CN114921449B

CN114921449B - 一种组织蛋白酶k的制备方法

Info

Publication number: CN114921449B
Application number: CN202210561354.8A
Authority: CN
Inventors: 张静静; 王斌; 安文琪; 邢体坤; 宋路萍
Original assignee: Shengming Biotechnology Zhengzhou Co ltd
Current assignee: Shengming Biotechnology Zhengzhou Co ltd
Priority date: 2022-05-23
Filing date: 2022-05-23
Publication date: 2023-10-10
Anticipated expiration: 2042-05-23
Also published as: CN114921449A

Abstract

本发明公开了一种组织蛋白酶K的制备方法。所述方法包括如下步骤：使融合蛋白的编码基因在宿主菌或宿主细胞中进行表达，得到所述组织蛋白酶K；所述融合蛋白为将PelB信号肽融合于组织蛋白酶K的N端后所得。本发明基于原核表达系统采用四种不同信号肽DsbA、OmpA、PelB和STII制备组织蛋白酶K，并通过对组织蛋白酶K表达量进行分析发现：PelB信号肽可以高效引导组织蛋白酶K分泌至周质空间，其表达量显著高于其它信号肽，是组织蛋白酶K周质空间分泌表达的最佳信号肽，不仅在组织蛋白酶K制品的表达和制备中具有良好的应用前景，还对开发组织蛋白酶K的单克隆抗体或小分子抑制剂及治疗骨质疏松症的药物研发具有重要意义。

Description

一种组织蛋白酶K的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种组织蛋白酶K的制备方法。

背景技术

组织蛋白酶是一种广泛存在于溶酶体中的蛋白质水解酶，具有维持细胞内动态平衡的作用。根据组织蛋白酶活性中心氨基酸残基分为半胱氨酸蛋白酶家族(组织蛋白酶B、C、F、H、K、L、O、S、V、X和W)，天门冬氨酸(组织蛋白酶D和E)和丝氨酸类蛋白酶(组织蛋白酶A和G)。其中，组织蛋白酶K(Cathepsin K，CTSK)参与分解骨骼组织中多种蛋白质，包括I型胶原蛋白、骨桥蛋白和骨结合素等，对于调节骨平衡具有重要的意义。

骨质疏松症是在骨代谢过程中骨吸收大于骨形成导致的一种常见老年多发疾病。骨吸收过程中，破骨细胞首先附着于骨骼表面，形成相对封闭的骨吸收环境，分泌质子和蛋白水解酶，先溶解骨矿物质，继而降解骨基质，导致骨空洞形成。在溶骨过程中，发挥主要作用的就是组织蛋白酶中的组织蛋白酶K(CTSK)。因此，开发组织蛋白酶K(CTSK)的单克隆抗体或抑制剂，可能成为治疗骨质疏松症的途径。但目前关于组织蛋白酶K(CTSK)表达与制备的报道较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织蛋白酶K的制备方法。

为了实现上述目的，本发明首先提供了PelB信号肽的新用途。

本发明提供了PelB信号肽在如下A1)-A4)中任一种中的应用：

A1)制备组织蛋白酶K或其融合蛋白；

A2)提高组织蛋白酶K或其融合蛋白表达量或产量；

A3)制备组织蛋白酶K检测产品；

A4)开发或筛选组织蛋白酶K靶点药物；

所述PelB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

与所述PelB信号肽相关的生物材料在如下A1)-A4)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：

A1)制备组织蛋白酶K或其融合蛋白；

A2)提高组织蛋白酶K或其融合蛋白表达量或产量；

A3)制备组织蛋白酶K检测产品；

A4)开发或筛选组织蛋白酶K靶点药物；

与所述PelB信号肽相关的生物材料为所述PelB信号肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系。

所述PelB信号肽的编码基因为如下(a1)-(a3)中任一种：

(a1)SEQ ID No.5第7-69位所示的DNA分子；

(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码上述PelB信号肽的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有75％以上同一性且编码上述PelB信号肽的DNA分子。

为了实现上述目的，本发明又提供了一种融合蛋白。

本发明提供的融合蛋白为将上述PelB信号肽融合于组织蛋白酶K的N端后所得。

与所述融合蛋白相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

与所述融合蛋白相关的生物材料为所述融合蛋白的编码基因或含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系。

所述融合蛋白的编码基因为如下(b1)-(b3)中任一种：

(b1)SEQ ID No.5第7-867位所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码上述融合蛋白的DNA分子；

(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有75％以上同一性且编码上述融合蛋白的DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的PelB信号肽编码基因或融合蛋白的编码基因进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的PelB信号肽编码基因或融合蛋白的编码基因75％或者更高同一性的基因序列，只要编码PelB信号肽或融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的序列并且等同于本发明的序列。

上述任一所述编码基因中，所述同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对核苷酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述任一所述编码基因中，所述75％以上的同一性可为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述任一所述编码基因中，所述严格条件可为在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min；或在0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述任一所述生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主菌或宿主细胞中表达组织蛋白酶K或上述融合蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组载体可为含有组织蛋白酶K的编码基因或上述融合蛋白的编码基因的表达载体。在本发明的具体实施例中，所述重组载体可为在pET26b表达质粒的NdeI和XhoI酶切位点之间插入SEQ ID No.5所示DNA片段后得到的重组质粒pET26b-PelB-CTSK。

所述重组菌可为含有上述编码基因或上述表达盒或上述重组载体的真菌或细菌。所述真菌可为酵母。所述细菌可为大肠杆菌，具体可为携带DE3基因型的大肠杆菌。

在本发明的具体实施例中，所述重组菌为含有上述重组质粒pET26b-PelB-CTSK的BL21(DE3)大肠杆菌。

所述重组细胞系可为含有上述编码基因或上述表达盒或上述重组载体的原核生物细胞或真核生物细胞。所述真核生物细胞可为酵母细胞、HEK293细胞、CHO细胞或昆虫细胞。所述原核生物细胞可为细菌细胞，具体可为携带DE3基因型的大肠杆菌细胞。在本发明的具体实施例中，所述重组细胞系为含有上述重组质粒pET26b-PelB-CTSK的BL21(DE3)大肠杆菌细胞。

上述融合蛋白或与上述融合蛋白相关的生物材料在如下A1)-A4)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：

A1)制备组织蛋白酶K或其融合蛋白；

A2)提高组织蛋白酶K或其融合蛋白表达量或产量；

A3)制备组织蛋白酶K检测产品；

A4)开发或筛选组织蛋白酶K靶点药物。

上述任一所述应用中，所述提高组织蛋白酶K或其融合蛋白表达量或产量为提高组织蛋白酶K或其融合蛋白在宿主菌或宿主细胞中的表达量或产量。

所述宿主菌可为真菌或细菌。所述真菌可为酵母。所述细菌可为大肠杆菌，具体可为携带DE3基因型的大肠杆菌。在本发明的具体实施例中，所述宿主菌为BL21(DE3)大肠杆菌。

所述宿主细胞可为原核生物细胞或真核生物细胞。所述真核生物细胞可为酵母细胞、HEK293细胞、CHO细胞或昆虫细胞。所述原核生物细胞可为细菌细胞，具体可为携带DE3基因型的大肠杆菌细胞。在本发明中的具体实施例中，所述宿主细胞为BL21(DE3)大肠杆菌细胞。

上述任一所述应用中，所述“组织蛋白酶K检测产品”可为本发明制备的组织蛋白酶K。本发明制备的组织蛋白酶K可作为组织蛋白酶K标准品，用于组织蛋白酶K检测中的标准曲线绘制，进而实现组织蛋白酶K检测。

所述“组织蛋白酶K检测产品”还可为以本发明制备的组织蛋白酶K为材料制备得到的组织蛋白酶K抗体。该组织蛋白酶K抗体作为组织蛋白酶K检测抗体可用于以免疫法(如ELISA，免疫组化等)为基础的组织蛋白酶K检测方法中，进而实现组织蛋白酶K检测。

上述任一所述应用中，所述“组织蛋白酶K靶点药物”可为以本发明制备的组织蛋白酶K为材料制备得到的组织蛋白酶K抗体，具体可为组织蛋白酶K的单克隆抗体。

所述“组织蛋白酶K靶点药物”还可为利用本发明制备的组织蛋白酶K为材料筛选获得的抑制剂，具体可为组织蛋白酶K的小分子抑制剂。

所述药物可为用于预防和/或治疗骨质疏松症的药物。

为了实现上述目的，本发明最后还提供了一种制备组织蛋白酶K的方法。

本发明提供的制备组织蛋白酶K的方法包括如下步骤：使上述融合蛋白的编码基因在宿主菌或宿主细胞中进行表达，得到所述组织蛋白酶K。

上述方法中，所述宿主菌可为真菌或细菌。所述真菌可为酵母。所述细菌可为大肠杆菌，具体可为携带DE3基因型的大肠杆菌。在本发明的具体实施例中，所述宿主菌为BL21(DE3)大肠杆菌。

进一步的，所述方法包括如下步骤：

1)将上述融合蛋白的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；

2)将所述重组菌进行诱导培养，得到诱导菌液；

3)从所述诱导菌液中提取周质空间蛋白，并从所述周质空间蛋白中纯化得到所述组织蛋白酶K。

更进一步的，所述步骤1)中，所述融合蛋白的编码基因通过重组质粒导入宿主菌。所述重组质粒具体为在pET26b表达质粒的NdeI和XhoI酶切位点之间插入SEQ ID No.5所示DNA片段后得到的重组质粒pET26b-PelB-CTSK。

所述步骤2)包括如下步骤：培养(在37℃、180rpm振荡条件下培养)所述重组菌至OD_600nm值为0.6-1.0(或0.6-0.8或0.8-1.0或0.6或0.8或1.0)时，向培养体系中添加0.8-1.2mM(或0.8-1.0mM或1.0-1.2mM或0.8mM或1.0mM或1.2mM)的IPTG进行诱导培养。

所述诱导培养的条件可为在28℃、180rpm振荡培养条件下培养16-24小时(或16-20小时或16小时)。

所述步骤3)中，所述提取周质空间蛋白采用渗透休克法。所述纯化采用镍柱亲合层析。

所述渗透休克法中的高渗溶液包括10％蔗糖溶液、15％蔗糖溶液、20％蔗糖溶液、25％蔗糖溶液、30％蔗糖溶液中的一种。在本发明的具体实施例中，所述渗透休克法中的高渗溶液是将水、蔗糖、EDTA和Tris混匀后得到的溶液，各溶质浓度分别为蔗糖20％、EDTA1mM、Tris 30mM。

所述渗透休克法中的低渗溶液包括1.0mM Mg²⁺溶液、2.5mM Mg²⁺溶液、5.0mM Mg²⁺溶液、10mM Mg²⁺溶液、20mM Mg²⁺溶液的一种。在本发明的具体实施例中，所述渗透休克法中的低渗溶液为5mM MgCl₂溶液(溶剂为水)。

上述任一所述应用或方法中，所述组织蛋白酶K的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述组织蛋白酶K的编码基因序列如SEQ ID No.2所示。

本发明基于原核表达系统采用四种不同信号肽DsbA、OmpA、PelB和STII制备组织蛋白酶K，并通过对组织蛋白酶K表达量进行分析发现：PelB信号肽可以高效引导组织蛋白酶K分泌至周质空间，其表达量显著高于其它信号肽，是组织蛋白酶K周质空间分泌表达的最佳信号肽。本发明提供的利用PelB信号肽制备组织蛋白酶K的方法，经渗透休克法提取周质空间蛋白和亲合层析纯化获得的纯化后蛋白浓度为3.36mg/mL，SDS-PAGE蛋白电泳检测组织蛋白酶K蛋白纯度大于90％。除此之外，本发明的制备方法不经包涵体纯化变性复性，具有纯化工艺简单和生产成本低的优点，不仅在组织蛋白酶K制品的表达和制备中具有良好的应用前景，还对开发组织蛋白酶K(CTSK)的单克隆抗体或小分子抑制剂及治疗骨质疏松症的药物研发具有重要意义。

附图说明

图1为四种不同信号肽引导的组织蛋白酶K(CTSK)表达质粒的酶切鉴定图。其中，1为pET26b-DsbA-CTSK酶切产物；2为pET26b-OmpA-CTSK酶切产物；3为pET26b-PelB-CTSK酶切产物；4为pET26b-STII-CTSK酶切产物。

图2为组织蛋白酶K(CTSK)诱导菌液SDS-PAGE电泳图。箭头标注为组织蛋白酶K对应条带，其中，1为空BL21(DE3)阴性对照菌液；2为pET26b-DsbA-CTSK/BL21(DE3)诱导菌液；3为pET26b-OmpA-CTSK/BL21(DE3)诱导菌液；4为pET26b-PelB-CTSK/BL21(DE3)诱导菌液；5为pET26b-STII-CTSK/BL21(DE3)诱导菌液。

图3为组织蛋白酶K(CTSK)诱导菌液SDS-PAGE电泳图灰度分析图。箭头标注为组织蛋白酶K对应峰图，其中，A为pET26b-DsbA-CTSK/BL21(DE3)诱导菌液；B为pET26b-OmpA-CTSK/BL21(DE3)诱导菌液；C为pET26b-PelB-CTSK/BL21(DE3)诱导菌液；D为pET26b-STII-CTSK/BL21(DE3)诱导菌液。

图4为组织蛋白酶K(CTSK)周质空间提取SDS-PAGE电泳图。箭头标注为组织蛋白酶K对应条带，其中，1为空BL21(DE3)阴性对照菌液；2为pET26b-PelB-CTSK/BL21(DE3)诱导菌液；3为周质空间提取上清；4为纯化后样品。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料，试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的主要试剂及其厂家信息如下：

pET26b表达质粒：Novagen公司；

BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞：生工生物工程(上海)股份有限公司；

NdeI：NEB公司；

XhoI：NEB公司；

Ni-NTA 6FF His标签蛋白纯化试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；

Amicon Ultra-0.5离心过滤装置：Millipore公司；

PBS pH7.4(1×)：Gibco公司；

蛋白marker：Thermo Fisher公司；

Sure PAGE^TM,Bis-Tris,10x8,4-12％,12wells：南京金斯瑞生物科技有限公司；

5×上样缓冲液：南京金斯瑞生物科技有限公司；

凝胶成像系统：Protein Simple公司；

超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；

eStain^TM L1蛋白染色仪：南京金斯瑞生物科技有限公司；

HYG-A全恒温摇瓶柜：太仓市实验设备厂；

DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂；

DYCP-31DN型水平电泳槽：北京市六一仪器厂；

微量移液器：Eppendorf公司。

下述实施例中的组织蛋白酶K的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，组织蛋白酶K的编码基因序列如SEQ ID No.2所示。

实施例1、重组表达质粒构建

1、不同信号肽引导的组织蛋白酶K全长基因序列的合成

委托上海百力格生物技术有限公司分别合成DsbA、OmpA、PelB和STII四种不同信号肽引导的组织蛋白酶K全长基因序列。

DsbA信号肽引导的组织蛋白酶K全长基因序列DsbA-CTSK如SEQ ID No.3所示。

OmpA信号肽引导的组织蛋白酶K全长基因序列OmpA-CTSK如SEQ ID No.4所示。

PelB信号肽引导的组织蛋白酶K全长基因序列PelB-CTSK如SEQ ID No.5所示。

STII信号肽引导的组织蛋白酶K全长基因序列STII-CTSK如SEQ ID No.6所示。

2、重组表达质粒的构建与鉴定

分别将不同信号肽引导的组织蛋白酶K全长基因序列克隆至pUC57质粒，分别得到重组质粒pUC57-DsbA-CTSK、pUC57-OmpA-CTSK、pUC57-PelB-CTSK和pUC57-STII-CTSK。然后使用NdeI和XhoI分别对重组质粒pUC57-DsbA-CTSK、pUC57-OmpA-CTSK、pUC57-PelB-CTSK和pUC57-STII-CTSK进行双酶切，连接克隆至pET26b表达质粒中，分别获得重组表达质粒pET26b-DsbA-CTSK、pET26b-OmpA-CTSK、pET26b-PelB-CTSK和pET26b-STII-CTSK。

(1)酶切鉴定

使用NdeI和XhoI对四个重组表达质粒进行双酶切，酶切鉴定结果如图1所示。由图可见，NdeI和XhoI双酶切后质粒片段大小为5225bp，目的片段大小约为715bp，鉴定结果符合预期。

(2)测序鉴定

分别对重组表达质粒进行测序验证，测序结果表明：

重组表达质粒pET26b-DsbA-CTSK为在pET26b表达质粒的酶切位点NdeI和XhoI之间插入SEQ ID No.3所示DNA片段后得到的重组质粒。SEQ ID No.3第1-6位为NdeI酶切位点，第7-60位为DsbA信号肽的编码基因，第67-705位组织蛋白酶K的编码基因，第706-711位为XhoI酶切位点。

重组表达质粒pET26b-OmpA-CTSK为在pET26b表达质粒的酶切位点NdeI和XhoI之间插入SEQ ID No.4所示DNA片段后得到的重组质粒。SEQ ID No.4的第1-6位为NdeI酶切位点，第7-66位为OmpA信号肽的编码基因，第67-711位为组织蛋白酶K的编码基因，第712-717位为XhoI酶切位点。

重组表达质粒pET26b-PelB-CTSK为在pET26b表达质粒的酶切位点NdeI和XhoI之间插入SEQ ID No.5所示DNA片段后得到的重组质粒。SEQ ID No.5的第1-6位为NdeI酶切位点，第7-69位为PelB信号肽的编码基因，第70-714位为组织蛋白酶K的编码基因，第715-720位为XhoI酶切位点。

重组表达质粒pET26b-STII-CTSK为在pET26b表达质粒的酶切位点NdeI和XhoI之间插入SEQ ID No.6所示DNA片段后得到的重组质粒。SEQ ID No.6的第1-6位为NdeI酶切位点，第7-72位为STII信号肽的编码基因，第73-717位为组织蛋白酶K的编码基因，第718-723位为XhoI酶切位点。

实施例2、蛋白表达

1、重组菌的构建

分别将实施例1构建的四个重组表达质粒pET26b-DsbA-CTSK，pET26b-OmpA-CTSK，pET26b-PelB-CTSK和pET26b-STII-CTSK转化BL21(DE3)宿主细胞，分别得到重组菌pET26b-DsbA-CTSK/BL21(DE3)，pET26b-OmpA-CTSK/BL21(DE3)，pET26b-PelB-CTSK/BL21(DE3)和pET26b-STII-CTSK/BL21(DE3)。

转化具体操作步骤如下：

(1)超低温冰箱中取BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，冰上解冻；

(2)取1μL质粒加入50μL BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，冰上静置30分钟；

(3)42℃热激90秒，立即冰上静置2分钟；

(4)在800μL LB液体培养基中在37℃摇床180rpm振荡培养条件下培养1小时；

(5)于超净工作台中取适量菌液均匀涂布在LB固体培养板上，倒置培养过夜，次日取出备用。

2、诱导表达

分别挑单克隆接种至5mL LB卡那抗性培养基(无抗性空细胞为阴性)中，在37℃摇床180rpm振荡培养条件下培养至OD_600nm值约为0.8，然后加入1mM IPTG在28℃摇床180rpm振荡培养条件下诱导培养16小时，得到诱导菌液。将诱导菌液进行SDS-PAGE电泳。

SDS-PAGE电泳具体操作步骤如下：

(1)全菌样品处理：取100μL诱导菌液，1000g离心1min，弃上清液，收集菌体，并用40μL PBS溶液重悬菌体，得到菌悬液。然后向菌悬液中加入10μL 5×Sample Buffer上样缓冲液(金斯瑞)，混匀100℃处理10min，10000g离心1min，上样5μL；

(2)150V进行SDS-PAGE电泳1小时；

(3)eStain^TM L1蛋白染色仪染色3个循环，脱色一个循环染色；

(4)凝胶成像系统拍照，记录实验结果。

周质空间分泌表达结果显示：重组表达质粒pET26b-DsbA-CTSK和pET26b-OmpA-CTSK几乎无目的蛋白表达，而重组表达质粒pET26b-PelB-CTSK和pET26b-STII-CTSK均可表达得到目的蛋白。说明OmpA和DsbA两个信号肽均无法引导组织蛋白酶K在宿主细胞中分泌表达，而PelB和STII两个信号肽可以引导组织蛋白酶K在宿主细胞中分泌表达。其中PelB信号肽引导组织蛋白酶K在宿主细胞中的表达量最高，STII信号肽次之。

实施例3、蛋白表达量灰度分析

采用Image J软件进行实施例2中SDS蛋白电泳图灰度分析，分别计算不同信号肽引导的重组表达质粒中的目标蛋白表达量占总蛋白百分比。操作步骤为Image→Type→32-Bit转化为灰度图；Process→Subtract Background→OK去除背景色；矩形工具选择泳道→Analyze→Gel→Select First Lane确定分析泳道，重复选择多条泳道同时分析；Analyze→Gel→Plot Lane生成峰面积；线性工具选择目标条带对应峰图，Wand工具计算对应峰图面积，通过“{箭头峰图面积/总蛋白峰图面积}×100％”即可求得目标蛋白表达量占总蛋白百分比。

结果如图3所示。含有DsbA信号肽的重组表达质粒中的目标蛋白表达量占总蛋白百分比为2.3％；含有OmpA信号肽的重组表达质粒中的目标蛋白表达量占总蛋白百分比为2.4％；含有PelB信号肽的重组表达质粒中的目标蛋白表达量占总蛋白百分比为23.4％；含有STII信号肽的重组表达质粒中的目标蛋白表达量占总蛋白百分比为9.4％。与实施例2结论一致。

实施例4、组织蛋白酶K蛋白的制备与纯化

综合实施例3实验结果，采用实施例1构建的重组表达质粒pET26b-PelB-CTSK进行组织蛋白酶K的制备与纯化。具体步骤如下：

1、诱导表达

将实施例1构建的重组表达质粒pET26b-PelB-CTSK转化BL21(DE3)宿主细胞，得到重组菌pET26b-PelB-CTSK/BL21(DE3)。挑单克隆接种至5mL LB卡那抗性培养基，在37℃，180rpm条件下过夜培养。次日按照1：100比例扩大培养至100mL，摇菌至OD_600nm值约为0.8，加入1mM IPTG在28℃摇床180rpm振荡培养条件下诱导培养16小时，得到诱导菌液。

2、周质空间蛋白提取

取步骤1获得的诱导菌液，采用渗透休克法进行周质空间蛋白提取。具体步骤如下：

(1)将250mL诱导菌液12000g离心1min，弃上清，收集菌体；

(2)加20mL溶液I悬浮菌体，用枪头轻轻吹打混匀，冰浴并轻轻震荡(将冰浴盒放在摇床上轻轻摇动)10min；

(3)8000g、4℃离心10min，弃上清，收集菌体；

(4)加4mL溶液II悬浮，用枪头轻轻吹打悬起，冰浴并轻轻震荡(将沉淀用溶液冰浴盒放在摇床上轻轻摇动)10min；

(5)12000g离心15min，取上清即为周质空间蛋白；

溶液I：将水、蔗糖、EDTA和Tris混匀，各溶质浓度分别为蔗糖20％、EDTA 1mM、Tris30mM，最后用HCl调节pH至8.0。

溶液II：5mM MgCl₂溶液(溶剂为水)。

3、镍柱亲合层析

取步骤2提取的周质空间蛋白上清，采用Ni-NTA 6FF His标签蛋白纯化试剂盒(生工)进行纯化，具体步骤如下：

(1)超滤浓缩上清和结合/洗涤缓冲液按照体积比1：1混匀，静置20min充分孵育，待上柱纯化；

(2)用五倍柱体积的结合/洗涤缓冲液平衡柱子，缓冲液依靠重力流穿预装柱；

(3)将超滤浓缩上清和结合/洗涤缓冲液混匀液加入柱子依靠重力流穿预装柱，如有剩余样品可再次上样，重新流通一次，收集流穿液到离心管中；

(4)用10倍柱体积的结合/洗涤缓冲液清洗柱子并收集流穿液。使用一个新的收集管重复该步骤，直到流穿液的吸光度280nm接近基线；

(5)用4倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱上的重组蛋白。重复此步骤直到流穿液的吸光度280nm接近基线。

4、超滤置换

(1)纯化后的蛋白溶液加入Amicon Ultra-0.5离心过滤装置(UFC5010BK，Millipore公司)，分批10000g离心3min，直至溶液剩余约150μL；

(2)轻轻加入300μL PBS(pH7.4)，10000g离心至剩余150μL，重复三次；

(3)PBS(pH7.4)洗脱超滤管收样，最终体积约为1mL，留样5μL采用紫外吸收法测定纯化后蛋白浓度并进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。

实验结果表明：纯化后蛋白浓度为3.36mg/mL，SDS-PAGE蛋白电泳检测组织蛋白酶K蛋白纯度大于90％，符合预期(图4)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数，浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更，用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 河南晟明生物技术研究院有限公司

<120> 一种组织蛋白酶K的制备方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 215

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Thr Pro Asp Ser Ile Asp Tyr Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr Pro Val

1 5 10 15

Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ser Val Gly

20 25 30

Ala Leu Glu Gly Gln Leu Lys Lys Lys Thr Gly Lys Leu Leu Asn Leu

35 40 45

Ser Pro Gln Asn Leu Val Asp Cys Val Ser Glu Asn Tyr Gly Cys Gly

50 55 60

Gly Gly Tyr Met Thr Asn Ala Phe Gln Tyr Val Gln Arg Asn Arg Gly

65 70 75 80

Ile Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Pro Tyr Val Gly Gln Asp Glu Ser Cys

85 90 95

Met Tyr Asn Pro Thr Gly Lys Ala Ala Lys Cys Arg Gly Tyr Arg Glu

100 105 110

Ile Pro Glu Gly Asn Glu Lys Ala Leu Lys Arg Ala Val Ala Arg Val

115 120 125

Gly Pro Val Ser Val Ala Ile Asp Ala Ser Leu Thr Ser Phe Gln Phe

130 135 140

Tyr Ser Lys Gly Val Tyr Tyr Asp Glu Asn Cys Ser Ser Asp Asn Val

145 150 155 160

Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr Gly Ile Gln Lys Gly Asn Lys

165 170 175

His Trp Ile Ile Lys Asn Ser Trp Gly Glu Ser Trp Gly Asn Lys Gly

180 185 190

Tyr Ile Leu Met Ala Arg Asn Lys Asn Asn Ala Cys Gly Ile Ala Asn

195 200 205

Leu Ala Ser Phe Pro Lys Met

210 215

<210> 2

<211> 645

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

accccggact ctatcgacta ccgtaaaaaa ggttacgtta ccccggttaa aaaccagggt 60

cagtgcggtt cttgctgggc tttctcttct gttggtgctc tggaaggtca gctgaaaaaa 120

aaaaccggta aactgctgaa cctgtctccg cagaacctgg ttgactgcgt ttctgaaaac 180

tacggttgcg gtggtggtta catgaccaac gctttccagt acgttcagcg taaccgtggt 240

atcgactctg aagacgctta cccgtacgtt ggtcaggacg aatcttgcat gtacaacccg 300

accggtaaag ctgctaaatg ccgtggttac cgtgaaatcc cggaaggtaa cgaaaaagct 360

ctgaaacgtg ctgttgctcg tgttggtccg gtttctgttg ctatcgacgc ttctctgacc 420

tctttccagt tctactctaa aggtgtttac tacgacgaaa actgctcttc tgacaacgtt 480

aaccacgctg ttctggctgt tggttacggt atccagaaag gtaacaaaca ctggatcatc 540

aaaaactctt ggggtgaatc ttggggtaac aaaggttaca tcctgatggc tcgtaacaaa 600

aacaacgctt gcggtatcgc taacctggct tctttcccga aaatg 645

<210> 3

<211> 711

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

catatgaaaa agatttggct ggcgctggct ggtttagttt tagcgtttag cgcatcggcg 60

accccggact ctatcgacta ccgtaaaaaa ggttacgtta ccccggttaa aaaccagggt 120

cagtgcggtt cttgctgggc tttctcttct gttggtgctc tggaaggtca gctgaaaaaa 180

aaaaccggta aactgctgaa cctgtctccg cagaacctgg ttgactgcgt ttctgaaaac 240

tacggttgcg gtggtggtta catgaccaac gctttccagt acgttcagcg taaccgtggt 300

atcgactctg aagacgctta cccgtacgtt ggtcaggacg aatcttgcat gtacaacccg 360

accggtaaag ctgctaaatg ccgtggttac cgtgaaatcc cggaaggtaa cgaaaaagct 420

ctgaaacgtg ctgttgctcg tgttggtccg gtttctgttg ctatcgacgc ttctctgacc 480

tctttccagt tctactctaa aggtgtttac tacgacgaaa actgctcttc tgacaacgtt 540

aaccacgctg ttctggctgt tggttacggt atccagaaag gtaacaaaca ctggatcatc 600

aaaaactctt ggggtgaatc ttggggtaac aaaggttaca tcctgatggc tcgtaacaaa 660

aacaacgctt gcggtatcgc taacctggct tctttcccga aaatgctcga g 711

<210> 4

<211> 717

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

catatgaaaa aaaccgctat cgctatcgct gttgctctgg ctggtttcgc taccgttgct 60

caggctaccc cggactctat cgactaccgt aaaaaaggtt acgttacccc ggttaaaaac 120

cagggtcagt gcggttcttg ctgggctttc tcttctgttg gtgctctgga aggtcagctg 180

aaaaaaaaaa ccggtaaact gctgaacctg tctccgcaga acctggttga ctgcgtttct 240

gaaaactacg gttgcggtgg tggttacatg accaacgctt tccagtacgt tcagcgtaac 300

cgtggtatcg actctgaaga cgcttacccg tacgttggtc aggacgaatc ttgcatgtac 360

aacccgaccg gtaaagctgc taaatgccgt ggttaccgtg aaatcccgga aggtaacgaa 420

aaagctctga aacgtgctgt tgctcgtgtt ggtccggttt ctgttgctat cgacgcttct 480

ctgacctctt tccagttcta ctctaaaggt gtttactacg acgaaaactg ctcttctgac 540

aacgttaacc acgctgttct ggctgttggt tacggtatcc agaaaggtaa caaacactgg 600

atcatcaaaa actcttgggg tgaatcttgg ggtaacaaag gttacatcct gatggctcgt 660

aacaaaaaca acgcttgcgg tatcgctaac ctggcttctt tcccgaaaat gctcgag 717

<210> 5

<211> 720

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

catatgaaat acctgctgcc gaccgctgct gctggtctgc tgctcctcgc tgcccagccg 60

gcgatggcca ccccggactc tatcgactac cgtaaaaaag gttacgttac cccggttaaa 120

aaccagggtc agtgcggttc ttgctgggct ttctcttctg ttggtgctct ggaaggtcag 180

ctgaaaaaaa aaaccggtaa actgctgaac ctgtctccgc agaacctggt tgactgcgtt 240

tctgaaaact acggttgcgg tggtggttac atgaccaacg ctttccagta cgttcagcgt 300

aaccgtggta tcgactctga agacgcttac ccgtacgttg gtcaggacga atcttgcatg 360

tacaacccga ccggtaaagc tgctaaatgc cgtggttacc gtgaaatccc ggaaggtaac 420

gaaaaagctc tgaaacgtgc tgttgctcgt gttggtccgg tttctgttgc tatcgacgct 480

tctctgacct ctttccagtt ctactctaaa ggtgtttact acgacgaaaa ctgctcttct 540

gacaacgtta accacgctgt tctggctgtt ggttacggta tccagaaagg taacaaacac 600

tggatcatca aaaactcttg gggtgaatct tggggtaaca aaggttacat cctgatggct 660

cgtaacaaaa acaacgcttg cggtatcgct aacctggctt ctttcccgaa aatgctcgag 720

<210> 6

<211> 723

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

catatgaaaa agaacatcgc attcctcctg gcatctatgt ttgttttctc tatcgctacc 60

aacgcttacg ctaccccgga ctctatcgac taccgtaaaa aaggttacgt taccccggtt 120

aaaaaccagg gtcagtgcgg ttcttgctgg gctttctctt ctgttggtgc tctggaaggt 180

cagctgaaaa aaaaaaccgg taaactgctg aacctgtctc cgcagaacct ggttgactgc 240

gtttctgaaa actacggttg cggtggtggt tacatgacca acgctttcca gtacgttcag 300

cgtaaccgtg gtatcgactc tgaagacgct tacccgtacg ttggtcagga cgaatcttgc 360

atgtacaacc cgaccggtaa agctgctaaa tgccgtggtt accgtgaaat cccggaaggt 420

aacgaaaaag ctctgaaacg tgctgttgct cgtgttggtc cggtttctgt tgctatcgac 480

gcttctctga cctctttcca gttctactct aaaggtgttt actacgacga aaactgctct 540

tctgacaacg ttaaccacgc tgttctggct gttggttacg gtatccagaa aggtaacaaa 600

cactggatca tcaaaaactc ttggggtgaa tcttggggta acaaaggtta catcctgatg 660

gctcgtaaca aaaacaacgc ttgcggtatc gctaacctgg cttctttccc gaaaatgctc 720

gag 723

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 7

Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala

1 5 10 15

Gln Pro Ala Met Ala

20

Claims

1.PelB信号肽在如下A1)或A2)中的应用：

A1)制备组织蛋白酶K；

A2)提高组织蛋白酶K表达量或产量；

所述PelB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

2.与PelB信号肽相关的生物材料在如下A1)或A2)中的应用：

A1)制备组织蛋白酶K；

A2)提高组织蛋白酶K表达量或产量；

所述与PelB信号肽相关的生物材料为所述PelB信号肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系；

所述PelB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述编码基因为SEQ ID No.5第7-69位所示的DNA分子。

4.融合蛋白，所述融合蛋白为将PelB信号肽融合于组织蛋白酶K的N端后所得；

所述PelB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

5.与权利要求4所述融合蛋白相关的生物材料，所述生物材料为权利要求4所述融合蛋白的编码基因或含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系。

6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于：所述编码基因为SEQ ID No.5第7-714位所示的DNA分子。

7.权利要求4所述的融合蛋白或权利要求5所述的生物材料在如下A1)或A2)中的应用：

A1)制备组织蛋白酶K；

A2)提高组织蛋白酶K表达量或产量。

8.一种制备组织蛋白酶K的方法，包括如下步骤：使权利要求4所述的融合蛋白的编码基因在宿主菌或宿主细胞中进行表达，得到所述组织蛋白酶K。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

1)将权利要求4所述融合蛋白的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；

2)将所述重组菌进行诱导培养，得到诱导菌液；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述诱导培养的方法包括如下步骤：培养所述重组菌至OD_600nm值为0.6-1.0时，向培养体系中添加0.8-1.2mM的IPTG进行诱导培养。