JPH0829111B2 - 酵母菌による異種構造のタンパク質の発現、プロセシングおよび分泌 - Google Patents

酵母菌による異種構造のタンパク質の発現、プロセシングおよび分泌

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JPH0829111B2
JPH0829111B2 JP58038116A JP3811683A JPH0829111B2 JP H0829111 B2 JPH0829111 B2 JP H0829111B2 JP 58038116 A JP58038116 A JP 58038116A JP 3811683 A JP3811683 A JP 3811683A JP H0829111 B2 JPH0829111 B2 JP H0829111B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に、望ましくないプレ配列または発現
の他のアーチファクトを伴わない、分離した異種のタン
パク質を発現し、プロセシングし、そして分泌する、酵
母菌宿主系および発現ベクターを利用する組換えDNA技
術に関する。
本発明が基づく発見は、酵母菌宿主に対して通常は異
種のタンパク質を、酵母菌培養物から、有用な量で回収
できる、第１の場合であり、ここでそれは自然の細胞の
環境におけるその生産をまねる方法で、酵母菌生物によ
り発現され、プロセシングされ、そして分泌されてい
る。本発明は、酵母菌宿主により通常合成されないタン
パク質の合成を管理し、そして、認られるように、酵母
菌宿主を調節してタンパク質をその分泌の通路の方向の
もとにこさせるように、発現ベクターおよび酵母菌宿主
を操作することに成功した結果として生じた。こうし
て、本発明は、異種のタンパク質を暗号化するDNAを含
有する発現ベクターを収容（harbore）する生存できる
細胞を含有する酵母菌培養物の培地から、有用な量の異
種のタンパク質を得る手段および方法に関する。本発明
により多数の利点を得ることができ、たとえば、細胞培
養培地中に有用な分離したタンパク質生産物を得ること
ができる。このとき、従来、細胞内容物からのみ入手で
きる、しばしば成熟以外の形態の、生産物を、回収する
ためには、細胞溶解に頼ることが必要であったが、本発
明によれば、これを排除することができる。
本発明の背景を明らかにし、とくに本発明の実施に関
する追加の詳細を提供する、刊行物および他の資料を、
引用によってここに加え、便宜上、添付の文献の形で数
字で参照し、整理してある。
酵母菌生物は、ある数のある種の同種タンパク質を、
細胞表面の生長および細胞の代謝への必須の寄与物とし
て、原形質膜へ、時にはそれを通して、自然に移送す
る。細胞が娘細胞の形成に対する増殖の準備の偶発的出
来事として出芽するとき、細胞壁および原形質膜の形成
ならびに代謝のために追加のタンパク質が要求される。
これらのタンパク質のいくつかは、機能の部位へたどり
つかなくてはならない。それゆえ、分泌の通路は存在す
ると信じられる（１）。上の過程に関与するある種の同
種タンパク質は、小胞体における翻訳により形成され
る。同種タンパク質は、通常酵母菌種により生産され、
そしてその生存に要求されるものである。いったん形成
すると、それらは酵素的転移によりコルジ装置へ移動
し、そこから小胞内を経て原形質膜へ行き、ここである
もの、あるいはある程度、原形質膜と細胞壁との間の空
間の中へ浸透する。少数の同種タンパク質、たとえば、
α−因子およびキラー毒素は、細胞壁を通して完全に移
出されるものと思われる（２、３）。
再び、細胞の出芽区域は小胞の吸引部位であると思わ
れ、そして出芽の内表面への融合によって、それらは原
形質膜、および多分、細胞壁、の全体の生長に寄与する
（４、５、６）。この理論は、前記膜を通るタンパク質
の分泌または移動が実際に置こるという証明を提供しな
い。同様に、タンパク質のグリコシル化は、いわゆる分
泌過程を促進するか、あるいはそれに関係しうるかどう
かは、なお議論の的である。さらに、定義「分泌され
た」タンパク質とは、信号（シグナル）プレペプチドを
有すると信じられ、膜表面における移動または組み込み
の過程と関連すると考えられる。分泌過程において、存
在するとしても、成熟タンパク質のこのような修飾の機
能、および表面生長における分泌通路の全体の役割は、
確実な証拠に基づかない推測である。
組換えDNA技術は酵母菌生物における分泌過程につい
ての未解決の問題を解決するうえで価値ある助力を提供
でき、そしてこのような生物および他の生物が、分離
し、成熟した形態の異種タンパク質の分泌を管理するこ
とを目的とした酵母菌宿主の適当な操作を達成するうえ
で、おびただしい量の異種ポリペプチド生産物を内生的
に生産することを可能とする前記技術の応用が明らかに
なると、考えられた。
本発明は、酵母菌生物が、通常は酵母菌に対して異種
であり、かつその生存に必要とされないタンパク質を発
現し、プロセシングし、そして分泌させるようにし、こ
うして生存物を保持し、望ましくないポリペプチドプレ
配列または他の発現のアーチファクトを伴わない、分離
した形態で酵母菌細胞を生産する培地から、タンパク質
を得ることができるという発見に基づく。異種のシグナ
ルポリペプチドと一緒にタンパク質が発現されると、発
現生産物はプロセシングされ、そして成熟した異種たん
ぱく質は細胞培養物の培地中へ移出される。生産物は、
比較的容易に培地から取り出され、生存しうる酵母菌細
胞を分裂的に妨害することを必要とせず、そして望まし
くない前配列または他の発現のアートファクト（たとえ
ば、AUG翻訳開始シグナルコドンの発現の結果物であ
る、異った第1N末端アミノ酸へ結合したメチオニン）の
除去を必要とせずに、使用のために別の自然な形態で回
収される。こうして、培地は生存しうるまたは分裂した
（すなわち、溶解した、そうでなければ破壊した）細胞
を実質的に含まない形態で得ることができ、そして、そ
れが所望の生産物を含有するものとして得られると、容
易に精製することができる。このような生産物は、精製
後、意図する用途に適合する。たとえば、ヒト白血球イ
ンターフェロンは、抗ウィルス剤および／または抗腫剤
として使用される（一般に、７〜17を参照）。
要約すると、本発明は、酵母菌の発現、プロセシング
および分泌の生産物として、酵母菌生物に対して異種で
あり、かつその生存能力を必要とせず、望ましくないポ
リペプチドのプレ配列または他の発現のアーチファクト
を伴わない分離した形態の、タンパク質、ならびにこの
ようなタンパク質を生産するときに使用する手段および
方法に関する。さらに、本発明は、このようなタンパク
質を生産することができる酵母菌培養物および生産物と
してこのようなタンパク質を含有する、得られる酵母菌
培養物を提供する。
ここで使用する「異種のタンパク質」という語は、通
常酵母菌生物により生産されないか、あるいは酵母菌生
物の生存能力を必要としない、タンパク質を意味する。
この用語は、このようなタンパク質を暗号化するDNA
を、組換え技術により、発現ベクター中に機能的な挿入
を意図し、そして前記発現ベクターは酵母菌生物宿主の
形質転換に使用される。DNAの機能的挿入は、異種タン
パク質を暗号化するDNAおよびプレ配列を、発現管理促
進系の調節のもとに、発現ベクター（Vector）中に挿入
することを意味する。このような異種タンパク質の例
は、次の通りである：ホルモン類、たとえば、ヒト成長
ホルン、ウシ成長ホルモン、など；リンフォカイン類；
酵素類；インターフェロン類、たとえば、ヒト繊維芽細
胞、ヒト免疫およびヒトおよび雑種白血球インターフェ
ロン、など；ウィルス抗原類または免疫原類、たとえ
ば、足および口の病気の抗原類、インフルエンザ抗原性
タンパク質、肝炎のコア（core）および表面の抗原類、
など；および種々の他のポリペプチド類、たとえば、ヒ
ト血清アルブミン、ヒトのインスリン、種々の他の糖タ
ンパク質類、など。「異種のプレ配列または異種の信号
ポリペプチド」は、酵母菌系により通常生産されない
か、あるいは使用されない、このようなポリペプチドを
意味し、そして問題の異種タンパク質に対して自然（本
来）の（native）信号ポリペプチドまたは問題の異種タ
ンパク質へ機能的に結合した異種（信号）ポリペプチド
から選択することができる。
ここで使用する「分泌」は、酵母菌有機体の原形質膜
を通過し、かつ少なくともその細胞壁に入るか、あるい
はそれを通過して、細胞培養物を保持する培地へ入る、
生産物の移出（exportation）を意味する。これに関し
て、ある場合において、「分泌された」生産物は、ある
方法で細胞壁と会合（associate）し、多分異る精製手
順または酵母菌宿主の構造および機能の修飾（modifica
tion）を必要とするであろう。「プロセシング」（proc
essing）は、外来のペプチドを伴わない、−−いわゆる
分離した（discrete）−−成熟した形態のタンパク質を
生産するための、成熟タンパク質からの信号ポリペプチ
ドの細胞の、分裂（cleavage）を意味する。外来のペプ
チドとは、発現のペプチドのアーチファクト、たとえ
ば、前述のメチオニンを包含する。プロセシングは、成
熟タンパク質との信号タンパク質の結合（union）の正
確な点に不活性化的でなく近接する位置において、信号
ポリペプチドの重要でない分裂を許す。
材料 すべてのDNA制限酵素および代謝酵素は、ニュー・イ
ングランド・バイオラブス（New England Biolabs）お
よびベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda R
esearch Labolatories）から購入した。DNA制限酵素お
よび代謝酵素は、それらのそれぞれの製造所が記載する
条件および緩衝液のもとで使用した。ATPおよびデオキ
シヌクレオチド トリホスフェート類dATP、dGTP、dCTP
およびdTTPは、PL バイオケミカルズ（Biochemicals）
から購入した。DNAリンカー（linker）類は、標準法に
よりつくった。
DNAの調製および形質転換 E.coliからの共有的に閉じた環状プラスミドDNA（1
8）の精製およびE.coli（19）の形質転換は、従来記載
された手順に従い行った。E.coliミニスクリーン（mini
screen）類は、記載されているもであった（20）。酵母
菌の形質転換は、記載されているように行ったが（2
1）、次ぎのように変更した。200mlの細胞を、２×107/
mlで使用し、25mlのH2Oを用い遠心により洗浄した。こ
れらの細胞は10mlの１モルのソルビトール、25ミリモル
のEDTA（pH＝８）および50ミリモルのジチオスレイトー
ルで30℃において10分間処理し、次いで10mlのソルビト
ールで洗浄した。次いで沈殿した細胞を10mlのSCE（１
モルのソルビトール、0.1モルのクエン酸ナトリウム、p
H＝5.8、および0.01モルのEDTA）の中におだやかに再懸
濁し、そして30℃において200μｇのジモリアーゼ（zym
olyase）60,000（Kirin Brewary）で処理した。100μｌ
の前記懸濁液を0.9mlの10％のSDSに加え、Abs800ｍμを
測定し、酵素の添加前に細胞を０％として希釈すること
によって、スフェロプラスティング（sheroplasting）
を実施した（10％のSDS中の溶解は、Abs800を減少し
た）。次いで、細胞を10mlのトールで３回洗浄した。細
胞は、０℃においてソルビトール中で数日間貯蔵した。
次いで細胞を１モルのソルビトール、10ミリモルのCaCl
2、および10ミリモルのTris−HCl（pH7.4）で１回洗浄
し、次いで1mlの同じものの中に再懸濁する。次いで５
〜15μｇの精製したプラスミドDNAまたは20μｇのE.col
i誘導ミニスクリーンDNA（LBにおいて成長させたE.coli
の5mlの静止培養物からのプラスミドDNAの2/5）を加
え、100μｌの前記再懸濁細胞とおだやかに15分間混合
した。次いで20（w/v）％のポリエチレングリコール400
0（Baker）、10ミリモルのCaCl2、および10ミリモルのT
ris−HCl（pH＝7.5）を含有する溶液の1mlを、おだやか
に混合しながら15分間加えた。次いで細胞を遠心分離
し、200μｌのSOS（１モルのソルビトール、33.5（v/
v）％のYEPD肉汁、および6.5ミリモルのCaCl2）の中に
おだやかに再懸濁し、30℃において20分間保温した。次
いで、この懸濁液の100μｌを、20mlの底部の寒天（H2O
の１当り182gのソルビトール、20gのグルコース、6.7
gのYNB、および30gのDifco寒天）を含有するペトリ皿の
上に置き、10mlの50℃の上部の寒天（底部の寒天と同一
であるが、底部の寒天の50mlにつき1mlのアデニン（1.2
mg/ml）、1mlのウラシル（2.4mg/ml）、および1mlの−t
rpドロップ−アウト（drop−out）混合物を含む）でお
おった［−trpドロップ−アウト混合物は、水の100mlに
つき、次ぎのアミノ酸を含有する:0.2gのarg、0.1gのhi
s、0.6gのile、0.6gのleu、0.4gのlys、0.1gのmet、
０、6gのphe、0.5gのthr］。このTrp+の選択は、プラス
ミドDNAの１μｇにつき103〜104の酵母菌形質転換体を
生ずる。
酵母菌プラスミドは、YNB＋CAA（上のStrains and Me
dia参照）中で15mlの酵母菌を静止相（Abs660＝５〜
６）に生長させることにより、上の手順におけるように
スフェロプラスチングすることにより、そして記載され
ている（20）ようにE.coliミニスクリーンの手順（リゾ
チームを使用せず）を使用することによって、酵母菌か
ら得た。
酵母菌中のプラスミドの安定性は、YNB＋CAA中の選択
的生長の間細胞を希釈し、そしてYEPD平板（非選択的）
上で平板培養することによって、決定した。プラスミド
の安定性のパーセントは、非選択的に生長したコロニー
の数から、選択的に生長しないものを減じ、非選択的に
生長したコロニーの数で割り、100を掛けることによっ
て、計算した。
株および培地 E.coliK−12株294（ATCC no.31446）（22）を、すべ
ての他の形質転換のために使用した。酵母菌株pep4−３
（20B−12、ｄ trpl pep 4−３）（23）およびGM3C−
２（α、leu 2−３、leu 2−112、trp 1−１、his 4−5
19、cyc 1−１、cyp 3−１）（24）を、酵母菌の形質転
換のために使用した。酵母菌株20B−12およびGM3C−２
は、制限なしにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（American Type Culture Collection）へ、19
82年３月５日に、それぞれATCC No.20626および20625で
供託された。種々の酵母菌株を使用できる−−Lodder,T
he Yeasts,a Taxonomic Study,North−Holland and Pub
l.Co.,アムステルダム参照。同様に、種々の培地を使用
できる−−Difco Manual of Dehydrated Culture Media
and Reagents for Microbiological and Clinical Lbo
latory Procedures,9th Ed.,DIfco Laboratories,Inc.,
ミシガン州デトロイト（1953）参照。
LBは、Miller（25）により、培地をオートクレーブ処
理し、そして冷却した後、20μg/mlのアンピシリン（Si
gma）を添加されたと、記載されている。酵母菌は次ぎ
の培地上で生長させた:1％の酵母エキス、２％のペプト
ンおよび２％のグルコース±３％のDifco寒天を含有し
たYEPD。YMB＋CAAは、11につき、6.7gの酵母窒素基剤
（アミノ酸を含ない）（YNB）（Difco）、10mgのアデニ
ン、10mgのウラシル、5gのDifcoカサミノ（casamino）
酸類（CAA）、20gのグルコースおよび±30gの寒天を、
含有した（Trp+の選択に使用した）。
生長曲線および抽出物 酵母菌株YEpIPT−preLeIF−Ａ53t/pep4−３およびYEp
IPT−LeIF−Ａ1t/pep4−３の個々のコロニーを、100ml
のYNB＋CAA中で30℃において７時間ほぼ1.1のA660に生
長させた。これらの培養物の100mlを、YNB＋CAAで１
に希釈して、0.1のA660の溶液を形成した。次いで１
のこれらの培養物を30℃で生長させ、10mlのアリコート
を周期的に抜き出して、光学濃度、インターフェロンの
生産および分泌を測定した。測定のため、10mlのアリコ
ートを7Krpmにおいて15分間Sorval RC3B内で遠心分離し
た。上澄み（培地）を、希釈せずに測定した。細胞は等
体積のガラスビーズを含有する0.7mlの７モルのグアニ
ジン−HCl中に再懸濁させた。次いで、細胞溶解物を、
測定のため、PBS/BSA（150ミリモルのNaCl、20ミリモル
のリン酸ナトリウム（pH＝7.9）、および0.5％のウシ血
清アルブミン）中に希釈した。
インターフェロンの測定 酵母菌の抽出物を、インターフェロンの標準と比較す
ることにより、細胞変性作用（CPE）阻止の測定（26）
により測定した酵母菌の抽出物は、次ぎのようにして調
製した:10mlの培養物を、A660が１〜２にほぼ等しいく
なるまで、YNB＋CAA中で生長させた。細胞を遠心分離に
より集め、次いで3mlの1.2モルのソルビトール、10ミリ
モルのKH2PO4、pH＝6.8および１％のチモリアーゼ60,00
0の中に再懸濁し、次いで30℃で30分間（90％のスフェ
ロプラスチングに）保温した。スフェロプラストを3000
×ｇにおいて10分間沈殿させ、次いで150μｌの７モル
のグアニジン塩酸塩（GHCl）プラス１ミリモルのフェニ
ルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）の中に再懸濁
した。抽出物を、測定直前に、PBS/BSA緩衝液（20ミリ
モルNaH2PO4、pH＝7.4、150ミリモルのNaCl、0.5％のBS
A）で20〜100倍に希釈した。別方として、10mlの細胞を
同じA660において沈殿させ、約0.4mlのガラスビーズ
（0.45〜0.5mm、Brawn Melsurgen AG）を含有するエッ
ペンドルフ（Eppendorf）（1.5ml）管内の0.4mlの７モ
ルのGHCL中に再懸濁した。これらの管を、氷を間に保持
しながら、最高の渦装置において２回渦を発生させた。
抽出物をエッペンドルフの遠心分離機で５分間遠心分離
し、PBS/BSA緩衝液中で希釈した。バイオアッセイを、M
DBK細胞（26）を用いてLeIF A、LeIF Dおよびプレフォ
ーム（pre−form）類につて、そしてヘラ（HeLa）細胞
（26）を用いてIFN−γおよびpreIFN−γについて、実
施した。
培地からの（preD/A）の精製 酵母菌株YEpIPT−preLeIF−Ａ53t/pep4−３の単一コ
ロニーを、30℃において500mlのUNB＋CAA中でA660に生
長させた。この培養物の500mlを、YNB＋CAAで5lに希釈
してA660＝0.21とした。得られる5lの培養物をA660＝４
まで30℃において生長させた。この時点において、5lの
培養物を、7,000rpmにおける10分間の遠心分離により収
穫した。発酵の間10mlのアリコートを周期的に取り出し
て、光学濃度、インターフェロンの生産および分泌を測
定した、。測定前、各アリコートをベンチ・トップ（be
nch−top）冷却遠心機内で５分間遠心分離により、培地
から細胞を分離した。培地および細胞を前述のように測
定した（第９図、第10A図および第10B図参照）。
培地を200mlに最終体積に濃縮し、次いでアミコン（A
micon）の細いチャンネル装置（TFC 10）において1000
ダルトンの限外膜（Ｏ−PS、Osmosis）上で、tris/cys/
EDTA、pH＝8.0に対して透析ろ過した。保持液（200ml）
を、アフィゲル（Affigel）10（BioRad）へ共有結合し
たLeIF−Ａに対する抗体を含有する免疫親和カラムの1.
5mlに、15ml/hの流速で通過させた。もとの溶液中のイ
ンターフェロン活性の80％より多くがカラムへ結合し
た。次いで、貫流をこのカラムへ、40ml/hの流速で再適
用した。第２の適用後、もとのほぼ７％が貫流中に存在
した。次いで、カラムをtris/cys/EDTA、pH＝8.0中の0.
2モルのNaClで洗浄した。活性のはお1.7％が、この洗浄
の間溶離された。
次いで、インターフェロン活性の全部（もとの活性の
ほぼ50％）を、51.5mlのpH5.5no脱イオン水でカラムか
ら溶離された。最後にカラムを22.5mlの0.2モルの酢酸
で洗浄して、残っているかもしれないタンパク質を溶離
した。もとの活性のほぼ８％が溶離された。酢酸の溶離
後、カラムをtris/cys/EDTA、pH8.0で最平衡化した。2.
25〜4.5の分画が、水、酢酸およびtris/cys/EDTAの洗浄
の間収集された（第11図）。分画番号１〜７をプール
し、凍結乾燥乾固した。残留物を200μｌの0.1％のトリ
フルオロ酢酸（TFA）、pH2.5中に再溶解し、さらにシン
クロパック（Synchropak）RP−ＰカラムでHPLCにより精
製した。このカラムを、1ml/mの流速において、0.1％の
TFA中の０〜100％のアセトニトリルの直線の勾配で溶離
した。1mlの分画を集め、前述のようにPBS/BSA中への希
釈後、測定した。また、精製したIFN−Ａの2.5μｇの試
料を、対照としてクロマトグラフ処理した（第12図）。
インターフェロン活性は、分画39付近に中心をなす単一
のピークとしてカラムから溶離された。この分画を凍結
乾燥乾固し、残留物を配列（sequence）した。
配列の分析 配列の分析は、エドマンの減成（27）に基づく。試料
をベックマン890B回転カップのシークエンサー（sequen
cer）に導入した。Poiybrene（商標）（ポリ−N,N,N,N1
N1−テトラリメチル−Ｎ−トリメチレンヘキサメチレン
ジアンモニウムジアセテート）を、このカップ中で坦体
として使用した。このシークエンサーを冷却トラップお
よびいくつかのプログラムの変化で変更して、バックグ
ラウンドのピークを減少した。試薬は、ベックマンの配
列級の0.1モルのQuadrol緩衝液、フェニルイソチオシア
ネート、およびヘプタフルオロ酪酸であった。
また、変更は、２−アニリノ−５−チアゾリノン誘導
体がシークエンサーから抽出されるとき、前記誘導体の
自動的転化を包含した。１−クロロブタンをPierce rea
cti−Vial（商標）中に集め、窒素のもとに乾燥した。
次いで水中の25％のトリフルオロ酢酸（TFA）を２−ア
ニリノ−５−チアゾリノンに加え、20℃において10分間
加熱して、それを３−フェニル−２−チオヒダントイン
（PTH誘導体）に転化した（29）。次いでPTH−アミノ−
酸残留物を50％のアセトニトリルおよび水中に自動的に
溶かし、逆相高圧液体クロマトグラフト中に注入した。
次いでPTH−アミノ酸は、転化びんへ導入し、シークエ
ンサーからのサイクルと同じ方法で処理した、PTH−ア
ミノ酸の標準混合物の保持時間との比較により、同定し
た。
ウェスターン・ブロッティング（Western Blotting）手
順 タンパク質を、まず、ニトロセルロース紙（Ｓ＋S BA
85）への電気泳動転写前に、ドデシルスルホン酸ナト
リウムの存在下にポリアクリルアミドのスラブゲル上で
電気泳動に付し、引き続いてHGHの免疫学的同定に付し
た。25ミリモルのTris、195ミリモルのグリシンを含有
する転写緩衝液、pH8.4でゲルおよびニトロセルロース
紙を簡単に洗浄した後、転写装置（Electroblot,E.C.Ap
peratus Corp.,St.Petersburg,FL）を組立た。転写を40
0maにおいて1.5時間実施し、次いでブロット（blot）を
50分間のTris、pH7.4、0.15モルのNaCl、５ミリモルのE
DTA、0.25％（w/v）のゼラチン、0.05％の次いで40中に
に入れ、一夜おだやかにかきまぜた。ウサギ抗ヒトhGH
抗血精を、ブロットおよびNP−40ゼラチン緩衝液（典型
的には、100u/cm2）を含むプラスチックバッグに入れ、
おだやかに揺動しながら室温において２時間保温した。
ブロットを水で簡単に、NP−40/ゼラチンで１時間洗浄
し、そしてSeal−ａ−Mealバッグ内のNP−40/ゼラチン
緩衝液中に希釈した［125I］タンパク質Ａ（New Englan
d Nuclear）で、室温においておだやかに揺動しなが
ら、１時間プローブ（probe）した。水で数回洗浄した
後、ブロットをセロファンで包み、増強スクリーンをも
つＸ−Omat−ARフィルム（Kdak）とともにカセット内に
−70℃において一夜入れた。
ゲルの着色 タンパク質を含有するポリアクリルアミドのゲルを、
Oakley et al（41）の方法により着色した。
ほ乳動物のインターフェロン遺伝子分泌信号配列 白血球（７）、線維芽細胞（10）、および免疫（30）
のインターフェロンについての遺伝子を含有するcDNA類
の最近の単離では、異種構造の遺伝子の発原系としての
酵母菌の最近の発展を見ると、酵母菌における信号ペプ
チド配列のための暗号化区域を含有する異種構造遺伝子
の発原を試験することが可能となった。
第１図は、５種類の異なるインターフェロンの信号配
列を示す。これらのアミノ末端配列は、ほ乳動物からの
インターフェロンタンパク質の分泌を促進すると信じら
れる。こ過程の間、信号配列は−１と＋１との間の特異
的プロテアーゼ開裂により、インターフェロンのいわゆ
る成熟形態として知られているものが得られる。これら
の配列は、他の分泌信号配列の一般特性をもつ（31）。
それらのすべては、非常に疎水性であり、他の信号とは
ぼ同じ長さをもち、そして開裂部位の左に小さいアミノ
酸をもつ。preLeIF、preLeIFAD、およびPreIFN−γは、
すべてグリシンとシステインとの間で開裂するが、PreI
FN−βにより明らかなように、これは他のほ乳動物の信
号については一般的規則ではない。
事実、有機体間または同一有機体内には共働の（cons
ensus）信号配列は存在しない。また、信号配列とタン
パク質生産物の成熟形態との間に開裂点は存在しない。
したがって、酵母菌における前インターフェロン（pr
e−interferon）類の発原を試みて、これらの異種構造
タンパク質が酵母菌から分泌されるかどうか、およびこ
れらのタンパク質のプロセシングの性質がなんであるか
を、決定することに大きい興味をもった。酵母菌はほ乳
動物の細胞に似た真核生物の有機体であり、そして酵母
菌は高等真核生物に対して多くの面で似た分泌の通路を
有するように思われる（１、32）が、それは非常に原始
的な真核生物であり、そしてこれらの遺伝子生産物の適
切な機能およびプロセシングは、酵母菌とほ乳動物の細
胞との間にプロセスの大きな保存を必要とするであろ
う。しかし、その結果はまったく明らかでない。
前インターフエロン遺伝子の発言のための酵母菌プラス
ミドの構成 酵母菌における異種構造遺伝子の発現のためのプラス
ミドの構成の情報は、刊行物に記載されている（14）。
この研究に使用したプラスミドは、第２図に示されて
いる。このプラスミドは、アンピシリン抵抗（Ap R）、
およびE.Coliにおける選択および安定な生長のための複
製のE.Coli源を有するpBR322（33）の一部分を含有する
（生体外構成と酵母菌の形質転換との間の中間体として
使用する）。また、プラスミドは、酵母菌の染色体III
から発生するEcoRI〜Pst１断片上のTRP１遺伝子を含有
する（34〜36）。
この遺伝子はtrp1-酵母菌における選択を許し、こう
してプラスミドを含有する酵母菌細胞を単離しかつプラ
スミドを維持するために使用できる。さらに、プラスミ
ドは、内生酵母２μプラスミドDNAからの2.0kbpの断片
上に複製の酵母源を含有する（37）。この源はDNAが酵
母菌中で自律的に複製し、かつプラスミドとして維持さ
れることを許す。
この系の主成分は、プラスミド中のEcoRI部位のみの
付近の転写から生ずる酵母菌の３−ホスホグリセレート
キナーゼ（PGK）プロモーター断片である（この他のEco
RI部位は、E.coli DNAポリメラーゼＩ（Klenow）を使用
し、次いでブラント（blunt）末端を結合することによ
り、制限された部位における充填（filling）により除
去される）。
3-ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）遺伝子（37a）
および1.6kbpのプロモーター断片の構成（前記）は、ど
こかで論じられた。染色体IIIの酵母菌TRP１遺伝子区域
（34〜36）からのHindIII/BglIIは、pBR322のBamHI部位
と結合し、プラスミドテトラサイクリン感受体（Tc 3）
をつくるための、HindIII〜BglIIのコンバーター（conv
ertor）として使用した。さらに、２μのDNAからの2.0k
bpの断片は他の機能を行い、それは通常２μのプラスミ
ドにおける「エイブル（Able）」遺伝子（37）のための
停止信号である転写停止／ポリアデニル化信号を含有す
るということを、述べるべきである。このような区域
は、すぐれた発現のためには必須であるように思われ
る。右の配向におけるEcoRI断片としての遺伝子挿入体
は、次いで、ベクターが酵母菌中に入れられるとき、タ
ンパク質として発現されることができる。
種々のインターフエロン遺伝子の発現のための酵母菌プ
ラスミドの構成 酵母菌発現プラスミドYEpIPTは、信号EcoRI制限部位
を含有する。異質遺伝子をこの独特のEcoRI部位に挿入
すると、酵母菌ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）プ
ロモーターの調節のもとに、この遺伝子は発現される。
この酵母菌プラスミドのEcoRI部位への種々のインター
フエロン遺伝子を挿入するための１つの便利な方法は、
種々のインターフエロン遺伝子の開始コドンおよび停止
コドンをフランキング（flanking）するEcoRI部位をも
つDNA断片をもつことである。われわれは、ここにイン
ターフエロン遺伝子の発現のためのこのようなEcoRI断
片の構成を記載する。遺伝子の３′‐末端におけるEcoR
Iノンコンバーター類を使用することが重要である。な
ぜなら、それらは転写を停止しないが、２μのターミネ
イター（terminator）への転写を許すからである。
われわれは、成熟IFN−α１遺伝子（14、17）、成熟I
FN−α２遺伝子（７）、成熟IFN−β遺伝子（10）、お
よび成熟IFN−γ遺伝子（30）のためのATG開始コドンの
すぐ前のEcoRI部位の構成を、前に記載した。
DNA制限分析は、IFN−α１のcDNAクロン（８）の３′
‐非暗号化区域に好都合に位置するEcoRI部位が存在
し、こうしてEcoRIによるプラスミドpLeIFD3（17）の消
化はIFN−α１遺伝子を含有する583bpのEcoRI断片を発
生することを示す。
第３図は、pre−IFN−α１遺伝子を含有するEcoRI断
片の構成を示す。HaeIII部位は、pre−IFN−α１の第１
および第２のアミノ酸の間に位置する（８）。暗号化区
域の中央においてこのHaeIII部位からBglII部位へ延び
る、部分的にHaeIII消化された254bpの断片は、単離さ
れた。自己相補性の合性オリゴヌクレオチド５′−CCAT
GAATTCATGG−３′は、ATG開始コドンに先行するEcoRI部
位を発生させるために、254bpのHaeIII−BglII断片へブ
ラント末端において結合させた。次いで、264bpのEcoRI
−BglII断片を、EcoRIおよびBglIIで結合混合物を消化
することにより単離した。次いで、preIFN−α１遺伝子
の前半分を含有する、このEcoRI−BglII断片を、pre−I
FN−α１遺伝子の後半分、すなわちBglIIおよびEcoRIに
よるIFN−α1 cDNAクロンの消化から単離された372bpの
BglII−EcoRI断片、へ結合した。次いで、全pre−IFN−
α１遺伝子を含有するEcoRI断片を、EcoRIで結合混合物
を消化し、そして636bpの断片を単離することにより、
発生させた。
第４図は、成熟IFN−α２遺伝子を含有するEcoRI断片
の構成を示す。ATG開始コドンの直前にEcoRI部位をも
ち、かつcDNAクロンから誘導された400bpの３′‐非暗
号化区域をもつ、成熟IFN−α２遺伝子を含有する876bp
のEcoRI−PstＩ断片は、プラスミドpLeIFA25（７）をEc
oRIおよびPstＩで消化することにより単離した。次いで
この876bpの断片のPstＩ末端を、受容体断片を用いるこ
とにより、EcoRIに変換した。この978bpの受容体断片
は、内部のEcoRI部位を含有し、そして両末端上にPstＩ
部分を有する。１つのPst末端からEcoRI部位へ延びる23
0bpのこの断片は、酵母菌プラスミド２μDNA（37）から
誘導される。EcoRIから他のPstＩ末端へ延びる断方の残
部の748bpは、バクテリアのプラスミドpBR322（全断片
はYEp13（37b）から誘導される）から誘導される。この
受容体断片を、成熟IFN−α２遺伝子を含有する876bpの
EcoRI−PstＩ断片へ結合し、次いでEcoRIで消化する
と、両末端上にEcoRI部位をもつ成熟IFN−α遺伝子を含
有する1096bpの断片を発生する。
第５図は、pre−IFN−α２遺伝子を含有するEcoRI断
片の構成を示す。制限分析は、pre−IFN−α１およびα
２遺伝子の両者の前配列中の第14および第15のアミノ酸
の間に存在する共通のDdeI部位を示す。pre−IFN−α１
遺伝子を暗号化するEcoRI断片から誘導された44bpのEco
RI−DdeＩ断片をIFN−α２のcDNAクロンから誘導された
900bpのDdeＩ−PstＩ断片と結合し、次いでEcoRIおよび
PstＩで消化すると、944断片を発生する。この944bpのE
coRI−PstＩ断片は、IFN−α１から誘導されたプレペプ
チド中の最初の14アミノ酸の暗号化配列、プレペプチド
の残部の暗号化配列、およびIFN−α２から誘導された
全成熟タンパク質を含有する。次いで、成熟IFN−α２
のためのEcoRI断片の構成の場合におけるように、受容
体断片を用いて、この944bpの断片のPstＩ末端をEcoRI
部位に変換した。
第６図は、初めのATGコドンに先行する70bpの先導（l
eader）配列をもつ、pre−IFN−γ遺伝子を含有するEco
RI断片の構成を示す。IFN−γcDNAクロン（30）の消化
は、60bpの5-フランキング配列、pre−IFN−γの全暗号
化配列、および290bpの３′‐非暗号化配列をもつ、842
bpのSau3A断片を発生する。次いで、このSau3A断片をBa
mHI消化ベクターpUC7、すなわち１本鎖のフアージＭ13m
p7（38）のプラスミドの同等物（counterpart）、ノン
クローニングした。プラスミドpUC7は、pBR322から、ま
ずテトラサイクリン抵抗遺伝子を含有する2,067塩基対
のEcoRI−PvuII断片を取り出し、フアージEcoRI−PvuII
断片を取り出し、フアージM13誘導体mp7（38）からの42
5塩基対のHaeII断片を、生ずるプラスミドのHaeII部位
の2352位置（pBR322の表示法に関して）に挿入すること
によつて、誘導した。mp7からのHaeII断片は、配列の多
制限酵素クローニング部位がβ‐ガラクトシダーゼの第
４および第５のアミノ酸残基の間に挿入されている、E.
coli lac Z遺伝子のＮ−末端暗号化区域を含有する。異
質DNA断片をこれらのクローニング部位へ挿入すると、l
acプロモーターおよびlac Z遺伝子の間の連続性を分裂
し、こうしてプラスミドで形質転換されたJM83の表現型
をlac+からlac-へ変更する。pUC7の多制限クローニング
部位におけるBamHI部位をフランキングする２つのEcoRI
部位が存在するので、842bpのSau3A挿入体を含有するプ
ラスミドをEcoRIで消化すると、EcoRI部位がフランキン
グする全pre−INF−γ配列を含有する862bpの断片が生
ずるであろう。
プラスミドpIFN−γtrp48（30）をEcoRIおよびBglＩ
で消化すると、ATG開始コドンに先行するEcoRI末端、成
熟IFN−γの全暗号化配列、および210bpの非暗号化配列
を有する689bpの断片を発生する。次いで、BglＩ末端
は、前述のpre−INF−γ EcoRI断片から誘導された29b
pのBglＩ−EcoRI受容体へ結合することにより、EcoRI末
端へ変換した。引き続いて結合混合物をEcoRIで消化す
ると、成熟IFN−γ遺伝子を含有する718bpのEcoRI断片
が発生するであろう。
第７図は、EcoRI末端とATG開始コドンに先行する配列
AAAをもつpre−INF−γ遺伝子を含有する、EcoRI断片の
構成を示す。前述のpre−INF−γ遺伝子を含有するEcoR
I断片を、EcoRIおよびMboIIで消化して184bpの断片を発
生させた。この断片は、pre−INF−γ遺伝子の前部を含
有し、加熱変性およびアニーリングして（10）pre−INF
−γ遺伝子の最初の４アミノ酸のための５′‐キナーゼ
化合成オリゴヌクレオチド５′‐pATGAAATACA暗号にし
た。EcoRI−MboII断片の下部鎖、鋳型、およびプライマ
ーとしてオリゴヌクレオチドでは、E.coliDNAポリメラ
ーゼのクレナウ（Klenow）断片を使用して、上部鎖を合
成し、そして下部鎖から３′‐突起末端を除去した。AT
G開始コドンから最初のMboII部位の下流に延びる、得ら
れる178bpのブラント末端の断片を、次いで自己相補性
の５′−TTTGAATTCAAA−３′EcoRIリンカー（linker）
へ結合した。結合混合物をEcoRIおよびDdeＩで消化する
と、pre−INF−γ遺伝子の前部を含有する165bpのEcoRI
−DdeＩ断片を発生する。次いで、INF−γ遺伝子の背部
および３′−非暗号化区域を含有する600bpのDdeＩ−Ec
oRI断片を結合することにより、全遺伝子を組み立て
た。次いで、結合混合物をEcoRIで消化させて、全pre−
INF−γ遺伝子を含有する765bpのEcoRIを発生させた。
すべてのこれらのEcoRI断片の構成の要約（Ｉ〜IX）
を第８図に示す。すべてのこれらの構成は、酵素を用い
る発現および分泌の実験のためベクターYEpIPT（第２
図）中に配置した。
これらのプラスミドを含有する酵母菌によるインターフ
エロンの発現および分泌のレベル 第８図からのEcoRI−断片遺伝子をYEpIPI（第２図）
中に入れ、配向について検査し、そして酵母菌中に入れ
た後、Trp+相補性を用いて、それらのプラスミドを含有
する酵母菌を、抽出物、解放された細胞壁物質、および
培地についての細胞変性効果（CPE）測定（26）（バイ
オアツセイ）を用いて、インターフエロンについて測定
した。インターフエロンの測定は、酵母菌培養物中の３
つの明確な画分的位置について行つた。このような測定
の結果を表Ｉに示す。
ａ）抽出物調製の方法参照。２つの方法を抽出に使用す
ることに注意。細胞がスフエロプラスチングされると
き、「細胞内」の量は実際に内部の物質である。しか
し、N.D.（測定せず）を特定するとき、「細胞内」の量
および「細胞壁除去後の解放」は両者とも「細胞内」の
量の一部分である−−この型の抽出物は細胞壁を除去し
ないでガラスビーズ処理した細胞を含む。スフエロプラ
スチングしないガラスビーズ抽出は、常にIFN−γおよ
びpreIFN−γについてなされたこと、およびPBS緩衝液
を７モルのGHClの代わりに使用した。
ｂ）LeIFNおよびLeIFDの特異的活性は、計算すると、両
者とも108U/mgであると推定される。酵母菌培養物は、
培養物中にAbs660＝１において約100mgのタンパク質を
含有する。
ｃ）スフエロプラスチング手順を参照。
ｄ）測定を実施した倍地のAbs。
ｅ）分泌パーセントは「細胞壁除去後の解放」のパーセ
ントプラス「細胞外」のパーセントである。スフエロプ
ラスチングを実施しないとき、「分泌された活性のパー
セント」はこの細胞壁の分泌活性を含まず、そしてパー
セントは実際よりも低い（多分1/2）であろう。
最初の画分は細胞の内部である。この分画は、細胞壁
の除去後、細胞抽出物をつくることにより測定し、そし
て分泌されないインターフエロン活性を定める。他の２
つの画分は、倍地（酵母菌細胞から完全に分離された物
質）と、チモラーゼを用いて細胞壁の除去後解放された
活性（分泌された物質であるが、細胞壁中に非共有的に
捕捉される）。倍地の分画および細胞壁の除去後解放さ
れた分画の両者は、合計の分泌された物質を表わす。あ
るいは、細胞壁が除去されないとき（方法を参照）、細
胞内活性は細胞壁中に付着した分泌された活性をも含
む。
表１において（pre D/A）Le IFAは、雑種信号ペプチ
ド配列をもつ成熟遺伝子であることに注意すべきである
（第１図および第８図参照）。この構成は前述したとお
りであるが、それを見ると、preLe IFDおよびpreLe IFA
の両者に対して共通であるDdeＩ制限部位を用いて構成
された。第１図は、アミノ酸−10におけるこのDdeＩ制
限部位を用いて構成された。第１図は、アミノ酸−10に
おけるこのDdeＩ部位を示す。下線を付したアミノ酸
は、preLe IFDおよびpreLe IFAのアミノ酸配列の間の差
を表わす。雑種（pre D/A）Le IFAは、pre Aよりもpre
Dに似ている。
成熟Le IFAおよびLe IFD遺伝子（構成ＩおよびIII）
の両者は、酵母菌において、1.0％の合計の細胞タンパ
ク質のレベルで発現される（2.0％のレベルも見られ
た。）これらの遺伝子または前遺伝子の誤まつた配向
は、発現しない。これらの２つの遺伝子ならびに成熟IF
N−の遺伝子については、分泌は起こらない。しかしな
がら、前配列をこれらの遺伝子上に使用しない場合、す
べての３種の生産物は培地中に分泌された生産物として
見出される。８％程度に高いレベルは、（pre D/A）LeI
FAの培地中にAbs 660＝３〜４において観測された。すべ
てのこれらのプラスミドは、自律的に複製するプラスミ
ドの存在を立証するTrp+選択的圧力のもとで生長する培
養物の細胞の95％にあることに、注意すべきである。
pre D/A）LeIFA遺伝子を含有する酵母菌からの培地中の
生長曲線および生産物 ２種のインターフエロン生産性酵母菌を、それ以上の
特性づけにより研究した。これらはYEp1PT-preLeIFA53t
/pep4-3およびYEp1PT-LeIFA1/pep4-3であつた。前者は
構成IV（第８図）の２つのコピーをYEp1PTのEcoRI部位
に含有し、そして細胞内、細胞壁中、および細胞外（培
地）に存在する活性を生ずる。この２つのコピー（直列
−両者は適切な発現のための配向をしている）を含有す
るプラスミドを、単一のコピーの構成の代わりに使用し
た。なぜなら、それは時にはより高いレベルのインター
フエロン活性を培地中に与えるからである。Pep4-3酵母
菌は、培地から減成しないタンパク質（インターフエロ
ン）を得るために有利であるかもしれない、細胞内およ
び細胞外のプロテアーゼレベル（23）が大きく減少して
いるので、それを使用した。
後者は、YEp1PT中に構成III（第８図）を含有し、そ
して細胞内で成熟LeIFAを発現するが、分泌しない。
第９図は、YNB＋CAA中にこれらの２種の酵母菌株の生
長曲線を示す（Trp+選択的生長）。ログ（log）相はAbs
660ｍμ＝３〜４に続き、次いで静止相が始まる。両者
の曲線は本質的に同一である（これにより、これらの２
種の異なるタンパク質〔LeIFAおよび（pre D/A）LeIF
A〕の生産が酵母菌の生長または生存性に影響を及ぼさ
ないことが示唆される。バイオアツセイは、細胞の生長
の間、種々の時間において培地について実施して、これ
らの２種の株による培地におけるインターフエロンの生
産に依存する生長曲線を研究した。これらの結果から、
LeIFA上の前配列は培地中へインターフエロンを解放す
ることが明らかとなつた。この配列を用いないと、活性
は解放されない。また、培地中の活性のレベルは静止相
付近で最大になることが明らかである。
培地からの（pre D/A）LeIFAの精製 （pre D/A）LeIFAを酵母菌培地中へ分泌する過程の性
質を決定するためには、培地からのタンパク質生産物を
精製することが必要であつた。酵母菌がタンパク質を分
泌できる場合、それは哺乳動物の細胞が通常前インター
フエロンタンパク質でなすように、分泌の過程の間ある
方法でアミノ末端を多分プロセシングするであろう。そ
れ以上の実験の目的は、このプロセシングの性質を、次
のように決定することであつた。
Ａ）5lの発酵 第10A図は、細胞壁内および同じ発酵の間の細胞中の
インターフエロン活性を示す。これらの抽出は、沈殿、
および引き続く７モルのGHCl中のガラスビーズ処理によ
り実施した。この活性は細胞内物質と細胞壁中の物質を
含有するからである。この活性はAbs660ｍμ＝1.5〜2.0
において約25×106U/lの最大値に到達し、これにより細
胞内のインターフエロンの生産が細胞外の物質と異なり
静止前のログ（log）相において終ることが示唆され
る。こうして活性の約８％が培地中に自由に分泌され
る。しかしながら、再び多くの活性は細胞壁中に存在し
うる（表１参照）。抽出物質はほとんど細胞内のインタ
ーフエロンを含有し、そしてこの物質はここでそれがプ
ロセシングされるか否かについて見るために、精製す
る。
第10B図は、YNB＋CAA中のYEp1PT-preLeIFA53t/pep4-3
の5lの発酵についての生長曲線である。発酵の終りにお
いて、MPBK測定によると、約2.0×106U/lのインターフ
エロン活性が存在した。再び、最高の生産は静止相にお
いて見られる。この培地中のインターフエロン生産物
は、静止相に到達した後、30℃においてさらに24時間振
とうさせてさえ、非常に安定であることに注意すべきで
ある。この培地は、それ以上の精製工程のために使用し
た。
Ｂ）免疫親和性カラム上への培地濃縮物 YEp1PT-preLeIFA53t/pep4-3からの培地をまず遠心分
離した。この濃縮物を、成熟LeIFAに対するモノクロン
抗体を含有するカラム上に置いた。tris/cys/EDTA、pH
＝8.0中の0.2モルのNaClで洗浄した後、インターフエロ
ンは第11図に示すようにH2O（pH＝5.5）で溶離した。溶
離されたピークＡ（矢印はH2Oを適用したときを表わ
す）は、この方法で得られ、そしてカラム上に置いた活
性の50％を表わす。ピークＡをカツコで示すようにプー
ルし、さらに精製するために使用した。0.2モルの酢酸
で溶離すると、ピークＢ（矢印は緩衝変化の点を表わ
す）が生じ、そして位置Ｃはもとの洗浄緩衝液の適用点
を表わす。
Ｃ）ピークＡ活性のHPLC実験 ピークＡの分画を凍結乾燥乾固し、次いでHPLC上に流
した（方法参照）。第12図はこの実験の結果を図解す
る。精製したLeIFA（E.coliから）の2.5μｇの試料を、
対照として別に実験した。
標準および（pre D/A）LeIA（またはpre LeIFA）の両
者は、図面から明らかなように、同じ保持時間を有し
た。これらの結果が示すように、培地からのインターフ
エロンは、pre LeIFAが非常に異なる保持時間をもつの
で、プロセシングされた。このHPLCの実験からの陰影を
つけた分画を次いでタンパク質配列に使用した。
酵母菌培地から精製された（pre D/A）LeIFAのNH2‐末
端配列 第13図は、精製されたインターフエロンを配列した結
果を示す。上の配列は、プロセシングが起こらない場合
（pre D/A）LeIFAについて期待されるものである。哺乳
動物の細胞により多分認識される、このインターフエロ
ンの正常の開裂点が示されている。
タンパク質配列は、PTHアミノ酸が各対応するエドマ
ン（Edman）サイクルにおいて増加し、次いで次のサイ
クルにおいて減少するということを認めることによつ
て、判読した。通常低い回収率を与えるPTHアミノ酸（c
ys,ser,thr,arg,his）は、他のPTHアミノ酸が見られな
いとき、仮定された。mg量は、判読した残留物の面積
を、同じHPLCによるPTHアミノ酸の標準混合物からの面
積と比較することによつて、推定した。Nor-ロイシンの
内部標準を各クロマトグラムに導入して、保持時間が再
現性であるようにした。
第13図は、精製した（pre D/A）LeIFAについて得られ
たタンパク質の配列の結果を示す。プロセシングが起こ
らない場合期待される配列と、哺乳動物の細胞における
この前インターフエロンの正常の開裂点も示されてい
る。２回の独立の配列の実験を、細胞および培地からの
２種の異なる精製された試料について実施した。第13図
が示すように、培地中のインターフエロンの大部分は適
切にプロセシングされた（64％）が、前配列の３種の追
加アミノ酸を含有する他の形態（36％）も存在した。細
胞内インターフエロンもこれらの２種の形態をわずかに
異なる比率で、ならびに前配列の８アミノ酸を含有する
第３の形態を含有した。完全な長さの前配列は、決して
観察されず、これにより酵母菌がpre-IFNのすべてをあ
る方法でプロセシングすることが示唆された。
前配列の３種のアミノ酸を含有するプロセシングされ
た形態は、pre D/A信号配列の雑種の性質から生じたこ
とがありうる。したがつて、非雑種（pre D）LeIFDのプ
ロセシングも検査した。Pre DはPre D/Aとアミノ酸の位
置−２においてのみ異なる（leu対val）。培地から精製
したpre IFN−α１のプロセシングを検査したとき、＋
１および−３の両者の形態が再び観察された（第13
図）。しかしながら、少量の種も培地中に−14形態とし
て存在し、これは（pre D/A）LeIFAには見られなかつ
た。
S.cerevisialからの異種構造タンパク質の分泌を研究
するために、いく種類かの成熟インターフエロン（IF
N）およびいく種類かのpre IFNについての遺伝子の生体
内転写のための、プラスミドを構成した。疎水性信号ペ
プチドの暗号配列が存在するときはいつでも、IFN抗ウ
イルス活性を宿主細胞および培養培地の両者から回収す
ることができ、一方合成が成熟IFN遺伝子により支配さ
れたIFNのすべては細胞内にとどまつた。構成を行うこ
とにより、インターフエロン遺伝子が、（pre D）LeIFD
におけるように、それ自体の自然信号配列を有するか、
あるいは（pre D/A）LeIFAにおけるように、２つのIFN-
α種の複合体として設計された雑種信号配列を有するか
について、分泌の要件を特性づけようと試みた。一般
に、これらの構造を収容する酵母菌細胞は培養培地中に
分泌したが、活性の量は株の間で異なり、そして精製
し、配列したIFN種も異なつた。
発現した合計のインターフロンの90％を構成する分泌
されないインターフエロンの３種の形態を、（pre D/
A）LeIFA遺伝子を収容する細胞から精製した。１つの形
態（33％）は適切に処理され（＋１、第13図）、第２の
形態（55％）は３種の追加のアミノ酸を含有し（−３、
第13図）、そして第３の形態（11％）は８種の追加のア
ミノ酸を含有した。最後の形態は培地中に見られなかつ
たが、完全な長さの前配列をもつIFNは細胞または培地
のいずれにも決して観察されなかつた。
（preD）LeIFDのプロセシング （pre D/A）LeIFA酵母菌について使用した振とうフラ
スコの生長の代わりに、（preD）LeIFD発現酵母菌を10l
の発酵器内でA550＝60に生長させた。
培地から精製した（pre D）LeIFDのプロセシング（精
製はpre D/ALeIFAと同じ）を検査したとき、＋１および
−３の両者の形態が観察された。追加の少量の種も培地
中に−14形態とし存在した。培地タンパク質対細胞タン
パク質のSDSゲル電気泳動により検査したとき、培地中
に細胞溶解の証拠は存在しなかつた。興味あることに
は、この高い生長密度において、培地中への非常に高い
分泌パーセント（30％）がLeIFDについて得られた。（p
re D/A）LeIFA発現酵母の高密度の発酵も、この高いパ
ーセントの発酵を示す。
酵母菌は、分泌されたインターフエロンと分泌されな
いインターフエロンの両者をプロセシングするように見
える。分泌される活性の量は、細胞の生長段階に依存し
て変化し、そして最高のパーセントは振とうフランスコ
内でかつ高密度の発酵において起こる（培地中の30
％）。
YEp1PT-preLeIFA53tおよびYEp1PT-LeIFA1含有酵母菌中
のプラスミドの組成の確認 これらのプラスミドを含有し、前の実験において使用
した酵母菌を、酵母菌からのプラスミドの修正（retrie
val）によりさらに検査した。これは次のように実施し
た。すなわち、酵母菌抽出物からプラスミドDNAをE.col
iの形質転換により単離し、次いでミニスクリーンDNAを
調製し、そしてプラスミドDNAを制限分析した。いく主
種類かのE.coli単離されたプラスミドDNAを、酵母菌の
両者の型について特性づけた。すべての場合において、
プラスミドは、プラスミドを含有する（pre D/A）LeIFA
上の前配列の存在およびプラスミドを含有する成熟LeIF
A上の前配列の不存在を証明する、期待した制限配列を
含有した。
pB1の3.1kb挿入体の制限地図および部分的配列 300μｇのpB1（37a）を500μｌの反応体積においてHi
ndIIIで完全に消化し、次いで１％のアガロースの調製
アガロース（Sea Kem）ゲル上で電気泳動させた。3.1kb
のHindIII挿入体をエチジウム着色ゲルから切り取り、
電気溶離（electroelution）し（39）、等体積の緩衝液
飽和フエノールおよびクロロホルムで２回抽出し、次い
でエタノールで沈殿させた。再懸濁したDNA断片の部分
を分割し、そして１群の異なる制限酵素で制限切断し
て、第１図に示す部分的制限地図を得た。
精製した3.1kbの挿入体の30μｇをSau3Aで切断し、次
いで６％のアクリルアミドのゲル上に流した。265bpお
よび141bpに相当する断片を、前述のように電気溶離に
より別々に精製した。次いで、各DNA断片をDNA配列の分
析（39）に付した。
このDNA配列の一部分を第Ｂ図に示す。PGK構造遺伝子
のＮ−末端アミノ酸に相当するアミノ酸は、DNA配列の
上に印刷されている。
PGK5′プロモーター区域における制限部位の挿入 配列５′ATTTGTTGTAAA3′をもつ合成オリゴヌクレオ
チドを、標準法（40）により合成した。このプライマー
の100ngを、200μCiの〔γ32‐Ｐ〕ATPをも含有する20
μｌの反応体積における10単位のT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて、５′末端において標識付けした。この
標識プライマー溶液は、PGK構造遺伝子配列の直前のPGK
５′−フランキングDNA中にEcoRI制限部位を入れるよう
に、多工程法における第１工程を設計したプライマー修
善（repair）反応において使用した。
工程１（第17図） 39bpのXba I-対‐San 3A PGK片のプライマーの修善反
応およびクローニング 100μｇのpB1をHaeIIIで完全に消化し、次いで６％の
ポリアクリルアミドのゲル上に展開させた。エチジウム
着色ゲル上の最上の帯（PGKプロモーター区域を含有す
る）を、前述のように電気溶離により単離した。DNAの
この1200bpのHaeIII片をHindIIで制限し、次いで６％の
アクリルアミドのゲル上に展開させた。650bpの帯が電
気溶離により単離された。５μｇのDNAが単離された。D
NAのこの650bpのHaeIII-対‐HindII片を20μｌのdIH2O
中に再懸濁し、次いで前述の20μｌのホスホリル化プラ
イマー溶液と混合した。この混合物をフエノール‐クロ
ロホルムで１回抽出し、次いでエタノールで沈殿させ
た。乾燥したDNAを50μｌのH2O中に再懸濁し、次いで沸
とう水中で７分間加熱した。次いでこの溶液を乾燥氷‐
エタノール浴中で急冷し（10〜20秒間）、次いで氷‐水
浴へ移した。この溶液に、10μｌの10X DNAポリメラー
ゼＩ緩衝液（Boehringer Mannheim）、10μｌの各デオ
キシヌクレオシドトリホスフエート）（dATP、dTTP、DG
TPおよびdCTP）中の前もつて2.5ミリモルとした10mlの
溶液、25μｌのdIH2Oおよび５単位のDNAポリメラーゼＩ
クレナウ（Klenow）断片を含有する溶液の50μｌを加え
た。この100μｌの反応混合物を37℃で４時間保温し
た。次いでこの溶液をフエノール‐クロロホルムで１回
抽出し、エタノールで沈殿させ、凍結乾燥し、10単位の
San3Aで完全に制限した。この溶液を次いで６％のアク
リルアミドのゲル上で展開させた。大きさが39bpに相当
する帯をゲルから切り取り、次いで前述の電気溶離によ
り単離した。この39bpの帯は１つのブラント末端と１つ
のSan3A付着性（sticky）末端とを有する。この断片を
修飾されたpFIFtrp 69ベクター（10）にクローニングし
た。10μｇのpFIFtrp 69をXbaＩで直線化し、フエノー
ル‐クロロホルムで１回抽出し、次いでエタノールで沈
殿させた。XbaＩの粘着性末端を、各ヌクレオシドトリ
ホスフエート中に250μモルを含有する50μｌの反応溶
液中のDNAポリメラーゼＩクレナウ（Klenow）断片を用
いて、充填した。このDNAをBamHIで切断し、次いで６％
のアクリルアミドのゲル上で展開させた。ベクターの断
片をこのゲルから電気溶離により単離し、次いで20μｌ
のdIH2O中に再懸濁した。このベクターの20ngを、上の
ように合成した39bpの断片の20ngで室温において４時間
結合した。この結合混合物の５分の１を用いて、E.coli
株294をアンピシリン抵抗に形質転換した（LB＋20μg/m
lのアンピシリン平板上）。この形質転換体からのプラ
スミドを、急速スクリーン手順（20）により検査した。
１つのプラスミド、pPGK-39（第17図）を引き続く分析
のために選択した。このプラスミドの20μｇをXbaＩで
消化し、エタノールで沈殿させ、次いで1000単位のバク
テリアのアルカリ性ホスフアーゼで68℃において45分間
処理した。このDNAをフエノール‐クロロホルムで３回
抽出し、次いでエタノールで沈殿させた。次いで脱ホス
ホリル化した末端を、200μCiの〔δ32‐Ｐ〕ATPおよび
10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを含有する20μｌ
反応溶液中で標識付けした。このプラスミドをSalＩで
切断し、６％のアクリルアミドのゲル上で展開させた。
標識挿入体の帯をゲルから単離し、化学的減成法（3
9）により配列させた。このプロモーター片の３′‐末
端におけるDNA配列は、期待したとおりであつた。
工程２（第18図） 312bpのPvuI-対‐EcoRIプロモーター断片の構成 25μｇのpPGK-39（第17図）をSalＩおよびXbaＩ（各
５単位）で同時に消化し、次いで６％のゲル上で電気泳
動させた。30bpのプロモーター片を含有する390bpの帯
を、電気溶離により単離した。再懸濁液したDNAをSan3A
で制限し、次いで８％のアクリルアミドのゲル上で電気
泳動させた。このDNAはSan3A-対‐XbaＩ断片上に39bpの
PGKプロモーターの５′末端を含有した。
25μｇのpB1をPvuＩおよびKpnＩで制限し、次いで６
％のゲル上で電気泳動させた。0.8kbpのDNAの帯を電気
溶離により単離し、次いでSan3Aで制限し、６％のゲル
上で電気泳動させた。PGKプロモーター（第15図）から
の265bpの帯を、電気溶離により単離した。
次いでこのDNAを上からの39bpのプロモーター断片で
室温において２時間結合号した。結合混合物をKbaＩお
よびPvuＩで制限し、次いで６％のアクリルアミドのゲ
ル上で電気泳動させた。312bpのXba‐対‐PvuＩ制限断
片を電気溶離により単離し、次いで200ngのpBR322（3
3）〔前述のように単離した、162PvuI-対‐PstＩ制限断
片を欠損（missing）する〕および20μｇのpLIFIFtrp A
から前もつて単離した200ngのXbaI-対‐pstI LeIFAcDNA
遺伝子を含有する結合混合物に加えた。この3-因子‐結
合混合物を使用して、E.coli株294をテトラサイクリン
抵抗に形質転換した。形質転換体のコロニーをミニスク
リーニングし、コロニーの１つのpGK-300は、pBR322に
基づくベクター中のLe IFA遺伝子へ融合した304bpのPGK
5′‐フランキングDNAをもつものとして、単離された。
LeIFAの５′末端は次の配列を有する:5′‐CTAGAAATTC
3′。こうしてPGKプロモーター断片からこの配列中への
XbaI部位の融合は、XbaＩ部位へのEcoRI部位の付加を許
す。こうしてpPGK-300は、PvuI-対‐EcoRI断片中に単離
されたPGKプロモーターの部分を含有する。
工程４ 1500bpのEcoRI-対‐EcoRI PGKプロモーター断片の構成 10μｇのpB1をPvuＩおよびEcoRIで消化し、６％のア
クリルミドのゲル上で展開した。PGK5′‐フランキング
DNAからの1.3kbのPvuI-対‐EcoRI DNA帯を、電気溶離に
より単離した。10μｇのpPGK-300をEcoRIおよびPvuIで
消化し、312bpのプロモーター断片を、消化混合物の６
％のゲル上の電気泳動後単離した。５μｇのpFRL4をEco
RIで切断し、エタノールで沈殿あせ、次いでバクテリア
のアルカリ性ホスフアターゼ68-において45分間処理し
た。このDNAをフエノール／クロロホルムで３回処理し
た後、エタノールで沈殿させ、そして20mlのdIH2O中に
再懸濁させた。200ngのベクターをpPGK-300からの312bp
のEcoRI-対‐PvuI DNAの100ngおよびpB1からのEcoRI-対
‐PvuＩで結合した。結合混合物を使用して、E.coli株2
94をアンピシリン抵抗に形質転換した。ApRコロニーの
１つから、pPGK-1500が得られた。このプラスミドは、D
NAのEcoRI-対‐EcoRI片またはHindIII-対‐EcoRI片とし
て1500bpのPGKプロモーター断片を含有する。
成熟HGH（ヒト成長ホルモン）およびpreHGH発現プラス
ミドの構成 第14図の構成Ａ〜Ｅを、便利な部位をもつベクター中
で構成した。構成Ａにおいて、合成DNAがHpaII部位から
のpreHGH cDNA（42）の開始において、ATG翻訳開示の前
にEcoRIを形成させて、DNA配列を複製するようにした。
HpaII対PstＩ断片がpreHGH cDNA（42）から得られ、そ
して合成DNAをもつこの断片をEcoRI対PstＩベクター（p
HGH207-1、ApR遺伝子の部分を含有するEcoRI対PstＩが
除去され、そして両者の部位は、両者の部位を除するた
めのクレナウ（Klenow）充填後結合される）で結合して
構成Ａを得た。前記ベクターは、HGH cDNA（43）のPst
ＩからSmaＩ部位を含有した。構成Ｂは直接発現のため
に前もつてフツク・アツプ（hook up）された成熟HGH遺
伝子を含有するプラスミドからつくつた。前記HGH遺伝
子は、NH2‐末端に合成暗号化配列の23のアミノ酸を含
有した。この遺伝子を含有するプラスミドは、HGH遺伝
子中のPvuIIおよびTcR遺伝子中のBamHIで切断した。次
いで遺伝子の大部分を含有する大きい断片を、HG遺伝子
（TAG）の末端を複製しかつHind III部位をつくる合成D
NAで結合した。このHindIII部位を、３因子結合の第３
因子としてpBR322のHindIII/BamHI断片で結合して、構
成Ｂを含有するプラスミドを得た。
次いでＡおよびＢを、第14図に示すように組み合わせ
て構成ｃを得た。ｃをさらに修飾してＤとし、ここでHi
ndIII部位はEcoRI（またはEcoRI）部位へ変換された。
このようにして得られたEcoRI片を、酵母菌中のpreHGG
遺伝子の発現のため、酵母菌発現プラスミドYEpIPTのEc
oRI部位中に入れた。また、構成Ｅは、Ｄにおいて使用
したコンバーターを用いて、YEpIPT中の発現のためにEc
oRI断片上に成熟インターフエロン遺伝子（分泌信号配
列をもたない）を得た。
酵母菌中の成熟HGHおよびpreHGHの発現 YEpIPT中のmHGH構成（Ｅ）を株peb4-3trp1（20B-12）
中に入れ、そして抽出物を前述の方向におけるようにガ
ラスビーズを用いて調製した。しかしながら、ガラスビ
ーズを、0.5mlの0.1％のSOSを含む10mlの沈殿した細胞
へ加えた。ウマ血清中に希釈し、RIAの測定を記載され
ているように（44）実施した。
RIAにより、HGHはA660＝1.0において合計の酵母菌タ
ンパク質の約0.5％として発現された（0.5mg/l/
A660）。HGHは培地中に検出されなかつた。
また、YEpIPT中のpreHGH構成を酵母菌中に入れ、そし
て細胞および培地をHGHについて測定した。これより低
いレベルの発現は、細胞中に検出された（0.08mg/l/A
660、すなわち合計の酵母菌タンパク質約0.08％）。こ
うして、このレベルは成熟HGH発現のそれの約1/6であ
り、これは白血球インターフエロンの結果に非常に類似
する。しかしながら、これは公正な比較ではないことが
ある。なぜなら、成熟HGH（44）のコドンの使用は、pre
HGHについての同じアミノ酸よりも23アミノ酸異なるか
らである。このような差により、これらの２種の生産物
の発現のレベルに差が生ずることがある（45）。細胞に
おいて発現されたレベルの10％すなわち８μg/l/（A660
＝１）は、preHGH発現性酵母菌の培地中に見出された。
A550＝85の10lの発酵物中において、約10％の分泌が存
在し、培地中のHGHは1mg/lであつた。
preHGHの発現の性質 細胞内のHGHタンパク質対細胞外のHGHタンパク質の比
較を、前述のウエスターン・ブロツテイング手順により
実施した。結果は、preHGH発現性酵母菌の高い密度の発
酵（A550＝85）からの培地を示す。成熟HGHの大きさに
相当する単一の帯が存在する。この帯は、酵母培地タン
パク質の１〜２％に相当する。
この培地のHGHを、インターフエロンについて用いて
ような、抗体親和性クロマトグラフイー（Hybritech A
b）およびHPLCにより精製すると、NH2‐末端配列は、第
13図に部分的に示すように、HGHのほぼ100％が成熟HGH
であることを示した（配列は10の残基について実施し
た）。こうして、培地のHGHすべては、ヒト細胞により
なされるように、信頼性をもつてプロセシングされる。
HSA分泌 異種遺伝子産物を分泌させる利点を明らかにするた
め、ヒト血清アルブミン（HSA）によって説明する。こ
の65kDaの血液タンパク質はＮ連結グリコシル化部位を
有していないが、35個のシステインを有している；この
タンパク質のモノマーは血中では、17個のジスルフィド
結合を有している。HSAは、そのアミノ末端分泌ペプチ
ド配列を用いずに酵母において細胞内産生させると、折
りたたみに不整合が生じる。これは、そのHSAの不溶
性、90％以上の抗原性の喪失（これはヒト誘導化HSAと
比較した場合のもの）、及び大きなタンパク質凝集の形
成に由来するものである。酵母の培地への分泌を促進さ
せるその天然の分泌シグナルを用いると、HSAは可溶性
になり、明らかにヒト血液誘導体と同じジスルフィド結
合を有するようになる。
材料、菌株及び方法 プレプロHSAをコードするcDNAを含有している酵母発
現プラスミド［LawnらのNucleic Acids Res.,9:6103（1
981）］を以下のようにして構築した。Ｐ−14プレプロH
SAクローンを含有する約700bpのPstI断片（Lawnらの前
掲文献及び1981年８月28日出願のEP73,646から誘導され
るプレプロHSAのコード化配列由来）をpBR322に挿入し
た。次いで、このプラスミドをBstE IIで切断した。得
られたBstEII断片を、末端を標識化したEcoRIリンカー
に連結させ、以下の配列を得た： 得られた構築物をPvuIIで消化し、次にEcorIで消化
し、255bpバンドとしてゲル単離した（温）。次いで、
成熟HSA cDNA（Lawnらの前掲）を含有するPvuII−HindI
IIの1.6kb断片、及びpBR322由来の約4.3kb HindIII−Ec
oRI断片に、得られた単離物を連結させた。この３パー
ト連結により、アンピシリン耐性、テトラサイクリン感
受性である6.2kbプラスミドを得た。1.8kb HindIII−Ec
oRI断片をこの6.2kbプラスミドからゲル単離し、それ
を、上記の1.6kb HindIII−EcoRI PGKプロモーター断片
及び230bp trpターミネーター配列を含有する酵母発現
プラスミドCV13由来の10.6kb HindIII−HindIIIベクタ
ー断片に連結した。（CV13の構造物を添付の第20図に示
す。この３パート連結により、14.0kbのベクターが作成
され、２つの配向性のクローンが得られる。１つの配向
性はCV13ベクターのtrpターミネーター部分が目的の構
造遺伝子の後ろに配置されている（pYHSA11）。他の配
向性では、trpターミネーターがプロモーターの５′側
に位置し、その構造遺伝子の効果的なターミネーターが
２−μターミネーター配列になっている（pYHSA12）。
pYHSA11及びpYHSA12を共に、上記の酵母株GM3C−２に
形質転換し、得られた細胞を一般的な前記の方法で培養
すると、ロイシンの不存在下、プラスミドの存在に関す
る選択が行われる。
HSA濃度を測定するため、pYHSA11及びpYHSA12を使用
し、細胞抽出物、酵母細胞のスフェロプラスト化の際に
遊離されるペリプラスムのタンパク質、及び栄養培地に
対してRIAを行い、対照としては肝炎表面抗原、及び／
又は成熟HSA（プレプロ配列を有しない）のcDNAを含有
するプラスミド（pYHSA5又はpYHSA6）を使用した。
HSAのRIAは以下の試薬及び材料を用いて行った。
リン酸緩衝化食塩水pH7.3 １リットル当たり、 NaCl 8.0g KCl 0.2g Na2HPO4 1.13g KH2PO4 0.2g 目的容量まで水で希釈。
PBSA（0.5パーセントw/v）：シグマA7888、RIA級、ウ
シアルブミン、500mg BSA/100mlPBS;4℃にて１カ月まで
保存。
ペンテックス・ヒトアルブミン：マイルス・ラボラト
リーズ（Miles Laboratories）82−301−１、ロット37;
PBSで0.5mg/mlに希釈、20μｌ量、−20℃で保存。
125I標識化ヒトアルブミン：標準的な手法によりヨウ
素化し、約50μCi/μｇの比活性を得る。これは精製カ
ラムから溶出されるタンパク質ピークを定量することに
より算定した。これを標本化し、−20℃で保存する。ヨ
ウ素化の日から１カ月まではトレーサーとして使用でき
る。
ウサギ抗ヒトアルブミン：キャペル・ラボラトリーズ
（Cappel Laboratories）、0101−0342、ロット15852、
滅菌蒸留水2mlで再構成。これを標本化し、−20℃で保
存する。
ヤギ抗−ウサギ1gG免疫ビーズ：バイオラド（BioRa
d）170−5602、0.5％PBSA50mlで再構成し、それを４℃
で１カ月まで保存する。
試験チューブ:Sarstedt No.477の12×75mmの円錐形ポ
リスチレンである。
RIAの操作は以下のようにして行った。すべてのチュ
ーブには、最終インキュベーション用量200μｌ（免疫
ビーズの添加前）を含有させ、２組み行った。ヒトアル
ブミンの標品を0.5％PBSAを用いて連続希釈した：連続
希釈物は少なくとも250μｌであり、以下の濃度を有し
ている:200、100、40、20、10ng/ml（最終インキュベー
ション濃度は100、50、20、10、5ng/mlになる）。
検定チューブ１個当たり各標品を総量100μｌ加え
た。２つ目のチューブには、標品の代わりに緩衝液を含
有させ、抗体に対するトレーサーの最大結合性：BOを測
定した。
容量が検定毎に不均一になっていないはずの対照プー
ルと共に、測定する未知の試料を希釈した。試料は0.5
％PBSAで希釈した。高濃度のヒトアルブミンを含有して
いると期待される試料を、標準曲線の容量範囲内で測定
できるようにするため、適切に希釈した。未知の試料そ
れぞれ100μｌを各検定チューブに加えた。125I−標識
化ヒトアルブミンのトレーサーを0.5％PBSAで約500,000
cpm/mlにまで希釈した。トレーサーを総量50μｌ（約2
5,000cpm）で各検定チューブに加えた。50μｌのトレー
サーしか含有していない総カウントのチューブは排除し
た。ウサギ抗−ヒトアルブミンを0.5％PBSAで1:25,000
に希釈した（100チューブについて２μl/50ml、抗血清
の最終インキュベーション希釈度は1:100,000であ
る）。
チューブ１個当たりに希釈した抗血清を総量50μｌで
加えた。２つ目のチューブには、トレーサーの非特異的
結合性を測定するため、トレーサーと緩衝液とのみを含
有させた。非特異的結合性は５％を越えていないはずで
ある。高いパーテンセイジはトレーサーの分解を示して
いる。
チューブを旋回させ、37℃で３時間インキュベートし
た。免疫ビーズ溶液を総量で200μｌ加えた（ビーズを
懸濁させた状態を保ため、添加の際には時折そのストッ
ク溶液を混合させる）。試験管を旋回させ、37℃で２時
間インキュベートした。抗体結合アルブミンを遊離アル
ブミンから分離するため、チューブを2000×Ｇで10分間
遠心した。上清を吸引し、得られた沈澱物について、総
カウントチューブと共にガンマカウンターを用いてカウ
ントした。非特異的結合の量を各標品及び未知の試料チ
ューブから差し引いた。各沈澱物におけるトレーサーの
量は各試料中のアルブミンの量に応じて変動した。アル
ブミンの濃度が高くなれば、トレーサーの結合性は低下
する。各標準曲線の抗体結合トレーサーの量（cpm結
合、B/T又はB/BO）を各標品のアルブミン濃度の対数に
対してプロットし、標準曲線を作成した。未知試料の各
チューブの抗体結合トレーサーの量を標準曲線と比較
し、各試料中のアルブミン濃度を測定した。
結果 ３つの別個の試験についてのRIAの結果を以下の表に
示す。
上記の結果は、プレプロHSAを含有するプラスミドに
よって形質転換した細胞と対照細胞とを比較することに
よって明らかになるように、HSAは培地中へ分泌される
ことを示している。
さらに、常法に従って、細胞を代謝学的に標識し、細
胞溶解し、そしてゲル上に泳動させ、得られたゲルをオ
ートラジオグラフィーにかけた。試料を凍結乾燥して濃
縮した場合のHSAの分子量のバンドから示されるよう
に、得られたゲルは、pYHSA11プラスミドを使用するとH
SAが培地中へ分泌されることを示した。
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒトIFN−α１（pre D）、IFN−α２（pre
A）、IFN−α1,2（pre D/A）、IFN−γ１（pre γ）、
およびIFN−β１（pre β）の信号プレペプチドのアミ
ノ酸配列の比較を示す。下線のアミノ酸は、preAおよび
preDのアミノ酸配列の間の差を表わす。DdeI部位は、雑
種preD/A前配列の調製におけるＤおよびＡの接合を示
す。 第２図は、ここで種々の遺伝子挿入物の発現のための一
般的媒質として使用する、酵母菌発現プラスミドYEpIPT
の線図であり、その制限部位および興味ある種々の区域
のいくつかを示す。 第３図は、酵母菌中のIFN−α１の直接発現のためのpre
−plus IFN−α１遺伝子を含有する、EcoRI断片の構成
を示す。 第４図は、酵母菌中の直接発現のための成熟IFN−α２
遺伝子を含有する、EcoRI断片の構成を示す。 第５図は、酵母菌中のIFN−α２の直接発現のための、p
re−IFN−α１の前配列中の最初の14アミノ酸の暗号化
配列をもつpre−plus IFN−α２遺伝子を含有する、Eco
RI断片の構成を示す。 第６図は、酵母菌中のIFN−γの発現のための開始ATGコ
ドンに先行する70bpの先導配列をもつ、pre−plus IFN
−γ遺伝子を含有する、EcoRI断片の構成を示す。 第７図は、酵母菌中のIFN−γの直接発現のためのpre−
plus IFN−γ遺伝子を含有する、EcoRI断片の構成を示
す。 第８図は、酵母菌中の種々のIFNの発現、プロセシング
および分泌において本発明を実施するために使用する、
すべての構成の要約を示す。 第９図は、Abs660 ｍμにより測定した、ａ）YEp1PT−Le
IFA1/pep4−３およびｂ）YEp1PT−preLeFA53t/pep4−３
の生長曲線である。培地は、バイオアッセイを用いて
ａ）およびｂ）についてインターフェロン活性を測定し
た。時間は、30℃における生長の時間である。 第10A図は、YEp1PT−preLeFA53t/pe4−３の5lの発酵に
つての生長曲線である。（Ｏ）はABs660ｍμおよび
（Ｏ）106単位/1の細胞内インターフェロン活性であ
る。 第10B図は、第10A図におけるように定義した、培地から
の活性をグラフにした、同じ生長曲線である。 第11図は、モノクロンの（monoclonal）抗体カラムから
の培地preD/Aの溶離プロフィルである。 第12図は、モノクロンの抗体カラムからのピークＡイン
ターフェロン プールのHPLCトレースである。 第13図は、HPLC精製後に得られた、生産物のアミノ酸配
列の結果である。 第14図は、本発明に従いヒト生長ホルモン（HGH）を生
産するために使用する種々の構成を図解する。 第15図は、PGKプロモーターを単離したベクターpB1の3.
1kbpのHind III挿入物の制限地図の略図である。PGK遺
伝子の５′−フランキングDNAにおけるEcoRI部位および
XbaI部位の挿入が、示されている。 第16図は、XbaI部位およびEcoRI部位の挿入前のPGK遺伝
子のための５′−フランキング配列プラス初めの暗号化
配列を図解する。 第17図は、PGKプロモーモーターにおける−８位置にXba
I部位を挿入しかつこのXbaI末端およびSau3A末端を含有
するPGKの５′−フランキング配列の39bpの断片を単離
するために使用する技術を概略的に図解する。 第18図は、上の39bpの断片、追加のPvuIからSau3Aまで
のPGK5′−フランキング配列（265bp）（第15図参照）
およびXbaIに隣接するEcoRIを含有する300bpの断片の構
成を概略的に図解する。 第19図は、第４図において構成された断片に加えて、PG
Kの５′−フランキング配列からPvuI断片への1300bpのH
ind IIIを含有する、1500bpのPGKプロモーター断片（Hi
nd III/EcoRI）の構成を概略的に図解する（第15図参
照）。 第20図は、プラスミドCV13の制限部位及び機能地図の模
式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (56)参考文献 特開 昭56−30925（ＪＰ，Ａ) 米国特許4503035（ＵＳ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．78（1981）Ｐ．5401 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．76（1979）Ｐ．640−644 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ〔256〕（1981) Ｐ．2395

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】酵母の発現、プロセッシング及び分泌の産
    物としての、ヒトプラスミノーゲンアクチベーター又は
    ヒト神経成長因子以外の酵母生物にとって異種のタンパ
    ク質を入手するための方法であって、 酵母生物が通常は産生又は利用しない酵母にとって異種
    のシグナルペプチドと共にそのタンパク質をコードして
    いるDNAを機能的に含有する発現ベクターによって形質
    転換された生存している酵母細胞を培養し、その培養に
    より培養物の培地中にタンパク質を分泌させ、そして得
    られた培養物の培地からそのタンパク質を回収すること
    を特徴とする方法。
  2. 【請求項２】異種シグナルが異種タンパク質本来のもの
    である特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】タンパク質がヒトインターフェロンである
    特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】タンパク質がヒト血清アルブミンである特
    許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。
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