | W | T |
P | D | e | pref | erênci | a | e | 'St | e | P | ol | ip | ép | tido | e | prodi | uzi | .do | ||||||||||
atravi | Ss | de i | um | processe | 1 c | ;ompi | ee | im | dendo | a | IS | et | ;a| | aas | de: | ||||||||||||
(a | 1) | obtenção | de i | um | fragment | .0 | de | í A | DN i | de | CS | d | lo | P. | viv | ax, | |||||||||||
com | enda | inuclease i | de | res1 | tri | .ção | Bgl | II | 9 | de | i 1 | 5 | ki | .lo | ba | IS 1 | B, | ni | um |
vector adequado;
(b) subclonar o referido fragmento num vector adequado;
(c) obter um fragmento de ADN de P, vivax, de 4,1 kilo base, codificando para a referida sequência de aminoácidos5
(d) | incorporar o referido fragmento num vector de ex- |
pressão em | levedura; |
(e) expressão i | transformar a levedura com o referido vector de |
(f) | cultivar a referida levedura sob condições que per- |
mitam a expressão da proteína codificada pelo referido vector e;
(g) colher o meio contendo a referida proteína expressa.
Descrição detalhada do Invento gene CS de P» vivax é apresentado a seguir (juntamente com a sequência de aminoácidos para a qual ele codifica) /“Terminal N_7 ATGAAGAACTTCATTCTCTTGGCTGTTTCTTCCATCCTGTTGGTGGACTTG MKNFILLAVSSILLVDL TTCCCCACGCACTGCGGGCACAATGTAGATCTGTCCAAGGCCATAAACTTAAATGGAGTAAAC FPTHCGHNVDLSKAINLNGVN TTCAATAATGTAGACGCCAGTTCACTTGGCGCGGCACACGTAGGACAAAGTGCTAGCCGAGGCAG FNNVDASSLGAAHVGQSASRGR
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-10AGGCCTTGGCGAGAACCCAGATGACGAGGAAGGAGATGCTAAAAAAAAAAAGGATGGAAAGAAA
GLGENPDDEEGDAKKKKDGKK
GCAGAACCAAAAAATCCACGTGAAAATAAGCTGAAGCAACCAGGAGACAGAGCAGATGGACAGC
AEPKNPRENKLKQPGDRADGQ
CAGCAGGAGACAGAGCAGATGGACAGCCAGCAGGTGATAGAGCAGATGGACAACCAGCAGGAGA
PAGDRADGqPAGDRADGQPAGD
TAGAGCAGCTGGACAACCAGCAGGAGATAGAGCAGATGGACAGCCAGCAGGAGACAGAGCAGAT
RAAGQPAGDRADGqPAGDRAD
GGACAGCCAGCAGGAGACAGAGCAGATGGACAACCAGCAGGAGACAGAGCAGATGGACAACCAG
GqPAGDRADGqPAGDRADGQP } CAGGTGATAGAGCAGCTGGACAACCAGCAGGTGATAGAGCAGCTGGACAACCAGCAGGAGATAG AGDRAAGqPAGDRAAGqPAGDR AGCAGATGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGATGGA
ADGqPAGDRAAGqPAGDRADG
CAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGATGGACAGCCAGCAG qPAGDRAAGqPAGDRADGQPA GAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGC GDRAAGqPAGDRAAGqPAGDRA AGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAAATGGTGCAGGTGGACAG AGqPAGDRAAGqPAGNGAGGq GCAGCAGGAGGAAACGCAGGAGGACAGGGACAAAATAATGAAGGTGCGAATGCCCCAAATG
AAGGNAGGqGqNNEGANAPN GAAAGTCTGTGAAAGAATACCTAGATAAAGTTAGAGCTACCGTTGGCACCGAATGGACTCCATG | EKSVKEYLDKVRATVGTEWTPC
CAGTGTAACCTGTGGAGTGGGTGTAAGAGTCAGAAGCAGAGTTAATGCAGCTAACAAAAAACCA
SVTCGVGVRVRSRVNAANKKP
GAGGATCTTACTTTGAATGACCTTGAGACTGATGTTTGTACAATGGATAAGTGTGCTGGCATAT
EDLTLNDLETDVCTMDKCAGI
TTAACGTTGTGAGTAATTCATTAGGGCTAGTCATATTGTTAGTCCTAGCATTATTCAATTAA FNVVSNSLGLVILLVLALFN /Terminal C_7 fragmento de ADN escolhido para inserção no hospedeiro levedura foi:
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5986/23181-PG i ;·Λ
-11GCAGAACCAAAAAATCCACGTGAAAATAAGCTGAAGCAACCAGGAGACAGAGCAGATGGACAGC AEPKNPRENKLKQPGDRADGQ
CAGCAGGAGACAGAGCAGATGGACAGCCAGCAGGTGATAGAGCAGATGGACAACCAGCAGGAGA PAGDRADGQPAGDRADGQPAGD TAGAGCAGCTGGACAACCAGCAGGAGATAGAGCAGATGGACAGCCAGCAGGAGACAGAGCAGAT RAAGQPAGDRADGQPAGDRAD
GGACAGCCAGCAGGAGACAGAGCAGATGGACAACCAGCAGGAGACAGAGCAGATGGACAACCAG GQPAGDRADGQPAGDRADGQP
CAGGTGATAGAGCAGCTGGACAACCAGCAGGTGATAGAGCAGCTGGACAACCAGCAGGAGATAG AGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDR AGCAGATGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGATGGA ADGQPAGDRAAGQPAGDRADG
CAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGATGGACAGCCAGCAG QPAGDRAAGQPAGDRADGQPA
GAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGC GDRAAGQPAGDRAAGQPAGDRA AGCTGGACAGCCAGCAGGAGATAGAGCAGCTGGACAGCCAGCAGGAAATGGTGCAGGTGGACAG AGQPAGDRAAGQPAGNGAGGQ
GCAGCAGGAGGAAACGCAGGAGGACAGGGACAAAATAATGAAGGTGCGAATGCCCCAAATG AAGGNAGGQGQNNEGANAPN
AAAAGTCTGTGAAAGAATACCTAGATAAAGTTAGAGCTACCGTTGGCACCGAATGGACTCCA EK5VKEYLDKVRATVGTEWTP
Este fragmento inclui a sequência de repetição em tandem completa mais unaregião que está substancialmente paralela à Re, gião I de Dame e col., Science 225:628 (1984) que precede a re gião de repetição e que codifica a sequência de aminoácidos AEPKNPRENKLKQPG.
Esta sequência inclui a subsequência K L K Q P que é mantida em todas as espécies de malária que foram até agora in vestigadas.
fragmento de ADN atrás mencionado foi obtido a partir do gene completo subclonando um fragmento BglII com 15 kb isolado como descrito por Arnot e col. (Pedido de Patente E.U. N9. de Série 754 645 e Science 230:815-818, 15 de Novembro de 1985 ambos incorporados como referência). Foi então inserido no ADN do plasmídeo de levedura modificado pAB24 como descrito a seguir no Exemplo 1.
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-12<*
Para a expressão do antigénio do CS do P. vivax em levedura, utilizou-se um promotor híbrido compreendendo a glicera.1 deído-3-fosfato desidrogenase, de levedura, forte, e o promotor de álcool desidrogenase-2 (ADH-2) regulável pela glucose. A fjj são deste promotor com genes heterólogos permite o crescimento de culturas de levedura com elevada densidade, usando a glucose como uma fonte de carbono. A deplecção da glucose nos meios, durante o crescimento fermentativo, conduz à concomitante indução da expressão da proteína heteróloga. A incorporação do plasmí deo em plasmídeos de levedura, que se replicam autonomamente, com elevado número de cópias, e, a transformação das células de levedura gerou estirpes que são capazes de exprimir proteínas CS com níveis elevados, aquando da indução.
Desenvolveu-se a levedura por cultura em meio YEP (1% p/v de extracto de levedura, peptona a 2%) com glucose a 1% como descrito a seguir no Exemplo 1. Obtiveram-se assim duzentos li tros de material levedura e armazenaram-se a -809C.
material de levedura assim obtido continha uma mistura complexa de diferentes proteínas de levedura bem como aditivos do meio de cultura. A electroforese em gel deste material, num gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio a 7,5% deu uma indicação da sua heterogeneidade (ver Fig. 6 faixa 1). 0 procedimento de expressão e a construção do plasmídeo estão sublinhados na Figura 1 e descritos no exemplo 1 a seguir.
A purificação deste polipéptido foi conduzida de acordo com um método desenvolvido por V. Nussenziueig da Netu York University, o qual é objecto de um pedido divisionário do presente pedido de Patente.
Observou-se que todos os anticorpos da proteína CS de P. knoiulesi reconheceram a região do epítopo imunodominante desta proteína, mesmo depois da proteína CS ter sido aquecida a 1009C durante 30 minutos ou submetida a desnaturação completa por tratamento com guanidina 6M e com /3-mercapto-etanol a 1% (Gysin, 3., e col. 3. Exp. Med. 160:935, 1984J Godson, G.
N., e col., Nature 305:29, 1983).
Esta observação referia-se à proteína CS do P. knoudesi, completa, e de modo nenhum estabelecia que a proteína CS do
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-13P. vivax poderia apresentar comportamento semelhante após aquecimento, ou que os seus fragmentos, consistindo essencialmente no polipéptido aqui empregue e abrangendo a região do epítopo permaneceriam reactivos imunoquimicamente com os anticorpos anti-proteína CS do P. vivax, após terem sido submetidos a condições de aquecimento que normalmente resultam na des, naturação das proteínas. Outro facto imponderável, foi, no presente invento o fragmento do proteína CS ter sido misturado com quantidades muito grandes de materiais não relevantes. 0 aquecimento da mistura pode conduzir à formulação de agregados com outros polipéptidos e a mascaramento dos epítopos e/ou co-precipitação. Também não se sabia se tais fragmentos continua riam a ser imunogénicos após terem sido submetidos ao tratameri to de aquecimento acima.
Apesar de tudo, o Dr. Nussenzuieig usou um passo de aquecimento como passo inicial da purificação do polipéptido CS do P. vivax obtido por engenharia em leveduras. (Quando usado neste pedido de Patente polipéptido referir-se-à a um fragmeri to de proteína relativamente longo, proteína referir-se-à a uma proteína completa e péptido referir-se-à a um péptido re, lativamente curto, p.e. um contendo 30 resíduos de aminoácidos ou menos. Em relação ao uso da palavra sequência entender-se-à que polipéptidos e péptidos, de acordo com o presente in vento, serão funcionalmente equivalentes se tiverem a mesma s,e quência quer a sequência seja apresentada do terminal N para o C, quer do terminal C para o N).
A mistura foi então submetida a aquecimento a 1009C, que resultou numa precipitação maciça do material de células de le vedura lisadas. Separou-se, secou-se e liofilizou-se o sobrenadante. 0 resíduo do sobrenadante liofilizado mostrou um melhoramento substancial em pureza em relação ao extracto de levedura (ver Fig. 6 faixa 4).
Uma solução do material liofilizado foi mais purificada sequencialmente por (a) cromatografia de permuta aniónica usari do um gradiente de electrólito para eluir o polipéptido CS construído; e (b) cromatografia com peneiro molecular.
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.............
-14As fracções possuindo actividade do polipéptido CS foram identificadas com um radio-imunoensaio. Uma pequena quantidade do material de levedura muito purificado foi radio-marcado para apresentar uma elevada actividade especifica com I. Cada fracção foi testada por um radio-imunoensaio clássico em re lação à sua capacidade para inibir a ligação do material marca, do com anticorpo monoclonal anti-P. vivax, imobilizado, dirigi do contra o epítopo repetitivo da proteína CS de P. vivax.
polipéptido CS de P. vivax, construído, assim purific^ do é homogéneo por SDS-PAGE e por focalização isoeléctrica e espera-se assim que esteja substancial mente isento de impurezas tóxicas e inflamatórias, pirogénicas, que podem ter estado associadas com material de células de levedura e meios de cultu ra de leveduras lisados.
rendimento da combinação do procedimento de expressão em levedura e do processo de purificação, do presente invento, mostrou ser de 13 mg de polipéptido CS puro por litro de cultu. ra de levedura. Dado que se produziram 200 litros desta cultu ra em três dias usando equipamento à escala piloto (fermentador de 250 litros), é evidente que se podem obter num curto p.e ríodo de tempo grandes quantidades do polipéptido CS construído.
Um extracto obtido a partir de 200 litros de caldo de le vedura contém polipéptido CS construído suficiente para imunizar cerca de 25 000 seres humanos contra o P. vivax usando 100 microgramas de polipéptido por pessoa.
As principais vantagens do polipéptido CS produzido de acordo com □ presente invento consistem em que o péptido construído:
(a) pode ser produzido em grande escala sem impurezas e sem antigénios não relevantes;
(b) representa um fragmento grande da molécula de CS na tiva;
(c) mostrou ser altamente imunogénica em roedores, usari do hidróxido de alumínio como adjuvante;
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i ’ lh.1ríb
(d) os anticorpos que são produzidos reagem quer com as repetições” quer com a região conservada da molécula de CS.
Anticorpos contra as repetições” mostraram neutralizar muito eficazmente a infecciosidade dos parasitas. Os anticorpos contra um péptido contendo esta região conservada também neutralizaram a infecciosidadé dos parasitas, mas não se pode quantificar rigorosamente a actividade inibidora (Vergara, e col., 3. Immunol. 134:3445-3448, 1985). Além disso, o facto da sequência KLKQP, que faz parte do péptido, estar presente em todas as proteínas CS, sugere que esta região tem uma função importante.
presente invento é descrito a seguir em detalhe por meio de exemplos específicos que ilustram o invento sem limitar o seu âmbito.
EXEMPLO 1: Restrição do gene da CS de P. vivax, ligação num vector, transformação das células de levedura hos. pedeiras e expressão
Na descrição que se segue, todas as enzimas e endonucleai ses de restrição estão disponíveis comercialmente em Pharmacia Fine Chemical Co., (Piscataway, N.3.), Neu» England Biolabs (Beverley, MA), Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) ou Bethesda Research Laboratories, Inc. (Gaithersburg, MD) e são usados de acordo com as instruções do fabricante.
Um vector pUC9 (Pharmacia Fine Chemical Co., Piscataiuay, NJ) contendo o gene da proteína CS de P. vivax foi derivado subclonando um fragmento BglII com 15 kb inserida nos locais BamHI do EM8LIII, um vector do bacteriófago lambda (como divul gado em Arnot e col., pedido de Patente E.U. Na. de Série 754 645, e incorporado como referência). 0 clone pUC9Ci foi di. gerido com BglII e XBal e purificado em gel para obter um fragmento de 4,1 kb codificando todas as sequências de repetição (Arnot e col., Science 230:815-818, 1985, incorporado como referência). Este fragmento purificado em gel foi em seguida di. gerido com Fokl e Bani e ligado aos ligantes sintéticos 5’-fo£ forilados seguintes, sintetizados pelo método da fosforamidita
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-16utilizando sintetizadores 380A DNA de Applied Biosystems.
I CCTTGGAACCATGG
GGAACCTTGGTACCGTCT
Ncol Complementarmente à saliência Fokl
II GCACCGAATGGACTCCATAG ____GCTTACCTGAGGTATCCAGCT Bani Sall
Ligante I proporciona um local Ncol enquanto que o Ligante II proporciona uma saliência Sall.
fragmento contendo o ligante foi digerido com Ncol e Sall, isolado por electroforese em gel e clonado no pBSIOO digerido com Ncol/Sall (construção descrita a seguir). 0 plasmí deo resultante foi designado por pAG/P.vivaxl. 0 pBSIOO é um plasmídeo derivado do pBR322 contendo o promotor (1200 pb) GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) regulado por ADH-2, e o terminador (900 pb) GAPDH (ver Figura 1) e a sua construção é descrita a seguir.
A parte ADH-2 do promotor, foi construída por corte de um plasmídeo contendo o gene ADH-2 do tipo selvagem (plasmídeo pADR2, ver Baier e Young, Nature, 300;724-728, (1982), incorpçi rado como referência) com a enzima de restrição EcoR5 que efectu a o corte na posição +66 em relação ao codão de início ATG, bem como em outros dois locais do pADR2, fora da região ADH-2. A mistura resultante de um fragmento do vector e de dois fragmejn tos mais pequenos, foi digerida com exonuclease Bal31 para remover cerca de 300 pb. Sintetizaram-se quimicamente e ligaram -se a um ADN tratado com Bal31, ligantes sintéticos Xhol tendo a sequência
CCTCGAGG GGAGCTCC fragmento vector de ligante e ADN resultante (cerca de 5 kb) foi separado dos ligantes por cromatografia em coluna (em Sepharose CL4B de Pharmacia), cortado com a enzima de restrição Xhol, religado e usado para transformar a E. coli de mo
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-17do a ser resistente à ampicilina. As posições das adições de ligante Xhol foram determinadas por sequenciação do ADN, usando técnicas padrão bem conhecidas na técnica. Um plasmídeo, que continha o ligante Xhol localizado na região não-transcrita 5', do gene do ADH-2 (posição -232 em relação a ATG), foi cortado com a enzima de restrição Xhol, tratado com nuclease Sl, específica, de cadeia simples e, subsquentemente, tratado com a enzima de restrição EcoRI de modo a criar uma molécula vector, linear, tendo uma extremidade romba no local do ligante Xhol, e uma extremidade EcoRI.
A parte GAP do promotor foi construída cortando o plasmí deo pPGAP (como divulgado no Pedido de Patente Europeia n3. 164 556 de Chiron Corporation, depositado em 3 de Maio de 1985, incorporado como referência e de acordo com o cor respondente pedido E.U, nS. de série 609 540, depositado em 11 de Maio de 1984), com as enzimas BamHI e EcoRI, seguindo-se o isolamento do fragmento de ADN de 0,4 kpb. 0 plasmídeo pPGAP é um plasmídeo de levedura contendo as sequências, promotora e terminadora, GAPDH em levedura flanqueada pelos locais dos endonucleases de restrição Ncol e Sall. 0 fragmento purificado é parcialmente digerido com a enzima Alui, para produzir uma extremidade romba próximo do local BamHI, e usado para construir o plasmídeo p3S104.
plasmídeo p3S104 foi construído por ligação do fragmeri to promotor GAP AluI-EcoRI ao fragmento ADH-2 presente no vector linear anteriormente descrito.
fragmento promotor ADH-GAP BamHI-Ncol foi obtido a par. tir do plasmídeo pJS103, que é igual ao p3S104 (acima) excepto por o fragmento GAP do promotor ADH-GAP ter cerca de 200 pb no p3S103 e 400 pb no pJS104. A construção do p3S103 foi igual à do p3S104 excepto por o fragmento BamHI-EcoRI com 0,4 kb ter s_i do completamente digerido com Alui (em vez de parcialmente digerido, como no p3S104) e isolou-se um fragmento de 200 pb.
Toda a região acima contendo o promotor, segmento de P. vivax e terminador, (daqui em diante denominado cassete de expressão) foi excisada por digestão com BamHI, purificada por /
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-18electroforese em gel e clonada em pAB24, digerido com BamHI. Está apresentado na Figura 2 um mapa de restrição deste plasmí. deo.
pAB24 é um vector de expressão em levedura (Fig. 2) o qual contém as sequências 2 mu completas necessárias para uma replicação autónoma na levedura (Broach, em: Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1.:445, Cold Spring Harbor Press, 1981) e nas sequências pBR322. Contém também o gene da levedu ra URA3 dBrivado do plasmídeo YEp24 (Botstein, e col., Gene (1979) 8.:17 aqui incorporado como referência) e o gene da levje dura L.EU2d derivado do plasmídeo pCl/1 (ver Pedido de Patente Europeia NQ. de Série 116 201 depositado em 22 de Agosto de 1984, no nome de Chiron Corporation, incorporada como referência). A inserção da cassete de expressão foi efectuada no local BamHI do pBR322, interrompendo assim o gene para a resistência bacteriana à tetraciclina.
Expressão de proteínas CS do P. vivax
A estirpe AB11O de Saccharomyces Cerevisiae isolada por Chiron Corporation (Mat, leu2-04, ou ambos leu2-3 e leu2-112, pep4-3, his4-580, cir°) foi transformada com pAB24/£. vivax 1-5 de acordo com Hinnen, e col., Proc. Natl. Açad. Sei, USA 75:1929-1933 (1978). As colónias de um único transformante contendo vectores regulados por GAP foram cultivadas em 2 ml de meios selectivcs leu” (deficiente em leucina) até à fase log tardia ou até à fase estacionária. Apenas leveduras contendo plasmídeo podem crescer neste meio. As culturas foram subsequentemente diluídas a 1:20 (v/v) em YEP (extracto de levedura a 1% p/v, peptona a 2% p/v) com 1% de glucose e cultivadas até saturação (cerca de 36 h), neste meio. As células foram lisadas na presença de sulfato de dodecilo e sódio (SDS) e ditiotreitol (DTT) e os lisados foram clarificados por centrifugação. Os lisados límpidos foram submetidos a electroforese em gel de poliacrilamida (Laemmli, U.K., Nature, 227:680, 1970). Após coloração com azul de Comassie, observou-se nos extractos dos transformantes contendo o plasmídeo de P. vivax (Figura 3) uma banda pesada de cerca de 38KD. Esta banda foi detectada
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5986/23181-PG '® -19nas células transformadas com o vector de expressão, estando aju sente nos extractos de células contendo os plasmídeos de contro lo (pCl/1). A proteína de fusão representa mais de 10% da proteína celular total. A razão da migração celular anormal (38 KD versus 23 KD previsível da construção do ADN) pode ser atribuível à ligação anormal do SDS, como previamente referido em relação às proteínas CS de P« knowlesi (Ozaki e col., Cell 34: :185, 1983), devido, provavelmente, à baixa proporção de resíduos hidrofébicos.
Para confirmar a identidade da banda de 38 KD, as proteínas sintetizadas pela levedura foram também submetidas a análise Western. Os lisados de levedura clarificados, preparados co mo descrito acima foram submetidos a electroforese em geles de poliacrilamida (Laemmlí, supra) e as proteínas foram subsequentemente submetidos a electroblot” sobre filtros de nitrocelulo se (Towbin, e col*, Proc* Natl* Açad. Sçj. USA 76:3450, 1979). 0 filtro foi pré-incubado durante 1 h com 1% (BSA) em PBS e trata do subsequentemente com um anticorpo monoclonal para a proteína CS do P. vivax, durante 12 h a 49C. Os filtros foram lavados com BSA/PBS a 1% e adicionou-se um segundo anticorpo anti-rato de cabra conjugado com peroxidase de rábano (Bio Rad Laboratories, Richmond, Califórnia). Finalmente, os filtros foram incubados com reagente revelador da cor da peroxidase de rábano (Bio-Rad Richmond, CA) θ lavados. A análise Western mostrou que a proteína de fusão reagiu com os anticorpos monoclonais (Fig. 4).
Embora não seja objecto das presentes reivindicações, descreve-se a seguir, com a finalidade de completação, um método de purificação, preferido, de um polipéptido de acordo com o presejn te invento.
EXEMPLO 2: Purificação do polipéptido do circum-esporozoíto do Plasmodium vivax
As culturas de levedura exprimindo uma parte do polipéptido CS foram preparadas como no Exemplo 1. 0 polipéptido expresso consistia de 234 aminoácidos incluindo todo o domínio de repetição e uma região conservada, nomeadamente a Região I de Dame, 3. B., e col., SciencB 225:628 (1984). 0 aminoácido
N-terminal do polipéptido expresso é a alanina nas posições nucleótidas N2. 385-7 (GCA) e o aminoácido C-terminal é a pror......
1!^·'·..... ’
......
&
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-20lina nas posiçães nucleótidas N9. 1084-1086 (CCA); Arnot e col., Science 230:815-818, 1985. 0 primeiro passo da purifica ção do fragmento de pêptido expresso pela levedura consistia em submeter os extractos a temperaturas de 1009C. A purificação foi efectuada da seguinte forma:
Os extractos de levedura pelotizados, a partir de 20 litros de cultura de levedura, foram preparados num batedor de esferas, diluindo a levedura num volume igual de tampão de fos; fato de sódio 0,1 M, pH 7,3, 0,1% de Triton-X, EDTA 1 mM, PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) 1 mM e 1 micrograma por ml de pepstatina. 0 extracto (370 ml) foi adicionado a 200 ml de água fervente contendo PMSF 1 mM e 1 micrograma/ml de leupeptina. A mistura foi levada a uma temperatura de 1009C e mantida durante dez minutos com agitação constante a esta tempe. ratura. A mistura foi arrefecida para 03C e centrifugada a 18 000 rotaçães por minuto, numa ultracentrífuga Rotor TI-19 de Beckman (Beckman Instruments, Paio Alto, CA) durante quinze minutos. 0 sobrenadante foi removido e depois liofilizado.
material seco foi dissolvido em 120 ml de água, centri fugado para remover uma pequena quantidade residual de material insolúvel, dialisado extensivamente contra água destilada, durante 48 horas, s novamente liofilizado. 0 pó foi dissolvido em tampão fosfato de sódio e potássio 3 mM pH 7,5, e a conductividade foi ajustada com água para 0,58 mS. A solução foi centrifugada para remover os materiais insolúveis e submetida a cromatografia de permuta aniónica numa coluna DEAE-Sephacel (Pharmacia Fine Chem. Co., Piscatau/ay, N.3.) (5 cm x 24 cm) equilibrada no mesmo tampão. O caudal foi ajustado para 100 ml por hora e recolheram-se 21 ml por tubo. A colu na foi então lavada com 500 ml do mesmo tampão, i.e., com um volume de cerca de uma coluna. A eluição foi continuada com um tampão formado num gradiente linear no qual 1.500 ml do tam pão inicial foram gradualmente misturados com 1500 ml do mesmo tampão contendo também NaCl 0,75 Μ. A presença do polipéptido CS nas diversas fracçães eluindo a partir da coluna, foi detecta
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-21da usando um radio-imunoensaio competitivo descrito a seguir.
As fracções positivas foram eluídas entre as fracções NQ. 65-90 num pico simétrico, com conductividades entre 2 e 10 mS (Fig. 5). Todas as fracções de 65-90 foram liofilizadas, redissolvidas em 60 ml de NaCl 0,3 M e dialisadas contra NaCl 0,3 M, à temperatura ambiente durante várias horas. 0 dialisa do foi centrifugado para remover uma pequena quantidade de material insolúvel e um terço, i.e. 20 ml, foi submetido a croma tografia com peneiro molecular em Sephadex G-200 (Pharmacia) equilibrada com cloreto de sódio 0,3 M. 0 Sephadex era superfino e a coluna tinha 5 cm de diâmetro e 100 cm de comprimento. Colectaram-se da coluna amostras de 21 ml por tubo. 0 polipéptido CS foi eluído num pico simétrico agudo entre os tubos 51-57. No entanto, os materiais com pesos moleculares superio res e inferiores, em quantidades mais pequenas, foram distribuídos em tubos precedendo e procedendo este pico. Os conteúdos dos tubos 51-57 foram reunidos, dialisados extensivamente contra água destilada e liofilizados. Recuperou-se uma quanti dade total de 89 mg de polipéptidos CS puros. Sobre esta base calculou-se que o rendimento de 20 litros de levedura é de 89 x 3, i.e. 267 mg de proteína pura, ou cerca de 13 mg por li tro de cultura de levedura. A pureza do polipéptido CS recuperado foi avaliada por electroforese em gel de poliacrilamida e sulfato de dodecilo e sódio (SDS-PAGE) e por focalização is.0 eléctrica sob condições desnaturantes. A concentrações de 2 mg por ml detectou-se, por focalização isoeléctrica, uma banda única com um ponto isoeléctrico de 4,3 (Fig. 7). Por SDS-PA. GE detectou-se um dupleto com um peso molecular entre 43 000 e 45 000 (Fig. 6). A 280 nanómetros o coeficiente de extinção das soluções de polipéptido CS contendo 1 mg de proteína por ml foi da 0,2. Uma amostra do polipéptido foi submetida a aná lise da sequência N-terminal, parcial, e a sequência principal era alanina-ácido glutâmico-prolina-lisina-asparagina-prolina, 125 como esperado. Outra amostra foi radiomarcada com I e imunoprecipitada com anticorpos monoclonais específicos da proteí, na CS do Plasmodium yivax. Foram especificamente reconhecidas pelo anticorpo 75 a 85% das contagens
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-22Usou-se um radio-imunoensaio competitivo de fase sólida para detectar o polipéptido CS, construído, durante □ procedimento de purificação. A curva padrão referente à dose de anti génio, com o sinal obtido no radio-imunoensaio, foi preparada como se segue. 0 polipéptido de CS construído, purificado, foi radiomarcado com I para uma actividade específica de cerca de 2 x 106 contagens por minuto por micrograma de proteX na, utilizando o bem conhecido método de iodogéneo. Prepararam-se misturas contendo uma quantidade constante de polipéptX do CS, construído, radiomarcado e quantidades variáveis de polipéptido CS construído, purificado, frio (i.e. não marcado) (num volume total de 100 microlitros). Trinta microlitros das misturas foram então colocados no fundo de depósitos de placas de microtitulação pré-revestidos de anticorpos monoclonais para a proteína CS do Plasmodium vivax (2F2). Este anticorpo mo noclonal reage com o epítopo repetitivo da proteína CS. (Nardin E.H. e col.» 2· ExP. Med., 156 ?20, 1982). 0 efeito inibidor do péptido frio sobre a ligação do péptido marcado com o fundo dos depósitos, foi proporcional à concentração do péptX do frio. Este ensaio detectou concentrações de péptido frio tão baixas como 5 nanogramas por ml (Fig. 8). 0 ensaio das fracções da coluna e dos extractos, foi realizado exactamente como descrito acima e o grau de inibição obtido foi relacionado com a curva padrão (Fig. 8) para calcular a concentração do péptido da proteína CS. Todas as diluições e lavagens neste ensaio foram realizadas numa solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1,0% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% de azida de sódio.
Com base nos resultados destes ensaios, calculou-se que as culturas de levedura continham cerca de 60 mg de proteína CS por litro, e que a recuperação do material purificado era de cerca de 20% do total. Não houve perdas no passo inicial de purificação, i.e., após fervura dos extractos este passo re moveu mais de 90% das bandas de proteínas não relevantes obse£ vadas no SDS-PAGE dos extractos originais.
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....
-23EXEMPLO 3: Imunização de ratinhos com o polipéptido de
P, vivax construído em levedura polipéptido CS construído, purificado foi usado como antigénio para imunizar ratinhos. Dez ratinhos fêmeas não consanguíneos Su/iss-Webster, com 8-12 semanas de idade, foram injectados com 50 microgramas de péptido purificado adsorvido em hidróxido de alumínio. Três e seis semanas depois, os rati nhos foram reforçados com a mesma dose de antigénio utilizando outra vez o hidróxido de alumínio como adjuvante. Dez dias mais tarde os ratinhos foram sangrados e os soros submetidos a análise por meio de um ensaio imunorradiomêtrico para detectar anticorpos para o polipéptido CS. Neste ensaio os depósitos das placas de microtitulação foram revestidos com polipéptido CS construído, purificado (10 microgramas/ml em PBS) e em seguida incubaram-se os depósitos com 30 microlitros de soro de ratinho em PBS-BSA a várias diluições. Os depósitos foram em seguida lavados e re-incubados com 50 000 cpm de imunoglobulina anti-rato de cabra, purificada por afinidade, radiomarcada (10f cpm/micrograma por proteína) diluída em PBS-BSA. Os depji sitos foram em seguida novamente lavados e contados.
Todos os soros reagiram com o polipéptido CS construído a diluições de 1:10000 ou maiores. 0s resultados de uma titulação dos soros reunidos são mostrados na Fig. 9. Mostrou-se pelas duas experiências abaixo descritas, que estes soros continham grandes quantidades de anticorpos para as repetições da proteína CS de P. vivax.
1) Um péptido de 18 aminoácidos, sintético (18-mero) compreendendo a sequência (Asp-Gly-Gln-Pro-Ala-Gly-Asp-Arg-Ala)2 e representando duas repetições em tandem da proteína CS de P. vivax foi sintetizado como descrito em (a) pedido de Patente E.U., co-pendente N9. de Série 754 645 depositada em 9 de Julho de 1985 e incorporada como referência no presente pedido; e (b) Arnot e col., Science, 230:815, 1985. Este péptido foi usado para revestir depósitos de placas de microti. tulação e detectaram-se os teores dos soros em anticorpos pelo ensaio imunorradiomêtrico descrito acima. Todos os soros rea
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5986/23181-PG giram com os títulos a 1:4000 ou mais. Os resultados das titu lações dos soros reunidos obtidos após a segunda injecção de reforço de antigénio estão mostrados na Fig. 10.
2) Usou-se também o péptido sintético de 18 aminoácidos para inibir a ligação dos anticorpos, presentes no anti-soro reunido, aos depósitos das placas de plástico revestidas com o polipéptido CS construído. Nestas experiências, incubaram-se em primeiro lugar amostras, a uma diluição de 1:3000, de soro reunido de ratos (obtidas após a rejeição do 20 reforço) com concentrações cada vez maiores do péptido de 18 aminoácidos aci ma descrito. Como controlo, incubaram-se amostras de soro com a mesma concentração de outro péptido 18-mero com uma sequência de aminoácidos diferente e não relacionada. Após uma incu bação de uma hora à temperatura ambiente, adicionaram-se 30 mi crolitros das misturas, aos depósitos das placas pré-revestidas com o polipéptido CS construído. Os depósitos foram em se guida lavados, incubados com imunoglobulina anti-rato de cabra radiomarcada, como descrito acima, novamente lavados e contados. Os resultados mostrados na Fig. 11 demonstram que o pépti do repetido (mas não o péptido de controlo) inibia cerca de 50% da reacção entre os anticorpos e a proteína CS. Todas as diluições e lavagens nestas experiências foram realizadas com PBS-BSA.
Os mesmos soros foram também analisados em relação à pos. sível presença de anticorpos para a região 1 de Dame, e col., supra. Para este fim, usou-se como antigénio imobilizado um pequeno péptido sintético NH^-Cys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Ile-Glu-Arg-Asn-Asn-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-COOH. Este péptido inclui uma sja quência de cinco aminoácidos que são comuns a todas as proteínas CS de todos os parasitas da malária examinados até à data, Lys-Leu-Lys-Gln-Pro (Dame e col., Science, 225:593. 1984, e Enea, V., comunicação pessoal). Os primeiros dois aminoácidos (Cys e Tyr) são estranhos para a proteína CS e foram adicionados para fins de ligação do péptido a uma proteína transportadora e radiomarcação com I. Este péptido foi usado para re vestir depósitos de placas de microtitulação e os conteúdos em
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anticorpo nos soros foram detectados como acima descritos. Após o segundo reforço, todos os soros reconheceram este peque no péptido a diluições de 1:2000 ou mais. Os resultados das titulações de uma recolha destes soros estão apresentados na Fig. 12.
Os soros foram também testados por imunofluorescência in directa usando o esporozoíto do P» vivax como o antigénio. To dos os soros foram positivos a diluições de 1:1000 ou mais.
Finalmente, outra experiência demonstrou que níveis rela tivamente baixos de anticorpos para a proteína CS construída, neutralizam a infecciosidade de esporozoítos de P, vivax. 0 ensaio foi efectuado como descrito no J. Immunol. 132:909, 1984 (incorporado como referência) usando a linha celular de hepatoma humano Hep 62 como o alvo da invasão de parasita. Os resultados, apresentados no Quadro I, abaixo, mostram que se obteve um grau significativo de inibição a diluições de soro de 1:5000. As percentagens de inibições foram calculadas como 100-Z~(valores experimentais médios/média dos controlos)χ100_/. 0s controlos consistiam em esporozoítos incubados com concentrações equivalentes de soro de rato normal (pre-imune).
QUADRO I
Inibição de esporozoítos de P. vivax em hepatocitos, in vitro, através de anticorpos para a proteína CS construí da pela levedura
Claims (8)
1 - Processo de preparação de um polipéptido construído tendo uma sequência de aminoácidos que consiste, essencialmen-
P caracterizado por compreender os seguintes passas:
(a) obtenção do fragmento de ADN do CS de P. vivax com endonuclease de restrição BglII, de 15 kilobase, num vector adequado;
(b) subclonação do referido fragmento num vector adequado ;
(c) obtenção de um fragmento de ADN do CS de P. vivax com 4,1 kilobase, codificando a referida sequência de aminoáci^ dos;
(d) incorporação do referido fragmento num vector de ex. pressão em leveduras;
(e) transformação da levedura com o referido vector de expressão;
(f) cultivo da referida levedura sob condições que permitam a expressão da proteína codificada pelo referido vector e, (g) recolha do meio contendo a referida proteína expres.
sa.
2 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri
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-27zado por □ referido vector adequado para subclonar o referido fragmento ser o pUC9.
3 - Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracteri zado por o referido vector de expressão em levedura ser o pias, mídeo pAB24 contendo o referido fragmento de ADN de P. vivax com 4,1 kilobase.
4 - Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracteri. zado por o referido vector de expressão conter ainda um promotor híbrido de álcool desidrogenase-2 e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e um terminador de gliceraldeído-3-fosfato d.e sidrogenase.
5 - Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracteri. zado por o referido promotor híbrido ser obtido a partir do plasmídeo pSJ103.
6 - Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracteri zado por conter ainda 2 sequências mu de levedura.
7 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri. zado por a referida levedura transformada ser da estirpe AB11O.
8 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri, zado por a referida levedura transformada ser cultivada num meio de crescimento deficiente em leucina.
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