CN1309712A - 在转化的酵母细胞中生产蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于在酵母中表达异源蛋白质或多肽的方法,该方法通过培养一种不含功能性抗生素抗性标记基因的转化酵母菌株来进行。
Description
发明领域
本发明涉及蛋白质在转化的酵母细胞中的表达、DNA构建体和用于该过程的载体以及用该载体转化的酵母细胞。
发明背景
众所周知使用转化的酵母菌株来表达蛋白质，参见例如欧洲专利申请0088632A、0116201A、0123294A、0123544A、0163529A、0123289A、0100561A、0189998A和0195986A、PCT专利申请WO95/01421、95/02059和WO90/10075和美国专利4,546,082。
上述方法的共有特性在于酵母生产质粒含有用于抗生素标记的基因。这样的标记基因是由大肠杆菌中的起始克隆步骤产生的，其中将它用于筛选转化的细胞或维持用作载体的质粒。据认为所述的抗生素标记基因对转化的酵母细胞的培养没有任何不良影响，因此通常的做法是不采取任何步骤来缺失这样的DNA。此外，通常通过从所述转化的酵母细胞中分离质粒并将分离的质粒转化入大肠杆菌、随后进行抗生素选择来进行质粒构建体的表征。因此，它适合于保持抗生素抗性标记基因的实际目的。
尽管研究实验室和工业化生产工厂都受到极为严格的安全性管理制度的控制，但是仍然存在小的危害，即少量细胞将偶然被释放到环境中。由于它们极为复杂的特性，这类基因工程微生物仅能存活极短的期限并且对环境的危害程度极低。这当然就是为什么已经批准这类转化的微生物可用于研究和大规模操作的原因。
尽管细胞快速死亡，但是含有抗生素抗性基因的质粒仍然可能偶然被处理到环境中，且如果质粒自然被吸收，那么在理论上存在细菌中引入了抗生素耐受性的危害。
抗生素对于治疗人和动物细菌感染来说是极为重要的。如果可能，应将使用使抗生素产生耐受性的基因导致的任何潜在环境污染的危害降到最低限度。
因此，对开发甚至比迄今为止所用方法更为安全的方法存在一种需求且本发明的目的就是提供这类改进的方法。
发明概述
本发明涉及一种用于在酵母中表达异源蛋白质或多肽的方法，其中用于生产的酵母转化体菌株含有一种表达载体，在该表达载体中已经通过在转化酵母宿主前的体外修饰而使用于起始克隆步骤的抗生素标记基因成为非功能性的。本发明还涉及用于这类方法的DNA序列和表达载体并涉及转化的酵母细胞。
本发明的一个方面涉及一种重组酵母表达载体，它不能够使细菌细胞产生抗生素抗性并且包括编码异源蛋白质的基因和已经通过体外修饰而成为非功能性的抗生素抗性标记基因。
本发明的另一方面涉及一种用于生产所需多肽或蛋白质的方法，所述的方法包括培养一种酵母菌株和从培养基中分离所需产物的步骤，其中所述的酵母菌株含有不能够使细菌细胞产生抗生素抗性并且包括编码异源蛋白质的基因和抗生素抗性标记基因，该标记基因已经在转化酵母宿主前通过体外修饰而成为非功能性的。
本发明的方法一般包括培养一种酵母菌株的步骤，所述的酵母菌株含有一种酵母表达质粒，在该质粒中，用于细菌中起始克隆步骤的功能性抗生素标记基因已经在插入用于表达和分泌所需多肽或蛋白质的酵母宿主前通过体外缺失部分标记基因或整个标记基因而成为非功能性的。
抗生素标记基因的缺失优选通过在抗生素抗性标记基因的每一侧上插入合适的限制切割位点来进行，由此通过用合适的限制酶的体外处理而使所述的标记基因缺失。
本发明还涉及转化的酵母菌株，它含有不能够使细菌细胞产生抗生素抗性的载体并含有编码异源蛋白质的基因和已经在转化酵母宿主前通过体外修饰而使抗生素抗性标记基因成为非功能性的。
酵母菌株优选是酵母属的菌株，且特别是优选酿酒酵母菌株。
本文所用的措词“抗生素标记基因”或“抗生素抗性标记基因”指的是允许对转化的细菌细胞进行表型选择和质粒扩增的基因。
在大肠杆菌中最常用的抗生素抗性标记基因是使氨苄西林(AMP)、氯霉素、新霉素、卡那霉素和四环素产生耐受性的标记基因。
本文所用的措词“非功能性标记基因”指的是标记基因已经缺失或通过缺失部分基因而成为非功能性的。优选所述的基因是完全缺失的。
本文所用的“体外修饰”指的是在细胞环境外的载体上进行的修饰步骤。
本文所用的“不能够使细菌细胞产生抗生素抗性”指的是抗生素抗性基因由于所述的基因操作而在任何生物体中是非功能性的。
本文所用的“酵母宿主”指的是欲用表达质粒或载体转化或转染的酵母生物体。
附图的简要说明
参照附图进一步说明本发明，其中
附图1表示在来自酿酒酵母的TPI启动子和TPI终止子序列以及由YAP3信号肽和合成LA19前导肽组成的信号前导序列的表达控制下含有表达胰岛素前体的基因的表达质粒pAK729。pAK729的构建如WO97/22706中所述。该质粒还含有来自包括氨苄西林抗性基因和大肠杆菌中DNA复制起点的pBR322/pUC13的AMP-R序列；
附图2表示用于生产在缺失Amp基因前缺乏AMP基因的NN729.5菌株的pAK729.5质粒的质粒图谱；
附图3表示用于生产在缺失Amp基因前缺乏AMP基因的NN729.6菌株的pAK729.6质粒的质粒图谱；
附图4表示AMP基因已经缺失的pAK729.6-Δamp质粒的质粒图谱；
附图5表示用于生产在缺失Amp基因前缺乏AMP基因的NN729.7菌株的pAK729.7质粒的质粒图谱；且
附图6表示通过用MFα*-Arg34GLP-1(7-37)编码序列取代pAK729(附图1)中的EcoRI(940)-XbaI(1403)编码序列所修饰的pKV228质粒的质粒图谱。
发明详述
通过使用可得到的限制位点或通过使用PCR引入合适的限制位点、位点特异性诱变或其它众所周知的用于操作DNA序列的技术、随后用合适的限制酶处理来进行抗生素抗性标记基因的体外缺失。
构建了4种修饰的NN729菌株以评估质粒中的各种缺失是否会影响长期发酵过程中的胰岛素前体发酵产率或菌株稳定性(表Ⅰ)。比较了菌株与原始NN729菌株的发酵产率和发酵稳定性(表Ⅱ)。此外，构建了3种修饰的产生GLP-1变体Arg34GLP-1(7-37)的酵母菌株以评估含有AMP基因的质粒pKV228中的各种缺失是否会影响Arg34GLP-1(7-37)的发酵产率(表Ⅲ)。
将AMP基因和可能的周边序列已经缺失的质粒和菌株均命名为“ΔAMP”。
通过转化pAK729或pKV228修饰的质粒至酿酒酵母菌株MT663(E2-7B XE11-36a/α,ΔtpiΔtpi,pep4-3/pep4-3)或ME1719(MATa/αΔyap3::ura3/Δyap3::URA3pep4-3/pep4-3Δtpi::LEU2/Δtpi::LEU2 leu2/leu2 Δura3/Δura3)制备了修饰的酵母菌株，在所述的修饰的质粒中，AMP标记基因和来自原始质粒的可能的其它DNA序列已经缺失。
通过使用已经存在于质粒中的合适限制酶位点或通过以AMP基因可以被缺失的方式插入合适的限制酶位点制备了修饰的质粒。在以AMP基因被缺失或使AMP基因成为非功能性的这样的方式转化至酿酒酵母(菌株MT663)前可以在体外操作修饰的质粒且由此所得的酵母菌株缺乏AMP基因。因此，在处理酵母细胞的过程中由AMP基因产生的对环境的污染的潜在危险得以消除。
将修饰的pAK729或pKV228质粒用合适的限制酶消化、进行琼脂糖凝胶电泳、分离、再连接且随后分别转化至感受态MY663和感受态ME1719 WO98/01535的酿酒酵母细胞。
由本发明方法生产的蛋白质或多肽可以是任意的可以有利地在酵母细胞中生产的异源蛋白质或多肽。这类蛋白质的实例是抑酶肽、组织因子途径抑制剂或其它蛋白酶抑制剂、胰岛素、胰岛素前体或胰岛素类似物、胰岛素样生长因子Ⅰ或Ⅱ、人或牛生长激素、白细胞介素、组织纤溶酶原激活物、转化生长因子a或b、胰高血糖素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)、GRPP、因子Ⅶ、因子Ⅷ、因子XⅢ、血小板衍生的生长因子和酶类诸如脂酶类。
所谓“胰岛素前体”或“胰岛素类似物前体”可以理解为单链多肽，包括胰岛素原，可以将它通过一种或多种随后进行的化学和/或酶促反应而转化成具有如在天然人胰岛素中发现的3个二硫桥的正确构象的双链胰岛素或胰岛素类似物分子。所述的胰岛素前体一般含有桥连胰岛素A与B链的修饰的C-肽。此外，优选的胰岛素前体缺乏B(30)氨基酸残基。最优选的胰岛素前体是在例如EP163529和PCT申请95/00550以及95/07931中所述的那些胰岛素前体。胰岛素的实例是人胰岛素、优选脱(B30)人胰岛素和猪胰岛素。优选的胰岛素类似物是一个或多个天然氨基酸残基、优选一个、两个或三个氨基酸残基已经被另一种可编码的氨基酸残基所取代的这样的胰岛素类似物。因此，在亲代胰岛素的A21位上可以带有一种选自于包括Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val在内的组的氨基酸残基，特别是选自于包括Gly、Ala、Ser、和Thr在内的组的氨基酸残基来代替Asn。同样，在亲代胰岛素的B28位上可以带有一种选自于包括Asp、Lys等在内的组的氨基酸残基来代替Pro；而在亲代胰岛素的B29位上可以带有氨基酸Pro来代替Lys。
本文所用的措词“可编码的氨基酸残基”表示可以通过遗传密码即核苷酸的三联体(“密码子”)编码的氨基酸残基。
通过已经确立的标准方法，例如由S.L.Beaucage和M.H.Caruthers在《四面体通讯》(Tetrahedron Letters)22,1981,pp.1859-1869中所述的亚磷酰胺法或由Matthes等在《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO Journal)3,1984,pp.801-805中所述的方法可以制备DNA构建体。根据亚磷酰胺法，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸、将它们纯化、形成双链并连接以形成合成的DNA构建体。目前优选的制备DNA构建体的方式是通过聚合酶链反应(PCR)，例如如Sambrook等在《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual),Cold Spring Harbor,NY,1989中所述。
编码所需蛋白质的DNA还可以来源于基因组或cDNA，例如按照标准技术(参见Sambrook等在《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning:A LaboratoryManual),Cold Spring Harbor,1989)通过制备基因组或cDNA文库并经使用合成寡核苷酸探针的杂交法筛选编码本发明全部或部分多肽的DNA序列来获得。
最后，编码所需蛋白质的DNA可以来源于通过按照标准技术使合成的、基因组的或cDNA来源的(如果合适)的片段退火制备的合成与基因组的混合型、合成与cDNA的混合型或基因组与cDNA的混合型，所述的片段符合完整DNA构建体的不同部分。
重组表达载体可以是自主复制载体，即作为染色体外本体存在的载体，例如质粒、染色体外因子、微型染色体或人工染色体，其复制与染色体的复制无关。该载体可以含有确保自复制的任意形式。另一方面，当将该载体引入宿主细胞时，它可以是一种整合入基因组并与所整合入的染色体共同复制的载体。载体系统可以是单一载体或质粒或两种或多种共同含有将被引入宿主细胞基因组的总DNA或转座子的载体或质粒。
重组表达载体可能会含有编码可操作地与合适的启动子序列连接的所需蛋白质或多肽的DNA序列。所述的启动子可以是在酵母中具有转录活性的任意DNA序列并可以来源于编码与酵母同源或异源的蛋白质的基因。该启动子优选来源于编码与酵母同源的蛋白质的基因。合适的启动子的实例是酿酒酵母Mal、TPI、ADH或PGK启动子。
编码所需蛋白质或多肽的DNA序列还可以可操作地与合适的终止子连接，例如TPI终止子(参见T.Alber和G.Kawasaki，《实用分子遗传学杂志》(J.Mol.Appl.Genet.)1,1982,pp.419-434)。
本发明的重组表达载体还包含使载体能够在酵母中复制的DNA序列。这类序列的实例是酵母质粒2μ复制基因REP1-3和复制起点。所述载体还可以包含选择性标记，例如由P.R.Russell在《基因》(Gene)40,1985,pp.125-130中所述的粟酒裂殖酵母TPI基因。
最后，表达载体优选含有信号/前导序列以便确保所需蛋白质或多肽分泌入培养基。信号序列是编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，所编码的多肽作为一种较大多肽的成分可指导较大多肽通过合成它的细胞的分泌途径。通常将较大多肽裂解以便在通过分泌途径转运的过程中除去分泌肽。
分泌信号序列可以编码确保有效指导所表达的多肽进入细胞分泌途径的任意信号肽。所述的信号肽可以是天然存在的信号肽或其功能部分或它可以是一种合成肽。用于酵母宿主细胞的信号肽类获自酿酒酵母a-因子和酿酒酵母转化酶的基因、小鼠唾液淀粉酶的信号肽(参见O.Hagenbuchle等《自然》(Nature)289,1981,pp.643-646)、修饰的羧肽酶信号肽(参见L.A.Valls等《细胞》(Cell)48,1987,pp.887-897)、酵母BAR1信号肽(参见WO87/02670)或酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitani等《酵母》(Yeast)6,1990,pp.127-137)。
为了在酵母中进行有效分泌，编码前导肽的序列也可以被插入信号序列的下游和编码该多肽的DNA序列的上游。前导序列的功能是使得所表达的多肽从内质网定向于高尔基体并进一步定向于分泌小泡以便分泌入培养基(即多肽穿过细胞壁或至少通过细胞膜排入酵母细胞的壁膜间隙)。前导肽可以是酵母a-因子的前导区(其应用在例如美国专利4,546,082、EP16 201、EP123 294、EP123 544和EP163 529中描述)。另一方面，前导肽可以是一种合成的前导肽，它是一种未在自然界被发现的前导肽。可以如WO89/02463或WO92/11378中所述和由Kjeldsen等在“蛋白质的表达和纯化”(“Protein Expressionand Purification”)9,331-336(1997)中所述构建前导肽类。
可以将措词“前导肽”理解为表示前肽序列形式的肽，所述的前肽序列的功能是使得所分泌的异源蛋白质从内质网定向于高尔基体并进一步定向于分泌小泡以便分泌入培养基，(即所表达的蛋白质或多肽穿过细胞膜和细胞壁(如果存在)或至少通过细胞膜排入具有细胞壁的细胞的壁膜间隙)。
用于分别连接编码所需蛋白质或多肽的DNA序列、启动子和终止子以及将它们插入含有酵母复制所必需的信息的合适的酵母载体的步骤对于本领域技术人员来说是众所周知的(参见例如Sambrook等，在所引用的文献中所述)。应该理解的是可以通过首先制备含有编码本发明多肽的完整DNA序列的DNA构建体且随后将该片段插入合适的表达载体或通过顺序插入含有用于各元件(诸如信号、前导区或异源蛋白质)的遗传信息的DNA片段、随后连接可以构建所述的载体。
用于本发明方法的酵母生物体可以是任意合适的酵母生物体，在培养时它们产生令人满意数量的所需蛋白质或多肽。合适的酵母生物体的实例可以选自下列酵母菌种的菌株：酿酒酵母、克鲁弗酵母、粟酒裂殖酵母、葡萄汁酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、Pichia methanolica、克鲁弗毕赤酵母、Yarrowialipolytica、假丝酵母属的菌种、可可假丝酵母、地霉属的菌种和Geotrichum fermentans；优选的酵母菌种是酿酒酵母。
例如，通过原生质体形成、随后以本身已知的方式转化可以实现酵母细胞的转化。用于培养所述细胞的培养基可以是任意适合于使酵母生物体生长的常规的培养基。可以通过常规步骤从培养基中回收以正确加工形式和显著的比例存在于培养基中的分泌的异源蛋白质，所述的常规步骤包括：通过离心或过滤从培养基中分离酵母细胞，借助于一种盐，例如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白质成分，随后通过各种色谱程序，例如离子交换色谱法、亲和色谱法等进行纯化。当所述的蛋白质分泌至壁膜间隙时，通过酶促方式或机械方式使细胞破裂。
可以将所需的蛋白质或多肽表达和分泌为如WO97/22706中所述的N-末端延伸的融合蛋白。然后可以通过本领域中众所周知的化学或酶促裂解在体外从回收的蛋白质中除去N-末端延伸的部分。优选使用酶进行裂解。这类酶的实例是胰蛋白酶或水解无色杆菌蛋白酶Ⅰ。
在下列实施例中更详细地描述本发明，这些实施例不以任何方式来限制所要求保护的本发明的范围。
实施例1
为表达胰岛素前体(一种N-末端延伸的B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)胰岛素前体，参见WO97/22706)而构建的酵母质粒pAK729含有两个ApaLⅠ酶限制位点ApaLⅠ(4477)和ApaLⅠ(5723)(参见附图1)。这些限制位点位于AMP标记基因的每一侧上。除去pAK729中两个AplaLⅠ位点之间的1246个核苷酸会除去AMP标记基因和某一附加的大肠杆菌衍生的质粒DNA。
将pAK729质粒用ApaLⅠ限制酶消化、进行琼脂糖凝胶电泳、分离、重新连接且随后转化至感受态酿酒酵母细胞(MT663，参见EPBO163529)以便得到转化的酵母菌株NN729.1-ΔAMP。从酵母菌株NN729.1-ΔAMP中重新分离修饰的表达质粒并在PCR发生后检验DNA序列，随后亚克隆以缺失为特征的DNA区。同样，在从酵母菌株NN729.1-ΔAMP中重新分离的质粒DNA上检验编码胰岛素前体的DNA序列。
在30℃下，在YPD培养基中将酵母菌株NN729.1-ΔAMP培养72小时。通过RP-HPLC测定胰岛素前体的发酵产率。
实施例2
通过PCR在pAK729质粒中引入酶的限制位点XhoⅠ(5676)和XhoⅠ(5720)。随后检验得到的pAK729.5质粒的选择的DNA序列。pAK729.5的限制质粒图谱如附图2中所示。可以从缺失了位于AMP基因内的44个核苷酸的质粒pAK729.5中缺失限制酶位点XhoI(5676)和XhoⅠ(5720)之间的DNA片段。
将质粒pAK729.5用XhoⅠ限制酶消化、进行琼脂糖凝胶电泳、分离、重新连接且随后转化至感受态酿酒酵母细胞，从而得到酵母转化体NN729.5-ΔAMP。从酵母菌株NN729.5-ΔAMP中重新分离修饰的表达质粒并在PCR发生后检验DNA序列，随后亚克隆以缺失为特征的DNA区。同样，在从酵母菌株NN729.5-ΔAMP中重新分离的质粒DNA上检验编码胰岛素前体的DNA序列。就破坏β-内酰胺酶活性而言，结果是pAK729.5-ΔAMP中44个核苷酸的缺失与AMP基因的完全缺失同样有效。
在30℃下，在YPD培养基中将酵母菌株NN729.5-ΔAMP培养72小时。通过RP-HPLC测定胰岛素前体的发酵产率。
实施例3
通过PCR将酶的限制位点AatⅡ(4982)引入pAK729质粒。随后检验得到的pAK729.6质粒的选择的DNA序列。pAK729.6的限制质粒图谱如附图3中所示。在pAK729.6中，限制酶位点AatⅡ(4982)和AatⅡ(5978)之间的DNA片段可以被缺失，从而从该质粒中除去了996个核苷酸。这可除去所有的AMP基因和启动子。
将pAK729.6质粒用DNA限制酶AatⅡ消化、进行琼脂糖凝胶电泳、分离、重新连接且随后转化至感受态MT663酿酒酵母细胞。从酵母菌株NN729.6-ΔAMP中重新分离修饰的表达质粒并在PCR发生后检验DNA序列，随后亚克隆以缺失为特征的DNA区。同样，在从酵母菌株NN729.6-ΔAMP中重新分离的质粒DNA上检验编码胰岛素前体的DNA序列。缺乏AMP基因的质粒NN729.6-ΔAMP如附图4中所示。
在30℃下，在YPD培养基中将酵母菌株NN729.6-ΔAMP培养72小时。通过RP-HPLC测定胰岛素前体的发酵产率。实施例4
通过PCR将pAK729.7质粒中的新酶的限制位点AatⅡ(3801)引入原始pAK729质粒。随后检验pAK729.7质粒的选择的DNA序列。在pAK729.7中，限制酶位点AatⅡ(3801)和AatⅡ(5978)之间的DNA片段可以被缺失，从而从该表达质粒中除去了2177个核苷酸。将pAK729.7质粒设计成AMP基因和大肠杆菌复制起点均可以被缺失。pAK729.7的限制质粒图谱如附图5中所示。
将pAK729.7质粒用DNA限制酶AatⅡ消化、进行琼脂糖凝胶电泳、分离、重新连接且随后转化至感受态MT663酿酒酵母细胞。从酵母菌株NN729.7-ΔAMP中重新分离修饰的表达质粒并在PCR发生后检验DNA序列，随后亚克隆以缺失为特征的DNA区。同样，在从酵母菌株NN729.7-ΔAMP中重新分离的质粒DNA上检验编码胰岛素前体的DNA序列。在30℃下，在YPD培养基中将酵母菌株NN729.7-ΔAMP培养72小时。通过RP-HPLC测定胰岛素前体的发酵产率。
表Ⅰ
以带有非功能性或缺失的AMP基因的pAK729质粒
为基础的NN729菌株的概要
| 菌株 | 质粒 | 修饰 | 缺失的核苷酸 |
| NN729.1-ΔAMP | pAK729.1-ΔAMP | ApaLⅠ(4477)和ApaLⅠ(5723)之间的序列缺失 | 1246 |
| NN729.5-ΔAMP | pAK729.5-ΔAMP | XhoⅠ4(5676)和XhoⅠ(5720)之间的序列缺失 | 44 |
| NN729.6-ΔAMP | pAK729.6-ΔAMP | AatⅡ(5978)和AatⅡ(4982)之间的序列缺失 | 996 |
| NN729.7-ΔAMP | pAK729.7-ΔAMP | AatⅡ(5978)和AatⅡ(3801)之间的序列缺失 | 2177 |
将新的NN729-ΔAMP菌株与原始的NN729菌株的胰岛素前体的发酵产率进行了比较(表Ⅱ)。
表Ⅱ
用带有非功能性或缺失的AMP基因的质粒
转化的NN729-ΔAMP菌株的发酵产率
| 菌株 | 胰岛素前体的产率 |
| NN729 | 100％ |
| NN729.1 | 122％ |
| NN729.5 | 110％ |
| NN729.6 | 112％ |
| NN729.7 | 107％ |
从上述结果中可以看出：包括部分或完全缺失AMP标记基因的表达质粒的酵母菌株表达的胰岛素前体比包括含有AMP基因的表达质粒的原始酵母菌株表达的胰岛素前体多10-20％。
实施例5使用带有非功能性或缺失的AMP抗性基因的质粒在酵母中表达Arg34GPL-1(7-37)
用本实施例的MFα*-Arg34GLP-1(7-37)编码序列(附图6)取代编码附图1-5中所说明的LAl9 X5 MI3的pAK729构建体的EcoRⅠ(940)-XbaⅠ(1403)序列。将修饰82位上的Leu和83位上的Asp已经分别被Met和Ala所取代的MFαl前前导肽原(Kurjan&Herskowitz，《细胞》(Cell)30,1982,pp.933)而在DNA序列中引入NcoⅠ切割位点这一过程用于此构建体中。将前导序列命名为MFα1*(Kjeldsen T.等1996)。MFα1信号MFα1*前导肽序列包括从Arg34GPL-1(7-37)编码序列中分离前导区的二元Kex2p识别基元(Lys-Arg)。肽Arg34GLP-1(7-37)是一种人GLP-1(7-37)变体(S.Mojsov等《生物化学杂志》(
J. Biol.Chem.)261,1986,pp.11880-11889)，其中34位上的天然氨基酸残基被Arg残基所取代。
用对NN729.1(实施例1)、NN729.5(实施例2)和NN729.6(实施例3)所述的AMP抗性基因破坏法构建了三种Arg34GLP-1(7-37)表达质粒且随后将它们转化至感受态ME1719(参见WO98/01535)酿酒酵母细胞，从而分别得到酵母转化体YES2076、YES2079和YES2085。
已经用于表达Arg34GLP-1(7-37)的宿主菌株是一种二倍体菌株并且具有缺乏两种天冬氨酸蛋白酶的表型，所述的天冬氨酸蛋白酶即(1)裂解一元或二元氨基酸残基C-末端的酵母天冬氨酰蛋白酶3(YAP3)(Egel-Mitani等《酵母》(YEAST)6:127-137,1990)和(2)导致其它蛋白酶诸如蛋白酶B、羧肽酶Y、氨肽酶I、RNA酶、碱性磷酸酶、酸性海藻糖酶和聚磷酸外切酶活化的液泡蛋白酶A。此外，丙糖磷酸异构酶基因(TPI)已经被破坏，其表型使得在生长于含有葡萄糖的培养基上的转化体中利用葡萄糖成为可能。ME1719的遗传背景是MATa/aDyap3::ura3/Dyap3::URA3 pep4-3/pep4-3 tpi::LEU2/Dtpi::LEU2 leu2/leu2 Dura3/Dura3。
从酵母菌株中重新分离修饰的表达质粒pKV301、pKV307和pKV304并在PCR发生后检验DNA序列，随后亚克隆以缺失为特征的DNA区。同样，在从所述的酵母菌株中重新分离的质粒DNA上检验编码Arg34GLP-1(7-37)的DNA序列。表Ⅲ显示了修饰的与未修饰的菌株的比较结果。
表Ⅲ
以带有用于表达Arg34GLP-1(7-37)的非功能性或缺失的AMP
抗性基因的质粒为基础的YES菌株的概要
| 菌株 | 质粒 | 修饰 | 缺失的核苷酸 | Arg34GLP-1(7-37)产率的比较 |
| YES1757 | pKV228 | 未修饰 | 0 | 100％ |
| YES2076 | pKV301 | ApaLⅠ(4456)和ApaLⅠ(5702)之间的序列缺失 | 1246 | 119％ |
| YES2079 | pKV307 | XhoⅠ(5655)和XhoⅠ(5699)之间的序列缺失 | 44 | 113％ |
| YES2085 | pKV304 | AatⅡ(5957)和AatⅡ(4961)之间的序列缺失 | 996 | 136％ |
在30℃下，比较YPD中进行72小时的5ml实验室规模的发酵的产率。使用HPLC估计产率。
Claims (8)
1．不能够使细菌细胞产生抗生素抗性的重组酵母表达载体，所述的载体包括编码异源蛋白质的基因和已经通过体外修饰而成为非功能性的抗生素抗性标记基因。
2．根据权利要求1所述的重组酵母表达载体，其中所述的抗生素标记基因是AMP基因。
3．用于生产所需多肽或蛋白质的方法，该方法包括在合适的条件下培养含有权利要求1-2所述载体的酵母菌株并从培养基中分离所需产物的步骤。
4．用于生产所需多肽或蛋白质的方法，该方法包括在合适的条件下培养含有酵母表达质粒的酵母菌株的步骤，在所述的质粒中，在插入酵母宿主前已经通过体外缺失部分标记基因或整个标记基因而使用于细菌中起始克隆步骤的功能性抗生素标记基因成为非功能性的。
5．根据权利要求4所述的方法，包括在抗生素抗性标记基因周围插入合适的限制位点并通过用合适的限制酶进行的体外处理而使所述标记基因缺失的步骤。
6．根据权利要求3-5所述的方法，其中所述的酵母菌株是酵母属的菌株，优选酿酒酵母菌株。
7．含有权利要求1-2所述载体的转化酵母细胞。
8．根据权利要求7所述的转化酵母菌株，它是一种酵母属的菌株，优选酿酒酵母菌株。
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| PB01 | Publication | ||
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| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20050202 |