JP3158566B2 - 酵母での異種蛋白の製造方法、プラスミド及び形質転換体 - Google Patents
酵母での異種蛋白の製造方法、プラスミド及び形質転換体Info
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- JP3158566B2 JP3158566B2 JP30697191A JP30697191A JP3158566B2 JP 3158566 B2 JP3158566 B2 JP 3158566B2 JP 30697191 A JP30697191 A JP 30697191A JP 30697191 A JP30697191 A JP 30697191A JP 3158566 B2 JP3158566 B2 JP 3158566B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は酵母で機能する新規異種
シグナルペプチドを用いることによる異種蛋白質の分泌
発現に関する。
シグナルペプチドを用いることによる異種蛋白質の分泌
発現に関する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】組換えＤ
ＮＡ技術により、目的蛋白質を組換え宿主に産生させる
場合、その宿主が目的蛋白質を分泌発現することに多く
の利点が見出される。即ち、目的蛋白質が宿主細胞内に
直接発現されると宿主の増殖、生存に不都合な毒性を示
す場合、目的蛋白質を分泌発現することでこの毒性を回
避することができる。また、毒性を持たない場合でも、
目的蛋白質が宿主細胞内に多量に蓄積すると宿主の増殖
を抑制する場合があるが、分泌発現ではこれを避けるこ
とが可能である。また、目的蛋白質が宿主細胞内に蓄積
するような発現系では、目的蛋白質が宿主細胞内で変性
し、不溶化する現象がよく見られるが、分泌発現の系で
はこれを回避できる。また、商業的に組換えＤＮＡ技術
を用いて目的蛋白質を生産する場合、目的蛋白質が細胞
内に蓄積する系では目的蛋白質を精製する為に、細胞を
破壊し、その破壊液中から目的蛋白質を精製する必要が
ある。このような精製では組換え宿主由来の不純物が多
く混入し、高純度の目的蛋白質を得る事が困難である。
ＮＡ技術により、目的蛋白質を組換え宿主に産生させる
場合、その宿主が目的蛋白質を分泌発現することに多く
の利点が見出される。即ち、目的蛋白質が宿主細胞内に
直接発現されると宿主の増殖、生存に不都合な毒性を示
す場合、目的蛋白質を分泌発現することでこの毒性を回
避することができる。また、毒性を持たない場合でも、
目的蛋白質が宿主細胞内に多量に蓄積すると宿主の増殖
を抑制する場合があるが、分泌発現ではこれを避けるこ
とが可能である。また、目的蛋白質が宿主細胞内に蓄積
するような発現系では、目的蛋白質が宿主細胞内で変性
し、不溶化する現象がよく見られるが、分泌発現の系で
はこれを回避できる。また、商業的に組換えＤＮＡ技術
を用いて目的蛋白質を生産する場合、目的蛋白質が細胞
内に蓄積する系では目的蛋白質を精製する為に、細胞を
破壊し、その破壊液中から目的蛋白質を精製する必要が
ある。このような精製では組換え宿主由来の不純物が多
く混入し、高純度の目的蛋白質を得る事が困難である。
【０００３】一方、分泌発現系で目的蛋白質を生産する
場合には、培養液から目的蛋白質を精製すればよく、組
換え宿主由来の不純物の混入は最小限に防ぐことがで
き、大きなメリットとなる。また、蛋白質の多くは、糖
鎖の付加、ジスルフィド結合の形成、不活性な前駆体蛋
白質の限定水解による活性化、特定のアミノ酸のリン酸
化、カルボキシル化等の修飾を受けるが、これらの中に
は各種細胞で共通に備わった機能もあり、これらの修飾
のいくつかは分泌の過程で生じる。従って、目的蛋白質
を分泌発現で生産する場合、細胞内に蓄積する系に比較
して、より自然な蛋白質に近い機能および構造を持った
蛋白質の生産が期待される。
場合には、培養液から目的蛋白質を精製すればよく、組
換え宿主由来の不純物の混入は最小限に防ぐことがで
き、大きなメリットとなる。また、蛋白質の多くは、糖
鎖の付加、ジスルフィド結合の形成、不活性な前駆体蛋
白質の限定水解による活性化、特定のアミノ酸のリン酸
化、カルボキシル化等の修飾を受けるが、これらの中に
は各種細胞で共通に備わった機能もあり、これらの修飾
のいくつかは分泌の過程で生じる。従って、目的蛋白質
を分泌発現で生産する場合、細胞内に蓄積する系に比較
して、より自然な蛋白質に近い機能および構造を持った
蛋白質の生産が期待される。
【０００４】現在までに、酵母を宿主として、酵母由来
の分泌シグナルを用いて、目的産物を生産した例として
は、ＳＵＣ２シグナル配列を用いたもの（シュン・ナン
・チャンら：特開昭６０−４１４８８号公報）、ＭＦα
１シグナル配列を用いたもの（アンソニー・ジェイ・ブ
レイク：特開昭５９−１３２８９２号公報）が挙げられ
る。また、酵母を宿主として、酵母以外の分泌シグナル
を用いて、目的産物を生産した例としては、Aspergillu
s awamori 由来のグルコアミラーゼのシグナル配列を用
いたもの（エム・エー・イニスら：Science, 228 , 21
(1985)), Rhizopus 由来のグルコアミラーゼのシグナ
ル配列を用いたもの（ヨシズミハジメら：Trends in Bi
otechnology, 5 , 277 (1987)) 、 Mucor pusillus 由
来のアスパルチックプロテアーゼのシグナル配列を用い
たもの（ヤマシタタカシら：Molecular General Geneti
cs, 210 , 462 (1987)) 、卵白リゾチームのシグナル配
列を用いたもの（ジガミヨシフミら：Gene, 43, 273(19
86))が挙げられる。
の分泌シグナルを用いて、目的産物を生産した例として
は、ＳＵＣ２シグナル配列を用いたもの（シュン・ナン
・チャンら：特開昭６０−４１４８８号公報）、ＭＦα
１シグナル配列を用いたもの（アンソニー・ジェイ・ブ
レイク：特開昭５９−１３２８９２号公報）が挙げられ
る。また、酵母を宿主として、酵母以外の分泌シグナル
を用いて、目的産物を生産した例としては、Aspergillu
s awamori 由来のグルコアミラーゼのシグナル配列を用
いたもの（エム・エー・イニスら：Science, 228 , 21
(1985)), Rhizopus 由来のグルコアミラーゼのシグナ
ル配列を用いたもの（ヨシズミハジメら：Trends in Bi
otechnology, 5 , 277 (1987)) 、 Mucor pusillus 由
来のアスパルチックプロテアーゼのシグナル配列を用い
たもの（ヤマシタタカシら：Molecular General Geneti
cs, 210 , 462 (1987)) 、卵白リゾチームのシグナル配
列を用いたもの（ジガミヨシフミら：Gene, 43, 273(19
86))が挙げられる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは酵母による
蛋白質の分泌発現に必須なベクターを構成するシグナル
ペプチドについて研究を重ねて来たところ、Aspergillu
s oryzae由来のアルカリプロテアーゼ（黄麹菌由来アル
カリプロテアーゼ）シグナルペプチドが酵母におけるベ
クターのシグナルペプチドとして機能することを見出
し、さらに研究を重ねて本発明を完成させるに至った。
蛋白質の分泌発現に必須なベクターを構成するシグナル
ペプチドについて研究を重ねて来たところ、Aspergillu
s oryzae由来のアルカリプロテアーゼ（黄麹菌由来アル
カリプロテアーゼ）シグナルペプチドが酵母におけるベ
クターのシグナルペプチドとして機能することを見出
し、さらに研究を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００６】すなわち、本発明は下記(1) 〜(3) に関す
るものである。 (1) Aspergillus oryzae由来アルカリプロテアーゼのシ
グナル配列を用いて、異種蛋白質を酵母で分泌発現させ
ることを特徴とする異種蛋白質の製造方法。 (2) Aspergillus oryzae由来アルカリプロテアーゼのシ
グナルペプチドＤＮＡ配列の上流に酵母で機能するプロ
モーター、下流に異種蛋白質をコードするＤＮＡ配列及
び酵母で機能するターミネーターを連結した配列からな
るプラスミド。 (3) 請求項２記載のプラスミドを用いて形質転換させた
酵母。 本発明における異種蛋白質には特に制限はないが、好ま
しくはヒト血清アルブミン、インターフェロン−α，β
あるいはγ、ウロキナーゼ、成長ホルモン、インシュリ
ン、各種リンホカインなどが挙げられる。このような異
種蛋白質遺伝子は、特開昭６２−２９９８５号公報（ヒ
ト血清アルブミン）、特開昭６３−５２８８３号公報
（ＨＢｓＡｇ）、特開昭６１−１８５１８９号公報（イ
ンターフェロン−α）、特開昭６１−１０８３９７号公
報（インターフェロン−γ）、特開昭６０−１８０５９
１号公報（ウロキナーゼ）などに記載されている。
るものである。 (1) Aspergillus oryzae由来アルカリプロテアーゼのシ
グナル配列を用いて、異種蛋白質を酵母で分泌発現させ
ることを特徴とする異種蛋白質の製造方法。 (2) Aspergillus oryzae由来アルカリプロテアーゼのシ
グナルペプチドＤＮＡ配列の上流に酵母で機能するプロ
モーター、下流に異種蛋白質をコードするＤＮＡ配列及
び酵母で機能するターミネーターを連結した配列からな
るプラスミド。 (3) 請求項２記載のプラスミドを用いて形質転換させた
酵母。 本発明における異種蛋白質には特に制限はないが、好ま
しくはヒト血清アルブミン、インターフェロン−α，β
あるいはγ、ウロキナーゼ、成長ホルモン、インシュリ
ン、各種リンホカインなどが挙げられる。このような異
種蛋白質遺伝子は、特開昭６２−２９９８５号公報（ヒ
ト血清アルブミン）、特開昭６３−５２８８３号公報
（ＨＢｓＡｇ）、特開昭６１−１８５１８９号公報（イ
ンターフェロン−α）、特開昭６１−１０８３９７号公
報（インターフェロン−γ）、特開昭６０−１８０５９
１号公報（ウロキナーゼ）などに記載されている。
【０００７】上述の文献中では、異種蛋白質遺伝子を含
むプラスミドとして開示されている。
むプラスミドとして開示されている。
【０００８】本発明の酵母を形質転換するための組換え
プラスミドは、シグナルペプチド遺伝子の下流に異種蛋
白質遺伝子を自体既知の手段で連結し、これらを含むプ
ラスミドとして自体既知の手段にて調製される。
プラスミドは、シグナルペプチド遺伝子の下流に異種蛋
白質遺伝子を自体既知の手段で連結し、これらを含むプ
ラスミドとして自体既知の手段にて調製される。
【０００９】プロモーターおよびターミネーターは酵母
で機能するものであれば特に限定されない。
で機能するものであれば特に限定されない。
【００１０】プロモーターとしては、ＰＧＫプロモータ
ー、ＡＤＨプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＧＡ
Ｌ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＧＡＰ−
ＤＨプロモーターなどが好適に使用される。
ー、ＡＤＨプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＧＡ
Ｌ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＧＡＰ−
ＤＨプロモーターなどが好適に使用される。
【００１１】プロモーターは黄麹菌アルカリプロテアー
ゼシグナルペプチド遺伝子の上流に位置する。
ゼシグナルペプチド遺伝子の上流に位置する。
【００１２】ターミネーターとしてはＰＨＯ５ターミネ
ーター、ＧＡＰ−ＤＨターミネーターなどが好適に使用
される。
ーター、ＧＡＰ−ＤＨターミネーターなどが好適に使用
される。
【００１３】ターミネーターは異種蛋白質遺伝子の下流
に位置する。
に位置する。
【００１４】プロモーター、ターミネーターは各々プラ
スミドに組み込まれた形で入手される。
スミドに組み込まれた形で入手される。
【００１５】プラスミドＤＮＡは酵母中で自律複製可能
なものであれば特に限定されない。具体的には、ｐＪＤ
Ｂ２０７、ｐＪＤＢ２１９などが例示される。
なものであれば特に限定されない。具体的には、ｐＪＤ
Ｂ２０７、ｐＪＤＢ２１９などが例示される。
【００１６】本発明の組換えプラスミドは、上述したプ
ラスミド群から各々、黄麹菌アルカリプロテアーゼシグ
ナルペプチド遺伝子−異種蛋白質遺伝子からなるＤＮＡ
配列、プロモーターを含むＤＮＡ配列およびターミネー
ターを含むＤＮＡ配列を制限酵素により切り出した後に
連結（接続）して適当なプラスミドに組み込むか、また
は、一方のＤＮＡ配列を切り出した後に他方のプラスミ
ド中に組み込むかのいずれかの方法により得られる。
ラスミド群から各々、黄麹菌アルカリプロテアーゼシグ
ナルペプチド遺伝子−異種蛋白質遺伝子からなるＤＮＡ
配列、プロモーターを含むＤＮＡ配列およびターミネー
ターを含むＤＮＡ配列を制限酵素により切り出した後に
連結（接続）して適当なプラスミドに組み込むか、また
は、一方のＤＮＡ配列を切り出した後に他方のプラスミ
ド中に組み込むかのいずれかの方法により得られる。
【００１７】その際、配列の順序は上流から下流に向か
って、プロモーター、黄麹菌アルカリプロテアーゼシグ
ナルペプチド遺伝子、異種蛋白質遺伝子、ターミネータ
ーとなるように調製する。
って、プロモーター、黄麹菌アルカリプロテアーゼシグ
ナルペプチド遺伝子、異種蛋白質遺伝子、ターミネータ
ーとなるように調製する。
【００１８】また、選別時のマーカーとして、抗生物質
〔Ｇ４１８、クロラムフェニコール等〕耐性遺伝子ある
いは宿主の栄養要求性を補う遺伝子を組み込むことも可
能である。
〔Ｇ４１８、クロラムフェニコール等〕耐性遺伝子ある
いは宿主の栄養要求性を補う遺伝子を組み込むことも可
能である。
【００１９】本発明のＤＮＡ配列を用いて形質転換体を
調製する方法としては、当該ＤＮＡ配列を組み込んだ組
換えプラスミドを用いる方法、あるいは当該ＤＮＡ配列
を宿主（酵母）の染色体上に挿入する方法などが挙げら
れる。
調製する方法としては、当該ＤＮＡ配列を組み込んだ組
換えプラスミドを用いる方法、あるいは当該ＤＮＡ配列
を宿主（酵母）の染色体上に挿入する方法などが挙げら
れる。
【００２０】この組換えプラスミドを用いて形質転換体
を製作する方法ひいては異種蛋白質を製造する方法は以
下の通りである。
を製作する方法ひいては異種蛋白質を製造する方法は以
下の通りである。
【００２１】組換えプラスミドを宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては酵母が用いられる。具体的には挿入さ
れるプラスミドが担持する選択マーカー遺伝子によって
相補する変異をもった変異株、たとえばロイシン要求性
変異株であるサッカロミセス・セレビシェ（Saccharomy
ces cerevisiae) AH22(a, his 4, leu 2, can 1)等が好
適に用いられる。
宿主細胞としては酵母が用いられる。具体的には挿入さ
れるプラスミドが担持する選択マーカー遺伝子によって
相補する変異をもった変異株、たとえばロイシン要求性
変異株であるサッカロミセス・セレビシェ（Saccharomy
ces cerevisiae) AH22(a, his 4, leu 2, can 1)等が好
適に用いられる。
【００２２】宿主細胞（酵母）の形質転換は公知の方
法、たとえば、リチウム法、プロトプラストポリエチレ
ングリコール融合法、エレクトロポレーション法などに
より行う。
法、たとえば、リチウム法、プロトプラストポリエチレ
ングリコール融合法、エレクトロポレーション法などに
より行う。
【００２３】必要な形質転換体を選択する。
【００２４】形質転換株は、宿主細胞用として自体公知
の培地で培養する。培地としては YNB液体培地〔0.７％
Yeast Nitrogen Base (Difco社) 、２％グルコー
ス〕、およびＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラ
クト（Difco 社) 、２％バクトペプトン（Defco 社) ２
％グルコース〕などが例示される。
の培地で培養する。培地としては YNB液体培地〔0.７％
Yeast Nitrogen Base (Difco社) 、２％グルコー
ス〕、およびＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラ
クト（Difco 社) 、２％バクトペプトン（Defco 社) ２
％グルコース〕などが例示される。
【００２５】培養は、通常１５〜４３℃（好適には３０
℃程度）で２０〜１００時間程度行い、必要により通気
や攪拌を加えることもできる。培養後、培養上清を回収
し、自体公知の方法、たとえばアフィニティクロマトグ
ラフィー、分画法などにより異種蛋白質を精製する。
℃程度）で２０〜１００時間程度行い、必要により通気
や攪拌を加えることもできる。培養後、培養上清を回収
し、自体公知の方法、たとえばアフィニティクロマトグ
ラフィー、分画法などにより異種蛋白質を精製する。
【００２６】
【発明の効果】本発明の方法により、目的とする異種蛋
白質を分泌発現で生産することができ、細胞内で蓄積す
る系に比較して、より自然な蛋白質に近い機能および構
造を有する異種蛋白質の生産が期待できる。
白質を分泌発現で生産することができ、細胞内で蓄積す
る系に比較して、より自然な蛋白質に近い機能および構
造を有する異種蛋白質の生産が期待できる。
【００２７】また、目的蛋白質が細胞内に蓄積する系で
は目的蛋白質を精製する為に、細胞を破壊し、その破壊
液中から目的蛋白質を精製する必要があるが、本発明の
方法によればかかる精製の必要がない。特に異種蛋白質
の効率的な発現に対して有用と考えられる。
は目的蛋白質を精製する為に、細胞を破壊し、その破壊
液中から目的蛋白質を精製する必要があるが、本発明の
方法によればかかる精製の必要がない。特に異種蛋白質
の効率的な発現に対して有用と考えられる。
【００２８】
【実施例】本発明をより詳細に説明するために、実施例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。
【００２９】なお、本発明において多くの技法、反応お
よび分析方法は当業界においてよく知られている。特に
ことわらない限り、全ての酵素は商業的供給源、たとえ
ば宝酒造；ニューイングランド バイオラブス（ＮＥ
Ｂ)(NewEngland Biolabs)マサチューセッツ、米国；ア
マーシャム（Amerscham)、英国およびベセスダ リサー
チ ラボラトリーズ〔Bethesda Research Labolatories
(BRL) 〕、メリーランド、米国から入手することができ
る。
よび分析方法は当業界においてよく知られている。特に
ことわらない限り、全ての酵素は商業的供給源、たとえ
ば宝酒造；ニューイングランド バイオラブス（ＮＥ
Ｂ)(NewEngland Biolabs)マサチューセッツ、米国；ア
マーシャム（Amerscham)、英国およびベセスダ リサー
チ ラボラトリーズ〔Bethesda Research Labolatories
(BRL) 〕、メリーランド、米国から入手することができ
る。
【００３０】酵素反応のための緩衝液および反応条件は
特に断らない限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使
用した。
特に断らない限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使
用した。
【００３１】プラスミドを用いた大腸菌の形質転換法、
電気泳動法およびＤＮＡのゲルからの回収法は、「モレ
キュラークローニング」コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー〔「Moleculer Cloning 」Cold Spring Harb
or Laboratory (1982)〕に記載されている方法により行
った。酵母の形質転換は、「メソッド・イン・イースト
・ジェネティクス」コールドスプリングハーバーラボラ
トリー〔「Method inYeast Genetics」Cold Spring Har
bor Laboratory (1981)〕に記載されている方法で行っ
た。
電気泳動法およびＤＮＡのゲルからの回収法は、「モレ
キュラークローニング」コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー〔「Moleculer Cloning 」Cold Spring Harb
or Laboratory (1982)〕に記載されている方法により行
った。酵母の形質転換は、「メソッド・イン・イースト
・ジェネティクス」コールドスプリングハーバーラボラ
トリー〔「Method inYeast Genetics」Cold Spring Har
bor Laboratory (1981)〕に記載されている方法で行っ
た。
【００３２】実施例１（ヒト血清アルブミンの産生） １．アルカリプロテアーゼ遺伝子のシグナル配列の予測 黄麹菌の産生するアルカリプロテアーゼのｍＲＮＡから
翻訳されると考えられる未成熟な蛋白質のアミノ酸配列
（特願昭６３−１７００１８号公報）を、配列表・配列
番号１に示す。 G. von Heijne (G. von Hijne (1986)
Nucl. Acids Res., 14, 4683-4690)は R. Staden (R.St
aden (1984) Nucl. Acids Res., 12, 505-519)の手法を
応用して、既知の分泌蛋白質シグナルペプチドのアミノ
酸配列を統計的に解析し、シグナルペプチド切断部位を
予測する方法を報告している。そこでその手法を用いて
アルカリプロテアーゼのシグナルペプチド切断部位を予
測したところ、２０番目のＧｌｙと２１番目のＡｌａの
間で切断されると考えられた。
翻訳されると考えられる未成熟な蛋白質のアミノ酸配列
（特願昭６３−１７００１８号公報）を、配列表・配列
番号１に示す。 G. von Heijne (G. von Hijne (1986)
Nucl. Acids Res., 14, 4683-4690)は R. Staden (R.St
aden (1984) Nucl. Acids Res., 12, 505-519)の手法を
応用して、既知の分泌蛋白質シグナルペプチドのアミノ
酸配列を統計的に解析し、シグナルペプチド切断部位を
予測する方法を報告している。そこでその手法を用いて
アルカリプロテアーゼのシグナルペプチド切断部位を予
測したところ、２０番目のＧｌｙと２１番目のＡｌａの
間で切断されると考えられた。
【００３３】２．シグナル配列の設計及び合成 シグナル配列をコードするＤＮＡは化学合成により製造
した。使用するコドンは全て酵母のcodon usage に合わ
せた。シグナルペプチドのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ配列をアプライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成機
モデル３８１Ａを用い、ホスフォアミダイト法にて合成
した。そのＤＮＡ配列を配列表・配列番号２に示す。ま
た、異なる表記方法による当該配列を図１に示す。
した。使用するコドンは全て酵母のcodon usage に合わ
せた。シグナルペプチドのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ配列をアプライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成機
モデル３８１Ａを用い、ホスフォアミダイト法にて合成
した。そのＤＮＡ配列を配列表・配列番号２に示す。ま
た、異なる表記方法による当該配列を図１に示す。
【００３４】３．酵母でヒト血清アルブミンを分泌発現
させる為のプラスミドＤＮＡの作製 使用したプラスミドはpHSA1, pHSA2, pGAL12, pPT2であ
り、これらのプラスミドの詳細は特願昭63-33657号公報
に開示されている。pHSA1 、pHSA2 、 pGAL12 及びpPT2
を構築する手順は、それぞれ図２、図３、図４、図５及
び図６に示した通りである。
させる為のプラスミドＤＮＡの作製 使用したプラスミドはpHSA1, pHSA2, pGAL12, pPT2であ
り、これらのプラスミドの詳細は特願昭63-33657号公報
に開示されている。pHSA1 、pHSA2 、 pGAL12 及びpPT2
を構築する手順は、それぞれ図２、図３、図４、図５及
び図６に示した通りである。
【００３５】上記合成ＤＮＡの5'末端をATP 及びT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、pHSA
1 を XbaＩ及びHincIIで消化しヒト血清アルブミン蛋白
質のＮ末端側をコードする約１kbのＤＮＡ断片 HSA1 を
電気泳動で単離した。上記リン酸化した合成ＤＮＡと H
SA1 を混合し、T4 DNAリガーゼを用いて連結し、さらに
XbaＩおよびBamHＩで消化した。pHSA2 を XbaＩ及びBa
mHＩで消化後、アルカリホスファターゼで処理した。こ
れらのＤＮＡを混合し、T4 DNAリガーゼで連結後、大腸
菌エシェリシアコリHB101 コンピテントセルに導入し
た。得られたトランスフォーマントのうち、図７及び図
８に示したプラスミドpAP-0 を有するクローンを得た。
ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、pHSA
1 を XbaＩ及びHincIIで消化しヒト血清アルブミン蛋白
質のＮ末端側をコードする約１kbのＤＮＡ断片 HSA1 を
電気泳動で単離した。上記リン酸化した合成ＤＮＡと H
SA1 を混合し、T4 DNAリガーゼを用いて連結し、さらに
XbaＩおよびBamHＩで消化した。pHSA2 を XbaＩ及びBa
mHＩで消化後、アルカリホスファターゼで処理した。こ
れらのＤＮＡを混合し、T4 DNAリガーゼで連結後、大腸
菌エシェリシアコリHB101 コンピテントセルに導入し
た。得られたトランスフォーマントのうち、図７及び図
８に示したプラスミドpAP-0 を有するクローンを得た。
【００３６】pAP-0 をEcoRＩ及びBamHＩで消化後、アル
カリホスファターゼで処理した。pGAL12をEcoRＩ及びBa
mHＩで消化後、電気泳動により GAL1 プロモーターを有
する1 kb のＤＮＡ断片を単離し、上記処理をしたpAP-0
と混合し、T4 DNAリガーゼにより連結した。得られた
トランスフォーマントより、図９及び図１０に示したプ
ラスミドpAP-1 を有するクローンを得た。 pAP-1は GAL
1 プロモーター下流に黄麹菌由来のアルカリプロテアー
ゼシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、およびそ
の直後に成熟ヒト血清アルブミン蛋白質をコードするＤ
ＮＡ配列、およびその直後のヒト血清アルブミンcDNA由
来 3' 非翻訳領域がpUC19 のEcoRＩ- HindIII 部位に挿
入されたプラスミドＤＮＡである。
カリホスファターゼで処理した。pGAL12をEcoRＩ及びBa
mHＩで消化後、電気泳動により GAL1 プロモーターを有
する1 kb のＤＮＡ断片を単離し、上記処理をしたpAP-0
と混合し、T4 DNAリガーゼにより連結した。得られた
トランスフォーマントより、図９及び図１０に示したプ
ラスミドpAP-1 を有するクローンを得た。 pAP-1は GAL
1 プロモーター下流に黄麹菌由来のアルカリプロテアー
ゼシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、およびそ
の直後に成熟ヒト血清アルブミン蛋白質をコードするＤ
ＮＡ配列、およびその直後のヒト血清アルブミンcDNA由
来 3' 非翻訳領域がpUC19 のEcoRＩ- HindIII 部位に挿
入されたプラスミドＤＮＡである。
【００３７】pAP-1 をEcoRＩ及びHindIII で消化し、電
気泳動により2.7 kbの GAL1 プロモーター、シグナルペ
プチド、成熟ヒト血清アルブミン蛋白質、非翻訳領域を
コードしたＤＮＡ断片を単離した。また、pPT2をBamHＩ
で消化し、さらにアルカリホスファターゼで処理した。
これと上記 2.7 kb ＤＮＡ断片を混合し、dATP, dGTP,
dTTP, 及び dCTP 存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩ，クレ
ノウ断片にて付着末端を修復した。更に、T4DNAリガー
ゼにより連結し、大腸菌HB101 に導入した。得られたト
ランスフォーマントより、図１１及び１２に示したプラ
スミドpAP-2 を有するクローンを得た。pAP-2 は大腸菌
及び酵母中で自律増殖可能なプラスミドで、酵母におい
て機能する GAL1 プロモーターの支配下にコンセンサス
シグナルペプチドとそれに続いて成熟ヒト血清アルブミ
ン蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有している。さら
に、 pAP-2は大腸菌においてアンピシリン耐性を付与す
る遺伝子、及び酵母においてロイシン栄養要求性を補う
遺伝子を有しており、これらの遺伝子はトランスフォー
マントの選択マーカーとして使用可能である。
気泳動により2.7 kbの GAL1 プロモーター、シグナルペ
プチド、成熟ヒト血清アルブミン蛋白質、非翻訳領域を
コードしたＤＮＡ断片を単離した。また、pPT2をBamHＩ
で消化し、さらにアルカリホスファターゼで処理した。
これと上記 2.7 kb ＤＮＡ断片を混合し、dATP, dGTP,
dTTP, 及び dCTP 存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩ，クレ
ノウ断片にて付着末端を修復した。更に、T4DNAリガー
ゼにより連結し、大腸菌HB101 に導入した。得られたト
ランスフォーマントより、図１１及び１２に示したプラ
スミドpAP-2 を有するクローンを得た。pAP-2 は大腸菌
及び酵母中で自律増殖可能なプラスミドで、酵母におい
て機能する GAL1 プロモーターの支配下にコンセンサス
シグナルペプチドとそれに続いて成熟ヒト血清アルブミ
ン蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有している。さら
に、 pAP-2は大腸菌においてアンピシリン耐性を付与す
る遺伝子、及び酵母においてロイシン栄養要求性を補う
遺伝子を有しており、これらの遺伝子はトランスフォー
マントの選択マーカーとして使用可能である。
【００３８】４．プラスミドpAP-2 の酵母への導入とヒ
ト血清アルブミンの分泌発現 4-1. プラスミドpAP-2 の酵母への導入 ヒト血清アルブミン分泌発現用プラスミドpAP-2 を酵母
サッカロミセスセレビシエ AH22 に以下の方法により導
入した。
ト血清アルブミンの分泌発現 4-1. プラスミドpAP-2 の酵母への導入 ヒト血清アルブミン分泌発現用プラスミドpAP-2 を酵母
サッカロミセスセレビシエ AH22 に以下の方法により導
入した。
【００３９】YPD メディウム（イーストエキストラクト
10 ｇ、バクトペプトン 20 ｇを水に溶解し900 mlとし
た後オートクレーブ滅菌し、別にオートクレーブ滅菌し
た 20 ％グルコース 100mlと混合した。）50ml中 37
℃、一夜振盪培養したサッカロミセスセレビシエ AH22
を遠心し、得られた細胞を水20mlに懸濁後、再度遠心し
て細胞を得た。これを10mlの 50 mMジチオスレイトー
ル、1.2 M ソルビトール、25 mM EDTA, pH 8.5に懸濁
し、 30 ℃で10分間穏やかに振盪した。遠心により細胞
を集め、1.2 M ソルビトール 10 mlに懸濁し、再度遠心
により細胞を集めた。細胞を 10 mlの 1.2 Mソルビトー
ルに懸濁し、遠心により細胞を集めた。細胞を10 mlの
0.2mg／mlザイモリアーゼ100T, 1.2Mソルビトール、10
mM EDTA, 0.1M クエン酸ナトリウム、pH5.8 に懸濁後、
30 ℃で１時間穏やかに振盪した。遠心で細胞を集め、
1.2 M ソルビトール、次いで 10 mM塩化カルシウム, 1.
2 M ソルビトール各 10 mlで洗浄し、遠心で細胞を集め
た。細胞を１mlの 10 mM塩化カルシウム, 1.2 M ソルビ
トールに懸濁した。懸濁液100 μｌを滅菌試験管にと
り、５μｌ（５μｇ）のpAP-2 と混合し、室温に 15 分
間静置した。更に、1.2 mlの 20 ％ポリエチレングリコ
ール 4000, 10 mM塩化カルシウム, 10 mM トリス-塩酸,
pH7.5 を加え穏やかに混合後、室温で 20 分間静置し
た。遠心で細胞を集め、0.1 mlの1.2 M ソルビトール、
10 mM 塩化カルシウム含有YPD メディウムに懸濁し、30
℃で30分間穏やかに振盪した。懸濁液1,5, 10, 20 およ
び 50 μｌをそれぞれ 45 ℃に保温した 10 mlの1.2 M
ソルビトール、3 ％ノーブルアガー、2 ％グルコース、
0.7 ％イーストナイトロジェンベースに懸濁し、1.2 M
ソルビトール、3 ％バクトアガー、2 ％グルコース、0.
7 ％イーストナイトロジェンベースから成るプレートに
拡げた。プレートが固化したら、30℃で３日間静置培養
した。
10 ｇ、バクトペプトン 20 ｇを水に溶解し900 mlとし
た後オートクレーブ滅菌し、別にオートクレーブ滅菌し
た 20 ％グルコース 100mlと混合した。）50ml中 37
℃、一夜振盪培養したサッカロミセスセレビシエ AH22
を遠心し、得られた細胞を水20mlに懸濁後、再度遠心し
て細胞を得た。これを10mlの 50 mMジチオスレイトー
ル、1.2 M ソルビトール、25 mM EDTA, pH 8.5に懸濁
し、 30 ℃で10分間穏やかに振盪した。遠心により細胞
を集め、1.2 M ソルビトール 10 mlに懸濁し、再度遠心
により細胞を集めた。細胞を 10 mlの 1.2 Mソルビトー
ルに懸濁し、遠心により細胞を集めた。細胞を10 mlの
0.2mg／mlザイモリアーゼ100T, 1.2Mソルビトール、10
mM EDTA, 0.1M クエン酸ナトリウム、pH5.8 に懸濁後、
30 ℃で１時間穏やかに振盪した。遠心で細胞を集め、
1.2 M ソルビトール、次いで 10 mM塩化カルシウム, 1.
2 M ソルビトール各 10 mlで洗浄し、遠心で細胞を集め
た。細胞を１mlの 10 mM塩化カルシウム, 1.2 M ソルビ
トールに懸濁した。懸濁液100 μｌを滅菌試験管にと
り、５μｌ（５μｇ）のpAP-2 と混合し、室温に 15 分
間静置した。更に、1.2 mlの 20 ％ポリエチレングリコ
ール 4000, 10 mM塩化カルシウム, 10 mM トリス-塩酸,
pH7.5 を加え穏やかに混合後、室温で 20 分間静置し
た。遠心で細胞を集め、0.1 mlの1.2 M ソルビトール、
10 mM 塩化カルシウム含有YPD メディウムに懸濁し、30
℃で30分間穏やかに振盪した。懸濁液1,5, 10, 20 およ
び 50 μｌをそれぞれ 45 ℃に保温した 10 mlの1.2 M
ソルビトール、3 ％ノーブルアガー、2 ％グルコース、
0.7 ％イーストナイトロジェンベースに懸濁し、1.2 M
ソルビトール、3 ％バクトアガー、2 ％グルコース、0.
7 ％イーストナイトロジェンベースから成るプレートに
拡げた。プレートが固化したら、30℃で３日間静置培養
した。
【００４０】4-2.形質転換酵母のＨＳＡ産生 形成したコロニーを爪楊枝で採取し、3 mlの0.7 ％イー
ストナイトロジェンベース、2 ％グルコースに懸濁後、
30℃で２日間振盪培養した。そのうちの 1.5mlを遠心
し、細胞を集め 3mlのYPGメディウム（イーストエキス
トラクト10ｇ、バクトペプトン 20 ｇを水に溶解し 900
mlとした後オートクレーブ滅菌し、別にオートクレーブ
滅菌した20％ガラクトース 100mlと混合した。）に懸濁
し、30℃で振盪培養した。培養上清のヒト血清アルブミ
ン濃度をＲＰＨＡ法にて測定したところ、培養３日目で
最高20〜40μｇ／mlのヒト血清アルブミンが検出され
た。
ストナイトロジェンベース、2 ％グルコースに懸濁後、
30℃で２日間振盪培養した。そのうちの 1.5mlを遠心
し、細胞を集め 3mlのYPGメディウム（イーストエキス
トラクト10ｇ、バクトペプトン 20 ｇを水に溶解し 900
mlとした後オートクレーブ滅菌し、別にオートクレーブ
滅菌した20％ガラクトース 100mlと混合した。）に懸濁
し、30℃で振盪培養した。培養上清のヒト血清アルブミ
ン濃度をＲＰＨＡ法にて測定したところ、培養３日目で
最高20〜40μｇ／mlのヒト血清アルブミンが検出され
た。
【００４１】これら、組換え酵母により培地中に分泌さ
れたヒト血清アルブミンを高度精製し、Ｎ末端アミノ酸
配列を調べたところ、７番目までの配列が血漿由来と一
致した。従って、シグナルペプチダーゼによる認識と切
断が正しく行われたと推定された。
れたヒト血清アルブミンを高度精製し、Ｎ末端アミノ酸
配列を調べたところ、７番目までの配列が血漿由来と一
致した。従って、シグナルペプチダーゼによる認識と切
断が正しく行われたと推定された。
【００４２】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Gln Ser Ile Lys Arg Thr Leu Leu Leu Leu Gly Ala Ile Leu Pro 5 10 15 Ala Val Leu Gly Asp Ala His Lys Ser Val 20 25 配列番号：２ 配列の長さ：７３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：アスペルギルス オリーゼ（Aspergillus oryzae） 配列の特徴 特徴を示す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：15..74 特徴を示した方法：Ｓ 配列： GATCCAAAAA AAAA ATG CAA TCT ATT AAG AGA ACT TTG TTG TTG TTG GGT 50 Met Gln Ser Ile Lys Arg Thr Leu Leu Leu Leu Gly -20 -15 -10 GCT ATT TTG CCA GCT GTT TTG GGT 74 Ala Ile Leu Pro Ala Val Leu Gly -5
【図１】図１はアルカリプロテアーゼ遺伝子のシグナル
配列をコードするＤＮＡ配列を示す図である。
配列をコードするＤＮＡ配列を示す図である。
【図２】図２はpHSA1 を構築する手順を示す図である。
【図３】図３はpHSA1 を構築する手順を示す図（続き）
である。
である。
【図４】図４はpHSA2 を構築する手順を示す図である。
【図５】図５はpGAL12を構築する手順を示す図である。
【図６】図６はpPT2を構築する手順を示す図である。
【図７】図７はpAP-0 を構築する手順を示す図である。
【図８】図８はpAP-0 を構築する手順を示す図（続き）
である。
である。
【図９】図９はpAP-1 を構築する手順を示す図である。
【図１０】図１０はpAP-1 を構築する手順を示す図（続
き）である。
き）である。
【図１１】図１１はpAP-2 を構築する手順を示す図であ
る。
る。
【図１２】図１２はpAP-2 を構築する手順を示す図（続
き）である。
き）である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 川辺 晴英 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株式会社ミドリ十字 中央研究所内 (56)参考文献 Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏ ｌ．219（1989）ｐ．33−38 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．228［4695 ］（1985）ｐ．21−26 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/81 C12N 1/19 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】 配列表配列番号１に示されるアミノ酸配
列中アミノ酸番号１〜２０で示されるAspergillus oryz
ae由来アルカリプロテアーゼのシグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列の上流に酵母で機能するプロモータ
ー、下流に異種蛋白質をコードするＤＮＡ配列及び酵母
で機能するターミネーターを連結した配列を含むプラス
ミド。 - 【請求項２】 Aspergillus oryzae由来アルカリプロテ
アーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列が配
列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号１５〜７
４で示される請求項１記載のプラスミド。 - 【請求項３】 酵母で機能するプロモーターがＧＡＬ１
プロモーターであり、酵母で機能するターミネーターが
ＰＨＯ５ターミネーターである請求項１または２記載の
プラスミド。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載のプラス
ミドを用いて形質転換させた酵母。 - 【請求項５】 請求項４記載の酵母を培地中で培養し
て、異種蛋白質を分泌発現させることを特徴とする異種
蛋白質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30697191A JP3158566B2 (ja) | 1991-10-24 | 1991-10-24 | 酵母での異種蛋白の製造方法、プラスミド及び形質転換体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30697191A JP3158566B2 (ja) | 1991-10-24 | 1991-10-24 | 酵母での異種蛋白の製造方法、プラスミド及び形質転換体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05115295A JPH05115295A (ja) | 1993-05-14 |
| JP3158566B2 true JP3158566B2 (ja) | 2001-04-23 |
Family
ID=17963472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30697191A Expired - Fee Related JP3158566B2 (ja) | 1991-10-24 | 1991-10-24 | 酵母での異種蛋白の製造方法、プラスミド及び形質転換体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3158566B2 (ja) |
-
1991
- 1991-10-24 JP JP30697191A patent/JP3158566B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．２１９（１９８９）ｐ．３３−３８ |
| Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２２８［４６９５］（１９８５）ｐ．２１−２６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05115295A (ja) | 1993-05-14 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |