JP2799348B2 - 発現分泌ベクター - Google Patents

発現分泌ベクター

Info

Publication number
JP2799348B2
JP2799348B2 JP6331663A JP33166394A JP2799348B2 JP 2799348 B2 JP2799348 B2 JP 2799348B2 JP 6331663 A JP6331663 A JP 6331663A JP 33166394 A JP33166394 A JP 33166394A JP 2799348 B2 JP2799348 B2 JP 2799348B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
sequence
seq
saccharomyces cerevisiae
pygilp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP6331663A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0847393A (ja
Inventor
鳳鉉 鄭
寿完 南
炳文 金
スン−アー ヤン
英薫 朴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Institute of Science and Technology KIST
Original Assignee
Korea Institute of Science and Technology KIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Institute of Science and Technology KIST filed Critical Korea Institute of Science and Technology KIST
Publication of JPH0847393A publication Critical patent/JPH0847393A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2799348B2 publication Critical patent/JP2799348B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01007—Inulinase (3.2.1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4721—Lipocortins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵母細胞内で発現され
た目的タンパク質を効率よく分泌させる新規な分泌シグ
ナル配列（ペプチド）に関する。詳述すると、組換え酵
母細胞内で発現された目的タンパク質を菌体外にほぼ完
全に分泌させるクルイベロミセスマルシアヌス（Ｋｌｕ
ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）由来のイ
ヌリナーゼ（ｉｎｕｌｉｎａｓｅ）の分泌シグナル配
列、前記分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配
列、前記ヌクレオチド配列を含む発現分泌ベクター、前
記発現分泌ベクターにより形質転換された組換え酵母細
胞、及び前記組換え酵母細胞を培養することにより目的
タンパク質を生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】多様なタンパク質、特に医薬品として使
用されるタンパク質は安定性が広く認識されているサッ
カロミセス属を含む酵母から生産してきたし（Ｍａｒｔ
ｅｎ＆ Ｓｅｏ，Ｃｈａｐ．７，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄＰｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ
ｒＤＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｅｄ．ｂｙ Ｈａｔｃ
ｈ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，４７
７ （１９９１））、目的タンパク質を生産及び分泌さ
せるために“プロモーター＋分泌シグナル配列をコード
するＤＮＡ＋目的タンパク質の構造遺伝子＋ターミネー
ター”のように構成された発現分泌プラスミドを使用し
てきた。そのようなプラスミドに使用するためのプロモ
ーターとしては、ＰＧＫ（Ｌｏｉｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，大韓民国特許公開第８８−７７２７号及び第８８
−７００２３４号各明細書；Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ．，６，７２（１９８８））、ＧＡＰＤＨ、交配因子
α（ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−α，ＭＦα−１）、
ＰＨＯ５（Ｍｅｙｈａｃｋ ｅｔａｌ．，大韓民国特許
公開第８６−３８１号及び第８７−６１８５号各明細
書；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ｅｄ．ｂｙ Ｈｅｒｓｈｂ
ｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｐｐ．３１１−３２１（１
９８９），アメリカ微生物学会刊）、及びグルコースの
ない培地にガラクトースを添加することによって遺伝子
発現を誘導できるＧＡＬ１等のＧＡＬプロモーターシリ
ーズが使用されている。しかしながら、ＰＧＫ、ＧＡＰ
ＤＨ、又はＭＦα−１プロモーターの調節下において
は、遺伝子が構成的に、又は菌体増殖期の末期に発現さ
れるので発現量が少なく、そのようなプロモーターを含
むプラスミドの安定性は培養途中で低下しやすい。ＰＨ
Ｏ５プロモーターは、培地内のリン酸塩の濃度が低いと
き、遺伝子の発現を誘導するが、組換え酵母の発酵途中
で培地内のリン酸塩濃度をおとすことは複雑で煩わしい
工程である。このような理由で、ＧＡＬシリーズプロモ
ーターが目的遺伝子発現調節用として好ましく使用され
ている。
【０００３】酵母から目的タンパク質を分泌させるため
に現在使用されている分泌シグナル配列としては、イン
ベルターゼシグナル配列（アメリカ特許第５，０１０，
００３号）、酸性ホスファターゼシグナル配列（アメリ
カ特許第５，０１３，６５２号）、及び交配因子αのシ
グナル配列（ｐｒｅｐｒｏ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ；以下、ｐｐＬと略称する；アメリカ特許第４，
５８８，６８４号）などがある。この中でｐｐＬがもっ
とも広く使われている。分泌シグナル配列としてｐｐＬ
を利用して酵母細胞からヒトリポコルチン−Ｉ（３４６
個のアミノ酸）とヒトインターロイキン−２（１３３個
のアミノ酸）の分泌に対し研究する間、本発明者らは相
当量のリポコルチン−Ｉとインターロイキン−２が細胞
内に残留することを観察した。また、チェボ（Ｚｓｅｂ
ｏ）らは、分泌シグナル配列としてｐｐＬを利用して酵
母から異種タンパク質を分泌させるとき、アミノ酸３１
個からなるベータエンドルフィン（β−ｅｎｄｏｒｐｈ
ｉｎ）やアミノ酸３２個からなるカルシトニン（ｃａｌ
ｃｉｔｏｎｉｎ）は菌体外に完全に分泌されたが、アミ
ノ酸１６６個からなるα−インターフェロンは９５％が
細胞内に残留することを報告した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２６１，５８５８ー５８６５（１９８６））。
以上は、ｐｐＬが、比較的高分子量のタンパク質を分泌
するための分泌シグナル配列としては、適当ではないこ
とを示した。
【０００４】
【産業上の利用分野】本発明は、組換え酵母細胞内で発
現された目的タンパク質を菌体外にほぼ完全に分泌させ
るクルイベロミセスマルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）由来のイヌリナーゼ
（ｉｎｕｌｉｎａｓｅ）の分泌シグナル配列をコードす
るヌクレオチド配列を含む発現分泌ベクター、前記発現
分泌ベクターにより形質転換された組換え酵母細胞、及
び前記組換え酵母細胞を培養することにより目的タンパ
ク質を生産する方法に関する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、以上の
ような既存の分泌シグナルの欠点を補完し、比較的高分
子量の目的タンパク質を組換え酵母細胞外に効率的に分
泌させる新規な分泌シグナル配列を開発すべく鋭意研究
を行った結果、クルイベロミセスマルシアヌスから由来
したイヌリナーゼの分泌シグナルペプチドをコードする
新規なヌクレオチド配列が、酵母細胞で発現された高分
子量の目的タンパク質をほぼ完全に細胞外に分泌させる
ことを発見して、本発明を完成した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、分泌
シグナル配列をコードする前記ポリヌクレオチド；シグ
ナル−コード配列の上流に位置し、遺伝子転写を促進で
き得る酵母プロモーター；シグナル−コード配列の下流
に位置し、目的タンパク質のＤＮＡ配列を、シグナル−
コード配列と共に開放型読み取り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａ
ｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）になるようにベクター内に挿入
するための部位；目的タンパク質のＤＮＡ配列の挿入の
ための部位から下流にあるターミネーターを含む発現分
泌ベクター、及びこのベクターの目的タンパク質のＤＮ
Ａ配列の挿入のための部位に、目的タンパク質をコード
するＤＮＡ配列が、シグナル−コード配列と共に開放型
読み取り枠になるように挿入された組換え発現分泌ベク
ターに関する。また、本発明は、目的タンパク質を細胞
外培地に完全に分泌することができる、上記の発現分泌
ベクターにより形質転換された組換え酵母細胞、及び組
換え酵母細胞を培養し、培地から目的タンパク質を回収
することを含む、酵母細胞で目的タンパク質を生産する
方法にも関する。
【０００７】以下、本発明を詳述する。１．新規な分泌シグナル配列 クルイベロミセスマルシアヌスＡＴＣＣ１２４２４（ラ
ルー等及び高重煥、前記文献参照）から由来したイヌリ
ナーゼのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を比較する
と、同一菌株から由来したものであっても、７個のアミ
ノ酸、２７個のヌクレオチド及び開放型読み取り枠（ｏ
ｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ；以下、ＯＲＦと
称することもある。）の外の上流部分と下流部分でのヌ
クレオチド配列が、相互に異なる。この事実を基にし
て、ラルー等がクローニングしたイヌリナーゼ遺伝子を
ＩＮＵ１と、高重煥がクローニングしたイヌリナーゼ遺
伝子をＩＮＵ１Ａと、それぞれ命名する。同一菌株にイ
ヌリナーゼ遺伝子が２種類以上存在するのは２倍体酵母
細胞から遺伝子の２倍体複製数（ｄｉｐｌｏｉｄ ｃｏ
ｐｉｅｓ）が原因である（高重煥の前記論文参照）。
【０００８】以上において、本発明者らは、クルイベロ
ミセスマルシアヌス（Ｒｏｕｗｅｎｈｏｒｓｔ ｅｔ
ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，５６，３３３７−３３４５（１９９０））及び組
換えサッカロミセスセレビジエ（ラルー等、前記文献参
照）細胞の外に分泌される全ての成熟イヌリナーゼのＮ
末端が２４番目のアミノ酸から始まる共通点を有し；イ
ヌリナーゼ遺伝子ＩＮＵ１及びＩＮＵ１Ａによりコード
されたタンパク質の２２、２３番のアミノ酸がそれぞれ
リジン、アルギニンであり；このリジン−アルギニン配
列はサッカロミセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエンドプロテアーゼ
ｙｓｃＦ（ＫＥＸ２遺伝子の発現物）の認識部位であり
（Ｊｕｌｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３７，１０
７５−１０８９（１９８４））；イヌリナーゼ遺伝子Ｉ
ＮＵ１及びＩＮＵ１Ａによりコードされたタンパク質の
１番アミノ酸であるメチオニンから２３番アミノ酸であ
るアルギニンまでからなるポリペプチドが分泌シグナル
配列と推定されるという事実を基にして、新規な分泌シ
グナルを発見した。
【０００９】イヌリナーゼ遺伝子によりコードされたタ
ンパク質の１番目から２３番目までのアミノ酸からなる
本発明の新規な分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列は
次のとおりである。 N-Met Lys Z Ala Tyr Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ala
Gly Val Ser Ala Ser Val Ile Asn Tyr Lys Arg-C 上記配列で、ＺはＩＮＵ１Ａの場合にはロイシン（Ｌｅ
ｕ）（配列番号：１）で、ＩＮＵ１の場合にはフェニル
アラニン（Ｐｈｅ）（配列番号：２）である。なお、イ
ヌリナーゼ遺伝子の１番から６９番までのヌクレオチド
からなる本発明の新規な分泌シグナルペプチドをコード
する代表的であるポリヌクレオチド（配列番号：３）は
次のとおりである。 5'-ATG AAG TTM GCA TAC TCC CTC TTG CTT CCA TTG GCA GGA GTC AGT GCT TCA GTK ATC AAT TAC AAG AGA-3' 上記の配列で、Ｍ及びＫはＩＮＵ１Ａの場合にはそれぞ
れＡ及びＴであり、ＩＮＵ１の場合にはそれぞれＣ及び
Ｇである。
【００１０】一方、前記アミノ酸配列において、アミノ
酸の置換、添加又は削除が起こることがあり、遺伝暗号
（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅｓ）の縮退（ｄｅｇｅｎｅ
ｒａｃｙ）及び酵母のコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕ
ｓａｇｅ）により、同一のアミノ酸配列をコードでき得
る多数のヌクレオチド配列の存在が有り得る。こうして
生成されたアミノ酸配列が、目的タンパク質の分泌のた
めの元の配列と機能的に同等である限り、そのような変
化も本発明の範囲に含まれる。前記ポリヌクレオチド
は、イヌリナーゼ遺伝子から分離することによって得る
ことができるばかりでなく、化学的に合成することもで
きる。
【００１１】２．組換え発現分泌ベクター及び形質転換
体 本発明の新規な分泌シグナル配列は、目的タンパク質を
細胞外培地へ効率的に分泌させるためのベクターシステ
ム、例えば、ＹＥｐ３５２（Ｈｉｌｌ ｅｔａｌ．，Ｙ
ｅａｓｔ，２，１６３（１９８６））、ｐＹＥＳ２．０
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）などの酵母ベクター
に幅広く用いることができる。目的タンパク質をコード
するＤＮＡを、前記分泌シグナル配列をコードする構造
遺伝子の下流に連結して開放型読み取り枠（ＯＲＦ）を
形成することによって、組換え発現分泌ベクターを構築
する。このような組換えベクターの例としては、リポコ
ルチン−Ｉ遺伝子と前記分泌シグナル配列とをプラスミ
ド内に連結して構築されたプラスミドｐＹＧＩＬＰ−
１、ｐＹＧＩＬＰ−２、ｐＹＧＩＬＰ−３、及びｐＹＧ
ＩＬＰ−４等が含まれる。もうひとつの組換えベクター
の例として、インターロイキン−２構造遺伝子と前記分
泌シグナル配列とをプラスミド内に連結して構築された
プラスミドｐＹＧＩ−ＩＬ２とｐＹＧＩ−ＩＬ２Ｆも含
まれる。目的とするタンパク質、使用されたプロモータ
ー及びターミネーター等により、多様な組換え発現分泌
ベクターが存在することが有り得る。そのような組換え
発現分泌ベクターも本発明の範囲に含まれる。。
【００１２】組換え発現分泌ベクターを用いて生産でき
る目的タンパク質としては、リポコルチン、インターフ
ェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子（ｃｏｌ
ｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）、
プロウロキナーゼ（ｐｒｏｕｒｏｋｉｎａｓｅ）、ウロ
キナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔｉ
ｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏ
ｒ）、リゾチーム、インスリン、因子（ｆａｃｔｏｒ）
VIII、ヒルジン、スーパーオキシドジスムターゼ、カル
シトニン、インスリン様増殖因子、表皮成長因子、ヒト
成長ホルモン等が含まれる。上記の組換え発現分泌ベク
ターを用いて、通常の方法、例えば、文献（Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎＹｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｅ
ｄ．Ｆ．Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｒ．Ｆｉｎｋ，ａｎｄ
Ｊ．Ｂ．Ｈｉｃｋｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８６）の方法によ
り、酵母細胞を形質転換させることができる。
【００１３】宿主細胞としては、サッカロミセス属（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属
（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイ
ベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセ
ヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒ
ｒｏｗｉａ）、ピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ）に属する多様
な酵母細胞等、好ましくはサッカロミセスセレビジエを
使用することができる。形質転換された酵母細胞を、宿
主細胞及び使用された発現システムによって選択された
培地上で適切な条件下に培養し、培地へ分泌されたタン
パク質を精製することによって、目的タンパク質を得る
ことができる。
【００１４】下記実施例等は、本発明をより詳細に説明
するためのものであり、本発明の範囲を制限せず、実施
例に使用された実験方法等は、別に言及しない限り、下
記に与えられた比較例により行うことができる。また、
固体混合物中固体、液体中液体及び液体中固体に対して
下記に与えられたパーセントは、別に断らない限り、そ
れぞれ重量／重量、容量／容量及び重量／容量による。
【００１５】
【実施例】比較例１ （段階１）ヒトリポコルチン−Ｉ構造遺伝子を増幅及び
制限酵素認識部位を導入するために、下記ヌクレオチド
配列を有するプライマーＩ、IIをＤＮＡ合成器（Ｍｏｄ
ｅｌ ３９１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社、米国）を利用して合成した。 プライマー（Ｉ）（配列番号：４） 5’− CGCCGTCTAG ATAAAAGGAT GGCAATGGTA TCAG −
3’ プライマー（II）（配列番号：５） 5’− TCTTCTGATC ATAGCTGTCG ACCATCAAGG GAATGT −
3’ プライマーＩ及びIIそれぞれ１μｌ（１００ｐｍｏｌｅ
ｓ）、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＬＣ１−Ｓ（ＫＣ
ＴＣ８４１８Ｐ）２ｎｇ、１０倍濃縮ポリメラーゼ緩衝
液（ベーリンガーマンハイム社）１０μｌ、及び１０倍
濃縮ｄＮＴＰ混合液（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及
びｄＣＴＰがそれぞれ２ｍＭ；ベーリンガーマンハイム
社）１０μｌの混合物に、滅菌蒸留水７２μｌを加えて
総容量を１００μｌにし、反応混合物の蒸発を防止する
ためにミネラルオイル（シグマ社）１００μｌを加え
た。反応混合物を９５℃で５分間加熱した後、７２℃ま
で冷却させた。１μｌ（５単位）のＴａｑ ＤＮＡ ポ
リメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社）を混合物に添
加し、ＥＺ循環器（Ｅｒｉｃｏｍｐ Ｉｎｃ．；米国）
を使用して９４℃、１分；５５℃、２分；７２℃、３分
で構成されたポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲ
と称する）サイクルを２５回反復することによってＰＣ
Ｒを行った。
【００１６】このＰＣＲで得た０．１μｇのＤＮＡ断片
（約１、０６０ｂｐ）をＸｂａＩ及びＳａｌＩで切断し
て、生成した断片を、ＸｂａＩ及びＳａｌＩであらかじ
め切断したプラスミドｐブルースクリプトＳＫ（ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米
国）と連結して、プラスミドｐＢＬＰを構築した。プラ
スミドｐＢＬＰをＸｂａＩ及びＳａｌＩで切断して、リ
ポコルチン−Ｉ遺伝子を含む約１，０５０ｂｐの断片を
分離した（断片１）。プラスミドｐＹＥＧα−ＨＩＲ５
（ＫＣＴＣ ８５１８Ｐ）をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで
切断して、ｐｐＬを含む約３００ｂｐのＤＮＡ断片を分
離した（断片２）。プラスミドｐＹＥＳ２．０（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ社；米国）をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで
切断して得た約５，９００ｂｐのＤＮＡ断片を、断片
１、２と連結して、プラスミドｐＹＧＬＰを構築した。
プラスミドｐＹＧＬＰは、ＧＡＬ１プロモーター、ＭＦ
αー１のｐｐＬのペプチド（８５個のアミノ酸）をコー
ドするポリヌクレオチド、ＡＴＧ開始コドンから始まる
リポコルチン−Ｉ構造遺伝子及びＣＹＣ１ターミネータ
ーの順になっている。プラスミドｐＹＧＬＰの構築過程
を図１に示す。
【００１７】（段階２）イトーらの塩化リチウム法（Ｉ
ｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５
３、１６３−１６８（１９８３））によって、段階１で
製作したプラスミドｐＹＧＬＰでサッカロミセスセレビ
ジエＳＥＹ２１０２（ＭＡＴα，ｕｒａ３−５２，ｌｅ
ｕ２−３，−１１２，ｈｉｓ４−５１９，ｓｕｃ２−Δ
９；Ｅｍｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，７０８０−７０８
４（１９８３））を形質転換させた。ＹＰＤ培地（酵母
エキス１％、バクトーペプトン２％、グルコース２％）
１０ｍｌにサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２を
接種し、３０℃で１晩振盪培養した。培養液１００μｌ
を更にＹＰＤ培地１０ｍｌに接種し、６００ｎｍで培養
液の光学的密度が１．０になるまで３０℃で振盪培養し
た。１０ｍｌの培養液を２，０００ｒｐｍで５分間遠心
して培地を除去し、細胞沈殿物を得た後、これをＴＥ緩
衝液（１０ｍＭトリス−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭＥＤ
ＴＡ）５ｍｌで洗浄した。細胞沈殿物に０．５ｍｌのＴ
Ｅ緩衝液と０．５ｍｌの０．２Ｍ塩化リチウム（シグマ
社；米国）を加えよく懸濁し、３０℃で１時間振盪し
た。振盪液１００μｌを別のエッペンドルフチューブに
移し、段階１で用意したプラスミドｐＹＧＬＰ溶液０．
１μｇを振盪液に添加した。
【００１８】この混合物を３０℃で３０分間振盪し、７
０％ＰＥＧ４０００溶液１５０μｌを加え懸濁し、生成
された溶液を３０℃で１時間振盪した後、４８℃で１０
分間ヒートショックをかけた。生成物は１５，０００ｒ
ｐｍで１分間遠心して上澄み液を捨て、２０ｍｇ／ｌの
アンピシリンを含む食塩水で細胞沈殿物を洗浄した後、
前記食塩水２００μｌに懸濁した。懸濁液を最小選択培
地（ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔ
ｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ０．６７％、グルコ
ース２％、ロイシン０．００３％、ヒスチジン０．００
２％、バクトアガ２％）に広げ３０℃で４日間培養した
後、酵母形質転換体、すなわちサッカロミセスセレビジ
エＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＬＰを選別した。
【００１９】（段階３） （ｉ）サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２（宿主
細胞）を１０ｍｌのＹＰＤ培地で３０℃で７２時間振盪
培養した。 （ii）（段階２）で得たサッカロミセスセレビジエＳＥ
Ｙ２１０２／ｐＹＧＬＰを１０ｍｌのＹＰＤ培地で３０
℃で７２時間振盪培養した。 （iii)サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２（宿主
細胞）を１０ｍｌのＹＰＤＧ培地（酵母エキス１％、バ
クトーペプトン２％、グルコ−ス０．４％、ガラクトー
ス２％）で３０℃で７２時間振盪培養した。 （iv）（段階２）で得たサッカロミセスセレビジエＳＥ
Ｙ２１０２／ｐＹＧＬＰを１０ｍｌのＹＰＤＧ培地で３
０℃で７２時間振盪培養した。
【００２０】実施例１ イヌリナ−ゼ（ＩＮＵ１Ａ）分泌シグナルをコードする
ポリヌクレオチドを６つのオリゴヌクレオチド（III
）、（IV）、（Ｖ）、（VI）、（VII ）及び（VIII）
に分けてＤＮＡ合成器で合成した。 オリゴヌクレオチド（III ）（配列番号：６） 5'-GA TCT ATG AAG TTA GCA TAC TCC CTC TTG-3' オリゴヌクレオチド（IV）（配列番号：７） 3'-A TAC TTC AAT CGT ATG AGG GAG AAC GAA GGT-5' オリゴヌクレオチド（Ｖ）（配列番号：８） 5'-CTT CCA TTG GCA GGA GTC AGT GCT TCA GTT-3' オリゴヌクレオチド（VI）（配列番号：９） 3'-AAC CGT CCT CAG TCA CGA AGT CAA TAG TTA-5' オリゴヌクレオチド（VII ）（配列番号：１０） 5'-ATC AAT TAC AAG AGA ATG GCA ATG GTA TCA G-3' オリゴヌクレオチド（VIII）（配列番号：１１） 3'-ATG TTC TCT TAC CGT TAC CAT AGT CTT AA-5' 上記オリゴヌクレオチド（III ）、（IV）、（Ｖ）、
（VI）、（VII ）及び（VIII）それぞれ１μｌ（１００
ｐｍｏｌｅｓ）を混合してポリヌクレオチドキナーゼ
（Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓ
ｅ、ベーリンガーマンハイム社）でリン酸化した後、会
合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）反応で二重鎖を形成させた。
リガーゼ（Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、ベーリンガー
マンハイム社）でそれぞれの二重鎖ポリヌクレオチドを
連結した後、アガロースゲル電気泳動を行ない、ゲルか
ら約１００ｂｐの断片を切出し、ＩＮＵ１Ａの分泌シグ
ナルをコードする断片３を得た。比較例１で構築したプ
ラスミドｐＢＬＰをＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断して
リポコルチン−Ｉ構造遺伝子を含む約ｌ，０３０ｂｐの
断片を得た（断片４）。プラスミドｐＹＥＳ２．０（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；米国）をＢａｍＨＩ及びＸｈｏ
ｌで切断して得た約５，９００ｂｐのＤＮＡ断片５を、
断片３及び断片４と連結し、生成したプラスミドｐＹＧ
ＩＬＰ−１で、比較例１の段階２に記述された方法を使
用してサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２を形質
転換させた。プラスミドｐＹＧＩＬＰ−１で形質転換さ
れたサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２は、韓国
標準菌株収集所（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ；以下、ＫＣＴＣ
と称する）に寄託番号第ＫＣＴＣ００８５ＢＰ号として
１９９３年９月１４日付で寄託された。プラスミドｐＹ
ＧＩＬＰ−１の構築過程を図２に示す。
【００２１】実施例２ オリゴヌクレオチド（IX）及び（Ｘ）をＤＮＡ合成器で
合成した。 オリゴヌクレオチド（IX）（配列番号：１２） 5'-GA TCT ATG AAG TTC GCA TAC TCC CTC TTG-3' オリゴヌクレオチド（Ｘ）（配列番号：１３） 3'-A TAC TTC AAG CGT ATG AGG GAG AAC GAA GGT-5' 上記オリゴヌクレオチド（Ｖ）、（VI）、（VII ）、
（VIII）、（IX）及び（Ｘ）それぞれ１μｌ（１００ｐ
ｍｏｌｅｓ）を混合して、実施例１のようにリン酸化及
びリガーゼ処理し、アガロースゲル電気泳動によりゲル
からＩＮＵ１の分泌シグナルをコードする約１００ｂｐ
の断片６を得た。断片４、５及び６をつないで、ＩＮＵ
１Ａの分泌シグナル配列をコードするポリヌクレオチド
の９番目塩基であるＡがＣになった（分泌シグナルペプ
チドの３番目アミノ酸がフェニルアラニンになった）プ
ラスミドｐＹＧＩＬＰ−２を構築した。比較例１の段階
２に記述した方法を使用して、プラスミドｐＹＧＩＬＰ
−２で形質転換されたサッカロミセスセレビジエＳＥＹ
２１０２を得た。
【００２２】実施例３ オリゴヌクレオチド（XI）及び（XII ）をＤＮＡ合成器
で合成した。 オリゴヌクレオチド（XI）（配列番号：１４） 5'-CTT CCA TTG GCA GGA GTC AGT GCT TCA GTG -3' オリゴヌクレオチド（XII ）（配列番号：１５） 3'-AAC CGT CCT CAG TCA CGA AGT CAC TAG TTA -5' 上記オリゴヌクレオチド（III ）、（IV）、（VII ）、
（VIII）、（XI）及び（XII ）それぞれ１μｌ（１００
ｐｍｏｌｅｓ）を混合して、実施例１のようにリン酸化
及びリガーゼ処理し、アガロースゲル電気泳動してゲル
からＩＮＵ１Ａの分泌シグナルをコードする約１００ｂ
ｐの断片７を得た。断片４、５、及び７をつないで、Ｉ
ＮＵ１Ａの分泌シグナルペプチドをコードするポリヌク
レオチドの５４番目の塩基であるＴがＧに置換されたプ
ラスミドｐＹＧＩＬＰ−３を構築した。比較例１の段階
２のような方法を使用して、プラスミドｐＹＧＩＬＰ−
３で形質転換されたサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２
１０２を得た。
【００２３】実施例４ 上記オリゴヌクレオチド（VII ）、（VIII）、（IX）、
（Ｘ）、（XI）及び（XII ）それぞれ１μｌ（１００ｐ
ｍｏｌｅｓ）を混合して、実施例１のようにリン酸化及
びリガーゼ処理し、アガロースゲル電気泳動してゲルか
ら約１００ｂｐの断片８を得た。断片４、５、及び８を
つないで、ＩＮＵ１Ａの分泌シグナルペプチドをコード
するポリヌクレオチドの９番目塩基であるＡ及び５４番
目塩基であるＴがＣ及びＧでそれぞれ置換されＩＮＵ１
の分泌シグナルと一致するプラスミドｐＹＧＩＬＰ−４
を構築した。比較例１の段階２のような方法を使用し
て、プラスミドｐＹＧＩＬＰ−４で形質転換されたサッ
カロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２を得た。以上のよ
うに構築したプラスミドのイヌリナーゼ分泌シグナルの
塩基配列及びリポコルチン−Ｉ遺伝子の塩基配列は、ジ
デオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５
４６３−５４７６（１９７７））で確認した。
【００２４】実施例５ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりに、
サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬ
Ｐ−１を使用して、比較例１の段階３の（ｉ）の手順を
反復した。
【００２５】実施例６ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりに、
サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬ
Ｐ−１を使用して、比較例１の段階３の（iii）の手順
を反復した。
【００２６】実施例７ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりに、
サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬ
Ｐ−２を使用して、比較例１の段階３の（ｉ）の手順を
反復した。
【００２７】実施例８ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりに、
サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬ
Ｐ−２を使用して、比較例１の段階３の（iii）の手順
を反復した。
【００２８】実施例９ 比較例１の段階３の（ｉ）〜（iv）及び実施例５〜８の
各培養液２ｍｌを遠心（２，０００ｒｐｍ、５分）し
て、培養培地と細胞沈澱物をそれぞれ分離した。デモル
デルーらの方法（Ｄｅｍｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２，１７９−１８９
（１９９４））によって、培養培地に２００μｌの０．
２％（Ｗ／Ｖ）デオキシコール酸ナトリウム（シグマ
社）を加えて、生成された混合物を５分間室温に放置し
た後、２００μｌの１００％（Ｗ／Ｖ）トリクロロ酢酸
を加えた。生成された溶液を０℃で３０分間放置した
後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心してタンパク質
沈澱物を得た。沈澱物を５００μｌのアセトンで洗浄し
て、１０μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐ
Ｈ６．８、１００ｍＭジチオトレイトール、２％ＳＤ
Ｓ、５％２−メルカプトエタノール、０．１％ブロモフ
ェノールブルー、及び１０％グリセリン）に溶かして、
１００℃で５分間加熱した。生成された溶液を培養培地
タンパク質画分と命名した。
【００２９】ホフマンとウィンストンの方法（Ｈｏｆｆ
ｍａｎ ＆ Ｗｉｎｓｔｏｎ，Ｇｅｎｅ，５７，２６７
（１９８７））によって、細胞沈澱物を破砕緩衝液（２
％トリトンＸ−１００，１％ＳＤＳ，１００ｍＭ塩化ナ
トリウム，１０ｍＭトリス−Ｃｌ，ｐＨ８．０，及び１
ｍＭ ＥＤＴＡ）２ｍｌに懸濁して、０．４〜０．５ｍ
ｍのガラスビーズで菌体を破砕した。生成された細胞均
質液（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）に５倍濃縮溶解緩衝液を
０．５ｍｌ加えて、１００℃で５分間加熱した。生成さ
れた溶液を菌体タンパク質画分と命名した。
【００３０】培養培地タンパク質画分及び菌体タンパク
質画分のそれぞれ１０μｌを、５％濃縮ゲル（ｐＨ６．
８、横２０ｃｍ、縦３．０ｃｍ、厚さ１ｍｍ）と１０％
分離ゲル（ｐＨ８．８、横２０ｃｍ、縦１０ｃｍ、厚さ
１ｍｍ）からなるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで１
００〜２００ボルト、３０ｍＡで３時間電気泳動した。
ゲルをクーマシーブルー染色液（１０％イソプロパノー
ル、１０％酢酸、及び０．０５％クーマシーブリリアン
トブルーＲ−２５０）で５時間染色し、脱色液（１０％
イソプロパノール、及び１０％酢酸）で３時間脱色し
た。その結果を図３に示す。
【００３１】図３において、第１列は標準分子量標識
（上からそれぞれ１０６、８０、５０、３３、２７ｋＤ
ａ）を、第２列は比較例１段階３の（ｉ）の菌体タンパ
ク質を、第３列は比較例１段階３の（iii)の菌体タンパ
ク質を、第４列は比較例１段階３の（ii）の菌体タンパ
ク質を、第５列は比較例１段階３の（iv）の菌体タンパ
ク質を、第６列は実施例５の菌体タンパク質を、第７列
は実施例６の菌体タンパク質を、第８列は実施例７の菌
体タンパク質を、第９列は実施例８の菌体タンパク質
を、第１０列は比較例１段階３の（ｉ）の培養培地タン
パク質を、第１１列は比較例１段階３の（iii)の培養培
地タンパク質を、第１２列は比較例１段階３の（ii）の
培養培地タンパク質を、第１３列は比較例１段階３の
（iv）の培養培地タンパク質を、第１４列は実施例５の
培養培地タンパク質を、第１５列は実施例６の培養培地
タンパク質を、第１６列は実施例７の培養培地タンパク
質を、第１７列は実施例８の培養培地タンパク質を、第
１８列は精製リポコルチン−Ｉ０．１μｇを示す。図３
の第１８列の精製リポコルチン−Ｉは、サッカロミセス
セレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＬＰをＹＰＤＧ培地
で４８時間培養した後、上澄み液をＳＰ陽イオン交換ク
ロマトグラフィーで１次精製して、Ｇ−７５ゲル濾過ク
ロマトグラフィーで２次精製したものである。
【００３２】前記結果で、リポコルチン−Ｉ（約３７ｋ
Ｄａ、第１８列）に相当するバンドは、培養培地タンパ
ク質と菌体タンパク質のどちらにも示されなかった。こ
の結果は、リポコルチン−Ｉが全く発現されなかった
か、あるいは、非常に少量しか発現されずにクーマシー
ブルー染色によっては検出できないことを意味するの
で、結果を確認するためにウエスタンブロッティングを
用いる分析を行った。
【００３３】実施例１０ バーネトルの方法（Ｂｕｒｎｅｔｌｅ，Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，１１２，１９５（１９８１））によっ
て、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によっ
て分離されたタンパク質を、クーマシーブルー染色しな
いで、電気泳動転写装置（Ｈｏｅｆｅｒ社、ｔａｎｋ
ｔｒａｎｓｆｅｒ ｕｎｉｔ，ｍｏｄｅｌＴＲ−２２）
を用いて１５０ｍＡ、５０Ｖで１時間、ニトロセルロー
ス膜に転写した。膜に転写されたタンパク質を１／５，
０００に希釈したウサギの抗リポコルチンポリクローナ
ル抗体（Ｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｒ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．，２４，４５３−４６０（１９９１））と３
０分間反応させて、リポコルチン−Ｉのバンドをウエス
タンブロッティングＡＰシステム（ヤギの抗ウサギＩｇ
Ｇ｛Ｈ＋Ｌ又はＦｃ｝−アルカリホスファターゼ結合
体、プロメガ社、米国）で確認した。その結果を図４に
示す。
【００３４】図４において、第１列は標準分子量標識
（上からそれぞれ１０６、８０、５０、３３、２７ｋＤ
ａ）を、第２列は比較例１段階３の（ｉ）の菌体タンパ
ク質を、第３列は比較例１段階３の（iii)の菌体タンパ
ク質を、第４列は比較例１段階３の（ii）の菌体タンパ
ク質を、第５列は比較例１段階３の（iv）の菌体タンパ
ク質を、第６列は実施例５の菌体タンパク質を、第７列
は実施例６の菌体タンパク質を、第８列は実施例７の菌
体タンパク質を、第９列は実施例８の菌体タンパク質
を、第１０列は比較例１段階３の（ｉ）の培養培地タン
パク質を、第１１列は比較例１段階３の（iii)の培養培
地タンパク質を、第１２列は比較例１段階３の（ii）の
培養培地タンパク質を、第１３列は比較例１段階３の
（iv）の培養培地タンパク質を、第１４列は実施例５の
培養培地タンパク質を、第１５列は実施例６の培養培地
タンパク質を、第１６列は実施例７の培養培地タンパク
質を、第１７列は実施例８の培養培地タンパク質を、第
１８列は精製リポコルチン−Ｉ０．１μｇを示す。
【００３５】精製されたリポコルチン−Ｉは、実施例９
に示した方法により得た。前記結果で、リポコルチン−
Ｉ（約３７ｋＤａ、第１８列）に相当するバンドは、比
較例１段階３の（ｉ）及び（iii)の宿主細胞の菌体タン
パク質又は培養培地タンパク質のいずれにも見られなか
った（第２、３、１０及び１１列）。ＹＰＤ培地で培養
された比較例１段階３の（ii）のＳＥＹ２１０２／ｐＹ
ＧＬＰの菌体タンパク質又は培養培地タンパク質のいず
れにも、リポコルチン−Ｉバンドが見えないが（第４列
及び第１２列）、ＹＰＤＧ培地で培養された比較例１段
階３の（iv）のＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＬＰの菌体タン
パク質及び培養培地タンパク質においては、全てリポコ
ルチン−Ｉバンドが検出された（第５列及び第１３
列）。この結果は、細胞内で発現されたリポコルチン−
Ｉが、培地中に完全には分泌されてはいないことを意味
する。ＹＰＤＧ培地で培養されたＳＥＹ２１０２／ｐＹ
ＧＬＰの場合、培養培地タンパク質内のリポコルチンの
量は約０．０５μｇであり、菌体タンパク質内のリポコ
ルチンの量は約０．７μｇであるので、分泌率はわずか
約７％であった。
【００３６】ＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬＰ−１の場合
には、ＹＰＤ培地で培養したときは、培養培地タンパク
質又は菌体タンパク質のいずれにもリポコルチン−Ｉバ
ンドが見えなかった（実施例５、第６列及び第１４
列）。しかし、リポコルチン−Ｉの発現がガラクトース
によって誘導されると、すなわち、細胞をＹＰＤＧ培地
で培養すると、菌体タンパク質ではリポコルチン−Ｉバ
ンドが見えず、培養培地タンパク質ではリポコルチン−
Ｉバンドが観察された（実施例６、第７列及び第１５
列）。
【００３７】また、ＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬＰ−２
の場合、これをＹＰＤ培地で培養したときは、培養培地
タンパク質又は菌体タンパク質のいずれにもリポコルチ
ン−Ｉバンドが見えない（実施例７、第８列及び第１６
列）。しかし、リポコルチン−Ｉの発現がガラクトース
によって誘導されると、菌体タンパク質ではリポコルチ
ン−Ｉバンドが見えず、培養培地タンパク質ではリポコ
ルチン−Ｉバンドが観察された（実施例８、第９列及び
第１７列）。この結果は、細胞内で発現されたリポコル
チン−Ｉがイヌリナーゼ分泌シグナルによって菌体外に
ほぼ完全に分泌されたことを意味し、分離されたリポコ
ルチン−Ｉの量もｐｐＬシグナルペプチドを使用した場
合よりずっと多い（第１３列、第１５列及び第１７列参
照）。
【００３８】実施例１１及び１２ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりに、
サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬ
Ｐ−３及びサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／
ｐＹＧＩＬＰ−４をそれぞれ使用して、比較例１段階３
の（iii)、実施例９、１０の手順を反復した。その結果
は、それぞれ図４の第７列及び第１５列並びに第９列及
び第１７列と一致した。
【００３９】比較例２ （段階１）分泌シグナルとしてｐｐＬを利用した酵母用
のインターロイキン−２発現分泌ベクターの構築 ＤＮＡ合成器でプライマー（XIII）及び（XIV ）を合成
した。 プライマ−（XIII）（配列番号：１６） 5'-CGC CGT CTA GAT AAA AGA ATG GCG CCT ACT TCA AGT
TCT ACA-3' プライマ−（XIV ）（配列番号：１７） 5'-TGT CGA CCA TCA AGG GAA TGT TTA AGT TAG TGT TGA
GAT-3' プライマ−（XIII）及び（XIV ）それぞれ１μｌ（１０
０ｐｍｏｌｅｓ）並びに鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐ
ＮＫＭ２１（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．，５，１６３−１６８（１９９１））２ｎｇ
を使用して、比較例１の段階１に記述したＰＣＲの方法
で約４００ｂｐの断片を得た。この断片をＸｂａＩ（部
分切断）及びＳａｌＩで切断し、アガロースゲル電気泳
動してゲルからインターロイキン−２構造遺伝子を含む
約４００ｂｐの断片９を得た。ＹＥＧα−ＨＩＲ５２５
（ＫＣＴＣ８５１９Ｐ）をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで切
断して、ＧＡＬ１０プロモ−タ−及びｐｐＬ配列を含む
約７００ｂｐの断片１０を得た。一方、プラスミドＹＥ
Ｇα−ＨＩＲ５２５をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断し
て約５，８００ｂｐの断片１１を得た。断片９、１０及
び１１をつないでプラスミドｐＩＬ−２を作製した。プ
ラスミドｐＩＬ−２は、ＧＡＬ１０プロモーター＋ＭＦ
α−ＩのｐｐＬペプチド（８５アミノ酸）をコードする
ポリヌクレオチド＋ＧＣＧコドン（アラニン）から始ま
るインターロイキン−２構造遺伝子＋ＧＡＬ７ターミネ
ーターのように構成されている。プラスミドｐＩＬ−２
の構築過程を図５に示す。
【００４０】（段階２）プラスミドｐＹＧＬＰの代わり
にｐＩＬ−２を使用して、前記比較例１の段階２と同じ
方法で形質転換菌株サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２
１０２／ｐＩＬ−２を得た。
【００４１】（段階３） （ｉ）サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わ
りにサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＩＬ
−２を使用して、前記比較例１の段階３の（ｉ）と同じ
方法を行った。 （ii）サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わ
りにサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＩＬ
−２を使用して、前記比較例１の段階３の（iii ）と同
じ方法を行った。
【００４２】実施例１３：ＩＮＵ１Ａ分泌シグナルを利
用した酵母用のインターロイキン−２発現分泌ベクター
の構築 ＤＮＡ合成器でオリゴヌクレオチド（XV）、（XVI ）、
（XVII）及び（XVIII）を合成した。 オリゴヌクレオチド（XV）（配列番号：１８） 5'- AA TTC ATG AAG TTA GCA TAC TCC CTC TTG -3' オリゴヌクレオチド（XVI ）（配列番号：１９） 3'- G TAC TTC AAT CGT ATG AGG GAG AAC GAA GGT -5' オリゴヌクレオチド（XVII）（配列番号：２０） 5'- ATC AAT TAC AAG AGG G -3' オリゴヌクレオチド（XVIII ）（配列番号：２１） 3'- ATG TTC TCC CGC -5' 前記オリゴヌクレオチド（XV）、（XVI ）、（XVII）及
び（XVIII ）並びに実施例１のオリゴヌクレオチド
（Ｖ）及び（VI）を用いて、実施例１のようにリン酸化
及びリガーゼ処理した後、アガロースゲル電気泳動を行
なった。アガロースゲルからＩＮＵ１Ａの分泌シグナル
をコードする約８０ｂｐの断片１２を得た。比較例２の
断片９をＮａｒＩ及びＳａｌＩで切断してインターロイ
キン−２構造遺伝子を含む約４００ｂｐの断片１３を得
た。ＹＥＧα−ＨＩＲ５２５をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ
で切断してＧＡＬ１０プロモ−タ−を含む約６，３００
ｂｐの断片１４を得た。断片１２、１３及び１４をつな
いでプラスミドｐＹＧＩ−ＩＬ２を作製した。プラスミ
ドｐＹＧＩ−ＩＬ２は、ＧＡＬ１０プロモーター＋ＩＮ
Ｕ１Ａの分泌シグナル配列＋ＧＣＧコドンから始まるイ
ンターロイキン−２構造遺伝子＋ＧＡＬ７ターミネータ
ーのように構成されている。プラスミドｐＹＧＩ−ＩＬ
２の構築過程を図６に示す。
【００４３】実施例１４：ＩＮＵ１分泌シグナルを利用
した酵母用のインターロイキン−２発現分泌ベクターの
構築 プラスミドｐＹＧＩ−ＩＬ２Ｆの構築過程は、ＩＮＵ１
分泌シグナルの合成用のオリゴヌクレオチドが違うだけ
で、他の過程は図６と同じである。ＤＮＡ合成機でオリ
ゴヌクレオチド（XIX ）及び（XX）を合成した。 オリゴヌクレオチド（XIX ）（配列番号：２２） 5'-AA TTC ATG AAG TTC GCA TAC TCC CTC TTG -3' オリゴヌクレオチド（XX）（配列番号：２３） 3'-G TAC TTC AAG CGT ATG AGG GAG AAC GAA GGT -5' 前記オリゴヌクレオチド（XIX ）と（XX）、実施例１３
のオリゴヌクレオチド（XVII）と（XVIII ）、及び実施
例１のオリゴヌクレオチド（Ｖ）と（VI）を利用して、
実施例１のようにリン酸化及びリガーゼ処理し、アガロ
ースゲル電気泳動してゲルからＩＮＵ１分泌シグナルを
コードする約８０ｂｐの断片１５を得た。実施例１３の
断片１３及び断片１４を断片１５につないでプラスミド
ｐＹＧＩ−ＩＬ２Ｆを構築した。プラスミドｐＹＧＩ−
ＩＬ２Ｆは、ＧＡＬ１０プロモーター＋ＩＮＵ１の分泌
シグナル配列＋ＧＣＧコドン（アラニン）から始まるイ
ンターロイキン−２構造遺伝子＋ＧＡＬ７ターミネータ
ーのように構成されている。以上のプラスミドのイヌリ
ナーゼ分泌シグナル及びインターロイキン−２構造遺伝
子の塩基配列は、実施例４に示したサンガー（Ｓａｎｇ
ｅｒ）のジデオキシ法で確認した。
【００４４】実施例１５ プラスミドｐＹＧＬＰの代わりにｐＹＧＩ−ＩＬ２とｐ
ＹＧＩ−ＩＬ２Ｆをそれぞれ使用して、前記比較例１の
段階２と同じ方法で、２種類の形質転換菌株サッカロミ
セスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−ＩＬ２及び
ＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−ＩＬ２Ｆを得た。サッカロ
ミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−ＩＬ２
は、１９９４年９月２７日付でＫＣＴＣへ寄託番号ＫＣ
ＴＣ０１２０ＢＰ号として寄託された。
【００４５】実施例１６ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりにサ
ッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−Ｉ
Ｌ２を使用して、前記比較例１の段階３の（ｉ）と同じ
方法を行った。
【００４６】実施例１７ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりにサ
ッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−Ｉ
Ｌ２を使用して、前記比較例１の段階３の（iii ）と同
じ方法を行った。
【００４７】実施例１８ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりにサ
ッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−Ｉ
Ｌ２Ｆを使用して、前記比較例１の段階３の（ｉ）と同
じ方法を行った。
【００４８】実施例１９ サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２の代わりにサ
ッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−Ｉ
Ｌ２Ｆを使用して、前記比較例１の段階３の（iii ）と
同じ方法を行った。
【００４９】実施例２０ 比較例２の段階３の（ｉ）及び（ii）並びに実施例１６
及び１７の培養液各々１ｍｌを遠心（２，０００ｒｐ
ｍ、５分）して培養培地と細胞沈澱物とに分離し、実施
例９の方法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行なった後、実施例１０の方法で抗インターロイキン
−２抗体（ベーリンガーマンハイム社）を使ってウェス
タンブロッティングを行った。結果を図７に示す。図７
において、第１列は標準分子量標識（上から３３、２
７、１８ｋＤａ）を、第２列は比較例１の段階３の
（ｉ）の菌体タンパク質を、第３列は比較例１の段階３
の（iii ）の菌体タンパク質を、第４列は比較例２の段
階３の（ｉ）の菌体タンパク質を、第５列は比較例２の
段階３の（ii）の菌体タンパク質を、第６列は実施例１
６の菌体タンパク質を、第７列は実施例１７の菌体タン
パク質を、第８列は比較例１の段階３の（ｉ）の培養培
地タンパク質を、第９列は比較例１の段階３の（iii ）
の培養培地タンパク質を、第１０列は比較例２の段階３
の（ｉ）の培養培地タンパク質を、第１１列は比較例２
の段階３の（ii）の培養培地タンパク質を、第１２列は
実施例１６の培養培地タンパク質を、第１３列は実施例
１７の培養培地タンパク質を示す。
【００５０】比較例１の宿主細胞の菌体タンパク質と培
養培地タンパク質のいずれにもインターロイキン−２バ
ンドが示されなかった（第２、３、８及び９列）。サッ
カロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＩＬ−２をＹ
ＰＤ培地で培養すると（比較例２の段階３の（ｉ））、
菌体タンパク質と培養培地タンパク質のいずれにもイン
ターロイキン−２バンドが見えないが（第４及び１０
列）、ＹＰＤＧ培地で培養すると（比較例２の段階３の
（ii））、菌体タンパク質と培養培地タンパク質にイン
ターロイキン−２バンド（約１５ｋＤａ）が検出された
（第５及び１１列）。この結果は、ｐｐＬが細胞内で発
現されたインターロイキン−２を効果的に分泌させない
ことを意味する。菌体内のインターロイキン−２（第５
列）の量と培養培地中のインターロイキン−２（第１１
列）の量を比較すると、分泌率はわずか１０％に過ぎな
い。サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧ
Ｉ−ＩＬ２の場合、ＹＰＤ培地（実施例１６）では、菌
体タンパク質と培養培地タンパク質いずれにもインター
ロイキン−２バンドが見られなかった（第６列及び第１
２列）。しかし、ＹＰＤＧ培地（実施例１７）におい
て、菌体タンパク質にはインターロイキン−２バンドが
見えないが（第７列）、培養培地タンパク質にはインタ
ーロイキン−２バンドが観察された（第１３列）。これ
は、細胞内に発現されたインターロイキン−２が大部分
効率的に分泌されたことを意味する。実施例１８、１９
のサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ
−ＩＬ２Ｆも、サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０
２／ｐＹＧＩ−ＩＬ２と同じ結果を示した。したがっ
て、既存の分泌シグナルとしてもっとも普遍的に使用さ
れるＭＦα−１のｐｐＬよりも、本発明で開発したイヌ
リナーゼ（ＩＮＵ１ＡとＩＮＵ１遺伝子の産物）分泌シ
グナルの方が、ヒトリポコルチン−Ｉだけでなくヒトイ
ンターロイキン−２等の異種タンパク質の発現分泌にお
いて、ずっと優れていることがわかる。本発明を特定の
実施態様について記述したが、本発明が属する技術分野
で熟練した者であれば、特許請求の範囲に記載された本
発明の範囲内で変更又は修正できることが認識されるべ
きである。
【００５１】
【発明の効果】本発明の分泌シグナル配列によれば、組
換え酵母で発現された目的タンパク質を菌体外にほぼ完
全に分泌させることができる。
【００５２】
【配列表】
【００５３】配列番号：１ 配列の長さ：２３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質
【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：２３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質
【００５５】配列番号：３ 配列の長さ：６９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 ATG AAG TTM GCA TAC TCC CTC TTG CTT CCA 30 TTG GCA GGA GTC AGT GCT TCA GTK ATC AAT 60 TAC AAG AGA 69
【００５６】配列番号：４ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマーＤＮＡ 配列 CGCCGTCTAG ATAAAAGGAT GGCAATGGTA TCAG 34
【００５７】配列番号：５ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマーＤＮＡ 配列 TCTTCTGATC ATAGCTGTCG ACCATCAAGG GAATGT 36
【００５８】配列番号：６ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCTATGAA GTTAGCATAC TCCCTCTTG 29
【００５９】配列番号：７ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGGAAGCAAG AGGGAGTATG CTAACTTCAT A 31
【００６０】配列番号：８ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTCCATTGG CAGGAGTCAG TGCTTCAGTT 30
【００６１】配列番号：９ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATTGATAACT GAAGCACTGA CTCCTGCCAA 30
【００６２】配列番号：１０ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATCAATTACA AGAGAATGGC AATGGTATCA G 31
【００６３】配列番号：１１ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTCTGATA CCATTGCCAT TCTCTTGTA 29
【００６４】配列番号：１２ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCTATGAA GTTCGCATAC TCCCTCTTG 29
【００６５】配列番号：１３ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGGAAGCAAG AGGGAGTATG CGAACTTCAT A 31
【００６６】配列番号：１４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTCCATTGG CAGGAGTCAG TGCTTCAGTG 30
【００６７】配列番号：１５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATTGATCACT GAAGCACTGA CTCCTGCCAA 30
【００６８】配列番号：１６ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマーＤＮＡ 配列 CGCCGTCTAG ATAAAAGAAT GGCGCCTACT TCAAGTTCTA CA 42
【００６９】配列番号：１７ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマーＤＮＡ 配列 TGTCGACCAT CAAGGGAATG TTTAAGTTAG TGTTGAGAT 39
【００７０】配列番号：１８ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTCATGAA GTTAGCATAC TCCCTCTTG 29
【００７１】配列番号：１９ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGGAAGCAAG AGGGAGTATG CTAACTTCAT G 31
【００７２】配列番号：２０ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATCAATTACA AGAGGG 16
【００７３】配列番号：２１ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGCCCTCTTG TA 12
【００７４】配列番号：２２ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTCATGAA GTTCGCATAC TCCCTCTTG 29
【００７５】配列番号：２３ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGGAAGCAAG AGGGAGTATG CGAACTTCAT G 31
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＹＧＬＰの構築過程を模式的に示
す説明図である。
【図２】プラスミドｐＹＧＩＬＰ−１の構築過程を模式
的に示す説明図である。
【図３】宿主細胞及びリポコルチン−Ｉを生産する組換
え酵母の菌体タンパク質及び培養培地タンパク質を用い
たＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）分析の結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】宿主細胞及びリポコルチン−Ｉを生産する組換
え酵母の菌体タンパク質及び培養培地タンパク質を用い
たウェスタンブロッティング分析の結果を示す図面に代
わる写真である。
【図５】プラスミドｐＩＬ−２の構築過程を模式的に示
す説明図である。
【図６】プラスミドｐＹＧＩ−ＩＬ２の構築過程を模式
的に示す説明図である。
【図７】宿主細胞及びインターロイキン−２を生産する
組換え酵母の菌体タンパク質及び培養培地タンパク質を
用いたウェスタンブロッティング分析の結果を示す図面
に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 南 寿完 大韓民国大田直轄市儒城区魚殷洞99番地 ハンビットＡＰＴ．115棟1305号 (72)発明者 金 炳文 大韓民国忠清北道清州市福台洞53−２番 地 (72)発明者 ヤン スン−アー 大韓民国大邱直轄市東区新川１洞626− 10番地 (72)発明者 朴 英薫 大韓民国大田直轄市儒城区道龍洞391番 地タウンハウス５棟101号 (56)参考文献 国際公開91／5051（ＷＯ，Ａ) ＡＰＰＬＩＥＤ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ ＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ ＯＧＹ，ＶＯＬ．40，ＮＯ．２−３, （1993），Ｐ．309−317 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/19 C12P 21/00 - 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列表の配列番号１又は配列番号２で表
    されるアミノ酸配列を含む分泌シグナルペプチドをコー
    ドするポリヌクレオチドと、 分泌シグナルペプチドをコードする前記ポリヌクレオチ
    ドの上流に位置し、サッカロミセス属に属する酵母の細
    胞で転写を促進でき得るＤＮＡ配列と、 前記ポリヌクレオチドの下流に位置し、目的タンパク質
    をコードするＤＮＡ配列を、分泌シグナルペプチドをコ
    ードする前記ポリヌクレオチドと共に開放型読み取り枠
    になるようにベクター内へ挿入するための部位と、 目的ＤＮＡ配列の挿入のための部位の下流にある転写タ
    ーミネーターとを含む、サッカロミセス属に属する酵母
    用の発現分泌ベクター。
  2. 【請求項２】 分泌シグナルペプチドをコードする前記
    ポリヌクレオチドが配列表の配列番号３で表される塩基
    配列を含む、請求項１に記載の発現分泌ベクター。
  3. 【請求項３】 目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列
    の挿入のための部位に、目的タンパク質をコードする目
    的ＤＮＡ配列を、分泌シグナルペプチドをコードする前
    記ポリヌクレオチドと共に開放型読み取り枠になるよう
    に挿入させた請求項１又は２に記載の発現分泌ベクタ
    ー。
  4. 【請求項４】 プラスミドｐＹＧＩＬＰ−１（ＫＣＴＣ
    ００８５ＢＰ）、ｐＹＧＩＬＰ−２、ｐＹＧＩＬＰ−３
    又はｐＹＧＩＬＰ−４である請求項３に記載の発現分泌
    ベクター。
  5. 【請求項５】 プラスミドｐＹＧＩ−ＩＬ２（ＫＣＴＣ
    ０１２０ＢＰ）又はｐＹＧＩ−ＩＬ２Ｆである請求項３
    に記載の発現分泌ベクター。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の発
    現分泌ベクターにより形質転換されたサッカロミセス属
    に属する酵母の組換え細胞。
  7. 【請求項７】 サッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０
    ２／ｐＹＧＩＬＰ−１（ＫＣＴＣ００８５ＢＰ）又はサ
    ッカロミセスセレビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩ−Ｉ
    Ｌ２（ＫＣＴＣ０１２０ＢＰ）である請求項６に記載の
    組換え細胞。
  8. 【請求項８】 請求項６に記載の組換え細胞を培養し、
    培地から目的タンパク質を回収することを含む、サッカ
    ロミセス属に属する酵母の組換え細胞により目的タンパ
    ク質を生産する方法。
  9. 【請求項９】 目的タンパク質がヒトリポコルチン−Ｉ
    又はヒトインターロイキン−２であり、そしてサッカロ
    ミセス属に属する酵母の組換え細胞がサッカロミセスセ
    レビジエＳＥＹ２１０２／ｐＹＧＩＬＰ−１（ＫＣＴＣ
    ００８５ＢＰ）又はサッカロミセスセレビジエＳＥＹ２
    １０２／ｐＹＧＩ−ＩＬ２（ＫＣＴＣ０１２０ＢＰ）で
    ある、請求項８に記載の方法。
JP6331663A 1993-12-10 1994-12-09 発現分泌ベクター Expired - Fee Related JP2799348B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR930027269 1993-12-10
KR1993/27269 1993-12-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0847393A JPH0847393A (ja) 1996-02-20
JP2799348B2 true JP2799348B2 (ja) 1998-09-17

Family

ID=19370595

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP6331663A Expired - Fee Related JP2799348B2 (ja) 1993-12-10 1994-12-09 発現分泌ベクター

Country Status (5)

Country Link
US (1) US5712113A (ja)
EP (1) EP0662515B1 (ja)
JP (1) JP2799348B2 (ja)
AT (1) ATE197608T1 (ja)
DE (1) DE69426289T2 (ja)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69636536T2 (de) * 1995-02-03 2007-10-25 Asahi Glass Co., Ltd. Sekretionssignal-Gen und dieses enthaltender Expressionsvektor
WO2003088932A2 (en) * 2002-04-22 2003-10-30 The Procter & Gamble Company Shampoo containing a cationic guar derivative
US20070172446A1 (en) 2003-05-16 2007-07-26 Intermune, Inc. Synthetic chemokine receptor ligands and methods of use thereof
DE10342794A1 (de) * 2003-09-16 2005-04-21 Basf Ag Sekretion von Proteinen aus Hefen
EP1713930B1 (en) 2004-01-17 2010-11-03 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Rapid screening method of translational fusion partners for producing recombinant proteins and translational fusion partners screened therefrom
US7597884B2 (en) 2004-08-09 2009-10-06 Alios Biopharma, Inc. Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use
CA2576030A1 (en) * 2004-08-09 2006-02-23 Alios Biopharma Inc. Synthetic hyperglycosylated, protease-resistant polypeptide variants, oral formulations and methods of using the same
US7892788B2 (en) 2005-02-07 2011-02-22 Basf Se Hydrophobin fusion products, production and use thereof
KR20080004555A (ko) 2005-03-31 2008-01-09 바스프 악티엔게젤샤프트 접착 촉진제로서의 폴리펩티드의 용도
CA2603374C (en) 2005-04-01 2013-05-28 Basf Aktiengesellschaft Use of hydrophobin as a phase stabiliser
CN101228249B (zh) 2005-04-01 2011-11-30 巴斯福股份公司 含疏水蛋白的钻井液
DE102005027139A1 (de) 2005-06-10 2006-12-28 Basf Ag Neue Cystein-verarmte Hydrophobinfusionsproteine, deren Herstellung und Verwendung
DE102005048720A1 (de) 2005-10-12 2007-04-19 Basf Ag Verwendung von Proteinen als Antischaum-Komponente in Kraftstoffen
JP5354559B2 (ja) * 2005-11-24 2013-11-27 独立行政法人産業技術総合研究所 高効率分泌シグナルペプチド及びそれらを利用したタンパク質発現系
ES2374320T3 (es) 2006-08-15 2012-02-15 Basf Se Procedimiento para la producción de preparaciones de hidrofobina secas de flujo libre.
JP5769142B2 (ja) * 2007-09-04 2015-08-26 独立行政法人酒類総合研究所 ピヒア属酵母において異種タンパク質を高分泌させる方法
CN102239183B (zh) * 2008-12-04 2017-06-30 韩国生命工学研究院 大量分泌的蛋白的筛选和它们作为融合配偶体在重组蛋白制备中应用
WO2012060666A2 (ko) 2010-11-04 2012-05-10 한국생명공학연구원 효모에서 인체 상피세포 성장인자를 대량 생산하는 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4588684A (en) * 1983-04-26 1986-05-13 Chiron Corporation a-Factor and its processing signals
US5081019A (en) * 1985-01-10 1992-01-14 Biogen, Inc. DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing lipocortin-like polypeptides
IT1196484B (it) * 1986-07-11 1988-11-16 Sclavo Spa Vettore ad espressione e secrezione in lieviti,utile per la preparazione di proteine eterologhe
WO1991005051A1 (en) * 1989-09-28 1991-04-18 Leningradsky Gosudarstvenny Universitet Method of obtaining human-interleukin-2 polypeptide in yeast cells
WO1994013821A1 (en) * 1992-12-11 1994-06-23 Quest International B.V. The use of the kluyveromyces marxianus inulinase gene promoter for protein production

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＡＰＰＬＩＥＤ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．４０，ＮＯ．２−３，（１９９３），Ｐ．３０９−３１７

Also Published As

Publication number Publication date
DE69426289D1 (de) 2000-12-21
JPH0847393A (ja) 1996-02-20
ATE197608T1 (de) 2000-12-15
US5712113A (en) 1998-01-27
EP0662515B1 (en) 2000-11-15
DE69426289T2 (de) 2001-04-12
EP0662515A1 (en) 1995-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2799348B2 (ja) 発現分泌ベクター
JP2791418B2 (ja) 異種蛋白質の製造方法、組換えｄｎａ、形質転換体
EP2106447B1 (en) Method for methanol independent induction from methanol inducible promoters in pichia
RU2143495C1 (ru) Способ получения гетерологичного белка
JP3667339B2 (ja) 酵母菌株
JPH03500370A (ja) ペプチドおよびｄｎａ配列
EP0749478A1 (en) Yeast strains and modified albumins
JPH03143385A (ja) 酵母細胞
KR102495283B1 (ko) 재조합 숙주 세포에서 탄소 공급원 조절된 단백질 생산
JPS6387983A (ja) 酵母の発現及び分泌クロ−ニングベクタ−
JP2001512684A (ja) 新規のｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子配列およびそれらの使用方法
JP3366339B2 (ja) 高効率発現ベクターを用いてサッカロミセスセレビジエから再組合蛋白質を製造する方法
EP1364030B1 (en) Supersecretable peptides, processes for their production, and parallel improvement of the secreted form of one or more other polypeptides
Chung et al. Highly efficient secretion of heterologous proteins from Saccharomyces cerevisiae using inulinase signal peptides
US4940661A (en) Metallothionein transcription control sequences and use thereof
US7070989B2 (en) Escherichia coli strain secreting human granulocyte colony stimulating factor (G-CSF)
AU2019218315A1 (en) Codon optimized precursor gene and signal peptide gene of human insulin analogue
JPH07508166A (ja) 改変クルイベロミセス（Ｋ１ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）酵母，それらの作製および使用
JP2715000B2 (ja) 蛋白質甘味料の酵母中における発現
EP0801682B1 (en) Process for the production of proteins
JPH11503318A (ja) 酵母中で興味あるタンパク質を発現するための新規なプロモーター
KR0145948B1 (ko) 효모로부터 재조합 인간 안티트립신-α-1 단백질을 발현 분비시키기 위한 벡터
KR0145452B1 (ko) 사카로마이세스속 효모로부터 이종 단백질을 분비시키기 위한 발현벡터
PT716705E (pt) Processo para a preparacao por recombinacao de proteinas na levedura hansenula
EP0313584A1 (en) Stabilised polypeptides and their expression and use in fermentation

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees