JPH01240191A - 酵母で機能する新規シグナルペプチドおよびこれを用いた異種蛋白質の分泌発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酵母で機能する新規シグナルペプチドおよびこ
れを用いた異種蛋白質の分泌発現に関する。

〔従来技術〕

組換えＤＮＡ技術により、目的蛋白質を組換え宿主に産
生させる場合、その宿主が目的蛋白質を分泌発現するこ
とに多くの利点が見出される。即ち、目的蛋白質が宿主
細胞内に直接発現されると宿主の増殖、生存に不都合な
毒性を示す場合、目的蛋白質を分泌発現することでこの
毒性を回避することができる。また、毒性を持たない場
合でも、目的蛋白質が宿主細胞内に多量に蓄積すると宿
主の増殖を抑制する場合があるが、分泌発現ではこれを
避けることが可能である。また、目的蛋白質が宿主細胞
内に蓄積するような発現系では、目的蛋白質が宿主細胞
内で変性し、不溶化する現象がよく見られるが、分泌発
現の系ではこれを回避できる。また、商業的に組換えＤ
ＮＡ技術を用いて目的蛋白質を生産する場合、目的蛋白
質が細胞内にＭ積する系では目的蛋白質を精製する為に
、細胞を破壊し、その破壊液中から目的蛋白質を精製す
る必要がある。このような精製では組換え宿主由来の不
純物が多く混入し、高純度の目的蛋白質を得る事が困難
である。一方、分泌発現系で目的蛋白質を生産する場合
には、培養液から目的蛋白質を精製すればよく、組換え
宿主由来の不純物の混入は最小限に防ぐことができ、大
きなメリットとなる。また、蛋白質の多くは、ｔｌ！鎖
の付加、ジスルフィド結合の形成、不活性な前駆体蛋白
質の限定氷解による活性化、特定のアミノ酸のリン酸化
、カルボキシル化等の修飾を受けるが、これらの中には
各種細胞で共通に備わった機能もあり、これらの修飾の
いくつかは分泌の過程で生じる。

従って、目的蛋白質を分泌発現で生産する場合、細胞内
に蓄積する系に比較して、より自然な蛋白質に近い機能
および構造を持った蛋白質の生産が期待される。

このような背景のもとに、蛋白質の分泌発現に必須なシ
グナルペプチドについて、その最適なアミノ酸配列を示
すのが本発明である。

シグナルペプチドの性状についてはいくつかの知見があ
り、そのアミノ酸配列の特徴は以下のようである。Ｎ末
端近傍に塩基性アミノ酸が多く、またＣ末端側のシグナ
ルペプチダーゼに消化される部位近傍には極性を有する
アミノ酸が多く、また、ｉの間は疎水性のアミノ酸が連
続する。Ｎ末端近傍の塩基性アミノ酸は、細胞内部表面
のリン脂質と相互作用し、中央部の疎水性アミノ酸の連
続は細胞膜通過に重要な役割を果たし、Ｃ末端の極性ア
ミノ酸はシグナルペプチダーゼに消化される時の認識部
位の役割を演じていると推定されている。このような特
徴は原核生物から高等動物に到るまで極めて類似してお
り、共通の蛋白質分泌メカニズムを推定させる（Ｍ、Ｓ
、Ｂｒ１ｇｇ５　ａｎｄ　Ｌ、Ｍ、Ｇｉｅｒａｓｃｈ（
１９８６）　　Ａｄｖ、　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｃｈｅ
ｍ、、３８，１０９−１８０　　ＦＧ、ｖｏｎ　ｌ！ｅ
ｉｊｎｅ　（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、、　３．２３１
５−２３１８参照〕。

Ｇ、ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅは真核生物、原核生物のシグ
ナルペプチドのアミノ酸配列を調べ、中央部の疎水性ア
ミノ酸の連続からＣ末端側シグナルペプチダーゼ切断部
位に到るアミノ酸配列の特徴を報告したＣＧ、ｖｏｎ　
１ｌｅｉｊｎｅ　（１９８６）　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、＋　１４＋４６８３−４６９０参照〕、それ
によれば、真核細胞ではシグナルペプチド切断部位置前
のアミノ酸番号を−１とした時、−１３から−６に到る
部分は疎水性アミノ酸、特にロイシンがよく検出され、
その他フェニルアラニン、アラニン、イソロイシン、バ
リン等の疎水性アミノ酸、更に、システィン、メチオニ
ン等も比較的検出頻度が高い、−５から−１のアミノ酸
については比較的極性の高いアミノ酸が多い。最も検出
頻度の高いアミノ酸を連結した配列は次式で表わされる
。

Ｌｅｕ　Ｉｅｕ　Ｌｅｕ　ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｅｕ　Ｌ
ｅｕ　ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ−３−２−１＋１　　＋
２ Ｃｙｓ　　Ｔｒｐ　　Ａｌａ　　Ｇｉｎ　　Ｐｒ。

−１と＋１の間でシグナルペプチドが切断される。

従って、＋１．　＋２のアミノ酸は成熟蛋白質のＮ末端
である。−船釣に多くのシグナルペプチドは１５−３（
１０）アミノ酸から成り、上式で表わされるシグナル配
列についても、更に上流Ｎ末端側に塩基性アミノ酸の配
列が必要である。塩基性アミノ酸にはアルギニン、リジ
ン、ヒスチジンがあり、これらが１個あるいは複数個存
在し得る。

以上の背景をもとに、本発明の目的はコンセンサスシグ
ナルペプチドを提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

このような目的を達成するために、本発明者らは酵母に
よる蛋白質の分泌発現に必須なベクターを構成するシグ
ナルペプチドについて研究を重ねて来たところ、特定の
構造を有するシグナルペプチドが酵母におけるベクター
のシグナルペプチドとして機能することを見出し、さら
に研究を重ねて本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は下記（１）〜（６）に関するもので
ある。

ｆｉｌ　　下記の特定の構造を有するシグナルペプチド
。

＋２１　　ｆｉｌのシグナルペプチドの後ろに異種蛋白
質を連結したプレ蛋白質。

＋３１　　ｆｉｌのシグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列。

（４）　　ｉｌ＋のシグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を含み、酵母を形質転換するための組換えプラス
ミド。

＋５１　　（１）のシグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を含む組換えプラスミドを用いて形質転換した酵
母。

＋６１　　（１）のシグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を含む組換えプラスミドを用いて形質転換した酵
母から異種蛋白質を分泌発現する方法。

本発明に関する組換えプラスミドは、シグナルペプチド
をコードするＤＮＡ配列、異種蛋白質をコードするＤＮ
Ａ配列、プロモーター、ターミネータ−およびプラスミ
ドＤＮＡからなる。

上記１）１でいう特定構造のシグナルペプチドは、以下
のアミノ酸配列（［）で示される。

Ｍｅｔ−Ａ＋−Ａｘ−χ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ　　　　
　（＋　）（式中、Ａ１は１〜３個のＡｒｇ、Ｓｅｒ、
ＬｙｓまたはＨｉｓから選ばれたアミノ酸からなるペプ
チド鎖を、Ａ２は１〜３個の任意のアミノ酸からなるペ
プチド鎖を、Ｘは８〜１０個の疎水性アミノ酸からなる
べ゛ブチド鎖を、ＢはＰｒｏまたはＳｅｒを、ＣはＧｌ
ｙまたはｐｒｏを、ＤはＣｙｓ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅ
ｒ、ＴｈｒまたはＶａｌから選ばれたアミノ酸を、Ｅは
ＴｒｐまたはＧＩｎを、ＦはＡｌａまたはＧｌｙを各々
表わす）Ａ２中で表わされる任意のアミノ酸としては、
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃ
ｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ。

Ｇｉｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｔ
ｒｐ、Ｐｒｏ、Ｖａ　ｌが挙げられる。Ｘ中で表わされ
る疎水性アミノ酸としては、ｌ、ｅｕ。

Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔなど
が例示される。好ましくは、Ａ１は−Ａｒｇ−３ｅｒ−
を、Ａ２は−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−を、Ｘは−（Ｌ　ｅ　ｕ
）ｓ−を表わす。

より好ましくはシグナルペプチドは、−例として以下の
アミノ酸配列で示される。

ＭｅｔＡｒｇＳｅｒ（Ｌｅｕ）　＋ｏＰｒｏＧ１ｙＣｙ
ｓＴｒｐＡＩａシグナルペプチド遺伝子は上述したアミ
ノ酸配列で表現できるＤＮＡ配列を有していればよいが
、各アミノ酸のコドンとしては以下のものが例示される
。ＡｌａはＧＣＴまたはＧＣＣ，ＣｙｓはＴＧＴ、Ａｓ
ｐはＧＡＣ，ＧｌｕはＧＡＡ、ＰｈｅはＴＴＣ，Ｇｌ）
ＩはＧＧＴ、Ｈｉ　ｓはＧＡＣ，１）ｅはＡＴＴまたは
Ａ’ｒｃ、ＬｙｓはＡＡＧ、ＬｅｕはＴＴＧ、Ｍｅ　ｔ
はＡＴＣ，、ＡｓｎはＡＡＣ。

ＰｒｏはＣＣＡ、ＧｌｎはＣＡＡ％ＡｒｇはＡＧＡ　％
　Ｓ　ｅ　ｒはＴＣＴまたはＴＣＣ，ＴｈｒはＡＣＴま
たはＡＣＣ，Ｖａ　ｌはＧＴＴまたはＧＴＣ。

ＴｒｐはＴＧＧ、Ｔｙ　ｒはＴＡＣ，好ましくは以下の
ようなりＮＡ配列を有するものが用い゛られる。

Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ＾ＴＧ　ＡＧＡ
　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　
ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＧＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌ
ｙ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　ＡｌａＴＴＧ　　ＴＴＧ　　ＣＣ
Ａ　　ＧＧＴ　　ＴＧＴ　　ＴＧＧ　　ＧＣＴ本発明に
おける異種蛋白質には特に制限はないが、好ましくはヒ
ト血清アルブミン、インターフェロン−α、βあるいは
ｒ、ウロキナーゼ、成長ホルモン、インシュリン、各種
リンホカインなどが挙げられる。

このような異種蛋白質遺伝子は、特開昭６２−２９９８
５号公報（ヒト血清アルブミン）、特開昭６１　１８５
１８９号公＊Ｉａ　（イアター７ｓロン−α）、特開昭
６１−１０８３９７号公報（インターフェロン−Ｔ）、
特開昭６０−１８０５９１号公報（ウロキナーゼ）など
に記載されている。

上述の文献中では、異種蛋白質遺伝子を含むプラスミド
として開示されている。

本発明の酵母を形質転換するための組換えプラスミドは
、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子の下流に異種
蛋白質遺伝子を自体既知の手段で連結し、これらを含む
プラスミドとして自体既知の手段にて調製される。

プロモーターおよびターミネータ−は酵母で機能するも
のであれば特に限定されない。

プロモーターとしては、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプ
ロモーター、ｐｈｏＥ（５１プロモーター、ＧＡＬＩプ
ロモーター、ＧＡＬＩＯプロモーター、Ｇ　Ａ　Ｐ　−
Ｄ　ＩＩプロモーターなどが好適に使用される。

プロモーターは血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子
の上流に位置する。

ターミネータ−としてはｐｈｏＥ＋５１ターミネータ−
、ＧＡＰＤＨターミネータ−などが好適に使用される。

ターミネータ−は異種蛋白質遺伝子の下流に位置する。

プロモーター、ターミネータ−は各々プラスミドに組み
込まれた形で入手される。

プラスミドＤＮＡは酵母中で自律複製可能なものであれ
ば特に限定されない。具体的には、ｐＪＤＢ２０７、ｐ
ＪＤＢ２１９などが例示される。

本発明の＆ｌｌ換えプラスミドは、上述したプラスミド
群から各々、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子−
異種蛋白質遺伝子からなるＤＮＡ配列、プロモーターを
含むＤＮＡ配列およびターミネーターを含むＤＮＡ配列
を制限酵素により切り出した後に連結（接続）して適当
なプラスミドに組み込むか、または、一方のＤＮＡ配列
を切り出した後に他方のプラスミド中に組み込むかのい
ずれかの方法により得られる。

その際、配列の順序は上流から下流に向かって、プロモ
ーター、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子、異種
蛋白質遺伝子、ターミネータ−となるように調製する。

また、選別時のマーカーとして、抗生物質〔テトラサイ
クリン、アンピシリン、カナマイシン〕耐性遺伝子ある
いは宿主の栄養要求性を補う遺伝子を組み込むことも可
能である。

本発明のＤＮＡ配列を用いて形質転換体を調製する方法
としては、当該ＤＮＡ配列を組み込んだ組換えプラスミ
ドを用いる方法、あるいは当該ＤＮＡ配列を宿主（酵母
）の染色体上に挿入する方法などが挙げられる。

この組換えプラスミドを用いて形質転換体を製作する方
法ひいては異種蛋白質を製造する方法は以下の通りであ
る。

組換えプラスミドを宿主細胞に導入する。宿主細胞とし
ては酵母が用いられる。具体的には挿入されるプラスミ
ドが担持する選択マーカー遺伝子によって相補する変異
をもった変異株、たとえばロイシン要求性変異株である
サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉＳｉａｅ）＾８２２（ａ。

ｈｉｓ　４＋　　６ｉ＝ｕ　２＋　ｃａｎ　１）等が好
適に用いられる。

宿主細胞（酵母）の形質転換は公知の方法、たとえば、
リン酸カルシウム沈澱法、プロトプラストポリエチレン
グリコール融合法、エレクトロボレーシタン法などによ
り行う。

必要な形質転換体を選択する。

形質転換株は、宿主細胞の自体公知の培地で培養する。

培地としてはＹＮＢ液体培地〔０，７％Ｙｅａｓｔ　Ｎ
ｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ　（Ｄｉｆｃｏ社）、２％グ
ルコース〕、およびＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキ
ストラクト（Ｄｉｆｃｏ社）、２％ポリペプトン（大五
栄養社ン　２％グルコース〕などが例示される。

培養は、通常１５〜４３℃（好適には３０℃程度）で２
０〜１００時間程度行い、必要により通気や撹拌を加え
ることもできる。

培養後、培養上清を回収し、自体公知の方法、たとえば
アフィニティクロマトグラフィー、分画法などによりｉ
！ｆｆｉ蛋白質を精製する。

〔効果〕

本発明の方法により、目的とする異種蛋白質を分泌発現
で生産することができ、細胞内で蓄積する系に比較して
、より自然な蛋白質に近い機能および構造を有する異種
蛋白質の生産が期待できる。

また・目的蛋白質が細胞内に蓄積する系では目的蛋白質
を精製する為に、細胞を破壊し、その破壊液中から目的
蛋白質を精製する必要があるが、本発明の方法によれば
かかる精製の必要がない。

特に蛋白質の分泌発現に必須なシグナルペプチドについ
て本発明のシグナルペプチドを選択したことにより、新
たな発現系が確立でき、異種蛋白質の効率的な発現に対
しても有用と考えられる。

〔実施例〕

本発明をより詳細に説明するために、実施例を挙げるが
、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない
。

なお、本発明において多くの技法、反応および分析方法
は当業界においてよく知られている。特にことわらない
限り、全ての酵素は商業的供給源、たとえば宝酒造；ニ
ューイングランド　バイオラプス（ＮＥＢ）　（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））マサチ
ューセッツ、米国；アマ−ジャム（Ａｓｅｒｓｃｈａ＋
ｍ）　ｓ英国およびベセスダ　リサーチ　ラボラトリー
ズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｌ
ａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）　）　、メリーランド、米国
から人手することができる。

酵素反応のための緩衝液および反応条件は特に断らない
限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使用した。

プラスミドを用いた大腸菌の形質転換法、プラークハイ
ブリダイゼータジン法、電気泳動法およびＤＮへのゲル
からの回収法は、「モレキュラークローニング」コール
ドスプリングハーバ−ラボラトリ−（ｒＭｏｌｅｃｕｌ
ｅｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌ
ｌａｒｂｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）
　）に記載されている方法により行った。酵母の形質転
換法は、「メソフド・イン・イースト・ジェネティクス
Ｊコールドスプリングハーバ−ラボラトリ−（ｒＭｅｔ
ｈｏｄ　１ｎＹｅａｓｔ　ＧｅｎｅｔｉｃｓＪ　）　　
（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ−ｏ
ｒａｔｏｒｙ）　（１９８１）に記載されている方法で
行った。

■、酵母ＧＡＬＩ、１０プロモーターのクローニングｌ
−１，酵母染色体ＤＮＡライブラリーの作製酵母サツカ
ロミセスセレビシェＧＲＦ１８　ＰＩ１０８０ｃｉｒ’
株の染色体ＤＮＡをＲ，Ｃｒｙｅｒ等の方法（＋？。

Ｃｒｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９７５）　Ｍｅｔｈｏｄ
　Ｅｎｚｙ＋＊ｏ１．、１２．３９）で抽出精製した。

Ｍｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ　（Ｍ
、Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒ，Ｗ。

Ｄａｖｉｓ　（１９８４）　Ｍｏ１．Ｃｅ１）．Ｂｉｏ
ｌ、、　４．１４４０−１４４８．）によれば、酵母Ｇ
ＡＬＩ、１０プロモーター領域は酵母染色体上にあり制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉで消化すると約１　ｋ
ｂのＤＮＡ断片として得られる。

そこで上記のように抽出精製した酵母染色体ＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩ及びＸｂａ　１で消化し、電気泳動により約１
　ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。これをＥｃｏＲＩ及び
Ｘｂａ　１消化し、子牛小腸由来アルカリホスファター
ゼ（ＣＩＰ）で５゛末端のリン酸基を除いたプラスミド
ρＵＣ１９と混合し、ライゲーションキットで連結した
。これを大腸菌ニジエリシアコリＪＭ１０９コンピテン
トセルに導入した。トランスフォーマントを０．００４
χＸ−ｇａｌ　（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−
３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉ
ｄｅ）及び１ｍＭＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β、
　Ｄ−ｔｈ　ｉｏｇａ　ｌａｃ　ｔｏｐｙｒ’ａｎｏｓ
　１ｄｅ）含有ＹＴアガープレート　（ポリペプトン８
ｇイーストエキストラクト５ｇ塩化ナトリウム５ｇを水
に溶解し、１）とした後１２ｇの寒天束を加えてオート
クレーブ滅菌後、プラスチックシャーレに分注、固化す
る。Ｘ−ｇａｌ、　ＩＰＴＧはオートクレーブ後、培地
が冷えてから添加する。）に塗布し、３７°Ｃ，−夜培
養した。白色及び青色のコロニーが出現するが、このう
ちＤＮＡインサートを有する白色コロニーのみを１００
個ずつ４０μｓ／ｍ７アンビシリン含有しアガープレー
ト（トリスペース０．６２ｇポリペプトン１０［ｇ、イ
ーストエキストラクト５ｇ塩化ナトリウム５ｇを水に熔
解し、１）とした後１２ｇの寒天束を加えてオートクレ
ーブ滅菌し、プラスチックシャーレに分注、固化する。

アンピシリンはオートクレーブ後、培地が冷えてから添
加する。）に滅菌した爪楊枝にて接種した。このＬアガ
ープレートを３１℃、−夜培養した。このような方法で
、約５０００個がら成るライブラリーを作製した。形成
したコロニーをニトロセルロースフィルターに移し、０
．５Ｍ水酸化ナトリウム−１，５Ｍ塩化ナトリウムから
成る溶液に浸しＤＮＡを変性させ、次いで１．５Ｍ塩化
ナトリウム−０，５Ｍ１−リス−塩酸、　ｐＨ７，５か
ら成る溶液で中和した。大腸菌の残渣を２ｘＳＳＣ（０
，３Ｍ塩化ナトリウム−０，０３Ｍクエン酸ナトリウム
、ｐ）Ｉ　７．０）で洗浄、除去しフィルターを風乾後
、更に８０℃、２時間減圧乾燥した。

ｌ−２，プローブの作製 ＧＡＬｌ、１０プロモーターをコードする遺伝子の塩基
配列の一部をアプライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成
装置モデル３８１Ａを用い、ホスホアミダイト法にて合
成した。その配列を以下に示す。

５’−ＣＴＣＴＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＧＴＣＡＡＧ　−
３’これを７Ｍ尿素−２０χポリアクリルアミドゲルで
電気泳動し、精製した。精製したＤＮＡ配列の５“末端
を、［γ−”Ｐｌ　ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて放射能ラベルした０合成りＮＡ　　１０
　　ｐｍｏｌｅｓ＋　　　［７−”Ｐｌ　　八ＴＰ　　
２５０μＣｉ、　　Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ８ユ
ニットを用いた反応により２２ｐで末端ラベルされた合
成りＮＡプローブが、２　ｘ　１０’　ｃｐｍ　　（セ
レンコフコウント）得られた。合成りＮＡプローブの精
製はＮＥＮＳＯＲＢ２０を用いて行った。

１−３．　ＧＡＬＩ、１０プロモーターのスクリーニン
グ１−１項でＤＮＡを固定したニトロセルロースフィル
ターを１０枚ずつ一組にしてビニール袋に入れ、以下の
処理をした。　６　ｘ　ＳＳＣ，０，１χＳＯＳ、及び
１００℃１５分間加熱後氷上で冷却したサケ精子ＤＮＡ
２０μｇ／−から成るプレハイブリダイゼーション溶’
１）１）０　ｍｌをビニール袋に入れ、シール後、４０
℃。

３時間インキエベートした。プレハイブリダイゼーショ
ン液を廃棄し、ハイブリダイゼーション溶液１０　　を
入れて、４０℃、−夜インキユベートした。

ハイブリダイゼーション溶液の組成は６　ｘ　ＳＳＣ。

０．１χＳＯ５，１００、Ｅｌ　ｇ／１）７サケ精子Ｄ
ＮＡ、７．５に１０５ＣｐＩＩｌ／ｆｆｉ！の３ｚｐ−
プローブとした。インキュベート終了後、フィルターを
ビーカーに移し、６　ｘ　ＳＳＣ。

０．１χＳＤＳで５０℃、３０分間、２　Ｘ　ＳＳＣ，
０，１χＳＯＳで５０℃、３０分間、２　ｘ　ＳＳＣ，
０，１χＳＤＳで５０℃、３０分間、最後ニ０．１　ｘ
　ＳＳＣ，０，１χＳＤＳで５０℃、３０分間の順に洗
浄した。洗浄したフィルターは風乾し、１００−２００
　ｃｐ−のマークをスポットした後オートラジオグラフ
ィーした。その結果、２個のポジティブクローンが得ら
れた。このうちの１クローンを４０ｐｇ／献アンピシリ
ン含有スーパープロス（バクトドリプトン１２ｇ、イー
ストエキストラクト２４ｇ、グリセロール５ｍｌを水に
溶解し９００−としてオートクレーブ滅菌したＡ液、及
びリン酸２水素カリウム３．８１ｇ、　　リン酸１水素
カリウム１２．５　ｇを水に溶解し１００献としてオー
トクレーブ滅菌したＢ液を９：１（ｖ／ｖ）の割合で混
合したもの）中３７℃、−夜振盪培養し、アルカリ−Ｓ
ＯＳ法にてプラスミドＤＮＡを抽出精製した。

このプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　（ｐＧＡＬｌｌ、図１）に
ついて一部塩基配列をグイデオキシ法にて調べたところ
、報告されている配列（Ｍ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ａｎｄ
Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ（１９８４）阿ｏ１．　Ｃｅ１）．
Ｂｉｏ＋、、　４．１４４０−１４４８．）と一致した
。　ｐＧＡＬｌｌはＥｃｏＲ１部位からＸｂａ　１部位
の方向にＧＡＬＩプロモーター、逆の方向にＧＡＬＩＯ
プロモーターを有している。

１−４．　ｐＧＡＬｌｌ　Ｘｂａ　１部位のＢａｍＨｒ
部位への変換ｐＧＡＬｌｌ上のプロモーター配列を、シ
グナルペプチド及びヒト血清アルブミン蛋白質をコード
するＤＮＡ配列と連結する場合に、Ｘｂａ　Ｔ部位を介
する事はヒト血清アルブミン遺伝子上にＸｂａ　１部位
が存在するので不都合である。そこで、Ｘｂａ　１部位
をＢａ１ｌｌ目部位に変換した。　　ｐＧＡＬｌｌをＸ
ｂａ　１消化後、ｄＧＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、
　ｄＣＴＰ存在下、大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼ■、
クレノウ断片により付着末端を修復した。このＤＮＡ断
片に５゛末端がリン酸化されたＢａｍＨＩリンカ−、Ｃ
ＧＧＡＴＣＣＧを加え、↑４　ＤＮＡリガーゼにより連
結した。これをＢａｍ１ｌ　　Ｉで消化後、再度Ｔ４　
ＤＮＡリガーゼにより連結し大腸菌ニジエリシアコリＩ
ＩＢＩＯＩに導入した。

得られたトランスフォーマントより図１に示したプラス
ミドＰＧＡＬ１２を有するクローンヲ得り。

ｐＧＡＬ１２をＥｃｏＲ［及びＢａ１ｌｌ　Ｉでｔ肖イ
ヒする事により、約１ｋｂのＤＮＡ断片としてＧＡＬＩ
及びＧＡＬＩＯプロモーターを単離できる。

２、酵母ｐｈｏ５ターミネータ−を有する大腸菌・酵母
シャトルベクターｐＰＴ２の作製 特開昭６２−１５１）８３号公報に述べられた酵母サツ
カロミセスセレビシェｐｈｏ５遺伝子をコードしたプラ
スミドｐＡＰ５を制限酵素５ａｕ３＾Ｉ及びＰｓＬＩで
消化し、約３７０　ｂｐのｐｈｏ５ターミネータ−をコ
ードしたＤＮＡ断片を電気泳動で単離した（図２）。

市販のプラスミドｐｔｌｃ９をＢａ１ｌＨＩ及びＰｓｔ
ｌで消化し、アルカリホスファターゼで処理後、上君己
３７０　ｂｐ断片と連結した。　３７０　ｂｐ断片の５
ａｕ３Ａ　Ｉ切断部位の塩基配列は ＧＡＴＣＣ・・・・ Ｇ　・・・・ であり、これはＢａｍＨ１付着末端と連結するとＢａｍ
＋Ｈ１部位が再生される。従って、上記連卑占反応で得
られたプラスミドｐＰＴ１をＢａｍＨｒ及びＰｓｔ　　
Ｉで消化する事により、あるいはＢａｍ１ｌ　Ｉ及びＨ
ｉｎｄ　ｍで消化する事により３７０　ｂｐのｐｈｏ５
タミネーターを有するＤＮＡ断片が得られる（図２）。

市販のシャトルベクターｐＪＤＢ２０７　（図３）は大
腸菌及び酵母中で自律複製が可能である。これをＢａｍ
１ｌ　ＩおよびＨｉｎｄ　ｍで消化後、アルカリホスフ
ァターゼ処理した。　ｐＰＴｌをＢａｗｌ　Ｉ及び旧ｎ
ｄｎｌで消化後、約３７０　ｂｐのｐｈｏ５ターミネー
タ−を有するＤＮＡ断片を電気泳動で単離し、上記ｐＪ
Ｄ［１２０７と連結した。得られたトランスフォーマン
トより、図３に示したプラスミドｐＰＴ２を有するクロ
ーンを得た。　ｐＰＴ２はｐｈｏ５ターミネークーを有
する大腸菌・酵母シャトルベクターであり、大腸菌にお
いてはβラクタマーゼによるアンピシリン耐性のマーカ
ー、酵母においてはロイシン栄養要求性を補うマーカー
をそれぞれ有している。

３、ヒト血清アルブミン遺伝子 ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡ配列は特開昭６
２−２９９８５に述べられたプラスミドｐＧＸ４０１（
図４．５）に由来し、以下のように誘導した。

プラスミドｐｃχ４０１を制限酵素Ｘｂａ　Ｉ及び旧ｎ
ｄ　ｍで消化し、ヒト血清アルブミン蛋白質のアミノ酸
配列Ｃ末端側３ＳりＬｅｕ　ｗ　”’Ｌｅｕ及び３゛非
翻訳゛　　領域をコードする、約７５０　ｂｐのＤＮＡ
断片（ＩＳＡ２）を電気泳動で単離した。市販のプラス
ミドｐＵｃ１９をＸｂａ　Ｉ及び１ｌｉｎｄ　ｍで消化
し更にアルカリホスファターゼで処理し、５゛末端のリ
ン酸基を除去した後、Ｔ４　ＯＮ＾リガーセによりＩｓ
＾２と連結した。

これを大腸菌ニジエリシアコリＨＢＩＯＩに導入し、得
られたトランスフォーマンより図６に示したプラスミド
ｐＨｓＡ２を有するクローンを得た。　ｐＧＸ４０１を
Ｄｒａ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉで消化し、約１　ｋｂのＤＮ
Ａ断片を電気泳動で単離した。このＤＮＡ断片はヒト血
清アルブミン蛋白質のアミノ酸配列Ｎ末端側ｌ２Ｌｙｓ
−５６ＴｈｒをコードするＤＮＡ配列である。

アプライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成機モデル３８
１Ａを用いてホスホアミダイト法にて成熟ヒト血清アル
ブミン蛋白質のアミノ酸配列Ｎ末端’　Ａｓｐ〜”Ｐｈ
ｅをコードする以下のＤＮＡ配列を合成した。

ＣＧＡＣＧＣＡ　　ＣＡＣＡＡＧ　　ＡＧＴ　　ＧＡＧ
　　ＧＴＴ　　ＧＣＴ　　ＣＡＴ　　ＣＧＧ　　ＴＴＴ
Ｇ　ＣＧＴ　ＧＴＧ　ＴＴＣＴＣＡ　ＣＴＣＣＡＡ　Ｃ
ＧＡ　ＧＴＡ　ＧＣＣＡＡＡアスパラギン酸（Ａｓｐ）
をコードするコドンはｐＧＸ４０１ではＧＡＴであった
が、ここではＧＡＣとした。

その結果、上記合成りＮＡを前記ｐＧＸ４０１由来の約
１ｋｂ　ＤＮＡ断片と連結後、ｐＵｃ１９のＳａｌ　Ｉ
　−Ｘｂａ　１部位に挿入するとＳａｌ１部位が再生さ
れる。しかも、旧ｎｃＩ［で消化すれば成熟ヒト血清ア
ルブミンのＮ末端’Ａｓρから始まるアミノ酸配列をコ
ードしたＤＮＡ配列が得られる。

上記合成りＮＡの５゛末端をＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼによりリン酸化し、　ｐＧＸ４０１をＤ
ｒａ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉで消化し電気泳動で単離したＨ
ＳＡＩと７４　ＯＮ＾リガーゼで連結した。これを大腸
菌ニジエリシアコリＨＢＩＯＩに導入し、得られたトラ
ンスフォーマントから、図７に示したプラスミドｐＨ３
Ａｌを有するクローンを得た。

４、酵母にヒト血清アルブミンを°分泌発現させる為の
プラスミドＤＮＡの作製 アミノ酸配列（１）で示されるコンセンサスシグナルペ
プチドの一例として以下のシグナルペプチドを・成熟ヒ
ト血清アルブミン蛋白質のＮ末端に連結した組換えブレ
・ヒト血清アルブミン蛋白質をコードするＤＮＡ配列を
、酵母サツカロミセスセレビシェにおいて分泌発現可能
なプラスミドとして作製した。コンセンサスシグナルペ
プチドのアミノ酸配列は Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ
　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ａｌａであり、ア
ミノ酸配列（ｒ）の式を満足する。

上記シグナルペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ配列をアプライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成膜モ
デル３８１Ａを用い、ホスフォアミダイト法にて合成し
た。そのＤＮＡ配列を以下に示す。

Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＧＡＴＣＣＡＴＧ　ＡＧＡ　ＴＣ
Ｔ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＧ
Ｇ　ＴＡＣＴＣＴ　ＡＧＡ　ＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ
ＡＡＣＡＡＣ〔余白〕 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｃ
ｙｓ　Ｔｒｐ　ＡｌａＴＴＧ　ＴＴＧ　　ＴＴＧ　　Ｔ
ＴＧ　　ＣＣＡ　　ＧＧＴ　ＴＧＴ　ＴＧＧ　　ＧＣＴ
＾ＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＧＴ　　ＣＣＡ　　ＡＧＡ
　＾ＣＣＣＧＡ上記合成りＮＡの５゛末端を＾ＴＰ及び
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一
方、ｐＨ５Ａ１をＸｂａ　Ｉ及びｌ１ｉｎｃｌ＋で消化
しヒト血清アルブミン蛋白質のＮ末端側をコードする約
１ｋｂのＤＮＡ配列Ｈ３ＡＩを電気泳動で単離した。上
記リン酸化した合成りＮＡとＨＳＡＩを混合し、Ｔ４　
ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、さらにＸｂａ　Ｉおよ
びＢａｌ！ｌＨ［で消化した。　ｐＨｓＡ２をＸｂａ　
Ｉ及びＢａｍ１ｌ　Ｉで消化後、アルカリホスファター
ゼで処理した。これらのＤＮＡを混合し、Ｔ４　ＤＮＡ
リガーゼで連結後、大腸菌ニジエリシアコリＨＢＩＯＩ
コンピテントセルに導入した。得られたトランスフォー
マントのうち、図８に示したプラスミドｐＹＮＯ１８を
有するクローンを得た。

ｐＹＮＯ１８をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化後、ア
ルカリホスファターゼで処理した。　ｐＧＡＬ１２をｉ
！ｃｏＲＩ及びＢａ５ＨＩで消化後、電気泳動によりＧ
ＡＬＬブロモ−クーを有するｌ　ｋｂのＤＮＡ断片を単
離し、上記処理をしたｐＹＮＯ１８と混合し、Ｔ４　Ｄ
ＮＡリガーゼにより連結した。得られたトランスフォー
マントより・図９に示したプラスミドｐＹＮＯ２１を有
するクローンを得た。ｐＹＮＯ２１はＧＡＬＩプロモー
ター下流にコンセンサスシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ配列、およびその直後に成熟ヒト血清アルブミン
蛋白質をコードするＤＮＡ配列、およびその直後のヒト
血清アルブミンｃＤＮＡ由来３゛非翻訳領域がｐｔｌｃ
１９のＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄｎ１部位に挿入されたプ
ラスミドＤＮＡである。

ｐＹＮＯ２１をＥｃｏＲ］及び旧ｎｄｌｆｆで消化し、
電気泳動により２．７　ｋｂのＧＡＬＬプロモーター、
シグナルペプチド、成熟ヒト血清アルブミン蛋白質、非
翻訳領域をコードしたＤＮＡ断片を単離した。また、ｐ
ＰＴ２をＢａｍＨＩで消化し、さらにアルカリホスファ
ターゼで処理した。これと上記２．７　ｋｂ　ＤＮＡ断
片を混合し、ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ、及び
ｄＣＴＰ存在下、ＤＮＡポリメラーゼ■、フレノウ断片
にて付着末端を修復した。更に、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ
により連結し、大腸菌ニジエリシアコリ８８１０１に導
入した。得られたトランスフォーマントより、図１Ｏに
示したプラスミドｐＹＮＯ２２を有するクローンを得た
。　　ｐＹＮＯ２２は大腸菌及び酵母中で自律増殖可能
なプラスミドで、酵母において機能するＧＡＬＬプロモ
ーターの支配下にコンセンサスシグナルペプチドとそれ
に続いて成熟ヒト血清アルブミン蛋白質をコードするＤ
ＮＡ配列を有している。さらに、ｐＹＮＯ２２は大腸菌
においてアンピシリン耐性を付与する遺伝子、及び酵母
においてロイシン栄養要求性を補う遺伝子を有しており
、これらの遺伝子はトランスフォーマントの選択マーカ
ーとして使用可能である。

５、プラスミドｐＹＮＯ２２の酵母への導入とヒト血清
アルブミンの分泌発現 ５−１．　　プラスミドｐＹＮＯ２２の酵母への導入ヒ
ト血清アルブミン分泌発現用プラスミドｐＹＮ０２２ヲ
酵母サツカロミセスセレビシェＡｌ２２に以下の方法に
より導入した。

ＹＰＤメディウム（イーストエキストラクト１０ｇ、バ
タトベプトン２０　ｇを水に溶解し９００　ｍｌとした
後オートクレーブ滅菌し、別にオートクレーブ滅菌した
２０％グルコース１００＠Ｉと混合したφ）５〇−中３
７℃、−夜振盪培養したサツカロミセスセレビシェＡｌ
１２２を遠心し、得られた細胞を水２０＠ｌに懸濁後、
再度遠心して細胞を得た。これをｌＯ−の５０　ｍＭジ
チオスレイトール、１．２１’ｌソルビトール、２５　
ｍＭ　ＥＤＴ＾、　ｐＨ８，５に懸濁し、３０℃で１０
分間穏やかに振盪した。遠心により細胞を集め、１．２
Ｍソルビトール１０１）７に懸濁し、再度遠心により細
胞を集めた。細胞をｌＱｍ／の１．２−ソルビトールに
懸濁し、遠心により細胞を集めた。細胞を１０−の０．
２■／−ザイモリアーゼ１００Ｔ、　１．２１ソルビト
ール、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１　Ｍクエン酸ナ
トリウム、ｐＨ５，８に懸濁後、３０℃で１時間穏やか
に振盪した。遠心で細胞を集め、１．２ｉソルビトール
、次いで１０１塩化カルシウム、　１．２　）ｌソルビ
トール各１０ばで洗浄し、遠心で細胞を集めた。細胞を
１−の１０１塩化カルシウム、　１．２　？１ソルビト
ールに懸濁した。懸濁液１００μを滅菌試験管にとり、
５パ（５ｐｇ）のｐＹＮＯ２２と混合し、室温に１５分
間静置した。更に、１．２　ｍｌの２０％ポリエチレン
グリコール４０００．１０　ｍ？塩化カルシウム、　１
０　ｍＭ　　トリス−塩酸、　ｐＨ７，５を加え穏やか
に混合後、室温で２０分間静置した。遠心で細胞を集め
、０．１ｍ７の１．２Ｍソルビトール、１０　ｍＭ塩化
カルシウム含有ＹＰＤメディウムに懸濁し、３０℃で３
０分間穏やかに振盪した。懸濁液１，５．１０．２０お
よび５０　Ｐｌをそれぞれ４５℃に保温した１０　ｍＺ
の１．２門ソルビトール、３％ノープルアガー、２％グ
ルコース、０．７％イーストナイト口ジェンベースに懸
濁し、１．２　Ｍソルビトール、３％バタトアガー、２
％グルコース、０．７％イーストナイト口ジェンベース
から成るプレートに拡げた。プレートが固化したら、３
０℃で３日間静置培養した。形成したコロニーを爪楊枝
で採取し、３ＩＩＩｌの０．７％イーストナイト口ジェ
ンベース、２％グルコースに懸濁後、３０℃で２日間振
盪培養した。そのうちの１．５−を遠心し、細胞を集め
３献のＹＰＧメディウム（イーストエキストラクト１０
ｇ、バクトペプトン２０　ｇを水に溶解し９００−とじ
た後オートクレーブ滅菌し、別にオートクレーブ滅菌し
た２０％ガラクトース１００ｄと混合した。）に懸濁し
、３０℃で振盪培養した。培養上清のヒト血清アルブミ
ン濃度をＲＰＨＡ法にて測定したところ、１日目で最高
２　ｎ　／　ｌ１）７．２日目で最高１０ｐｇ／ｄ、３
日目で最高４０ｎ／ｄのヒト血清アルブミンが検出され
た。

これら、組換え酵母により培地中に分泌されたヒト血清
アルブミンを高度精製し、Ｎ末端アミノ酸配列を調べた
ところ、７番目までの配列が血漿由来と一致した。従っ
て、シグナルペプチダーゼによる認識と切断が正しく行
われたと推定された。

【図面の簡単な説明】

図１はにＡＬＩ、１０プロモーターを有するプラスミド
ｐＧＡＬ１）からｐＧＡＬ１２を構築する手順を示す。 図２はｐｈｏ５遺伝子全体を有するプラスミドｐＡＰ５
とｐＵｃ９から、ｐｈｏ５ターミネータ−だけを有する
ｐＰＴｌを構築する手順を示す。 図３はｐｈｏ５ターミネータ−を有するプラスミドｐＰ
Ｔ１とｐＪＤＢ２０７からｐＰＴ２を構築する手順を示
す。 図４および５はプレプロヒト血清アルブミン遺伝子を有
するプラスミドｐＧＸ４０１の制限酵素地図を示す。 図６はプラスミドｐＧＸ４０１とｐＩＪＣ１９がらヒト
血清アルブミン遺伝子Ｃ末端側を有するｐＨ３＾２を構
築する手順を示す。 図７はプラスミドｐＧχ４０１とｐＵｃ１９からヒト血
清アルブミン遺伝子Ｎ末端側を有するｐＨ５Ａ１を構築
する手順を示す。 図８は、ｐＨ３Ａ１　、ｐＨ３＾２および合成したシグ
ナルペプチド遺伝子からシグナルペプチド遺伝子および
成熟ヒト血清アルブミン遺伝子を有するプラスミドｐＹ
Ｎ０１８を構築する手順を示す。 図９はｐＹＮＯ１８とｐＧＡＬ１２から、ＧＡＬＩプロ
モーター、シグナルペプチド遺伝子および成熟ヒト血清
アルブミン遺伝子を有するプラスミドｐＹＮＯ２１を構
築する手順を示す。 図１ＯはｐＹＮＯ２１とｐＰＴ２から、ＧＡＬＩプロモ
ーター、シグナルペプチド遺伝子、成熟ヒト血清アルブ
ミン遺伝子およびｐｈｏ５ターミネータ−を有するプラ
スミドｐＹＮＯ２２を構築する手順を示す。 目　　　１ 手続＋ｉｎ正書装置発） １．事件の表示 昭和６３年特許願第３３６５７号 ２、発明の名称 酵母でａ能する新規シグナルペプチドおよびこれを用い
た異種蛋白質の分泌発現 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）株式会社　ミドリ十字 ４、代理人■５４１ 住所　大阪市東区平野町４丁目５６番地（湯水ビルン 置　　（０６）２２７−１）５６ ５、補正の対象 ６、補正の内容 （１）　　明細書第１２頁第３行および第１６行の「血
清アルブミン」を削除する。 （２）　　明細書第１２頁第１８〜１９行の「ターミネ
ーター」を「ターミネータ−」に訂正する。 （３）　　明細書第１３頁第５行の「血清アルブミン」
を削除する。 （４）　　明細書第２０頁第１８行の「１ｏ」の後に「
層１」を加入する。 （５）　　明細書第３１頁第４行の「３７Ｊを「３ｏ」
に訂正する。 （６）明細書第３３頁第１）行の「７番目」の前に「調
べたＪを加入する。 （７）明細書第３３頁第１）行の「血禁Ｊを「血液」に
訂正する。 （８）　　明細書第１３頁第１２行の「由来Ｊの後に「
ヒト血清アルブミン」を加入する。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下のアミノ酸配列で示されるシグナルペプチド
   。 Ｍｅｔ−Ａ＿１−Ａ＿２−Ｘ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ（式
   中、Ａ＿１は１〜３個のＡｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓまたは
   Ｈｉｓから選ばれたアミノ酸からなるペプチド鎖を、Ａ
   ＿２は１〜３個の任意のアミノ酸からなるペプチド鎖を
   、Ｘは８〜１０個の疎水性アミノ酸からなるペプチド鎖
   を、ＢはＰｒｏまたはＳｅｒを、ＣはＧｌｙまたはＰｒ
   ｏを、ＤはＣｙｓ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒま
   たはＶａｌから選ばれたアミノ酸を、ＥはＴｒｐまたは
   Ｇｌｎを、ＦはＡｌａまたはＧｌｙを各々表わす）
2. （２）請求項（１）のシグナルペプチドの後ろに異種蛋
   白質が連結したプレ型蛋白質。
3. （３）請求項（１）のシグナルペプチドをコードするシ
   グナルペプチドＤＮＡ配列。
4. （４）請求項（３）のシグナルペプチドＤＮＡ配列を含
   んでなるＤＮＡ配列。
5. （５）シグナルペプチドＤＮＡ配列の後ろに異種蛋白質
   をコードするＤＮＡ配列を連結した請求項（４）のＤＮ
   Ａ配列。
6. （６）異種蛋白質がヒト血清アルブミンである請求項（
   ５）のＤＮＡ配列。
7. （７）シグナルペプチドＤＮＡ配列の上流に酵母で機能
   するプロモーター、下流に酵母で機能するターミネータ
   ーを連結した請求項（４）のＤＮＡ配列。
8. （８）請求項（４）のＤＮＡ配列が酵母中で自律複製可
   能なプラスミドＤＮＡ上に存在する組換えプラスミド。
9. （９）請求項（４）のＤＮＡ配列を用いて形質転換させ
   た酵母。
10. （１０）請求項（９）の形質転換酵母から異種蛋白質を
    分泌発現させることを特徴とする異種蛋白質の製造方法
    。