JP4668414B2 - 形質転換した酵母細胞におけるタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、形質転換した酵母細胞におけるタンパク質の発現、そのような過程において使用するためのＤＮＡ構築物及びベクター、並びに該ベクターで形質転換した酵母細胞に関する。
【０００２】
【発明の背景】
タンパク質の発現のために、形質転換した酵母株を使用することは公知であり、例えば、欧州特許出願第0088632A号、第0116201A号、第0123294A号、第0123544A号、第0163529A号、第0123289A号、第0100561A号、第0189998A号及び第0195986A号、PCT特許出願第WO95/01421号、第95/02059号及び第90/10075号、並びに米国特許第4,546,082号を参照のこと。
【０００３】
酵母産生プラスミドが抗生物質マーカー遺伝子を含むことは、上記の方法の一般的な特徴である。そのようなマーカー遺伝子は、大腸菌(E.coli)における最初のクローニング工程に由来し、ここで該マーカー遺伝子は、形質転換した細胞を選別するために用いられるか、又はベクターとして用いられるプラスミドを維持するために用いられる。抗生物質マーカー遺伝子は、形質転換した酵母細胞の培養に不都合な影響を決して与えないと考えられており、従ってそのようなＤＮＡを欠失させる何れの工程も行わないのが通例であった。さらに、プラスミド構築物の特性は、形質転換した酵母細胞からのプラスミドの単離、及び大腸菌への単離したプラスミドの形質転換の後、抗生物質による選択によって調査される。従って、抗生物質耐性マーカー遺伝子を保有することは、実際には好都合であった。
【０００４】
研究所及び工業生産物プラントは、非常に厳密な安全性管理によって制御されているが、誤って幾らか細胞が環境に放出されるという小さな危険性が常に存在する。それらの非常に複雑な性質のために、そのような遺伝子工学的に操作された微生物は非常に短期間生存するのみであり、環境を害する危険は極めて低い。勿論、このことが、そのような形質転換した微生物が研究及び大規模な実施の両方において使用が許可されてきた理由である。
【０００５】
たとえ細胞が迅速に死に至るとしても、依然として、抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドが誤って環境に廃棄される可能性があり、プラスミドが自発的に獲得される場合に、細菌中において抗生物質に対する耐性が導入されるという理論上の危険が存在する。
【０００６】
抗生物質は、ヒト及び動物の細菌感染の治療に非常に重要である。抗生物質に対して耐性にさせる遺伝子による潜在的な環境汚染の如何なる危険性も、可能な限り最小にすべきである。
従って、今日まで用いられてきた方法よりも、いっそう安全な方法を開発する必要があり、そのような改良方法を提供することが本発明の目的である。
【０００７】
【発明の概要】
本発明は、酵母において異種タンパク質又はポリペプチドを発現させる方法であって、ここで、産生のために用いる酵母形質転換株は発現ベクターを含有し、該ベクターにおいて、最初のクローニング工程で用いられる抗生物質マーカー遺伝子を、酵母宿主の形質転換の前に、イン・ビトロでの修飾により非機能的にする方法に関する。また本発明は、そのような方法において使用するためのＤＮＡ配列及び発現ベクター、並びに形質転換した酵母細胞に関する。
【０００８】
一つの側面に従えば、本発明は、細菌細胞を抗生物質耐性にすることができない組換え型酵母発現ベクターであって、異種遺伝子及びイン・ビトロでの修飾により非機能的にした抗生物質耐性マーカー遺伝子をコードする遺伝子を含む組換え型酵母発現ベクターに関する。
【０００９】
更なる側面に従えば、本発明は、所望のポリペプチド又はタンパク質の製造方法であって、細菌細胞を抗生物質耐性にすることができないベクターであり、かつ異種遺伝子及び酵母宿主の形質転換の前にイン・ビトロでの修飾により非機能的にした抗生物質耐性マーカー遺伝子をコードする遺伝子を含むベクターを含有する酵母株を培養し、その培地から所望の産物を単離することを含んでなる方法に関する。
【００１０】
本発明に従った方法は、典型的に、酵母発現プラスミドを含有する酵母株を培養することを含んでなり、該プラスミドにおいて、細菌における最初のクローニング工程に用いられる機能的抗生物質マーカー遺伝子を、酵母宿主に挿入する前にイン・ビトロにて該マーカー遺伝子の一部又は全マーカー遺伝子を欠失させることにより非機能的にする方法であって、所望のポリペプチド又はタンパク質の発現及び分泌のために用いられる方法である。
【００１１】
抗生物質マーカー遺伝子の欠失は、好ましくは、抗生物質マーカー遺伝子の各側における適切な制限切断部位の挿入によって行われ、それにより、該マーカー遺伝子は、イン・ビトロにて適切な制限酵素で処理することにより欠失する。
【００１２】
また本発明は、細菌細胞を抗生物質耐性にすることができないベクターであり、かつ異種遺伝子及び酵母宿主の形質転換前にイン・ビトロでの修飾により非機能的にした抗生物質耐性マーカー遺伝子をコードする遺伝子を含むベクターを含有する形質転換した酵母株に関する。
酵母株は、サッカロミセス属の株、特にサッカロミセス・セレビシエ(cerevisiae)株が好ましい。
【００１３】
ここで用いる「抗生物質マーカー遺伝子」又は「抗生物質耐性マーカー遺伝子」の表現は、形質転換した細菌細胞の表現型の選択及びプラスミド増幅を可能にする遺伝子を意味する。
【００１４】
大腸菌において最も一般的に用いられる抗生物質耐性マーカー遺伝子は、アンピシリン（ＡＭＰ）、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン及びテトラサイクリン耐性を与えるマーカー遺伝子である。
【００１５】
ここで用いる「非機能的マーカー遺伝子」の表現は、マーカー遺伝子を欠失させるか、又はマーカー遺伝子を該遺伝子の一部を欠失することで非機能的にしたことを意味する。遺伝子を完全に欠失することが好ましい。
【００１６】
ここで用いる「イン・ビトロでの修飾」は、細胞環境の外部でベクターに実施される修飾工程を意味する。
【００１７】
ここで用いる「細菌細胞を抗生物質耐性にすることができない」は、記載される遺伝子操作により、何れの有機体においても抗生物質耐性遺伝子が非機能的であることを意味する。
【００１８】
ここで用いる「酵母宿主」は、発現プラスミド若しくはベクターで、形質転換又はトランスフェクションする酵母有機体を意味する。
【００１９】
【発明の詳細な記述】
本発明は、添付の図面を参照してさらに説明される。
利用可能な制限部位の使用又はＰＣＲ、部位特異的突然変異誘発若しくはＤＮＡ配列操作において他の公知の技法を用いた適切な制限部位の導入、続く適切な制限酵素での処理によって、抗生物質耐性マーカー遺伝子をイン・ビトロにて欠失させる。
【００２０】
４種の修飾ＮＮ７２９株を構築し、プラスミドにおける種々の欠失がインスリン前駆体発酵収率又は長期の発酵中における株の安定性に影響を及ぼすかどうかを評価した（表１）。これらの株は、発酵収率および発酵安定性に関して源(original)のＮＮ７２９株と比較した(表２）。さらに、ＧＬＰ−１変異Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を産生する３種の酵母株を構築し、ＡＭＰ遺伝子を含むプラスミドｐＫＶ２２８における種々の欠失が、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)発酵収率に影響を及ぼすかどうかを評価した（表３）。
【００２１】
ＡＭＰ遺伝子及び恐らく周囲の配列が欠失したプラスミド及び株は、全て「ΔＡＭＰ」と称する。
Ｓ．セレビシエ株ＭＴ６６３(Ｅ２-７Ｂ ＸＥ１１-３６ ａ/α, ΔｔｐｉΔｔｐｉ,ｐｅｐ ４-３/ｐｅｐ ４-３)又はＭＥ１７１９(ＭＡＴａ/αΔｙａｐ３::ｕｒａ３/Δｙａｐ３::ＵＲＡ３ｐｅｐ４-３/ｐｅｐ４-３Δｔｐｉ::ＬＥＵ２/Δｔｐｉ::ＬＥＵ２ ｅｕ２/ｌｅｕ２ Δｕｒａ３/Δｕｒａ３)への、ｐＫＡ７２９又はｐＫＶ２２８修飾プラスミド（ここで、源のプラスミド由来のＡＭＰマーカー遺伝子及び恐らく他のＤＮＡ配列は欠失した）の形質転換により、修飾酵母株を調製した。
【００２２】
プラスミドに既に存在する適切な制限酵素部位の使用、又はＡＭＰ遺伝子が欠失し得るような方法での適切な制限酵素部位の挿入によって、修飾プラスミドを調製した。修飾プラスミドは、Ｓ．セレビシエ（株 ＭＴ６６３）に形質転換する前に、ＡＭＰ遺伝子を欠失させるか、又は非機能的にするような方法で、イン・ビトロで操作することができ、その結果として得られる酵母株はＡＭＰ遺伝子を欠如する。従って、酵母細胞の廃棄中におけるＡＭＰ遺伝子での環境汚染の潜在的な危険性がなくなる。
【００２３】
修飾ｐＡＫ７２９又はｐＫＶ２２８プラスミドを、適切な制限酵素で消化させ、アガロース電気泳動を行い、単離し、再連結させ、次にコンピテントＭＴ６６３及びコンピテントＭＥ１７１９（WO98/01535 それぞれＳ．セレビシエ細胞）に形質転換する。
【００２４】
本発明の方法によって産生されるタンパク質又はポリペプチドは、酵母細胞において都合よく産生される得る何れの異種タンパク質又はポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質の例としては、アプロチニン、組織因子系凝固阻害因子又は他のプロテアーゼ阻害因子、インスリン、インスリン前駆体又はインスリン類縁体、インスリン様増殖因子Ｉ又はII、ヒト成長ホルモン又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノゲン賦活剤、トランスホーミング増殖因子ａ又はｂ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、ＧＲＰＰ、第VII因子、第VIII因子、第XIII因子、血小板由来増殖因子、及びリパーゼのような酵素が挙げられる。
【００２５】
１以上の連続した化学的過程及び／又は酵素的過程により、天然のヒトインスリンに見られるような３つのジスルフィド架橋が正しく形成された２つの鎖のインスリン又はインスリン類縁体分子へ変換され得るプロインスリンを含む単一鎖のポリペプチドは、「インスリン前駆体」又は「インスリン類縁体の前駆体」として理解され得る。インスリン前駆体は、インスリンのＡ鎖及びＢ鎖を架橋する修飾Ｃ−ペプチドを、典型的に含有するであろう。さらに、好ましいインスリン前駆体は、Ｂ(30)アミノ酸残基を欠如するであろう。最も好ましいインスリン前駆体は、例えばEP163529、及びPCT出願第95/00550及び95/07931に記載されるようなものである。インスリンの例としては、ヒトインスリン、好ましくはdes(Ｂ30)ヒトインスリン及びブタインスリンが挙げられる。好ましいインスリン類縁体は、１以上の天然アミノ酸残基、好ましくは１、２または３の天然のアミノ酸残基が、別のコード可能なアミノ酸残基によって置換されたものである。従って、源のインスリンは、位置Ａ２１において、Ａｓｎの代わりに、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｒｙ又はＶａｌを含む群から選択されるアミノ酸残基、特にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＴｈｒを含む群から選択されるアミノ酸残基を有していてもよい。同様に、源のインスリンは、位置Ｂ２８において、Ｐｒｏの代わりに、Ａｓｐ、Ｌｙｓ等を含む群から選択されるアミノ酸残基を有していてもよく、位置Ｂ２９において、Ｌｙｓの代わりに、アミノ酸Ｐｒｏを有していてもよい。
【００２６】
ここで用いる「コード可能なアミノ酸残基」の表現は、遺伝暗号、即ちヌクレオチドのトリプレット（「コドン」）によってコードされ得るアミノ酸残基を表わす。
【００２７】
用いるＤＮＡ構築物は、確立された標準的な方法（例えば、S. L. Beaucage及びM. H. Caruthers, Tetrahedoron Letters 22, 1981, pp1859-1869に記載されるホスホアミダイト法、又はMatthesら, EMBO Journal 3, 1984, pp801-805に記載される方法）により合成的に調製され得る。ホスホアミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドを、例えば、自動ＤＮＡ合成機にて合成し、精製し、二重構造にし、連結させて合成ＤＮＡ構築物を形成する。一般に好ましいＤＮＡ構築物の調製方法は、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく。
【００２８】
また、所望のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、標準的な技法(Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989参照)に従って、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを調製し、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーションすることにより本発明のポリペプチドの全て又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることによって得られる、ゲノム起源又はｃＤＮＡ起源であってもよい。
【００２９】
最後に、所望のタンパク質をコードするＤＮＡは、標準的な技法に従って、合成起源、ゲノム起源又はｃＤＮＡ起源（適切なもの）のアニーリングフラグメント（このフラグメントは、全ＤＮＡ構築物の種々の部分に相当する）によって調製される、合成起源とゲノム起源の混合物、合成起源とｃＤＮＡ起源の混合物、又はゲノム起源とｃＤＮＡ起源の混合物であってもよい。
【００３０】
組換え型発現ベクターは、自律的に複製するベクター、即ち、その複製が染色体の複製に無関係な、染色体外の独立体として存在するベクター（例えば、プラスミド、染色体外因子、ミニクロモソーム、又は人工染色体）であってもよい。ベクターは、確実に自己複製する何れの手段を含有してもよい。また代わりとして、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体とともに複製されるものであってもよい。ベクター系は、宿主細胞のゲノムに導入されて全ＤＮＡをともに含有する、単一のベクター若しくはプラスミド、又は２以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンであってもよい。
【００３１】
組換え型発現ベクターは、適切なプロモーター配列に使用可能なように連結させた所望のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有してもよいであろう。プロモーターは、酵母において転写活性を示す何れのＤＮＡ配列であってもよく、酵母に対して同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子由来であってもよい。適切なプロモーターの例は、サッカロミセス・セレビシエＭα１、ＴＰＩ、ＡＤＨ又はＰＧＫプロモーターである。
【００３２】
また所望のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、例えば、ＴＰＩターミネーターのような適切なターミネーター(T. Alber 及びG. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, pp.419-434参照)に使用可能なように連結させてもよい。
【００３３】
また、本発明の組換え型発現ベクターは、酵母においてベクターが複製できるようなＤＮＡ配列を含有するであろう。そのような配列の例は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１-３及び複製起点である。また該ベクターは、選択可能なマーカー（例えば、P. R. Russell, Gene 40, 1985, pp.125-130に記載されるようなシゾサッカロミセスポンペＴＰＩ遺伝子）を含有していてもよい。
【００３４】
最後に、発現ベクターは、好ましくは、培地に所望のタンパク質又はポリペプチドを確実に分泌するようにシグナル／リーダー配列を含有するであろう。シグナル配列は、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を通ってより大きなポリペプチドを誘導するポリペプチド（分泌ペプチド）をコードするＤＮＡ配列である。より大きなポリペプチドは、分泌経路を通過する間に一般に切断されて、分泌ペプチドを除去する。
【００３５】
分泌シグナル配列は、発現したポリペプチドを、確実にかつ効果的に細胞の分泌経路へ誘導する何れのシグナルペプチドをコードしてもよい。シグナルペプチドは、天然に存在するシグナルペプチド若しくはそれらの機能部分であってもよく、又は合成ペプチドであってもよい。酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエａ−因子及びサッカロミセス・セレビシエインベルターゼ、マウス唾液のアミラーゼのシグナルペプチド(O. Hagenbuchleら, Nature 289, 1981, pp.643-646参照)、修飾カルボキシぺプチダーゼシグナルペプチド(L. A. Vallsら, Cell 48, 1987, pp.887-897参照)、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド(WO87/02670参照)、又は酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド(M. Egel-Mitaniら, Yeast 6, 19909, pp.127-137参照)の遺伝子から得られる。
【００３６】
また酵母における効率的な分泌のために、リーダーペプチドをコードする配列が、シグナル配列の下流かつポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の上流に挿入されてもよい。リーダーペプチドの機能は、培地への分泌のために、発現したポリペプチドを小胞体からゴルジ装置へ、さらには分泌小胞へ誘導させることである（即ち、細胞壁を横切ったポリペプチドの輸送、又は少なくとも酵母細胞の細胞周辺腔への細胞膜を通ったポリペプチドの輸送）。リーダーペプチドは、酵母ａ−因子リーダーであってもよい（例えば、その使用はUS 4,546,082, EP 16201, EP 123294, EP 123544及びEP 163529に記載される）。また代わりとして、リーダーペプチドは、天然に存在しない合成リーダーペプチドであってもよい。合成リーダーペプチドは、WO89/02463又はWO92/11378、及びKjeldsenらによる「タンパク質の発現と精製９, 331〜336（1997年）」に記載されるように構築されてもよい。
【００３７】
「リーダーペプチド」の表現は、その機能により異種タンパク質が分泌されて培地への分泌のために、小胞体からゴルジ装置へ、さらには分泌小胞へ誘導される（即ち、存在するのであれば、細胞膜及び細胞壁を横切った発現したタンパク質若しくはポリペプチドの輸送、又は少なくとも細胞壁を有する細胞の細胞周辺腔への細胞膜を通った発現したタンパク質若しくはポリペプチドの輸送）プロペプチド配列の形態にあるペプチドを意味すると理解される。
【００３８】
所望のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、プロモーター及びターミネーターそれぞれを連結し、それらを酵母複製に必要な情報を含む適切な酵母ベクターにそれらを挿入するために用いられる方法は、当業者にとって公知である（例えば、上述のSambrook参照）。第一に本発明のポリペプチドをコードする全ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を調製し、次にこのフラグメントを適切な発現ベクターに挿入するか、又は個々の要素（シグナル、リーダー又は異種タンパク質のような）の遺伝情報を含むＤＮＡフラグメントを順次挿入し、続いて連結するかによってベクターを構築してもよいことは理解されるであろう。
【００３９】
本発明の過程で用いられる酵母有機体は、培養において、十分な量の所望のタンパク質又はポリペプチドを産生する何れの適切な酵母有機体でもよい。適切な酵母有機体の例は、酵母種サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・クルイベリ(kluyveri)、シゾサッカロミセス・ポンベ、サッカロミセス・ウバルム(uvarum)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)・ラクチス(lactis)、ハンセヌラ(Hansenula)・ポリモルファ(polymorpha)、ピチア(Pichia)・パストリス(pastoris)、ピチア・メタノリカ(methanolica)、ピチア・クルイベリ、ヤロウィア(Yarrowia)・リポリチカ(lipolytica)、カンジダ種、カンジダ・ウチリス(utilis)、カンジダ・カカオイ(cacaoi)、ゲオトリクム種及びゲオトリクム・ファメンタンズ(fermentans)から選択される株であってよく、好ましくは酵母種サッカロミセス・セレビシエである。
【００４０】
酵母細胞の形質転換は、例えば、プロトプラスト形成、続いて本質的に知られた方法での形質転換によって行われてもよい。細胞を培養するのに用いられる培地は、酵母有機体の成長に適切な従来の何れの培地であってもよい。そのかなりの割合が正確に処理された形態で培地中に存在するであろう分泌された異種タンパク質は、遠沈法又は濾過による培地からの酵母細胞の分離、上澄み液又は濾液のタンパク様成分の塩による沈殿（例えば、硫酸アンモニウム）、続いて種々のクロマトグラフィ法による精製（例えば、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ等）を含む従来の方法によって、培地から回収され得る。タンパク質が細胞周辺腔に分泌される場合、酵素的又は機械的に細胞を崩壊させる。
【００４１】
所望のタンパク質又はポリペプチドは、WO97/22706に記載されるようにＮ末端が伸長された融合タンパク質として発現、分泌されてもよい。次にＮ末端伸長は、本技術分野で公知のように、イン・ビトロでの化学的又は酵素的切断によって、回収したタンパク質から除去されてもよい。酵素を用いて切断するのがより好ましい。そのような酵素の例としては、トリプシン又はアクロモバクター(Achromobacter)・リチクス(lyticus)プロテアーゼＩが挙げられる。
【００４２】
本発明は、以下の実施例において更に詳しく記載されるが、それは如何なる方法でも本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。
【００４３】
【実施例】
例１
インスリン前駆体（Ｎ末端が伸張されたＢ(1-29)-Ａｌａ-Ａｌａ-Ｌｙｓ-Ａ(1-21)インスリン前駆体、WO97/22706を参照）の発現のために構築した酵母プラスミドｐＡＫ７２９は、２つのＡｐａＬＩ酵素制限部位ＡｐａＬＩ(4477)及びＡｐａＬＩ(5723)を含む（図１参照）。これらの制限部位は、ＡＭＰマーカー遺伝子の各側に位置する。ｐＡＫ７２９における２つのＡｐａＬＩ部位間の1246ヌクレオチドを除去することにより、ＡＭＰマーカー遺伝子及び更に幾らかの大腸菌由来のプラスミドＤＮＡが取り除かれるであろう。
【００４４】
ｐＡＫ７２９プラスミドを、ＡｐａＬＩ制限酵素で消化させ、アガロース電気泳動を行い、単離し、再連結させ、次にコンピテントＳ．セレビシエ細胞（ＭＴ６６３、EPB0163529参照）に形質転換して、形質転換した酵母株ＮＮ７２９．１−ΔＡＭＰが得られる。酵母株ＮＮ７２９．１−ΔＡＭＰから該修飾発現プラスミドを再分離し、ＰＣＲ生成、続く欠失を特徴とするＤＮＡ領域のサブクローニング後にＤＮＡ配列を確認した。同様に、酵母株ＮＮ７２９．１−ΔＡＭＰから再分離したプラスミドＤＮＡにおいて、インスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列を確認した。
酵母株ＮＮ７２９．１−ΔＡＭＰを、ＹＰＤ培地中で、３０℃にて、７２時間培養した。インスリン前駆体の発酵収率は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した。
【００４５】
例２
ｐＡＫ７２９プラスミドにおいて、ＰＣＲにより酵素制限部位ＸｈｏＩ(5676)及びＸｈｏＩ(5720)を導入した。次に得られたｐＡＫ７２９．５プラスミドの選択されたＤＮＡ配列を確認した。ｐＡＫ７２９．５の制限プラスミド地図を図２に示してある。制限酵素部位ＸｈｏＩ(5676)及びＸｈｏＩ(5720)間のＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＡＫ７２９．５から欠失させて、ＡＭＰ遺伝子内に位置する４４ヌクレオチドを欠失させることが可能である。
【００４６】
プラスミドｐＡＫ７２９．５をＸｈｏＩ制限酵素で消化させ、アガロース電気泳動を行い、単離し、再連結させ、次にコンピテントＭＴ６６３Ｓ．セレビシエ細胞に形質転換させ、酵母形質転換株ＮＮ７２９．５−ΔＡＭＰを得た。酵母株ＮＮ７２９．５−ΔＡＭＰから該修飾発現プラスミドを再分離し、ＰＣＲ生成、続く欠失を特徴とするＤＮＡ領域のサブクローニング後に、ＤＮＡ配列を確認した。同様に、酵母株ＮＮ７２９．５−ΔＡＭＰから再分離したプラスミドＤＮＡにおいて、インスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列を確認した。ｐＡＫ７２９．５−ΔＡＭＰにおける４４のヌクレオチドの欠失が、βーラクタマーゼ活性の喪失に関してＡＭＰ遺伝子の完全な欠失と同程度に効率的であることがわかった。
酵母株ＮＮ７２９．５−ΔＡＭＰを、ＹＰＤ培地中で、３０℃にて、７２時間培養した。インスリン前駆体の発酵収率は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。
【００４７】
例３
酵素制限酵素部位ＡａｔII(4982)を、ＰＣＲによってｐＡＫ７２９プラスミドに導入した。次に得られたｐＡＫ７２９．６プラスミドの選択されたＤＮＡ配列を確認した。ｐＡＫ７２９．６の制限プラスミド地図は図３に示してある。ｐＡＫ７２９．６において、制限酵素部位ＡｔａII(4982)及びＡｔａII(5978)間のＤＮＡフラグメントを欠失させて、該プラスミドから996のヌクレオチドを取り除くことができる。これにより、ＡＭＰ遺伝子全て及びプロモーターが除去されるであろう。
【００４８】
ｐＡＫ７２９．６プラスミドをＤＮＡ制限酵素ＡａｔIIで消化させ、アガロース電気泳動を行い、単離し、再連結させ、次にコンピテントＭＴ６６３Ｓ．セレビシエ細胞に形質転換した。酵母株ＮＮ７２９．６−ΔＡＭＰから該発現プラスミドを再分離し、ＰＣＲ生成、続く欠失を特徴とするＤＮＡ領域のサブクローニング後に、ＤＮＡ配列を確認した。同様に、酵母株ＮＮ７２９．６−ΔＡＭＰから再分離したプラスミドＤＮＡにおいて、インスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列を確認した。ＡＭＰ遺伝子を欠如しているプラスミドｐＡＫ７２９．６−ΔＡＭＰを図４に示してある。
酵母株ＮＮ７２９．６−ΔＡＭＰを、ＹＰＤ培地中で、３０℃にて、７２時間培養した。インスリン前駆体の発酵収率は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。
【００４９】
例４
ｐＡＫ７２９．７プラスミドにおける新たな酵素制限酵素部位ＡａｔII(3801)を、ＰＣＲにより源のｐＡＫ７２９プラスミドに導入した。次にｐＡＫ７２９．７の選択されたＤＮＡ配列を確認した。ｐＡＫ７２９．７において、制限酵素部位ＡｔａII(3801)およびＡａｔII(5978)間のＤＮＡフラグメントを欠失させて、該発現プラスミドから2177のヌクレオチドを除去することかできる。ｐＡＫ７２９．７プラスミドは、ＡＭＰ遺伝子及び大腸菌の複製起点の両方を欠失させることができるように設計された。ｐＡＫ７２９．７の制限プラスミド地図は図５に示してある。
【００５０】
ｐＡＫ７２９．７プラスミドを、ＤＮＡ制限酵素ＡａｔIIで消化させ、アガロース電気泳動を行い、単離し、再連結させ、次にコンピテントＭＴ６６３Ｓ．セレビシエ細胞に形質転換した。酵母株ＮＮ７２９．７−ΔＡＭＰから該修飾発現プラスミドを分離し、ＰＣＲ生成、続く欠失を特徴とするＤＮＡ領域のサブクローニング後に、ＤＮＡ配列を確認した。同様に、酵母株ＮＮ７２９．７−ΔＡＭＰから再分離したプラスミドＤＮＡにおいて、インスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列を確認した。酵母株ＮＮ７２９．７−ΔＡＭＰを、ＹＰＤ培地中で、３０℃にて、７２時間培養した。インスリン前駆体の発酵収率は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。
【００５１】
【表１】
【００５２】
インスリン前駆体の発酵収率に関して、新規ＮＮ７２９−ΔＡＭＰ株を、源のＮＮ７２９株と比較した（表２）。
【００５３】
【表２】
【００５４】
部分的に又は完全に欠失させたＡＭＰマーカー遺伝子を有する発現プラスミドを含有する酵母株が、ＡＭＰ遺伝子を含む発現プラスミドを含有する源の酵母株に比較して、インスリン前駆体を１０〜２０％も多く発現するということが、上記より明らかである。
【００５５】
例５：非機能的ＡＭＰ耐性遺伝子又は欠失させたＡＭＰ耐性遺伝子を有するプラスミドを用いた酵母におけるＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)の発現
図１〜５に例示されるＬＡ１９Ｘ５Ｍ１３をコードするｐＡＫ７２９構築物のＥｃｏＲＩ(940)−ＸｂａＩ(1403)配列を、本例のＭＦアルファ*−Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)をコードする配列で置き換えた（図６）。ＭＦα１プレ−プロリーダーペプチド(Kurjan 及び Herskowitz, Cell 30, 1982. pp.993)の修飾（ここで、位置８２のＬｅｕ及び位置８３のＡｓｐは、それぞれＭｅｔ及びＡｌａで置換され、ＤＮＡ配列にＮｃｏＩ切断部位を導入する）を、この構築物にて行った。該リーダー配列を、ＭＦα１*と称した(Kjeldsen T.ら, 1996年)。ＭＦα1シグナルＭＦα１*リーダーペプチド配列は、二塩基のＫｅｘ２ｐ認識モチーフ（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）を含有し、該モチーフはＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)のコード配列とリーダーとを分離する。ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)は、ヒトＧＬＰ−１(7-37)変異体(S. Mojsovら, J Biol. Chem. 261, 1986, pp.11880-11889）であり、ここで、位置３４の天然のアミノ酸残基はＡｒｇ残基で置換されている。
【００５６】
ＮＮ７２９．１（例１）、ＮＮ７２９．５（例２）及びＮＮ７２９．６（例３）に記載されるように、ＡＭＰ耐性遺伝子を崩壊させて、３種のＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)発現プラスミドを構築し、次にコンピテントＭＥ１７１９（WO98/01535参照）Ｓ.セレビシエ細胞に形質転換し、それぞれ酵母形質転換株ＹＥＳ２０７６、ＹＥＳ２０７９及びＹＳＥ２０８５を得た。
【００５７】
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を発現させるのに用いた宿主株は、二倍体株であり、２つのアスパラチルプロテアーゼ（即ち、（１）一塩基又は二塩基アミノ酸残基のＣ末端側を切断する酵母アスパラチルプロテアーゼ３（ＹＡＰ３）(Egel-Mitaniら, YEAST 6: 127-137, 1990年)及び（２）プロテアーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＹ，アミノペプチダーゼＩ、ＲＮａｓｅ、アルカリホスファターゼ、酸性トレハラーゼ及びエキソポリホスファターゼのような他のプロテアーゼの活性化を招く液胞型プロテアーゼＡ）を欠如した表現型を有する。さらに、トリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子（ＴＰＩ）を崩壊させ、その表現型は、グルコースを含有する培地における形質転換株の成長においてグルコースを利用することを可能にする。ＭＥ１７１９の遺伝的背景は、ＭＡＴａ/ａ Ｄｙａｐ３::ｕｒａ３/Ｄｙａｐ３::ＵＲＡ３ ｐｅｐ４-３/ｐｅｐ４-３ ｔｐｉ::ＬＥＵ２/Ｄｔｐｉ::ＬＥＵ２ ｌｅｕ２/ｌｅｕ２ Ｄｕｒａ３/Ｄｕｒａ３である。
【００５８】
酵母株から該修飾発現プラスミドｐＫＶ３０１、ｐＫＶ３０７及びｐＫＶ３０４を再分離し、ＰＣＲ生成、続く欠失を特徴とするＤＮＡ領域のサブクローニング後に、ＤＮＡ配列を確認した。同様に、これら酵母株から再分離したプラスミドＤＮＡにおいて、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)をコードするＤＮＡ配列を確認した。表３は、修飾株と非修飾株の比較を示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
収率は、ＹＰＤ中で、３０℃にて、７２時間の５ｍｌ実験室規模の発酵で比較した。収率は、ＨＰＬＣを用いて評価した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｓ．セレビシエ由来のＴＰＩプロモーター及びＴＰＩターミネーター配列の発現制御下にて、インスリン前駆体を発現する遺伝子、及びＹＡＰ３シグナルペプチド及び合成ＬＡ１９リーダーペプチドからなるシグナルリーダー配列を含む発現プラスミドｐＡＫ７２９を示す図である。ｐＡＫ７２９の構築は、WO97/22706に記載される。また該プラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２／ｐＵＣ１３由来のＡＭＰ−Ｒ配列及び大腸菌におけるＤＮＡ複製起点を含有する。
【図２】 ＡＭＰ遺伝子を欠如したＮＮ７２９．５株の生成に用いられる、Ａｍｐ遺伝子の欠失させる前のｐＡＫ７２９．５プラスミドのプラスミド地図を示す図である。
【図３】 ＡＭＰ遺伝子を欠如したＮＮ７２９．６株の生成に用いられる、Ａｍｐ遺伝子を欠失させる前のｐＡＫ７２９．６プラスミドのプラスミド地図を示す図である。
【図４】 ＡＭＰ遺伝子を欠失させたｐＡＫ７２９．６−Δａｍｐプラスミドののプラスミド地図を示す図である。
【図５】 ＡＭＰ遺伝子を欠如したＮＮ７２９．７株の生成に用いられる、Ａｍｐ遺伝子を欠失させる前のｐＡＫ７２９．７プラスミドのプラスミド地図を示す図である。
【図６】 ｐＡＫ７２９（図１）におけるＥｃｏＲＩ(940)−ＸｂａＩ(1403)をコードする配列を、ＭＦアルファ*-Ａｒｇ34ＧＬＰ-１(7-37)をコードする配列で置換することで修飾したｐＫＶ２２８プラスミドのプラスミド地図を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、形質転換した酵母細胞におけるタンパク質の発現、そのような過程において使用するためのＤＮＡ構築物及びベクター、並びに該ベクターで形質転換した酵母細胞に関する。
【０００２】
【発明の背景】
タンパク質の発現のために、形質転換した酵母株を使用することは公知であり、例えば、欧州特許出願第0088632A号、第0116201A号、第0123294A号、第0123544A号、第0163529A号、第0123289A号、第0100561A号、第0189998A号及び第0195986A号、PCT特許出願第WO95/01421号、第95/02059号及び第90/10075号、並びに米国特許第4,546,082号を参照のこと。
【０００３】
酵母産生プラスミドが抗生物質マーカー遺伝子を含むことは、上記の方法の一般的な特徴である。そのようなマーカー遺伝子は、大腸菌(E.coli)における最初のクローニング工程に由来し、ここで該マーカー遺伝子は、形質転換した細胞を選別するために用いられるか、又はベクターとして用いられるプラスミドを維持するために用いられる。抗生物質マーカー遺伝子は、形質転換した酵母細胞の培養に不都合な影響を決して与えないと考えられており、従ってそのようなＤＮＡを欠失させる何れの工程も行わないのが通例であった。さらに、プラスミド構築物の特性は、形質転換した酵母細胞からのプラスミドの単離、及び大腸菌への単離したプラスミドの形質転換の後、抗生物質による選択によって調査される。従って、抗生物質耐性マーカー遺伝子を保有することは、実際には好都合であった。
【０００４】
研究所及び工業生産物プラントは、非常に厳密な安全性管理によって制御されているが、誤って幾らか細胞が環境に放出されるという小さな危険性が常に存在する。それらの非常に複雑な性質のために、そのような遺伝子工学的に操作された微生物は非常に短期間生存するのみであり、環境を害する危険は極めて低い。勿論、このことが、そのような形質転換した微生物が研究及び大規模な実施の両方において使用が許可されてきた理由である。
【０００５】
たとえ細胞が迅速に死に至るとしても、依然として、抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドが誤って環境に廃棄される可能性があり、プラスミドが自発的に獲得される場合に、細菌中において抗生物質に対する耐性が導入されるという理論上の危険が存在する。
【０００６】
抗生物質は、ヒト及び動物の細菌感染の治療に非常に重要である。抗生物質に対して耐性にさせる遺伝子による潜在的な環境汚染の如何なる危険性も、可能な限り最小にすべきである。
従って、今日まで用いられてきた方法よりも、いっそう安全な方法を開発する必要があり、そのような改良方法を提供することが本発明の目的である。
【０００７】
【発明の概要】
本発明は、酵母において異種タンパク質又はポリペプチドを発現させる方法であって、ここで、産生のために用いる酵母形質転換株は発現ベクターを含有し、該ベクターにおいて、最初のクローニング工程で用いられる抗生物質マーカー遺伝子を、酵母宿主の形質転換の前に、イン・ビトロでの修飾により非機能的にする方法に関する。また本発明は、そのような方法において使用するためのＤＮＡ配列及び発現ベクター、並びに形質転換した酵母細胞に関する。
【０００８】
一つの側面に従えば、本発明は、細菌細胞を抗生物質耐性にすることができない組換え型酵母発現ベクターであって、異種遺伝子及びイン・ビトロでの修飾により非機能的にした抗生物質耐性マーカー遺伝子をコードする遺伝子を含む組換え型酵母発現ベクターに関する。
【０００９】
更なる側面に従えば、本発明は、所望のポリペプチド又はタンパク質の製造方法であって、細菌細胞を抗生物質耐性にすることができないベクターであり、かつ異種遺伝子及び酵母宿主の形質転換の前にイン・ビトロでの修飾により非機能的にした抗生物質耐性マーカー遺伝子をコードする遺伝子を含むベクターを含有する酵母株を培養し、その培地から所望の産物を単離することを含んでなる方法に関する。
【００１０】
本発明に従った方法は、典型的に、酵母発現プラスミドを含有する酵母株を培養することを含んでなり、該プラスミドにおいて、細菌における最初のクローニング工程に用いられる機能的抗生物質マーカー遺伝子を、酵母宿主に挿入する前にイン・ビトロにて該マーカー遺伝子の一部又は全マーカー遺伝子を欠失させることにより非機能的にする方法であって、所望のポリペプチド又はタンパク質の発現及び分泌のために用いられる方法である。
【００１１】
抗生物質マーカー遺伝子の欠失は、好ましくは、抗生物質マーカー遺伝子の各側における適切な制限切断部位の挿入によって行われ、それにより、該マーカー遺伝子は、イン・ビトロにて適切な制限酵素で処理することにより欠失する。
【００１２】
また本発明は、細菌細胞を抗生物質耐性にすることができないベクターであり、かつ異種遺伝子及び酵母宿主の形質転換前にイン・ビトロでの修飾により非機能的にした抗生物質耐性マーカー遺伝子をコードする遺伝子を含むベクターを含有する形質転換した酵母株に関する。
酵母株は、サッカロミセス属の株、特にサッカロミセス・セレビシエ(cerevisiae)株が好ましい。
【００１３】
ここで用いる「抗生物質マーカー遺伝子」又は「抗生物質耐性マーカー遺伝子」の表現は、形質転換した細菌細胞の表現型の選択及びプラスミド増幅を可能にする遺伝子を意味する。
【００１４】
大腸菌において最も一般的に用いられる抗生物質耐性マーカー遺伝子は、アンピシリン（ＡＭＰ）、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン及びテトラサイクリン耐性を与えるマーカー遺伝子である。
【００１５】
ここで用いる「非機能的マーカー遺伝子」の表現は、マーカー遺伝子を欠失させるか、又はマーカー遺伝子を該遺伝子の一部を欠失することで非機能的にしたことを意味する。遺伝子を完全に欠失することが好ましい。
【００１６】
ここで用いる「イン・ビトロでの修飾」は、細胞環境の外部でベクターに実施される修飾工程を意味する。
【００１７】
ここで用いる「細菌細胞を抗生物質耐性にすることができない」は、記載される遺伝子操作により、何れの有機体においても抗生物質耐性遺伝子が非機能的であることを意味する。
【００１８】
ここで用いる「酵母宿主」は、発現プラスミド若しくはベクターで、形質転換又はトランスフェクションする酵母有機体を意味する。
【００１９】
【発明の詳細な記述】
本発明は、添付の図面を参照してさらに説明される。
利用可能な制限部位の使用又はＰＣＲ、部位特異的突然変異誘発若しくはＤＮＡ配列操作において他の公知の技法を用いた適切な制限部位の導入、続く適切な制限酵素での処理によって、抗生物質耐性マーカー遺伝子をイン・ビトロにて欠失させる。
【００２０】
４種の修飾ＮＮ７２９株を構築し、プラスミドにおける種々の欠失がインスリン前駆体発酵収率又は長期の発酵中における株の安定性に影響を及ぼすかどうかを評価した（表１）。これらの株は、発酵収率および発酵安定性に関して源(original)のＮＮ７２９株と比較した(表２）。さらに、ＧＬＰ−１変異Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を産生する３種の酵母株を構築し、ＡＭＰ遺伝子を含むプラスミドｐＫＶ２２８における種々の欠失が、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)発酵収率に影響を及ぼすかどうかを評価した（表３）。
【００２１】
ＡＭＰ遺伝子及び恐らく周囲の配列が欠失したプラスミド及び株は、全て「ΔＡＭＰ」と称する。
Ｓ．セレビシエ株ＭＴ６６３(Ｅ２-７Ｂ ＸＥ１１-３６ ａ/α, ΔｔｐｉΔｔｐｉ,ｐｅｐ ４-３/ｐｅｐ ４-３)又はＭＥ１７１９(ＭＡＴａ/αΔｙａｐ３::ｕｒａ３/Δｙａｐ３::ＵＲＡ３ｐｅｐ４-３/ｐｅｐ４-３Δｔｐｉ::ＬＥＵ２/Δｔｐｉ::ＬＥＵ２ ｅｕ２/ｌｅｕ２ Δｕｒａ３/Δｕｒａ３)への、ｐＫＡ７２９又はｐＫＶ２２８修飾プラスミド（ここで、源のプラスミド由来のＡＭＰマーカー遺伝子及び恐らく他のＤＮＡ配列は欠失した）の形質転換により、修飾酵母株を調製した。
【００２２】
プラスミドに既に存在する適切な制限酵素部位の使用、又はＡＭＰ遺伝子が欠失し得るような方法での適切な制限酵素部位の挿入によって、修飾プラスミドを調製した。修飾プラスミドは、Ｓ．セレビシエ（株 ＭＴ６６３）に形質転換する前に、ＡＭＰ遺伝子を欠失させるか、又は非機能的にするような方法で、イン・ビトロで操作することができ、その結果として得られる酵母株はＡＭＰ遺伝子を欠如する。従って、酵母細胞の廃棄中におけるＡＭＰ遺伝子での環境汚染の潜在的な危険性がなくなる。
【００２３】
修飾ｐＡＫ７２９又はｐＫＶ２２８プラスミドを、適切な制限酵素で消化させ、アガロース電気泳動を行い、単離し、再連結させ、次にコンピテントＭＴ６６３及びコンピテントＭＥ１７１９（WO98/01535 それぞれＳ．セレビシエ細胞）に形質転換する。
【００２４】
本発明の方法によって産生されるタンパク質又はポリペプチドは、酵母細胞において都合よく産生される得る何れの異種タンパク質又はポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質の例としては、アプロチニン、組織因子系凝固阻害因子又は他のプロテアーゼ阻害因子、インスリン、インスリン前駆体又はインスリン類縁体、インスリン様増殖因子Ｉ又はII、ヒト成長ホルモン又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノゲン賦活剤、トランスホーミング増殖因子ａ又はｂ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、ＧＲＰＰ、第VII因子、第VIII因子、第XIII因子、血小板由来増殖因子、及びリパーゼのような酵素が挙げられる。
【００２５】
１以上の連続した化学的過程及び／又は酵素的過程により、天然のヒトインスリンに見られるような３つのジスルフィド架橋が正しく形成された２つの鎖のインスリン又はインスリン類縁体分子へ変換され得るプロインスリンを含む単一鎖のポリペプチドは、「インスリン前駆体」又は「インスリン類縁体の前駆体」として理解され得る。インスリン前駆体は、インスリンのＡ鎖及びＢ鎖を架橋する修飾Ｃ−ペプチドを、典型的に含有するであろう。さらに、好ましいインスリン前駆体は、Ｂ(30)アミノ酸残基を欠如するであろう。最も好ましいインスリン前駆体は、例えばEP163529、及びPCT出願第95/00550及び95/07931に記載されるようなものである。インスリンの例としては、ヒトインスリン、好ましくはdes(Ｂ30)ヒトインスリン及びブタインスリンが挙げられる。好ましいインスリン類縁体は、１以上の天然アミノ酸残基、好ましくは１、２または３の天然のアミノ酸残基が、別のコード可能なアミノ酸残基によって置換されたものである。従って、源のインスリンは、位置Ａ２１において、Ａｓｎの代わりに、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｒｙ又はＶａｌを含む群から選択されるアミノ酸残基、特にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＴｈｒを含む群から選択されるアミノ酸残基を有していてもよい。同様に、源のインスリンは、位置Ｂ２８において、Ｐｒｏの代わりに、Ａｓｐ、Ｌｙｓ等を含む群から選択されるアミノ酸残基を有していてもよく、位置Ｂ２９において、Ｌｙｓの代わりに、アミノ酸Ｐｒｏを有していてもよい。
【００２６】
ここで用いる「コード可能なアミノ酸残基」の表現は、遺伝暗号、即ちヌクレオチドのトリプレット（「コドン」）によってコードされ得るアミノ酸残基を表わす。
【００２７】
用いるＤＮＡ構築物は、確立された標準的な方法（例えば、S. L. Beaucage及びM. H. Caruthers, Tetrahedoron Letters 22, 1981, pp1859-1869に記載されるホスホアミダイト法、又はMatthesら, EMBO Journal 3, 1984, pp801-805に記載される方法）により合成的に調製され得る。ホスホアミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドを、例えば、自動ＤＮＡ合成機にて合成し、精製し、二重構造にし、連結させて合成ＤＮＡ構築物を形成する。一般に好ましいＤＮＡ構築物の調製方法は、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく。
【００２８】
また、所望のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、標準的な技法(Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989参照)に従って、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを調製し、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーションすることにより本発明のポリペプチドの全て又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることによって得られる、ゲノム起源又はｃＤＮＡ起源であってもよい。
【００２９】
最後に、所望のタンパク質をコードするＤＮＡは、標準的な技法に従って、合成起源、ゲノム起源又はｃＤＮＡ起源（適切なもの）のアニーリングフラグメント（このフラグメントは、全ＤＮＡ構築物の種々の部分に相当する）によって調製される、合成起源とゲノム起源の混合物、合成起源とｃＤＮＡ起源の混合物、又はゲノム起源とｃＤＮＡ起源の混合物であってもよい。
【００３０】
組換え型発現ベクターは、自律的に複製するベクター、即ち、その複製が染色体の複製に無関係な、染色体外の独立体として存在するベクター（例えば、プラスミド、染色体外因子、ミニクロモソーム、又は人工染色体）であってもよい。ベクターは、確実に自己複製する何れの手段を含有してもよい。また代わりとして、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体とともに複製されるものであってもよい。ベクター系は、宿主細胞のゲノムに導入されて全ＤＮＡをともに含有する、単一のベクター若しくはプラスミド、又は２以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンであってもよい。
【００３１】
組換え型発現ベクターは、適切なプロモーター配列に使用可能なように連結させた所望のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有してもよいであろう。プロモーターは、酵母において転写活性を示す何れのＤＮＡ配列であってもよく、酵母に対して同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子由来であってもよい。適切なプロモーターの例は、サッカロミセス・セレビシエＭα１、ＴＰＩ、ＡＤＨ又はＰＧＫプロモーターである。
【００３２】
また所望のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、例えば、ＴＰＩターミネーターのような適切なターミネーター(T. Alber 及びG. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, pp.419-434参照)に使用可能なように連結させてもよい。
【００３３】
また、本発明の組換え型発現ベクターは、酵母においてベクターが複製できるようなＤＮＡ配列を含有するであろう。そのような配列の例は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１-３及び複製起点である。また該ベクターは、選択可能なマーカー（例えば、P. R. Russell, Gene 40, 1985, pp.125-130に記載されるようなシゾサッカロミセスポンペＴＰＩ遺伝子）を含有していてもよい。
【００３４】
最後に、発現ベクターは、好ましくは、培地に所望のタンパク質又はポリペプチドを確実に分泌するようにシグナル／リーダー配列を含有するであろう。シグナル配列は、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を通ってより大きなポリペプチドを誘導するポリペプチド（分泌ペプチド）をコードするＤＮＡ配列である。より大きなポリペプチドは、分泌経路を通過する間に一般に切断されて、分泌ペプチドを除去する。
【００３５】
分泌シグナル配列は、発現したポリペプチドを、確実にかつ効果的に細胞の分泌経路へ誘導する何れのシグナルペプチドをコードしてもよい。シグナルペプチドは、天然に存在するシグナルペプチド若しくはそれらの機能部分であってもよく、又は合成ペプチドであってもよい。酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエａ−因子及びサッカロミセス・セレビシエインベルターゼ、マウス唾液のアミラーゼのシグナルペプチド(O. Hagenbuchleら, Nature 289, 1981, pp.643-646参照)、修飾カルボキシぺプチダーゼシグナルペプチド(L. A. Vallsら, Cell 48, 1987, pp.887-897参照)、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド(WO87/02670参照)、又は酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド(M. Egel-Mitaniら, Yeast 6, 19909, pp.127-137参照)の遺伝子から得られる。
【００３６】
また酵母における効率的な分泌のために、リーダーペプチドをコードする配列が、シグナル配列の下流かつポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の上流に挿入されてもよい。リーダーペプチドの機能は、培地への分泌のために、発現したポリペプチドを小胞体からゴルジ装置へ、さらには分泌小胞へ誘導させることである（即ち、細胞壁を横切ったポリペプチドの輸送、又は少なくとも酵母細胞の細胞周辺腔への細胞膜を通ったポリペプチドの輸送）。リーダーペプチドは、酵母ａ−因子リーダーであってもよい（例えば、その使用はUS 4,546,082, EP 16201, EP 123294, EP 123544及びEP 163529に記載される）。また代わりとして、リーダーペプチドは、天然に存在しない合成リーダーペプチドであってもよい。合成リーダーペプチドは、WO89/02463又はWO92/11378、及びKjeldsenらによる「タンパク質の発現と精製９, 331〜336（1997年）」に記載されるように構築されてもよい。
【００３７】
「リーダーペプチド」の表現は、その機能により異種タンパク質が分泌されて培地への分泌のために、小胞体からゴルジ装置へ、さらには分泌小胞へ誘導される（即ち、存在するのであれば、細胞膜及び細胞壁を横切った発現したタンパク質若しくはポリペプチドの輸送、又は少なくとも細胞壁を有する細胞の細胞周辺腔への細胞膜を通った発現したタンパク質若しくはポリペプチドの輸送）プロペプチド配列の形態にあるペプチドを意味すると理解される。
【００３８】
所望のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、プロモーター及びターミネーターそれぞれを連結し、それらを酵母複製に必要な情報を含む適切な酵母ベクターにそれらを挿入するために用いられる方法は、当業者にとって公知である（例えば、上述のSambrook参照）。第一に本発明のポリペプチドをコードする全ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を調製し、次にこのフラグメントを適切な発現ベクターに挿入するか、又は個々の要素（シグナル、リーダー又は異種タンパク質のような）の遺伝情報を含むＤＮＡフラグメントを順次挿入し、続いて連結するかによってベクターを構築してもよいことは理解されるであろう。
【００３９】
本発明の過程で用いられる酵母有機体は、培養において、十分な量の所望のタンパク質又はポリペプチドを産生する何れの適切な酵母有機体でもよい。適切な酵母有機体の例は、酵母種サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・クルイベリ(kluyveri)、シゾサッカロミセス・ポンベ、サッカロミセス・ウバルム(uvarum)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)・ラクチス(lactis)、ハンセヌラ(Hansenula)・ポリモルファ(polymorpha)、ピチア(Pichia)・パストリス(pastoris)、ピチア・メタノリカ(methanolica)、ピチア・クルイベリ、ヤロウィア(Yarrowia)・リポリチカ(lipolytica)、カンジダ種、カンジダ・ウチリス(utilis)、カンジダ・カカオイ(cacaoi)、ゲオトリクム種及びゲオトリクム・ファメンタンズ(fermentans)から選択される株であってよく、好ましくは酵母種サッカロミセス・セレビシエである。
【００４０】
酵母細胞の形質転換は、例えば、プロトプラスト形成、続いて本質的に知られた方法での形質転換によって行われてもよい。細胞を培養するのに用いられる培地は、酵母有機体の成長に適切な従来の何れの培地であってもよい。そのかなりの割合が正確に処理された形態で培地中に存在するであろう分泌された異種タンパク質は、遠沈法又は濾過による培地からの酵母細胞の分離、上澄み液又は濾液のタンパク様成分の塩による沈殿（例えば、硫酸アンモニウム）、続いて種々のクロマトグラフィ法による精製（例えば、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ等）を含む従来の方法によって、培地から回収され得る。タンパク質が細胞周辺腔に分泌される場合、酵素的又は機械的に細胞を崩壊させる。
【００４１】
所望のタンパク質又はポリペプチドは、WO97/22706に記載されるようにＮ末端が伸長された融合タンパク質として発現、分泌されてもよい。次にＮ末端伸長は、本技術分野で公知のように、イン・ビトロでの化学的又は酵素的切断によって、回収したタンパク質から除去されてもよい。酵素を用いて切断するのがより好ましい。そのような酵素の例としては、トリプシン又はアクロモバクター(Achromobacter)・リチクス(lyticus)プロテアーゼＩが挙げられる。
【００４２】
本発明は、以下の実施例において更に詳しく記載されるが、それは如何なる方法でも本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。
【００４３】
【実施例】
例１
インスリン前駆体（Ｎ末端が伸張されたＢ(1-29)-Ａｌａ-Ａｌａ-Ｌｙｓ-Ａ(1-21)インスリン前駆体、WO97/22706を参照）の発現のために構築した酵母プラスミドｐＡＫ７２９は、２つのＡｐａＬＩ酵素制限部位ＡｐａＬＩ(4477)及びＡｐａＬＩ(5723)を含む（図１参照）。これらの制限部位は、ＡＭＰマーカー遺伝子の各側に位置する。ｐＡＫ７２９における２つのＡｐａＬＩ部位間の1246ヌクレオチドを除去することにより、ＡＭＰマーカー遺伝子及び更に幾らかの大腸菌由来のプラスミドＤＮＡが取り除かれるであろう。
【００４４】
ｐＡＫ７２９プラスミドを、ＡｐａＬＩ制限酵素で消化させ、アガロース電気泳動を行い、単離し、再連結させ、次にコンピテントＳ．セレビシエ細胞（ＭＴ６６３、EPB0163529参照）に形質転換して、形質転換した酵母株ＮＮ７２９．１−ΔＡＭＰが得られる。酵母株ＮＮ７２９．１−ΔＡＭＰから該修飾発現プラスミドを再分離し、ＰＣＲ生成、続く欠失を特徴とするＤＮＡ領域のサブクローニング後にＤＮＡ配列を確認した。同様に、酵母株ＮＮ７２９．１−ΔＡＭＰから再分離したプラスミドＤＮＡにおいて、インスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列を確認した。
酵母株ＮＮ７２９．１−ΔＡＭＰを、ＹＰＤ培地中で、３０℃にて、７２時間培養した。インスリン前駆体の発酵収率は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した。
【００４５】
例２
ｐＡＫ７２９プラスミドにおいて、ＰＣＲにより酵素制限部位ＸｈｏＩ(5676)及びＸｈｏＩ(5720)を導入した。次に得られたｐＡＫ７２９．５プラスミドの選択されたＤＮＡ配列を確認した。ｐＡＫ７２９．５の制限プラスミド地図を図２に示してある。制限酵素部位ＸｈｏＩ(5676)及びＸｈｏＩ(5720)間のＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＡＫ７２９．５から欠失させて、ＡＭＰ遺伝子内に位置する４４ヌクレオチドを欠失させることが可能である。
【００４６】
プラスミドｐＡＫ７２９．５をＸｈｏＩ制限酵素で消化させ、アガロース電気泳動を行い、単離し、再連結させ、次にコンピテントＭＴ６６３Ｓ．セレビシエ細胞に形質転換させ、酵母形質転換株ＮＮ７２９．５−ΔＡＭＰを得た。酵母株ＮＮ７２９．５−ΔＡＭＰから該修飾発現プラスミドを再分離し、ＰＣＲ生成、続く欠失を特徴とするＤＮＡ領域のサブクローニング後に、ＤＮＡ配列を確認した。同様に、酵母株ＮＮ７２９．５−ΔＡＭＰから再分離したプラスミドＤＮＡにおいて、インスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列を確認した。ｐＡＫ７２９．５−ΔＡＭＰにおける４４のヌクレオチドの欠失が、βーラクタマーゼ活性の喪失に関してＡＭＰ遺伝子の完全な欠失と同程度に効率的であることがわかった。
酵母株ＮＮ７２９．５−ΔＡＭＰを、ＹＰＤ培地中で、３０℃にて、７２時間培養した。インスリン前駆体の発酵収率は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。
【００４７】
例３
酵素制限酵素部位ＡａｔII(4982)を、ＰＣＲによってｐＡＫ７２９プラスミドに導入した。次に得られたｐＡＫ７２９．６プラスミドの選択されたＤＮＡ配列を確認した。ｐＡＫ７２９．６の制限プラスミド地図は図３に示してある。ｐＡＫ７２９．６において、制限酵素部位ＡｔａII(4982)及びＡｔａII(5978)間のＤＮＡフラグメントを欠失させて、該プラスミドから996のヌクレオチドを取り除くことができる。これにより、ＡＭＰ遺伝子全て及びプロモーターが除去されるであろう。
【００４８】
ｐＡＫ７２９．６プラスミドをＤＮＡ制限酵素ＡａｔIIで消化させ、アガロース電気泳動を行い、単離し、再連結させ、次にコンピテントＭＴ６６３Ｓ．セレビシエ細胞に形質転換した。酵母株ＮＮ７２９．６−ΔＡＭＰから該発現プラスミドを再分離し、ＰＣＲ生成、続く欠失を特徴とするＤＮＡ領域のサブクローニング後に、ＤＮＡ配列を確認した。同様に、酵母株ＮＮ７２９．６−ΔＡＭＰから再分離したプラスミドＤＮＡにおいて、インスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列を確認した。ＡＭＰ遺伝子を欠如しているプラスミドｐＡＫ７２９．６−ΔＡＭＰを図４に示してある。
酵母株ＮＮ７２９．６−ΔＡＭＰを、ＹＰＤ培地中で、３０℃にて、７２時間培養した。インスリン前駆体の発酵収率は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。
【００４９】
例４
ｐＡＫ７２９．７プラスミドにおける新たな酵素制限酵素部位ＡａｔII(3801)を、ＰＣＲにより源のｐＡＫ７２９プラスミドに導入した。次にｐＡＫ７２９．７の選択されたＤＮＡ配列を確認した。ｐＡＫ７２９．７において、制限酵素部位ＡｔａII(3801)およびＡａｔII(5978)間のＤＮＡフラグメントを欠失させて、該発現プラスミドから2177のヌクレオチドを除去することかできる。ｐＡＫ７２９．７プラスミドは、ＡＭＰ遺伝子及び大腸菌の複製起点の両方を欠失させることができるように設計された。ｐＡＫ７２９．７の制限プラスミド地図は図５に示してある。
【００５０】
ｐＡＫ７２９．７プラスミドを、ＤＮＡ制限酵素ＡａｔIIで消化させ、アガロース電気泳動を行い、単離し、再連結させ、次にコンピテントＭＴ６６３Ｓ．セレビシエ細胞に形質転換した。酵母株ＮＮ７２９．７−ΔＡＭＰから該修飾発現プラスミドを分離し、ＰＣＲ生成、続く欠失を特徴とするＤＮＡ領域のサブクローニング後に、ＤＮＡ配列を確認した。同様に、酵母株ＮＮ７２９．７−ΔＡＭＰから再分離したプラスミドＤＮＡにおいて、インスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列を確認した。酵母株ＮＮ７２９．７−ΔＡＭＰを、ＹＰＤ培地中で、３０℃にて、７２時間培養した。インスリン前駆体の発酵収率は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。
【００５１】
【表１】
インスリン前駆体の発酵収率に関して、新規ＮＮ７２９−ΔＡＭＰ株を、源のＮＮ７２９株と比較した（表２）。
【００５３】
【表２】
部分的に又は完全に欠失させたＡＭＰマーカー遺伝子を有する発現プラスミドを含有する酵母株が、ＡＭＰ遺伝子を含む発現プラスミドを含有する源の酵母株に比較して、インスリン前駆体を１０〜２０％も多く発現するということが、上記より明らかである。
【００５５】
例５：非機能的ＡＭＰ耐性遺伝子又は欠失させたＡＭＰ耐性遺伝子を有するプラスミドを用いた酵母におけるＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)の発現
図１〜５に例示されるＬＡ１９Ｘ５Ｍ１３をコードするｐＡＫ７２９構築物のＥｃｏＲＩ(940)−ＸｂａＩ(1403)配列を、本例のＭＦアルファ*−Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)をコードする配列で置き換えた（図６）。ＭＦα１プレ−プロリーダーペプチド(Kurjan 及び Herskowitz, Cell 30, 1982. pp.993)の修飾（ここで、位置８２のＬｅｕ及び位置８３のＡｓｐは、それぞれＭｅｔ及びＡｌａで置換され、ＤＮＡ配列にＮｃｏＩ切断部位を導入する）を、この構築物にて行った。該リーダー配列を、ＭＦα１*と称した(Kjeldsen T.ら, 1996年)。ＭＦα1シグナルＭＦα１*リーダーペプチド配列は、二塩基のＫｅｘ２ｐ認識モチーフ（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）を含有し、該モチーフはＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)のコード配列とリーダーとを分離する。ペプチドＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)は、ヒトＧＬＰ−１(7-37)変異体(S. Mojsovら, J Biol. Chem. 261, 1986, pp.11880-11889）であり、ここで、位置３４の天然のアミノ酸残基はＡｒｇ残基で置換されている。
【００５６】
ＮＮ７２９．１（例１）、ＮＮ７２９．５（例２）及びＮＮ７２９．６（例３）に記載されるように、ＡＭＰ耐性遺伝子を崩壊させて、３種のＡｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)発現プラスミドを構築し、次にコンピテントＭＥ１７１９（WO98/01535参照）Ｓ.セレビシエ細胞に形質転換し、それぞれ酵母形質転換株ＹＥＳ２０７６、ＹＥＳ２０７９及びＹＳＥ２０８５を得た。
【００５７】
Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)を発現させるのに用いた宿主株は、二倍体株であり、２つのアスパラチルプロテアーゼ（即ち、（１）一塩基又は二塩基アミノ酸残基のＣ末端側を切断する酵母アスパラチルプロテアーゼ３（ＹＡＰ３）(Egel-Mitaniら, YEAST 6: 127-137, 1990年)及び（２）プロテアーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＹ，アミノペプチダーゼＩ、ＲＮａｓｅ、アルカリホスファターゼ、酸性トレハラーゼ及びエキソポリホスファターゼのような他のプロテアーゼの活性化を招く液胞型プロテアーゼＡ）を欠如した表現型を有する。さらに、トリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子（ＴＰＩ）を崩壊させ、その表現型は、グルコースを含有する培地における形質転換株の成長においてグルコースを利用することを可能にする。ＭＥ１７１９の遺伝的背景は、ＭＡＴａ/ａ Ｄｙａｐ３::ｕｒａ３/Ｄｙａｐ３::ＵＲＡ３ ｐｅｐ４-３/ｐｅｐ４-３ ｔｐｉ::ＬＥＵ２/Ｄｔｐｉ::ＬＥＵ２ ｌｅｕ２/ｌｅｕ２ Ｄｕｒａ３/Ｄｕｒａ３である。
【００５８】
酵母株から該修飾発現プラスミドｐＫＶ３０１、ｐＫＶ３０７及びｐＫＶ３０４を再分離し、ＰＣＲ生成、続く欠失を特徴とするＤＮＡ領域のサブクローニング後に、ＤＮＡ配列を確認した。同様に、これら酵母株から再分離したプラスミドＤＮＡにおいて、Ａｒｇ34ＧＬＰ−１(7-37)をコードするＤＮＡ配列を確認した。表３は、修飾株と非修飾株の比較を示す。
【００５９】
【表３】
収率は、ＹＰＤ中で、３０℃にて、７２時間の５ｍｌ実験室規模の発酵で比較した。収率は、ＨＰＬＣを用いて評価した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｓ．セレビシエ由来のＴＰＩプロモーター及びＴＰＩターミネーター配列の発現制御下にて、インスリン前駆体を発現する遺伝子、及びＹＡＰ３シグナルペプチド及び合成ＬＡ１９リーダーペプチドからなるシグナルリーダー配列を含む発現プラスミドｐＡＫ７２９を示す図である。ｐＡＫ７２９の構築は、WO97/22706に記載される。また該プラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２／ｐＵＣ１３由来のＡＭＰ−Ｒ配列及び大腸菌におけるＤＮＡ複製起点を含有する。
【図２】 ＡＭＰ遺伝子を欠如したＮＮ７２９．５株の生成に用いられる、Ａｍｐ遺伝子の欠失させる前のｐＡＫ７２９．５プラスミドのプラスミド地図を示す図である。
【図３】 ＡＭＰ遺伝子を欠如したＮＮ７２９．６株の生成に用いられる、Ａｍｐ遺伝子を欠失させる前のｐＡＫ７２９．６プラスミドのプラスミド地図を示す図である。
【図４】 ＡＭＰ遺伝子を欠失させたｐＡＫ７２９．６−Δａｍｐプラスミドののプラスミド地図を示す図である。
【図５】 ＡＭＰ遺伝子を欠如したＮＮ７２９．７株の生成に用いられる、Ａｍｐ遺伝子を欠失させる前のｐＡＫ７２９．７プラスミドのプラスミド地図を示す図である。
【図６】 ｐＡＫ７２９（図１）におけるＥｃｏＲＩ(940)−ＸｂａＩ(1403)をコードする配列を、ＭＦアルファ*-Ａｒｇ34ＧＬＰ-１(7-37)をコードする配列で置換することで修飾したｐＫＶ２２８プラスミドのプラスミド地図を示す図である。
Claims (3)
- 適切な条件下にて酵母発現プラスミドを含有する酵母株を培養することを含んでなる、所望のポリペプチド又はタンパク質の製造方法であって、前記プラスミドにおいて、細菌における最初のクローニング工程に用いられる機能的抗生物質マーカー遺伝子を、酵母宿主に挿入する前にイン・ビトロにて前記マーカー遺伝子の一部又は全マーカー遺伝子を欠失させることにより、非機能的にする方法。
- 前記抗生物質耐性マーカー遺伝子の周囲に適切な制限部位を挿入し、イン・ビトロにて適切な制限酵素で処理することにより前記マーカー遺伝子を欠失させることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
- 前記酵母株が、サッカロミセス属の株、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ株である請求項１または２項に記載の方法。
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