KR20010071929A - 형질전환된 이스트 세포 내에서의 단백질 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 기능성 항생물질 마커 유전자를 함유하지 않는 형질전환된 이스트 균주를 배양하는 것에 의해서 이스트 내에서 이종성 단백질이나 폴리펩티드를 발현시키는 방법에 관한 것이다.
Description
예를 들어 유럽 특허 출원번호 0088632A, 0116201A, 0123294A, 0123544A, 0163592A, 0123289A, 010056A, 0189998A, 0195986A, PCT 특허출원번호 WO 95/01421, WO 95/0259 ,WO 90/10075, 미국 특허 번호 4,546,082 에서 보듯 단백질의 발현을 위해 형질전환된 이스트균주를 사용하는 것은 잘 알려져 있다.
이스트 생성 플라스미드가 항생물질 마커에 대한 유전자를 함유하는 것은 상기의 방법의 일반적인 특징이다. 그러한 마커 유전자는 대장균 내에서 형질전환된 세포를 보호하거나 벡터로서 사용된 플라스미드를 유지하는데 사용되는 초기클로닝 단계로 부터 유래한다. 항생물질 마커 유전자는 형질전환된 이스트세포의 배양에서 어떤 반대의 영향을 준다고 믿어지지 않는다. 그러므로 그 DNA를 결실하기 위해 어떤 단계도 밟지 않는 일반적인 실행을 해왔다. 게다가 플라스미드 구조의 특성화는 일반적으로 형질전환된 이스트세포로 부터 플라스미드의 분리와 항생물질 선택에의해 수반되는 대장균내로 분리된 플라스미드의 형질전환에 의해 행해진다. 그러므로 항생물질 마커 유전자를 유지하는 것은 실용적인 목적을 위해 편리한 것이었다.
연구실과 산업적 생산공장이 매우 엄격한 안전규정에 의해 조절된다 할지라도 우연히 수개의 세포가 외계로 방출될 작은 위험은 항상 있다. 고도로 복잡한 성질 때문에 그러한 유전공학에 의해 생산된 미생물은 단지 매우 짧은 시간동안 생존할것이고 환경을 손상시키는 위험은 극히 낮다. 이것이 그런 형질전환된 미생물이 연구와 대규모 조작의 양자에서 사용을 위해 승인되는 당연한 이유이다.
설사 세포가 재빨리 죽는다 할지라도 항생물질 내성 유전자는 여전히 우연히 외계로 배치될 것이고 만일 플라스미드가 자발적으로 흡수된다면 박테리아 에서 항생제에 대한 내성의 도입의 이론상의 위험이 있다.
항생제는 감염에 있어서 인간과 동물 박테리아 처치에 대해 매우 중요하다. 항생제에 내성을 주는 유전자와 함께 잠재적인 환경오염의 위험은 가능한 한 최소화 되어야 한다.
그러므로 오늘날까지 진부하게 사용된 방법보다 좀더 안전한 방법을 개발하는 것이 필요하고 그런 개선된 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
(발명의 개요)
본 발명은 생성물을 위해 사용된 이스트 형질전환균주가 이스트숙주의 형질전환 전에 시험관내 변이에 의해 초기 클로닝 단계에서 사용된 항생물질 마커 유전자가 비기능성으로 만들어진 발현 벡터를 포함하는 점에 있어서 이스트내 이종성 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DNA서열과 그런 방법에서 사용되기위한 발현 벡터와 형질전환된 이스트세포에 관한 것이다.
하나의 관점에 의하면 본 발명은 이종성 유전자를 코딩하는 유전자와 시험관내 변이에 의해 비기능성으로 만들어진 항생물질 내성 마커 유전자를 포함하는 박테리아 세포에 항생물질 내성을 부여할 수 없는 재조합 이스트 발현 벡터에 관한 것이다.
다른 추가적인 관점에서 본 발명은 당해 방법이 박테리아 세포에 항생물질 내성을 부여할 수 없는 벡터를 포함하고 이종성유전자를 코딩하는 유전자를 유전자와 마커 유전자가 이스트숙주의 형질전환 전에 시험관내 변이에 의해 비기능성으로 만들어진 항생물질 마커 유전자를 포함하는 이스트 균주를 배양하고, 배지로부터 원하는 생성물을 분리하는 것을 포함하는 원하는 단백질 또는 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 방법은 전형적으로 박테리아내에 초기 클로닝단계에 사용하는 기능성의 항생물질 마커 유전자가 발현에 사용된 이스트숙주 내로 삽입전에 마커 유전자 일부 또는 전체 마커 유전자를 시험관내 결실로써 플라스미드 내에서 비기능성으로 만들어진 이스트 발현 플라스미드를 함유하는 이스트 균주와 원하는 폴리펩티드 또는 단백질의 세크레틴을 배양하는 것을 포함한다.
항생물질 마커 유전자의 결실은 항생물질 내성 마커 유전자의 각 측면에서 적당한 제한 분열 부위의 삽입에 의해 이뤄지고, 그 결과 마커 유전자는 적당한 제한 효소와의 시험관내 처치에 의해 결실된다.
본 발명은 또한 박테리아 세포에 대해 항생물질 내성을 부여할 수 없는 벡터와, 이종성 유전자를 코딩하는 유전자와 이스트 숙주의 형질전환 전에 시험관내 변이에 의해 비기능성으로 만들어진 항생물질 내성 마커 유전자를 포함하는 형질전환된 이스트 균주에 관한 것이다.
이스트 균주는 바람직하게는 사카로마이시스 균주이고, 특히 사카로마이시스 세레비시애 균주이다.
이 문서 중에 사용된 표현 "항생물질 마커 유전자 또는 항생물질 내성 마커 유전자" 는 형질전환된 박테리아 세포의 표현형의 선택과 플라스미드 증폭을 허용하는 유전자를 의미한다.
대장균에서 가장 일반적으로 사용된 항생물질 내성 마커 유전자는 암피실린(AMP), 클로람페니콜, 네오마이신, 카나마이신과 테트라사이클린 내성을 부여하는 마커 유전자 이다.
이 문서 중에 사용된 표현 "비기능성의 마커 유전자"는 마커 유전자가 유전자의 일부를 결실하여 비기능성으로 만들어 지거나 결실된 것을 의미한다. 유전자는 완전히 결실되는 것이 더 좋다.
이 문서 중에 사용된 "시험관내 변이" 는 세포 환경밖 백터에서 미리 형성된 변이 단계를 의미한다.
이 문서 중에 사용된 "박테리아 세포에 항생물질 내성을 부여할 수 없는" 이란 항생물질 내성 유전자가 서술된 유전자 조작 때문에 어떤 생명체 내에서 비기능성인 것을 의미한다.
이 문서 중에 사용된 "이스트 균주" 란 발현 플라스미드 또는 벡터에 의해 형질전환 되거나 분리핵산된 이스트 생명체를 의미한다.
본 발명은 형질전환된 이스트 세포내에서 단백질의 발현, DNA구조 그리고 그 과정에서 사용하기 위한 벡터와 그 벡터로써 형질전환된 이스트세포에 관한 것이다.
본 발명은 추가적으로 부가된 도면에 참고로서 도해 되어 있다.
도 1은 합성 LA19리더 펩티드와 YAP3시그널 펩티드로 구성되어 있는 시그널 리더 서열과 S. 세레비시애로부터 TPI프로모터와 TPI터미네이터 서열의 발현조절하에서 인슐린 전구체를 발현시키고 있는 유전자를 포함하는 발현 플라스미드 pAK729를 나타낸다. pAK729의 구조는 WO 97/22706에 기술된다. 플라스미드는 또한 대장균 내에 DNA 복제의 원형과 암피실린 내성 유전자를 포함하는 pBR322/pUC13으로부터 AMP-R서열을 함유한다.
도 2는 AMP 유전자의 결실에 앞서서 AMP 유전자가 부족한 NN729.5균주의 발생을 위해 사용된 pAK729.5 플라스미드의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 3은 AMP 유전자의 결실에 앞서서 AMP 유전자가 부족한 NN729.6균주의 발생을 위해 사용된 pAK729.6플라스미드의 플라스미드지도를 나타낸다.
도 4는 AMP유전자가 결실된 pAK729.6-△amp 플라스미드의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 5는 AMP유전자의 결실에 앞서서 AMP유전자가 부족한 NN729.7균주의발생을 위해 사용된 pAK729.7플라스미드의 플라스미드지도를 나타낸다.
도 6은 pAK729(도 1)에서 EcoRI (940)- Xbal(1403)코딩 서열을 MF alpha*-Arg34GLP(7-37)코딩 서열로 대체함으로써 변이된 pKV228 플라스미드의 플라스미드지도를 나타낸다.
항생물질 내성 마커 유전자의 시험관내 결실은 유용한 제한 부위의 사용에 의해서 또는 PCR의 사용에의한 적당한 제한 부위의 도입에 의해서 행해지고 , 부위 종돌연변이유발 또는 그외 것은 적절한 제한효소와의 처치에 의해서 따르는 DNA서열의 조작을 위한 기술을 잘 안다.
네개의 NN729 균주는 플라스미드 내에서 다양한 결실이 이슐린 전구체 발효수율 또는 장기간 발효동안 균주의 안전성에 영향을 미칠수 있는지 어떤지를 평가하기 위하여 구성되었다(도 1). 그 균주는 발효수율과 발효안정성에 관하여는 원형의 NN729균주와 비교되었다(도 2). 게다가 GLP-1변형된 Arg34GLP-1(7-37)을 생성하는 세개의 변이된 이스트 균주는 AMP유전자를 포함하는 플라스미드 pKV228 내에서의 다양한 결실이 Arg34GLP-1(7-37)발효수율에 영향을 미칠 수 있는지 어떤지를 평가하기 위하여 구성되었다(도 3).
AMP 유전자와 어쩌면 결실된 주위의 서열에 있어서 프라스미드와 균주는 모두 표시된 "△AMP " 이다.
변이된 플라스미드는 AMP 마커 유전자와 원형 플라스미드로 부터 가능한 다른 DNA가 S.세레비시애 균주 MT663(E2-7B XE11-36 a/α,△tpi△tpi,pep 4-3/pep4-3)또는ME1719(MATa/α△yap3::ura3/△yap3::URA3pep4-3/pep4-3△tpi::LEU2/△tpi::LEU2 eu2/leu2 △ura3/△ura3)) 내로 결실되었던 pAK729 또는 pKV228 변이된 플라스미드의 형질전환에 의해 제조되었다.
변이된 플라스미드는 플라스미드내에 이미 존재하는 적절한 제한효소 부위의 사용에 의해서 또는 AMP유전자가 결실될 수 있는 그러한 경로에서 적절한 제한효소 부위의 삽입에 의해서 제조되었다. 변이된 플라스미드는 AMP유전자가 결실되거나 비기능성 으로 만들어지는 그러한 경로로 S.세레비시애 (균주 MT663 )내로 형질전환 전에 시험관 내에서 조작될 수 있고 그 결과로서 결과된 이스트 균주는 AMP 유전자가 결핍된다. 따라서 이스트 세포가 배열하는 동안 AMP 유전자와 함께 환경오염에 대한 잠재적인 위험은 제거되었다.
변이된 pAK729 또는 pKV228 플라스미드는 적절한 제한효소에 의해서 분류되고, 아가로스 전기영동에 위임되고, 분리되고, 재결찰되었다. 그리고 이어서 우수한 MT663 와 우수한 ME1719 WO98/01535 S.세레비시애 세포내로 각각 형질전환되었다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 단백질 또는 폴리펩티드는 이스트 세포내에서 아마 유익하게 생성된 폴리렙타이드 또는 이종성 단백질일 것이다. 그런 단백질의 예는 아프로티닌, 조직인자경로억제제, 또는 다른 단백질분해효소 억제제(portease inhibitor), 인슐린, 인슐린 전구체 또는 이슐린 유사체,이슐린 유사-성장인자Ⅰ또는Ⅱ, 인간 또는 소과의 성장호르몬, 인터루킨, 조직 플라스미노겐 엑티베이터, 형질전환하는 성장인자 a또는b, 글루카곤, 글루카곤 유사펩티드1(GLP-1) ,글루카곤유사 펩티드2(GLP-2 ), GRPP, 인자Ⅶ, 인자Ⅷ, 인자ⅩⅢ, 혈소판 유도 성장인자, 리파아제 등의 효소 이다.
인슐린 전구체 또는 이슐린 유사체의 전구체는 프로인슐린을 포함하는, 하나 또는 그이상의 뒤이은 케미칼에의해 그리고/또는 효소적인 과정은 천연의 인간 인슐린에서 발견된는 것처럼 세개의 이황화물 브릿지의 정확한 체제를 가지는 인슐린 유사체 또는 이중고리 인슐린으로 전환될수 있는 단일 고리 폴리펩티드로 이해된다. 인슐린 전구체는 전형적으로 인슐린의 A와 B고리를 연결하는 변이된 C펩티드를 포함한다. 게다가 선호되는 인슐린 전구체는 B(30)아미노산 잔재물을 필요로 할 것이다. 대부분의 선호된 인슐린 전구체는 예컨데 EP163529 와PCT출원번호 95/00550과 95/07931에서 서술된 것들이다. 인슐린의 예는 인간 인슐린 바람직하게는 des(B30)인간 인슐린, 그리고 돼지의 인슐린 이다. 선호된 인슐린 유사체는 하나 또는 그 이상의 천연 아미노산 잔재물, 바람직하게는 하나, 둘, 또는 세개가 다른 암호화 가능한 아미노산 잔재물로 치환되는 점에 있어서의 그러한 것이다. 위치 A21의 본원 인슐린은 아마도 Asn을 대신하여 Ala, Gln, Glu, Gly, His, IIe, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔재물, 특히 Gly,Ala,Ser과 Thr을 포함하는 그룹으로 부터 선택된 아미노산 잔재물 을 가질 것이다. 마찬가지로, 위치B28에서 본원인슐린은 아마도 Pro를 대신하여 Asp,Lys등을 포함하는 그룹으로 부터 선택된 아미노산 잔재물을 가질 것이고, 그리고 위치B29에서 본원 인슐린은 Lys를 대신하여 아미노산 Pro를 가질 것이다.
이 문서 중에 사용된 표현 "암호화가능한 아미노산 잔재물"은 유전학상의 코드, 다시 말해서 뉴클레오티드의 트리플렛("코돈")에 의해서 암호화 될수 있는 아미노산 잔재물을 지칭한다.
사용된 DNA구조는 확립된 표준방법, 예컨데 S.L.Beaucage 와 M.H.Csruthers, Tetrahedron Letters22, 1981,pp.1859-1869,에 의해 설명된 포스포아미다이트방법 또는 Matthes et al.,EMBO 저널3,1984,pp.801-805에 의해서 설명된 방법에 의하여 아마 합성적으로 제조될 수 있다. 포스포아미다이트 방법 에의하면 올리고 뉴클레오티드는 예컨데 자동 DNA 합성기 에서 합성되고, 결실되고, 복사되고, 합성된DNA 구조를 형성하기 위해 결찰된다. DNA 구조합성의 일반적으로 선호되는 방식은 예를 들면 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Lsboratory Manual, Cold Spring Harbor. NY, 1989 에서 설명된 대로 폴리머레이즈 고리반응(PCR)에 의한 것이다.
또한 원하는 단백질을 코딩하는 DNA는 아마 예컨데 유전자 은행또는 cDNA은행을 제조함에 의하여 그리고 표준기술에 따라서 합성된 올리고뉴클래오티드프로브를 사용하는 혼성화에 의한 발명 또는 폴리펩티드의 전부나 일부를 코딩하는 DNA서열을 보호함에 의하여 얻어지는 개놈의또는 cDNA의 원형일 것이다(참조 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Lsboratory Manual, Cold Spring Harbor. 1989 ).
마침내, 원하는 단백질을 암호화하는 DNA는 합성된 ,게놈의 또는 cDNA의원형 의 가열냉각 단편, 표준기술에 따라서 완전한 DNA구조의 다양한 부분에 상응하는단편에 의해서 제조되는 혼합된 합성의 그리고 게놈의, 혼합된 합성의 그리고 cDNA의 또는 혼합된 게놈의 그리고 cDNA의 원형일 것이다.
재조합 발현벡터는 예컨데 염색체외 실체로서 존재하는 벡터와 같은 자율적인 복제벡터, 예컨데 플라스미드, 염색체외 인자, 미니염색체, 모조 염색체와 같은 염색체에 비의존적인 복제벡터일 것이다. 벡터는 자기복제를 확신하는 어떤 도구를 포함할것이다. 택일적으로 벡터는 숙주세포내로 도입될때 게놈내로 합쳐진것과 합쳐진벡터내로 염색체와 함께 서로 복제된 벡터의 하나일 것이다. 벡터시스템은 숙주세포또는 트란스포존의 게놈내로 도입된 토탈 DNA를 서로 함유하는 하나의 벡터또는 플라스미드 또는 두개나 그이상의 벡터또는 플라스미드일 것이다.
재조합 발현 벡터는 적당한 프로모터서열에 조작할수 있게 연결된 원하는 단백질 또는 폴리펩티다이드를 암호화하는 DNA서열을 포함할것이다. 프로모터는 이스트에서 복사의 활동성을 보여주는 어떤 DNA서열일 것이고 이스트에 동종성이나 이종성의 단백질을 암호화하는 유전자로부터 파생될 것이다. 프로모터는 바람직하게는 이스트에 단백질 동종성을 암호화하는 유전자로부터 파생될 것이다. 프로모터의 적당한 예는 사카로마이시스 세레비애 Mα1,TPI,ADH 또는 PGK 프로모터이다.
원하는 단백질또는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA서열은 예컨데 터미네이터와 같은 적당한 터미네이터에 조작할수 있게 연결될 것이다.(참조 T.Alber & G.Kawasaki,J. Mol.Appl. Genet.1,1982,pp.419-434 )
본 발의 재조합 발현 벡터는 이스트내에 복제하기위한 벡터를 가능하게하는 DNA서열을 또한 포함할 것이다. 그런 서열의 예는 이스트 플라스미드 2μ복제유전자 REP 1-3와 복제의 원형이다. 또한 그 벡터는 P.R.Russel,Gene40,1985,pp125-130 에의해서 설명된 대로 예컨데 스키조사카로마이시스 폼베 TPI 유전자와 같은 선택가능한 표시를 포함할 것이다.
마침내 발현 벡터는 바람직하게는 배지에 원하는 단백질이나 폴리펩티드의 분비를 보증하는 시그널/리더 서열을 포함할 것이다. 시그널 서열은 더 큰 폴리펩티드의 구성성분으로서 폴리펩티드를 암호화하고 ,합성된 세포의 분비경로를 통해서 더큰 폴리펩티드를 지휘하는 DNA서열이다.더큰 폴리펩티드는 일반적으로 분비경로를 통해 운반하는 동안 분비성 펩티드를 제거하기 위하여 쪼개진다.
분비성 시그널 서열은 세포의 분비경로 내로 발현된 폴리펩티드의 유효한 지시를 보증하는 어떤 시그널 펩티드이다.시그널 펩티드는 자연히 발생하는 시그널펩티드 또는 그것으로 부터의 기능적인 부분이거나 합성 펩티드일 것이다.이스트숙주에 대한 유용한 시그널 펩티드는 시카로마이시스 세레비애요소와 시카로마이시스 세레비애 인버타아제, 구강타액의 아밀라제의 시그널 펩티드(참조 O.Hagenbuchle et al.,Nature 289, 1981, pp. 643-646 ), 변이된 카르복시펩티다아제 시그널 펩티드(참조L.A. Valls etal.,Cell 48, 1987, pp. 887-897), 이스트BAR1시그널 펩티드(참조WO 87/02670), 또는 이스트 아스파라틱 프로테아제3(YAP3)시그널펩티드(참조 M. Egel-Mitani et al.,Yeast 6, 1990, pp. 127-137)에 대한 유전자로부터 얻어진다.
이스트에서 유효한 분비작용을 위해, 리더 펩티드를 암호화하는 서열은 시그널 서열의 하류와 폴리펩티드를 암호화하는 DNA서열의 상류에 삽입된다. 리더 펩티드의 기능은 발현된 폴리펩티드가 소포체에서 골지체와 배지내로의 분비를 위한 더 먼 분비성의 소포로 지시되도록 한다.(다시말해 폴리펩티드의 유출은 세포벽 또는 적어도 이스트세포 의 주변세포질공간내로 세포막을 통해 가로지른다.) 리더 펩티드는 이스트 팩터 리더일 것이다(그의 용도는 예를들어 US 4,546,082,EP,16 201,EP 123294,EP 123 544 & EP 163 529 에 서술되어 있다). 택일적으로 리더 펩티드는 자연에서는 발견되지 않는 리더 펩티드인 합성된 리더 펩티드 일 것이다. 합성된 리더 펩티드는 WO 89/02463 또는 WO 92/11378과 Kjeldsen et al에 의한 "단백질 발현과 정제9" 331-336(1997) 에서 서술된대로 구성된 것이다.
표현 "리더펩티드"는 그의 기능이 이종성단백질이 소포체에서 골지체와 배지내로의 분비를 위한 더 먼 분비성의 소포로 지시되도록 분비되는것을 허용하는 폴리펩티드서열의 형성에 있어서의 펩티드를 지칭하는것으로 이해된다.(다시 말해 발현된 단백질 이나 폴리펩티드는 세포막과 만일 존재한다면 세포벽 또는 적어도 세포벽을 가지는 세포의 주변세포질 공간 내로 세포막을 통해서 가로지른다.)
원하는 단백질이나 폴리펩티드, 프로모터와 터미네이터 각각에 대해 암호화를 하는 DNA 서열을 결찰하기 위해 사용되고 그들을 이스트 복제를 위한 정보필요를 포함하는 적절한 이스트 벡터내로 삽입하기 위해 사용되는 과정은 당업자에게 잘 알려진다(예컨데 Sambrook et al.,op.cit.). 벡터는 이 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 완전한 DNA 서열과 순차적으로 적당한 발현 벡터 내로 이 단편을 삽입하는것을 포함하는 첫번째 제조된 DNA구조에 의해서 이거나 결찰에 의해 수행되는 개개의 요소(시그널, 리더 또는 이종성 단백질과 같은)에 대한 유전학상의 정보를 포함하는 DNA단편을 순차적으로 삽입하는 것에 의해서 만들어진다고 이해된다.
본 발명의 과정에서 사용된 이스트생명체는 배양균에서 원하는 단백질이나 폴리펩티드의 만족스러운 상당양을 생성하는 어떤 적당한 이스트 생명체일 것이다.적당한 이스트 생명체의 예는 이스트 종 Saccharomyces cerevisiae,Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri,Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida cacaoi, Geotrichum sp., 그리고 Geotrichum fermentans, 바람직하게는 이스트 종 Saccharomyces cerevisiae로부터 선택된 균주일 것이다.
예를 들면 이스트 세포의 형질전환은 그 자체로 알려진 방법에서 형질전환에 의해 수행되는 원형질체구조에 의해서 초래될 것이다. 세포를 배양하기 위해서 사용된 배지는 이스트 생명체를 성장시키기 위해 적당한 전통적인 배지일 것이다. 분비된 이종성 단백질은, 올바르게 진행된 방식으로 배지에서 존재할 중요한 비율로, 예컨대 이온교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피 또는 이와 동일한 종류의 것의 크로마토그래피 절차의 다양성에 의한 정화에 의해 수행되는, 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 이스트 세포를 분리하는 것을 포함하는, 예를 들어 암모니움 설페이트 등의 염을 수단으로한 여과액 또는 상청액의 단백질 같은 구성성분을 침전시키는 것을 포함하는 전통적인 절차에 의해 배지로부터 재생될 것이다. 단백질이 주변세포질공간으로 분비될 때 세포는 효소적으로 또는 기계적으로 분해된다.
원하는 단백질이나 폴리펩티드는 WO 97/22706에서 설명된 대로 N-터미널이 확대된 퓨전단백질로서 발현되고 분비될 것이다. 그리고 나서 N-터미널확대는 당업계 있어서 잘 알려진 대로 화학적 또는 효소적 분열에 의해 시험관내에서 재생된 단백질로부터 결실될 것이다. 효소의 이용에 의한 분열을 실시하는 것이 선호된다.그런 효소의 예는 트립신이나 아크로모박터 리티커스 프로테아제Ⅰ(Achromobacter lyticus protease Ⅰ) 이다.
본 발명은 청구된 발명의 범위를 한정하려고 의도된 방법이 아닌 다음의 실험 예에서 보다 상세히 설명된다.
(실시예1)
인슐린 전구체(N-터미널이 확대된 B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) 인슐린 전구체, WO 97/22076에 보임)의 발현을 위해 만들어진 이스트플라스미드pAK 729는 두 개의 ApaLI효소제한부위ApaLI(4477)와 ApaLI(5273)을 포함한다(도 1). 제한 부위는 AMP마커 유전자의 각 측면에서 자리잡는다. pAK729내에서 두개의 ApaLI 부위간에서 1246뉴클레오티드의 제거는 AMP마커 유전자와 플라스미드DNA가 유도된 약간의 부가적인 대장균을 제거할 것이다.
pAK 729플라스미드는 ApaLI 제한효소로 이해되고, 아가로스 전기영동에 위임되고, 분리되고, 재결찰되고, 이어서 형질전환된 이스트균주 NN729.1-△AMP를 제공하기 위해 우수한 S.세레비애 세포( MT663, EP BO 163529에서 보임 )내로 형질전환되었다. 변이된 발현 플라스미드는 이스트균주NN729.1-△AMP 로 부터 재결찰되고 DNA서열은 결실을 특징으로 하는 DNA범위의 서브클로닝에 의해서 수행되는 PCR세대 후에 확인되었다. 마찬가지로, 인슐린 전구체를 암호화하는 DNA서열은 이스트균주 NN729.1-△AMP 로 부터 재결찰된 플라스미드 DNA에서 확인되었다.
이스트균주 NN729.1-△AMP는 72시간동안 30℃ 에서 YPD배지 내에서 배양되었다. 인슐린 전구체의 발효수율은 RP-HPLC에 의해 결정되었다.
(실시예2)
효소제한부위 Xhol(5676) 과 Xhol(5720)은 PCR에 의한 pAK 729플라스미드로 도입되었다.pAK 729.5플라스미드에 귀착하는 선택된 DNA서열은 순차적으로 확인되었다.pAK 729.5의 제한효소 플라스미드지도는 도 2에서 보여진다. 제한효소 부위 Xhol(5676) 과 Xhol(5720)간의 DNA 단편은 AMP유전자 내부에 국한된 44뉴클레오티드를 결실하는 pAK 729.5 플라스미드로부터 결실될 수 있다.
플라스미드pAK 729.5는 Xhol제한효소로 이해되고 ,아가로스 전기영동에 위임되고 ,분리되고 ,재결찰되고 이어서 이스트 형질전환체 NN729.5-△AMP를 제공하는 우수한 MT663 S.세레비애 세포 내로 형질전환되었다. 변이된 발현 플라스미드는 이스트균주 NN729.5-△AMP 로 부터 재결찰되고 그리고 DNA서열은 결실을 특징으로 하는 DNA범위의 서브클로닝에 의해서 수행되는 PCR세대 후에 확인되었다. 마찬가지로 인슐린 전구체를 암호화하는 DNA서열은 이스트균주 NN729.5-△AMP 로 부터 재결찰된 플라스미드 DNA에서 확인되었다. pAK 729.5-△AMP 내에서 44뉴클레오티드 결실은 β-lactamase 활성 파괴에 관한AMP유전자의 완전한 결실만큼 유효한 것으로 판명되었다.
이스트균주 NN729.5-△AMP는 72시간동안 30℃ 에서 YPD 배지내에서 배양되었다. 인슐린 전구체의 발효수율은 RP-HPLC에 의해 결정되었다.
(실시예3)
효소제한 부위 Aatll(4982)은 PCR에 의한 pAK 729플라스미드 내로 도입되었다. pAK 729.6플라스미드에 귀착하는 선택된 DNA서열은 순차적으로 확인되었다. pAK 729.6의 제한효소 플라스미드지도는 도 3에서 보여진다. 제한효소부위 Aatll(4982)과 Aatll(5978)간의 DNA단편은 플라스미드로 부터 996뉴클레오티드를 제거하면서 결실될 수 있다. 이것은 AMP유전자와 프로모터의 모두를 제거할 수 있다.
pAK 729.6 플라스미드는 DNA 제한효소 Aatll로 이해되고 ,아가로스 전기영동에 위임되고 ,분리되고, 재결찰되고 이어서 이스트 형질전환체 NN729.5-△AMP를 제공하는 우수한 MT663 S.세레비애 세포 내로 형질전환되었다. 변이된 발현플라스미드는 이스트균주 NN729.6-△AMP 로 부터 재결찰되고 그리고 DNA서열은 결실을 특징으로 하는 DNA범위의 서브클로닝에 의해서 수행되는 PCR세대 후에 확인되었다. 마찬가지로 인슐린 전구체를 암호화하는 DNA서열은 이스트균주 NN729.6-△AMP로부터 재결찰된 플라스미드 DNA에서 확인되었다. AMP유전자를 결여하는 플라스미드 pAK 729.6-△AMP는 도 4에서 보여진다.
이스트균주 NN729.6-△AMP는 72시간동안 30℃ 에서 YPD배지 내에서 배양되었다. 인슐린 전구체의 발효수율은 RP-HPLC에 의해 결정되었다.
(실시예4)
pAK 729.7플라스미드 내에서 새로운 효소제한효소 부위Aatll(3801)은 PCR에 의해 원형 pAK 729 내로 도입되었다. pAK 729.7플라스미드의 선택된 DNA서열은 순차적으로 확인되었다. pAK 729.7내에서 제한효소부위 Aatll(3801) 과 Aatll(5978) 간의 DNA단편은 발현플라스미드로부터 2177뉴클레오티드를 제거하면서 결실될 수있다. pAK 729.7플라스미드는 디자인되고 따라서 AMP유전자와 복제의 대장균원형 둘다 결실될 수 있다. pAK 729.7의 제한플라스미드지도는 도 5에서 보여진다.
pAK729.7 플라스미드는 DNA 제한효소위 Aatll로 이해되고 아가로스 전기영동에 위임되고, 분리되고, 재결찰되고 이어서 우수한 MT663 S. 시레비시애 세포내로 형질전환되었다. 변이된 발현 플라스미드는 이스트 균주 NN729.7-△AMP로 부터 재분리되고 DNA서열은 결실을 특징으로 하는 DNA부위의 서브클로닝에 의해 수행되는 PCR세대 후에 확인되었다. 또한 인슐린 전구체를 암호화하는 DNA 서열은 이스트균주 NN729.7-△AMP로 부터 재분리된 플라스미드에서 확인되었다. 이스트균주 NN729.7-△AMP은 72시간동안 30℃에서 YPD 배지 내에서 배양되었다. 이슐린 전구체의 발효수율은 RP-HPLC에 의해 결정되었다.
| 균주 | 플라스미드 | 변이 | 결실된 뉴클레오티드 |
| NN729.1-△AMP | pAK729.1-△AMP | ApaLI(4477)와 ApaLI(5723)사이의 서열의 결실 | 1246 |
| NN729.5-△AMP | pAK729.5-△AMP | XhoIa(5676)와 XhoI(5720)사이의 서열의 결실 | 44 |
| NN729.6-△AMP | pAK729.6-△AMP | Aatll(5978)와 Aatll(4982)사이의 서열의 결실 | 996 |
| NN729.7-△AMP | pAK729.7-△AMP | Aatll(5978)와 Aatll(3801)사이의 서열의 결실 | 2177 |
인슐린 전구체의 발효수율에 관해서는 새로운 NN729-△AMP 는 원형의 NN729 균주와 비교되었다.(표 2)
| 균주 | 인슐린 전구체의 수율 |
| NN729 | 100% |
| NN729.1 | 122% |
| NN729.5 | 110% |
| NN729.6 | 112% |
| NN729.7 | 107% |
상기에서 부분적으로 또는 완전히 결실된 AMP 마커 유전자로 발현플라스미드를 포함하는 이스트 균주는 AMP유전자를 함유하는 발현 플라스미드를 포함하는 이스트 균주에 비교되는 인슐린 전구체의 10내지 20% 더많이 발현한다는 것을 나타난다.
(실시예5)
비기능성 또는 결실된 AMP 내성 유전자를 가진 플라스미드를 사용하는 이스트내에서 Arg
34
GLP-1
(7-37)
발현
도 1 내지 도 5에서 도해된 LA19X5 M13D을 암호화하는 pAK 729구조의 EcoRI (940)- Xbal(1403)서열은 본 실시예를 위해 서열을 코딩하는 MFalpha*-Arg34GLP-1(7-37)로 대체되었다(도 6). DNA 서열 내에 Ncol분열을 도입하면서 82위치에서의 Leu 와 83위치에서의 Assp가 각각 Met 와 Ala 로 치환된 MFα1 프리프로리더 펩티드(Kurijan & Herskowitz,Cell 30, 1982. pp.933.)의 변이는 이 구조 내에 적용되었다. 리더 서열은 MFα1*(Kjeldsen T. et. al. 1996) 을 지정한다. MF α 1시그널 MFα1*리더 펩티드 서열은 Arg34GLP-1(7-37)을 위해 암호화 서열로 부터 리더를 분리시키는 2염기성의 Kex2P 인지모티브(Lys-Arg)를 포함한다. 펩티드 Arg34GLP-1(7-37)는 위치34에서의 천연아미노산 잔재물이 Arg잔재물로 치환된 점에 있어서 인간GLP-1(7-37)변체(S. Mojsov, et al.,J Biol. Chem.261,1986, pp. 11880-11889)이다.
세 Arg34GLP-1(7-37)발현 플라스미드는 NN729.1(실시예1),NN729.5 (실시예2), NN729.6 (실시예3)을 위해 기술된 대로 AMP 내성 유전자 분열으로써 건축되었다. 이어서 각각 이스트 형질전환체 YES2076, YES2079, YES2085를 주는 우수한 ME 1719(WO98/01535 에서 봄)S. 세레비시애 세포 내로 형질전환된다.
Arg34GLP-1(7-37)을 발현시키기 위해 사용되었던 숙주 균주는 배수체 균주이다. 그리고 상세히 말해서 하나는 단일 또는 2염기성의 아미노산 잔재물( Egel-Mitani, et al., YEAST 6: 127-137, 1990 )의 C 터미날 사이드를 쪼개는 이스트 아스파틸 프로테아제3(YAP3)이고, 다른 하나는 프로테아제B, 카르복시펩티다제Y, 아미노펩티다제I, RNase, 알칼리 인산화효소, 산 트레할라제, 엑소폴리 포스파타제 와 같은 다른 프로테아제의 활성화를 초래하는 액포의 프로테아제 A 인 두개의 아스파라틸 프로테아제가 부족한 표현형을 가진다. 게다가 트리오제 인산염 이소머라제 유전자 (TPI) 는 표현형이 배지를 포함하는 글루코스에서 자란 형질전환체에서글루코스를 이용하는것을 가능하게 하는 것을 분쇄시켜 왔다. ME1719의 유전학상의 배경은 MATa/a Dyap3::ura3/Dyap3::URA3 pep4-3/pep4-3 tpi::LEU2/Dtpi::LEU2 leu2/leu2 Dura3/ dura3 이다.
변이된 발현된 플라스미드 pKV301,pKV307, pKV304 는 이스트균주로 부터 재분리되었다. 그리고 DNA 서열은 결실를 특징으로 하는 DNA 부위의 반복제에 의해서 뒤따르는 PCR세대 후에 확인되었다. 마찬가지로 Arg34GLP-1(7-37)을 암호화하는 DNA서열은 이스트균주로 부터 재분리된 플라스미드 DNA에서 확인되었다. 표3은 변이된균주와 변이되지 않은 균주간의 대조를 나타낸다.
| 균주 | 플라스미드 | 변이 | 결실된뉴클레오티드 | Arg34GLP-1(7-37)의 수율의 비교 |
| YES1757 | pKV228 | 없슴 | 0 | 100% |
| YES2076 | pKV301 | ApaLI(4456)와 ApaLI(5702)사이의 서열의 결실 | 1246 | 119% |
| YES2079 | pKV307 | XhoI(5655)와 XhoI(5655)사이의 서열의 결실 | 44 | 113% |
| YES2085 | pKV304 | Aatll(5957)와 Aatll(4961)사이의 서열의 결실 | 996 | 136% |
수율은 30℃에서 72시간동안 YPD내에 5㎖연구실 규모 발효로 부터 비교되었다. 수율은 HPLC를 사용하면서 평가되었다.
Claims (8)
- 이종성 유전자를 코딩하는 유전자와 시험관내 변이에 의해 비기능성으로 만들어진 항생 물질 내성 마커 유전자를 포함하는 박테리아 세포에 항생물질 내성을 부여할 수 없는 재조합 이스트 발현 벡터.
- 제 1 항에 있어서, 항생물질 마커 유전자가 AMP 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 이스트 발현 벡터.
- 적당한 조건하 에서 제1항 또는 제2항에 따르는 벡터를 포함하는 이스트 균주를 배양하고, 배지로부터 원하는 생성물을 분리하는 것을 포함하는 원하는 단백질 또 는 폴리펩티드의 제조 방법
- 박테리아 내에서 초기의 클로닝 단계에 사용된 기능성의 항생물질 마커 유전자 가 이스트 숙주 내로 삽입하기 전에 마커 유전자의 일부 또는 전부를 시험관 내에서 결실함으로써 플라스미드 내에서 비기능성으로 만들어진 이스트 발현 플라스미드를 함유하는 이스트 균주를 적당한 조건하에서 배양하는것을 포함하는 원하는 폴리펩티드 또는 단백질의 제조 방법.
- 제 4 항에 있어서, 항생물질 내성 마커 유전자 주위에 적절한 제한 부위를삽입하는 것과 적절한 제한효소와의 시험관내에서 처치로써 마커 유전자를 결실하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 이스트 균주가 사카로마이시스균주, 바람직하게는 사카로마이시스 세레비시애 균주인 것을 특징으로 하는 방법
- 제 1 항 또는 제 2 항에 따르는 벡터를 포함하는 형질전환된 이스트 세포.
- 제 7 항에 있어서, 사카로마이시스 균주, 바람직하게는 사카로마이시스 세레비시애 균주인 것을 특징으로 하는 형질전환된 이스트세포.
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