JP2781459B2 - ヒト血清アルブミンのｎ―末端フラグメント含有融合蛋白質 - Google Patents

ヒト血清アルブミンのｎ―末端フラグメント含有融合蛋白質

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、２つの個々のポリペプチドまたはそれらの
部分が融合して単一のアミノ酸鎖を生成した融合ポリペ
プチドに関する。このような融合は、組換えDNA技術に
よって形成された単一の連続コード配列の発現によって
生じる。
融合ポリペプチドとしては、たとえば、その方法の最
終的な所望生成物が、細胞からのそのポリペプチドの分
泌を促進または可能にするＮ−末端「リーダー配列」と
ともに発現した場合のポリペプチドが知られている。そ
の例は、EP−Ａ−116 201（Chiron）に開示されてい
る。
ヒト血清アルブミン（HSA）は血液中に見出される既
知の蛋白質である。EP−Ａ−147 198（Delta Biotechn
ology）は、形質転換宿主、この場合は酵母中でのその
発現を開示している。本発明者らの以前の出願、EP−Ａ
−322 094には、HSAのＮ−末端フラグメント、すなわ
ち、治療的利用性を有する、残基１〜ｎ（ｎは369〜419
である）からなるフラグメントが開示されている。この
出願はまた、このような分子のＣ−末端残基を、とくに
名指しされてはいないが、他のポリペプチドに融合する
ことの可能性について触れている。
本発明の一態様は融合ポリペプチドを提供するもので
ある。この融合ポリペプチドは、そのＮ−末端部分の少
なくとも一部として、HSAのＮ−末端部分またはその変
異体と、そのＣ−末端部分の少なくと一部として、それ
を除く他のポリペプチドからなる融合ポリペプチドを提
供する。HSAの上記Ｎ−末端部分が１〜ｎ部分（ｎは369
〜419である）またはその変異体である場合には、上記
ポリペプチドは（ａ）ヒトフィブロネクチンの585〜157
8部分もしくはその変異体、（ｂ）CD4の１〜368部分も
しくはその変異体、（ｃ）血小板由来成長因子もしくは
その変異体、（ｄ）形質転換成長因子もしくはその変異
体、（ｅ）成熟ヒト血漿フィブロネクチンの１〜261部
分もしくはその変異体、（ｆ）成熟ヒト血漿フィブロネ
クチンの278〜578部分もしくはその変異体、（ｇ）成熟
ヒトフォン・ビルブラント因子の１〜272部分もしくは
その変異体、または（ｈ）α−１−抗トリプシンもしく
はその変異体である。
HSAのＮ−末端部分は、好ましくは、上記１〜ｎ部
分、１〜177部分（システインまでそれを含めて）、１
〜200部分（システインまで、ただしそれを除く）、ま
たは１〜177および１〜200の中間部分である。
「ヒト血清アルブミン」（HSA）の語は、HSAの既知の
またはまだ発見されていない多形型を包含する（必ずし
もそれに限定されるものではない）。たとえば、アルブ
ミンNaskapiはGlu−372の代わりにLys−372を有し、ま
たプロ−アルブミンChristchurchは変化したプロ−配列
をもっている。「変異体」の語は、配列における微小な
人工的変異、たとえば、１個もしくは２、３個の残基が
欠失した分子、保存的置換もしくは残基の微小な挿入を
有する分子、またはアミノ酸構造のわずかな変化を有す
る分子、を包含することを意味する。すなわち、HSAの
等価の長さと80％、85％、90％、95％または99％の相同
性を有するポリペプチドが「変異体」とみなされる。こ
のような変異体はまた、生理学的にHSAと同様である。
すなわち、変異体はHSAと少なくとも１種の薬理学的活
性を共有する。さらに、薬理学的使用が意図される変異
体候補は、処理すべき動物、とくにヒト、に対して非免
疫原性でなければならない。
保存的置換とは、１種または２種以上のアミノ酸が類
似の性質を有する他のアミノ酸に置換された置換であっ
て、ポリペプチド化学における熟練者であればそのポリ
ペプチドの少なくとも二次構造、好ましくは三次構造に
実質的な変化を生じないことが予期できるような置換を
いう。たとえば、典型的なこのような置換の例には、グ
ルタミンのアスパラギンへの、アスラギンのセリンへ
の、またリジンのアルギニンへの置換がある。変異体は
また、あるいは同時に、相当する天然HSA部分に対比し
て10個まで（好ましくは１個または２個のみ）の中間ア
ミノ酸残基（上記HSAのＮ−末端部分の末端ではない）
を欠失していてもよく、このような脱落は分子（成熟HS
A自体に関して）100から369までの部分（存在すれば）
に生じることが好ましい。同様に、10個まで、ただし好
ましくは１個または２個のみのアミノ酸が付加されてい
てもよい。この場合も、付加は100から369までの部分
（存在すれば）に生じることが好ましい。「生理機能的
に均等な」の語はまた、上記配列に加えてさらにＮ−末
端における他の配列（たとえばプロ−HSA、プレ−プロH
SAおよびmet−HSA）からなるより大きな分子も包含す
る。
当然ではあるが、本発明の融合化合物中の上記「他の
ポリペプチド」がHSAの残余部分であることはない。そ
うでないと、全体のポリペプチドがHSAになってしま
い、「融合ポリペプチド」ではなくなるからである。
HSA様部分が上述のHSAの１〜ｎ部分でない場合でも、
非HSA部分は上述の（ａ）〜（ｈ）の実体の一つである
ことが好ましい。
CD4の１〜368部分は、ヒトＴリンパ球CD4蛋白質の最
初の４個のジスルフィド連結免疫グロブリン様ドメイン
であり、そのアミノ酸配列についての遺伝子はD.Smith
らによって開示されている（Science,328:1704〜1707、
1987）。これはHIV感染の撲滅に用いられる。
ヒト血小板由来成長因子（PDGF）は、Collinsら:Natu
re,316:748〜750（1985）に記載されている。同様に、
形質転換成長因子β（TGF−β）の配列は、Derynckら:N
ature,316:701〜705（1985）に記載されている。これら
の成長因子は創傷治癒に有用である。
Fnの１〜261部分のcDNA配列はEP−Ａ−207 751に開
示されている（プラスミドpFH6からエンドヌクレアーゼ
Pvu IIによって得られる）。この部分はフィブリンに結
合し、融合化合物を血餅に向けさせるのに用いられる。
コラーゲン結合ドメインを含有するFnの278〜578部分
のcDNA配列は、R.J.Owens ＆ F.E.Baralleにより1986
年、EMBO J.５、2825〜2830に開示されている。この部
分は血小板に結合する。
フォン・ビラブランド因子の１〜272部分は第VIII因
子に結合して、それを安定化する。その配列はBontham
ら:Nucl.Acids Res.14、7125〜7127に報告されている。
α−１−抗トリプシンの変異体にはRosenburgら（Nat
ure,312、77〜80、1984）によって開示された変異体が
包含される。とくに、本発明はビッツバーグ変異体（Me
t358がArgに変異している）およびPro357とMet358がそ
れぞれアラニンおよびアルギニンに変異した変異株を包
含する。これらの化合物は、細菌性ショックや肺疾患の
処置に有用である。
本発明のポリペプチドの非−HSA部分の変異体には、H
SA部分について上述したような変異体を包含し、たとえ
ば保存的アミノ酸置換を有する変異体、また他の種から
の相同体がある。
本発明の融合ポリペプチドは、HSAのＮ−末端部分に
相当する部分を越えて広がるＮ−末端アミノ酸をもって
いてもよい。たとえば、HSA様部分が成熟HSAのＮ−末端
部分に相当する場合には、それにプレ、プロまたはプレ
−プロ配列、たとえば酵母のα−因子リーダー配列が付
加されていてもよい。WO 90/01063号の融合リーダー部
分が使用できる。HSA部分に融合したポリペプチドは、
天然に存在するポリペプチド、そのフラグメントまたは
融合ポリペプチドを含めた新規なポリペプチドであって
もよい。たとえば、以下の例３におけるように、フィブ
ロネクチンのフラグメントを４アミノ酸リンカーを介し
てHSAに融合される。
HSA分子のアミノ末端部分は、真核細胞中で、本発明
の融合化合物のとくに効率的なトランスロケーションお
よび排出に有利な構造をもつことが明らかにされてい
る。
本発明はその第２の態様として、上述の融合ポリペプ
チドの発現に適するように配置された核酸配列を有する
形質転換宿主を提供する。「適するように配置された」
の語は、たとえば、ヌクレオチド配列が適当なRNAポリ
メラーゼ結合部位と翻訳開始配列をもって正しい読み取
り枠で、また適当なプロモーターの制御下にあることを
意味する。プロモーターは宿主に関して同種でも異種で
もよい。既知のように、所望によって下流（３′）調節
配列が包含されていてもよい。宿主としては、酵母〔た
とえば、Saccharomyces族たとえばS.cerevisiae；Kluyv
eromyces属たとえばK.lactis；Pichia属；またはSchizo
saccharomyes属たとえばS.pombe〕が好ましいが、他の
任意の適当な宿主、たとえばE.coli，B.subtilis，Aspe
rgillus属、哺乳動物細胞、植物細胞または昆虫細胞で
あってもよい。
本発明の第三の態様は、本発明の第二の態様の形質転
換細胞を培養し、ついで融合ポリペプチドを有用な形で
分離することによる、本発明の第一の態様の融合ポリペ
プチドの製造方法を提供する。
本発明の第四の態様は、上述の融合ポリペプチドを投
与することからなる、ヒトまたは他の動物の生体の治療
的処置方法を提供する。
本発明の方法は、とくに、酵母からの有用なヒト蛋白
質の分泌効率を改善することに関し、通常は効率的には
分泌されないこれらの蛋白質をHSAのアミノ末端部分に
融合するとの着想に基づくものである。この種の蛋白質
の一つとして、有用な創傷治癒ポリペプチドとしての価
値が考えられるヒトフィブロネクチンのアミノ酸585〜1
578（本明細書ではFn585〜1578と呼ぶ）がある。本発明
者らが別出願（同日付出願）に記載しているように、こ
の分子は、創傷治癒に有用な細胞拡散活性、化学走化活
性および化学動力学活性を有する。Ｃ−末端部分がFn58
5〜1578である本発明の融合ポリペプチドは、とくにハ
イブリッドヒト蛋白質が局所的に適用される場合、生合
成されたまま、創傷治癒の適用に使用できる。しかしな
がら、ヒトフィブロネクチンのアミノ酸585〜1578の部
分は所望により、Ｘ因子切断部位からなるアミノ酸をフ
ィブロネクチン部分の最初のアミノ酸に先行されること
によって、融合蛋白質から回収することができる。培養
上清から融合蛋白質を単離したのち、所望の分子をＸ因
子切断によって遊離させ、適当なクロマトグラフィー
（たとえばイオン交換クロマトグラフィー）によって精
製する。酵素的または化学的切断が可能な他の部位は、
Ｎ−末端とＣ−末端部分の適当な並置またはその間への
適当なリンカーの挿入によって提供することができる。
本発明の融合ポリペプチドの少なくとも一部、とくに
上記CD4およびvWFフラグメント、PDGFならびにα1ATを
包含する融合ポリペプチドでは、血中での半減期が増大
し、したがって、それ自体の利点および治療的有用性、
すなわち分子の非HSA部分の治療的有用性が増す。α1AT
等の場合、化合物は通常、１回限りまたは短期間に数回
のみしか投与されず、長期にわたって使用されることは
ないので、これらの化合物が免疫応答を生じる可能性は
小さい。
約：要約 標準的な組換えDNA操作は、とくに指示しない限り、M
aniatisら（1982年刊および最近の第２版）によって記
載された通りとした。ファージM13組換えクローンの構
築および分析はMessing（1983）およびSangerら（197
7）の記載によった。
以下の分子の構築に使用されるヒト血清アルブミンの
蛋白質をコードするDNA配列は、プラスミドmHOB12およ
びpDB2（EP−Ａ−322 094、Delta Biotechnology Lt
d、その関連部分は以下に再掲する）から、またはこの
配列の部分に均等なオリゴヌクレオチドの合成により、
誘導される。血漿フィブロネクチンをコードする完全ヒ
トcDNAを含有するプラスミドpFHDEL1は、プラスミドpFH
6、15、54、154および１（EP−Ａ−207 751;Delta Bio
technology Ltd）に由来するDNAのリゲーションによっ
て得られた。
このDNAは‘ED'配列を含まないmRNA変異体の一列であ
り、III−CS領域の89−アミノ酸変異を有する（R.J.Owe
ns,A.R.Korn−blihtt ＆ F.E.Baralle:Oxford Surveys
on Eukaryotic Gene ３、141〜160、1986）。このベク
ターの地図は図11に、このcDNAの発現によって産生され
る成熟ポリペプチドの蛋白質配列は図５に示されてい
る。
オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems380Bオリ
ゴヌクレオチドシンセサイザーにより、製造業者の推奨
に従って合成した（Applied Biosystems,Warrington,Ch
eshire,UK）。
HSA分泌シグナルと387番目のアミノ酸、ロイシンまで
（これを含む）をコードするDNAが、ヒトフィブロネク
チンのアミノ酸585〜1578（前後を含む）セグメントを
コードするDNAとインフレームに融合し、Saccharomyces
cerevisiaeで機能する高度に効率的なガラクトース誘
導可能プロモーターであるEP−Ａ−258 067（Delta Bi
otechnology）のハイブリッドプロモーターの下流に配
置された発現ベクターを構築した。ヒトフィブロネクチ
ンの第1578番目のアミノ酸のコドンは直接、停止コドン
（TAA）、ついでS.cerevisiaeホスホグリセレートキナ
ーゼ（PGK）遺伝子転換ターミネーターに続いていた。
このベクターを次にS.cerevisiaeに形質転換によって導
入して、HSAのＮ−末端の387個のアミノ酸がＣ末端で、
ヒトフィブロネクチンのアミノ酸585〜1578に融合した
ハイブリッド分子を発現させ、細胞から分泌させた。
第二の例では、HSAのＮ−末端の195個のアミノ酸がＣ
末端で、ヒトフィブロネクチンのアミノ酸585〜1578に
融合したハイブリッド分子のS.cerevisiaeからの分泌を
可能にする類似のベクターが構築される。
本発明の態様を、以下に例を挙げ、添付の図面を参照
しながら説明する。図中、 図１（２頁）は、現在最も代表的と考えられる天然HS
Aのアミノ酸配列を示し〔HSA（１−ｎ）の選択可能なＣ
末端を四角で囲んである〕、 図２（２頁）は成熟HSAをコードするDNA配列であり
（リンカー３に含まれる配列は下線を付してある）、 図３は、mHOB16の構築を図式的に例示した図であり、 図４は、pHOB31の構築を図式的に例示した図であり、 図５（６頁）はFnプラスミドpFHDEL1でコードされる
成熟蛋白質配列を例示し、 図６は、リンカー５を例示し、８個の構成要素オリゴ
ヌクレオチドが示されていて、 図７は、プラスミドpDBDF2の構築を図式的に示し、 図８は、プラスミドpDBDF5の構築を図式的に示し、 図９は、プラスミドpDBDF9の構築を図式的に示し、 図10は、プラスミドpFHDEL1を用いたプラスミドDBDF1
2の構築を図式的に示し、 図11は、プラスミドpFHDEL1の地図を示す。
例1:Fn585〜1578に融合したHSA1〜387 以下は、EP−Ａ−322 094に開示されている、HSAの
部分をコードする配列からなるプラスミドの製造の説明
である。
以下の分子の構築に用いられるヒト血清アルブミンを
コードする配列は、プラスミドM13mp19.7（EP−Ａ−201
239,Delta Biothechnology Ltd.）から、またはこの
配列の一部に相当するオリゴヌクレオチドの合成により
誘導される。オリゴヌクレオチドはApplied Biosystems
380Bオリゴヌクレオチドシンセサイザーにより、製造
業者の推奨に従って（AB Inc,Warrington,Cheshire,Eng
land）、ホスホルアミダイト化学を用いて合成された。
既知のHSAコード配列（図２）のPst I部位（図２、12
35〜1240）から、コドンがGTGからGTCへ変化されたバリ
ン381までのコドンまでの部分であるオリゴヌクレオチ
ドが合成された（リンカーＡ）。
リンカー１ リンカー１を、予めPst IとHinc IIで消化したベクタ
ーM13mp19（Norranderら、1983）にリゲートし、このリ
ゲーション混合物を用いて大腸菌XL1−Blue株（Stratag
ene Cloning Systems,San Diego,CA）をトランスフェク
トした。組換えクローンは、IPTG（イソプロピルチオ−
β−ガラクトシド）の存在下、色素生成指示薬Ｘ−gal
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−
ガラクトシド）を含有するメジウム上で青色を呈しない
ことにより同定された。組換えクローンのバクテリオフ
ァージ粒子から調製された鋳型DNAのDNA配列分析によ
り、必要なDNA配列をもつ分子が同定され、mHOB12と命
名された（図３）。
M13mp19.7は、M13mp19（Norranderら、1983）中の成
熟HSAのコード領域からなり、HSAの最初のアミノ酸のコ
ドン、GATが唯一のXho I部位と次のように重複している
（EP−Ａ−210 239）。
M13mp19.7はXho Iで消化し、S1−ヌクレアーゼ処理し
てブランド末端を作成し、ついで以下のオリゴクレオチ
ド（リンカー２）とリゲートした。
リンカー２ 次にこのリゲーション混合物を用いて大腸菌XL1−Blu
eをトランスフェクトし、数個のプラークから鋳型DNAを
調製し、ついでDNA配列決定によって分析して、正しい
配列を有するクローン、pDBD1（図３）を同定した。
HSAコード領域の５′末端の挿入オリゴマヌクレオチ
ドリンカーの半分に相当する1.1kbのHind III〜Pst Iフ
ラグメントをpDBD1からアガロースゲル電気泳動によっ
て単離した。このフラグメントを次に、予めHind IIIと
Pst Iで消化した二本鎖mHOB12にリゲートし、ついでこ
のリゲーション混合物を用いて大腸菌XL1−Blueをトラ
ンスフェクトした。数個のプラークの成熟バクテリオフ
ァージ粒子から一本鎖の鋳型DNAを作成した。DNAを、ア
ニーリングしたシクエンシングプライマーから、デオキ
シヌクレオシド三リン酸の存在下DNAポリメラーゼＩの
クレノウフラグメントによる延長で、in vitroにおい
て二本鎖とした。このDNAの制限酵素分析により、正し
いコンフィギュレーションをもつクーロン、mHOB15（図
３）の同定が可能となった。
以下のオリゴヌクレオチド（リンカー３）は、成熟HS
Aの382番目のアミノ酸（グルタミン酸、GAA）のコドン
からリジン389のコドンまでに相当し、これに停止コド
ン（TAA）およびHind III部位、ついでBamH I付着端に
続いている。
リンカー３ これを、予めHinc IIとBamH Iで消化した二本鎖mHOB1
5にリゲートした。リゲーション後、DNAをHinc IIで消
化してすべての非組換え分子を破壊し、次にこれを用い
て大腸菌XL1−Blueをトランスフェクトした。多数のク
ローンのバクテリオファージ粒子から一本鎖DNAを作成
し、DNA配列分析に付した。正しDNA配列を有する一つの
クローンをmHOB16（図３）と命名した。
成熟HSAコード領域がHSA分泌シグナルに融合した分子
は、BamH IおよびXho I消化M13mp19.7にリンカー４を挿
入して、pDBD2（図４）を形成させることにより作成し
た。
リンカー４ このリンカー中、最初のメチオンの後の４番目のアミ
ノ酸のコドン、HSAプレ−プロリーダー配列（Lawnら、1
981）中スレオニンのACCはセリンのAGCに変化してい
て、Hind III部位を形成している。
既知のHSAコード配列の部分（Lawnら、1981）（アミ
ノ酸382〜387、図２）が既知のフィブロネクチンコード
配列の部分（Korn−blihttら、1985）（アミノ酸585〜6
40、図２）に融合した合成DNA配列は、６個のオリゴヌ
クレオチドの合成により製造した（リンカー５、図
６）、オリゴヌクレオチド２、３、４、６、７および８
を、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、
ついでオリゴヌクレオチドを対にして、すなわち１＋
８、２＋７、３＋６および４＋５を基準条件下にアニー
リングされたオリゴヌクレオチドを次に一緒に混合し
て、予め制限酵素Hinc IIおよびEcoR Iで消化したmHOB1
2とリゲートした。ついて、リゲーション混合物を用い
て大腸菌XL1−Blue（Stratagene Cloning Systems,San
Diego,CA）にトランフェクトした。次に、数個の独立の
プラークに由来する成熟バクテリオファージ粒子から一
本鎖鋳型DNAを調製し、ついでDNAシクエンシングによっ
て分析した。期待された配列のリンカーがベクターに正
しく挿入されたクローンをpDBDF1（図７）と命名した。
このプラスミドを次にPst IおよびEcoR Iで消化し、約
0.24kbのフラグメントを精製し、pDBD2（図７）の1.29k
b BamH I−Pst IフラグメントおよびBamH I＋EcoR I消
化pUC19（Yanisch−Perronら、1985）とリゲートして、
pDBDF2（図７）を形成させた。
全長ヒトフィブロネクチンをコードするDNA配列を含
むプラスミド、pFHDEL1をEcoR IおよびXho Iで消化し、
0.77kbEcoR I−Xho Iフラグメント（図８）を単離し、
ついでEcoR IとSal Iで消化したM13mp18（Norrander
ら、1983）とリゲートして、pDBDF3（図８）を形成させ
た。
EP−Ａ−207 751のフィブロネクチン配列の4784〜47
91におけるPst I部位からチロシン1578のコドン（図
５）に相当し、これに続いて停止コドン（TAA）、Hind
III部位、ついでBamH I付着端を有する以下のオリゴヌ
クレオチドリンカー（リンカー６）を合成した。
リンカー６ このリンカーを次に、Pst IおよびHind III消化pDBDF
3とリゲートしてpDBDF4（図８）を生成させた。つい
で、以下のDNAフラグメント、すなわちpDBDF4の0.68kb
EcoR I−BamH Iフラグメント、pDBDF2の1.5kb BamH
I−Stu IフラグメントおよびpFHDEL1の2.2kb Stu I−E
coR Iフラグメントを、図８に示すように、Bg1 II消化p
KV50（EP−Ａ−258 067）と一緒にリゲートさせた。得
られたプラスミドpDBDF5（図８）は、成熟HSAのアミノ
酸１〜387をコードするDNAに融合したHSA分泌シグナル
の発現を指図するEP−Ａ−258 067のプロモーターを包
含し、一方、ヒトフィブロネクチンのアミノ酸585〜157
8をコードするDNAと直接、インフレームに融合し、その
後で翻訳は停止コドンTAAにおいて停止する。これはS.c
erevisiae PGK遺伝子転写ターミネーターに続いてい
る。このプラスミドはまた、E.coliおよびS.cerevisiae
中での選択および維持を可能にする配列も含有する（EP
−Ａ−258 067）。
このプラスミドを標準操作（Beggs,1978）によってS.
cerevisiae S150−2B（leu２−３ leu２−122 ura３
−52 trpl−289 his３−１）に導入した。
例2:Fn585〜1578に融合したHSA1〜195 この第二の例においては、ヒト血清アルブミンの最初
のドメイン（アミノ酸１〜195）をヒトフィブロネクチ
ンのアミノ酸585〜1578に融合させる。
プラスミドpDBD2をBamH IおよびBgl IIで消化し、0.7
9kbフラグメントを精製し、ついでBamH I消化M13mp19と
リゲートして、pDBDF6（図９）を生成させた。
以下のオリゴヌクレオチド を突然変異誘発プライマーとして使用し、Amersham Int
ernational PLCによって供給されているキットを用いた
in vitro突然変異誘発により、pDBDF6中にXho I部位を
創製した。この部位は、HSAの塩基番号696をＴからＧへ
変化させて作成された（図２）。次に、この新たに作成
されたXho I部位からHSAのリジン195のコドン（AAA）ま
でおよびそれに続き、フィブロネクチンのイソロイシン
585のコドンから図６に示したオリゴヌクレオチド１と
８の末端までに相当する以下のリンカーを合成した。
リンカー７ このリンカーを、図３に示すアニーリングされたオリ
ゴヌクレオチド、すなわち２＋７、３＋６および４＋
５、ならびにXho IとEcoR Iで消化したpDBDF7とともに
リゲートして、pDBDF8（図９）を生成させた。元のHSA
のDNA配列、すなわちアミノ酸を再生するため、リンカ
ー７および他のオリゴヌクレオチドのpDBDF7への挿入で
Xho I部位は再生しないことに注意すべきである。
pDBDF8の0.83kbBamH I−Stu Iフラグメントを精製
し、ついでpDBDF2の0.68kbEcoR I−BmH Iフラグメント
およびpDFHDEL1の2.22kbStu I−EcoR Iフラグメント
と、Bgl II消化pKV50中にリゲートして、pDBDF9（図
９）を生成させた。このプラスミドは、HSAがpDBDF8の
場合の１〜387ではなく、残基１〜195のみに特定されて
いることを除いてpDBDF5と同じである。
上述の場合と同様、S.cerevisiae S150−2B中に導入
すると、このプラスミドはHSAの残基１〜195がフィブロ
ネクチンの残基585〜1578に融合してなるハイブリッド
分子の発現および分泌が指図される。
例3:Fn585〜1578に融合したHSA1〜387（切断可能分子） フィブロネクチンの残基585〜1578の大量の製造を容
易にするため、HSAの残基１〜387をコードするDNAとフ
ィブロネクチンの残基585〜1578をコードするDNAの間に
以下の配列をはさんだ。
この配列は、血液凝固第Ｘ因子の切断認識部位を特定
するものである。その結果、精製された分泌生成物を第
Ｘ因子で処理し、ついでこの分子のフィブロネクチン部
分をHSA部分から分離することが可能になる。
そのためには、２個のオリゴヌクレオチドを合成し、
ついでそれらをアニーリングしてリンカー８を生成させ
た。
リンカー８ このリンカーをついで、図６に示したようなアニーリ
ングされたオリゴヌクレオチド、すなわち２＋７、３＋
６および４＋５と、Hinc II−EcoR I消化mHOB12にリゲ
ートして、pDBDF10（図10）を生成させた。このプラス
ミドを次にPst IとEcoR Iで消化し、ほぼ0.24kbのフラ
グメントを精製し、ついでpDBD2の1.29kb BamH I−Pst
IフラグメントおよびBamH IとEcoR Iで消化したpUC19
とリゲートしてpDBDF17（図10）を生成させた。
pDBDF11の1.5kb BamH I−Stu Iフラグメントを次
に、pDBDF4の0.68kb EcoR I−BamH Iフラグメントおよ
びpFHDEL1の2.22kb Stu I−EcoR IフラグメントとBgl
II消化pKV50中にリゲートしてpDBDF12（図10）を生成さ
せた。このプラスミドをついでS.cerevisiae Ｓ−150
−2B中に導入した。分泌した融合蛋白質を生成し、第Ｘ
因子で処理すると、天然分式の残基585〜1578に相当す
るフィブロネクチンフラグメントが遊離する。
参考文献 Beggs,J.D.（1978）Nature 275,104−109 Kornblihttら（1985）EMBO J.４,1755−1759 Lawn,R.M.ら（1981）Nucl.Acid.Res.９,6103−6144 Maniatis,T.ら（1982）Molecular cloning:Alaboratory
manual.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor,New York. Messing,J.（1983）Methods Enzymol.101,20−78 Norrander,J.ら（1983）Gene 26,101−106 Sanger,F.ら（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463
−5467 Yanisch−Perron,C.（1985）Gene 33,103−119
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/765 Ｃ０７Ｋ 14/765 14/81 14/81 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ｎ−末端部分の少なくとも一部としてHSA
    のＮ−末端部分またはその変異体、およびＣ−末端部分
    の少なくとも一部としてそれ以外の他のポリペプチドか
    らなり、上記HSAのＮ−末端部分が１〜ｎ部分（ｎは369
    〜419である）もしくはその変異体である場合は、上記
    ポリペプチドは（ａ）ヒトフィブロネクチンの585〜157
    8部分もしくはその変異体、（ｂ）CD4の１〜368部分も
    しくはその変異体、（ｃ）血小板由来成長因子もしくは
    その変異体、（ｄ）形質転換成長因子もしくはその変異
    体、（ｅ）成熟ヒト血漿フィブロネクチンの１〜261部
    分もしくはその変異体、（ｆ）成熟ヒト血漿フィブロネ
    クチンの278〜578部分もしくはその変異体、（ｇ）成熟
    ヒトフォン・ビルブラント因子の１〜272部分もしくは
    その変異体、または（ｈ）α−１−抗トリプシンもしく
    はその変異体である融合ポリペプチド。
  2. 【請求項２】HSAのＮ−末端部分に相当する部分がさら
    に少なくとも１個のＮ−末端アミノ酸で延長されている 「請求項１」記載の融合ポリペプチド。
  3. 【請求項３】Ｎ−末端部分とＣ−末端部分の接合部に切
    断可能領域を設けた「請求項１または２」記載の融合ポ
    リペプチド。
  4. 【請求項４】Ｃ−末端部分はヒト血漿フィブロネクチン
    の585〜1578部分またはその変異体である「請求項１〜
    ３」のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
  5. 【請求項５】「請求項１〜４」のいずれかに記載の融合
    ポリペプチドを発現するように配列されたヌクレオチド
    を有する形質転換またはトランスフェクションされた宿
    主。
  6. 【請求項６】「請求項５」記載の宿主を培養し、ついで
    融合ポリペプチドを有用な形態で分離する融合ポリペプ
    チドの製造方法。
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ZA (1) ZA903237B (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019535267A (ja) * 2016-11-10 2019-12-12 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッドＫｅｒｏｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． Ｇｄｎｆ融合ポリペプチド及びその使用方法

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5629287A (en) * 1991-01-18 1997-05-13 University College London Depot formulations
US5610148A (en) * 1991-01-18 1997-03-11 University College London Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686900B1 (fr) * 1992-01-31 1995-07-21 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides ayant une activite de stimulation des colonies de granulocytes, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO1994016085A2 (en) * 1992-12-30 1994-07-21 Zymogenetics, Inc. Hybrid proteins having cross-linking and tissue-binding activities
GB9408466D0 (en) * 1994-04-27 1994-06-22 Univ Nottingham Cloning and functional expression of neurotoxins
US5543308A (en) * 1994-10-18 1996-08-06 New England Biolabs, Inc. Isolated DNA encoding the FSEI restriction endonuclease and related methods for producing the same
US5641483A (en) * 1995-06-07 1997-06-24 Beaulieu; Andre Wound healing formulations containing human plasma fibronectin
US5877149A (en) 1995-06-07 1999-03-02 Beaulieu; Andre Deepithelialized skin diffusion cell system
AR008077A1 (es) * 1996-07-26 1999-12-09 Talarico Salinas Laura Beatriz Un polipeptido de fusion o una sal del mismo, su uso, un proceso para prepararlos, una composicion farmaceutica que los comprende, y un vector.
US6423512B1 (en) 1996-07-26 2002-07-23 Novartis Ag Fusion polypeptides
US5932693A (en) * 1996-12-10 1999-08-03 Washington University Antithrombotic peptides
KR20010034305A (ko) 1998-01-23 2001-04-25 한센 핀 베네드 효모에서 원하는 폴리펩티드를 만드는 방법
US6548653B1 (en) 1998-06-15 2003-04-15 Genzyme Transgenics Corporation Erythropoietin analog-human serum albumin fusion
ES2484966T3 (es) * 2000-04-12 2014-08-12 Novozymes Biopharma Dk A/S Proteínas de fusión de albúmina
CN101633907B (zh) 2001-08-15 2012-09-05 宝生物工程株式会社 抗原特异性细胞毒性t细胞的扩大培养方法
WO2003060071A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ATE491021T1 (de) 2002-03-25 2010-12-15 Takara Bio Inc Verfahren zur produktion eines zytotoxischen lymphozyten
CN1839202B (zh) * 2003-08-22 2012-07-18 宝生物工程株式会社 细胞毒性淋巴细胞的制备方法
PL2520654T3 (pl) 2003-08-26 2017-08-31 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Inhibitory aktywności proteazy serynowej i ich zastosowanie w sposobach i kompozycjach do leczenia zakażeń bakteryjnych
WO2006067511A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Novozymes Delta Limited Gene expression technique
GB0329722D0 (en) 2003-12-23 2004-01-28 Delta Biotechnology Ltd Modified plasmid and use thereof
GB0329681D0 (en) 2003-12-23 2004-01-28 Delta Biotechnology Ltd Gene expression technique
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
AU2007258609B2 (en) 2006-06-07 2013-01-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
DK2049560T3 (da) 2006-07-13 2013-07-29 Novozymes Biopharma Dk As Fremgangsmåde til fremstilling af partikler af proteinholdigt materiale
EP2396347B1 (en) 2009-02-11 2017-04-12 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates
BR112012009450A2 (pt) 2009-10-30 2017-05-23 Novozymes Biopharma Dk As variantes de albumina
EP2556087A1 (en) 2010-04-09 2013-02-13 Novozymes Biopharma DK A/S Albumin derivatives and variants
EP3628327A1 (en) * 2011-06-24 2020-04-01 The Regents of the University of Colorado, A Body Corporate Compositions, methods and uses for alpha-1 antitrypsin fusion molecules
WO2013075066A2 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Proteins with improved half-life and other properties
WO2013135896A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
WO2014072481A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
WO2014165093A2 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold domains linked to serum albumin or a moiety binding thereto
BR112018003179A2 (pt) 2015-08-20 2018-09-25 Albumedix As conjugados e variantes de albumina

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE459586B (sv) * 1987-09-14 1989-07-17 Mta Szegedi Biolog Koezponti Strukturgen som kodar foer autentiskt humant serum albumin och foerfarande foer dess framstaellning
GB8725529D0 (en) * 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019535267A (ja) * 2016-11-10 2019-12-12 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッドＫｅｒｏｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． Ｇｄｎｆ融合ポリペプチド及びその使用方法
US11912750B2 (en) 2016-11-10 2024-02-27 Keros Therapeutics, Inc. GDNF fusion polypeptides and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
GB9119043D0 (en) 1991-12-04
CA2015687C (en) 2000-08-29
JPH04506598A (ja) 1992-11-19
GB8909916D0 (en) 1989-06-14
IL94243A (en) 1995-10-31
HU904413D0 (en) 1992-01-28
CA2015687A1 (en) 1990-10-29
GB2246783B (en) 1992-10-14
KR920701451A (ko) 1992-08-11
WO1990013653A1 (en) 1990-11-15
IE67651B1 (en) 1996-04-17
FI104255B (fi) 1999-12-15
FI915073A0 (fi) 1991-10-28
EP0470165A1 (en) 1992-02-12
KR100227167B1 (ko) 1999-10-15
AU5564690A (en) 1990-11-29
IE901554L (en) 1990-10-29
FI104255B1 (fi) 1999-12-15
GB2246783A (en) 1992-02-12
IL94243A0 (en) 1991-01-31
AU630450B2 (en) 1992-10-29
ZA903237B (en) 1991-03-27
HUT61049A (en) 1992-11-30

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