JPS6387983A - 酵母の発現及び分泌クロ−ニングベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 母の発現及び分泌クローニングベクターに係る。

本発明は、さらに、このクローニングベクターと異種タ
ンパク質を暗号化するＤＮＡ配列との結合によって得ら
れたハイブリッドプラスミド、及びかかるハイブリッド
プラスミドにより形質転換せしめた酵母を適当な培養基
内で培養することを包含する異種タンパク質の製法に係
る。

遺伝子工学の分野における最近の発達によって異種タン
パク質を製造することが可能になってきた。この方法は
、組換ＤＮＡ技術に従って異種タンパク質を暗号化する
遺伝子を含有するハイブリッドプラスミドを作製し、こ
のハイブリッドプラスミドを宿主微生物に導入し、この
ようにして形質転換せしめた微生物を適当な培養基中で
培養して、異種遺伝子によって暗号化されたタンパク質
を生成するものである。

一般に、異種タンパク質は、これまで宿主微生物として
細菌（これらの制御システムは公知である）を使用する
ことによって製造されていた。

しかしながら、このような方法において細菌を使用する
ことは各種の問題（たとえばエンテロトキシンの産生、
工業的製法の場合における使用できる菌株の制限等）を
生じていた。

このため、従来法の問題点を生じない宿主微生物、たと
えば酵母の利用が求められていた。酵母の場合には、真
核微生物であるため哺乳動物に対する親和性が強く、細
菌と異なりエンテロトキシンを産生せず、工業的発酵法
において長期間使用されてきた。

しかし、酵母が宿主細胞として使用されるためには、細
胞内に安定して保持され、かつクローン化された異種遺
伝子が充分に発現して培養基内に遺伝生成物を分泌出来
るようにするための調節シグナルを含有するクローニン
グベクターを有することが必要である。

技術文献及び特許文献によれば、酵母の発現及び分泌ベ
クターの作製法（酵母から単離される遺伝子から得られ
る調整遺伝子を使用する）が知られている。特に、同種
及び異種タンパク質の分泌ベクターは、サツカロミセス
・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ　Ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）のα因子及びキラートキシンの分泌に関
与するリーダーペプチドを使用することによって生成さ
れる。しかし、ががるベクターは、ヒトインターフェロ
ンの生成（Ｓｉｎｇｈら［ヌクレイヅク・アシッズ・リ
サーチ（Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）Ｊ　１２　、８９２７−８９３
８．１９８４）及びマウスインターロイキン　ＩＬ−２
の生成（Ｍｉｙａｊｉｍａら［ジーン（Ｇｅｎｅ）Ｊ　
３７．１５５−１’６１．１９８５）に使用される際、
合成タンパク質の特殊な分泌を生ずる。

実際、Ｓ、セレビシェのα因子及びキラートキシンは、
いずれも、多細胞微生物を代表するものとは全く異なる
リーダーペプチドを有する。

クリベロマイセス・ラクティス（Ｋ　Ｉｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓｌ　ａｃｔ　ｉｓ）属の酵母について行なわれ
た最近の検討によれば、この種に属するキラー菌株が、
Ｓ、セレビシェのキラートキシンとは構造的にかつ機能
的に異なる毒素を分泌することが示されている（Ｓｕｇ
ｉｓａｋｉら　「ネーチ’ｒ−（Ｎａｔｕｒｅ）Ｊ　３
０４．４６４−４６６、１９８３）。

この毒素は、実際には、２つのサブユニットで構成され
ており、培養基内に糖タンパク質とじて分泌される。そ
の後、５ｔａｒｋらは、Ｋ、ラクティスの毒素を暗号化
する遺伝子のヌクレオチド配列に関して行った研究に基
き、その分泌はアミノ酸１６個の長さのリーダーペプチ
ド（その構造は原核生物及び真核生物のリーダーペプチ
ドのものと類似している）によって命令されるとの仮説
を述べている　（ｒＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
Ｊ　　１２．６０１１−６０３０゜１９８４）。

たとえ制御システムの存在が考えられたとしても、かか
るシステムがクローニングベクターの作製に使用される
際、その機能を発揮しうるか否かは予想され得ない。

発明者らは、酵母において異種タンパク質を有効に発現
及び分泌しうるクローニングベクターを新たに見出し、
本発明に至った。

従って、本発明の目的は、異種タンパク質の製造に使用
される酵母の発現及び分泌クローニングベクターにある
。この場合、合成された異種タンパク質の分泌は、誘導
性ハイブリッドプロモーターと酵母のＲＮＡ−ポリメラ
ーゼによって認識される転写終結シグナルが結合した多
重部位ポリインカー（ｐｏｌｙｉｎｋｅｒ）との間に位
置する合成オリゴヌクレオチドによって命令される。

本発明の他の目的は、上記クローニングベクターと異種
タンパク質を暗号化するＤＮＡ配列との結合によって得
られたハイブリッドプラスミド（この配列は合成オリゴ
ヌクレオチドの後に位置するポリインカーの制限部位の
１つに挿入される）にある。

本発明の目的は、さらに、上記ノ１イブリッドプラスミ
ドを用いて形質転換せしめた酵母を適当な培養基におい
て培養することからなる異種タンパク質の製法にある。

本発明のさらに他の目的は、このようにして得られた異
種タンパク質を診断及び治療の分野で使用することにあ
る。

さらに本発明の他の目的は、以下の記載により、明白に
なるであろう。

上述の如く、本発明によれば、分泌ベクターは、誘導性
ハイブリッドプロモーターの後方に位置する発現ベクタ
ーｐＥＭＢＬｙｅｘ　２の制限部位５ｓｔＩ及びＫｐｎ
　Ｉの間に、Ｋ、ラクティスのキラートキシンの仮説（
ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）リーダーペプチドを暗号化
する合成ヌクレオチドを挿入することによって作製され
る。

特に、かかるオリゴヌクレオチドは、開始剤メチオニン
からエンドペプチダーゼの開裂シグナル（Ｍａｌ　−Ｇ
ｉｎ　−Ｇｌｙ）の予想位置までのキラートキシンのア
ミノ末端のアミノ酸１６個を暗号化する暗号づけセクシ
ョンを包含する　（Ｄ　、　Ｐｅｒｌｍｅｎｔら「ジャ
ーナル・才ブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍ
ｏ１．　Ｂｉｏｌ、）Ｊ　１８７．３９１−４０９．１
９８３）。

この合成オリゴヌクレオチドは、誘導性プロモーター（
ＧＡＬ−ＣＹＣ）と、ｐＥＭＢＬｙｅｘ　２の転写終結
シグナル（２μｍプラスミドのＦＬＰの３′末端）が結
合するｐ−ＥＭＢＬ１８ベクター（Ｌ、　Ｄｅｎｔｅら
ｒＤＮＡクローニング（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）Ｊ第
１巻、ＩＲＬプレス社発行、第１Ｑ１−１０７頁、１ｇ
８５）の多重部位ポリインカーとの間に位置する。

特に、上記ポリインカーには、制限エンドヌクレアーゼ
用の６個の異なる認識部位が存在しくＳｍａｌ、　Ｘｍ
ａｌＳＢａＩＩＩＨＩ、５ａ１２Ｉ、　Ｐｓｔｌ、　１
１ｉｎｄＩＩ［）、これにより、合成オリゴヌクレオチ
ドの後方に目的のタンパク質（たとえばリンホカイン、
ホルモン、ウィルス抗原及び免疫原）を暗号化するＤＮ
Ａ配列の挿入を可能にする。

本発明による分泌ベクター（ＹＥｓｅｃ　１と称する）
は、さらに、Ｓ、セレビシェにおける選択及びエピゾー
ムの複製に必要なエレメントと共に、Ｅ。

コリにおける選択及び複製に必要な配列を含有する。

本発明によれば、発現ベクターｐＥＭＢＬｙｅｘ　２（
その作製については第１Ａ図及び実施例１において述べ
る）は酵母から得られた２つのブロック及びＥ、コリに
おける選択及び複製に必要な配列を含有する。第１のブ
ロック　（エピゾームの複製及びプラスミドコピーの数
を決定する）はプラスミドｐＪＢＤ　２１９　（Ｂｅｇ
ｇｓ　ｒＮａｔｕｒｅＪ　２７５．１０４−１０９゜１
９７８）によるもので、ｐＪＢＤ　２１９のｌｅｕ　２
−ｄ、　２μｘ　ＳＴＢ及び０１１部分を含有する塩基
対３，２２０のＮｄｅ　Ｉ　−Ｓｔｕ　Ｉフラグメント
でなる。このフラグメントは、さらに、転写及びポリア
デニル化の終結シグナルを含有する２μｌプラスミドの
ＦＬＰ遺伝子の３′末端を少量含有する。

第２のブロックはプラスミドＧ　２　　（Ｇｕａｒｅｎ
ｔｅ「メソッズ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
Ｅｎｚｙｍｏｌ、）ｌｏｔ、　１８１−１９１．１９８
３）の旧ｎｄＩ［［−ＢａｍＨＩ　　フラグメントに相
当し、ＵＲＡ　３遺伝子、及び唯一の炭素源としてガラ
ダトースを含有する培地で上記ベクターによって形質転
換せしめた菌株を育生する間にポリインカーにおいて転
写を誘導するシグナルを含有する。異種タンパク質の発
現及び分泌を命令するＹＥｐｓｅｃ　１の能力は、ＹＥ
ｐｓｅｃ　１の合成オリゴヌクレオチドの直後に位置す
るポリインカーのＢａｍＨ１部位において、ヒトインタ
ーロイキンｌβのアミノ酸１２１−２６９を暗号化する
ｃＤＮＡをクローニングすることによって証明される。

このようにして得られたハイブリッドプラスミドＹＥｐ
ｓｅｃ　１−ｈ　Ｉ　−１βを使用して、Ｓ、セレビシ
ェ、好ましくはＳ、セレビシェ３１５０−２Ｂの細胞の
形質転換を行なう。

ついで、形質転換せしめた細胞Ｔｈ１１を、従来より公
知の一般的方法に従って、唯一の炭素源としてガラクト
ース又はエタノールを含有する培養基で培養する。

Ｔｈ１１及びＴｓｅｃ　ｌ　（すなわちヒトインターロ
イキン−１βのＤＮＡを欠くベクターＹＥｐｓｅｃ　１
で形質転換せしめたＳ、セレビシェ３１５０−２Ｂの細
胞）の上澄液及び全細胞抽出物について行なった電気泳
動分析では、ガラクトースを使用して育生したＴｈ［１
細胞の上澄液にのみ約２２，０００ダルトンのタンパク
質が存在することを示す。

さらに、ガラクトースの存在下で培養したＴｈ１１細胞
の上澄液及び細胞抽出物中の上記タンパク質の免疫プロ
ッティング分析では、培養基内にこのタンパク質が完全
に分泌されていることを示す。分泌されたタンパク質が
組換体ＩＬ−１βであると仮定すると、その分子量は約
１７，０００ダルトンとなるはずである。

ＩＬ−１βはその配列のアミノ末端部にグリコシレージ
ョンの潜在部位（Ａｓｎ　−Ｃｙｓ　−Ｔｈｒ）を有す
るため、分子量の矛盾はアミノ基に結合するオリゴ糖の
存在によるものと考えられる。それ故、本発明に従って
、分泌されたタンノ（り質をエンドグリコシダーゼＨで
消化し、消化生成物をゲル−電気泳動によって再度分析
する。

実際、第２図に示す結果から、エンドグリコシダーゼＨ
による処理の後、２２，０００ダルトンに相当するバン
ドが消失し、予想した如く、新たに１７．０００ダルト
ンのバンドが現れることが観察された。

この結果は、さらに、ガラクトース及びツニカマイシン
（グリコシレージョン阻害剤である）を含有する培養基
において育生したＴｈ１１細胞の上澄液の分析によって
確認された。

本発明によれば、分泌されたタン７＜り質のアミ　　　
　　□ノ末端から９個のアミノ酸残基の配列が決定され
た。

かかる配列（Ｓｅｒ　−Ｌｅｕ　−Ｘ　−Ｘ　−Ｔｈｒ
　−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　−Ａｓｐ　−５ｅｒ）は、ＹＥ
ｐｓｅｃ　１でクローン化されたＩＬ−１βのｃＤＮＡ
の５′末端から明らかにされたもの（Ａｕｒｏｎら［プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−
・才ブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユーナイテッド・
ステーブ・オブ・アメリカ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）Ｊ　８１゜７９０７
−７９１１．１９８４）と一致しｔこ。

さらに、合成オリゴヌクレオチドとＩＬ−１βのＤＮＡ
との間に位置するポリインカーの配列によって暗号化さ
れるアミノ酸３個は全く存在しないことを示した。

この結果は、リーダーペプチドの開裂がポリインカーの
配列によって特定されるアミノ酸３個（第１Ｂ図、下部
、斜線矢印で示す）の少なくとも１つとＩＬ−１βの第
１のアミノ酸との間で生ずること、及びリーダーペプチ
ドが１９個のアミノ酸、すなわちキラートキシンの仮説
リーダーペプチドの合成オリゴヌクレオチドのアミノ酸
１６個及びｐＥＭＢＬｌｇのポリインカーのアミノ酸３
個（Ｔｈｒ。

ＡｒｇｌＧｌｙ）でなることを示す。

本発明に従い、分泌された組換タンパク質の生理活性を
、マウス胸腺細胞の細胞分裂促進テストによって測定し
た。

得られた結果（第４図に示す）は、かかる２２，０００
ダルトンのペプチドが天然ＩＬ−１βのものと同じ生理
活性を有することを示した。ハイブリッドプラスミドを
含有するＥ、コリの細胞ＹＥｐｓｅｃ　１−ｈｌｌにつ
いては、１９８６年３月６日付けでアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ６７０２４とし
て寄託している。

次に、添付図面について説明する。

第１Ａ図： 発現ｐＥＭＢＬｙｅｘ　２プラスミドベクター及び分泌
ＹＥｐｓｅｃ　ｌベクターの作製を概略的に示す。

Ｇ２プ°ラスミドの塩基対（ｂｐ）　１，７００のＢａ
ｍＨ１−ＨｉｎｄＩＩ［フラグメントをプラスミドｐＵ
Ｃ１９（ｐＹ４２）のＢａｍＨ−旧ｎｄｌｌＩフラグメ
ント（２，６９０ｂｐ）に結合させ、Ｐｓｔ　Ｉでの消
化及びＤＮＡ−ポリメラーゼ　Ｉ　Ｋｌｅｎｏｗフラグ
メントでの処理によりｔｌＲＡ　３遺伝子におけるＰｓ
ｔ　Ｉ制限部位をｐｙ　４２から除去することによって
ｐＹ　４７プラスミドを作製する。

ついで、ｐＹ４７のＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラ
グメント（１，７００ｂｌ））を単離し、予じめ　Ｅｃ
ｏＲＩで切断したプラスミド、　ｐＥＭＢＬ１８に結合
させる　（ｐＹ　５５）。

一方、ｐＥＭＢＬ　８に、Ｌｅｕ　２−ｄ、　　２　μ
ｍ、プラスミドのＳＴＢ及び２μ！プラスミドのＦＬＰ
の３′末端の配列を含有するプラスミドｐＪＤＢ　２１
９のＨｉｎｄ［［フラグメント（３，５６０ｂｐ）を挿
入することによってｐＹ４３を作製する。

ついでｐＹ　４３のＮｄｅ　Ｉ　−Ｓｔｕ　Ｉフラグメ
ント（３，２２０ｂｐ）をｐＹ　５５の旧ｎｄＩ［ｒフ
ラグメントに結合させてハイブリッドプラスミドｐＥＭ
ＢＬｙｅｘ　２を調整する。

第１Ｂ図： この図には、ｐＥＭＢＬｙｅｘ　２　　の５ｓｔｌ制限
部位及びＫｐｎ　Ｉ制限部位の間に合成オリゴヌクレオ
チドを挿入することによって得られた分泌ベクターＹＥ
ｐｓｅｃ　１の遺伝子地図が示しである。

第１Ｂ図の下部に示す配列は、Ｋ、ラクティスのキラー
トキシンの遺伝子の開始メチオニンからエンドペプチダ
ーゼの開裂の推定部位（Ｖａｔ−Ｇｉｎ　−ｃｔｙ）ま
での仮説リーダーペプチドの配列に相当し、後者と上記
ベクターにおいてクローン化されたインターロイキン−
１β（ＩＬ−１β）のｃＤＮＡ　（下線部）との結合に
相当する。

斜線矢印は実験の際に観察される開裂部位を示す。

第２図ニ ガラクトース２％（ａ及びＣ）又はエタノール２％（ｂ
及びｄ）を補充した完全培養基で育生したＴｈ１１の全
細胞抽出物（ａ及びｂ）及び培養物の上澄液（Ｃ及びｄ
）、及びガラクトース２％（ｅ及びｄ）又はエタノール
２％（ｒ及びｇ）を補充した完全培養基で育生したＴｓ
ｅｃ　１細胞の全細胞抽出物（ｅ及びｆ）及び培養物の
上澄液（ｇ及びｈ）の５ＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリルア
ミドゲル上での電気泳動分析（クマシー染料で着色）の
結果を示す。

上澄液のいずれにも存在する６７．７ｋｄのバンドは、
タンパク質を沈殿させるための支持体として使用された
ウシ血清アルブミンである。

第３図： エンドグリコシダーゼＨによる処理の前（ａ）及び後（
ｂ）における２２，０００ダルトンのタンパク質の５Ｄ
Ｓ−１’ＡＧＥ上での電気泳動分析の結果を示す。

第４図ニ ゲラフは、ガラクトースを含有する培養基で育生したＴ
ｈ１ｌの培養物から得られた上澄フラクションを使用し
て行なったマウス胸腺細胞の分裂促進テストの結果を示
す。

図中、横軸は５ｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ　２００カラムか
らの溶出物の容量（ＪＩＱ）を示し、縦軸はマウス胸腺
細胞による〔３Ｈ〕−チミジンの取込みを示す。

フィトヘマグルニチン（ＰＦＩＡ）のみによる取込の促
進は、点を付した域で示される。標準分子量を矢印によ
って示す。各点は３回の測定の平均（ＳＥＭ＜１０％）
である。

実施例Ｉ Ｇ２プラスミド　２μ９及びｐｕｃ　１９プラスミド２
μ９を、リン酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）　２０μｍ２中
、制限酵素Ｂａｍ１　Ｉ及び１ｉｎｄ　■（Ｂｉｏｌａ
ｂｓ社製）各々２単位（Ｕ）によって、酵素供給者の指
示する操作条件下でそれぞれ切断した。ついで、消化反
応を６５℃、１０分間で停止し、得られた消化混合物を
低液化点０．６％アガロースゲル（ＢＲＬ）に充填し、
１１０■で３時間泳動させた。

Ｇ２のＢａｍＨＩ　−ＢｉｎｄＩ［［フラグメント　（
１，７００ｂｐ）及びｐＵｃ１９のＢａｍ１’ｌ　Ｉ　
−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（２，６９０ｂｐ）にそ
れぞれ相当するバンドをカットし、Ｃｒｏｕｓらによっ
て「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）Ｊ第１０１巻、第７
８−８９頁、１９８３に記載されたように、アガロース
から単離することなく、Ｔ　、ＤＮＡリガーゼの存在下
で連結させた。

このようにして得られたりガーゼ混合物１０μσを、Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎにより「エンザイモロジ−（Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ、）」第６８巻、第３２６頁（１９７９）に記載さ
れた如くしてコンピテントとしたＥ、コリ　ＪＭ　１０
１　（ＢＲＬ）の細胞を形質転換させるために使用した
。

形質転換体を、アンピシリン５０μ９７　ＩＲＱを添加
したＬＢアーガー（ＤＩＦＣＯ）の平板培地上で選別し
た。

得られた陽性のクローンの１つから、ｐＹ　４２プラス
ミド（４，３９１ｂｐ）を抽出した。このプラスミドを
Ｐｓｔ　Ｉ　（ＢＲＬ）　２　Ｕで切断し、ポリメラー
ゼ（Ｋｌｅｎｏｗ　−Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　　によ
って３７℃で５分間処理し、ＵＲＡ　３遺伝子における
Ｐｓｔ　Ｉ制限部位を除去した。

ついで混合物を、１　ｍＭ　ＡＴＰ、　１０ｄジチオト
レイトール、２０ＩＩＩＭトリスーＨＣＱ、　１０ｍＭ
　ＭｇＣＱ１緩衝液中、１５℃、１６時間でＴ　、ＤＮ
Ａリガーゼによって処理して、ＤＮＡの最終濃度１５０
μ９／Ｍ（ｌとした。

リガーゼ混合物全体を、上記の如＜Ｅ、コリＪＭ　１０
１のコンピテント細胞の形質転換に使用した。

陽性のクローンの１つから、　ｐＹ　４７プラスミドを
単離した。このプラスミドを前述の如＜　ＢａｍＨＩ及
びＨｉｎｄＩＩ［で切断し、Ｉ）Ｙ　４７のＢａ１ＩＩ
ＨＩ　−ＨｉｎｄｌｌＩフラグメント（１，７００ｂｐ
）を予じめＥｃｏＲＩで切断しかつポリメラーゼによっ
て処理したｐＥＭＢＬ　１８プラスミドに連結させた。

ついで、リガーゼ混合物をＥ、コリＪＭ　１０１のコン
ピテント細胞を形質転換させるために使用した。陽性の
クローンの１つから５，７０１ｂｐのｐｙ　５５プラス
ミドを単離した。

セルロースフィルター上でのハイブリダイゼーションに
よる分析では、このプラスミドがｐＥＭＢＬ１８及び１
，７００ｂｐのＢａｍＨＩ　−ＨｉｎｄｌＩＩフラグメ
ントによって構成されることを示した。

ＰＪＢＤ　２１９　（Ｂｅｇｇｓ　ｒＮａｔｕｒｅＪ　
２７５．１０４１０４−１０９（１９７２ｕ　９及びｐ
ＥＭＢＬ　８　（ＤｅｎｔｅらｒＤＮＡクローニング（
ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）Ｊ第１巻、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ
ｓ社発行、第１０１−１０７頁（１９８５））　２　μ
９をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）２Ｕ
で切断した。

ついで、消化混合物を０．６％アガロースゲルに充填し
、１１０ｖ　で３時間泳動させた。ｐＪＢＤ　１９（Ｂ
ａｇｇｓ　ｒＮａｔｕｒｅＪ　２７５．１０４−１０９
　（１９７８））の旧ｎｄ■フラグメント（３，５６０
ｂｐ）に相当するバンドを切出し、Ｔ　、ＤＮＡリガー
ゼの存在下、ｐＥＭＢＬ　８の消化混合物に添加した。

ついで、リガーゼ混合物１０μｅをＥ、コリ　ＪＭｌｏ
ｌのコンピテント細胞を形質転換させるために使用し、
陽性の形質転換体の１つから、７，５６０　ｂｐのｐＹ
　４３プラスミドを単離した。

ｐＹ４３２μ９をＮｄｅｌ　　２Ｕ及びＳｔｕ　Ｉ　　
２　Ｕ　（ＢＲＬ）で消化した。

この消化混合物５μｅを、ｐｙ　５５を旧ｎｄＩＩ［で
切断することにより得られた消化混合物５μＱにＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼの存在下で添加し、上述の如く処理した。

陽性のクローンを、プローブとしてラベル付ｐＹ４３の
Ｎｄｅ　Ｉ　−Ｓｔｕ　Ｉフラグメントを使用するハイ
ブリダイゼーションによって同定した。このように操作
することによって、８，９２４　ｂｐのハイブリッドｐ
ＥＭＢＬｙｅｘ　２プラスミドを単離した。このプラス
ミドは、アンピシリン耐性を暗号化する遺伝子、Ｆ１フ
ァージの複製の原点、ウラシル３（ＵＲＡ３）の遺伝子
及びＳ、セレビシアのロイシン２−ｄ遺伝子及びＧ２に
由来するハイブリッドプロモーター（つづいてｐＥＭＢ
Ｌ　１８のポリインカーが結合する）を含有する。

ｐＥＭＢＬｙｅｘ　２１５μｆｉを５ｓｔＩ５Ｕで切断
し、ＫｐｎＩＩＵで部分的に切断した。ついで、消化混
合物を０．６％アガロースゲルに充填し、１１０ｖで３
時間泳動させた。

もっとも大きい分子量のフラグメントに相当するバンド
を分離し、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｉｓ　３
ｇ０Ａ合成装置を使用して合成した下記のオリゴヌクレ
オチドと連結させた。

ＣＡＴＣＡＡＴ　　ＡＴＡ　　ＴＴＴ　　ＴＡＣＡＴＡ
　　ＴＴＴ　　ＴＴＧＴＴＴ　　ＴＴＧ　　ＣＴＧ　　
ＴＣＡ　　ＴＴＣＧＴＴ　　ＣＡＡ　　ＧＧＴ　　ＡＣ
ＴＣＧＡＧ　　ＴＡＣＴＴＡ　　ＴＡＴ　　ＡＡＡ　　
ＡＴＧ　　ＴＡＴ　　ＡＡＡＡＡＣＧＡＣＡＧＴ　　Ａ
ＡＧ　　ＣＡＡ　　ＧＴＴ　　Ｃ得られたりガーゼ混合
物を、Ｅ、コリＨＢ　１０１　（コンピテント細胞の形
質転換に使用した。

ついで、形質転換体を、上述の如くアンピシリン耐性に
基いて選別した。

陽性のクローンから最終的にＹＥｐｓｅｃ　１プラスミ
ドを単離した（第１Ｂ図）。

実施例２ ＲＰＭ　Ｉ中で密度が１０＠細胞ＩＲＱとなるまで育生
したＴＩＰ　ｌ系の細胞をＴＰＡ　（０，１μ９／ｊＩ
Ｑ）で４時間活性化させた。Ｍａｎｉａｔｉｓらにより
　［モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・
マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：
　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ（Ｃｏ
ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ社発行、１９４−１９５　（１９Ｂ
２））に記載された方法に従って前記細胞から全ＲＮＡ
を抽出した。　ＲＮＡをオリゴ−ｄＴのカラムで展開し
、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐｔ（５，５）におけるサ
ッカロース勾配（５−２０％）で分画した。各フラクシ
ョンを、インターロイキン−１βの遺伝子の配列の少な
くとも１８個のコドンに相当する５ｓｂｐの合成プロー
ブ（Ａｕｒｏｎら　ｒＰ、Ｎ、Ａ、ｓｌ　８１．　７０
０８−７０１１．　１９８４）　　とハイブリダイズさ
せた。

陽性のフラクションを使用して、Ｇｒｕｂｅｒらの方法
（「ジーン（Ｇｅｎｅ）Ｊ　２５．２６３−２６９　（
１９８３））に従って、ｃＤＮＡを調製した。

上述のプローブを組換クローンの同定に使用した。

これらクローンの１つのプラスミドＤＮＡを使用して、
ＩＬ−１のｃＤＮＡを含有する６００ｂｐの５ａｕ３Ａ
部分フラグメントを単離した。このフラグメントを、ハ
イブリッドＹＥｐｓｅｃｌ　−ｈＩ　−１βプラスミド
を得るために、合成オリゴヌクレオチドの直後に位置す
るＹＥｐｓｅｃ　１プラスミドのＢａｍＨ［部位に挿入
した。後者を使用して、Ｅ、コリの細胞の形質転換を行
なった。形質転換せしめた細胞については、１９８６年
３月６日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションにＡＴＣＣ６７０２４として寄託している。

実施例３ Ｓ、セレビシェ　５１５０−２Ｂ　（ｌｅｕ　２−３　
１ｅｕ２−１１２　　ｕｒａ　３−５２　　ｔｒｐｌ　
−２８９ｈｉｓ　３−１ｃｉｒ＋）の細胞を、Ｒｏｔｈ
ｓｔｅｉｎらの方法（Ｇｌｏｖｅｒ編ｒＤＮＡ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇＪ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ社発行、第■巻、第４
５＝４６頁、　１９８５）に従って、ハイブリッドＹＥ
ｐｓｅｃ−ｈｌ−１βプラスミド（Ｓ、セレビシェＴｈ
１１）及びＹＥｐｓｅｃ　１ベクター（Ｓ、セレビシェ
Ｔｓｅｃ　１）によってそれぞれ形質転換せしめた。

このようにして形質転換させた細胞を、下記組成を有す
る培養基（ｐＨ５，５）　１＆を収容するエーレンマイ
ヤーフラスコ（容積　２Ｃ）内において、２００ｒｐｍ
、　３０℃で培養した。

組成 酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）　　　　　　１　　％ペプト
ン　（ＤＩＦＣＯ）　　　　　　１　　％ガラクトース
（Ｍｅｒｃｋ）　　　　　２　　％ＫＨ，ＰＯ４Ｑ、：
１％ Ｈ２Ｏ１ｇ 約４０時間後、ＩＬ−１βの存在を確認するため、Ｔｓ
ｅｃ　１及びＴｈ１１の上澄液及び全細胞抽出物の電気
泳動分析を行なった。

このうち細胞抽出物の調製を、小形のガラスポールによ
り細胞を約２分間冷時切断し、細胞懸濁液を１０．００
Ｏｒｐｍで１５分間遠沈し、得られた透明な液を２％５
ＤＳＳ１０％グリセリン、５％メルカプトエタノール及
び６２．５ｍＭ　）リス−ＨＣ（２の緩衝液（ｐＩ（６
，８）で希釈することによって実施した。

一方、上澄液については、細胞培養物を４．００Ｏｒｐ
ｍで５分間遠沈し、０．４５μｌの殺菌フィルターＭＨ
Ｉ　１ｐｏｒｅ上で上澄液を濾過することによって調製
した。ついで、ｐ液を０℃で保存し、ＩＬ−１β確認の
ため分析に供した。

このろ液Ｌ８ｚ（ｌにウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ
）を最終臭度１００μ／峠で添加し、トリクロル酢酸（
ＴＣＡ）　０．２友Ｃを添加した。

混合物を一２０℃に３０分間維持し、１０．００Ｏｒｐ
ｍで１５分間遠沈した。沈殿物を洗浄し、緩衝液（２％
硫酸ドデシルナトリウム、１０％グリセリン、５％メル
カプトエタノール、６２．５ｎ＋Ｍ　）リス−ＨＣｇ、
　ｐＨ６，８）　２５μＱ中に再度懸濁化させた。

得られた溶液を３分間沸騰温度に維持し、Ｌａｅｍ＋＋
＋　１　ｉの方法（ｒＮａｔｕｒｅＪ　２２７．６８０
−６８４　（１９７０））によって調製した１５％アク
リルアミドゲルに充填し、１５０■で５時間泳動させた
。

対照として、ガラクトースの代わりにエタノールを添加
した完全培養基で培養したＴｈ１１及びＴｓｅｃ　１細
胞の細胞抽出物及び上澄液について同じ分析を行なった
。この場合、酵母では、ヒトＩＬ−１βを暗号化する遺
伝子の発現を活性化させなかった。

ゲル電気泳動分析を、分子量のコントロール基準として
ＢＩＯＲＡＤ社製のＬｏｖ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｌｌ
ｅｉｇｈｔ（１４，４００−９２，０００ダルトン）１
βｇを使用して実施した。

第２図に示す結果は、Ｓ、セレビシェＴｈ１１の培養物
からのろ液にのみバンド（２２，０００ダルトンに相当
）が存在することを示した。Ｔｈ１１によって分泌され
たタンパク質がＩＬ−１βとすると、その分子量は２２
，０００ダルトンではなく約１７，０００となるはずで
ある。従って、この分子量の不一致はタンパク質の末端
アミノ基に結合したオリゴサツカライドの存在によるも
のである。かかるタンパク質のエンドグリコラーゼＨに
よる消化では、２２゜０００ダルトンのバンドが消失し
、新たに約１７，０００ダルトンのバンドが現れること
を示した（第３図）。

この結果を、ツニカマイシンによるインビボグリコシレ
ーションの阻害によって確認した。

グルコース及び０．５μｇ／Ｉ（Ｎの濃度のツニカマイ
シンを含有する培養基で育生したＴｈ１１の培養物の上
澄液は１７，０００ダルトンのタンパク質のみ生成した
。

かかるタンパク質の同定を行なうため、Ｅｄｍａｎ法（
Ｈｅｗｉｃｋら［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）Ｊ　
２５６．１９９０−１９９７　（１９８１））に従って
初のアミノ酸を分析した。

得られた結果は、予想したＩＬ−１βに関する配列と一
致した。タンパク質のアミノ末端では、ポリインカーに
より暗号化されたアミノ酸は全く見出されなかった。こ
れより、リーダーペプチドの切断がポリインカーの配列
によって暗号化される３個のアミノ酸の最後の１つとＩ
Ｌ−１βの最初のアミノ酸との間で起こることが示唆さ
れる（第１Ｂ図）。

Ｔｈ１１細胞の培養物から得られた上澄液について、Ｇ
ｅｒｇらにより　「セル・イミュノロジ−（ＣｅｌｌＩ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）Ｊ第６４巻、　２９３−３０３　
（１９８４）に開示された如く、胸腺細胞分裂分析によ
って、分泌されたタンパク質の生物活性をテストした。

実際には、上澄液を限外濾過によって濃縮し、０．１５
Ｍ　　ＮａＣＱで平衡化した５ｃｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ　
　２００カラム（３０Ｘ　１　ａｍ）に充填し、流ＩＩ
　ｘ（１／分で分子量２０．０００ないし２２，０００
（７）　７　ラ’）　ショア０．５ｍ１２を集め、下記
の如く分析した。

すなわち、４−８週間のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスから得た
胸腺細胞６・１０５をマイクロスラブのくぼみに導入し
、５％胎児血清アルブミン（ＦＢＳ、　ＨＶ−Ｃ１ｏｎ
ｅ、　５ｔｅｒｉｌｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｔｔ９
／ＭＱゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ）、２５ｍＭ
　ＨＥＰＥＳ、　２　ｍＭ　　Ｌ　−グルタミン及び１
．２５　ｘ　　１０−’　　Ｍ　　２−メルカプトメタ
ノールの存在下、ＲＰＭＩ　１６４０培養基における各
フラクションのスカラー溶液　０．２峠と接触させた。

培養物を３　ＨｄＴｈｄチミジン　１μＣｉ／＜ぼみて
標識化し、３７℃に１６−１８時間維持した。この時間
の経過時、細胞をガラスファイバーフィルター上で回収
し、結合した放射活性を測定するため、分光測定によっ
て分析した。分裂をカウント７分（ｃｐｆｆｌ）として
測定し、「分裂インデックス」、すなわちＰｔＩＡ＋フ
ラクションのｃｐｍ／コントロールのｃｐｍ（フラクシ
ョンを含有しないＰＨＡ）　　の比として表した。得ら
れた結果（第４図）は、分子量約２２．０００を有する
フラクションに一致する高い分裂を示した。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図は発現ｐＥＭＢＬｙｅｘ　２プラスミドベクタ
ー及び分泌　ＹＥｐｓｅｃ　１ベクターの作製を概略的
に示す図、第１Ｂ図は分泌ベクターＹＥｐｓｅｃ　１の
遺伝子地図を表す図、第２図はＴｈ［１及びＴｓｅｃ　
１の細胞抽出物及び培養物の上澄液について行なった電
気泳動分析の結果を示す写真、第３図は２２，０００ダ
ルトンのタンパク質のエンドグリコシダーゼＨによる処
理の前後における電気泳動の結果を示す写真、及び第４
図はＴｈ１１から分泌されたタンパク質について行なっ
た生物活性テストの結果を示すグラフである。 図面の浄書（内容に変更なし） 図面の浄Ｂ（内容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　異種タンパク質の生成に使用される酵母の発現及び
   分泌クローニングベクターにおいて、誘導性ハイブリッ
   ドプロモーターと酵母のＲＮＡポリメラーゼによって認
   識される転写終了シグナルが結合した多重部位ポリイン
   カーとの間に、異種タンパク質の分泌を命令する合成オ
   リゴヌクレオチドを挿入して成る、酵母の発現及び分泌
   クローニングベクター。 ２　特許請求の範囲第１項記載のものにおいて、前記誘
   導性ハイブリッドプロモーターがＧＡＬ−ＣＹＣであり
   、前記終了シグナルがＦＬＰの３′末端領域のものであ
   り、前記合成オリゴヌクレオチドの配列がＫ．ラグティ
   スのキラートキシンの仮説リーダー配列に相当し、前記
   多重部位ポリインカーがｐＥＭＢＬ１８ベクターのもの
   である、酵母の発現及び分泌クローニングベクター。 ３　特許請求の範囲第１項又は第２項によるクローニン
   グベクター及び異種タンパク質を暗号化するＤＮＡ配列
   から得られ、この配列が合成オリゴヌクレオチドの後の
   ポリインカーの制限部位の１つでクローン化される、発
   現及び分泌ハイブリッドプラスミド。 ４　特許請求の範囲第３項記載のものにおいて、前記配
   列が、前記合成オリゴヌクレオチドの直後のポリインカ
   ーのＢａｍＨＩのヒトインターロイキン−ｌβを暗号化
   するｃＤＮＡによって構成される、ハイブリッドプラス
   ミド。 ５　Ｅ．コリに含有せしめられたハイブリッドＹＥｐｓ
   ｅｃｌ−ｈＩ−ｌβプラスミド（ＡＴＣＣ６７０２４）
   。 ６　特許請求の範囲第３項又は第４項によるハイブリッ
   ドプラスミドを含有する酵母細胞を適当な培養基で培養
   することからなる、異種タンパク質の製法。