JP3676369B2 - 合成リーダーペプチド配列類 - Google Patents
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Description
本発明は、酵母においてポリペプチドを分泌するための合成リーダーペプチド配列類に関する。
発明の背景
酵母生物は、細胞内合成されるが、しかし細胞外での機能を有する多くのタンパク質を生成する。そのような細胞外タンパク質は分泌されたタンパク質として言及される。それらの分泌されたタンパク質は、小胞体(ER)の膜を通してその発現された生成物の効果的な方向性を確保するプレ配列を含む、前駆体又はプレ−タンパク質形で細胞の内部で初め発現される。通常シグナル配列と称するプレ配列は一般的に、トランスロケーションの間、所望する生成物から分離される。分泌経路に入った後すぐに、そのタンパク質はゴルジ体に運ばれる。そのゴルジ体から、タンパク質は、細胞液胞又は細胞膜のような区画に導く異なった経路に従い、又はそれは外部媒体に分泌されるよう細胞から経路を定められ得る(Pfeffer,S.R.and Rothman,J.E.Ann.Rev.Biochem.56(1987)829-852)。
いくつかのアプローチが、酵母に対して異種のタンパク質の酵母における発現及び分泌のために提案されて来た。公開されたヨーロッパ特許出願第88632号は、所望するタンパク質及びシグナルペプチドをコードするDNAを有する発現ビークルにより酵母生物を形質転換し、その形質転換された生物の培養物を調製し、そしてその培養培地からタンパク質を回収することによって、酵母に対して異種のタンパク質が発現され、プロセッシングされ、そして分泌される方法を記載する。シグナルペプチドは、所望するタンパク質自体のシグナルペプチド、異種シグナルペプチド又は生来のシグナルペプチドと異種シグナルペプチドとのハイブリットであり得る。
酵母に対して異種のシグナルペプチドの使用に関して遭遇する問題は、その異種シグナルペプチドが効果的なトランスロケーション及び/又はそのシグナルペプチド後の分離を確実にしないことである。
サッカロミセス セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)MFα1(α−因子)が、N−連結されたグルコシル化部位、続いて、(LysArg((Asp/Glu)Ala)2-3α因子)4を包含する、19個のアミノ酸のシグナル−又はプレペプチド、続く64個のアミノ酸の“リーダー”又はプロペプチドを含んで成る165個のアミノ酸のプレプロ形として合成されている(Kurjan,J.and Herskowitz,I.Cell 30(1982)933-943)。プレプロMFα1のシグナル−リーダー部分は、S.セレビシアエにおいて異種タンパク質の合成及び分泌を得るために広く使用されて来た。
酵母に対して同種のシグナル/リーダーペプチドの使用は、アメリカ特許第4,546,082号明細書、公開されたヨーロッパ特許出願第116201号、第123294号、第123544号、第163529号及び第123289号、及びデンマーク特許出願第3614183号から知られている。
ヨーロッパ特許第123289号においては、S.セレビシアエα−因子前駆体の利用が記載されており、そしてWO84/01153はS.セレビシアエインベルターゼシグナルペプチドの利用を示しており、そしてDK3614/83は外来性タンパク質の分泌のためへのS.セレビシアエPHO5シグナルペプチドの利用を示している。
アメリカ特許第4,546,082号明細書、ヨーロッパ特許第16201号、第123294号、第123544号及び第163529号は、S.セレビシアエ(MFα1又はMFα2)からのα−因子シグナル−リーダーが酵母における発現された異種タンパク質の分泌工程に利用される方法を記載する。S.セレビシアエMFα1をコードするDNA配列を融合することによって、所望するタンパク質分泌及び所望するタンパク質のプロセッシングのための遺伝子の5′端でのシグナル/リーダー配列が示された。
ヨーロッパ特許第206783号は、α−因子プロセッシング部位LysArgGluAla GluAlaを通して異種ポリペプチドに融合されるリーダーペプチド自体を残すために生来のリーダー配列上に存在する4種のα−因子単位を排除するよう切断されたα−因子リーダー配列を用いてのS.セレビシアエからのポリペプチドの分泌のためのシステムを開示する。この構成は、より小さなペプチド(50個よりも少ないアミノ酸)の効果的なプロセッシングを導くことを示される。より大きなポリペプチドの分泌及びプロセッシングのためには、生来のα−因子リーダー配列が、リーダーペプチドとポリペプチドとの間に1又は2つのα−因子単位を残すように切断されている。
多くの分泌されたタンパク質が、2個の連続した塩基性アミノ酸のカルボキシ端でペプチド結合を切断できるタンパク質分解性プロセッシングシステムに暴露されるよう経路を定められる。この酵素活性は、KEX2遺伝子によりコードされるS.セレビシアエに存在する(Julius,D.A.など.,Cell 37(1984b)1075)。KEX2プロテアーゼによる生成物のプロセッシングは活性S.セレビシアエ接合因子α1(MFα1又はα−因子)の分泌のために必要とされるが、ところがKEX2は活性S.セレビシアエ接合因子αの分泌に包含されない。
分泌される予定であるポリペプチドの分泌及び正しいプロセッシングは、上記文献に示されるようにして構成されたベクターにより形質転換される酵母生物を培養する場合に得られる。しかしながら、多くの場合、分泌のレベルはひじょうに低いか、又は分泌は存在せず、又はタンパク質分解性プロセッシングは不正解か又は不完全である。従って、ポリペプチドのより効果的な発現及び/又はプロセッシングを確保するリーダーペプチドを供給することが本発明の目的である。
発明の要約
驚くべきことには、酵母においてポリペプチドの高い収率での分泌を可能にする新規タイプのリーダーペプチドが見出された。
従って、本発明は、次の配列:
5′-P-SP-LS-PS-*遺伝子*-(T)i-3′
〔配列中、Pはプロモーター配列であり;
SPはシグナルペプチドをコードするDNA配列であり;
LSは下記一般式(I):
(式中、X1はペプチド結合又はコードできるアミノ酸であり;X2はペプチド結合、コードできるアミノ酸、又は同じであっても又は異なっていても良い4個までのコードできるアミノ酸の配列であり;Zはコードできるアミノ酸であり、但しProを除き;そしてX3は同じであっても又は異なっていても良い4〜30個のコードできるアミノ酸の配列である)で表わされるリーダーペプチドをコードするDNA配列であり;
PSはプロセッシング部位をコードするDNA配列であり;
*遺伝子*はポリペプチドをコードするDNA配列であり;
Tはターミネーター配列であり;そして
iは0又は1である〕を含んで成るDNA発現カセットに関する。
本明細書においては、用語“リーダーペプチド”とは、その機能が発現されたポリペプチドを小胞体からゴルジ体に及びさらに、媒体中への分泌のための分泌小胞に指図すること(すなわち、細胞壁を横切って又は少なくとも細胞膜を通して発現されたポリペプチドの細胞周辺胞中への輸送)を可能にするペプチドを示唆するものとして理解される。リーダーペプチドと共に使用される用語“合成”とは、リーダーペプチドが天然において見出されないものであることを示唆する。
用語“シグナルペプチド”とは、天然においては主に疎水性であり、そして酵母において発現される細胞外タンパク質の前駆体形のN−末端配列として存在するプレ配列を意味することが理解される。シグナルペプチドの機能は、発現されたタンパク質の小胞体に入るためへの分泌を可能にすることである。シグナルペプチドは通常、この工程の間に分割される。シグナルペプチドは、タンパク質を生成する酵母生物に対して異種であっても又は同種であっても良い。
用語“ポリペプチド”とは、異種ポリペプチド、すなわち天然において宿主酵母生物により生成されないポリペプチド、及び同種ポリペプチド、すなわち天然において宿主酵母生物において生成されるポリペプチド、並びにそれらのいづれかのプレフォームを示唆するものとして意図される。好ましい態様においては、本発明の発現カセットは異種ポリペプチドをコードする。
用語“コードできるアミノ酸”とは、ヌクレオチドのトリプレット(“コドン”)によりコードされ得るアミノ酸を示唆するものとして意図される。
本明細書に与えられるアミノ酸配列において、スラッシュにより分離される、2つのアミノ酸の3文字コードが括弧で与えられる場合、たとえば(Asp/Glu)の場合、これは、配列が適切な位置にそれらのアミノ酸の1つ又は他のアミノ酸のいづれかを有することを示唆するものとして意図される。
さらなる観点においては、本発明は、ポリペプチドを発現することができ、そして本発明のリーダーペプチド配列を包含する上記のような酵母発現ベクターにより形質転換される酵母細胞を、ポリペプチドの発現及び分泌を得るために適切な培地において培養し、この後、ポリペプチドを培地から回収することを含んで成る、酵母においてポリペプチドを生成するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
本発明は添付される図面に関してさらに次のように説明される。
図1はプラスミドpAK492を図解して示し;
図2はシグナルペプチド/リーダー/MI3インスリン前駆体をコードするDNA配列の一部を示し;
図3はプラスミドpAK546の構成を示し;
図4はリーダー配列番号4のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示し;
図5はYAP3シグナルペプチド、リーダー配列番号4及びMI3インスリン前駆体をコードするS.セレビシアエ発現プラスミドpAK546のDNA配列、及びコードされたアミノ酸配列を示し;
図6はリーダー配列番号6のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示し;
図7はリーダー配列番号8のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示し;
図8はリーダー配列番号17のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示し;
図9はリーダー配列番号16のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示し;
図10はリーダー配列番号19のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示し;
図11はリーダー配列番号20のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示し;
図12はリーダー配列番号21のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示し;
図13は配列番号4及び6の構成において直接的な鋳型として使用される、pAK527のDNAフラグメントを示し;
図14は配列番号8の構成において直接的な鋳型として使用される、pAK531のDNAフラグメントを示し;
図15は配列番号16及び17の構成において直接的な鋳型として使用される、pAK555のDNAフラグメントを示し;
図16は配列番号19及び20の構成において直接的な鋳型として使用される、pAK559のDNAフラグメントを示し;
図17は配列番号21の構成において直接的な鋳型として使用される、pAK562のDNAフラグメントを示し;
図18はリーダー配列番号27のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列番号66を示し;
図19はN−末端拡張されたMI3インスリン前駆体のアミノ酸配列(配列番号70)及びそれをコードするDNA配列(配列番号71)を示し;
図20はリーダー配列番号67のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列(配列番号69)を示し;
図21は配列番号27の構成において直接的な鋳型として使用される、pAK614のDNAフラグメント配列番号72を示し;そして
図22は配列番号67の構成において直接的な鋳型として使用される、pAK625のDNAフラグメント配列番号73を示す。
発明の詳細な開示
一般式IにおけるX1がアミノ酸を示す場合、それは好ましくは、Ser,Thr又はAlaである。一般式IにおけるX2が1つのアミノ酸を示す場合、それは好ましくはSer,Thr又はAlaである。一般式IにおけるX2が2つのアミノ酸の配列を示す場合、それは好ましくは、SerIleである。一般式IにおけるX2が3個のアミノ酸の配列を示す場合、それは好ましくは、Ser Ala Ileである。一般式IにおけるX2が4個のアミノ酸の配列を示す場合、それは好ましくは、Ser Phe Ala Thrである。好ましい態様において、X3は下記一般式(II):
X4−X5−X6 (II)
〔式中、X4は同じであっても又は異なっていても良い1〜21個のコードできるアミノ酸の配列であり、X5はPro又はアミノ酸配列ValAsnLeu又はLeuAlaAsnValAlaMetAlaの1つであり、そしてX6は同じであっても又は異なっていても良い1〜8個のコードできるアミノ酸の配列である〕で表わされるアミノ酸配列である。
一般式IIにおいて、X4は好ましくは、LeuValAsnLeu,SerValAsnLeu,MetAlaAsp,ThrGluSer,ArgPheAlaThr又はValAlaMetAlaの1つ又は複数を含むアミノ酸配列であり:又はX4は配列AsnSerThr又はAsnThrThrを含むアミノ酸配列であり;又はX4は下記配列を含むアミノ酸配列であり:
又はX4は下記配列を含むアミノ酸配列であり:
それらのいづれかの組合せである。
一般式IIにおいて、X5は好ましくは、Pro、又は配列ValAsnLeu,LeuAlaAsnValAlaMetAla,LeuAspValValAsnLeuProGly又はLeuAspValValAsnLeuIleSerMetを含むアミノ酸配列である。
一般式IIにおけるX6が1つのアミノ酸を示す場合、それは好ましくは、Ala,Gly,Leu,Thr,Val又はSerである。一般式IIにおけるX6が2つのアミノ酸の配列を示す場合、それは好ましくは、GlyAla又はSerAlaである。一般式IIにおけるX6が3個のアミノ酸の配列を示す場合、それは好ましくは、AlaValAlaである。一般式IIにおけるX6が8個のアミノ酸の配列を示す場合、それは好ましくは、
GlyAlaAspSerLysThrValGlu.である。
DNA配列LSによりコードされる好ましいリーダーペプチドの例は下記のものである:
DNA配列LSによりコードされる特に好ましいリーダーペプチドは下記のものである。
シグナル配列(SP)は、細胞の分泌経路中への発現されたポリペプチドの効果的な指図を確保するいづれかのシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは、天然に存在するシグナルペプチド又はその機能的部分であり得、又はそれは合成ペプチドでもあり得る。適切なシグナルペプチドは、α−因子シグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド、変性されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド、酵母BAR1シグナルペプチド又はヒューミコララヌギノーザ(Humicola lanuginosa)リパーゼシグナルペプチド、又はそれらの誘導体であることが見出された。マウスの唾液アミラーゼシグナル配列が、Hagenbuchle,O.など.,Nature 289(1981)643-646により記載されている。カルボキシペプチダーゼシグナル配列は、Valls,L.A.など.,Cell 48(1987)887-897により記載されている。BAR1シグナルペプチドはWO87/02670に開示されている。酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3シグナルペプチドはデンマーク特許出願第0828/93号に記載されている。
DNA配列PSによりコードされる酵母プロセッシング部位は適切には、Lys及びArgのいづれか対合された組合せ、たとえばサッカロミセス・セレビシアエのKEX2プロテアーゼ又は他の酵母種における同等のプロテアーゼによりポリペプチドのプロセッシングを可能にする、LysArg,ArgLys,ArgArg又はLysLysであり得る(Julins,D.A.など.,Cell 37(1984)1075)。KEX2プロセッシングが便利でない場合、たとえばそれが所望する生成物内の2つの連続的な塩基性アミノ酸の存在により、ポリペプチド生成物の分解を導く場合、ポリペプチド生成物に見出されないアミノ酸の組合せを含んで成る、もう1つのプロテアーゼのためのプロセッシング部位、たとえばEXaのためのプロセッシング部位IleGluGlyArgが選択され得る(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及びManiatis,T.,Molocular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,1989)。
本発明の方法により生成されるタンパク質は、酵母において都合良く生成され得るいづれかのタンパク質であり得る。そのようなタンパク質の例は、異種タンパク質、たとえばアプロチニン、組織因子経路インヒビター又は他のプロテアーゼインヒビター、インスリン又はインスリン前駆体、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、GLP-1,IGF-I,IGF-II、組織プラスミノーゲン活性化因子、形質転換成長因子α又はβ、血小板由来の成長因子、酵素又はそれらの機能的類似体である。本明細書において、用語“機能的類似体”とは、生来のタンパク質に類似する機能を有するタンパク質を示唆することを意味する(これは生来のタンパク質の生物学的活性のレベルよりもむしろ性質に関連するものとして理解されることを意図される)。タンパク質は生来のタンパク質に構造的に類似することができ、そして生来のタンパク質のC−及びN−末端のいづれか又は両者への1又は複数のアミノ酸の付加、生来のアミノ酸配列における1又は多数の異なった部位での1又は複数のアミノ酸の置換、生来のタンパク質のいづれかの又は両方の末端で又はアミノ酸配列における1又はいくつかの部位での1又は複数のアミノ酸の欠失、又は生来のアミノ酸配列における1又は複数の部位での1又は複数のアミノ酸の挿入により生来のタンパク質から誘導され得る。そのような変性は、上記いくつかのタンパク質のために良く知られている。また、他のタンパク質のための前駆体又は中間体は、本発明の方法により生成され得る。そのような前駆体の例は、アミノ酸配列B(1−29)AlaAlaLys A(1−21)(ここで、A(1−21)はヒトインスリンのA鎖であり、そしてB(1−29)はThr(B30)がミッシングしているヒトインスリンのB鎖である)を含んで成るMI3インスリン前駆体である。
リーダー配列をコードする好ましいDNA構造体は、図1〜12に示される通りであり又はそれらの適切な変性体である。DNA配列の適切な変性の例は、タンパク質のもう1つのアミノ酸配列を生ぜしめないが、しかしDNA構造体が挿入される酵母生物のコドン使用法に対応することができるヌクレオチド置換、又は異なったアミノ酸配列及び従って、たぶん、異なったタンパク質構造体を生ぜしめるヌクレオチド置換である。可能な変性の他の例は、配列中への1又は複数のコドンの挿入、配列のいづれかの端での1又は複数のコドンの付加及び配列の又は配列内のいずれかの端での1又は複数のコドンの欠失である。
発現カセット:5′-P-SP-LS-PS-*遺伝子*-(T)i-3′
(ここで、P,SP,LS、*遺伝子*、T及びiは上記の通りである)を担持する組換え発現ベクターは、酵母生物において複製できるいづれかのベクターであり得る。プロモーターは、酵母において転写活性を示すいづれかのDNA配列であり得、そして酵母に対して同種又は異種のいづれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来する。プロモーターは好ましくは、酵母に対して異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来する。適切なプロモーターの例は、サッカロミセス・セレビシアエMFα1,TPI,ADH又はPGKプロモーターである。
上記に示される配列は好ましくは、また適切なターミネーター、たとえばTPIターミネーターに操作可能的に連結されるべきである(Alber,T.and Kawasaki,G.,J.Mol.Appl.Genet.1(1982)419-434)。
本発明の組換え発現ベクターはさらに、酵母においてベクターの複製を可能にするDNA配列を含んで成る。そのような配列の例は、酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP1-3及び複製の起点である。ベクターはまた、選択可能マーカー、たとえばRussell,P.R.,Gene 40(1985)125-130により記載されるようなスキゾサッカロミセス・ポムベ(Schizosaccharomyces pombe)TPI遺伝子も含むことができる。
配列5′-P-SP-LS-PS-*遺伝子*-(T)i-3′を連結し、そしてそれを酵母複製のために必要な情報を含む適切な酵母ベクター中に挿入するために使用される方法は、当業者に良く知られている(たとえば、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.,前記)。ベクターは、まず完全な配列5′-P-SP-LS-PS-*遺伝子*-(T)i-3′を含むDNA構造体を調製し、そして続いて、このフラグメントを適切な発現ベクター中に挿入することによって、又は個々の要素(たとえばプロモーター配列、シグナルペプチド、リーダー配列GlnProIle(Asp/Glu)(Asp/Glu)X1(Glu/Asp)X2Asnz(Thr/Ser)X3、プロセッシング部位、ポリペプチド及び存在するなら、ターミネーター配列)のための遺伝子情報を含む適切なベクター中にDNAフラグメントを連続的に挿入し、続いて連結することによって構成され得ることが理解されるであろう。
本発明の方法に使用される酵母生物は、培養に基づいて、多量の所望するポリペプチドを生成するいづれかの適切な酵母生物であり得る。適切な酵母生物の例は、酵母種サッカロミセス・セレビシアエ,サッカロミセス・クルベク(Saccharomyces Kluvveri)、スキゾサッカロミセス・ポムベ又はサッカロミセス・ウバルム(Saccharomyces uvarum)の株である。酵母細胞の形質転換はたとえば、それ自体既知の手段でのプロトプラスト形成、続く形質転換によりもたらされ得る。細胞を培養するために使用される培地は、酵母生物を増殖するのに適切ないづれかの従来の培地であり得る。分泌されたポリペプチド(この有意な割合が正しくプロセッシングされた形で培地に存在するであろう)は、従来の方法、たとえば遠心分離又は濾過により培地から酵母細胞を分離し、塩、たとえば硫酸アンモニウムにより上清液又は濾液のタンパク質性成分を沈殿せしめ、続いて種々のクロマトグラフィー方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、又は同様の方法により精製することによって、培地から回収され得る。
本発明は次の例によりさらに記載されるが、それらの例は本発明を限定するものではない。
例
プラスミド及びDNA材料
すべての発現ベクターはC-POTタイプのものである。そのようなプラスミドは、ヨーロッパ特許出願第171142号に記載されており、そしてプラスミドの選択及び安定化のためにスキゾサッカロミセス・ポムベトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(POT)を含むことにおいて特徴づけられる。POT−遺伝子を含むプラスミドは、寄託されたE.コリ株(ATCC 39685)から入手できる。そのプラスミドはさらに、S.セレビシアエトリオースリン酸イソメラーゼプロモーター及びターミネーター(PTPI及びTTPI)を含む。それらは、pMT742(Egel-Mitani,M.など.,Gene 73(1988)113-120)(図1を参照のこと)と同一であるが、但し、シグナル/リーダー/生成物のためのコード領域を包含するEcoRI-XbaI制限部位により定義される領域を除く。
プラスミドpAK527,pAK531,pAK555,pAK559,pAK562,pAK614及びpAK625を、例に記載されるリーダーの構成に適用されるPCR反応におけるDNA鋳型として使用した。直接的な鋳型として作用する合成DNAフラグメントは図13〜17に示されている。示されるDNA領域を除いて、プラスミドは図1に示されるpAK492と同一である。
合成DNAフラグメントを、ホスホラミジット化学及び市販の試薬(Beaucage,S.L.and Caruthers,M.H.,Tetrahedron Letters 22(1981)1859-1869)を用いて、自動DNA合成機(Applied Biosystems model 380A)上で合成した。
使用されるすべての他の方法及び材料は、当業者の知識の範囲内である(たとえば、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,1989を参照のこと)。
例 1.
S.セレビシアエ(yAK546株)におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号4の合成
リーダー配列番号4は次のアミノ酸配列を有する:
次のオリゴヌクレオチドを合成した:
次のポリメラーゼ鎖反応(PCR)を、製造業者の説明書に従って、Gene Amp PCR反応キット(Perkin Elmer,761 Main Avewalk,CT 06859,USA)を用いて行った。反応の間、PCR混合物を、100μlの鉱油(Sigma Chemical Co.St.Louis MO,USA)により被覆した:
ポリメラーゼ鎖反応No.1
5μlのオリゴヌクレオチド#94(50pモル)
5μlのオリゴヌクレオチド#333(50pモル)
10μlの10X PCR緩衝液
16μlのdNTP混合物
0.5μlのTaq酵素
鋳型としての0.5μlのpAK527プラスミド(図13)(0.2μgのDNA)
63μlの水
合計12回のサイクルを実施し、1つのサイクルは94℃で1分;37℃で2分;72℃で3分であった。次に、PCR混合物を2%アガロースゲル上に負荷し、そして電気泳動を標準技法(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.,前記)を用いて行った。得られるDNAフラグメントをアガロースゲルから切断し、そして製造業者の説明書に従って、Gene Cleanキット(Bio 101 inc.,PO BOX 2284,La Jolla,CA 92038,USA)を用いて単離した。
ポリメラーゼ鎖反応No.2
5μlのオリゴヌクレオチド#312(50pモル)
5μlのオリゴヌクレオチド#94(50pモル)
10μlの10X PCR緩衝液
16μlのdNTP混合物
0.5μlのTaq酵素
10μlのPCR No.1からの精製されたDNAフラグメント
53.5μlの水
合計12回のサイクルを実施し、1つのサイクルは94℃で1分;37℃で2分;72℃で3分であった。ポリメラーゼ鎖反応No.2からのDNAフラグメントを単離し、そして製造業者の説明書に従って、Gene Cleanキット(Bio 101 inc.,PO BOX 2284,La Jolla,CA 92038,USA)を用いて精製した。
精製されたPCR DNAフラグメントを10μlの水及び制限エンドヌクレアーゼ緩衝液に溶解し、そして標準技法(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.,前記)に従って合計15μlの体積での制限エンドヌクレアーゼAsp718及びHindIIIにより切断した。167bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動にかけ、そして上記のようにしてGene Cleanキットを用いて精製した。S.セレビシアエ発現プラスミドpAK492(図1に示される)は、前で記載されたプラスミドpMT742の誘導体であり、ここで、シグナル/リーダー/インスリン前駆体をコードするフラグメントが図2に示されるEcoRI-XbaIフラグメントにより置換されている。このフラグメントを、製造業者の説明書に従って、Applied Biosystems DNA合成機により合成する。プラスミドpAK492を、制限エンドヌクレアーゼAsp718及びXbaIにより切断し、そして10986bpのベクターフラグメントを単離した。プラスミドpAK492を、制限エンドヌクレアーゼHindIII及びXbaIにより切断し、そしてMI3インスリン前駆体の一部をコードする140bpのDNAフラグメントを単離した。前記3種のDNAフラグメントを、標準条件下でT4 DNAリガーゼを用いて一緒に連結した(Sambrook,J.,Fritcsh,E.F.and Maniatis,T.,前記)。次に、連結混合物により、成分E.コリ株(R−,M+)を形質転換し、そして形質転換体を耐アンピシリン性により同定した。プラスミドを、標準のDNA miniprep技法(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.,前記)を用いて得られるE.コリのコロニーから単離し、適切な制限エンドヌクレアーゼ、すなわちEcoRI,XbaI,NcoI及びHindIIIにより調べた。選択されたプラスミドpAK546を、プライマー#94を用いてDNA配列決定分析(Sequenase,U.S.Bio Chemical Corp.)により示し、これはリーダー配列番号4をコードするDNA配列を含んでいた。リーダー配列番号4をコードするDNA配列のためには、図4を参照のこと。プラスミドpAK546を用いて、公開されたヨーロッパ特許出願第214826号に記載されるようにしてS.セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得られる株を、yAK546と称した。発現プラスミドのタンパク質コード領域のDNA配列は図5に与えられる。
例 2.
S.セレビシアエ(yAK531株)におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号6の合成
リーダー配列番号6は次のアミノ酸配列を有する:
次のオリゴヌクレオチドを合成した。
ポリメラーゼ鎖反応を例1に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌクレオチド#331を、オリゴヌクレオチド#333の代わりに使用した。
168bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントをアガラスゲル上での電気泳動にゆだね、そして例1に記載されるようにして精製した。Asp718/HindIII DNAフラグメントを例1に記載されるようにしてS.セレビシアエ発現プラスミド中にサブクローン化した。選択されたプラスミドpAK531を例1に記載されるようにしてDNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号6をコードするDNA配列を含むことを示した。リーダー配列番号6をコードするDNA配列に関しては、図6を参照のこと。プラスミドpAK531を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721.1号に記載されるようにして、S.セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得られる株をyAK531と命名した。シグナルペプチド及びインスリン前駆体をコードするDNA配列は、図5に示される配列と同じであった。
例 3.
S.セレビシアエ(yAK547株)におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号8の合成
リーダー配列番号8は次のアミノ酸配列を有する:
次のオリゴヌクレオチドを合成した:
ポリメラーゼ鎖反応を例1に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌクレオチド#345をオリゴヌクレオチド#333の代わりに用い、そしてプラスミドpAK531(図14)を鋳型として使用した。
171bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動にゆだね、そして例1に記載されるようにして精製した。そのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、例1に記載されるようにしてS.セレビシアエ発現プラスミド中にサブクローン化した。選択されたプラスミドpAK547を、例1に記載されるようにしてDNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号8をコードするDNA配列を含むことを示した。リーダー配列番号8をコードするDNA配列に関しては、図7を参照のこと。プラスミドpAK547を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721.1号に記載されるようにしてS.セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得られる株をyAK547と命名した。シグナルペプチド及びインスリン前駆体MI3をコードするDNA配列は、図5に示される配列と同じであった。
例 4.
S.セレビシアエ(yAK561株)におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号17の合成
リーダー配列番号17は次のアミノ酸配列を有する:
次のオリゴヌクレオチドを合成した:
ポリメラーゼ鎖反応を例1に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌクレオチド#376をオリゴヌクレオチド#333の代わりに用い、そしてプラスミドpAK555(図15)を鋳型として使用した。
180bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動にゆだね、そして例1に記載されるようにして精製した。そのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、例1に記載されるようにしてS.セレビシアエ発現プラスミド中にサブクローン化した。選択されたプラスミドpAK561を、例1に記載されるようにしてDNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号17をコードするDNA配列を含むことを示した。リーダー配列番号17をコードするDNA配列に関しては、図8を参照のこと。プラスミドpAK561を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721.1号に記載されるようにしてS.セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得られる株をyAK561と命名した。シグナルペプチド及びインスリン前駆体MI3をコードするDNA配列は、図5に示される配列と同じであった。
例 5.
S.セレビシアエ(yAK559株)におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号16の合成
リーダー配列番号16は次のアミノ酸配列を有する:
次のオリゴヌクレオチドを合成した:
ポリメラーゼ鎖反応を例1に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌクレオチド#375をオリゴヌクレオチド#333の代わりに用い、そしてプラスミドpAK555(図15)を鋳型として使用した。
222bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動にゆだね、そして例1に記載されるようにして精製した。そのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、例1に記載されるようにしてS.セレビシアエ発現プラスミド中にサブクローン化した。選択されたプラスミドpAK559を、例1に記載されるようにしてDNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号16をコードするDNA配列を含むことを示した。リーダー配列番号16をコードするDNA配列に関しては、図9を参照のこと。プラスミドpAK559を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721.1号に記載されるようにしてS.セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得られる株をyAK559と命名した。シグナルペプチド及びインスリン前駆体MI3をコードするDNA配列は、図5に示される配列と同じであった。
例 6.
S.セレビシアエ(yAK580株)におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号19の合成
リーダー配列番号19は次のアミノ酸配列を有する:
次のオリゴヌクレオチドを合成した:
ポリメラーゼ鎖反応を例1に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌクレオチド#384をオリゴヌクレオチド#333の代わりに用い、そしてプラスミドpAK559(図16)を鋳型として使用した。
228bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動にゆだね、そして例1に記載されるようにして精製した。そのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、例1に記載されるようにしてS.セレビシアエ発現プラスミド中にサブクローン化した。選択されたプラスミドpAK580を、例1に記載されるようにしてDNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号19をコードするDNA配列を含むことを示した。リーダー配列番号19をコードするDNA配列に関しては、図10を参照のこと。プラスミドpAK580を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721.1号に記載されるようにしてS.セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得られる株をyAK580と命名した。シグナルペプチド及びインスリン前駆体MI3をコードするDNA配列は、図5に示される配列と同じであった。
例 7.
S.セレビシアエ(yAK583株)におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号20の合成
リーダー配列番号20は次のアミノ酸配列を有する:
次のオリゴヌクレオチドを合成した:
ポリメラーゼ鎖反応を例1に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌクレオチド#390をオリゴヌクレオチド#333の代わりに用い、そしてプラスミドpAK559(図16)を鋳型として使用した。
231bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動にゆだね、そして例1に記載されるようにして精製した。そのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、例1に記載されるようにしてS.セレビシアエ発現プラスミド中にサブクローン化した。選択されたプラスミドpAK583を、例1に記載されるようにしてDNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号20をコードするDNA配列を含むことを示した。リーダー配列番号20をコードするDNA配列に関しては、図11を参照のこと。プラスミドpAK583を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721.1号に記載されるようにして、S.セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得られる株をyAK583と命名した。シグナルペプチド及びインスリン前駆体MI3をコードするDNA配列は、図5に示される配列と同じであった。
例 8.
S.セレビシアエ(yAK586株)におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号21の合成
リーダー配列番号21は次のアミノ酸配列を有する:
次のオリゴヌクレオチドを合成した:
ポリメラーゼ鎖反応を例1に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌクレオチド#401をオリゴヌクレオチド#333の代わりに用い、そしてプラスミドpAK562(図17)を鋳型として使用した。
183bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動にゆだね、そして例1に記載されるようにして精製した。そのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、例1に記載されるようにしてS.セレビシアエ発現プラスミド中にサブクローン化した。選択されたプラスミドpAK586を、例1に記載されるようにしてDNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号21をコードするDNA配列を含むことを示した。リーダー配列番号21をコードするDNA配列に関しては、図12を参照のこと。プラスミドpAK586を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721.1号に記載されるようにしてS.セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得られる株をyAK586と命名した。シグナルペプチド及びインスリン前駆体MI3をコードするDNA配列は、図5に示される配列と同じであった。
例 9.
本発明の選択されたリーダー配列を用いてのMI3インスリン前駆体の発現
上記のようなプラスミドを有する酵母株を、YPD培地(Sherman,F.など.,Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1981)において増殖した。個々の株のために、6個の個々の5ml培養物を30℃で72時間、振盪し、約15の最終OD600を得た。遠心分離の後、上清液をHPLC分析のために除き、分泌されたインスリン前駆体の濃度を、Snel,L.など.Chromatographia 24(1987)329-332により記載される方法により測定した。
表1においては、本発明の選択されたリーダー配列の使用により得られるインスリン前駆体MI3の発現レベルを、S.セレビシアエのMFα(1)リーダーを用いて、PMT742の形質転換体により得られるレベルの百分率として付与する。
例 10.
S.セレビシアエ(yAK677株)における拡張されたMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号27の合成
リーダー配列番号27は次のアミノ酸配列を有する:
次のオリゴヌクレオチドを合成した:
及び
ポリメラーゼ鎖反応を例1に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌクレオチド#440を、オリゴヌクレオチド#333の代わりに使用し、そしてプラスミドpAK614を鋳型として使用した。第2のポリメラーゼ鎖反応のためには、オリゴヌクレオチド#441を、オリゴヌクレオチド#312の代わりに使用した。
精製されたPCR DNAフラグメントを、例1に記載されるようにして、単離し、そして制限エンドヌクレアーゼAsp718及びHindIIIにより消化した。268bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、例1に記載されるようにして、アガロースゲル上での電気泳動にゆだね、そして精製した。Asp718/HindIII DNAフラグメントを、例1に記載されるようにしてS.セレビシアエ発現プラスミド中にサブクローン化した。但し、140bpのHindIII/XbaI DNAフラグメントがpAK602に由来し、そしてAspB28ヒトインスリンをコードする。選択されたプラスミドpAK616を、例1に記載されるようにして、DNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号27をコードするDNA配列を含むことを示した。リーダー配列番号27をコードするDNA配列(配列番号66)に関しては、図18を参照のこと。pAK616からの268bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを単離し、そしてpAK601からの10986bpのAsp718/XbaI DNAフラグメント及びpAK464からの140bpのHindIII/XbaI DNAフラグメント(AspB28ヒトインスリンの拡張部分をコードする)と連結し、そしてpAK625と命名した。pAK625からの180bpのAsp718/NcoI DNAフラグメントを単離し、そしてpJB146からの221bpのNcoI/XbaI DNAフラグメント(インスリン前駆体の拡張部分をコードする)及びpAK601からの10824bpのAsp718/XbaI DNAフラグメントと連結し、そしてその得られるプラスミドをpAK677と命名した。プラスミドpAK677を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721.1号に記載されるようにして、S.セレビシアエ株MT663を形質転換し、そしてその得られる株をyAK677と命名した。リーダーをコードするDNA配列を除いて、シグナルペプチドをコードするDNA配列は図5に記載される通りである。拡張されたMI3インスリン前駆体をコードするDNA配列は、図19に記載される通りである。
例 11.
S.セレビシアエ(yAK680株)における拡張されたMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号67の合成
リーダー配列番号67は次のアミノ酸配列を有する:
次のオリゴヌクレオチドを合成した:
PCRを例1に記載されるようにして実施した。但し、オリゴヌクレオチド#577をオリゴヌクレオチド#333の代わりに使用し、そしてプラスミドpAK625を鋳型として使用し、そして第2のPCRは実施されなかった。PCRフラグメントを制限エンドヌクレアーゼAsp718及びNcoIにより例1に記載されるようにして消化した。
190bpのAsp718/NcoI DNAフラグメントを、例1に記載されるようにして、アガロースゲル上での電気泳動にゆだね、そして精製した。但し、10824bpのAsp718/XbaIベクターDNAフラグメントをpAK601から単離した。190bpのAsp718/NcoI DNAフラグメントを、例1に記載されるようにしてS.セレビシアエ発現プラスミド中にサブクローン化した。但し、221bpのNcoI/XbaI DNAフラグメント(MI3インスリン前駆体の拡張された部分をコードする)をpAK677から単離し、そしてHindIII/XbaI DNAフラグメントの代わりに使用した。選択されたプラスミドを例1に記載されるようにして、DNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号67をコードするDNA配列を含むことを示し、そしてそれをpAK680と命名した。リーダー配列番号67をコードするDNA配列(配列番号69)に関しては、図20を参照のこと。プラスミドpAK680を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721.1号に記載されるようにして、S.セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得られる株をyAK680と命名した。リーダーをコードするDNA配列を除いて、シグナルペプチドをコードするDNA配列は図5に記載される通りであり、そして拡張されたインスリン前駆体MI3 DNA配列は図19に記載される通りである。
例 12.
本発明のリーダー配列:配列番号27及び67を用いてのN−末端拡張されたMI3インスリン前駆体の発現
上記のようなプラスミドを有する酵母株をYPD培地(Sherman,F.など.,Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1981)において増殖した。個々の株のために、6個の個々の5ml培養物を30℃で72時間、振盪し、約15の最終OD600を得た。遠心分離の後、上清液をHPLC分析のために除き、分泌されたインスリン前駆体の濃度を、Snel,L.など.,Chromatographia 24(1987)329-332に記載される方法により測定した。
表2においては、本発明のリーダー配列(配列番号27及び67)の使用により得られた、いくらかN−末端拡張されたMI3インスリン前駆体の発現レベルが、S.セレビシアエのMFα(1)リーダーを用いて、PMT742の形質転換体により得られるレベルの百分率として付与される。
配列の列挙
(1)一般情報
(i)出願人
(A)名称:Novo Nordisk A/S
(C)市:DK-2880 Bagsvaerd
(E)国:デンマーク
(G)電話番号:+45 44448888
(H)ファクシミリ:+45 44490555
(I)テレックス:37173
(ii)発明の名称:合成リーダーペプチド配列類
(iii)配列の数:73
(iv)通信先:
(C)市:DK-2880 Bagsvaerd
(E)国:デンマーク
(v)コンピューター読取りフォーム:
(A)媒体タイプ:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC compatible
(C)操作システム:PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア:PatentIn Release #1.0,Version #1.25
(vi)現出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日
(C)分類
(vii)従来の出願データ:
(A)出願番号:DK 0705/94 and US 08/282,852
(B)出願日:16-JUN-1994 and 29-JUL-1994
(viii)アトーニー/エージェント情報:
(A)名称:Jorgensen,Dan et al.
(C)参照/ドケット番号:4085-WO,DJ
(ix)通信情報:
(A)電話:+45 44448888
(B)ファクシミリ:+45 44493256
(2)配列番号1についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:15個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号1:
(2)配列番号2についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:15個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号2:
(2)配列番号3についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:16個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号3:
(2)配列番号4についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:15個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号4:
(2)配列番号5についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:16個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号5:
(2)配列番号6についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:17個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号6:
(2)配列番号7についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:15個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号7:
(2)配列番号8についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号8:
(2)配列番号9についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:17個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号9:
(2)配列番号10についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:17個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号10:
(2)配列番号11についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:17個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号11:
(2)配列番号12についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:17個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号12:
(2)配列番号13についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号13:
(2)配列番号14についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:21個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号14:
(2)配列番号15についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:25個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号15:
(2)配列番号16についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:33個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号16:
(2)配列番号17についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:19個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号17:
(2)配列番号18についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号18:
(2)配列番号19についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:35個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号19:
(2)配列番号20についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:36個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号20:
(2)配列番号21についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:20個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号21:
(2)配列番号22についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:21個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号22:
(2)配列番号23についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:36個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号23:
(2)配列番号24についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:39個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号24:
(2)配列番号25についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:21個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号25:
(2)配列番号26についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:39個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号26:
(2)配列番号27についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:39個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号27:
(2)配列番号28についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:39個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号28:
(2)配列番号29についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:27個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号29:
(2)配列番号30についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:25個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号30:
(2)配列番号31についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:56個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号31:
(2)配列番号32についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:21個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号32:
(2)配列番号33についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:55個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号33:
(2)配列番号34についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:36個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号34:
(2)配列番号35についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:60個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号35:
(2)配列番号36についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:75個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号36:
(2)配列番号37についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:72個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号37:
(2)配列番号38についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:45個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号38:
(2)配列番号39についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:61個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号39:
(2)配列番号40についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:372個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:82..351
(xi)配列:配列番号40:
(2)配列番号41についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:89個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号41:
(2)配列番号42についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:45個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:1..45
(xi)配列:配列番号42:
(2)配列番号43についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:15個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号43:
(2)配列番号44についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:297個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:1..276
(xi)配列:配列番号44:
(2)配列番号45についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:91個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号45:
(2)配列番号46についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:51個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:1..51
(xi)配列:配列番号46:
(2)配列番号47についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:17個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号47:
(2)配列番号48についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:54個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:1..54
(xi)配列:配列番号48:
(2)配列番号49についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:57個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:1..57
(xi)配列:配列番号49:
(2)配列番号50についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:99個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:1..99
(xi)配列:配列番号50:
(2)配列番号51についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:105個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:1..105
(xi)配列:配列番号51:
(2)配列番号52についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:108個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:1..108
(xi)配列:配列番号52:
(2)配列番号53についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:60個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:1..60
(xi)配列:配列番号53:
(2)配列番号54についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:276個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:113..274
(xi)配列:配列番号54:
(2)配列番号55についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:54個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号55:
(2)配列番号56についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:282個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:113..280
(xi)配列:配列番号56:
(2)配列番号57についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:56個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号57:
(2)配列番号58についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:282個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:113..280
(xi)配列:配列番号58:
(2)配列番号59についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:56個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号59:
(2)配列番号60についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:330個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:113..328
(xi)配列:配列番号60:
(2)配列番号61についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:72個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号61:
(2)配列番号62についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:288個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:113..286
(xi)配列:配列番号62:
(2)配列番号63についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:58個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号63:
(2)配列番号64についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:82個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号64:
(2)配列番号65についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:54個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号65:
(2)配列番号66についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:117個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号66:
(2)配列番号67についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:41個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号67:
(2)配列番号68についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:51個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号68:
(2)配列番号69についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:123個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号69:
(2)配列番号70についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:65個のアミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列:配列番号70:
(2)配列番号71についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:219個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(v)フラグメント型:内部
(xi)配列:配列番号71:
(2)配列番号72についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:348個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号72:
(2)配列番号73についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:379個の塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:配列番号73:
Claims (9)
- 下記配列:
5'-P-SP-LS-PS-*遺伝子*-(T)i-3'
〔配列中、
Pは、プロモーター配列であり;
SPは、シグナルペプチドをコードするDNA配列であり;
LSは、下記一般式(I):
(式中、
X1は、Ser、Thr又はAlaであり;
X2は、アミノ酸Ser、Thr又はAla、あるいはアミノ酸配列Ser-Ile、
Ser-Ala-Ile又はSer-Phe-Ala-Thrであり;
Zは、Thr又はSerであり;
X3は、一般式:X 4 -X 5 −X 6 で表されるアミノ酸配列であり、
ここで、
X 4 は、次のモチーフ:Leu-Val-Asn-Leu、Ser-Val-Asn-Leu、Met-Ala-Asp、
Thr-Glu-Ser、Arg-Phe-Ala-Thr、Val-Ala-Met-Ala、Asn-Ser-Thr、
Asn-Thr-Thr、
(Ser/Leu)-Val-Asn-Leu、
(Ser/Leu)-Val-Asn-Leu-Met-Ala-Asp、
(Ser/Leu)-Val-Asn-Leu-Met-Ala-Asp-Asp、
(Ser/Leu)-Val-Asn-Leu-Met-Ala-Asp-Asp-Thr-Glu-Ser、
(Ser/Leu)-Val-Asn-Leu-Met-Ala-Asp-Asp-Thr-Glu-Ser-Ile、
(Ser/Leu)-Val-Asn-Leu-Met-Ala-Asp-Asp-Thr-Glu-Ser-Arg-Phe-Ala-Thr、
Asn-(Thr/Ser)-Thr-Leu、
Asn-(Thr/Ser)-Thr-Leu−Asn-Ler、又は
Asn-(Thr/Ser)-Thr-Leu-Val-Asn-Leu、
の1又は複数を含むアミノ酸配列であり;
X 5 は、アミノ酸Pro、あるいはアミノ酸配列Val-Asn-Leu、
Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala、Leu-Asp-Var-Var-Asn-Ler-Pro-Gly又は
Leu-Asp-Val-Val-Asn-Leu-Ile-Ser-Met、
であり;
X 6 は、アミノ酸Ala、Gly、Leu、Thr、Val又はSer、あるいは
アミノ酸配列Gly-Ala又はSer-Ala
である)
をコードするDNA配列であり;
PSは、プロセッシング部位をコードするDNA配列であり;
*遺伝子*は、ポリペプチドをコードするDNA配列であり;
Tは、ターミネーター配列であり;そして
iは、0又は1である〕
を含んで成るDNA発現カセット。 - 前記SPが、α−因子シグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド、カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3シグナルペプチド又は酵母BAR1シグナルペプチドをコードするDNA配列である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の発現カセット。
- 前記PSが、Lys-Arg、Arg-Lys、Arg-Arg、Lys-Lys又はIle-Glu-Gly-ArgをコードするDNA配列である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の発現カセット。
- 前記ポリペプチドが、アプロチニン、組織因子経路インヒビター又は他のプロテアーゼインヒビター、インスリン又はインスリン前駆体、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子II、ヒト又はウシ成長因子、インターロイキン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド1、組織プラスミノーガン活性化因子、形質転換成長因子α又はβ、血小板由来の成長因子又は酵素から成る群から選択される請求項1〜5のいずれか1項に記載の発現カセット。
- 請求の範囲第1〜6のいづれか1項記載の発現カセットを含んで成る酵母発現ベクター。
- ポリペプチドを発現することができ、そして請求項7に記載の酵母発現ベクターにより形質転換された酵母細胞。
- 酵母においてポリペプチドを生成するための方法であって、所望のポリペプチドを発現することができ、そして請求項7に記載の酵母発現ベクターにより形質転換された酵母細胞を適切な培地において培養し、ポリペプチドの発現及び分泌を得、この後、前記ポリペプチドを培地から回収する、ことを含んで成る方法。
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