PL201350B1 - Sposób wytwarzania pożądanego polipeptydu lub białka w drożdżach - Google Patents
Sposób wytwarzania pożądanego polipeptydu lub białka w drożdżachInfo
- Publication number
- PL201350B1 PL201350B1 PL345584A PL34558499A PL201350B1 PL 201350 B1 PL201350 B1 PL 201350B1 PL 345584 A PL345584 A PL 345584A PL 34558499 A PL34558499 A PL 34558499A PL 201350 B1 PL201350 B1 PL 201350B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- yeast
- plasmid
- gene
- dna
- mcragrżwgoż
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 87
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 title description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 71
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 66
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 31
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract description 22
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 21
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 21
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 abstract description 14
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 65
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 26
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 26
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 26
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 24
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 20
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 101150107168 AMP gene Proteins 0.000 description 13
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 11
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 10
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 8
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 6
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101800004266 Glucagon-like peptide 1(7-37) Proteins 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 2
- 101800000221 Glucagon-like peptide 2 Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N glucagon-like peptide 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical group OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- 241000590035 Achromobacter lyticus Species 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 102100040356 Angio-associated migratory cell protein Human genes 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101710113783 Candidapepsin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 1
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N GDP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000178290 Geotrichum fermentans Species 0.000 description 1
- 241000603729 Geotrichum sp. Species 0.000 description 1
- 101800001226 Glicentin-related polypeptide Proteins 0.000 description 1
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 101000964180 Homo sapiens Angio-associated migratory cell protein Proteins 0.000 description 1
- 101500028773 Homo sapiens Glucagon-like peptide 1(7-37) Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 241000235087 Lachancea kluyveri Species 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000235042 Millerozyma farinosa Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000235061 Pichia sp. Species 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 101710180012 Protease 7 Proteins 0.000 description 1
- 101710127332 Protease I Proteins 0.000 description 1
- -1 RZase Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000582914 Saccharomyces uvarum Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 101000733770 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) Aminopeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 101150046681 atp5if1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 108091023030 exopolyphosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 108020003272 trehalose-phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania pozadanego poli- peptydu lub bia lka w dro zd zach, znamienny tym, ze prowadzi si e hodowl e w odpowiednich warunkach szczepu dro zd zy zawieraj acego dro z- d zowy plazmid ekspresyjny, w którym to plazmi- dzie funkcjonalny antybiotykowy gen markero- wy stosowany do wst epnych etapów klonowa- nia w bakterii zosta l wykonany jako niefunkcjo- nalny poprzez delecj e in vitro cz esci genu mar- kerowego lub ca lego genu markerowego przed insercj a do gospodarza dro zd zowego. PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201350 B1 (21) Numer zgłoszenia: 345584 (13) (22) Data zgłoszenia: 02.07.1999 (51) lntCL
C12N 15/81 (2006.01) (86) Date i numer z^oszema międzynarodowego: C12P21/00 (0(°)6.01)
02.07.1999, PCT/DK99/00380 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
27.01.2000, WO00/04172 PCT Gazette nr 04/00 (54) Sposób wytwarannia pożądanego polipeptydu lub białaa w drożdżach
| (30) Pierwszeństwo: 16.07.1998,DK,PA199800945 | (73) Uprawniony z patentu: |
| NOVO NORDISK A/S,Bagsvaerż,DK | |
| 28.05.1999,DK,PA199900754 | (72) Twórca(y) wynalazku: |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: 17.12.2001 BUP 26/01 | Thomas Kjelżsen,Virum,DK Knuż Vaż,Vanloese,DK |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.04.2009 WUP 04/09 | (74) Pełnomocnik: Bartnik Urszula, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. |
(57) 1. Sposób wytwarzania pożądanego polipeptydu lub białka w drożdżach, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę w odpowiednich warunkach szczepu drożdży zawierającego drożdżowy plazmid ekspresyjny, w którym to plazmidzie funkcjonalny antybiotykowy gen markerowy stosowany do wstępnych etapów klonowania w bakterii został wykonany jako niefunkcjonalny poprzez delecję in vitro części genu markerowego lub całego genu markerowego przed insercją do gospodarza drożdżowego.
PL 201 350 B1
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania pożądanego polipeptydu lub białka w drożdżach. Wynalazek oparty jest na ekspresji białek w transformowanych komórkach drożdży przy pomocy konstruktu DNA i wektorów stosowanych w tym procesie, oraz transformowanych tymi wektorami, komórek drożdży.
Dobrze znane jest zastosowanie transformowanych szczepów drożdży dla ekspresji białek, patrz na przykład Europejskie Zgłoszenia Patentowe o numerach: 0088632A, 0116201A, 0123294A, 0123544A, 0163529A, 0100561A, 0189998A i 0195986A, zgłoszenie patentowe PCT o numerach WO 95/01421,95/02059 i WO 90/10075 i Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4,546,082.
Wspólną cechą powyższych metod jest to, że plazmidy wytwarzane z drożdży zawierają gen dla markera antybiotykowego. Taki marker genowy pochodzi z początkowych etapów klonowania w E. coli, gdzie był on stosowany do przesiewowego poszukiwania transformowanych komórek lub do podtrzymywania plazmidów stosowanych w wektorach. Genowe markery antybiotykowe nie są uważane za posiadające negatywny wpływ na hodowanie transformowanej komórki drożdżowej i dlatego powszechną praktyką było nie podejmowanie jakichkolwiek kroków w celu delecji takiego DNA. Ponadto charakterystyka konstruktu plazmidu jest zwykle wykonywana przez izolowanie plazmidów z transformowanych komórek drożdżowych i transformowania izolowanych plazmidów do E. coli, a następnie selekcję antybiotykową. Jest zatem wygodne dla celów praktycznych pozostawić gen markerowy oporności antybiotykowej.
Jakkolwiek, zarówno laboratoria badawcze jak i przemysłowa produkcja roślin są kontrolowane przez ostre regulaminy bezpieczeństwa wciąż istnieje niewielkie ryzyko, że kilka komórek przypadkowo przedostanie się do środowiska. Z powodu ich skomplikowanej natury taki genetycznie wytworzony mikroorganizm będzie przeżywał tylko przez bardzo krótki okres czasu i ryzyko uszkodzenia środowiska jest niezwykle małe. Jest to oczywiście przyczyną dlaczego tak stransformowane mikrooorganizmy zostały dopuszczone do użycia zarówno w badaniach jak i w operacjach na dużą skalę.
Nawet jeżeli komórki te szybko umierają, to plazmidy zawierające gen oporności na antybiotyki wciąż może przypadkowo dostać się do środowiska i istnieje teoretyczne ryzyko wprowadzenia oporności na antybiotyki do bakterii jeżeli plazmid będzie pobrany spontanicznie.
Antybiotyki są bardzo ważne dla leczenia ludzkich i zwierzęcych zakażeń bakteryjnych. Każde ryzyko potencjalnego zanieczyszczenia środowiska genem może dostarczyć oporności na antybiotyki i powinno być minimalizowane, jeżeli jest to możliwe.
Istnieje zatem potrzeba rozwinięcia bardziej bezpiecznych sposobów niżeli dotychczas stosowane i przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie takich ulepszonych sposobów.
Niniejszy wynalazek dotyczy zatem sposobu wytwarzania pożądanego polipeptydu lub białka w drożdżach, polegającego na tym, że prowadzi się hodowlę w odpowiednich warunkach szczepu drożdży, który zawiera drożdżowy plazmid ekspresyjny i w którym to plazmidzie funkcjonalny antybiotykowy gen markerowy stosowany do wstępnych etapów klonowania w bakterii został wykonany jako niefunkcjonalny poprzez delecję in vitro części genu markerowego lub całego genu markerowego przed insercją do gospodarza drożdżowego.
Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje insercję odpowiedniego miejsca restrykcyjnego dookoła markerowego genu oporności antybiotykowej i delecję genu markerowego przez traktowanie in vitro odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi.
Także korzystnie w sposobie według wynalazku jako szczep drożdży stosuje się szczep Saccharomyces, ewentualnie Saccharomyces cerevisiae.
Niniejszy wynalazek należy do dziedziny ekspresji białek heterologicznych lub polipeptydów w drożdżach. Stosowany w sposobie według wynalazku, transformowany szczep drożdżowy zawiera wektor ekspresji, w którym genowy marker antybiotykowy stosowany do początkowych etapów klonowania wytworzony był jako niefunkcjonalny poprzez modyfikację in vitro przed transformacją gospodarza drożdżowego.
W sposobie według wynalazku stosowany jest rekombinowany wektor drożdżowy, który jest nie zdolny do nadawania bakteriom oporności na antybiotyki i który zawiera gen kodujący dla genu heterologicznego i markerowego genu oporności antybiotykowej, utworzonego jako niefunkcjonalny na drodze modyfikacji in vitro.
Delecja markerowego genu antybiotykowego jest korzystnie wykonana przez insercję odpowiedniego restrykcyjnego miejsca rozszczepienia, w każdym miejscu markerowego genu oporności
PL 201 350 B1 antybiotykowej, po czym wykonuje się wycięcie (delecję) genu markerowego przez traktowanie in vitro odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi.
Tak jak użyto w niniejszym opisie, określenie - „markerowy gen antybiotykowy” lub „markerowy gen oporności antybiotykowej” oznacza gen który pozwala na fenotypową selekcję transformowanych komórek bakteryjnych i amplifikację plazmidu.
Najpowszechniej stosowanymi markerowymi genami oporności antybiotykowej w E. coli są geny markerowe takie jak: ampicilinowy (AMP), chloramfenikolowy, neomycynowy, kanamycynowy i tetracyklinowy.
Tak jak użyto w niniejszym opisie określenie - „niefunkcjonalny gen markerowy” oznacza, że ten gen markerowy został albo wycięty lub utworzony jako nie funkcjonalny na drodze wycięcia części tego genu. Korzystnie jest aby gen był wycięty w całości.
Tak jak użyto w niniejszym opisie określenie - „modyfikacja in vitro oznacza etapy modyfikacji przeprowadzone na wektorze poza środowiskiem komórki.
Tak jak użyto w niniejszym opisie, określenie - „nie zdolny do nadawania oporności na antybiotyki komórkom bakteryjnym”, oznacza, że geny oporności na antybiotyki są niefunkcjonalne w każdym organiźmie powstałym na skutek opisanej manipulacji genowej.
Tak jak użyto w niniejszym opisie, określenie - „gospodarz drożdżowy” oznacza organizm drożdżowy transformowany lub transfekowany plazmidem ekspresyjnym lub wektorem.
Krótki opis rysunków
Niniejszy wynalazek został dalej zilustrowany w odniesieniu do załączonych rysunków.
Figura 1 przedstawia plazmid ekspresji pAK729, który zawiera gen z ekspresją prekursora isuliny pod kontrolą ekspresji sekwencji promotora TPI i terminatora TPI z S. cerevisiae oraz sekwencję sygnałową lidera, składającą się z peptydu sygnałowego YAP3 i syntetycznego peptydu liderowego LA19. Konstrukcja pAK729 jest opisana w WO 97/22706. Plazmid zawiera także sekwencję AMP-R z pBR322/pUC13 obejmującą gen oporności na ampicylinę i miejsce ori replikacji DNA w E. coli.
Figura 2 przedstawia plazmidową mapę plazmidu pAK729.5 stosowanego do wytwarzania szczepu NN729.5 (z brakiem genu AMP) przed wycięciem genu Amp.
Figura 3 przedstawia plazmidową mapę plazmidu pAK729.6 do wytwarzania szczepu NN729.6 (z brakiem genu APM) przed wycięciem genu Amp.
Figura 4 przedstawia plazmidową mapę plazmidu pAK729.6-Aamp w którym gen został wycięty.
Figura 5 przedstawia plazmidową mapę plazmidu pAK729.7 do wytwarzania szczepu NN729.7 (z brakiem genu AMP) przed wycięciem genu Amp; i
Figura 6 przedstawia plazmidową mapę plazmidu pKV228 zmodyfikowanego przez zastąpienie sekwencji kodującej EcoRI (940) - Xbal (1403) w pAK729 (Fig. 1) przez sekwencję kodującą MFalfa*-Arg34GLP-1(7-37).
Delecję in vitro markerowego genu oporności antybiotykowej wykonuje się albo przez zastosowanie dostępnych miejsc restrykcyjnych lub przez wprowadzenie odpowiednich miejsc restrykcyjnych za pomocą PCR, mutagenezę specyficzną co do miejsca lub innymi dobrze znanymi technikami manipulacji sekwencji DNA, a następnie przez traktowanie odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi.
Skonstruowano cztery szczepy NN729 w celu oceny, czy różne delecje w plazmidzie mogłyby wpływać na wydajność fermentacji prekursora insulinowego lub stabilność szczepu podczas przedłużonej fermentacji (Tabela I). Szczepy były porównywane z oryginalnym szczepem NN729 w odniesieniu do wydajności fermentacji i stabilności fermentacji (Tabela II). Ponadto, w celu oceny, czy różne delecje w plazmidzie pKV228 zawierającym gen AMP mogą zmieniać wydajność fermentacyjną Arg34GLP-1(7-37), skonstruowano trzy zmodyfikowane szczepy drożdżowe, produkujące GLP-1 wariant Arg34GLP-1(7-37) (Tabela III).
Plazmidy i szczepy, w których gen AMP i jeśli to możliwe, sekwencję otaczające zostały wycięte, wszystkie oznaczono jako „AAMP”.
Zmodyfikowane szczepy drożdżowe były przygotowywane przez transformowanie zmodyfikowanymi plazmidami pAK729 lub pK228 w których markerowy gen Amp i ewentualnie inne sekwencje DNA z plazmidu oryginalnego były wycięte, do szczepu S. cerevisiae - MT663 (E2 XE11-36 a/α, AtpiAtpi,pep 4-3/pep 4-3) lub ME1719 (MATa/aAyap3::ura3/Ayap3::URA3pep4-3/pep4-3Atpi::LEU2/Atpi::LEU2 eu2/leu2 Aura3/Aura3).
Zmodyfikowane plazmidy przygotowane były przez zastosowanie odpowiednich miejsc dla enzymów restrykcyjnych już obecnych w plazmidzie lub przez insercję odpowiednich miejsc dla enzymów restrykcyjnych w taki sposób, że gen AMP może być wycięty. Zmodyfikowane plazmidy mogą
PL 201 350 B1 być manipulowane in vitro przed transformacją do S. cerevisiae (szczep MT663) w taki sposób, że gen
APM jest wycinany lub otrzymywany jako niefunkcjonalny, i otrzymywany w wyniku szczep drożdżowy nie posiada genu AMP. W ten sposób zatem, potencjalne ryzyko dla zanieczyszczenia środowiska przez gen APM podczas usuwania komórek drożdżowych jest eliminowane.
Zmodyfikowane plazmidy pAK729 lub pKV228 były trawione za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych, poddawane elektroforezie na agarozie, izolowane, ponownie ligowane i następnie transformowane do kompetentnych komórek S. cerevisiae odpowiednio - MT663 i ME1719 (WO98/015335).
Białko lub polipeptyd wytwarzany sposobem według wynalazku może być białkiem heterologicznym lub polipeptydem, który może być korzystnie wytwarzany w komórkach drożdży. Przykładami takich białek są aprotynina, tkankowy czynnik inhibitorowy lub inne inhibitory proteazowe, insulina, prekursor insuliny lub analog insulinowy, czynnik wzrostowy I i II, hormon wzrostowy ludzki i bydlęcy, interleukina, tkankowy aktywator plazminogenu, transformujący czynnik wzrostu a i b, glukagon, glukagono-podobny peptyd 1 (GLP-1), glukagono-podobny peptyd 2 (GLP-2), GRPP, Czynnik VII, Czynnik VIII, Czynnik XIII, czynnik wzrostowy pochodzący z płytek, oraz enzymy takie jak lipazy.
Przez „prekursor insuliny” lub „prekursor analogu insuliny” rozumie się polipeptyd pojedyńczo-łańcuchowy, obejmujący insulinę, który poprzez jeden lub więcej następujących po sobie chemicznych i/lub enzymatycznych procesów może być przetwarzany w insulinę dwułańcuchową lub cząsteczkę analogu insuliny posiadającego takie jak stwierdzone w naturalnej insulinie, prawidłowe rozmieszczenie trzech mostków dwusiarczkowych. Prekursor insuliny będzie zawierał typowo zmodyfikowany C-peptyd mostkujący łańcuch A i B insuliny. Ponadto, korzystnym prekursorem insuliny są te opisane na przykład w zgłoszeniu EP 163529 i PCT numery 95/00500 i 95/07931. Przykładami analogów insuliny są takie w których, jedna lub więcej naturalnych reszt aminokwasowych, korzystnie jedna, dwie lub trzy, zostały podstawione przez inne kodowalne reszty aminokwasowe. Dlatego zatem, w pozycji A21 rodzicielskiej insuliny zamiast Asn może być reszta aminokwasowa wybrana z grupy zawierającej Ala, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr lub Val, zwłaszcza reszta aminokwasowa wybrana z grupy zawierającej Gly, Ala, Ser i Thr. Podobnie, w pozycji B28 rodzicielska insulina może zamiast Pro posiadać resztę aminokwasową wybraną z grupy zawierającej Asp, Lys i tym podobne, i w pozycji B29 rodzicielska insulina może zamiast Lys posiadać aminokwas Pro.
Wyrażenie „kodowalna reszta aminokwasowa” jak tutaj stosuje się oznacza resztę aminokwasową, która może być kodowana przez kod genetyczny, to znaczy trójkę („kodon”) nukleotydowy.
Stosowane konstrukty DNA mogą być wytwarzane syntetycznie przez zastosowanie metod standardowych np., metody fosfoamidytowej opisanej przez S. L. Beaucage i M.H. Caruthers'a, Tetrahedron Letters 22, 1981, strony 1859-1869, lub metodą opisaną przez Matthes i wsp., EMBO Journal 3, 1984, strony 801-805. Zgodnie z metodą fosfoamidytową, oligonukleotydy są syntetyzowane, np., w automatycznym syntetyzatorze DNA, oczyszczane, podwajane i ligowane tworząc konstrukt syntetycznego DNA. Obecnie preferowaną drogą przygotowywania konstruktu DNA jest poprzez reakcję polimerazową (PCR), np., jak opisano w Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
DNA kodujące pożądane białko może być także genomowym lub cDNA ori, otrzymywanym na przykład przez preparowanie biblioteki genomowej lub cDNA i przeszukiwanie na sekwencję DNA kodującą dla wszystkich lub części polipeptydu lub przez hybrydyzację stosując syntetyczne sondy oligonukleotydowe zgodnie z standardowymi technikami (cf. Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989).
Ostatecznie, DNA kodujący pożądane białko może być pochodzenia mieszanego - syntetycznego i genomowego, syntetycznego i cDNA lub genomowego i cDNA preparowanych przez topienie fragmentów syntetycznego, genomowego lub cDNA (tak jak odpowiada), fragmentów odpowiadających różnym częściom całkowitego konstruktu DNA, zgodnie z standardowymi technikami.
Rekombinowany wektor ekspresji może być autonomicznie replikującym wektorem, to znaczy wektorem, który istnieje jako jednostka pozachromosomalna, replikacja która jest niezależna od replikacji chromosomalnej, na przykład, plazmid, element pozachromosomalny, minichromosom, lub chromosom sztuczny. Wektor może zawierać jakikolwiek środek do zapewnienia samoreplikacji. Alternatywnie, wektor może być takim, który jeśli wprowadzony zostanie do komórki gospodarza, jest integrowany do genomu i replikowany razem z chromosomem(ami) do których został wintegrowany. Układ wektora może być pojedynczym wektorem lub plazmidem lub dwoma lub większą ilością wektorów lub plazmidów, które
PL 201 350 B1 razem zawierają całkowite DNA, które ma być wprowadzone do genomu komórki gospodarza, lub transpozonem.
Rekombinowany wektor ekspresji może zawierać sekwencję kodującą pożądane białko lub polipeptyd połączony z odpowiednią sekwencją promotora. Promotor może być każdą sekwencją DNA, która wykazuje aktywność transkrypcyjną w drożdżach i może pochodzić od genów kodujących białka albo homologiczne albo heterologiczne dla drożdży. Korzystnie promotor pochodzi z genu kodującego białko homologiczne dla drożdży. Przykładami odpowiednich promotorów są promotory Saccharomyces cerevisiae Ma1, TPI, lub PGK.
Sekwencja DNA kodująca pożądane białko lub polipeptyd może być także operacyjnie połączona z odpowiednim terminatorem, na przekład terminatorem TPI (cf. T. Alber and G.Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, strony 419-434).
Rekombinowany wektor ekspresji według wynalazku zawiera sekwencję DNA umożliwiającą wektorowi replikację w drożdżach. Przykładami takich sekwencji są drożdżowy plazmid 2μ replikacyjnych genów REP i-3 i miejsce ori replikacji. Wektor może także zawierać nadający się do wybrania marker, na przykład gen TPI Schizosaccharomyces pompe, jak opisano przez P.R. Russell, Gene 40, i985, strony i25-130.
Na koniec, wektor ekspresji korzystnie zawiera sekwencję segnałowo/liderową dla zapewnienia sekrecji do pożywki hodowlanej pożądanego białka lub polipeptydu. Sekwencja sygnałowa jest sekwencją DNA, która koduje polipeptyd („polipeptyd sekrecyjny”), który jako składnik większego polipeptydu kieruje ten większy polipeptyd na drogę wydzielniczą w komórce w której jest syntetyzowany. Ten większy polipeptyd jest zwykle rozszczepiany w celu usunięcia peptydu wydzielniczego podczas przechodzenia przez drogę wydzielniczą.
Wydzielnicza sekwencja sygnałowa może kodować każdy peptyd sygnałowy, który zapewnia skuteczne ukierunkowanie podlegającego ekspresji polipeptydu na drogę wydzielniczą komórki. Peptyd sygnałowy może być naturalnie występującym peptydem sygnałowym, lub jego częścią funkcjonalną lub może być peptydem syntetycznym. Użyteczne peptydy sygnałowe dla komórek gospodarza drożdżowego są otrzymywane z genów czynnika a Saccharomyces cerevisiae i inwertazy Saccharomyces cerevisiae, peptydu sygnałowego amylazy śliny mysiej (patrz, O. Hagenbuchle i wsp., Nature 289, i98i, strony 643-646), peptydu sygnałowego modyfikowanej karboksypeptydazy (patrz, Valls i wsp., Cell 48, i987, strony 887-897), drożdżowego peptydu sygnałowego BARi (patrz, WO 87/02670) lub peptydu sygnałowego drożdżowej proteazy asparaginianowej 3 (YAP3) (patrz, M. Egel-Mitani i wsp., Yeast 6, i990, strony i27-137).
W celu skutecznego wydzielania w drożdżach kodująca sekwencja peptydu liderowego może być wprowadzona przez insercję poniżej sekwencji sygnałowej i powyżej sekwencji DNA kodującej ten polipeptyd. Działanie peptydu liderowego pozwala na ekspresję polipeptydu tak aby był on kierowany z siateczki śródplazmatycznej do aparatu Golgiego i następnie do pęcherzyków wydzielniczych w celu wydzielenia do pożywki hodowlanej (to znaczy przeniesienia tego polipeptydu przez ścianę komórki lub co najmniej przez błonę komórkową do przestrzeni periplazmatycznej komórki drożdżowej). Peptyd liderowy może być liderowym drożdżowym czynnikiem a (zastosowanie których jest opisane w na przykład: US 4,546,082, EP i6 201, EP i23 294, EP i23 544 i EP i63 529). Alternatywnie, peptyd liderowy może być syntetycznym peptydem liderowym, to znaczy, peptydem liderowym nie występującym w naturze. Syntetyczne peptydy liderowe mogą być konstruowane tak jak opisano w WO 92/11378 przez Kjeldsen i wsp., w „Protein Expression and Purification” 9, 33i-336 (i997).
Wyrażenie „peptyd liderowy” jest rozumiane jako wskazujące na peptyd w postaci odpowiedniej sekwencji, której funkcja pozwala na wydzielenie heterologicznych białek i ukierunkowanie ich z siateczki śródplazmatycznej do aparatu Golgiego i następnie do pęcherzyków wydzielniczych w celu wydzielenia do pożywki, (to jest, przetransportowania wyrażonego białka lub polipeptydu przez błonę komórkową i ścianę komórkową, jeżeli taka jest obecna, lub co najmniej przez błonę komórkową do przestrzeni periplazmatycznej komórki posiadającej ścianę komórkową).
Procedury zastosowane w celu ligacji sekwencji DNA kodujących pożądane białko lub polipeptyd, promotor i terminator, oraz procedura insercji do odpowiednich wektorów drożdżowych zawierających konieczne do replikacji drożdży informacje, są bardzo dobrze znane fachowcom (por. na przykład Sambrook i wsp., op.cit.). Jest zrozumiałym, że wektor może być konstruowany zarówno poprzez, najpierw przygotowanie konstruktu DNA zawierającego pełną sekwencję DNA kodującą peptyd według wynalazku, a następnie insercję tych fragmentów do odpowiedniego wektora ekspresji, lub poprzez stopniową insercję fragmentów DNA zawierających genetyczną informację dla pojedynczych elementów (takich jak białka sygnałowe, liderowe lub heterologiczne a następnie przez ich ligację.
PL 201 350 B1
Organizm drożdżowy stosowany w sposobie według wynalazku może być każdym odpowiednim organizmem drożdżowym, który hodowany, wytwarza wystarczające ilości pożądanego białka lub polipeptydu. Przykładami odpowiednich organizmów drożdżowych mogą być szczepy wybrane z gatunków, takich jak Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosacharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp., i Geotrichum fermentans, korzystnie gatunek drożdży Saccharomyces cerevisiae.
Transformacja komórek drożdży może na przykład być wykonana przez tworzenie protoplastu a następnie przez transformację w znany sposób. Pożywka stosowana do hodowli komórek może być każdą konwencjonalną pożywką odpowiednią dla wzrostu organizmów drożdży. Wydzielane białko heterologiczne, znacząca część którego będzie obecna w pożywce w prawidłowo przetworzonej postaci, może być odzyskiwana z pożywki za pomocą procedur konwencjonalnych obejmujących oddzielenie komórek drożdży od pożywki przez wirowanie lub filtrację, strącanie białkopodobnych składników supernatantu lub sączenie za pomocą soli, na przykład siarczanu amonowego, a następnie przez oczyszczanie rozmaitymi procedurami chromatograficznymi, na przykład chromatografią jonowymienną, chromatografią powinowactwa, lub podobnymi. Kiedy białko jest wydzielone do przestrzeni periplazmatycznej, komórki są rozbijane enzymatycznie lub mechanicznie.
Pożądane białko lub polipeptyd może być wyrażane i wydzielane jako białko fuzyjne przedłużone na N-końcu jak opisano w WO 97/22706. Przedłużenie na N-końcu może być następnie usuwane z odzyskanego białka in vitro poprzez - albo chemiczne albo enzymatyczne rozszczepienie, jak dobrze wiadomo że stanu techniki. Rozszczepienie, korzystnie przeprowadza się przez zastosowanie enzymu. Przykładami takich enzymów są trypsyna lub proteaza I Achromobacter lyticus.
Niniejszy wynalazek jest opisany w szczegółach w następujących przykładach wykonania wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Drożdżowy plazmid pAK729 utworzony dla ekspresji prekursora insuliny (prekursor insuliny B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) przedłużony na N-końcu, patrz WO 97/22706) zawiera dwa miejsca ApaLI dla enzymów restrykcyjnych ApaLI (4477) i ApaLI (5723) (patrz Fig. 1). Te miejsca restrykcyjne są usytuowane na każdym boku genu markerowego AMP. Usunięcie 1246 nukleotydów pomiędzy tymi dwoma miejscami ApaLI w pAK729 będzie usuwało gen markerowy AMP i pewne dodatkowe pochodzące z E. coli DNA plazmidowe.
Plazmid pAK729 był trawiony enzymem restrykcyjnym ApaLI, poddany elektroforezie na agarozie, izolowany, ligowany powtórnie i następnie transformowany do kompetentnych komórek S. cerevisiae (MT663, patrz EP B0163529) dla otrzymania transformowanego szczepu drożdży NN729.1-ΔΑΜΡ. Zmodyfikowany plazmid ekspresji był izolowany ponownie ze szczepu drożdży NN729.1-ΔΑΜΡ i sekwencje DNA były weryfikowane po generacji PCR, a następnie region DNA cechujący się delecją subklonowano. Podobnie sekwencje DNA kodujące prekursor insuliny były weryfikowane na plazmidowym DNA izolowanym powtórnie ze szczepu drożdży NN729.1-AAMP.
Szczep drożdży NN729.1-AAMP był hodowany w pożywce YPD w 30°C przez 72 godziny. Wydajność fermentacji prekursora insulinowego była oznaczana przez RP-HPLC.
P r z y k ł a d 2
Miejsca dla enzymu restrykcyjnego, XhoI (5676) i XhoI (5720) były wprowadzone do plazmidu pAK729 przez PCR. Wybrane sekwencje DNA otrzymanego plazmidu pAK729.5 były następnie weryfikowane. Restrykcyjna mapa plazmidu pAK729.5 jest pokazana na Fig. 2. Fragment DNA pomiędzy miejscami dla enzymu restrykcyjnego XhoI (5676) i XhoI (5720) mogą być wycinane z plazmidu pAK729.5 usuwając 44 nukleotydy zlokalizowane w genie AMP.
Plazmid pAK729.5 był trawiony enzymami restrykcyjnymi Xhol, poddawany elektroforezie na agarozie, izolowany, ligowany powtórnie i następnie transformowany do kompetentnych komórek MT663 S. cerevisiae otrzymując transformowane drożdże NN729.5-AAMP. Zmodyfikowany plazmid ekspresji był izolowany ponownie ze szczepu drożdży NN729.5-AAMP i sekwencje DNA były weryfikowane po generacji PCR a następnie subklonowano region DNA cechujący się delecją. Podobnie sekwencje DNA kodujące prekursor insuliny były weryfikowane na plazmidowym DNA powtórnie izolowanym że szczepu drożdży NN729.5-AAMP. 44-nukleotydowa delecja w pAK729.5-AAMP okazała się skuteczna jako całkowita delecja genu AMP w odniesieniu do zniszczenia aktywności β-laktamazy.
Szczep NN729.5-AAMP hodowany był w pożywce YPD w 30°C przez 72 godziny. Wydajność fermentacji prekursora insuliny oznaczano przez RP-HPLC.
PL 201 350 B1
P r z y k ł a d 3
Miejsce dla enzymu restrykcyjnego Aatll (4982) było wprowadzone do plazmidu pAK729 przez PCR. Wybrane sekwencje DNA otrzymanego plazmidu pAK729.6 były potem weryfikowane. Restrykcyjna mapa plazmidu pAK729.6 jest pokazana na Fig. 3. W pAK729.6 fragment DNA pomiędzy miejscami dla enzymu restrykcyjnego AatII (4982) i AatII (5978) może być wycięty, usuwając 996 nukleotydów z tego plazmidu. Usunie to wszystkie geny AMP i promotor.
Plazmid pAK729.6 był trawiony restrykcyjnym enzymem DNA - AatII, następnie poddawany elektroforezie na agarozie, izolowany, ligowany powtórnie i następnie transformowany do kompetentnych komórek MT663 S. cerevisiae. Zmodyfikowany plazmid ekspresji był izolowany powtórnie ze szczepu drożdży ΝΝ729.6-ΔΑΜΡ i sekwencję DNA po generacji PCR weryfikowano a następnie subklonowano region DNA cechujący się delecją. Podobnie, sekwencje DNA kodujące prekursor insuliny były weryfikowane na DNA plazmidowym, powtórnie izolowanym z szczepu drożdży NN729.6-AAMP. Plazmid NN729.6-AAMP, w którym brak genu AMP jest pokazany na Fig. 4.
Szczep NN729.6-AAMP hodowany był w pożywce YPD w 30°C przez 72 godziny. Wydajność fermentacji prekursora insuliny oznaczano przez RP-HPLC.
P r z y k ł a d 4
Nowe miejsce dla enzymu restrykcyjnego AatII (3801), w plazmidzie pAK729.7 było wprowadzone do plazmidu pAK729 przez PCR. Wybrane sekwencje DNA plazmidu pAK729.7 były następnie weryfikowane. W pAK729.7 fragment DNA pomiędzy miejscami dla enzymu restrykcyjnego AatII (3801) i AatII (5978) może być wycięty, usuwając 2177 nukleotydów z plazmidu ekspresji. Plazmid pAK729.7 był trawiony tak, że zarówno gen AMP jak i miejsce ori replikacji E. coli były wycięte. Restrykcyjna mapa plazmidu pAK729.7 jest pokazana na Fig. 5.
Plazmid pAK729.7 był trawiony enzymem restrykcyjnym DNA - AatII, następnie poddawany był elektroforezie na agarozie, izolowany, ligowany powtórnie i następnie transformowany do kompetentnych komórek MT663 S. cerevisiae. Zmodyfikowany plazmid ekspresji był izolowany powtórnie ze szczepu drożdży NN729.7-AAMP i po generacji PCR sekwencję DNA weryfikowano a następnie subklonowano region DNA cechujący się delecją. Podobnie, sekwencje DNA kodujące prekursor insuliny były weryfikowane na DNA plazmidowym, powtórnie izolowanym ze szczepu drożdży NN729.7-AAMP.
Szczep NN729.7-AAMP hodowany był w pożywce YPD w 30°C przez 72 godziny. Wydajność fermentacji prekursora insuliny oznaczano przez RP-HPLC.
T a b e l a I
Przegląd szczepów NN729 w oparciu o plazmidy pAK729 z niefunkcjonalnym lub wyciętym genem AMP
| Szczep | Plazmid | Modyfikacje | Wydeletowane nukleotydy |
| NN729.1-AAMP | pAK729.'l-AAMP | Delecja sekwencji pomiędzy ApaLI (4477) a ApaLI (5723) | 1246 |
| NN729.5-AAMP | pAK729.5-ÓAMP | Detecja sekwencji pomiędzy XfioIa (5676) a Χ^ (5720) | 44 |
| NN729. 6-AAMP | pAK729.6-ÓAMP | Delecja sekwencji pomiędzy AatII (5978) a Aatll (4982) | 996 |
| NN729.7-AAMP | pAK729.7-AAMP | Delecja sekwencji pomiędzy AatII (5978) a Aatll (3801) | 2177 |
Nowe szczepy NN729-AAMP były porównane z oryginalnym szczepem NN729 w odniesieniu do wydajności fermentacji prekursora insuliny (Tabela II).
T a b e l a II
Wydajność fermentacji szczepów NN729-AAMP transformowanych plazmidami z niefunkcjonalnym lub wyciętym genem AMP
| Szczep | Wydajność prekursora insuliny |
| NN729 | 100% |
| NN729.1 | 122% |
| NN729.5 | 110% |
| NN729.6 | 112% |
| NN729.7 | 107% |
PL 201 350 B1
Jak wynika z powyższego, szczepy drożdży zawierające plazmid ekspresji z częściowo lub w całości wyciętym genem markerowym AMP wykazuje 10 - 20% więcej prekursora insuliny w porównaniu do oryginalnego szczepu drożdży zawierającym plazmid ekspresji posiadający gen AMP.
P r z y k ł a d 5
Ekspresja Arg34GLP-1(7_37) w drożdżach stosując plazmidy z niefunkcjonalnym lub wyciętym genem oporności AMP
Dla niniejszego przykładu (Fig. 6) sekwencja EcoRI (940) - XbaI (1403) konstruktów pAK729 kodująca LA19X5 M13 zilustrowana na Fig. 1-5 była zastąpiona przez sekwencją kodującą MFalfa*-Arg34GLP-1(7-37). W konstrukcie tym zastosowano modyfikację pre-pro peptydu liderowego MFa1 (Kurjan & Herskowitz, Cell 30, 1982, str. 933) w którym Leu w pozycji 82 i Asp w pozycji 83 zostały podstawione odpowiednio Met i Ala, wprowadzając do sekwencji DNA miejsce rozszczepienia Ncol. Sekwencja liderowa była oznaczona MFa1* (Kjeldsen T. i wsp., 1996). Sygnał MFa1 sekwencji peptydu liderowego MFa1* obejmuje dwuzasadowy Kex2p motyw rozpoznawczy (Lys-Arg) oddzielający lidera od sekwencji kodującej i Arg34GLP-1(7_37). Peptyd Arg34GLP-1(7-37) jest wariantem ludzkiego GLP-1(7-37) (S. Mojsov, i wsp., J. Biol. Chem. 261, 1986, str. 11880-11889), w którym naturalna reszta aminokwasowa w pozycji 34 podstawiona jest resztą Arg.
Trzy plazmidy ekspresji Arg34GLP-1(7-37) były konstruowane przez rozerwanie genu oporności AMP jak opisano dla NN729.1 (Przykład I), NN729.5 (Przykład II) i NN729.6 (Przykład lll) i następnie transformowane do kompetentnych komórek S. cerevisiae, dając transformanty drożdży, odpowiednio YES2076, YES2070 i YES2085.
Szczep drożdży, który był stosowany do ekspresji Arg34GLP-1(7-37) jest diploidalnym szczepem i posiada fenotyp w którym brak jest dwóch proteaz aspartylowych, to jest (1) drożdżowej proteazy aspartylowej 3 (YAP3), która odczepia C-końcowe miejsce jedno- lub dwuzasadowych reszt aminokwasowych (Egel-Mitani, i wsp., YEAST 6: 127-137, 1990) i (2) proteazę wodniczkową A, odpowiedzialną za aktywację innych proteaz takich jak proteaza B, karboksypeptydaza Y, aminopeptydaza I, RZaza, alkaliczna fosfataza, kwasowa trehaloza i egzopolifosfataza. Ponadto, gen izomerazy triozofosforanowej (TPI) został rozbity, co sprawia, że fenotyp jest zdolny do wykorzystywania glukozy w transformantach rosnących na pożywce zawierającej glukozę. Genetycznym tłem ME1719 jest MATa/a Dyap3::ura3/Dyap3::URA3 pep4-3/pep4-3 tpi::LEU2/Dtpi::LEU2 Ieu2/leu2 Dura3/Dura3.
Zmodyfikowane plazmidy ekspresji pKV301, pKV307 i pKV304 były ponownie izolowane ze szczepów drożdży i po generacji PCR sekwencje DNA były weryfikowane a następnie subklonowano regiony DNA cechujące się delecją. Podobnie, sekwencje DNA kodujące Arg34GLP-1(7-37) były zweryfikowane na DNA plazmidu izolowanym ponownie ze szczepów drożdżowych. Tabela III pokazuje porównanie pomiędzy zmodyfikowanymi i niezmodyfikowanymi szczepami.
T a b e l a III
Przegląd szczepów YES w oparciu o plazmidy z niefunkcjonalnym lub wyciętym genem oporności AMP dla ekspresji Arg34GLP-1(7-37)
| Szczep | Plazmid | Modyfikacja | Wydeletowane nukleotydy | Porównanie wydajności Arg34GLP-1(7-37) |
| YES1757 | pKV228 | niemodyfikowany | 0 | 100% |
| YES2076 | pKV301 | delecja sekwencji pomiędzy ApaLI (4456) i ApaLI (5702) | 1246 | 119% |
| YES2079 | pKV307 | delecja sekwencji pomiędzy XhoI (5655) i XhoI (5699) | 44 | 113% |
| YES2085 | pKV304 | delecja sekwencji pomiędzy ApatII (5957) i ApatII (4961) | 996 | 136% |
Wydajność była porównywana z 5 ml laboratoryjną skalą fermentacyjną w YPD przez 72 godziny w 30°C. Wydajność oceniano stosując HPLC.
PL 201 350 B1
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób iwtwarzania pożądanego polipeptydu lub białka w drożdżach, znnmieeny tym, ze prowadzi óię hżżswlę w żUoswigaeihh wczbeachh óahagpb Uzseadd acwigzcjdhgoż azsdadżwd piramid gaóozpódjed, w którym tż plcamiaaig fbeaejżecled cetdbiżtdażwd gge mcragrżwd ótżóżwced żż wótępeyhh gtcobw aiżeżwceic w bcatgrii ażótcł wtażeced jcaż eigfbeahjżecled pżprzga aglghję in vitro haęśhi ggeb mcragrżwgoż lbb hcłgoż ogeb mcragrżwgoż oraga ieógrhjd żż ożóożacrac arżdadżwgoż.
- 2. Sposób wagług zanttz. 1, zznmieeny tym, Od ożbjmuje l neercję ożaowieguiego miejsch reótiyahdjegoż ażżażłc mcragrżwgoż ogeb żożreżśhi cetdbiżtdażwgj i aglghję ogeb mcragrżwgoż oraga trcatżwceig in vitro żaożwigaeimi geatmcmi rgótzdahdjedmi.
- 3. Sposób wagługzantrz. żalbb 2, z znmieenn tym, żd g enoseahag drzżdaastooójesięseahag Pchhhcrżmdhgó, ażradóteig Schhhcrżmdhgó hgrgvióicg.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA199800945 | 1998-07-16 | ||
| DKPA199900754 | 1999-05-28 | ||
| PCT/DK1999/000380 WO2000004172A1 (en) | 1998-07-16 | 1999-07-02 | Method of making proteins in transformed yeast cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL345584A1 PL345584A1 (en) | 2001-12-17 |
| PL201350B1 true PL201350B1 (pl) | 2009-04-30 |
Family
ID=26064588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL345584A PL201350B1 (pl) | 1998-07-16 | 1999-07-02 | Sposób wytwarzania pożądanego polipeptydu lub białka w drożdżach |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1097228B1 (pl) |
| JP (1) | JP4668414B2 (pl) |
| KR (1) | KR20010071929A (pl) |
| CN (1) | CN1187451C (pl) |
| AT (1) | ATE318919T1 (pl) |
| AU (1) | AU4499399A (pl) |
| BR (1) | BR9912106B1 (pl) |
| CA (1) | CA2337635A1 (pl) |
| DE (1) | DE69930118T2 (pl) |
| ES (1) | ES2260917T3 (pl) |
| HU (1) | HUP0102697A3 (pl) |
| IL (1) | IL140403A0 (pl) |
| NO (1) | NO20010246L (pl) |
| PL (1) | PL201350B1 (pl) |
| RU (1) | RU2238323C2 (pl) |
| WO (1) | WO2000004172A1 (pl) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100783287B1 (ko) * | 2006-08-09 | 2007-12-06 | 한국생명공학연구원 | 텔로미어 전사 비활성화에 관여하는 화합물의 동정을 위한균주의 제조 |
| JP2016521701A (ja) | 2013-06-07 | 2016-07-25 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 成熟インスリンポリペプチドを作製するための方法 |
| WO2020106599A1 (en) * | 2018-11-19 | 2020-05-28 | Basf Se | A recombinant yeast cell |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE238425T1 (de) * | 1993-07-23 | 2003-05-15 | Dsm Nv | Selektionmarker-genfreie rekombinante stämme: verfahren zur ihrer herstellung und die verwendung dieser stämme |
| DE4428402A1 (de) * | 1994-08-11 | 1996-02-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Gentherapeutisches Verfahren unter Verwendung von DNA-Vektoren ohne Selektionsmarker-Gen |
| EP0814165B1 (en) * | 1996-06-21 | 2003-04-09 | Suntory Limited | Method for constructing transformed yeast cells, that do not contain a selective marker gene |
| JP4090090B2 (ja) * | 1996-06-21 | 2008-05-28 | サントリー株式会社 | 選択マーカー遺伝子を持たない形質転換体の作製方法 |
-
1999
- 1999-07-02 DE DE69930118T patent/DE69930118T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-02 EP EP99927739A patent/EP1097228B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-02 RU RU2001104431A patent/RU2238323C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-07-02 CN CNB998087068A patent/CN1187451C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-02 IL IL14040399A patent/IL140403A0/xx unknown
- 1999-07-02 ES ES99927739T patent/ES2260917T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-02 HU HU0102697A patent/HUP0102697A3/hu unknown
- 1999-07-02 BR BRPI9912106-9A patent/BR9912106B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-07-02 AU AU44993/99A patent/AU4499399A/en not_active Abandoned
- 1999-07-02 JP JP2000560269A patent/JP4668414B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-02 PL PL345584A patent/PL201350B1/pl unknown
- 1999-07-02 CA CA002337635A patent/CA2337635A1/en not_active Withdrawn
- 1999-07-02 KR KR1020017000677A patent/KR20010071929A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-07-02 AT AT99927739T patent/ATE318919T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-07-02 WO PCT/DK1999/000380 patent/WO2000004172A1/en not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-01-15 NO NO20010246A patent/NO20010246L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO20010246D0 (no) | 2001-01-15 |
| JP4668414B2 (ja) | 2011-04-13 |
| AU4499399A (en) | 2000-02-07 |
| ATE318919T1 (de) | 2006-03-15 |
| BR9912106A (pt) | 2001-05-02 |
| EP1097228A1 (en) | 2001-05-09 |
| WO2000004172A1 (en) | 2000-01-27 |
| BR9912106B1 (pt) | 2012-09-04 |
| HUP0102697A2 (hu) | 2001-11-28 |
| KR20010071929A (ko) | 2001-07-31 |
| RU2238323C2 (ru) | 2004-10-20 |
| CN1309712A (zh) | 2001-08-22 |
| EP1097228B1 (en) | 2006-03-01 |
| JP2002520061A (ja) | 2002-07-09 |
| IL140403A0 (en) | 2002-02-10 |
| NO20010246L (no) | 2001-01-15 |
| CA2337635A1 (en) | 2000-01-27 |
| DE69930118D1 (de) | 2006-04-27 |
| PL345584A1 (en) | 2001-12-17 |
| CN1187451C (zh) | 2005-02-02 |
| ES2260917T3 (es) | 2006-11-01 |
| DE69930118T2 (de) | 2006-11-02 |
| HUP0102697A3 (en) | 2003-09-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3730255B2 (ja) | イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質 | |
| CA2050336C (en) | Yeast processing system comprising a negatively charged amino acid adjacent to the processing site | |
| US5795746A (en) | Synthetic leader peptide sequences | |
| US6500645B1 (en) | N-terminally extended proteins expressed in yeast | |
| EP0195691A1 (en) | Process for the preparation of Insulin Precursors and process for the preparation of human insulin | |
| ES2258797T3 (es) | Proteinas con extension n-terminal expresadas en la levadura. | |
| US6358705B1 (en) | Method of making proteins in transformed yeast cells | |
| ES2242969T3 (es) | Vector para la expresion de proteinas con prolongacion n-terminal en celulas de levadura. | |
| PL201350B1 (pl) | Sposób wytwarzania pożądanego polipeptydu lub białka w drożdżach | |
| RU2167939C2 (ru) | Способ продуцирования полипептида в дрожжах | |
| MXPA01000516A (en) | Method of making proteins in transformed yeast cells | |
| CZ20015A3 (cs) | Rekombinantní exprimovaný kvasinkový vektor, způsob jeho získávání a transformovaná kvasinková buňka |