CN105601720B - 一种可有效提高蛋白分泌表达效率的信号肽及其应用 - Google Patents
一种可有效提高蛋白分泌表达效率的信号肽及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105601720B CN105601720B CN201610142029.2A CN201610142029A CN105601720B CN 105601720 B CN105601720 B CN 105601720B CN 201610142029 A CN201610142029 A CN 201610142029A CN 105601720 B CN105601720 B CN 105601720B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phospholipase
- signal peptide
- secreting
- expressing
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 60
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 47
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 108090000553 Phospholipase D Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 102000011420 Phospholipase D Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 37
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 18
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000032895 transmembrane transport Effects 0.000 description 2
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PKYCWFICOKSIHZ-UHFFFAOYSA-N 1-(3,7-dihydroxyphenoxazin-10-yl)ethanone Chemical compound OC1=CC=C2N(C(=O)C)C3=CC=C(O)C=C3OC2=C1 PKYCWFICOKSIHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 3-[[oxo(pyridin-4-yl)methyl]hydrazo]-N-(phenylmethyl)propanamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNC(=O)CCNNC(=O)C1=CC=NC=C1 NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108010000659 Choline oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 229940031098 ethanolamine Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- -1 phospho Chemical class 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000037317 transdermal delivery Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
- C12Y301/04004—Phospholipase D (3.1.4.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种介导蛋白质分泌表达的信号肽，属于蛋白质工程和基因工程领域。通过对已知的信号肽PelB和OmpA进行改造，其N端具有信号肽OmpA的前三个氨基酸残基MKK；C端具有信号肽OmpA的后三个氨基酸残基AQA；而中间的疏水结构则是信号肽PelB的疏水序列LLPTAAAGLLLLAAQP。本发明所述的可有效提高蛋白分泌效率的信号肽，使用后显著的提高了菌株的对目的蛋白的分泌表达能力，本发明中可将目标蛋白磷脂酶D的胞外酶活提高2倍，改造后的菌株胞外产酶能力显著提高，更利于工业化应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可有效提高蛋白分泌表达效率的信号肽及其应用。
背景技术
磷脂酶D(EC3.1.4.4)是一种特殊的酯类水解酶，它能催化水解磷脂分子中的磷酸和有机碱(如胆碱，乙醇胺等)羟基成酯的键，即4倍磷脂键。除水解作用外，在特定条件下还能催化各种含羟基的化合物结合到磷脂的碱基上，形成新的磷脂，这一特性被称为磷脂酶D的磷脂转移特性，也通常称作碱基交换反应。利用这一特性可以对磷脂进行改性，从而制备高纯度的单一磷脂和稀有磷脂，具有十分重要的研究价值。
但是磷脂酶D在自然界生物体中的含量往往极低，切提取工艺复杂，因此研究人员利用微生物易培养，成本低等特点，对微生物产磷脂酶D进行了广泛的研究。大肠杆菌更是成为了磷脂酶D高效表达的一个重要的宿主菌。
在大肠杆菌中目的蛋白原则上可以被以下几种方式生产：1，可溶性蛋白的胞内生产；2，包涵体蛋白的胞内生产；3，分泌至周质空间或直接至胞外培养基中。胞内生产可溶性蛋白时，要想获得目的蛋白，往往需要进行超声破碎，然后对目的蛋白进行纯化，操作工艺十分的复杂。并且由于大肠杆菌是原核生物，其胞内缺乏蛋白折叠过程中的相关辅因子，因此当目的蛋白在其胞内大量表达时往往容易形成包涵体沉淀，这更加加大了对目的蛋白进行处理的难度。但是如果目的蛋白能过跨过内膜而定位于周质空间，或者直接分泌到胞外，这将会极大的简化下游复性及分离纯化工艺，减少目的蛋白对宿主菌的毒性，显著提高表达量。
在大肠杆菌中实现目的蛋白的分泌表达要借助信号肽的介导。信号肽是一类具有15-60氨基酸的多肽，一般定位于分泌蛋白的N端。利用信号肽实现目的蛋白的分泌表达一般是将编码目的蛋白的基因序列克隆到信号肽序列的后端，从而在宿主菌中实现目的基因和信号肽序列在转录和翻译水平的融合。信号肽引导整个多肽链与胞内分子伴侣或者分泌信号识别位点相结合，进而跨膜转运至胞外。
虽然大肠杆菌的分泌表达已经得到了广泛关注，信号肽的种类也比较多，但是这些信号肽序列在用于在大肠杆菌中表达磷脂酶D时，没有能取得较好的技术效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种可有效提高蛋白分泌表达效率的信号肽序列。
本发明还要解决的技术问题是，提供上述信号肽在蛋白分泌表达中的应用。
本发明还要解决的技术问题是，提供一株分泌表达磷脂酶D的大肠杆菌基因工程菌。
本发明最后要解决的技术问题是，提供上述分泌表达磷脂酶D的大肠杆菌基因工程菌的构建方法及应用。
技术方案：一种介导蛋白质分泌表达的信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
编码权上述介导蛋白质分泌表达的信号肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
上述介导蛋白质分泌表达的信号肽在提高蛋白分泌表达效率中的应用。
一株分泌表达磷脂酶D的基因工程菌，它是在磷脂酶D基因的5’端克隆了SEQ IDNO：2所示核苷酸序列。
其中，所述的磷脂酶D基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
上述分泌表达磷脂酶D的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)将SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列克隆到表达质粒中，其中，SEQID NO：2位于SEQ ID NO：3的5’端，得到重组质粒；
(2)将重组质粒转化宿主菌，得到分泌表达磷脂酶D的基因工程菌。
步骤(1)中，所述的表达质粒为pET-28a。
步骤(1)中，所述的宿主菌为大肠杆菌Rosetta。
上述分泌表达磷脂酶D的基因工程菌在生产磷脂酶D中的应用。
具体的重组菌的构建方法如下：
(1)提取大肠杆菌BL21的基因组；
(2)PCR扩增磷脂酶D目的基因：
引物如下：
上游引物p1:5’-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGatgttgtcaaaatttaag；
下游引物p2:5’-TTGTCGACGGAGCTCGAATTCATACAGGATTCGGCTAAT。
将pET-28质粒双酶切线性化处理，并纯化回收。PCR产物和线性化的质粒用一步克隆的方法做连接反应，构建重组质粒pET-28a-PLD。然后用NcoI内切酶处理pET-28a-PLD。最后将合成的信号肽序列和线性化pET-28a-PLD用一步克隆的方法做连接反应，构建最终的质粒pET-28a-sp-PLD。
本发明所提供的信号肽核苷酸序列如SEQ ID N0：2所示，其是对信号肽PelB(SEQID N0：4)和OmpA(SEQ ID N0：5)两个信号肽进行改造而得来。该信号肽的N端使用的是信号肽OmpA的前三个氨基酸残疾MKK，中间的序列为PelB的强疏水序列LLPTAAAGLLLLAAQP，C端使用的是OmpA的后三个氨基酸残基AQA。
该信号肽主要功能是提高目的蛋白在大肠杆菌中得分泌表达，由于OmpA是大肠杆菌细胞自身的信号肽，因此再设计过程中用其极性头部MKK作为新型融合信号肽的头部，可以更加有效的识别大肠杆菌细胞膜上的信号肽结合位点，继而提高目的蛋白同细胞膜的结合能力。而PelB作为现在广泛应用的信号肽，其中间疏水序列LLPTAAAGLLLLAAQP具有相当强的疏水性，可以有效的协助目的蛋白在跨膜运输的过程中进行折叠，大大提高转运效率。最后，C端序列AQA来自于信号肽OmpA，它的应用可以有效的让大肠杆菌自身的信号肽酶在蛋白跨膜转运完成后识别到信号肽酶切位点，进而切割掉目的蛋白N端的信号肽序列，得到目的蛋白。
有益效果：
1、本发明提供一种将PelB和OmpA融合在一起的信号肽，该信号肽能顺利将蛋白质跨膜转运至胞外。
2、利用本发明提供的信号肽分泌表达磷脂酶D，发酵液中磷脂酶D的浓度为0.23g/L，酶活为1600U/L。
3、利用本发明提供的信号肽分泌表达的磷脂酶D比活为7.0U/mg，在不改变磷脂酶D酶活的情况下，大大提高了其分泌效率。
附图说明
图1为磷脂酶D基因PCR琼脂糖电泳图；泳道1中Maker依次为5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100；泳道2～5为磷脂酶D基因。
图2为磷脂酶D分泌表达发酵液上清蛋白电泳图；泳道1为无信号肽对照组，2-5为实验组发酵液上清中磷脂酶D蛋白。
图3为发酵液中磷脂酶D的浓度及酶活；1为无信号肽对照组，2为OmpA实验组，3为PelB实验组，4为新型信号肽OmpA’实验组。
图4为构建重组pET-28a-sp-PLD质粒图谱。
图5为不同IPTG浓度对磷脂酶D分泌表达的影响；1-4分别为IPTG终浓度0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM。
图6为不同温度对磷脂酶D分泌表达的影响；1-6分别为温度24℃，26℃，28℃，30℃，32℃，34℃。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:一种新型信号肽
本发明中所提供的的信号肽其核苷酸序列如SEQ ID N0：2所示，其是对信号肽PelB(SEQ ID N0：4)和OmpA(SEQ ID N0：5)两个信号肽进行改造而得来。该信号肽的N端使用的是信号肽OmpA的前三个氨基酸残疾MKK，中间的序列为PelB的强疏水序列LLPTAAAGLLLLAAQP，C端使用的是OmpA的后三个氨基酸残基AQA。此信号肽序列通过化学合成或PCR的方法获得，经过signalP 3.0对其可用性进行分析。
将此信号肽克隆到载体pET-28a(+)的NcoI酶切位点处，然后将目的基因PLD克隆到此信号肽的C端，目的蛋白表达后分泌性得到有效增强。PLD的分泌量有效提高，达到0.23g/L，PLD胞外酶活也达到1600U/L，相对于原始出发菌种效果明显。
实施例2：磷脂酶D基因的获取。
本发明中使用的目的蛋白为大肠杆菌BL21中的磷脂酶D，通过PCR的方法获得其磷脂酶D的功能基因。
1、大肠杆菌BL21的基因组提取。
1)用1.5ml Tube收集1ml的菌液，12,000rpm离心2分钟，弃上清(细胞培养液)。
2)加入180μl的Buffer GL、20μl的Proteinase K(20mg/ml)和10μl的RNase A(10mg/ml)充分振荡混匀，于56℃水浴温育10分钟，此时溶液应呈透明、澄清状。
3)加入200μl的Buffer GB和200μl的100％乙醇，充分吸打混匀。
4)将Spin Column安装在Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。
5)将500μl的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
6)将700μl的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
7)重复操作步骤3。
8)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2分钟。
9)将Spin Column安置于新的1.5ml离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50～200μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置5分钟。
10)12000rpm离心2分钟洗脱DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到SpinColumn膜的中央或再加入50～200μl的灭菌水或Elution Buffer，室温静置5分钟后，12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。
11)基因组DNA定量。提取得到的基因组DNA通过核酸电泳进行定量。
2、引物设计及PCR获得磷脂酶D基因。
1)PCR扩增磷脂酶D目的基因：参照数据库中的磷脂酶D的基因序列设计引物如下：
上游引物p1:5’-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGatgttgtcaaaatttaag；
下游引物p2:5’-TTGTCGACGGAGCTCGAATTCATACAGGATTCGGCTAAT。
以提取的大肠杆菌BL21的基因组为模板，PCR条件为：95℃预变性3min；98℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸1min30s，反应35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用DNA纯化试剂盒回收。
实施例3：磷脂酶D分泌表达菌株的构建诱导表达。
1、重组质粒的构建及转化。
首先，对质粒pET-28a用EcoRI和NdeI进行双酶切线性化处理，并纯化回收。PCR产物和线性化的质粒用一步克隆的方法做连接反应，体系如下：PCR纯化产物2ul，线性化pET-28a质粒4ul，CE buffer 4ul，ExnaseⅡ2ul，去离子水8ul，于37℃下反应30分钟，构建重组质粒pET-28a-PLD。然后用NcoI内切酶处理上述质粒pET-28a-PLD。最后将合成的信号肽序列和线性化pET-28a-PLD用一步克隆的方法做连接反应，构建最终的质粒pET-28a-sp-PLD(图4)。送金维智测序。
2、重组菌的诱导表达。
将上述构建的分泌表达质粒pET-28a-sp-PLD转入大肠杆菌Rosetta菌株，通过卡那霉素和氯霉素双抗平板筛选转化子，最后做PCR验证，重组质粒确实转入Rosetta中。重组菌接种到含有双抗的LB培养基中，37℃，培养12h进行活化。按3％接种量把上述菌液接种到双抗性的100mlTB培养基中，37℃培养2小时，待OD长至0.6-0.8，加入100ul 0.8mM的IPTG进行诱导，30℃条件下培养24小时。发酵结束后，离心取上清液进行SDS-PAGE电泳(图2)，用考马斯亮蓝法测定样品中的蛋白浓度。测得发酵液上清中的蛋白浓度为0.22g/L，磷脂酶D的酶活为1580U/L(图3)。对照组胞外磷脂酶D酶活：无信号肽，OmpA和PelB分别为150U/L，450U/L和320U/L，融合信号肽显著提高了胞外酶活。同时三个对照组发酵液上清中的蛋白浓度分别为0.02g/L，0.07g/L，0.06g/L，由此可见融合信号肽在提高磷脂酶D胞外酶活的同时也大大提高了其胞外产量。
实施例4：不同IPTG浓度对磷脂酶D分泌表达的影响
根据实施例3研究所述，新型融合信号肽OmpA’相对于其他实验组，能够更好地介导磷脂酶D进行分泌表达。我们进一步对IPTG浓度对诱导磷脂酶D分泌表达的条件进行研究。重组菌接种到含有双抗的LB培养基中，37℃，培养12h进行活化。按3％接种量把上述菌液接种到双抗性的100mlTB培养基中，37℃培养2小时，待OD长至0.6-0.8，加入终浓度为0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM的IPTG进行诱导，30℃条件下培养24小时，测定磷脂酶D的酶活。用考马斯亮蓝法测定发酵液上清中的中的蛋白浓度。测得发酵液上清中的蛋白浓度分别为为0.11g/L，0.23g/L，0.21g/L，0.22g/L，磷脂酶D的酶活分别为700U/L，1600U/L，1480U/L，1580U/L，见图5。由此可见融合信号肽介导的重组磷脂酶D在IPTG浓度为0.4mM的条件下即可成功的进行分泌表达，且酶活比较稳定。
实施例5：不同温度对磷脂酶D分泌表达的影响
在重组菌培养过程中，温度高有利于菌体生长，但是会影响重组蛋白的折叠易于形成包涵体；而较低的温度虽然有利于蛋白表达过程中的折叠，但是会抑制菌体的生长，从而引起目的蛋白表达量的不足。因此，对其最适表达温度进行研究很重要。在本研究中我们按照上述实施例的方法对重组菌进行活化，待OD长至0.6-0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG诱导，分六组分别在温度24℃，26℃，28℃，30℃，32℃，34℃条件下进行培养。发酵24小时后，测定发酵液上清中磷脂酶D的酶活和蛋白浓度。结果见图6，在28℃条件下磷脂酶D的胞外酶活为1610U/L，蛋白浓度为0.23g/L。此结果相对于24℃，26℃提高明显，但是跟30℃，32℃的结果并无太大差别，故我们选定28℃为最佳培养温度。
实施例6：磷脂酶D胞外酶活的测定原理。
磷脂酶D的活性采用酶联比色法进行测定。因为磷脂酶D可以催化卵磷脂水解生成胆碱，胆碱在胆碱氧化酶的作用下可生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下在Amplex Red的作用下生成试卤灵(Resorufin)；最后通过荧光酶标仪测定荧光强度，通过荧光强度高低反应PA含量多少，间接反应了PLD的活性，激发波长为540nm,发射波长为590nm。具体步骤见Thermo Fisher Scientific公司的磷脂酶D酶活检测试剂盒RedPhospholipase D Assay Kit(A12219)说明。
Claims (9)
1.一种介导蛋白质分泌表达的信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.编码权利要求1所述介导蛋白质分泌表达的信号肽的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
3.权利要求1所述介导蛋白质分泌表达的信号肽在提高蛋白分泌表达效率中的应用；所述的蛋白为磷脂酶D。
4.一株分泌表达磷脂酶D的基因工程菌，其特征在于，它是在磷脂酶D基因的5’端克隆了SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述的分泌表达磷脂酶D的基因工程菌，其特征在于，所述的磷脂酶D基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
6.权利要求5所述分泌表达磷脂酶D的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 将SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列克隆到表达质粒中，其中，SEQ IDNO：2位于SEQ ID NO：3的5’端，得到重组质粒；
(2) 将重组质粒转化宿主菌，得到分泌表达磷脂酶D的基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的分泌表达磷脂酶D的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的表达质粒为pET-28a。
8.根据权利要求6所述的分泌表达磷脂酶D的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的宿主菌为大肠杆菌Rosetta。
9.权利要求4所述的分泌表达磷脂酶D的基因工程菌在生产磷脂酶D中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610142029.2A CN105601720B (zh) | 2016-03-11 | 2016-03-11 | 一种可有效提高蛋白分泌表达效率的信号肽及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610142029.2A CN105601720B (zh) | 2016-03-11 | 2016-03-11 | 一种可有效提高蛋白分泌表达效率的信号肽及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105601720A CN105601720A (zh) | 2016-05-25 |
| CN105601720B true CN105601720B (zh) | 2019-04-30 |
Family
ID=55982130
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610142029.2A Active CN105601720B (zh) | 2016-03-11 | 2016-03-11 | 一种可有效提高蛋白分泌表达效率的信号肽及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105601720B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107200772B (zh) * | 2017-05-10 | 2020-05-19 | 江西省科学院微生物研究所 | 一种优化角蛋白酶Ker高效分泌表达的信号肽及其应用 |
| CN107022005B (zh) * | 2017-05-18 | 2020-02-14 | 江南大学 | 一种提高蛋白分泌效率的信号肽突变体及其应用 |
| CN107082801B (zh) * | 2017-05-18 | 2019-12-24 | 江南大学 | 一种提高蛋白分泌效率的pelB信号肽突变体及其应用 |
| CN107857801B (zh) * | 2017-10-23 | 2020-09-22 | 华南理工大学 | 一种可用于提高分泌效率的信号肽及其应用 |
| CN107698666A (zh) * | 2017-10-23 | 2018-02-16 | 华南理工大学 | 一种可有效提高分泌的信号肽及其应用 |
| CN109402037A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-03-01 | 深伦生物科技（深圳）有限公司 | 一种用于pet塑料降解的基因工程菌 |
| CN114921449B (zh) * | 2022-05-23 | 2023-10-10 | 晟明生物技术(郑州)有限公司 | 一种组织蛋白酶k的制备方法 |
-
2016
- 2016-03-11 CN CN201610142029.2A patent/CN105601720B/zh active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 信号肽及其在蛋白质表达中的应用;韦雪芳 等;《生物技术通报》;20061226(第6期);38-42 |
| 信号肽序列及其在蛋白质表达中的应用;郑斌 等;《生物技术通讯》;20050630;296-298 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105601720A (zh) | 2016-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105601720B (zh) | 一种可有效提高蛋白分泌表达效率的信号肽及其应用 | |
| Chien et al. | Solar-to-bioH2 production enhanced by homologous overexpression of hydrogenase in green alga Chlorella sp. DT | |
| CN113564171B (zh) | 一种提高多肽可溶性表达产量的方法 | |
| CN115011616B (zh) | 一种乙醛脱氢酶基因rkaldh及其应用 | |
| CN110607319A (zh) | 一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用 | |
| US20240002453A1 (en) | Compositions and methods using methanotrophic s-layer proteins for expression of heterologous proteins | |
| Gicana et al. | Valorization of fish waste and sugarcane bagasse for Alcalase production by Bacillus megaterium via a circular bioeconomy model | |
| CN108998458B (zh) | 重组人胰岛素的制备方法 | |
| CN110283797B (zh) | 一种酪氨酸酶及其基因、工程菌和制备方法 | |
| CN107674119A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌可有效提高分泌的信号肽及其应用 | |
| KR20160078068A (ko) | 목적 단백질의 정제용 폴리펩타이드 및 이의 용도 | |
| KR100803095B1 (ko) | 바실러스 서브틸리스 ｃｈ２ 유래의 키토산아제를 코딩하는유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로형질전환된 형질전환체 및 이로부터 생산되는 단백질의정제방법 | |
| CN110066814B (zh) | β-D-葡萄糖苷酶基因及其编码蛋白 | |
| CN114292321B (zh) | 可溶性表达eg95蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN116790538B (zh) | 一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用 | |
| CN108753802A (zh) | 一个苹果酸脱氢酶基因cimdh1及其重组表达载体 | |
| CN117402860B (zh) | 一种链霉菌胰蛋白酶突变体及其应用 | |
| CN107698668A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌可提高分泌效率的信号肽及其应用 | |
| CN116769756B (zh) | Pg2-lc蛋白作为snap-25的水解酶的应用 | |
| CN113151227B (zh) | 一种蛋白酶基因及其异源表达 | |
| KR101891234B1 (ko) | 신규 프로테아제 | |
| CN111434693B (zh) | 一种抗氧化融合蛋白及应用 | |
| CN105861406A (zh) | 用于植物表达重组人血白蛋白基因的转基因农杆菌株 | |
| KR102083009B1 (ko) | Ａｂｃ 트랜스포터를 통한 아라자임 분비 재조합 균주 및 이를 이용한 아라자임 생산방법 | |
| CN117821416A (zh) | 一种胞苷激酶突变体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |