CN1302333A - 在酵母中制备目的多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了在酵母中制备目的多肽的方法。目的产物以通过单碱性氨基酸加工位点连接的前导序列结合多肽形式表达。在体内或体外通过酶促切割,将目的多肽与前导序列裂解开。

Description

在酵母中制备目的多肽的方法

发明领域

本发明涉及在酵母中通过表达融合多肽制备目的多肽的方法，该融合多肽含单碱性氨基酸(monobasic)蛋白酶加工位点。

发明背景

酵母产生许多在细胞内合成但具细胞外功能的蛋白质。这些细胞外蛋白质被称为分泌蛋白。开始时分泌蛋白在细胞内以含前肽序列的前体或前蛋白形式表达，该前肽序列保证表达产物有效定向(进入细胞分泌途径)穿越内质网(ER)膜。该前序列通常被称为信号肽，一般在转位期间从目的产物上断裂掉。一旦已进入分泌途径，蛋白质即被转运至高尔基体。蛋白质从高尔基体分配至质膜、溶酶体和分泌小泡。

已提出数种方法用于酵母异源蛋白质在酵母中的表达和分泌。欧洲公开的专利申请116201号描述了一种方法，通过该方法，由含编码目的蛋白质、前导序列和加工信号之DNA的表达载体所转化的酵母宿主表达、加工和分泌酵母异源蛋白质，制备转化生物的培养物，培养它并从培养基中回收蛋白质，该前导序列是酵母α-因子前导序列。

酿酒酵母MFα1(α-因子)以165个氨基酸的前原(pre-pro)形式合成，含19个氨基酸的信号肽或前肽(prepeptide)，随后是64个氨基酸的前导序列或原肽(propeptide)，包含其后为(LysArg((Asp/Glu)Ala)_2-3α-因子)₄的3个N-连接的糖基化位点(Clements等人，基因，106,1991,pp.267-272)。该文献描述了以改善KEX2加工为目的的KEX2位点的某些修饰。

前原MFα1(pre-pro MFα1)的信号-前导部分已广泛用于在酿酒酵母中获得异源蛋白质的合成及分泌。

欧洲公开的专利申请301669号描述了一种方法，通过该方法，前导序列，尤其是α-因子前导序列指导酵母中所表达的异源多肽的分泌。EP324274公开了通过截短糖基化α-因子前导序列可改进异源多肽的表达和分泌效率。

分泌多肽的进行路线使其暴露于蛋白水解加工系统，该系统切割两连续碱性氨基酸残基羧基端的肽键。酿酒酵母中，该酶促活性由KEX2基因编码(Julius,D.A.等人，基因，37,1884b,pp.1075)。通过KEX2蛋白酶加工产物对于活性酿酒酵母交配因子α1(MFα1或α-因子)的分泌是必需的，而KEX2不参与酿酒酵母交配因子a的分泌。

WO90/10075和WO95/35384描述了KEX2位点周围的修饰。此外，WO95/34666、WO92/11378和WO90/13653描述了在使用KEX2不现实的情况下可选择利用含有称为FXa的氨基酸Ile-Glu-Gly-Arg的次级加工位点。

在应用微生物学生物技术(Applied Microbiological Biotechnology)35(1991)771-776中，Seeboth等人描述了一种机制，通过此机制，在体外用可溶性KEX2加工酵母中的α-前导序列结合多肽(其中通过修饰KEX2基因而将其制成可溶性的)，从而提供了一种增强体外位点特异性加工的方法。在Kjeldsen等人发表于基因，170(1996)107-112的文献中描述了在双碱性氨基酸性(dibasic)KEX2位点之后插入间隔肽，产生多肽前体的N-末端延伸形式，大大促进了KEX2加工并提高了多肽前体的产量。

关于上述方法的一个已认识到的问题是，分泌水平可能会太低或蛋白水解加工可能不正确或不完全，导致目的产物产量较低。

本发明的目的是提供一种可确保目的多肽有高产量的酵母表达方法。

发明概述

本发明涉及通过表达和分泌不含KEX2加工位点的前导序列结合多肽，在酵母中制备目的多肽的方法。前导序列结合多肽包括通过单碱性氨基酸加工位点及可能还有间隔肽连接的天然α-因子前导肽和目的多肽。

更特别的是，本发明涉及通过于合适培养基中培养含能表达具下式序列之表达载体的酵母菌株在酵母内制备目的多肽的方法：

      SP-LP-Xn-PS-^*多肽^*其中SP是信号肽；LP是天然α-因子前导肽或与其至少具85％同源性的前导肽；PS是单碱性氨基酸加工位点Lys或Arg；X是含n个氨基酸的间隔肽；n是0或1-10的整数；和^*多肽^*是目的多肽；

附带条件是间隔肽X不是Ile-G1u-G1y、Leu-Pro、Lys-Lys-Leu-Ile-Asp、Ile-Asp或Pro-Gly-Asp-Pro，进一步的附带条件是间隔肽X不含KEX2切割位点，并且不与PS或LP一起构成KEX2切割位点，且当n=0时，前导肽的C末端不是Lys、Arg、I1e-Glu-Gly、Leu-Pro、Lys-Lys-Leu-Ile-Asp、Ile-Asp或Pro-Gly-Asp-Pro，因此在体内穿越细胞膜过程中或分泌到培养基中后在体外，前导序列结合多肽于加工位点PS处被切割，从而分离出目的多肽。

本发明还涉及编码以上前导序列结合多肽的DNA序列、含该DNA序列的表达载体及被该载体转化的酵母菌株。

附图简述

参考本文附图说明本发明：

图1是酵母表达质粒pMT742的图解说明。该质粒含用于表达MFα1pre-pro-(1-85)-MI3的基因。

以下符号被使用：

ScTPI启动子：来自酿酒酵母(Sc)的丙糖磷酸异构酶(TPI)基因启动子序列。

ScTPIterm.：来自酿酒酵母的TPI基因终止子序列。

POT基因：来自粟酒裂殖酵母的TPI基因。

POT：编码来自粟酒裂殖酵母的TPI的序列。

大肠杆菌质粒：来自质粒pBR322的序列及pUC13复制起点。

AMP-R：编码β-内酰胺酶的序列(氨苄青霉素抗性标记)。

酵母2μ质粒：来自Sc 2μ质粒、含其复制起点的序列。

发明详述

本发明所用前导肽(LP)优选天然的α-因子前导肽，它是MFα1(1-83)的原肽(SEQ ID N0:1)。在MFα1(1-83)中，残基1-19形成所谓的前序列或信号肽，而残基20-83形成所谓的原序列或前导肽。

可用众所周知的技术稍微修饰天然α-因子前导肽，从而将一些氨基酸残基缺失或用其它氨基酸残基取代。前导序列因而可在C-末端被修饰，其中可用其它氨基酸残基取代2-5个氨基酸残基以改善加工位点PS处的加工。优选地，被修饰的前导序列在氨基酸组成方面与天然α-因子前导肽同源性超过85％，更优选同源性超过90％。

在优选的实施方案中，用Met-Ala取代α-因子前导肽C-末端最后两个氨基酸残基。

本发明所用信号肽可以是能保证在穿越分泌途径时安全有效地引导所表达多肽的任何肽。术语“信号肽”必须理解为具安全指导所表达多肽穿越内质网膜的功能的前肽序列，其中信号肽在转位过程中被切除。信号肽可与酵母同源或与酵母异源。它可以是天然或合成的信号序列。信号肽位于前导序列的N-末端，且特性上明显疏水。优选SP是编码α-因子信号肽的DNA序列。其它合适的信号肽是酵母天冬氨酸蛋白酶3信号肽、小鼠唾液淀粉酶信号肽、羧肽酶信号肽和酵母BAR1信号肽。

按照本发明，通过利用对单碱性氨基酸加工位点(Lys、Arg)特异的蛋白酶完成前导序列结合多肽在加工位点PS处的切割。这样的蛋白酶例子有胰蛋白酶、水解无色杆菌蛋白酶Ⅰ、肠激酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。优选的蛋白酶是酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)。

从前导序列结合多肽上切割前导肽可在前导序列结合多肽分泌后于体外进行。可通过添加合适蛋白酶至培养基中进行切割，随后分离目的多肽。或者可自培养基分离出前导序列结合多肽并在分离后切割。

或者，可通过共表达对单碱性氨基酸蛋白酶位点PS特异的蛋白酶进行体内切割。

目的多肽可以是能表达于酵母细胞中的任何多肽，并可选自抑酶肽、组织因子途径抑制剂或其它蛋白酶抑制剂、胰岛素样生长因子Ⅰ或Ⅱ、人或牛生长激素、白介素、组织纤溶酶原激活剂、胰高血糖素、胰高血糖素样肽1、因子Ⅶ、因子Ⅷ、因子ⅩⅢ、血小板衍生生长因子和工业酶，以及它们的任何功能性类似物。优选的多肽是胰岛素、胰岛素类似物、胰岛素和胰岛素类似物的前体、胰岛素样生长因子或它们的功能性类似物。

多肽也可以是人胰高血糖素原家族的较小肽，诸如胰高血糖素GLP-1、GLP-2和GRPP，包括截短的形式，如GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)或它们的功能性类似物，如GLP1^*。

术语“功能性类似物”表示功能上与天然多肽相当，但与天然多肽相比有修饰的多肽。

功能性类似物与天然多肽的不同之处可以是其具有一个或多个氨基酸缺失、截短、取代或插入。氨基酸的缺失、截短、取代或插入可以位于序列内或C-末端或N-末端，或者其中两处，或者所有以上位点。

胰岛素前体的例子是具B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)结构的MI3，其中B(1-29)是缺失位置B(30)处的氨基酸残基的人胰岛素B链，而A(1-21)是人胰岛素的A链。

间隔肽X的功能是优化在加工位点PS处从目的多肽裂解下前导序列。重要的是前导肽(LP)和间隔肽(Ⅹ)均不包括KEX2加工位点。未与理论相结合，人们认为，前导肽或间隔肽中存在KEX2位点会由于分泌途径中的过早切割而降低分泌产物的产量。

间隔序列X可以是长达10个氨基酸残基(n=10)的任何多肽序列，只要它不含KEX2位点，并且不与单碱性氨基酸加工位点PS或前导肽LP一起形成KEX2位点即可。X将优选包括7个(n=7)氨基酸残基，更优选包括2个(n=2)氨基酸残基。在优选实施方案中，X是Lys-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala或Lys-Glu。

在另一优选实施方案中，n是0，意思是在前导序列(LP)和单碱性氨基酸加工位点(PS)之间无间隔序列。在这种情况下，前导肽C-末端必须不构成KEX2位点或KEX2样位点，还必须C-末端氨基酸残基不与PS一起形成KEX2位点。

本发明方法中所用的酵母细胞可选自Saccharomyces uvae、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖酵母、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、克鲁弗毕赤酵母(Pichia kluyveri)、Yarrowia lipolytica、假丝酵母之种(Candida sp.)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、可可假丝酵母(Candida cacaoi)、地霉属之种(Ceotrichum sp.)和Geotrichum fermentans。优选的酵母菌株是酿酒酵母。

可用编码特异于单碱性氨基酸加工位点之蛋白酶的基因转化酵母细胞，从而达到蛋白酶和目的多肽的共表达。

按照本发明，可应用本领域技术中的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中有完整的解释，参阅如Sambrook,Fritsch＆Maniatis,分子克隆：实验室手册，第二版(1989)冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约。可用已建立的标准方法制备DNA构建体，如由S.L.Beaucage和M.H.Caruthers描述于四面体通讯(TetrahedronLetters)22 1981,pp.1859-1869中的亚磷酰胺法，或由Matthes等人描述于EMBO Journal 3,1984,pp.801-805中的方法。可按照亚磷酰胺方法合成寡核苷酸(如在自动DNA合成仪上)并纯化、双链化和连接，以形成合成的DNA构建体。目前优选的制备DNA构建体的方法是用聚合酶链式反应(PCR)，如描述于Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，冷泉港，纽约，1989中。

可为线性或环状的表达载体应包括与可提供其转录的附加片段有效连接的编码目的多肽的DNA序列。这样的附加片段可包括启动子和终止子序列，及任选一个或多个复制起点，一个或多个选择标记、增强子、多聚腺苷酸化信号，等等。

合适的酵母启动子是MFα1启动子、半乳糖诱导型启动子(如GAL1、GAL7和GAL10启动子)、糖酵解酶启动子，包括TPI和PGK启动子，TRP1启动子、CYC1启动子、CUP1启动子、PHO5启动子、ADH1启动子和HSP启动子。其它可用于酵母宿主细胞的有效启动子描述于文献Romanos等人，1992，酵母8:423-488中。

表达载体一般还包含与编码目的多肽之核酸序列的3’末端有效连接的终止子。任何在酵母细胞中有功能的终止子均可用于本发明中。优选的终止子来自于编码酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)或酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶和交配因子MFα1的基因，或来自克鲁维酵母糖酵解和呼吸性基因。其他可用于酵母宿主细胞的有效终止子描述于文献Romanos等人，1992，同上中。

该载体优选含一个或多个可便于转化细胞选择的选择标记。选择标记是其产物可提供杀生物剂或病毒抗性、抗重金属抗性、使营养缺陷型成为原养型等等的基因。用于酵母宿主细胞的合适标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、URA3、TPI1、PGK以及遗传霉素-G418R和KANE.C基因。

为能进行自主复制，载体还进一步包含能使载体在酵母宿主中自主复制的复制起点。可用于酵母宿主细胞的复制起点例子是2μ复制起点、CEN6和ARS4的组合形式以及CEN3和ARS1的组合形式。复制起点可以具有突变，使其在宿主细胞中以温度敏感型方式起作用(参阅如Ehrlich,1978，美国国家科学院院报75:1433)。

优选的酵母表达载体是其特征为存在粟酒裂殖酵母丙糖磷酸异构酶(POT)基因的质粒。POT基因可用来选择转化子，还可保证质粒在丙糖磷酸异构酶(TPI)阴性酿酒酵母菌株中得到维持。

用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法对本领域技术熟练人员是众所周知的(参阅如Sambrook等人，1989，同上)。

可用以下文献所述方法转化酵母菌株：Becker和Guarente Abelson，J.N.和Simon,M.I.所编的《酵母遗传学和分子生物学指南》，酶学方法，第194册，pp182-187,Academic Press,Inc.，纽约；Ito等人，1983，细菌学杂志153:163；及Hinnen等人，1978，美国国家科学院院报75:1920。

鉴于本文所公开的教义，可在本领域技术熟练人员已知的合适条件下培养已转化的酵母宿主细胞足够长时间以使目的产物得以表达和分泌。

用本领域众所周知的方法分离和纯化产物。如果分泌和分离产物是活性多肽的前体，诸如胰岛素前体，则用诸如酶促转换之类的已知方法将该前体转换为活性多肽。

在整篇说明书和权利要求书中，均按生化命名法IUPAC-IUB委员会通过(1974)的规则使用氨基酸单字母或三字母符号，参阅生化命名法IUPAC-IUB委员会暂定规则和建议汇编，第二版，马里兰，1975。

通过以下实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1：酿酒酵母中前导序列/产物融合体的克隆和产生

在本项研究中使用了附加体衍生POT型的酵母表达质粒(Thim等人，PNAS83,1986,pp.6766-6770；Kjeldsen等人，基因170,1996,pp.107-112；PCT N0.95/00250和PCT No.97/00298)。

图1显示了称为pMT742的一个酵母质粒例子(Egel-Mitani等人，基因，73,1988,pp.113-120)。该质粒包括含有插入质粒中酿酒酵母TPI基因转录启动子和转录终止子之间的EcoRⅠ-XbaⅠ片段的表达盒。

在质粒pMT742中，EcoRⅠ-XbaⅠ片段编码融合产物，其包括MFα1前原前导序列(pre-pro leader)、双碱性氨基酸加工内肽酶KEX2的Lys-Arg切割位点以及单链小胰岛素前体MI3。

为了构建编码多种前导序列/产物融合体的质粒(见表1)，按PCT专利申请95/00250号所概述的，用合适的寡核苷酸通过PCR或重叠PCR技术在EcoRⅠ和XbaⅠ位点之间引入修饰，随后用标准分子方法(如，Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，纽约，1989)分离和克隆。

表1显示了前导序列/产物融合体的不同质粒构建体

表1质粒构建体

由EcoRⅠ-XbaⅠ片段编码的前导序列/产物融合体

质粒   前原前导序列  间隔子和加工位点^a  基因  共表达蛋白酶

pMT742  MFα1(1-83)    KR(comparison)    MI3      ÷

pJB162  MFα1(1-83)    K(=n=0)           MI3      ÷

pJB160  MFα1(1-81)MA  KEAEAEAK          MI3      ÷

pIM176  MFα1(1-81)MA  KEAEAEAK          MI3      YAP3

PIM37   MFα1(1-81)MA  KEAEAEAK          MI3      YAP3_△18

PIM172  MFα1(1-81)MA  KEK               MI3      ÷

pIM256  MFα1(1-81)MA  KEK               MI3      YAP3_△18

pKV231  MFα1(1-81)MA  KR(对照)          GLP-1^*   ÷

pKV248  MFα1(1-81)MA  K(=n=0)           GLP-1^*   ÷

^aK=Lys；R=Arg；E=Glu；A=Ala

在表1中，MFα1(1-83)是组成酿酒酵母交配因子α1前体的前导肽的前83个氨基酸。残基1-19形成所谓的前序列(信号肽)，而残基20-83形成所谓的原序列(前导肽)。

MFα1(1-83)(SEQ ID N0:1)氨基酸序列如下：Met-Arg-Phe-Pro-Ser-Ile-Phe-Thr-Ala-Val-Leu-Phe-Ala-Ala-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala-Ala-Pro-Val-Asn-Thr-Thr-Thr-Glu-Asp-Glu-Thr-Ala-Gln-Ile-Pro-Ala-Glu-Ala-Val-Ile-Gly-Tyr-Ser-Asp-Leu-Glu-Gly-Asp-Phe-Asp-Val-Ala-Val-Leu-Pro-Phe-Ser-Asn-Ser-Thr-Asn-Asn-Gly-Leu-Leu-Phe-Ile-Asn-Thr-Thr-Ile-Ala-Ser-Ile-Ala-Ala-Lys-Glu-Glu-Gly-Val-Ser-Leu-Asp

MFα1(1-81)MA是其中最后两个残基(Leu-Asp)已被Met-Ala取代的MFα1(1-83)。

MI3是缺乏人胰岛素第30号氨基酸残基(B30)并具有连接B29-Lys和Al-Gly之Ala-Ala-Lys桥的人胰岛素前体。

MI3(SEQ ID NO:2)具有如下氨基酸序列：Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-Ala-Lys-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn.

GLP-1^*是具额外C-末端赖氨酸残基并且第26和34位赖氨酸由精氨酸取代的人胰高血糖素样肽GLP-1(7-37)。

GLP-1^*(SEQ ID NO:3)所具氨基酸序列如下：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Lys

为了构建共表达真正YAP3或C-末端被截短之YAP3对应物YAP3_△18的质粒，将含特定DNA构建体的DNA片段插入POT基因3’末端的SalⅠ位点(见图1)。

该真正的YAP3基因来自pME768(Egel-Mitani等人，酵母，6,1990,pp.127-137)，包括0.6kb的转录启动子序列和0.3kb的转录终止子序列。

YAP3_△18基因构建体来自pME927，其中YAP3编码区已在C-末端编码部分被截短(Egel-Mitani等人，1990，出处同前)。这样的截短使最后18个密码子缺失，被两个额外的氨基酸密码子(Pro-Ile)及UAG翻译终止信号置换。如同YAP3基因构建体，YAP3_△18基因构建体包含真正的0.6kb YAP3基因转录启动子序列，但携带来自MFα1基因的0.3kb转录终止子序列。

将表达质粒于大肠杆菌中增殖，在氨苄青霉素存在条件下培养并用标准技术分离(Sambrook等人，1989，出处同前)。通过用恰当限制内切核酸酶(如EeoRⅠ、XbaⅠ和SalⅠ)检查质粒DNA中的插入片段，并通过序列分析显示其编码正确的前导序列/产物融合构建体。

分别将质粒DNA转化入如PCT申请95/00250号和97/00298所述的酿酒酵母株MT663(MATa/MAT αpep4-3/pep4-3 HIS4/his4     △tpi::LEU2/△tpi::LEU2)或ME1487(MATα△yap3::URA3pep4-3 △tpi::LEU leu2△ura3)。

通过在YDP(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)琼脂(2％)平板上利用葡萄糖作为碳源选择酵母转化子。

通过ALP消化和HPLC对分泌产物进行定量测定

在5ml YPD液体培养基中于30℃将转化子以200rpm速度振荡培养3天。2500rpm离心后收集培养物上清液并用以下方法分析分泌产物：

对于每种培养物，将630μl上清液的一份样品(A)与70μl 1M Tris缓冲液pH8.75混合，并补充100μg/ml Lys-Xaa特异性水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)蛋白酶Ⅰ(ALP)。

将630μl上清液的另一样品(B)与70μl 1M Tris缓冲液pH8.75混合，不加入ALP。两个样品均在37℃温育2小时并随后用HPLC分析。

通过分析B样品(无ALP)可测定无前导序列的分泌和加工产物多肽的产量(表2中的MI3和表3中的GLP-1^*)。

通过分析ALP消化的A样品，可测定分泌和未加工前原前导序列/产物融合体的产量(表2中的L-MI3和表3中的L-GLP-1^*)。ALP在B29及Ala-Ala-Lys连接桥的内部赖氨酸残基处切割。如果存在的话，ALP还在分隔前导序列和MI3的赖氨酸残基处切割未加工的前导序列/MI3融合体。因而，加工和未加工的MI3的总产量可检测为A样品中desB30胰岛素的量。通过从ALP加工产物的总产量中减去无前导序列产物的产量(获自B样品)可间接测定未加工(结合前导序列的)MI3的产量。

所分泌的前导序列结合多肽产量不能通过对样品进行HPLC分析而测定。这是由于前导序列原部分有大量糖基化(过糖基化)。

然而，在MI3相关产物的参照质粒pMT742的情况下，通过测定在B链具额外N-末端精氨酸残基的desB30(“BOArg-desB30”)的量，可直接确定A样品中未加工的前原序列/MI3融合体的产量。BOArg-desB30胰岛素来源于在未加工的KEX2加工位点处Lys和Arg之间发生的切割。

表2显示了用MT663中MI3相关质粒构建体获得的相对产量。酵母株MT663已根据WO92/11378的申请保藏于Deutche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen中，给出的保藏号为DSM6278。该特殊酵母株已证实在质粒构建体表达和随后的多肽分泌中是非常合适和成功的。

表2.用MT663中MI3相关质粒构建体得到的相对产率

质粒      总量    MI3    L-MI3

PMT742    175a    100     75a

PJB162    290     ＜1     290

PJB160    220     15      205

PIM176    160     70      90

PIM37     150     140     10

PIM172    265     25      240

PIM256    170        170

＜1

发酵产量相应于用pMT742获得的MI3产量。通过检测未处理上清中的MI3确定MI3的产量。总产量检测为用ALP处理的上清中desB30胰岛素的产量，相对于获自pMT742的ALP处理上清的desB30胰岛素产量。通过从总产量中减去MI3的产量计算前导序列结合MI3(L-MI3)的产量。

^a：在pMT742的情况下，L-MI3测量为BO(Arg)-desB30胰岛素，相对于从来自pMT742之上清的ALP处理物中获得的desB30胰岛素产量，总产量计算为这些数据的总和。

表2中的结果显示，具本发明的切割位点且无共表达蛋白酶的构建体(即pJB162、pJB160和pIM172)产生比pMT742更多的MI3相关产物(即分别为165％、125％和150％)。此外，因为通过ALP消化可将前导序列结合MI3(除前导序列结合的Arg-desB30之外)转变为desB30胰岛素，故对于这些构建体来说，可用于人胰岛素生产的desB30胰岛素产量比pMT742构建体更高(290％、220％和265％)。对于表2中所述的其它构建体也是如此(即“总量”=desB30量)。此外，共表达YAP3_△18的pIM37和pIM256均比pMT742产生更多的体内加工MI3(分别为140％和170％)。MI3可用于纯化，而高糖基化的未加工前导序列原/MI3融合体产物却并非如此。表3.用ME1487中的胰高血糖素样肽GLP-1^*相关构建体获得的相应产量

质粒    GLP-1^*  L-GLP-1^*

pKV231    100    ＜1

pKV248    ＜1    375

发酵产量相应于用pKV231获得的GLP-1^*的产量。通过检测未处理上清中的GLP-1^*确定GLP-1^*的产量。从ALP处理上清的GLP-1^*产量中减去未处理上清的GLP-1^*产量，由此计算(原-)前导序列结合GLP1-1^*(L-GLP1-1^*)的产量。

在GLP1^*相关产物的参照质粒pKV231的情况下，不存在未加工的原前导序列/GLP1^*融合体，因为在ALP消化的A样品中不能检测到具额外N-末端精氨酸的GLP1^*(表3)。在pKV248的情况下，B样品中检测不到被加工的GLP1^*，而GLP1^*的量是用pKV231在ALP消化的A样品中获得量的375％。

                   序列表(1)一般信息：

(ⅰ)申请人

  (A)名称：Novo Nordisk A/S

  (B)衔道：Novo Alle

  (C)城市：Bagsvaerd

  (E)国家：丹麦

  (F)邮编(ZIP)：2880

(ⅱ)发明题目：制备多肽的方法

(ⅲ)序列数目：3

(ⅳ)计算机可读形式：

  (A)介质类型：软盘

  (B)计算机：IBM PC兼容

  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

  (D)软件：Patentln Release#1.0,Version、#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的资料：

(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：83个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1        5              10          15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln20           25            30Ile Pro Ala Glu Ala Val lle Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe35          40            45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu50             55          60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65          70           75             80Ser Leu Asp(2)SEQ ID NO:2的资料：

(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：53个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1         5           10            15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys20          25            30Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu35          40           45Glu Asn Tyr Cys Asn     50(2)SEQ ID NO:3的资料：

(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：32个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1         5            10            15Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Lys20              25              30

Claims (10)

1．通过于合适培养基中培养含有能表达下式序列的表达载体的酵母株，在酵母中制备目的多肽的方法，

      SP-LP-Xn-PS-^*多肽^*其中

SP是信号肽；

LP是天然α-因子前导肽或与其至少85％同源的前导肽；

PS是单碱性氨基酸加工位点Lys或Arg；

X是含n个氨基酸的间隔肽；

n是0或1-10的整数；并且

“多肽”是目的多肽；

条件是间隔肽X不是Ile-Glu-Gly、Leu-Pro、Lys-Lys-Leu-Ile-Asp、Ile-Asp或Pro-Gly-Asp-Pro，进一步的条件是间隔肽X不含KEX2切割位点，并且不与PS或LP一起构成KEX2切割位点，且当n=0时，前导肽C-末端不是Lys、Arg、Ile-Glu-G1y、Leu-Pro、Lys-Lys-Leu-Ile-Asp、Ile-Asp或Pro-Gly-Asp-Pro，从而前导序列结合的目的多肽在体内穿越细胞膜期间或分泌至培养基中后于体外在加工位点PS处被切割，由此分离目的多肽。

2．按照权利要求1的方法，其中SP是与酵母同源的信号肽。

3．按照权利要求2的方法，其中SP是α-因子信号肽、酵母天冬氨酸蛋白酶3信号肽、小鼠唾液淀粉酶信号肽、羧肽酶信号肽或酵母BARl信号肽。

4．按照权利要求1的方法，其中PS是Lys。

5．按照权利要求1的方法，其中X是Lys-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala或Lys-Glu。

6．按照权利要求1的方法，其中n是从1至3的整数。

7．按照权利要求1的方法，其中n=0。

8．按照权利要求1的方法，其中酵母株包括编码特异于单碱性氨基酸加工位点的蛋白酶的DNA序列，所说的蛋白酶与前导序列结合多肽共表达并在加工位点PS处切割前导序列结合多肽。

9．按照权利要求8的方法，其中共表达的蛋白酶是胰蛋白酶、水解无色杆菌蛋白酶Ⅰ、肠激酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶或YAP3。

10．按照权利要求9的方法，其中所述蛋白酶是YAP3或其类似物，诸如YAP3_△18。

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