JP2003525570A

JP2003525570A - 酵母において所望のポリペプチドを産生する方法

Info

Publication number: JP2003525570A
Application number: JP2000528700A
Authority: JP
Inventors: ブラン，ヤコブ; バー，クヌーズ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1998-01-23
Filing date: 1999-01-22
Publication date: 2003-09-02
Also published as: US6183989B1; KR20010034305A; AU2149899A; WO1999037793A1; EP1049790A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、酵母において所望のポリペプチドを産生するための方法を記載する。前記の所望の生成物は、一塩基性プロセシング部位によって結びついた、リーダー連結ポリペプチドとして発現する。前記の所望の生成物は、酵素的開裂によって、ｉｎｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏのどちらかにおいて、前記リーダーから開裂する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は一塩基性プロテアーゼプロセシング部位を含む、融合ポリペプチドを
発現することによって、酵母において所望のポリペプチドを産生する方法に関す
る。発明の背景酵母生物は、細胞内で合成されるが、細胞の外側における機能を有する多くの
タンパク質を提供する。これらの細胞外タンパク質は、分泌タンパク質として言
及される。初めに、前記分泌タンパク質は、発現した生成物の（細胞の分泌経路
への）小胞体（ＥＲ）の膜を通過しての効果的な方向づけを確実にするプレペプ
チド配列を含む前駆体又はプレタンパク質の形態において、細胞の内側で発現す
る。通常シグナルペプチドとして言及されるプレ配列は、一般に輸送の間、所望
の生成物から除去される。一旦分泌経路に入り込むと、前記タンパク質はゴルジ
体に輸送される。ゴルジ体から、細胞膜、リソソーム及び分泌小胞に前記タンパ
ク質は分配される。

【０００２】酵母にとって異種のタンパク質の、酵母における発現及び分泌のために、いく
つかのアプローチが示唆されてきた。欧州特許公開第１１６２０１号は、所望の
タンパク質、リーダー配列及びプロセシングシグナルをコードするＤＮＡを宿す
発現ベクターによって形質転換した酵母宿主によって、酵母にとって異種のタン
パク質が発現し、プロセシングされ、そして分泌される方法、形質転換した生物
の培養物の調製、培養物の増殖、及び培養培地からの前記タンパク質の回収、酵
母のα因子のリーダー配列であるリーダー配列を記載している。

【０００３】サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）のＭＦα１（α因子）は、１９アミノ酸のシグナル又はプレペプチド
に続いて６４アミノ酸の“リーダー”又はプロペプチドを含んで成り、３つのＮ
結合グリコシル化部位に続いて（ＬｙｓＡｒｇ（（Ａｓｐ／Ｇｌｕ）Ａｌａ） _2-3 α因子）₄を含む１６５アミノ酸のプレプロ型として合成される（Clements
et al., Gene, 106, 1991, pp.267-272）。この刊公物は、ＫＥＸ２プロセシン
グの向上を目的とするＫＥＸ２のある修飾を記載している。

【０００４】プレプロＭＦα１のシグナルリーダー部分は、Ｓ．セレビシアエにおける異種
タンパク質の合成及び分泌を獲得するために広範に使用されてきた。欧州特許公開第３０１６６９号は、リーダー配列、特にα因子のリーダーが、
酵母において発現した異種ポリペプチドの分泌を方向づける方法を記載している
。欧州特許第３２４２７４号は、グリコシル化したα因子のリーダー配列の端を
切除することによる、異種のポリペプチドの発現及び分泌の効率の向上を開示し
ている。

【０００５】前記分泌タンパク質は、２つの連続的な塩基性アミノ酸残基のＣ末端において
ペプチド結合を開裂する、タンパク質分解的プロセシング系にさらすために輸送
される。この酵素的な働きは、Ｓ．セレビシアエにおいてＫＥＸ２遺伝子にコー
ドされる（Julius, D.A. et al., GENE, 37, 1884b, pp.1075 ）。ＫＥＸ２プロ
テアーゼによる前記生成物のプロセシングは、活性のあるＳ．セレビシアエの接
合因子α１（ＭＦα１又はα因子）の分泌のために必要であり、一方ＫＥＸ２は
Ｓ．セレビシアエの接合因子ａの分泌には関与していない。

【０００６】国際公開第９０／１００７５号及び第９５／３５３８４号は、ＫＥＸ２部位の
周辺の修飾を記載している。更に、国際公開第９５／３４６６６号、第９２／１
１３７８号及び第９０／１３６５３号は、ＫＥＸ２の使用が実用的ではない状態
において、ＦＸ_aと称されるアミノ酸Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含んで
成る、第２のプロセシング部位を利用する選択を記載している。

【０００７】 Applied Microbiological Biotechnology 35 (1991) 771-776 において、Seeb
oth 等は酵母におけるαリーダー連結ポリペプチドが、ｉｎｖｉｔｒｏで、可
溶性ＫＥＸ２によってプロセシングされる機構を記載し、ここでＫＥＸ２はＫＥ
Ｘ２遺伝子を修飾することによって可溶性にされ、そしてそれによってｉｎｖ
ｉｔｒｏでの部位特異的プロセシングを増大する方法を提示している。GENE, 17
0 (1996) 107-112において、Kjeldsen等は、二塩基性ＫＥＸ２部位が続き、前記
ポリペプチド前駆体のＮ末端伸長を創作するスペーサーペプチドの挿入が、ＫＥ
Ｘ２プロセシング及びそれによる前記ポリペプチド前駆体の収率の向上を大変容
易にすることを記載している。

【０００８】上述の方法で認識される問題は、分泌のレベルが低すぎるかもしれないこと、
あるいはタンパク質分解的プロセシングが、所望の生成物の収率が低い、不正確
又は不完全なものであるかもしれないことである。本発明の目的は、所望のポリペプチドの高収率を確実にする酵母の発現方法を
提供することである。発明の要約この発明は、ＫＥＸ２プロセシング部位を含まない、リーダー連結ポリペプチ
ドの発現及び分泌による、酵母における所望のポリペプチドを産生するための方
法に関する。前記のリーダー連結ポリペプチドは、一塩基性のプロセシング部位
によって連結した天然のα因子リーダーペプチド及び所望のポリペプチド、並び
に可能な限りスペーサーペプチドを含んで成る。

【０００９】更に具体的に、本発明は以下の式ＳＰ−ＬＰ−Ｘ_n−ＰＳ−^*ポリペプチド^* （ここでＳＰはシグナルペプチドであり；ＬＰは天然のα因子のリーダーペプチド又は天然のα因子のリーダーペプチド
に少なくとも８５％相同であるリーダーペプチドであり；ＰＳは一塩基性プロセシング部位、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘはｎ個のアミノ酸を含むスペーサーペプチドであり；ｎは０又は１〜１０の整数であり；そして ^*ポリペプチド^*は所望のポリペプチドであり；但し、スペーサーペプチドＸはＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ，Ｌｅｕ−Ｐｒｏ，Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ，Ｉｌｅ−Ａｓｐ又はＰｒｏ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｐｒｏではなく、そして更に、スペーサーペプチドＸはＫＥＸ２開裂部
位を含まず、あるいはＰＳ又はＬＰと一緒にＫＥＸ２開裂部位を構成せず、そし
てｎが０である場合、リーダーペプチドのＣ末端はＬｙｓ，Ａｒｇ，Ｉｌｅ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ，Ｌｅｕ−Ｐｒｏ，Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ，Ｉ
ｌｅ−Ａｓｐ又はＰｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏではなく、その結果、リーダ
ーと連結した所望のポリペプチドは、ｉｎｖｉｖｏでの細胞膜を通る移動の間
か又はｉｎｖｉｔｒｏでの培養培地への分泌の後かのどちらかで、プロセシン
グ部位ＰＳにおいて開裂し、その結果、所望のポリペプチドが単離される）を有
する配列を、発現することが可能な発現ベクターを含む酵母の菌株を、適当な培
養培地中で培養することによって、酵母において所望のポリペプチドを産生する
方法に関する。

【００１０】本発明はまた、上記のリーダー連結ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、そ
の様なＤＮＡ配列を含む発現ベクター及びその様なベクターで形質転換した酵母
の菌株に関する。発明の詳細な説明本発明において使用されるリーダーペプチド（ＬＰ）は、好ましくはＭＦα１
（１〜８３）（配列番号１）のプロペプチドである、天然のα因子のリーダーペ
プチドである。ＭＦα１（１〜８３）において、残基１〜１９はいわゆるプレ配
列又はシグナルペプチドを形成し、そして残基２０〜８３はいわゆるプロ配列又
はリーダーペプチドを形成する。

【００１１】前記の天然のα因子のリーダーペプチドは、よく知られた技術によってわずか
に修飾されることがあり、これによっていくつかのアミノ酸残基を欠失し、又は
他のアミノ酸残基と置換される。この様に、プロセシング部位ＰＳでのプロセシ
ングを向上するために、２〜５のアミノ酸残が他のアミノ酸残基で置換されるＣ
末端の端で、前記リーダーは修飾されることがある。好ましくは、前記の修飾し
たリーダー配列はアミノ酸組成を基にした天然のα因子リーダーペプチドに対し
て、８５％以上の相同性及び更に好ましくは９０％以上の相同性があるであろう
。

【００１２】好ましい態様において、前記のα因子リーダーペプチドのＣ末端の端における
、終わりの２つのアミノ酸残基は、Ｍｅｔ−Ａｌａで置換される。本発明において使用されるシグナルペプチドは、分泌経路に入った際に、発現
したポリペプチドの安全な及び効果的な方向づけを確実にするあらゆるポリペプ
チドであることができる。“シグナルペプチド”の語は、発現したポリペプチド
を、小胞体の膜を通して安全に方向づける機能を有するプレペプチド配列として
理解されなければならず、ここで前記シグナルペプチドは輸送の間に除去される
。前記シグナルペプチドは、酵母にとって同種であることがあり、又はそれは酵
母にとって異種であることがある。それは天然の又は合成のシグナルペプチドで
あることがある。前記シグナルペプチドは前記リーダー配列のＮ末端に位置し、
そして天然では支配的に疎水性である。好ましくは、ＳＰはα因子のシグナル配
列をコードするＤＮＡ配列である。適当な他のシグナルペプチドは、酵母のアス
パラギン酸プロテアーゼ３のシグナルペプチド、マウスの唾液腺アミラーゼのシ
グナルペプチド、カルボキシペプチダーゼのシグナルペプチド及び酵母のＢＡＲ１シグナルペプチドである。

【００１３】本発明に従う、プロセシング部位ＰＳにおけるリーダー連結ポリペプチドの開
裂は、一塩基性プロセシング部位（Ｌｙｓ，Ａｒｇ）に特異的なプロテアーゼに
よって行われる。その様なプロテアーゼの例はアクロモバクター・リチカス（Ａ
ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｌｙｔｉｃｕｓ）のプロテアーゼＩ、エンテロキナ
ーゼ、及びフサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕ
ｍ）のトリプシン様プロテアーゼである。好ましいプロテアーゼは酵母のアスパ
ラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）である。

【００１４】前記リーダーペプチドからのリーダー連結ポリペプチドの開裂を、リーダー連
結ポリペプチドの分泌の後にｉｎｖｉｔｒｏで行うことができる。前記開裂を
培養培地への適当なプロテアーゼの添加によって行い、続いて所望のポリペプチ
ドの単離を行うことができる。代わりとして、前記のリーダー連結ポリペプチド
を、培養培地から単離し、そして単離の後開裂することができる。

【００１５】あるいは、前記開裂を一塩基性プロテアーゼ部位ＰＳに特異的なプロテアーゼ
の共発現によってｉｎｖｉｖｏで行う。前記の所望のポリペプチドは酵母細胞において発現することが可能なペプチド
のいずれかであることができ、そしてアプロチニン、組織因子系凝固インヒビタ
ー又は他のプロテアーゼインヒビター、インスリン様増殖因子Ｉ又はII、ヒト又
はウシの成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１、VII 因子、VIII因子、XIII因子、血
小板由来増殖因子及び工業用酵素、並びにそれらのあらゆる機能的類似体から成
る群から選択されることがある。好ましくは、前記ポリペプチドはインスリン、
インスリン類似体、インスリン及びインスリン類似体の前駆体、インスリン様増
殖因子、又はそれらの機能的な類似体である。

【００１６】前記ポリペプチドはまた、プログルカゴンファミリー、例えばＧＬＰ−１（７
〜３７）及びＧＬＰ−１（７〜３６）の様な端を切り取った形態又はＧＬＰ１^* の様な、その機能的類似体を含む、グルカゴンＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２及びＧＲ
ＰＰの、より小さいヒトのペプチドであることができる。 “機能的類似体”の語は、天然のポリペプチドに対して機能的に等しいが、天
然のポリペプチドと比較して修飾を有するポリペプチドを示す。

【００１７】前記の機能的類似体は、欠失され、短かくされ、置換され、又は挿入された１
又は複数のアミノ酸を有することによって、天然のポリペプチドと異なることが
ある。アミノ酸は前記配列内で、若しくはＣ末端の端において、若しくはＮ末端
の端において、又は両端において、あるいは上記の全ての部位において欠失され
、短かくされ、置換され、又は挿入されることがある。

【００１８】インスリン前駆体の例はＢ（１〜２９）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａ（１〜
２１）の構造を有するＭＩ３であり、ここでＢ（１〜２９）は位置Ｂ（３０）に
おけるアミノ酸残基を欠くヒトインスリンのＢ鎖であり、Ａ（１〜２１）はヒト
インスリンのＡ鎖である。前記スペーサーペプチドＸの機能は、プロセシング部位ＰＳにおける、所望の
ポリペプチドからのリーダーの開裂を最適化することである。リーダーペプチド
（ＬＰ）もスペーサーペプチド（Ｘ）もまたＫＥＸ２プロセシングを含まないこ
とが重要である。理論によって連結され無ければ、リーダーペプチド又はスペー
サーペプチドにおけるＫＥＸ２部位の存在が、分泌経路における早まった開裂の
ために分泌生成物の収率を減少させるであろうことが信じられている。

【００１９】前記のスペーサー配列Ｘは、それがＫＥＸ２部位を含まず、あるいは一塩基性
プロセシング部位ＰＳ又はリーダーペプチドＬＰと一緒にＫＥＸ２部位を形成し
ない、最大１０アミノ酸残基（ｎ＝１０）の長さを有するポリペプチド配列のい
ずれかであることができる。Ｘは、好ましくは７（ｎ＝７）及び更に好ましくは
２（ｎ＝２）のアミノ酸残基を含むだろう。好ましい態様においてＸはＬｙｓ−
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ又はＬｙｓ−Ｇｌｕである。

【００２０】別の好ましい態様において、ｎは０であり、これはリーダー（ＬＰ）及び一塩
基性プロセシング部位（ＰＳ）の間にスペーサー配列が無いことを意味している
。その場合において、前記リーダーペプチドのＣ末端の端はＫＥＸ２部位又はＫ
ＥＸ２様部位を構成してはならず、ＰＳと一緒に、前記のＣ末端のアミノ酸残基
もまたＫＥＸ２部位を形成してはならない。

【００２１】本方法において使用される酵母細胞は、サッカロミセス・ウバエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓｕｖａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚ
ｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・ウバラム（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｕｖａｒｕｍ）、クルイベロミセス・ラクチス（
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈ
ａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉ
ａｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏ
ｌｉｃａ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ヤロビ
ア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ）種、カンジダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）、カン
ジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａｃａｃａｏｉ）、ゲオトリチュム（Ｇｅｏｔ
ｒｉｃｈｕｍ）種及びゲオトリチュム・ファーメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕ
ｍｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）から成る群から選択されることがある。好ましい酵
母の菌株はサッカロミセス・セレビシアエである。

【００２２】前記の酵母細胞は、一塩基性のプロセシング部位に特異的なプロテアーゼをコ
ードする遺伝子で形質転換されることがあり、それによってプロテアーゼ及び所
望のポリペプチドの共発現を獲得することができる。本発明に従って、従来の分子生物学、微生物学、及び当業者の技量の範囲内に
ある、、組換えＤＮＡ技術を適用することができる。その様な技術は、文献にお
いて十分に説明されている。例えばSambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular
Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照せよ。前記ＤＮＡコン
ストラクトを、確立された標準的な方法、例えばS.L.Beaucage及びM.H.Caruther
s の、Tetrahedron Letters 22, 1981, pp.1859-1869に記載のホスホアミダイト
法、又はMatthes 等の、EMBO Journal 3, 1984, pp.801-805に記載の方法によっ
て合成的に調製することができる。前記ホスホアミダイト法に従い、合成ＤＮＡ
コンストラクトを形成するために例えば、自動ＤＮＡ合成装置においてオリゴヌ
クレオチドは合成され、精製され、二本鎖にされ、そして結合される。ＤＮＡコ
ンストラクトを調製する、近年好まれる方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）によってであり、例えばSambrook等の Molecular Cloning : A Laboratory Ma nual , Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。

【００２３】直鎖化又は環状化することができる発現ベクターは、その転写を提供する付加
的な部分に、作用可能に連結している所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列を含んで成るだろう。その様な付加的な部分は、プロモーター及びターミネー
ター配列、並びに任意に１又は複数の複製起点、１又は複数の選択マーカー、エ
ンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含むことがある。

【００２４】適当な酵母のプロモーターは、ＭＦα１プロモーター、ガラクトース誘導プロ
モーター、例えばＧＡＬ１、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０プロモーター、ＴＰＩ及び
ＰＧＫプロモーターを含む解糖系酵素プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、Ａ
ＤＨ１プロモーター、並びにＨＳＰプロモーターである。酵母宿主細胞のために
有用な他のプロモーターは、Romanos 等の、1992, Yeast 8 : 423-488 に記載さ
れている。

【００２５】前記の発現ベクターはまた、所望のポリペプチドをコードする核酸配列の３’
末端に作用可能に連結したターミネーターを典型的に含むだろう。前記酵母細胞
において機能的なターミネーターのいずれかを、本発明において使用することが
できる。好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシアエのエノラーゼ、サ
ッカロミセス・セレビシアエのシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、又はサッカロミセス
・セレビシアエのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオー
スリン酸イソメラーゼ及び接合因子ＭＦα１をコードする遺伝子、あるいはＳ．
クルイベリ由来の解糖系及び呼吸の遺伝子由来であろう。酵母宿主細胞のために
有用な他のターミネーターは、Romanos 等の1992, Supra に記載されている。

【００２６】前記ベクターは、形質転換細胞の選択を容易にする、１又は複数の選択マーカ
ーを好ましくは含むだろう。選択マーカーは、殺生物性又はウィルス耐性、重金
属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養性などを提供する生成物の遺伝子で
ある。酵母宿主細胞にとって適当なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２
、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＴＰＩ１、ＰＧＫ及びＫＡＮ^E.C. 遺伝子によるジェネティシンＧ４１８^Rである。

【００２７】自律的複製のために、前記ベクターは更に、酵母宿主において、ベクターが自
律的に複製することを可能にする、複製起点を含んで成る。酵母宿主細胞におけ
る使用のための複製起点の例は、２マイクロン複製起点、ＣＥＮ６及びＡＲＳ４
の組合わせ、並びにＣＥＮ３及びＡＲＳ１の組合わせである。前記複製起点は、
宿主細胞において温度感受性に作用する変異を有するものであることがある（例
えば、Ehrlich, 1978, Proceeding of the National Academy of Science USA 1
75 : 1433 を参照）。

【００２８】好ましい酵母の発現ベクターは、シゾサッカロミセス・ポンベのトリオースリ
ン酸イソメラーゼ（ＰＯＴ）遺伝子の存在を特徴とするプラスミドである。ＰＯ
Ｔ遺伝子は、形質転換細胞の選別に使用され、そしてまた、トリオースリン酸イ
ソメラーゼ（ＴＰＩ）ネガティブサッカロミセス・セレビシアエ菌株におけるプ
ラスミドの維持を確実にするであろう。上述の構成成分を本発明の組換え発現ベ
クターのコンストラクトに連結するために使用される方法は、当業者に公知であ
る（例えばSambrook等の、1989, Supra を参照）。

【００２９】前記の酵母の菌株を、Becker及びGuarente, In Abelson, J.N.及びSimon, M.I
., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in En
zymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York ; Ito等
の、1983, Journal of Bacteriology 153 : 163 ; 並びにHinnen等の、1978, Pr
oceedings of the National Academy of Sciences USA 75 : 1920 に記載の方法
を用いて形質転換することができる。

【００３０】次に、形質転換された細胞は、所望の生成物の発現及び分泌を可能にするため
に、ここで開示した教示を考慮して、十分な時間及び、当業者に知られた適当な
条件下培養される。前記生成物は、当業界で公知の方法によって単離され、そして精製される。分
泌され、そして単離された生成物が活性ポリペプチドの前駆体、例えばインスリ
ン前駆体ならば、前記前駆体は酵素的変換などの知られた手段によって活性ポリ
ペプチドに変換される。

【００３１】ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの生化学命名委員会によって承認された規則、vide Colle
cted Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical
Nomenclature IUPAC-IUB, 2^nd ed., Maryland, 1975に従い、本明細書及び請求
項を通じて、アミノ酸の１文字及び３文字表記を使用する。更に、本発明を以下の例によって例示する；例１：Ｓ．セレビシアエにおけるリーダー／生成物融合体のクローニング及び生成本研究において、エピソームに由来するＰＯＴ型の、酵母の発現プラスミド（
Thim等の、PNAS 83, 1986, pp.6766-6770 ; Kjeldsen等の、Gene 170, 1996, pp
.107-112 ; PCT No. 95/00250 及びPCT No. 97/00298）を使用した。

【００３２】図１はｐＭＴ７４２（Egel-Mitani 等の、Gene, 73, 1988, pp.113-120）と称
される、酵母のプラスミドの例を示す。本プラスミドは、Ｓ．セレビシアエのＴ
ＰＩ遺伝子の、転写プロモーター及び転写ターミネーターの間の、プラスミドに
挿入したＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを含んで成る発現カセットを含む。プラスミドｐＭＴ７４２において、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントはＭＦ
α１プレプロリーダー、二塩基性プロセシングエンドペプチドダーゼＫＥＸ２の
ためのＬｙｓ−Ａｒｇ開裂部位、及び一本鎖ミニインスリン前駆体ＭＩ３から成
る融合生成物をコードする。

【００３３】様々なリーダー／生成物融合体をコードするプラスミド（表１参照）を構築す
るために、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ部位の間に修飾を導入し、これは適当なオリ
ゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ又は重復ＰＣＲの技術、続いてＰＣＴ特許出願第
９５／００２５０号に概説された、標準的な分子的方法（例えばSambrook, J.,
Fritsch, E.F. 及びManiatis, T., Molecular Cloning : A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989 ）による。

【００３４】表１はリーダー／生成物融合体の異なるプラスミドコンストラクトを示す。

【００３５】

【表１】

【００３６】表１において、ＭＦα１（１〜８３）はＳ．セレビシアエ由来の接合因子α１
前駆体のリーダーペプチドを構成する最初の８３アミノ酸である。残基１〜１９
は、いわゆるプレ配列（シグナルペプチド）を形成し、そして残基２０〜８３は
いわゆるプロ配列（リーダーペプチド）を形成する。ＭＦα１（１〜８３）（配列番号１）は、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−
Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−
Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−
Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−
Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−
Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−
Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐのアミノ酸配列を有
する。

【００３７】ＭＦα１（１〜８１）のＭＡは、最後の２残基（Ｌｅｕ−Ａｓｐ）かＭｅｔ−
Ａｌａで置換されたＭＦα１（１〜８３）である。ＭＩ３は３０番目のアミノ酸残基（Ｂ３０）を欠き、そしてヒトインスリンの
Ｂ２９−ＬｙｓとＡ１−ＧｌｙをつなぐＡｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ架橋を有するヒ
トインスリン前駆体である。

【００３８】ＭＩ３（配列番号２）は、Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ
−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ
−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ
−Ｃｙｓ−Ａｓｎのアミノ酸配列を有する。

【００３９】ＧＬＰ−１^*は余分なＣ末端リジン残基、並びに２６及び３４位におけるリジ
ンからアルギニンへの置換を有する、ヒトグルカゴン様ペプチドＧＬＰ−１（７
〜３７）である。ＧＬＰ−１^*（配列番号３）は、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−
Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−
Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓの
アミノ酸配列を有する。

【００４０】真性ＹＡＰ３、又はＣ末端を切除したＹＡＰ３対応物ＹＡＰ３Δ₁₈を共発現す
るプラスミドの構築のために、特定のＤＮＡコンストラクトを含むＤＮＡ断片を
、ＰＯＴ遺伝子の３’末端におけるＳａｌＩに挿入した（図１参照）。前記の真性ＹＡＰ３の遺伝子は、ｐＭＥ７６８（Egel-Mitani 等の、Yeast, 6
, 1990, pp.127-137）由来であり、そして０．６kbの転写プロモーター配列、及
び０．３kbの転写ターミネーター配列を含んでいる。

【００４１】前記ＹＡＰ３Δ₁₈遺伝子コンストラクトは、ＹＡＰ３のコード領域が、Ｃ末端
をコードする部分において切除されたｐＭＥ９２７に由来した（Egel-Mitani 等
の、1990、前記引用文と同じ）。前記の切除は、終わりの１８アミノ酸を欠失さ
せ、これは２つの余分なアミノ酸コドン（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ）、及びＵＡＧ翻訳終
結シグナルによって置換される。ＹＡＰ３遺伝子コンストラクトの様に、ＹＡＰ
３Δ₁₈遺伝子コンストラクトは、標準の０．６kbのＹＡＰ３遺伝子転写プロモー
ター配列を含むが、ＭＦα１遺伝子由来の、０．３kb転写ターミネーター配列を
有する。

【００４２】前記発現プラスミドを、アンピシリン存在下で生育した、Ｅ．コリにおいて増
殖し、そして標準的な技術（Sambrook等の、1989、前記引用文と同じ）を用いて
単離した。前記のプラスミドＤＮＡを、適当な制限エンドヌクレアーゼ（例えば
ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ及びＳａｌＩ）によって挿入を確かめ、そして正しいリー
ダー／生成物融合体コンストラクトをコードしていることを、ジクエンス解析に
よって示した。

【００４３】前記プラスミドＤＮＡを、それぞれＰＣＴ出願第９５／００２５０号及び第９
７／００２９８号に記載の、Ｓ．セレビシアエの菌株ＭＴ６６３（ＭＡＴａ／Ｍ
ＡＴαｐｅｐ４−３／ｐｅｐ４−３ＨＩＳ４／ｈｉｓ４ Δｔｐｉ：：ＬＥＵ
２／Δｔｐｉ：：ＬＥＵ２）又はＭＥ１４８７（ＭＡＴαΔｙａｐ３：：ＵＲＡ
３ｐｅｐ４−３ Δｔｐｉ：：ＬＥＵｌｅｕ２ Δｕｒａ３）にトランスフォ
ーメーションした。

【００４４】酵母形質転換体を、ＹＤＰ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース
）寒天（２％）プレート上で、炭素源としてのグルコースを利用することによっ
て選択した。ＡＬＰ消化による分泌生成物の定量及びＨＰＬＣ形質転換体を、５mlのＹＰＤ液体培地中、３０℃で３日間、２００rpm で震盪
することで培養した。培養上清を、２５００rpm の遠心の後に回収し、そして以
下の方法において分泌生成物を解析した：各培養のために、一方の試料の６３０μｌの上清を、７０μｌの１ＭＴｒｉｓ
緩衝液、pH８．７５と混合し、そしてこれに１００μｇ／mlのＬｙｓ−Ｘａａの
特異的アクロモバクター・リチカスプロテアーゼＩ（ＡＬＰ）を添加した。

【００４５】別の試料（Ｂ）の６３０μｌの上清を、７０μｌの１Ｍトリス緩衝液、pH８．
７５と混合し、そしてＡＬＰは混合しなかった。両方の試料を３７℃で２時間イ
ンキュベートし、そして続けてＨＰＬＣによって解析した。前記のＢ試料（ＡＬＰ無し）を解析することで、リーダーの連結無しの、分泌
され、そしてプロセシングされた生成物ポリペプチド（表２のＭＩ３及び表３の
ＧＬＰ−１^*）の収量を定量出来た。

【００４６】ＡＬＰで消化したＡ試料を解析することによって、分泌され、そしてプロセシ
ングされなかったプロプレリーダー／生成物融合体（表２のＭＩ３及び表３のＬ
−ＧＬＰ−１^*）の収量を決定出来た。ＡＬＰは、Ｂ２９のリジン残基及びそれ
に連結しているＡｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ架橋の間を開裂する。更にＡＬＰは、プ
ロセシングされないリーダー／ＭＩ３融合体を、前記リーダー及びＭＩ３に分離
するリジン残基において、それが存在するならば開裂する。この様に、プロセシ
ングされたＭＩ３及びプロセシングされなかったＭＩ３の全収量を、Ａ試料中の
ｄｅｓＢ３０インスリンの量として測定できる。プロセシングされなかった（リ
ーダーが連結した）ＭＩ３の収量を、ＡＬＰ処理した生成物の全収量から（Ｂ試
料から得た）リーダー無しの生成物の収量を引くことによって、間接的に測定で
きる。

【００４７】分泌したリーダー連結ポリペプチドの収量は、前記試料のＨＰＬＣ解析によっ
て定量出来なかった。これは、プロリーダー部分の、高いグリコシル化（過グリ
コシル化）量によるものであった。しかしながら、ＭＩ３に関連した生成物の対照プラスミド、ｐＭＴ７４２の場
合、Ａ試料中のプロセシングされなかったプロリーダー／ＭＩ３融合体の収量を
、Ｂ鎖において余分なＮ末端アルギニン残基を有するｄｅｓＢ３０（“Ｂ０Ａｒ
ｇ−ｄｅｓＢ３０”）の量を定量することによって、直接決定した。Ｂ０Ａｒｇ
−ｄｅｓＢ３０インスリンは、プロセシングされなかったＫＥＸ２のプロセシン
グ部位におけるＬｙｓ及びＡｒｇの間の開裂から生じる。

【００４８】表２は、ＭＴ６６３において、ＭＩ３に関連のプラスミドコンストラクトによ
り得られた相対的収量を示す。前記の酵母の菌株ＭＴ６６３は、ＷＯ９２／１１
３７８のファイルに関連する、Deutche Sammlung von Mikroorganism und Zellk
ulturen に寄託され、そして寄託番号ＤＳＭ６２７８を与えられた。この特定の
酵母の菌株は、プラスミドコンストラクトの発現において、及び続くポリペプチ
ドの分泌において、極めて適当であり、そして好結果であることが証明された。

【００４９】

【表２】

【００５０】前記の発酵収量は、ｐＭＴ７４２により得られたＭＩ３の収量に対するもので
ある。ＭＩ３の収量を、未処理の上清中のＭＩ３を測定することによって決定し
た。全収量を、ｐＭＴ７４２由来の上清のＡＬＰ処理から得られてた、ｄｅｓＢ
３０インスリンの量に対する、ＡＬＰで処理した上清中のｄｅｓＢ３０インスリ
ンの収量として測定した。リーダー連結ＭＩ３（Ｌ−ＭＩ３）の収量を、全収量
からＭＩ３の収量を引くことによって計算した。

【００５１】ａ：ｐＭＴ７４２の場合、ｐＭＴ７４２由来の上清のＡＬＰ処理から得られた
、ｄｅｓＢ３０インスリン収量に対する、Ｂ０（Ａｒｇ）−ｄｅｓＢ３０として
Ｌ−ＭＩ３を測定し、そして全収量を、これらの数字の合計として計算した。表２における結果は、本発明に従う開裂部位を有し、そして共発現したプロテ
アーゼの無いコンストラクト（すなわちｐＪＢ１６２、ｐＪＢ１６０及びｐＩＭ
１７２）は、ｐＭｔ７４２より多くのＭＩ３関連生成物を提供することを示す（
すなわち、それぞれ１６５％、１２５％及び１５０％）。更に、リーダー連結Ｍ
Ｉ３（リーダー連結Ａｒｇ−ｄｅｓＢ３０を除く）が、ＡＬＰ消化によってｄｅ
ｓＢ３０インスリンに変換することができるので、従ってヒトインスリンの生成
にすぐにでも使用されるｄｅｓＢ３０インスリンの収量は、ｐＭＴ７４２コンス
トラクトより、これらのコンストラクトの方がより高い（２９０％、２２０％及
び２６５％）。これはまた、表２において記した他のコンストラクトにとっても
真実である（すなわち“合計”＝ｄｅｓＢ３０量）。

【００５２】更に、ＹＡＰ３Δ₁₈を共発現するｐＩＭ３７及びｐＩＭ２５６の両者は、ｉｎｖｉｖｏでｐＭＴ７４２より更にプロセシングされたＭＩ３を提供する（それ
ぞれ１４０％及び１７０％）。ＭＩ３は精製に直ちに使用可能であり、一方、過
グリコシル化された、プロセシングされなかったプロリーダー／ＭＩ３融合体生
成物はそうではない。

【００５３】

【表３】

【００５４】前記発酵収量はｐＫＶ２３１で得たＧＬＰ−１^*の収量に対するものである。
ＧＬＰ−１^*の収量を、未処理の上清中のＧＬＰ−１^*を測定することによって
決定した。（プロ）リーダー連結ＧＬＰ−１^*（Ｌ−ＧＬＰ−１^*）を、ＡＬＰ
処理した上清中のＧＬＰ−１^*の収量から、未処理の上清中のＧＬＰ−１^*の収
量を引くことによって計算した。

【００５５】ＧＬＰ−１^*関連生成物の対照プラスミド、ｐＫＶ２３１の場合、余分なＮ末
端アルギニンを有するＧＬＰ−１^*を、ＡＬＰで消化したＡ試料中に検出出来な
かったので、プロセシングされなかったプロリーダー／ＧＬＰ−１^*融合体は存
在しなかった（表３）。ｐＫＶ２４８の例において、プロセシングされたＧＬＰ
−１^*をＢ試料中で検出しなかったが、一方、ＧＬＰ−１^*の量は、ＡＬＰで消
化したＡ試料中、ｐＫＶ２３１で得たそれの３７５％であることが明らかとなっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は酵母の発現プラスミドｐＭＴ７４２の略図である。このプラスミドはＭ
Ｆα１プレプロ（１〜８５）−ＭＩ３の発現のための遺伝子を含む。以下の記号を使用する：ＳｃＴＰＩプロモーター：サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓｃ）由来のトリ
オースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子のプロモーター配列。ＳｃＴＰＩｔｅｒｍ．：Ｓｃ由来のＴＰＩ遺伝子のターミネーター配列。ＰＯＴ遺伝子：シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）由来のＴＰＩ遺伝子。ＰＯＴ：Ｓ．ポンベ由来のＴＰＩをコードする配列。Ｅ．Ｃｏｌｉのプラスミド：プラスミドｐＢＲ３２２及びｐＵＣ１３の複製起点
に由来する配列。ＡＭＰ−Ｒ：β−ラクタマーゼをコードする配列（アンピシリン耐性マーカー）
。酵母の２μプラスミド：Ｓｃ２μプラスミドの複製起点を含むＳｃ２μプラスミ
ド由来の配列。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１３年３月８日（２００１．３．８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００５５】ＧＬＰ−１^* 関連生成物の対照プラスミド、ｐＫＶ２３１の場合、余分なＮ末
端アルギニンを有するＧＬＰ−１^* を、ＡＬＰで消化したＡ試料中に検出出来な
かったので、プロセシングされなかったプロリーダー／ＧＬＰ−１^* 融合体は存
在しなかった（表３）。ｐＫＶ２４８の例において、プロセシングされたＧＬＰ
−１^* をＢ試料中で検出しなかったが、一方、ＧＬＰ−１^* の量は、ＡＬＰで消
化したＡ試料中、ｐＫＶ２３１で得たそれの３７５％であることが明らかとなっ
た。配列表 (1) 一般情報: (i) 出願人: (A) 氏名又は名称: ノボノルディスクアクティーゼルスカブ (B) 通り: ノボアレ (C) 都市: バグスバエルト (E) 国: デンマーク国 (F) 郵便番号: ２８８０ (ii) 発明の名称: ポリペプチドを産生する方法 (iii) 配列の総数: ３ (2) 配列番号１の情報: (i) 配列の特徴: (A) 配列の長さ: ８３アミノ酸 (B) 配列の型: アミノ酸 (C) 鎖の型: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型: タンパク質 (xi) 配列番号１の記述:

【表１】 (2) 配列番号２の情報: (i) 配列の特徴: (A) 配列の長さ: ５３アミノ酸 (B) 配列の型: アミノ酸 (C) 鎖の型: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型: タンパク質 (xi) 配列番号２の記述:

【表２】 (2) 配列番号３の情報: (i) 配列の特徴: (A) 配列の長さ: ３２アミノ酸 (B) 配列の型: アミノ酸 (C) 鎖の型: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型: タンパク質 (xi) 配列番号３の記述:

【表３】（訂正理由１）国際出願の明細書（英文）、第１７ページから第１８ページに記載の配列表が
、明細書の翻訳文に含まれていなかったので、前記配列表の翻訳文を追加した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者バー，クヌーズデンマーク国，デーコー−2720 バンレーセ，ホイヨーネバイ 22 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA02 BA14 BA80 DA12 EA04 GA11 GA19 HA01 4B064 AG01 AG16 CA06 CA19 CC24 DA01 DA10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の式ＳＰ−ＬＰ−Ｘ_n−ＰＳ−^*ポリペプチド^* （ここでＳＰはシグナルペプチドであり；ＬＰは天然のα因子のリーダーペプチド又は天然のα因子のリーダーペプチド
に少なくとも８５％相同であるリーダーペプチドであり；ＰＳは一塩基性プロセシング部位、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘはｎ個のアミノ酸を含むスペーサーペプチドであり；ｎは０又は１〜１０の整数であり；そして ^*ポリペプチド^*は所望のポリペプチドであり；但し、スペーサーペプチドＸはＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ，Ｌｅｕ−Ｐｒｏ，Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ，Ｉｌｅ−Ａｓｐ又はＰｒｏ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｐｒｏではなく、そして更に、スペーサーペプチドＸはＫＥＸ２開裂部
位を含まず、あるいはＰＳ又はＬＰと一緒にＫＥＸ２開裂部位を構成せず、そし
てｎが０である場合、リーダーペプチドのＣ末端はＬｙｓ，Ａｒｇ，Ｉｌｅ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ，Ｌｅｕ−Ｐｒｏ，Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ，Ｉ
ｌｅ−Ａｓｐ又はＰｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏではなく、その結果、リーダ
ーと連結した所望のポリペプチドは、ｉｎｖｉｖｏでの細胞膜を通る移動の間
か又はｉｎｖｉｔｒｏでの培養培地への分泌の後かのどちらかで、プロセシン
グ部位ＰＳにおいて開裂し、その結果、所望のポリペプチドが単離される）を有
する配列を、発現することが可能な発現ベクターを含む酵母の菌株を、適当な培
養培地中で培養することによって、酵母において所望のポリペプチドを産生する
方法。
【請求項２】ＳＰが酵母にとって同種のシグナルペプチドである、請求項
１に記載の方法。
【請求項３】ＳＰがα因子のシグナルペプチド、酵母のアスパラギン酸プ
ロテアーゼ３のシグナルペプチド、マウスの唾液腺アミラーゼのシグナルペプチ
ド、カルボキシペプチダーゼのシグナルペプチド、又は酵母のＢＡＲ１のシグナ
ルペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】ＰＳがＬｙｓである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】ＸがＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ又はＬｙｓ−Ｇｌｕである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】ｎが１〜３の整数である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】ｎが０である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記の酵母の菌株が一塩基性プロセシング部位に特異的であ
るプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を含み、前記プロテアーゼが、リーダー
連結ポリペプチドと共発現し、そしてプロセシング部位ＰＳにおいて、前記リー
ダー連結ポリペプチドを開裂する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記の共発現したプロテアーゼがトリプシン、アクロモバク
ター・リチカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｌｙｔｉｃｕｓ）のプロテアー
ゼＩ、エンテロキナーゼ、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏ
ｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼ又はＹＡＰ３である、請求項８
に記載の方法。
【請求項１０】前記プロテアーゼがＹＡＰ３又はその類似体、例えばＹＡ
Ｐ３Δ₁₈である、請求項９に記載の方法。