KR100274184B1 - 단백질 감미료에 융합된 인간칼시토닌 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 칼시토닌 유전자를 단백질 감미료(prosweet, proteinaceous sweetener) 유전자 뒤에 융합시킨 융합 인간 칼시토닌 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 벡터로 형질전환된 미생물 및 인간 칼시토닌이 단백질 감미료에 융합된 형태인 인간 칼시토닌의 융합 단백질, 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

단백질 감미료에 융합된 인간 칼시토닌

제1도는 인간 칼시토닌 유전자를 단백질 감미료 유전자뒤에 융합시킨 전체 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 합성 프라이머 위치를 나타낸것이고,

제2도는 융합 인간 칼시토닌 유전자의 효모 발현벡터로의 클로닝 과정을 도시한 것이고,

제3도는 단백질 감미료에 융합된 인간 칼시토닌을 SDS-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 화학합성한 인간 칼시토닌(human calcitonin, HCT) 유전자를 발현이 잘되는 유전자에 융합시킨 융합 인간 칼시토닌 유전자, 보다 상세하게는 인간 칼시토닌 유전자를 단백질 감미료(prosweet, proteinaceeus sweetener) 유전자 뒤에 융합시킨 융합 인간 칼시토닌 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 벡터로 형질전환된 미생물 및 인간 칼시토닌이 단백질 감미료에 융합된 형태인 인간 칼시토닌이 융합 단백질, 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

칼시토닌은 32 개의 아미노산을 함유하는 펩타이드 호르몬으로(Roger K. Craig et at., Nature 295, 346(1982)), 포유류에서는 갑상선(thyroid glands)의 씨-파라폴리큘 세포(C-parafollicular cells)에 의해, 파충류나 조류에서는 얼티보브란 키얼선(Ultimobranchial glands)에 의해서 생산된다. 칼시토닌은 부갑상선 호르몬 및 1,25-디하이드록시콜레칼시페롤 (1,25-dihyroxy cholecalciferol)과 함께 칼슘과 인의 대사조절에 아주 중요한 역할을 한다. 특히 사람에게 있어서는 성장이나 임신, 수유 등의 활동으로 야기되는 칼슘스트레스 기간 동안 뼈체계에서 칼슘이 집적되도록 자극하여 뼈의 공동화 현상을 막는 역할을 한다.

칼씨토닌은 과칼슘증(hypercaloemia)이나 뼈흡수증(bone resorption)등과 같은 병의 치료에 이용되어 왔다 [Avioli ＆ Gennari, First International Workshop, Floreuce, April 2-3 Elsevier, Amsterdam 1982, P49-54]. 인간의 치료에 최근까지 주로 이용된 것은 연어와 돼지의 칼시토닌이었으나 이들을 6 개월 이상 주입하면 환자에게 거부반응을 일으키며 특히 칼시토닌에 의한 항체 형성과 축적으로 인해 그 후에 계속적으로 주입되는 칼시토닌이 약으로서의 효과를 발휘하지 못하게 된다는 등의 문제점이 있었다[Gennari, First International Workshop, Florence, April 2-3 Elsevier, Amsterdam 1982, P44-48; Hosting, 1982, Ibid. P33-38].

따라서, 칼시토닌을 미생물에서 대량발현시키고, 구조-기능의 관계에 의한 구조적 변경 등을 통하여 인간 치료에 적합한 칼시토닌을 만들기 위한 노력이 있었다[Ivan Ivanov et at., Gene 59, 223-230(1987); Kazuhiro Morimoto, J. Pharmaceutical Sciences 73, 1366-1368(1984); Richard M. Epand et al,, J. Medicinal chemistry 31, 1595-1598(1988)]. 그러나 인간 칼시토닌 자체가 작은 크기의 단백질이므로 세포내에서 분해되는 속도가 너무 빨라 미생물에서의 발현에 의해 단량체의 칼시토닌을 얻기가 쉽지 않았다[Ivan Ivanov et al., Gene 59, 223-230(1987)].

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 연구를 하던 중, 단백질 감미료(prosweet PS)가 효모에서 대량 발현되며 단백질 분해효소의 공격에 강하다는 사실(참조 : 본출원인의 한국 특허출원 제 90-701941 호(공개번호 제 91-700342 호); PCT 국제 출원 번호 PCT/KR89/00013)에 착안하여 인간 칼시토닌 유전자를 단백질 감미료 유전자와 융합시킨 결과, 단백질 분해 효소로부터 보호될 수 있는 재조합 인간 칼시토닌을 효모에서 대량 제조할 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성 하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 인간 칼시토닌 유전자를 단백질 감미료 유전자 뒤에 융합시킴으로써 단독으로는 분해되기 쉬운 인간 칼시토닌을 단백질분해 요소의 공격에 강한 단백질 감미료가 N-말단 쪽에 포함되도록 융합된 재조합 인간 칼시토닌으로 효모에서 대량 발현시키는 데 있다.

본 발명은 단백질 감미료 유전자에 융합된 인간 칼시토닌 유전자, 그의 발현벡터 및 형질전환 미생물 및 단백질 감미료에 융합된 형태의 인간 칼시토닌의 융합 단백질과 그의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

인간 칼시토닌 유전자에 대한 프라이머 1,2,3(hct 1, hct 2, hct 3)을 합성하고 또한 단백질 감미료 유전자(PS)와 결합시키기 위한 PgaP 유전자를 합성한 후 합성된 4 가지 프라이머와 단백질 감미료 유전자를 PCR 반응에 의해, N-말단과 C-말단 각각에 제한효소 Nco I, Sal I 부위를 갖는 단백질 감미료 유전자가 융합된 인간 칼시토닌(PS-HCT) 유전자를 합성하고, 이 유전자와 본 출원인의 한국 특허공고 제 91-458 호의 인간성장 호르몬 발현 벡터[pYLBC-GAP-HGH](KFCC-10668)을 제한효소 Pst I/sal I, Pst I/Nco I 으로 처리한 두 헥산 절편과 융합시켜, Gap 작동유전자-단백질 감미료 유전자에 융합된 인간 칼시토닌-Gap 종료유전자를 갖는 발현벡터[pYLBC G-PS-HCT]를 제조하고, 이 벡터로 효모를 형질 전환시킨 효모 (Saccharomyces cerevisiae DCO4)를 한국 유전자 은행에 1992년 12월 30일자로 기탁하였다(기탁번호 : KCTC O066BP).

본 발명의 재조합 인간 칼시토닌 유전자는 단백질 감미료 유전자 뒤에 인간 칼시토닌 유전자를 연결시켜 줌으로써 효모세포에서 단백질 분해효소 공격에 대해 강하며 대량 발현되는 단백질 감미료 유전자 뒤에 인간 칼시토닌 유전자가 위치함으로 인하여 재조합 인간 칼시토닌을 대량 생산할 수 있도록 한 것이다.

본 발명에서 단백질 감미료 유전자는 본 출원인에 의해 출원된 특허 [PCT/KR89/00013]에 기술된 것이며, 인간 칼시토닌 유전자는 화학합성한 것이다.

이하 본 발명을 각 단계별로 상세히 기술하고자 한다.

먼저 32 개 아미노산의 인간 칼시토닌 유전자를 화학합성하는데 8 번째 아미노산이 메티오닌(Met), 이소류신(Ile), 또는 발린(Val)이 되게끔 하고, 인간 칼시토닌이 활성을 나타내도록 하기 위해 C-말단의 프롤린(Pro)을 α-아미드화 효소에 의해 α-아미드화 시킨다. 이 효소는 Gly 이 Pro 뒤에 있어야 Pro 을 α -아미드화시키므로 33 번째 아미노산으로 Gly 을 더 첨가하며, α-아미드화 효소의 기질인 Gly이 첨가된 인간 칼리토닌을 정교하게 제조하기 위해서 아미노산 배열인 Lys-Lys-Arg 을 C-말단에 더 첨가하여, 카복시펩티다제의 기질로 작용될 수 있도록 한다. 또한, 단백질 감미료 유전자를 증폭시키는데 필요한, Gap 작동 유전자의 3'-말단 염기서열 중 윗가닥의 염기서열 18 개와 같은 염기서열의 Pgap 프라이머를 합성한다.

그후 단백질 감미료 발현벡터[pYGG-MON](PCT/KR89/00013)을 주형으로 하여,한 튜브에는 Pgap과 인간 칼시토닌 프라이머 1(hct 1)을 첨가하고, 다른 튜브에는 프라이머 2,3(hct 2, hct 3)을 함께 넣어 PCR 반응 시켜 두 핵산 생성물을 얻는다. PCR 반응으로 얻어진 두 핵산 생성물을 한 튜브에 넣고 이들을 주형으로 하여 Pgap 과 프라이머-3(hct 3)을 첨가하여 PCR 반응을 실시하여, 제한효소 Nco I, Sal I 부위를 갖는, 단백질 감미료가 융합된 인간 칼시토닌 유전자를 얻은후 이를 Nco I, Sal I으로 절단하여 Nco I-Sal I 절편을 얻는다.

한편 효모 발현벡터[pYLBC GAP-HGH]를 제한효소 Pst I/Sal I, Pst I/Nco I 으로 처리하여 얻은 두 핵산 절편을 준비한 후 이를 상기 Nco I-Sal I 절편과 연결시켜 발현벡터[pYLBC G-PS-HCT]를 얻는다. 상기에서 얻어진 발현백터로 효모 (Saccharomyces cerevisiae DC04)를 형질전환시켜 재조합 효모 (KCTC O066BP)를 만든 후 , 이를 배양하여 단백질 감미료에 융합된 재조합 인간 칼시토닌을 생산한다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명하고자 하며, 이들로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 인간 칼시토닌(HCT) 유전자의 올리고뉴클레오티드의 합성

인간 칼시토닌 유전자 염기서열[Roger K. Craig, Nature 295, 345(1982)]을 효모 세포에서 선택적으로 사용하는 아미노산 코오돈으로 변경하여 전체 유전자를 유전자 합성기[Applied Biosystem, Model 380A, VSA]를 사용하여 포스포아미디트 방법을 실시하여 프라이머 hct-1, hct-2, hct-3 을 화학합성하였다. 또한 인간 칼시토닌 유전자를 PCR 방법으로 단백질 감미료와 융합시키기 위하여 pVGG-MON 의 작동 유전자 부위의 윗가닥과 동일한 염기 배열순서를 갖는 18 염기의 Pgap 프라이 머를 합성하였다. 이들 올리고뉴클레오티드 서열 및 유전자에서의 위치를 제 1 도에 나타내었다.

이 올리고뉴클레오티드는 인간 칼씨토닌의 32 개 아미노산에 해당하는 유전자 코오돈외에 후속 정제 과정중에 CNBR 로 추출하기 위하여 Met 의 유전자 코오돈 ATG 를 인간 칼시토닌 유전자 앞 -1 번 위치에 첨가하였으며, 인간 칼시토닌의 발현율을 높이기 위하여 8 번째 아미노산을 Met, Ile, Val 중 하나가 되게 디자인 했으며, C-말단의 단백질을 α -아미드화시키기 위하여 필요한 Gly 이 더 첨가되도록 하였으며, 또한 카복시펩티다제의 기질로 작용하도록 하기 위한 아미노산인 Lys-Lys-Arg 에 해당하는 코오돈, 2 가지 종결 코오돈 TAA, TAG 및 3'-말단 위치에 제한효소 Sal I 부위, 그리고 5' 말단 부위에서 단백질 감미료와 융합시키기 위한 Kpn I 인식 부위를 시작 코오돈(ATG)위에 첨가하여 전체 177 개의 염기를 합성하였다.

[실시예 2] 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 인간 칼시토닌 유전자와 유비퀴틴 유전자의 연결

단백질 감미료 발현벡터[pYGG-MON] 10ng 에 10㎕ 의 10×Tag 중합효소 완충용액[100mM Tris-HCl(pH 8.3), 500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.1%(W/V)젤라틴]과 10㎕ dNTP's 혼합용액 (각각 2.OmM 의 dGTP, dATP, dTTP, dCTP), 5㎕ 의 hct-1, 5㎕ 의 Pgap, 증류수 68.5㎕ 및 0.5㎕ 의 Tag DNA 중합효소(5u/λ, Boehringer Mannheim, Germany)를 첨가하여 전체 100㎕ 반응용액을 만든후 잘 혼합시켰다.

이때 용액의 증발을 방지하기 위하여 50㎕ 의 미네랄 오일을 반응용액에 첨가하고, 온도순환기(Hybaid, Thermocycler, England)을 사용하여 핵산 증폭반응을 수행하였는데, 온도 순환 프로그램은 94℃ 1분, 40℃ 2분 30초, 55℃ 2분 30초로 5 회, 94℃ 1분 30초, 46℃ 1분 30초, 72℃ 1분 30초로 25 회 반복시키고 마지막으로 75℃ 에서 10분동안 추가반응을 시켰다.

또다른 튜브에는 5㎕ 의 hct 2, 5㎕ 의 hct 3, 10㎕ 10×Tag 중합효소 완충용액, 10㎕ 의 2mM dNTPs, 69.5㎕ 의 증류수, 0.5㎕ 의 Tag DNA 중합효소를 첨가하여 100㎕ 반응용액을 만든후 94℃ 1분, 37℃ 2분, 55℃ 2분으로 2회 반복수행후 94℃ 분, 55℃ 2분, 72℃ 2분으로 4회 반복수행하였다.

증폭된 두 유전자를 7% 폴리아크릴 아미드젤(TBE 완충 용액, 7% 아크릴아미드)에서 전기 영동법으로 분리정제한 후 다음의 중합효소 연결반응에 사용하였다.

분리 정제된 두 유전자 각각을 1㎕ 씩 취한 후 Pgap 5㎕, hct-3 5㎕, 10×Tag 완충용액 10㎕, dNTP's 10㎕, 69㎕ 의 증류수, Tag DNA 중합효소 0.5㎕ 를 가하여 94℃ 1분, 45℃ 1분 30초, 72℃ 1분 30초로 5회, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분으로 25회 증폭 반응을 수행한 결과 연결된 단백질 감미료-인간 칼시토닌 핵산을 얻었다.

상기와 같이 7% 아크릴 아미드젤에서 전기 영동법으로 추출 정제하여 제한효소 Nco I/Sal I 으로 절단하고 이를 M13 계열의 플라스미드에 클로닝하여 메싱등(Messing et al., Method in Enzymology 101: p20, (1983))의 방법으로 염기서열을 확인하였다. 그 뉴클레오티드 서열을 제 1 도에 나타냈으며, M13 계열의 플라스미드에 클로닝된 칼시토닌의 8 번째 아미노산이 Met, Ile 또는 Val 인 각각의 JM103(M13-PS-HCT) 콜로니를 선별하였다.

[실시예 3] 단백질 감미료 융합 인간 칼시토닌 유전자의 효모발현 벡터로의 클로닝 및 상기 벡터로 효모의 형질전환

본 출원인에 출원된 한국 특허공고 제 91-458 호에 기술된 인간 성장 호르몬 발현벡터[pYLBC GAP-HGH]를 제한효소 Pst I/Sal I 과 Pst I/Nco I 으로 절단하여 각각을 1% 아가로스 젤로 전기영동하여 분리정제한 후, 8 번째 아미노산이 Val 인 M13-PS-HCT 를 Nco I/Sal I 으로 절단하여 얻어진 PS-HCT 핵산절편과 T₄DNA 리가제(T₄DAN ligase Boehringermanheim GM)를 이용하여 접합시킨 다음 대장균 HB101(ATCC 33698)를 형질전환시키고 앰피실린-함유 평판 배지에서 선별하였다.

PS-HCT 유전자가 재조합된 대장균 콜로니로부터 알칼리 분해 방법(Alkaline lysis, Birnboim 및 Doly, Nucleic Acid Res. 7, 1513(1979))으로 플라스미드를 추출한 후 제한효소 Nco I/Sal I 으로 절단하여 340 염기쌍의 핵산절편이 분리되는 것을 확인함으로써, 단백질 감미료가 융합된 인간 칼시토닌의 효모발현 벡터인 pYLBC G-PS-HCT(KCTC O066BP, 기탁일 : 92넌 12원 30일)를 얻었다. 이상의 효모발현 벡터로의 클로닝 과정을 요약하여 제 2 도에 도시하였다.

확인한 재조합 플라스미드를 알칼리분해 방법으로 대장균으로부터 대량 추출한 후 이를 이용하여 제임스 방법(James Hill et al., Nucleic Acids Research 19, 5791)에 의해 효모를 형질전환시키기 위해, 밤새 YEPD 2% 배지(1% 효모추출물, 2% 박토펩톤, 2% 글루코스)에 배양한 효모액(Saccharomyces cerevisiae DCO4) 1㎖을 100㎖의 새 YEPD 2% 배지에 접종하고 0.D.(600nm)가 0.8~0.1 될때까지 30℃ 에서 5 시간 정도 진탕 배양하였다. 상기 배양물을 3000rpm에서 3 분간 원심분리하여 얻은 세포 침전물을 10㎖ 의 리튬아세테이트 완충 용액(0.1M C₂H₃0₂Li 2H₂0, 10mM Tris HCl pH 8.0, 1mM EDTA)으로 씻은 다음, 다시 원심분리하여 상층액을 따라내고 침전물에 1㎖ 의 리튬아세테이트 용액을 첨가하여 잘 현탁시켰다. 팰콘 튜브(Falcon tube) 2054 에 100㎕ 의 상기 효모액을 넣고 10㎕ 의 효모 발현 벡터를 첨가한 후 5 분간 상온에서 방치시켰다. 그후 280㎕ PEG 4000 용액(리튬 아세테이트 완충액 중의 50% PEG 4000)을 첨가한 후 30℃ 에서 40분 배양한 후 43㎕ 의 디메틸술폭시드(DMSO)를 가하여 42℃ 에서 5분간 열 쇼크(heat shock)을 준다음 3 초간 30OOrpm 으로 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 200㎕ 의 증류수에 세포침전물을 잘 용해시켜 루이신-결핍 평판 배지(박토아가(Bacto Agar) 20g, 아미노산이 없는 효모 질소염기 6.7g, Leu-공급물 0.25g, 4㎖ 의 5% 트레오닌,

40㎖ 의 50% 글루코스, 820㎖ 의 증류수)에 도말하여 30℃ 에서 4~7 일 간 배양하여 재조합 효모 콜로니를 얻었다.

[실시예 4] 효모에서 융합 칼시토닌의 대량발현 및 SDS-폴리 아크릴아미드 젤 전기영동에 의한 확인

실시예 3 에서 얻어진 융합 인간 칼시토닌 발현벡터로 형질전환시킨 효모균주 사카로마이세스 세러비지에 DCO4[pYLBC G-PS-HCT]을 10㎖ 의 루이신-결핍 배양액(배양액 ℓ당 아미노산이 없는 효모 질소염기(DIFCO, USA) 6.7g, 루이신-결핍 아미노산 혼합물 0.25g 및 5% 글루코스)에서 30℃ 의 온도로 밤새 배양하였다.

그후 20㎖ 의 YEPD 1% 배지 (1% 효모 추출물, 2% 박토펩톤(Bactopeptone), 1% 글루코스)가 든 3개의 250㎖ 플라스크에 상기 배양물 1㎖ 을 각각 접종한 후 30℃ 에서 각각 24시간, 36시간 및 48시간 배양하였다.

O.D.(600nm) 10 을 기준으로 배양액 1㎖ 을 취한 후 원심분리하여 상층액을 버리고 침전된 세포에 TE(pH 8.0, Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM)완충용액 200㎕, 0.45mm 유리 구슬 300㎕ 을 가한 다음 비드 비터(Bead Beater; Bioseptic, USA)로 2 분간 강하게 진탕시켜 세포벽을 파괴하였다. 10㎕ 의 추출물을 램리(Laemmli, Nature 277, 680(1970)) 방법에 따라 15% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 후 코마시 브릴리언트 블루 R25O(Coomasie Brilliant Blue R250)로 염색하고, 그 결과를 제 4 도에 나타내었다.

제 3 도의 제 1 열은 발현벡터를 포함하지 않은 효모의 24 시간 배양후의 샘플이고, 제 2 열은 발현벡터를 포함하지 않은 효모의 36 시간 배양후의 샘플이고, 제 3 열은 사카로마이세스 세레비지에 DCO4[pYLBC G-PS-HCT(8th Met)의 YEPD 배지 에서 0 시간, 제 4 열은 사카로마이세스 세레비지에 DC04[pYLBC G-PS-HCT(8th Met]의 YEPO 배지에서 24 시간, 제 5 열은 사카로마이세스 세레비지에 DCO4[pYLBC G-PS-HCT(8th Met)의 YEPD 배지에서 36 시간, 제 6 열은 사카로마이세스 세레비지에 DCO4[pYLBC G-PS-HCT(8th Ile)]의 YEPD 배지에서 0 시간, 제 7 열은 사카로마이세스 세레비지에 DC04[pYLBC G-PS-HCT (8th Ile)의 YEPD 배지에서 24 시간, 제 8 열은 사카로마이세스 세레비지에 DCO4[pYLBC G-PS-HCT(8th Ile)]의 YEPO 배지에서 36 시간, 제 9 열은 사카로마이세스 세레비지에 DC04[pYLBC G-PS-HCT(8th Val)]의 YEPD 배지에서 0 시간, 제 10 열은 사카로마이세스 세레비지에 DC04[pYLBC G-PS-HCT(8th Val)]의 YEPD 배지에서 24 시간, 제 11 열은 사카로마이세스 세레비지에 DCO4 [pYLBC Q-PS-HCT(8th Val)]의 YEPD 배지에서 36 시간때의 샘플이고, 제 12 열은 표준 분자량 마커로 위에서부터 106K 달톤, 80K 달톤, 49.5K 달톤, 32.5K 달톤, 27.5K 달톤, 18.5K 달톤이다.

제 3 도의 제 9, 10 열에서 재조합 칼시토닌을 함유하지 않은 통상의 효모의 경우(제 1, 2 열)와 달리 13,000 달톤 위치에서 띠를 보여주고 있어 단백질 감미 료가 융합된 칼시토닌임을 확인할 수 있었다.

제 9, 10, 11 열을 서로 비교하여 보면 재조합 칼시토닌도 36 시간에서는 거의 분해됨을 알 수 있으며, 제 3, 6, 9 열로부터 발현율을 비교하면 8 번째 아미노산이 Val 일 경우의 칼시토닌 발현율이 가장 높음을 알 수 있다.

Claims (9)

1. 아미노 말단에 단백질 감미료가 융합되고 8번째 아미노산이 메티오닌(methionine), 이소류신(isoleucine) 및 발린(valine) 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산인 재조합 인간 칼시토닌.
2. 제1항에 있어서, 상기 칼시토닌의 C-말단 아미노산인 프롤린 다음에 글라이신을 추가로 포함하는 재조합 인간 칼시토닌.
3. 제1항 또는 제2항의 재조합 인간 칼시토닌을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 인간 칼시토닌 유전자.
4. 제3항에 있어서, 인간 칼시토닌 유전자의 앞 -1번 위치에 메티오닌(Met)에 해당하는 ATG 코오돈을 가지는 재조합 인간 칼시토닌 유전자.
5. 제3항에 있어서, 하기 뉴클레오티드 서열을 가지는 재조합 인간 칼시토닌 유전자.
6. 제3항의 유전자를 함유하는 발현 벡터.
7. 제6항에 있어서, 발현벡터 pYLBC G-PS HCT(KCTC 0066BP).
8. 제6항 또는 제7항의 발현벡터로 형질전환된 효모 균주.
9. 제8항의 효모 균주를 배양하여 아미노 말단에 단백질 감미료가 융합되고 8번째 아미노산이 메티오닌(methionine), 이소류신(isoleucine) 및 발린(valine)중에서 선택된 어느 하나의 아미노산인 재조합 인간 칼시토닌을 제조하는 방법.