JPH02501108A - 微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産本発明はプレプロヒト副甲状腺ホルモ ンをコードするＤＮＡを持つ、遺伝子工学的操作を加えた微生物に関するもので ある。

哺乳類細胞によって正常に合成される数々の蛋白質やペプチドは、医学、農業、 工業上有用であることが証明されてきた。これらの蛋白質やペプチドは異なる分 子サイズでもあり、例えば酵素や構造蛋白質、成長因子、ホルモンなどのように いくつかの異なる機能を有している。

本質的に、蛋白質、ペプチド共に、アミノ酸の一次配列より構成されており、２ 次構造、３次構造を形成して生物学的活性を発現する。

ヒト副甲状腺ホルモンは比較的小分子量であり、アミノ酸を順次付加することに よって、化学的にこのペプチドを合成する事が可能である。

故に副甲状腺ホルモンは商業的に利用可能ではあるが、ごく少量で高価である。

結果的に多くの潜在的、医学、農業、工業面の応用に供するのに適当な価格の利 用可能なヒト副甲状腺ホルモンは存在しない。

過去１０年間、組み換えＤＮＡを用いた微生物学的技術は異種のペプチドの生産 に微生物を利用する事を可能にしてきた。微生物は急速かつ、大量の成長が可能 であり、細菌のペプチドと同様の方法で、外来性の産生物を合成出来る。この分 子生物学的アプローチの有効性と可能性は既に医学或いは他の使用目的に今や多 用可能な数々のヒト蛋白質の微生物による生産によって証明されてきた。

副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は哺乳類のカルシウム代謝の最も重要なレギュレー ターの１つであり、ヒトや動物のミルク熱急性低カルシウム症の他に、病理的血 中カルシウムレベル変化といった、いくつかの病気にも関連している。それ故に このホルモンは、診断キットの一部としても重要であり、ヒトや家畜の医療にお いても治療に潜在的可能性を有している。

ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンＤＮへの最初の合成はヘントリ（Ｈｅｎｄｒｙ） Ｇ、Ｎ、Ｋｒｏｎｅｂｅｒｇ、）１．Ｍ、、Ｐｏｔｔｓ、Ｊｒ、Ｊ、Ｔ、Ｒｉｃ ｈ　Ａらによって報告された。（７８Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 　７３６５−７３６９．１９８１）　。

またヘンドリーらによってＰＴＨ，ｎ＋ＲＮＡ配列の相補ＤＮＡが合成され、２ 本鎖に合成された（前出）、このｃＤＮＡは、ｐＢＲ３２２ＤＮＡにクローニン グされ、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ、）　１７７６にトランスフェクトされた。選択 された抗生物質に耐性のコロニーのうち、２００コロニー中２３コロニーが、特 異的ヒトＰＴＨｃＤＮＡの挿入を持っていることが同定された。しかしながら２ ３個のヒトＰＴ）ｌコロニーのうち、全長にわたって挿入されているものはなか った（ヘンドリーら、前出）、後にプレイエル（Ｂｒｅｙｅｌ）、Ｅ、］’１ｏ ｒｅｌｌｅ、Ｇ、　Ａｕｆ’ｍｔｏｌｋ、Ｂ。

Ｆｒａｎｋ、Ｒ，Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｈ，Ｍａｙｅｒ、）１．らは、シャロン４Ａ フアージで構成された胎児肝、ジェノミックＤＮＡライブラリーにヒ）　ＰＴ） ｌ遺伝子があることを報告した（第３回欧州バイオテクノロジー会議、１９８４ 、　９月１０　１４．　ｖｏｌ、３．３６３　３６９）。ＰＴＨ遺伝子の制限酵 素断片が再クローン化され、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ、）にトランスフェクトされ た。

しかし、プレイエルらの研究により（前出）　、Ｅ、ｃｏｌｉはヒトＰＴ）ｌを 分解することがわかった。故に、これまでのところ、無障害のヒト副甲状腺ホル モンを安定に生産する微生物は報告されてきていない。更に、副甲状腺ホルモン は酵母からも単離されてきていない。

したがって、ヒトプレプロ副甲状腺ホルモン（）ＩＰＴ）ｌ）をコードするＤＮ Ａを持つ大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）挿入用のプラスミドの開発が本発明の目的であ る。また、ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡを持つ大腸菌を遺 伝子工学的に作成する事が本発明のもう一つの目的である。

更に、本発明の目的は、酵母挿入用の副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡを持 つプラスミドの開発である。また、ヒト副甲状腺ホルモンを含めて、副甲状腺ホ ルモンをコードするＤＮＡを持つ、形質転換酵母を作成し、その形質転換酵母か ら、副甲状腺ホルモンを得ることが、本発明の目的である。

本発明の他の目的や、利用法は、後述されるところによって明らかとなるであろ う。

前述の目的を達成する為に、本発明によってヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコ ードするＤＮＡを持つ大腸菌挿入用の新しいプラスミドが作成された。このプラ スミドは大腸菌に挿入されると大腸菌を形質転換させ、マルチコピーのプラスミ ド、つまりヒトプレプロ副甲状腺ホルモンのｃＤＮＡを複製させるものとして機 能する０本発明による大腸菌挿入用のプラスミドと形質転換大腸菌は、例えば、 ヘンドリーらによって報告されているように、本発明のプラスミドは、プレプロ 副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡの５′未満に２重の開始コドンを含んでい る点で、今までの人ロブラスミドや微生物と区別できる。この２重の開始コドン の存在により、このｃＤＮＡを持つプラスミドで微生物を形質転換させた時、プ レプロ副甲状腺ホルモンを従来技術の形質転換微生物よりも高効率、高収量で生 産するような生産微生物が得られたのであろう。

更に、本発明によって副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡを持った酵母挿入用 のプラスミドが作成された。より具体的にはこのプラスミドは前述の、大腸菌へ の挿入用のプラスミドをクローン化することによって開発された。最終的には、 本発明により、前述の酵母への挿入用プラスミドによって副甲状腺ホルモンを生 産分泌するような形質転換酵母が得られた。即ち、本発明は、酵母培地から、副 甲状腺ホルモンを単離できるような方法を開発したものである。

より具体的には、この形質転換酵母は、サツカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。また、副甲状腺ホル モンは、ヒト副甲状腺ホルモンである。ブタペスト条約の規定により、ｐｓｓＨ ＰＴＨ−１０とその形質転換大腸菌、ｐＳＳαＬＸ５−）ＩＰＴＨＩとその形質 転換サツカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｓ＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ）は、１９８６年９月２９日、メリーランド州のアメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクション（Ａ＋＊ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に供託された。これらのサンプルは、以下の寄託 番号を付与されている。

ｐＳＳ）ＩＰＴ）ｌ−１０を持つ、形質転換大腸菌　ＡＴＣＣ６７２２３ｐｓｓ ＨＰＴＨ−１０ＡＴＣＣ４０２６７ｐＳＳαＬＸＳ−ＨＰＴＨ１を持つ形質転換 サツカロマイセス・セレビシアエ　ＡＴＣＣ２０８２１ｐｓｓαＬＸ５−ＨＰＴ ＨＩ　ＡＴＣＣ４０２６６図１にヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコードするＤ ＮＡ塩基配列の可能な全てのバリエーションを示しである。

図２にクローンｐＳＳ）ＩＰＴ）Ｉ−１０のヒトプレプロ副甲状腺ホルモンＤＮ Ａに特異的なコード配列を示しである。

図３に本発明のプラスミドに存在すると考えられるヒトプレプロ副甲状腺ホルモ ンをコードし、５′末端に２重のスタートコドンを持つ、可能な全てのＤＮＡ配 列をその近接領域と共に示している。

図４はクローンｐＳＳ）ＩＰＴ）ｌ−１０の特異的ヒトプレプロ副甲状腺ホルモ ンＤＮＡ配列をその近接配列と共に示しである。

図５はクローンｐＳＳ）ＩＰＴＨ−１０のＤＮＡ配列にコードされる、ヒトプレ プロ副甲状腺ホルモンの実際のアミノ酸配列を示している。

図６は組み換えプラスミドｐＳＳＨＰＴＨ−１０の構成を示している。

図７はｐＡＬＸ　４の制限地図を示している。

図８はｐＬ４とｐＭＦα１−１からのｐαＬＸ−５の構成を示している。

図９はｐＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨ１の概略図を示している。

図１０は肝α１−ＨＰＴＨの融合遺伝子の配列と、肝ＴＨをコードするＤＮＡの 可能な全ての組み合わせを示している。

図１１は肝α１−ＨＰＴ）Ｉの融合遺伝子の配列を示している。

図１２は酵母が生産、分泌し、酵母培地から回収されたヒト副甲状腺ホルモンの 電気泳動プレートを示している。

以上に示したように本発明は、ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコードするＤＮ Ａを含んだ大腸菌への挿入用プラスミドについてのものである。また本発明は作 成された形質転換大腸菌に関する。

更に本発明は、大腸直への挿入用プラスミドに由来する、副甲状腺ホルモンをコ ードするＤＮＡを持つ酵母への挿入用プラスミドについてのものである。最終的 には本発明は、副甲状腺ホルモンが回収されると考えられる酵母についてのもの である。

更に本発明によりこのプラスミドと形質転換微生物の単離と作成の方法がもたら される。外科的操作後直ちに回収されたヒト副甲状腺腫からポリＡ選択のｌ’ｌ ＮＡが単離された。ポリＡ　ＲＮＡを庶糖濃度勾配超遠心によって適正な大きさ の１ｌＲＮＡに濃縮した。

このサイズに分画されたポリＡ　ＲＮＡからインビトロで正常な分子量の副甲状 腺ホルモンを翻訳しこれを、抗副甲状腺腫抗血清による免疫沈降後に、ＳＯＳ電 気泳動によって判定した。ヒト、ＰＴＨ特異的ｍＲＮＡを鋳型として用いオリゴ ｄ　（Ｔ）　１８マーをプライマーとして鳥筋原細胞腫ウィルス逆転写酵素を用 いて相補ＤＮＡを合成した。　ＲＮＡの鋳型をアルカリ加水分解によって除去し た後に、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメント存在下で精製した 第１のＤＮＡ鎖をインキュベートすることによって第２の相補鎖ＤＮＡを合成し た。二本鎖の相補ＤＮＡの末端をアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）の−末鎖特異的エンドヌクレアーゼ５１の作用により平 滑末端にし、５ｏｏｂｐ以上の長さの相補ＤＮＡをニュートラル庶糖濃度勾配遠 心によって単離した。約２０塩基長のｄ　（Ｃ）テイルをｃＤＮＡの３′末端に 酵素によって付加した。この修飾された相補ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断し オリゴｄ　（Ｇ）テイルを付加したベクターｐＢＲ３２２に付加した。作成され た組み換えプラスミドＤＮＡを大腸菌に１２　ＢＪ５１０３株に形質転換させた 。ポジティブな形質転換株は、それぞれ、ホルモンｍＲＮＡ配列の３′末端の非 コード領域と、Ｎ本のコード領域をカバーする２種類の合成デオキシオリゴヌク レオチドを用いたコロニーハイブリダイゼーションによって検索した。６６個の クローンのうち６つが両方のプローブにポジティブであり、これらを制限酵素地 図による詳細な解析に供したところ、スタートコドンと３′末端のストップコド ンのＸｂａ　１部位の近接領域において、サイズがいくつか異なることを除いて は、全て同一であった。そのうちの１つのクローンであるｐｓｓＨＰＴＨ４０の ＤＮＡ配列を解析したところｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位に４３２塩基長のヒト 副甲状腺ホルモンの相補ＤＮＡが挿入されている事が判明した。この全ｃＤＮＡ 配列は、スタートコドンの前に５ｂｐの欠失があった事を除いては、ヘンドリー ら（前述）によって報告された配列と同一であった。

図２は、ｐｓｓＨＰＴＨ−１０のヒトプレプロ副甲状腺ホルモンのＤＮＡ配列を 示したものである。５′の二重スタートコドンを除いては、ヒト副甲状腺ホルモ ンのＤＮＡ配列の可能な全てのバリエーションを示す図１と一致するであろう。

図３は本発明によって得られたクローンのＤＮＡ配列をその近接領域の配列と共 に示しである。より具体的には、ヒト副甲状腺ホルモンをコードする大腸菌への 挿入用プラスミドはｐＳＳＨＰＴＨ−１０であり、そのＤＮＡ配列は近傍の配列 と共に図４に示しである。

更に本発明により、酵母への挿入用の、副甲状腺をコードする１１１ＮＡを持つ プラスミドが得られる。この副甲状腺ホルモンはヒト及び動物、例えばブタやウ シの副甲状腺ホルモンでもよい。

本発明の酵母挿入用プラスミドは、ヒト又は動物の副甲状腺ホルモンをコードす るＤＮＡを持つプラスミドから再クローン化され得よう、具体的には、酵母への 挿入用プラスミドに、ヒト副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡが含まれている 。以下の例で示すように、ｐｓｓＨＰＴＨ−１０由来のヒ）　）ＩＰＴＨ配列を 再クローン化しサツ力ロマイセスーセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ＋ｎｙｃｅ ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で発現するように特別に設計されたベクターに挿入 した。

ｐＳＳＨＰＴＨ−１０は２８８ｂｐのＢｇｌ　ＩＩ−χｂａＩ断片にあるように 切断した。この断片をｐＵｃ１９中のＢａｍＨＩとＸｂａ　１部位間にサブクロ ーニングした。このサブクローンを更にＤｐｎ　ｌで切断し生じてきた最も大き な断片を単離した。この断片を次にＳａｌ　Ｉで切断した。

酵母ＭＡＴα細胞中でＰＴＨを発現、分泌するこのプラスミドｐＳＳαＬＸ−） ＩＰＴＨＩは三段階を経て作成された。

１、　酵母シャトルベクターｐＬ４　（大腸菌中でもサツカロマイセス・セレビ シアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でも複製する ）の作成。

２、酵母性フェロモン肝α１遺伝子を含んだＤＮＡ断片のクローニングと、これ の酵母シャトルベクターへの挿入によるｐαＬＸ５ベクターの作成。

３、ｐｓｓＨＰＴＨ−１０のＨＰＴＨ遺伝子のコード領域のＤＮＡ断片をｐαＬ Ｘ５のコード領域にＭＦα１遺伝子の前駆体部分と共に挿入することによるｐｓ ｓαＬＸ　５−　ＨＰＴＨベクターの作成。

シャトルベクターｐＬ４はｐＡＤＨＯ４０より単離したＡＤＨプロモーターを含 む、ＥｃｏＲＩ　−Ａｖａ　ＩＩ断片をｐＪＤＢ２０７に挿入することによって 作成した。５ｐｈｌ断片を次に欠失させ、プラスミドｐＡＬＸ　１を作成した。

βラクタマーゼ遺伝子中のｐｓｔ１部位を欠失させ、このプラスミドをｐｖａ　 ＩとＢｇｌ　Ｉで部分分解し、ｐＬｌｃのＰｖｕ　Ｉ　。

Ｂｇｌ　Ｉ断片をライゲーションし、ｐＡＬＸ　２を作成した。さらに、オリゴ ヌクレオチドの挿入後このプラスミドと旧ｎｄＩ［Ｉで分解し再び結合させてｐ ＡＬＸ　４を作成した。

Ｙ２８８ｃ株より得た酵母の全ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し１．６〜１．８ｋｂ の断片を単離した。これをＥｃｏＲＩで切断したｐＢＲ３２２に結合し、大腸菌 を形質転換させた。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより肝α−１ の挿入クローンをスクリーニングした。

この結果選択されたＤＮＡを大腸菌の形質転換用に用いた。得られたプラスミド ｐ？ＩＦα１−１をＥｃｏＲＩで切断しフレノウフラグメントで平滑末端にした 後にＢｇｌｌｌで切断した。ＭＦαｌ断片を単離し、（ＢａｍＨＩで切断した後 にフレノウフラグメントで平滑末端にした）ｐＬ５に結合してｐαＬＸ５を作成 した。ｐαＬＸ５にヒ）　ＰＴＨｃＤＮＡ断片を挿入する為に、ｐαＬＸ５を旧 ｎｄｌＩｌで切断し、生じた接着末端とこの部位をＤＮＡポリメラーゼ■のフレ ノウフラグメントとｄＮＴＰで平滑末端にした。次にｐαＬχ５を５ａｌｌで切 断し、５ａｉｌで切断した上記のヒトＰＴＨ断片と相補する接着末端を有するＤ ＮＡを作成した。

５ａｉｌで切断したヒトＰＴ）Ｉ断片を、５ａｉｌで切断したｐαＬＸ５に挿入 した０作成したプラスミドｐＳＳαＬＸ５・ＰＴ）Ｉは図９に示しである。

ｐｓｓαＬＸ５−ＰＴ）ｌを酵母に挿入し、ヒト副甲状腺ホルモンを生産、分泌 するような形質転換酵母を得た。より具体的には、この形質転換酵母はサツカロ マイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）である。

図１２に酵母培地より得たヒト副甲状腺ホルモンの電気泳動プレートを示しであ る。

しかしながら、ｐＳＳＨＰＴＨ−１０を再クローニングし酵母への挿入用プラス ミドを作成する方法は詳細に示してあり、この方法は本発明を例証するものとし て示しであるが、本発明は以後これに制限されるものではない。この方法は、ヒ ト、動物のＰＴ）ＩをコードするＤＮＡを持つ様々なプラスミドに応用されるだ ろうし、本発明の酵母への挿入用プラスミドが作成出来る。

本発明のプラスミド及び形質転換微生物は以下の例にあるように作成された。

例１ ヒト５　ホルモンのｍＲＮへの　−と　ＤＮＡ０人本発明の最初の材料として患 者より外科的に得られた副甲状腺腫が使われた。副甲状腺組織を摘出後、直ちに ドライアイス中で冷却しＲＮＡｍ製用に研究室に運ノしだ。この凍結組織は、４ ｈグアニジンイソチオシアネート存在下、超ツラックスホモゲナイザーでホモゲ ナイズし、ガーグイン（Ｇｈｉｒｇ賃ｉｎ　Ｊ、Ｍ、）、ビジビラ（Ｐｒｚｙｂ ｙｌａ　Ａ、Ｅ、）、マクドナルド（ＭａｃＤｏｎａｌｄ　Ｒ，Ｊ、）　、ルタ ー（Ｒｕｔｔｅｒ　Ｗ、Ｊ、）らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８５２ ９４　５２９９１９７９）に従って段階別エタノール沈殿によってＲＮＡを回収 した。

調製したＲＮＡを、オリゴｄ　（Ｔ）セルロース′アフィニティクロマトグラフ ィカラムにかけ、ポリ（Ａ）を持つｍＲＮＡを濃縮した。ポリ（Ａ）を多く含む ＲＮＡを更に１５〜３０％連続庶糖濃度勾配超遠心にかけ、副甲状腺ホルモンｍ ＲＮＡ０サイズのＩ？ＮＡを濃縮した。得られたグラジェントを２５画分に分画 し、３両分毎にインヒドロで翻訳させ、抗ＰＴ）ｌ抗血清による免疫沈降しガウ テビイク（Ｇａｕｔｖｉｋ。

Ｋ、Ｍ、）　Ｃａｕｔｉｖｉｋ、Ｖ、Ｔ、　Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ　Ｊ、Ｆ、　５ ｃａｎｄ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　４３５５３−５６９１９８４）とＳＤＳ、ポリアクリルアミド 電気泳動レムリ−（Ｌａｅｍｍｅｌｉ、Ｕ、に、）　２２７　Ｎａｔｕｒｅ　６ ８０１９７０）によってＰＴＨｍＲＮＡ含量を検量した。翻訳可能なＰＴＨｍＲ ＮＡを含む両分のＲＮＡはエタノール沈殿によって回収した。　ＰＴＨ＋＋＋Ｒ ＮＡを多量に含むこのＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成の為の鋳型にして、プライマーと してオリゴｄ（Ｔ）１８マーを、反応触媒として鳥筋原細胞腫ウィルス逆転写酵 素を用いた。マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）Ｆｒｉｔｓｃｈ　Ｅ、Ｆ 。

５ａｎｂｒｏｏｋ、Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｐｐ２３０− ２４３１９８２）　＊第一のＤＮＡ鎖の合成後に、ＲＮＡの鋳型をアルカリ加水 分解によって除去した。第２のｃＤＮＡ鎖は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフ レノウフラグメント存在下に、精製した第一のｃＤＮＡ鎖をインキュベートして 合成した（マニアナイス前出）。このインビトロ合成二本鎖ｃＤＮＡは、アスペ ルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）の−重鎖特異的 エンドヌクレアーゼＳ１の作用によって平滑末端にした（マニアナイス前出）。

この平滑末端ｃＤＮＡは、１５〜３０％のニュートラル蔗糖勾配によってサイズ 毎に分画した。各両分のサイズ分布は、マガロースゲル電気泳動で既知の［ｌＮ Ａ断片をマーカーにして検定した。約５００ｂｐより長いｃＤＮＡを含む両分を ストックし、ｃＤＮＡをエタノール沈殿によって集めた。

例２ ＰＴＨｃＤＮＡのブースミドＢＲ３２２へのクローニングと　Ｋ１２ＢＪ、５１ ８３の多　− 約２０塩基長のｄ　（Ｃ）テイルをｃＤＮＡの３′末端にターミナルデオキシヌ クレオチジルトランスフェラーゼによって付加した。（マニアナイス前出）この ｄ　（Ｃ）テイルが付加されたｃＤＮＡをＰｓｔ　Ｉで切断し、ｄ　（Ｇ）テイ ルが付加されたベクターｐＢＲ３２２にアニールさせ、作成された組み換えプラ スミドＤＮＡをハナハン（Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ）の方法（１６６、Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、　５５７−５８０１９８３）によって形質転換可能になった大腸菌に １２．Ｂ、Ｊ、５１８３細胞に形質転換した。得られた３３０００の形質転換株 がＰＴＨｃＤＮＡを含んでいることは、コロニーハイブリダイゼーション（Ｈａ ｎａｈａｎ、Ｄ、Ｍｅｓｅｌｓｏｎ　１０　Ｇｅｎｅ　６３１９８０）によって 検定した。

２〜３４個の形質転換株を、それぞれ８２■直径のニトロセルロースフィルター に直接にブレーティングによって接種し、テトラサイクリンを含む高栄養寒天プ レート上に置き、３７゛ｃで約０．１肺のコロニーが出現する迄インキュベート した。このフィルターに新しい２枚のフィルターを順次押しつけることによって それぞれのフィルターの２枚のレプリカを得た。このレプリカフィルターを新し いテトラサイクリンを含む寒天プレートの上に置き、約直径０．５膿のコロニー が出現するまで３７℃でインキュベートした。細菌のコロニーのマスターフィル ターは寒天プレート上に置き４°Ｃで保存し、２連のレプリカフィルターは寒天 プレートから引きはなして以下のコロニーハイブリダイゼーションの操作に供し た。

例３ えＰＴＨｃＤＮＡ　”　・　コロニーと　５ＳＨＰＴＨ−１０クローン如止肘１ それぞれのコロニーの細胞はその場でアルカリおよび塩化ナトリウム処理により こわされ、各々の細菌のクローンの有するＤＮＡが、露出された。フィルターを トリス緩衝液で中和し８０″Ｃで乾燥させることによってＤＮＡがフィルターに 結合する。ｍ胞の破片は６５°Ｃで、界面活性剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤ Ｓ）と塩化ナトリウムで洗浄することにより、はとんどが除去されたが、ＤＮＡ は細菌のコロニーがあった位置のフィルターに結合したままである。これらのフ ィルターを６ｘｓｓｃ液（０，９Ｍ　ＮａＣ１゜０．０９Ｍクエン酸ナトリウム ）、１×デンハルト液（０，１ｇ／ｍｉ！フィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．１ｇ ／−ポリビニルピロリドン、０．１ｇ／ｍｌ！ウシ血清アルブミン）　、１００ ｇ／ｉｆニシン精子ＤＮＡ、０．５％ＳＯ５，０，０５％ピロリン酸ナトリウム に３７°Ｃで２時間浸しており、（ウッズ（Ｗｏｏｄｓ、Ｄ、Ｅ、）　６　Ｆｏ ｃｕｓ　Ｎｏ、３．１９８４）ハイブリダイゼーションは、ｉｚｐ標識のＤＮＡ プローブが入っているハイブリダイゼーション液（６Ｘ５ＳＣ，Ｉ　Ｘデンハル ト液、２０ｇ＃＋ＮｔＲＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム）中で、４２° Ｃで１８時間かけて行った。（ウッズ前出） ハイブリダイゼーションのプローブとして使ったＤＮＡは、ヘンドリーら（前出 ）らによって報告されたヒトＰＴＨｃＤＮＡの配列から推定された２種類の異な る合成デオキシリボオリゴヌクレオチドのうちの１つである。１番目のフ゛ロー フ゛は、２４マーのオートコドン付近の配列に由来するものでありその配列はＴ ＡＣＴＡＴＧＧＡＣＧＴＴＴＴＣＴＧＴＡＣＣＧＡである。第２のオリゴヌクレ オチドは２４７−であり、終止コドンの３１ヌクレオチド下流に位置する制限酵 素Ｘｂａ　Ｔの切断部位をまたぐものであり、その配列はＣＴＣＡＡＧＡＣＧＡ ＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＡＴＣＣである。

”　Ｐ　−７−ＡＴＰの３２Ｐをオリゴヌクレオチドの５′末端にポリヌクレオ チドキナーゼの作用で結合させ標識した。（マキサム（Ｍａｘａｍ　Ａ、Ｍ、） 　Ｇ１１ｂｅｒｔ　Ｌ　６５．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　４９９１ ９８０）ハイブリダイズしたフィルターはオートラジオグラフィーの前に４２℃ で６ＸＳＳＣ１０，０５％ピロリン酸ナトリウム液中で洗浄した。二連のレプリ カフィルターの両方の写しにハイブリダイズしていることで判定してみたところ ６６個のクローンが両方のプローブにポジティブであることがわかった。ｃＤＮ Ａライブラリーがストックされているもとのフィルターからそれらを全て回収し て、−７０°Ｃで永久保存するために増殖させた。これらのうち６つをプラスミ ド調製用とエンドヌクレアーゼによる制限酵素地図の更に詳細な解析をするため に選んで調べたところ、開始コドンとＸｂａ　Ｉ部位の近接領域でそれぞれサイ ズが異なってきていることを除いては全てが全く同一のものであった。

例４ クローン５ＳＨＰＴＨ−１０ ｐＳＳＨＰＴＨ−１０クローンをマサキム・ギルバート法（前出）によるＤＮＡ の配列解析に供した０図６にｐｓｓＨＰＴＨ−１０の完全な構造が示しである。

このクローンは４３２ｂｐ長のＰＴＨｃＤＮＡの配列が、ｐＢＲ３２２のＰｓｔ Ｉ部位に挿入されており５′末端に２７のＧ／Ｃ塩基対か３′末端に１７のＧ／ Ｃ塩基対がある。図４にｐｓｓＨＰＴＨ−１０のｃＤＮＡ挿入部分の完全なりＮ Ａ配列が示しである。開始コドンのちょうど前１−５塩基対の欠失があることを 除いてはヘンドリー（前出）らのシーフェンスを同一であり、使用される開始コ ドンに先立つ、報告されている（ヘンドリーら前出）。開始−終止シグナル（Ａ ＴＧＴＧＡＡＧ）は、（下線部が欠失）、２重の開始シグナル（ＡＴＧＡＴＧ） に変わっていた。

例５ シャトルベク　−Ｌ４の ＨＰＴ）Ｉを酵母で発現させる計画が始まる以前に一般的な酵母発現ベクターの 一連のものが作成された。その１つがｐＬ４であり、以下に述べるように後に使 用してｐＳＳαＬＸ　５−　ＨＰＴＩ（を作成した。

ベッヂ（Ｂｅｇｇｓ　Ｊ、Ｄ）、Ｖｏｎ　Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ　Ｄ、Ｆｒ１ｉｓ 　Ｊ、Ｋｉｅｌｌａｎｄ　−Ｂｒａｎｄｔ　Ｍ、５ｔｅｎｄｅｒｕｐ、Ａらによ って作成されたプラスミドｐＪＤＢ２０７“マルチコピー酵母プラスミドベクタ ー”（Ｅｄｓ）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　（ １９８１）　Ａｌｆｒｅｄ　Ｂｅｎｚｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｎ　Ｖｏｌ、１６ ３８３−３９０）は、−ＪＧ的な発現ベクターのための基本に選んだ。

これは、ｐＢＲ３２２に由来するｐＡＴ１５３に酵母の２ミクロンＤＮＡのＥｃ ｏＲＩ断片が挿入されている。また、酵母のＬＥＬ１２遺伝子を持っている。ｐ ＪＤ２０７の酵母ｃｉｒ”細胞中でのコピー数は他のプラスミドに比較してはる かに多く、ａｉｒ″株での非選択培養後でもめずらしく安定である。

ベレフト（Ｐａｒｅｎｔ　Ｓ、Ａ、）ＦｅｎｉＩｌｏｒｅ　Ｃ，Ｍ、　Ｂｏｓｔ ｉａｎ　Ｋ、Ａ、　”発現用のベクターシステム、サツカロマイセス・セレビシ アエ（Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＮＡシークエンスの分析とクローニング″　１゜ｎ …紅　８３−１３８　（１９８５）　；エルバー）　（Ｅｒｈａｒｔ　Ｅ、）Ｈ ｏｌｌｅｎｂｅｒｇ　Ｃ，Ｐ、″サッカ０フイセス°セレビシアエ（Ｓａｃｃｈ ａｒｏｌＩｌｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２ミクロンＤＮＡ組み換えプ ラスミド上の欠損ＬＥＵ２の存在が高コピー数とキユアリングの原因である。” １５６　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　６２５　６３５（１９８３）　。

これらの特徴は選択マーカー遺伝子ＬＥＵ２　（またはＬＥｔ１２ｄと言う、ｄ は欠陥の頭文字）のプロモーターが部分的に弱くなっていることと関連があり、 エルハート（前出）、以下のプラスミド作成において変換されない。

ＡＤ旧プロモーターを含む１２６０塩基対のＥｃｏＲＩ　−Ａｖａ　ＩＩ断片を プラスミドｐＡＤ）１０４０から単離した。ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフ ラグメントと全ての４つのｄＮＴＰとの反応を完全に行わせた後にＢａｍＨＩリ ンカ−を付加してこの断片をｐＪＤＢ２０７の中にある唯一のＲａｍ）ｌ　１部 位にクローン化した。逆方向のプロモーターになっているプラスミドから１０５ ０塩基対のｓｐｈ　１断片（ｐＪＤＢ　２０７のｓｐｈ　１部位からプロモータ ー断片中のＳｐｈ　Ｉ部位に至る）を欠失させ、１つのＢａｎＨＩ部位のみを残 した。このプラスミドをｐＡＬＸｌと称した。

ｐＡＬＸ　ｌ中のβラクタマーゼ遺伝子中のＰｓｔ１部位を次に遺伝子を不活性 化させることなく欠失させた。ｐＡＬＸ　１をＰｓｔｌで完全に分解し、ヌクレ アーゼＳ１でＰｓｔ１部位を分解し、次にＰｖｕ　１とＢｇｌ　Ｉによって部分 的に分解した。同時にｐＵｃｌＢがらビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ　Ｊ、）　Ｍｅｓ ｓｉｎｇ　Ｊ、　１９．　Ｇｅｎｅ、　２５９．１９８２）　Ｐｓｔ　１部位を 含まない対応するβラクタマーゼ遺伝子の断片になる。Ｐｖｕ　Ｉ　ｒＢｇｌ　 Ｉの２５０塩基対の断片を単離した。これを部分分解したｐＡＬｘｌに結合させ た。単離されたアンピシリン耐性クローン全てのうち、βラクタマーゼ遺伝子は ｐｌＪｃ８断片と結合することにょっ特表千２−５０１１０８　（７） で、復帰していた。このプラスミドのことをｐＡＬＸ　２と称する。

ベルゲン（Ｂｅｒｇｅｎ　）大学のクレッペ（Ｋ、Ｋｌｅｐｐｅ）教授より以下 のオリゴヌクレオチドを購入し、ｐＡＬＸ　２のＢａｗｌ　１部位に挿入した。

適正な方向にプロモーターが入ったプラスミドを単離し、これをｐＡＬＸ　３と 称する。

最終的にｐＡＬＸ　３は旧ｎｄＩ［［で切断し再結合させることによってＨｉｎ ｄ　Ｉｎの４８０塩基対断片を欠失させた。このプラスミドをｐＡＬＸ　４と名 づけた。図７にｐＡＬＸ４の制限地図を示しである。

ｐＬ４はｐＡＬＸ　４由来のものでＡＤ）ＩＩのプロモーターが欠失している。

ｐＬ４は他のプロモーターの挿入用のものとして使われた。

ｐＡＬＸ　４をまずＢｇｌ　ＩＩと５ａｉｌで切断した。生じてきた接着末端を ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントと４つのｄＮＴＰによってうずめ て、再結合させた。この処理によってＡＤＨＩプロモーターが除去され、Ｂｇｌ 　ｍ部位を再び持つベクターｐＬ４が作成された。

例６ 出国■ 酵母の性フェロモン９Ｆαｌの遺伝子は初めてカージャン（Ｋｕｒｊａｎ、Ｊ、 ）とへルスコウィッ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、　１．）によってクローニングさ れた。

°゛酵母フェロモン遺伝子（ＭＦα）の構造；推定上のα因子前駆体には４つの タンデムコピーの成熟の因子が含まれる”３０並旦、９３３−９４３　（１９８ ２）。この文献に報告されている配列をもとに肝α１遺伝子を再クローニングし た。全酵母ＤＮＡをＹ２８８Ｃ株より得、ＥｃｏＲＩで切断し、この切断産物の うち１．６〜１．８ｋｄの範囲のサイズのものを調整用アガロースゲルから単離 した。これは次に脱リン酸化され、ＥｃｏＲＩで切断されたｐＢＲ３２２に結合 させ、大腸菌ＢＪ５１８３を形質転換するのに使われた。生じてきたクローンを 下記の構成の標識オリゴヌクレオチドでハイブリダイゼーションによって）ＩＦ α１遺伝子の挿入を調べた。

ＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡＡＧＣポジティブクローンより精製し てきたＤＮＡは、次に、プラスミドＤＮＡが調製されてきた大腸菌ＪＡ２２１を 形質転換するのに使われた。以下のプラスミドに使われたプラスミドすなわちｐ ＭＦα１−１は図８に示しである。

ＰＭＦα−１はＥｅｏＲＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメ ントと４つのｄＮＴＰと反応させ、フェノール抽出を行いＢｇｌ　Ｉｆで切断し た。１．７ｋｂの肝α１遺伝子をアガロースゲルから単離した。酵母シャトルベ クターにこれを挿入する前に、ｐＬ４の旧ｎｄＩ１１部位をＨｉｎｄＩＩＩによ る分解によって除去し、フレノウフラグメントでのうめあわせ反応と、再結合に よってｐＬ５シャトルベクターを作成した。ｐＬ５はＢａＩＩＨＩが切断され、 ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントと４つのｄＮＴＤによってうめあ わせ、フェノール抽出をし、Ｂｇｌ　ＩＩで切断した。ゲルで精製した後にこれ をＭＦα１の断片と結合させ、図８に示しであるような発現ベクターｐαＬＸ５ を作成した。

例７ ＳＳｃｒＬＸ５−ＨＰＴＨ１（７）　ｊ＠ｐｓｓＨＰＴＨ−１０プラスミドから の２８８塩基対のＢｇｌ　Ｉｔ、Ｘｂａ　Ｉ断片を単離しＰＯＣｌ２にそのベク ターのＢａｍＨＩとＸｂａ　Ｉ部位を用いてサブクローニングした。このｐｔｌ ｃ−）ＩＰＴＦＩと名づけられたサブクローンをＤｐｎ　Ｉで切断し最大の断片 を単離した。この断片をＳａｌ　ｌで切断し、Ｓａｌ　ｌ切断の方は接着末端に Ｄｐｎ　ｌ切断の方は平滑末端になっている、２つの生成断片のうち小さい方を 単離した。

ｐαＬＸ５を旧ｎｄＩＩｌで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメ ントと４つのｄＮＴＰでのうめあわせ反応をし、フェノール抽出を行い、Ｓａｌ 　１での切断を行った。ゲルから精製後、これを上述のＨＰＴ）Ｉ断片に結合し た。このり°ローンはリーディングフレームが適正となるように旧ｎｄｌＩ［部 位が再生されている。

このプラスミドをｐＳＳαＬＸ　５−ＨＰＴＨ１と称し、図９に示しである。肝 α１−ＨＰＴＨ融合遺伝子の配列は図５に示しである。

例８ −　にお番るＨＰＴＨの　とゝパ・ 酵母株ＰＬ２００（ｃｒ、　Ｕｒａ３．　Ｌｅｕ２）を、プラスミドｐαＬＸ５ とｐＳＳαＬＸ　５−　ＨＰＴ）Ｉ　ｌで、スフェロプラスト法で形質転換させ た。

それぞれのうち１つの形質転換株をＬｅｕ−の培地で成育させ、細胞を含まない 培養液を５ＯＳ−ＰＡＧＥ銀染色で調べた。（図１２）ｐＳＳαＬＸ　５−　Ｈ ＰＴＨ１の形質転換株の培地には２つの大量のバンドがあったが、ｐαＬＸ５の 形質転換株培養液にはなかった。１分子量に対応し、他のバンドは約１６０００ ダルトンであり、プロセンシングを受けていない肝α１−）ＩＰＴＨ融合産物に 対応するものであろう。両ポリペプチド共に生来のホルモンと同一の態様で抗ヒ ）　ＰＴＨ抗体と反応した。

以上の例は、例証により示されているが、本発明はこれに制限されるわけではな い。以上の例はヒト副甲状腺ホルモンを生産、分泌するサツカロマイセス・セレ ビシアエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の開発を目的としたものだが、本発明の 方法は、どの種の副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミドを作成 するのにも応用され得よう。更にこのプラスミドはどの種の酵母にも挿入され得 よう。故に本発明はサツカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ）に制限されない。

本発明の酵母が生産した、クローン化ヒト副甲状腺ホルモンには既知の、又は潜 在的可能性のある、様々な使用法がある。

例えば、最近の医学理論によると、ヒト副甲状腺ホルモンは骨粗ｒ症の治療に非 常に効果的であるらしい。遺伝子工学的に作成された副甲状腺ホルモンはヒトや 動物の副甲状腺ホルモンレベルを測る分析キットについても利用価値があろう。

ヒト副甲状腺ホルモンやその断片は減少性又は病理的血中カルシウムレベル異常 を示すヒトや動物の治療にも使えるであろう。

遺伝子工学的に作られた副甲状腺ホルモンが例えば本発明の結果として大量に入 手可能になると、数多くの他の使用法の開発が期待される。

本発明は特定の好適具体例を参照しつつ記載したが、その応用は当業者に明白な ので、本発明は上記具体例に限定されない。

人ＴＧ八へＨＣＣＮＧＣＮＡＡＲＧＡＹ入τにＧ（ＮＡＡＲＧＴＮＡτＧλＴＨ Ｇ）ＮＡＴＧＹτＮＧＣＮ入ＴｇτＧＹτＴＹＹτＮ７０　ＣＯ１１０ ＡＣＮλλＲＷＳＮＧ、ＡＹＧＧＮＡＡＲＷＳＮＧＴＮＡＡＲＡ入Ｒ１’、ＧＮ ＷＳＮＧτ９ＷＳＮＧ入ＲＡτＨ（λＲＹτＮＡＴＧＣＡＹ人ＡＹＹＴＮＧＧＮ 入ＡＲＣＡＹＹＴＮ入入Ｙ贅ＳＮ入τにＧＡＲＭＧＮＧ）ＮＧλＲＴＧＧＹτＮ ＭＧＮ入λＨＡλＲＹＴＮＣ入ＲＧＡＹＧＴＮＣ入ＹλλＹττ”Ｇ’：’ＮＧ ＣＮＹＴＮＧＧＮＧ（ＮＣＣＮＹＴＮＧＣＮＣＣＮＭＧＮＧλＹＧＣＮＧＧＮ讐 ＳＮＣ入Ｒ２５０’　２７０　２９０ ＭＧＮＣＣＮＭＧＮＡＡＲＡＡＲＧＡＲＧλＹ入入ＹＧＴＮＹτＮＧτＮＧＡＲ ＷＳＮＣＡＹＧＡＲ入ＡＲＷＳＮＹτＮＧＧＮＧλＲコ１０　３コ０ ＧＣＮＧＡ”ＡＡＲＧＣＮＧＡＹＧＴＮＡＡＹＧＴＮＹＴＮＡＣＮ入ＡＲＧＣＮ 入ＡＲＷＳＮＣλＲＴ！’ＩＲＨ雪入ｏ【Ｃ Ｒ露　Ａ　ｏｒ　Ｇ ｗ諺入口【Ｔ Ｓ冨Ｃｏｒ　Ｇ Ｙ　ｍ　Ｃｏｒで Ｈｍ　Ａ　ｏｒ　Ｃｏ：　Ｔ Ｎ　冨　Ａ　ｏｒ　Ｇ　ｏｒ　Ｃｏｒ　Ｔ。

Ｆ工ＧＬＩＲＥ　１ 人ＴＣλＴＧＡＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＡＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＴＴＡＴＧ ＡＴＴＧＴＣＡＴＧττＧＧＣ入ＡＴＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＣＡＡＡＡＴＣＧ ＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＣＴＧＴＴＡＡＧＡＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＧＡＧＴＧＡＡ ＡＴＡＣＡＧＣＴ”ＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＣＧ入ＡＡＡＡＡＧＧ入λＧＡＧ λ入ＴＧＴＣττＧＧＴＴＧＡＧＡＧＣＣＡＴＧＡλ人入λＡＧＴＣＴτＧＧλ Ｆ工ＧＵＰ、Ｅ　２ ＡＣＡＧＡＴ入ττＧＴＣλＧ入ＧＴＴＣτＧＣＴＣτ入ＧＡ（ＡＧＴＧＴＡＧ ＧＧＣＡＡＣλＡτＡＣλＴＣＣτＧＣτＡＡττＣＡＡＡＧＣＴＣτλττ入 Ｍ−人ｏｒ　Ｃ Ｒ雪Ａ　０＋”　Ｇ 誓璽Ａｏｒで Ｓ　Ｗ　ＣＯｒ　？ Ｙ冨Ｃｏ【で Ｈ−人Ｏｒ　（Ｏｒ　Ｔ ・Ｎ　ｍ　Ａ　ｏｒ　Ｇ　ｏｒ　Ｃｏｒ　？。

Ｆ工ＧＵＲＥ　３ ＡＡＡＧＣＴＣτ入τＴＡ。

ＦＩＧＵＲＥ　ａ １０　コ０　５０ ＡＣＡＧ八τＡＴＴＧＴＣＡＧλＧＴＴＣＴＧＣ’ｒＣＴＡＧＡ（ＡＧＴＧτλ ＧＧＧＣ入ＡＣＡＡＴＡＣλＴＧＣＴＧ（’ｒ入ＡττＣ゛入λＡＧＣＴＣＴＡ ττＡ。

罷３ハ ＦＩＧＵＲＥ　６ ＦＩＧＵＲＥ　７ Ｆ工ＧＵＲＥ　１０ 人ＲＧ入ＲＧＡＹλＡＹＧＴＮＹフＮＧτＮＧ入ＲＷＳＮＣＡＭＧλＲＡＡＲＷ ＳＮＹτＮＧＧＮＧＡＲＧＣＮＧＡＹ入ＡＦＩＧＣＮＧＴτＴ？ＣＡＴＴ’：” ＣＴＣＣＧＴＡＡＡ（入λＣＣＴＧ’：″：Ｔ”：ＣＣＣλτＧでＡＡＴ入ＴＣ ＣτＴττＣＴＡＴＴＴＴＴＣＧＴsＴ ＣＧττＡＣＣＡＡＣＴττλＣ入ＣＡＴＡＣＴＴ’：入τＡＴＡＧＣＴＡ？、 讐ｈｅｒｅｉｎＦ工ＧＵＲＥ　１０　（Ｃｏｎｔ、） Ｆ工ＧＵＲＥ　１１ ττＴＴＣＡＴＴフＣτＣＣＧフＡＡＡＣＡＡＣＣτＧＴＴＴＴＣＣＣＡＴＧτ 入ＡＴλτＣＣττττＣτ入ττＴττＣＧτττＦＩＧＵＲ三　１１　（Ｃ ｏｎ；、） 国際調査報告 ｌｍａｍｌｍ−＾−−に一−Ｉｅ、ｐｃ＝７＝ｐ　８７１００５８１国際調査報 告 ＥＰ　８７００５８１ ＳＡ　１９１０２

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）への挿入用プラスミドであって、ヒト副甲状腺ホル モンをコードするヌクレオチド配列からなり、このヌクレオチド配列の５′末端 に２重の開始コドンを持つプラスミド。
2. ２．上記配列が下記よりなる請求項１のプラスミド。 【配列があります】（ここで Ｍ＝Ａ又はＣ Ｒ＝Ａ又はＧ Ｗ＝Ａ又はＴ Ｓ＝Ｃ又はＧ Ｙ＝Ｃ又はＴ Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ Ｎ＝Ａ又はＧ又はＣ又はＴ。）
3. ３．ヌクレオチド配列が下記よりなる請求項２のプラスミド。 【配列があります】（ここで Ｍ＝Ａ又はＣ Ｒ＝Ａ又はＧ Ｗ＝Ａ又はＴ Ｓ＝Ｃ又はＴ Ｙ＝Ｃ又はＴ Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ Ｎ＝Ａ又はＣ又はＣ又はＴ。）
4. ４．ヌクレオチド配列が下記よりなる請求項２のプラスミド。 【配列があります】
5. ５．ヌクレオチド配列が下記よりなる請求項３のプラスミド。 【配列があります】
6. ６．請求項１のプラスミドを持つ微生物。
7. ７．その微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．）である請求項 ６の微生物。
8. ８．請求項２のプラスミドを持つ微生物。
9. ９．微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．）である請求項８の 微生物。
10. １０．請求項３のプラスミドを持つ微生物。
11. １１．微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．）である請求項１ ０の微生物。
12. １２．請求項４のプラスミドを持つ微生物。
13. １３．微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．）である請求項１ ２の微生物。
14. １４．請求項５のプラスミドを持つ微生物。
15. １５．微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．）である請求項１ ４の微生物。
16. １６．請求項１のプラスミドを作成する方法。
17. １７．請求項６の微生物を作成する方法。
18. １８．副甲状腺ホルモンをコードするヌクレオチド配列からなる酵母への挿入用 プラスミド。
19. １９．その副甲状腺ホルモンはヒト副甲状腺ホルモンである請求項１８のプラス ミド。
20. ２０．そのヌクレオチド配列が下記よりなる請求項１９のプラスミ【配列があり ます】（ここで Ｍ＝Ａ又はＣ Ｒ＝Ａ又はＧ Ｗ＝Ａ又はＴ Ｓ＝Ｃ又はＧ Ｙ＝Ｃ又はＴ Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ Ｎ＝Ａ又はＧ又はＣ又はＴ）。
21. ２１．ヌクレオチド配列が下記よりなる請求項２０のプラスミド。 【配列があります】
22. ２２．請求項１８のプラスミドを持つ微生物。
23. ２３．請求項１９のプラスミドを持つ微生物。
24. ２４．微生物が酵母である請求項２２の微生物。
25. ２５．酵母がサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項２４の酵母。
26. ２６．微生物が酵母である請求項２３の微生物。
27. ２７．酵母がサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項２６の酵母。
28. ２８．請求項１８のプラスミドを作成する方法。
29. ２９．請求項２２の微生物を作成する方法。