CN113061598B

CN113061598B - 胰蛋白酶突变体、其制备方法及其应用

Info

Publication number: CN113061598B
Application number: CN202110333251.1A
Authority: CN
Inventors: 葛新建; 马丽娜
Original assignee: Shanghai Beyotime Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Biyuntian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2041-03-29
Also published as: CN113061598A

Abstract

本发明提供了一种胰蛋白酶突变体、其制备方法及其应用。本发明发现猪胰蛋白酶的一些位点与其活性及稳定性密切相关，基于此获得了一类胰蛋白酶突变体，与野生型相比，所述突变体的酶活性及稳定性更好。本发明也提供了所述胰蛋白酶突变体的应用。本发明也提供了优化的表达胰蛋白酶突变体的方法，其产量高、生产成本低、适合规模化生产。

Description

胰蛋白酶突变体、其制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及一种胰蛋白酶突变体、其制备方法及其应用。

背景技术

胰蛋白酶是一种广泛存在于自然界中的丝氨酸蛋白酶，在细菌、真菌和哺乳动物中均有发现。在哺乳动物中，胰蛋白酶与新陈代谢、消化和凝血密切相关。胰蛋白酶被广泛应用于皮革、生物技术、医药和食品加工产业。例如在生物制药工业中将单链胰岛素前体转化为双链胰岛素，在动物细胞培养中消化细胞，以及质谱检测中消化蛋白质等。

胰蛋白酶在胰腺中以前酶原(Pretrypsinogen)形式生成，通过N端15个氨基酸组成的疏水信号肽从胰腺中分泌出来，分泌过程中信号肽被切除生成无活性的胰蛋白酶酶原(Trypsinogen)。该胰蛋白酶酶原N端由23个氨基酸组成激活肽，该激活肽被肠激酶(Enterokinase)或胰蛋白酶切除后生成具有活性的胰蛋白酶(Trypsin)。胰蛋白酶可裂解碱性氨基酸(赖氨酸或精氨酸氨)羧基端的肽键，如果脯氨酸在裂解位点的羧基一侧，则不会发生裂解，如果酸性氨基酸(谷氨酸或天冬氨酸)在裂解位点的两侧，则水解速度较慢。有活性的胰蛋白酶由223个氨基酸组成，含有6对保守的二硫键，三维结构整体呈球状，由N端和C端各6股反向平行的β片层组成的桶装结构域组成。胰蛋白酶必须结合Ca²⁺才具有酶活性，其钙离子结合坏(calcium-binding loop)与Ca²⁺相互作用，Ca²⁺参与胰蛋白酶三维结构的稳定，促进其水解底物的酶活性，并保护其免于发生自降解(autolysis)。其带负电的S1结合位点疏水口袋，决定了胰蛋白酶对底物P1位点为赖氨酸或精氨酸的特异性。激活后的胰蛋白酶因其三维结构表面存在暴露的赖氨酸或精氨酸易发生自降解，从单链形式的β-胰蛋白酶转化为内部由二硫键相连的双链α-胰蛋白酶，进一步的自降解会产生γ、δ、ψ形式的胰蛋白酶乃至碎片。自然条件下的胰蛋白酶主要形式是α-胰蛋白酶，其次是β-胰蛋白酶，α和β-胰蛋白酶的活性、热稳定性不同。

虽然动物胰腺提取的胰蛋白酶产品已被广泛应用，但是存在生产工艺复杂、胰蛋白酶得率较低、胰蛋白酶活性低或稳定性差、胰蛋白酶原激活方式不可控导致的蛋白纯度不均一、潜在动物污染等问题。随着市场对胰蛋白酶质量需求的提高，已有利用基因工程技术表达的重组胰蛋白酶产品问世，主要采用丝状真菌、酵母或大肠杆菌表达系统。利用丝状真菌表达系统将重组胰蛋白酶分泌到培养基中(见专利WO97/00316)，但是宿主细胞自身产生的蛋白酶易导致重组胰蛋白酶原的激活，从而影响重组胰蛋白酶的产量和纯度。利用酵母表达系统将重组胰蛋白酶分泌到培养基中(见专利WO 01/55429)，但其存在筛选稳转株周期长、筛选抗生素昂贵、诱导试剂(甲醇)残留和不规则糖基化导致重组蛋白构象不均一等缺陷。利用大肠杆菌表达系统在周质空间表达可溶重组胰蛋白酶的产量很低，而通过表达包涵体蛋白进行复性制备的重组胰蛋白酶(见专利CN106754842A)的复性率只有约10％，且在后续工业大规模纯化中损失严重，纯化方法无法区分错误折叠不具有胰蛋白酶活性和正确折叠具有胰蛋白酶活性的蛋白，导致终产品的酶比活较低。

综上所述，现有重组胰蛋白酶还亟待进一步加以优化以提高其性能，同时其表达、纯化技术存在包涵体蛋白复性率低、生产耗时长和生产成本高等问题也亟待解决。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胰蛋白酶突变体、其制备方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种胰蛋白酶突变体，其是：(a)氨基酸序列对应于SEQID NO:1所示的胰蛋白酶，下组位点或位点组合发生突变的酶：第75位、第76位、第78位、第82位、第163位、第165位；(b)将(a)酶的氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个，如8个，5个，3个，2个，1个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)酶的功能/活性的由(a)衍生的酶，但对应于SEQ ID NO:1所示的胰蛋白酶的第75位、第76位、第78位、第82位、第163位、第165位的氨基酸与(a)酶相应位置突变后的氨基酸相同；(c)与(a)酶的氨基酸序列有85％以上同源性(较佳地88％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)且具有(a)酶功能/活性的由(a)衍生的酶，但对应于SEQ ID NO:1所示的胰蛋白酶的第75位、第76位、第78位、第82位、第163位、第165位的氨基酸与(a)酶相应位置突变后的氨基酸相同；或(d)在(a)酶的氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在一个优选例中，所述“具有(a)酶的功能/活性”包括，与(a)酶的活性相比，具有其至少85％以上、90％以上、95％以上的活性。

在另一优选例中，(a)中，还包括下组位点或位点组合：第99位、第125位、第139位。

在另一优选例中，第75位突变为Ser(N75S)；第76位突变为Tyr(F76Y)；第78位突变为Ser(G78S)；第82位突变为Asn(D82N)；第163位突变为Ala(V163A)；第165位突变为Tyr(F165Y)；第99位突变为Leu(R99L)；第125位突变为Leu(K125L)；或，第139位突变为Leu(K139L)；较佳地，所述的胰蛋白酶突变体包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:9所示的突变体。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的核酸编码前面任一所述的胰蛋白酶突变体。

在一个优选例中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:12或其第7-678位序列；或，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:10或其第7-678位序列。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸；较佳地，所述载体还包括编码SUMO标签和/或His标签的核苷酸序列；更佳地，包括编码His-SUMO3标签的核苷酸序列；更佳地，该载体表达的融合蛋白中，His-SUMO3标签蛋白的C端连接前面任一所述的胰蛋白酶突变体。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸；较佳地，所述的宿主细胞包括原核细胞；更佳地，所述宿主细胞包括大肠杆菌细胞。

在一个优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；较佳地，所述的原核细胞包括大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞等；较佳地，所述真核细胞包括霉菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞等。

在本发明的另一方面，提供一种提高胰蛋白酶的活性或稳定性的方法，包括对其进行突变改造，对应于SEQ ID NO:1所示的胰蛋白酶，对选自下组的位点或位点组合进行突变：第75位、第76位、第78位、第82位、第163位、第165位；较佳地，还包括下组位点或位点组合：第99位、第125位、第139位。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的胰蛋白酶突变体的制备方法，该方法包含：(i)培养所述的宿主细胞；(ii)收集含有所述的胰蛋白酶突变体的培养物；(iii)从培养物中分离出所述的胰蛋白酶突变体。

在一个优选例中，当胰蛋白酶突变体的核苷酸序列与编码SUMO标签和/或His标签的核苷酸序列融合表达、获得融合蛋白包涵体后，还包括：包涵体变性、复性、纯化的步骤；较佳地，所述的纯化步骤中，包括：添加SUMO蛋白水解酶、切割融合蛋白、分离获得所述胰蛋白酶突变体；更佳地，所述SUMO蛋白水解酶为SUMO特异性蛋白酶2(SENP2)。

在另一优选例中，以His-SUMO3标签与所述胰蛋白酶突变体融合表达，对获得的包涵体蛋白进行清洗、溶解，之后进行复性。

在另一优选例中，所述清洗液包括：10-50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH7.4，0.1-1M NaCl，0.1-1％Triton X-100。

在另一优选例中，所述溶解液包括：6-8M尿素，5-50mM二硫苏糖醇(DTT)，10-50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.0。

在另一优选例中，所述复性液包括：1.5-2.5M尿素，10-100mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.0，1-10mM还原型谷胱甘肽(GSH)或者半胱氨酸(Cysteine)，0.2-10mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)或者胱氨酸(Cystine)，5-15％甘油，1-10mM氯化钙。

在另一优选例中，所述包涵体蛋白复性后，上样亲和层析树脂，柱上切除His-SUMO3标签，收集含有胰蛋白酶突变体的流穿液，纯化得到的有活性的胰蛋白酶突变体；较佳地，包涵体蛋白复性后，上样到耐还原螯合型的镍亲和层析树脂，柱上切除His-SUMO3标签，收集含有胰蛋白酶突变体的流穿液，之后经苯甲脒琼亲和层析树脂纯化得到的有活性的胰蛋白酶突变体。

在本发明的另一方方面，提供前面任一所述的胰蛋白酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物的用途，用于酶解蛋白质或变性蛋白质；较佳地，用于特异性识别和水解精氨酸和赖氨酸，酶解蛋白质或者变性蛋白质。

在一个优选例中，所述胰蛋白酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物用于进行多肽的肽图谱分析，蛋白测序或蛋白质组学研究。

在另一优选例中，所述胰蛋白酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物用于皮革加工、生物技术加工、医药或食品加工。

在另一优选例中，所述胰蛋白酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物用于生物制药工业；较佳地，用于将单链胰岛素前体转化为双链胰岛素。

在另一优选例中，所述胰蛋白酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物用于消化细胞。

在本发明的另一方面，提供一种酶解蛋白质或变性蛋白质的方法，包括：利用前面任一所述的胰蛋白酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物进行酶解反应。

在本发明的另一方面，提供一种用于酶解蛋白质或变性蛋白质的检测体系或检测试剂盒，其中含有：前面任一所述的胰蛋白酶突变体，表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、猪(Porcine)、牛(Bovine)和羊(Capra)胰蛋白酶一级氨基酸序列的对比图。图中也呈现了相应的三级结构的位置：参照猪胰蛋白酶(PDB code 1AVW)，β代表β片层，箭头方向代表片层延伸方向，α代表α螺旋，η代表3¹⁰helix，TT代表转角，严格保守的氨基酸用灰底带框标注，虚线标注为钙离子结合环和自溶解环，灰色实心五角星标注为“催化三联体”，空心椭圆标注为参与稳定活性中心的盐桥键，实心椭圆标注为底物结合S1口袋。

图2A-B、猪和牛胰蛋白酶三维结构对比图。猪胰蛋白酶(PDB code 1AVW)以浅灰显示，牛胰蛋白酶(PDB code 1AZ8)以深灰显示。B图中，包括了钙离子结合环、自溶解环；催化三联体、盐桥键、底物结合S1口袋以棍棒结构标注(图中位点根据糜蛋白酶(chymotrypsin)相应位置氨基酸进行编号)。

图3、纯化后重组猪胰蛋白酶和重组胰蛋白酶1的Native-PAGE胶电泳图。WT代表重组猪胰蛋白酶，R99L，K125，K139L代表重组胰蛋白酶1。箭头分别指向单链形式的β-胰蛋白酶和由二硫键连接的双链形式的α-胰蛋白酶。

图4、利用荧光底物NFF-3测试重组猪胰蛋白酶和重组胰蛋白酶3的酶活对比图。WT代表重组猪胰蛋白酶，Mutant-3代表重组胰蛋白酶3(N75S,F76Y,G78S,D82N,V163A,F165Y)。

图5、重组牛胰蛋白酶、重组猪胰蛋白酶和重组胰蛋白酶4包涵体蛋白复性率检测对比图。纵坐标代表包涵体蛋白复性百分率，左侧柱代表重组牛胰蛋白酶，中间柱代表重组猪胰蛋白酶，右侧柱Mutant-4代表重组胰蛋白酶4(R99L,K125L,K139L,N75S,F76Y,G78S,D82N,V163A,F165Y)。

图6、利用荧光底物NFF-3测试重组牛胰蛋白酶、重组猪胰蛋白酶和重组胰蛋白酶4的酶活对比图。三角标记的直线代表重组牛胰蛋白酶，方形标记的直线代表重组猪胰蛋白酶，圆形标记的直线代表重组胰蛋白酶4。

图7、重组牛胰蛋白酶、重组猪胰蛋白酶和重组胰蛋白酶4稳定性测试图。取5mg/mL的重组牛胰蛋白酶(三角标记的曲线)、重组猪胰蛋白酶(方形标记的曲线)和重组胰蛋白酶4(Mutant-4)在10mM Tris pH8.0，20mM CaCl₂，37℃的条件下孵育2、4、8和24小时(X轴)后，用荧光底物NFF-3检测胰蛋白酶的酶活性，剩余胰蛋白酶酶活百分比见Y轴。

图8、本发明纯化重组胰蛋白酶的总体流程图。

图9、纯化得到的重组胰蛋白酶4终产品经SDS-PAGE胶电泳图。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究试验，发现猪胰蛋白酶的一些位点与其酶活性及稳定性密切相关。在此基础上，本发明人获得了一类胰蛋白酶突变体，与野生型相比，所述突变体的酶活性及稳定性更好。本发明也提供了优化的表达重组胰蛋白酶突变体的方法，其产量高、生产成本低、适合规模化生产。

术语

如本文所用，除非另外说明，所述的“胰蛋白酶的突变体”、“突变型胰蛋白酶”可互换使用，是指对应于野生型猪胰蛋白酶(如SEQ ID NO:1)，发生选自以下位置的突变后所构成的蛋白：第75位、第76位、第78位、第82位、第163位和/或第165位；较佳地还包括下组位点或位点组合：第99位、第125位和/或第139位。

如本文所用，除非另外说明，所述的“胰蛋白酶的突变体”、“突变型胰蛋白酶”可互换使用，是指对野生型的胰蛋白酶进行突变后的产物。

如本文所用，若需要表示野生型的猪胰蛋白酶，其将被标示为“野生型猪胰蛋白酶”、SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白或WT。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的胰蛋白酶突变体”是指胰蛋白酶突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化猪胰蛋白酶突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

如本文所用，“重组的”是指借助基因工程手段来获得(或大量制备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。

如本文所用，“提高活性或稳定性”是指与改造前的野生型胰蛋白酶相比，发生突变的胰蛋白酶的活性或稳定性发生统计学意义的提高，或称为显著性的提高。例如，在同一种反应条件/环境下，活性或稳定性提高的突变型胰蛋白酶的酶活性或稳定性比改造前的酶显著提高5％以上，10％以上，20％以上，30％以上，50％以上，70％以上，80％以上，100％，150％以上等。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。术语“基本上由……构成”指在组合物/反应体系/试剂盒中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。

如本文所用，术语“有效量”是指可对本发明感兴趣的反应产生功能或活性、达到预期效果(准确的检测结果)的量。

胰蛋白酶突变体、其编码核酸及构建体

本发明的胰蛋白酶突变体可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括所述胰蛋白酶突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然胰蛋白酶突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，需要满足的条件是：所述的胰蛋白酶突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，必然存在至少一种本发明上面所特别指出的突变，较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，包括N75S、F76Y、G78S、D82N、V163A、F165Y、R99L、K125L和/或K139L。

在本发明中，术语“胰蛋白酶突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括胰蛋白酶突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在至少一个本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于SEQID NO:1所示的氨基酸序列，包括N75S、F76Y、G78S、D82N、V163A、F165Y、R99L、K125L和/或K139L。

在本发明中，术语“胰蛋白酶突变体”还包括(但并不限于)：与所述的胰蛋白酶突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在肯定存在至少一个本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，包括N75S、F76Y、G78S、D82N、V163A、F165Y、R99L、K125L和/或K139L。

发明还提供所述胰蛋白酶突变体的类似物。这些类似物与所述胰蛋白酶突变体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还提供了编码本发明胰蛋白酶突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或胰蛋白酶突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述突变的酶的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的胰蛋白酶突变体。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码胰蛋白酶突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，胰蛋白酶突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含胰蛋白酶突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

本发明中，所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如霉菌细胞，酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、农杆菌；真核细胞如酵母、植物细胞等。在本发明的具体实施例中，以大肠杆菌作为宿主细胞。

本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

突变体的重组表达

本发明建立的重组细胞(宿主细胞)可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在表达时，本发明的胰蛋白酶突变体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、高速离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

作为本发明的优选方式，采用原核宿主细胞进行本发明的胰蛋白酶突变体的重组表达，优选以大肠杆菌作为宿主细胞。在进行表达时，将胰蛋白酶突变体的核苷酸序列与编码SUMO标签和/或His标签的核苷酸序列融合表达、获得融合蛋白包涵体后，还包括：包涵体变性、复性、纯化的步骤；较佳地，所述的纯化步骤中，包括：添加SUMO蛋白水解酶、切割融合蛋白、分离获得所述胰蛋白酶突变体；更佳地，所述SUMO蛋白水解酶为SUMO特异性蛋白酶2(SENP2)。

SUMO标签可以作为重组蛋白表达的融合标签，其与本发明的胰蛋白酶突变体融合表达后，可被完整地切除以获得不带有多余氨基酸的胰蛋白酶突变体。利用SUMO蛋白水解酶(优选地如SUMO特异性蛋白酶2(SENP2))，能识别完整的SUMO标签蛋白序列，并把SUMO从融合蛋白上切割下来。切除SUMO标签后，经过亲和层析，去除标签蛋白部分，得到不带有多余氨基酸的胰蛋白酶突变体。作为本发明的优选方式，运用His-SUMO3标签融合本发明改造的重组胰蛋白酶，更佳地所述His-SUMO3标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

作为一种优选的实施方案，采用大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达His-SUMO3标签融合的重组胰蛋白酶。

作为一种优选的实施方案，针对大肠杆菌系统对氨基酸序列进行碱基密码子优化：降低GC含量，替换稀有密码子，提高重组胰蛋白酶的产量。

在较佳的实施方案中，所述在His-SUMO3标签蛋白的C末端甘氨酸后连接本发明的突变型胰蛋白酶，也可以是它们的截短形式，以及全长形式和截短形式对应的氨基酸任意突变形式。

作为本发明的优选实施方式，提供了一种表达胰蛋白酶突变体的方法：

(1)提供如本发明的胰蛋白酶突变体；较佳地，进行碱基密码子优化；

(2)构建重组胰蛋白酶表达载体的克隆：

(3)过表达His-SUMO3标签融合的重组胰蛋白酶形成包涵体蛋白；

(4)His-SUMO3标签融合的重组胰蛋白酶包涵体蛋白的清洗、溶解；较佳地，清洗液组分为：10-50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH7.4，0.1-1M NaCl，0.1-1％Triton X-100；较佳地，溶解液组分为：6-8M尿素，5-50mM二硫苏糖醇(DTT)，10-50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.0；

(5)His-SUMO3标签融合重组胰蛋白酶包涵体蛋白的复性；较佳地，复性液组分：1.5-2.5M尿素，10-100mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.0，1-10mM还原型谷胱甘肽(GSH)或者半胱氨酸(Cysteine)，0.2-10mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)或者胱氨酸(Cystine)，5-15％甘油，1-10mM氯化钙；甘油对包涵体蛋白复性率有显著提高；

(6)重组胰蛋白酶的纯化：His-SUMO3标签融合的重组胰蛋白酶包涵体蛋白充分复性后，经耐还原螯合型镍亲和层析树脂富集可溶重组蛋白；较佳地，经特异性超高的SUMO特异性蛋白酶2(SENP2)在耐还原螯合型镍亲和层析树脂层析柱上切除His-SUMO3标签，收集的流穿液经特异性结合胰蛋白酶活性中心的苯甲脒琼亲和层析树脂(BenzamidineSepharose 4FF)，纯化得到具有活性的重组胰蛋白酶。

专利CN106754842A采用阳离子交换层析树脂富集重组蛋白，洗脱后置换溶液加入SENP2酶切除His-SUMO3标签，经镍亲和层析树脂层移除His-SUMO3标签纯化得到重组胰蛋白酶，其缺点在于无法区分因二硫键错配或错误折叠导致的无活性重组胰蛋白酶与有活性的重组胰蛋白酶，使终产品比活降低，而且无论是阳离子交换层析上样前，还是洗脱后再次上样镍亲和层析树脂都需要对溶液组分进行置换，工业上采用浓缩、稀释的方法不仅耗费时间，并且大体积操作易导致重组蛋白得率下降。针对以上缺点，本发明的优选的重组表达方案中，包涵体蛋白复性完成后直接上样到耐还原螯合型的镍亲和层析树脂，柱上切除His-SUMO3标签后收集含有重组胰蛋白酶的流穿液，之后经苯甲脒琼亲和层析树脂(Benzamidine Sepharose4FF)纯化得到的有活性重组胰蛋白酶。该纯化方法无需置换溶液，柱上酶切，简便纯化操作、缩短纯化时间、降低蛋白损耗，利用苯甲脒琼亲和层析树脂特异性结合胰蛋白酶活性中心的原理，有效区分具有活性的重组胰蛋白酶和不具有活性的重组胰蛋白酶，提高终产品的比活。

与现有的制备重组人胰蛋白酶的技术方法(如发明专利CN106754842A等)相比，本发明的优异效果在于：(1)人工改造的胰蛋白酶突变体，使之具有原核表达后包涵体复性率高、热稳定性好、均一性好的特点的同时，具有高的酶活性，包涵体复性率可达60％(而CN106754842A专利的重组人胰蛋白酶复性率仅为10％)；(2)根据本发明优化的序列，在原核表达体系中的包涵体蛋白的表达量高；(3)本发明的重组胰蛋白酶的纯化方法，无需置换溶液，柱上酶切，能有效区分出有活性的重组胰蛋白酶，简便纯化操作，缩短纯化时间，降低蛋白损耗，提高产品比活。

本发明的重组表达胰蛋白酶突变体的方法，解决了现有技术中重组胰蛋白酶稳定性和酶活偏低、表达纯化时存在包涵体蛋白复性率低、生产耗时长和生产成本高等问题。

重组胰蛋白酶的应用

本发明的改造的胰蛋白酶突变体有多方面的与胰蛋白酶特性相关的用途，包括但不限于：特异性识别和水解精氨酸和赖氨酸，酶解蛋白质或者变性蛋白质，消化细胞，进行多肽的肽图谱分析，蛋白测序，蛋白质组学研究等。

本发明的改造的胰蛋白酶突变体可以应用于进行肽图谱分析(PeptideMapping)。肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶(一般为肽链内切酶)作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片段，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱，肽图分析是对多肽结构研究和特性鉴别的有效手段。

本发明的改造的胰蛋白酶突变体可用于皮革加工、生物技术加工、医药或食品加工等工业生产领域；用于生物制药工业；例如，用于将单链胰岛素前体转化为双链胰岛素。

综上所述，本发明的胰蛋白酶突变体具有产量高、稳定性好、酶活高、成本低、适合大规模工业生产的优点。同时，本发明优化的方法解决了现有的重组胰蛋白酶的表达、纯化存在包涵体蛋白复性率低、生产耗时长和生产成本高等问题。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1、针对胰蛋白酶R99L，K125L和K139L的改造

1、野生型胰蛋白酶以及稳定性相关位点分析

本发明人获得了野生型的猪、牛和羊来源的胰蛋白酶，它们的序列分别如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5；它们的经密码子优化的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6。

野生型猪胰蛋白酶(Porcine-Trypsin-WT)氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)(或见P00761)：

对SEQ ID NO:1的猪胰蛋白酶进行密码子优化后的核苷酸序列(人工全基因合成)如下(SEQ ID NO:2)：

GGATCC(BamH1)ATCGTGGGTGGTTATACCTGTGCAGCAAATAGTATTCCGTATCAGGTGAGCCTGAATAGCGGTAGTCATTTTTGCGGTGGCAGCCTGATTAATAGTCAGTGGGTGGTTAGTGCCGCACATTGCTATAAAAGTCGTATTCAGGTTCGCCTGGGTGAACATAATATTGATGTGCTGGAAGGTAATGAACAGTTTATTAATGCAGCAAAAATCATCACCCATCCGAATTTTAATGGCAATACCCTGGATAATGATATTATGCTGATTAAGCTGAGCAGTCCGGCAACCCTGAATAGCCGCGTGGCAACCGTTAGCCTGCCGCGCAGCTGCGCAGCAGCAGGTACCGAATGCCTGATTAGCGGTTGGGGTAATACCAAAAGTAGTGGCAGCAGTTATCCGAGCCTGCTGCAGTGCCTGAAAGCCCCGGTTCTGAGCGATAGTAGCTGTAAAAGCAGCTATCCGGGCCAGATTACCGGCAATATGATTTGCGTTGGCTTTCTGGAAGGCGGCAAAGATAGCTGTCAGGGCGATAGTGGTGGTCCGGTTGTTTGCAATGGTCAGCTGCAGGGCATTGTGAGTTGGGGCTATGGCTGCGCACAGAAAAATAAGCCGGGTGTTTATACCAAAGTGTGTAATTATGTTAACTGGATTCAGCAGACCATTGCCGCCAATTAA(Stop)CTCGAG(Xho1)

野生型牛胰蛋白酶(Bovine-Trypsin-WT)氨基酸序列如下(SEQ ID NO:3)(或见GenBank登录号XP_002687054.3)：

对SEQ ID NO:3的牛胰蛋白酶进行密码子优化后的核苷酸序列(人工全基因合成)如下(SEQ ID NO:4)：

GGATCC(BamH1)ATTGTGGGCGGCTATACCTGCGGCGCGAACACCGTGCCGTATCAAGTGAGCCTGAACAGTGGCTATCATTTTTGCGGCGGCAGCCTGATTAACAGTCAGTGGGTGGTGAGCGCGGCGCATTGCTATAAAAGCGGCATTCAAGTGCGCCTGGGCGAAGATAACATTAACGTGGTGGAAGGCAACGAACAGTTTATTAGCGCGAGCAAAAGCATTGTGCATCCGAGCTATAACAGCAACACCCTGAACAACGATATTATGCTGATTAAACTGAAAAGCGCGGCGAGCCTGAACAGCCGCGTGGCGAGCATTAGCCTGCCGACGAGCTGCGCGAGCGCGGGCACGCAGTGCCTGATTAGCGGCTGGGGCAACACCAAAAGCAGCGGCACGAGCTATCCGGATGTGCTGAAATGCCTGAAAGCGCCGATTCTGAGCGATAGCAGCTGCAAAAGCGCGTATCCGGGTCAGATTACGAGCAACATGTTTTGCGCGGGCTATCTGGAAGGCGGCAAAGATAGCTGCCAAGGCGATAGCGGCGGCCCGGTGGTGTGCAGCGGCAAACTGCAAGGCATTGTGAGCTGGGGCAGCGGCTGCGCGCAGAAAAACAAACCGGGCGTGTATACCAAAGTGTGCAACTATGTGAGCTGGATTAAACAGACCATTGCGAGCAACTAA(Stop)CTCGAG(Xho1)

野生型羊胰蛋白酶(Capra Hircus-Trypsin-WT)氨基酸序列如下(SEQ ID NO:5)(或见GenBank登录号XP_005701320.1)：

对SEQ ID NO:5的羊胰蛋白酶进行密码子优化后的核苷酸序列(人工全基因合成)如下(SEQ ID NO:6)：

GGATCC(BamH1)ATTGTGGGCGGCTATACCTGCGGCGCGAACACCGTGCCGTATCAAGTGAGCCTGAACAGCGGCTATCATTTTTGCGGCGGCAGCCTGATTAACAGTCAGTGGGTGGTGAGCGCGGCGCATTGCTATAAAAGCGGCATTCAAGTGCGCCTGGGCGAAGATAACATTAACGTGGTGGAAGGCAACGAACAGTTTATTAGCGCGAGCAAAAGCATTGTGCATCCGAGCTATAACAGCAACACCCTGAACAACGATATTATGCTGATTAAACTGAAAAGCGCGGCGAGCCTGAACAGCCGCGTGGCGAGTGTGAGCCTGCCGACGAGCTGCGCGAGCGCCGGCACGCAGTGCCTGATTAGCGGCTGGGGCAACACCAAAAGCAGCGGCACGAGCTATCCGGATGTGCTGCAGTGCCTGAAAGCGCCGATTCTGAGCGATAGCAGCTGCAAAAGCGCGTATCCGGGTCAGATTACGAGCAACATGTTTTGCGCGGGCTATCTGGAAGGCGGCAAAGATAGCTGCCAAGGCGATAGCGGCGGCCCGGTGGTGTGCAGCGGCAAACTGCAAGGCATTGTGAGCTGGGGCTATGGCTGCGCGCAGAAAAACAAACCGGGCGTGTATACCAAAGTGTGCAACTATGTGAGCTGGATTCAGCAGACCATTGCGAGCAACTAA(Stop)CTCGAG(Xho1)

猪、牛和羊胰蛋白酶的氨基酸序列的比较如图1，其中位点R99，K125和K139是保守的。

同时，本发明人分析了猪和牛胰蛋白酶晶体三维结构，其对比结果如图2A-B。经过晶体三维结构分析，R99，K125和K139位点暴露于表面存在导致自溶解的可能。

2、防止自溶解的序列改造

本发明人在上述野生型猪胰蛋白酶序列的基础上，设计出重组胰蛋白酶改造序列1(Recombinant Trypsin1-R99L、K125L、K139L)，具体如下(SEQ ID NO:7)：

对SEQ ID NO:7的猪胰蛋白酶进行密码子优化后的核苷酸序列(人工全基因合成)如下(SEQ ID NO:8)：

GGATCC(BamH1)ATTGTGGGCGGCTATACCTGCGCGGCGAACAGCATTCCGTATCAAGTGAGCCTGAACAGCGGCAGCCATTTTTGCGGCGGCAGCCTGATTAACAGTCAGTGGGTGGTGAGCGCGGCGCATTGCTATAAAAGCCGCATTCAAGTGCGCCTGGGCGAACATAACATTGATGTGCTGGAAGGCAACGAACAGTTTATTAACGCGGCGAAAATTATTACCCATCCGAACTTTAACGGCAACACCCTGGATAACGATATTATGCTGATTAAACTGAGCAGCCCGGCCACCCTGAACAGCCTGGTGGCGACCGTGAGCCTGCCGCGCAGCTGCGCGGCCGCGGGCACCGAATGCCTGATTAGCGGCTGGGGCAACACCCTGAGCAGCGGCAGCAGCTATCCAAGCCTGCTGCAGTGCCTGCTGGCGCCGGTGCTGAGCGATAGCAGCTGCAAAAGCAGCTATCCGGGTCAGATTACCGGCAACATGATTTGCGTGGGCTTTCTGGAAGGCGGCAAAGATAGCTGCCAAGGCGATAGCGGCGGCCCGGTGGTGTGCAACGGTCAGCTGCAAGGCATTGTGAGCTGGGGCTATGGCTGCGCGCAGAAAAACAAACCGGGCGTGTATACCAAAGTGTGCAACTATGTGAACTGGATTCAGCAGACCATTGCGGCGAACTAA(Stop)CTCGAG(Xho1)

同时表达、纯化重组猪胰蛋白酶和重组胰蛋白酶1，最终所得的重组蛋白进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。带有防止自溶解的R99L，K125L和K139L改造的重组胰蛋白酶1基本只有一条主带(单链形式的β-胰蛋白酶)，且该条带迁移速度较快；而重组猪胰蛋白酶(野生型，WT)在此条带位置之上，有一条迁移速度较慢的条带，条带亮度上小于主带，推测其为因稳定性低导致的由二硫键相连的双链α-胰蛋白酶(图3)。

因此，电泳结果表明，针对胰蛋白酶位点R99L，K125L和K139L的改造有效抑制了胰蛋白酶的自溶解，提高了重组胰蛋白酶的稳定性和均一性。

实施例2、提高重组胰蛋白酶活性的改造

本发明人比较猪和牛胰蛋白酶40个差异氨基酸及其蛋白三维结构，经过反复研究以及实验分析，确定了其差异氨基酸中的N75、F76、G78和D82位置可作为有利于提高酶活性的位点；以及确定了V163和F165作为改造位点。从空间结构上，本发明人也发现，N75、F76、G78和D82位于催化三联体附近；V163和F165位于底物结合口袋附近。

据此，基于野生型猪胰蛋白酶序列进行改造，获得重组胰蛋白酶改造序列3(Recombinant Trypsin3-N75S、F76Y、G78S、D82N、V163A、F165Y)，具体如下(SEQ ID NO:9)：

对SEQ ID NO:9的猪胰蛋白酶进行密码子优化后的核苷酸序列(人工全基因合成)如下(SEQ ID NO:10)：

ggatcc(bamh1)attgtgggcggctatacctgcgcggcgaacagcattccgtatcaagtgagcctgaacagcggcagccatttttgcggcggcagcctgattaacagtcagtgggtggtgagcgcggcgcattgctataaaagccgcattcaagtgcgcctgggcgaacataacattgatgtgctggaaggcaacgaacagtttattaacgcggcgaaaattattacccatccgagctataacagcaacaccctgaacaacgatattatgctgattaaactgagcagcccggcgaccctgaacagtcgcgtggcgaccgtgagcctgccgcgcagctgcgccgcggcgggcaccgaatgcctgattagcggctggggcaacaccaaaagcagcggcagcagctatccaagcctgctgcagtgcctgaaagcgccggtgctgagcgatagcagctgcaaaagcagctatccgggtcagattaccggcaacatgatttgcgcgggctatctggaaggcggcaaagatagctgccaaggcgatagcggcggcccggtggtgtgcaacggtcagctgcaaggcattgtgagctggggctatggctgcgcgcagaaaaacaaaccgggcgtgtataccaaagtgtgcaactatgtgaactggattcagcagaccattgcggcgaactaa(stop)ctcgag(xho1)

本发明人分别表达、纯化了重组猪胰蛋白酶和重组胰蛋白酶改造序列3，最终所得重组胰蛋白酶用荧光底物NFF-3(Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Lys(Dnp)-NH₂)进行酶活检测：用有机化合物二甲基亚砜(DMSO)溶解荧光底物NFF-3粉末配制成5mM储备液，避光保存。在进行测定时用缓冲液(10mM Tris pH8.0，150mM NaCl，10mM CaCl₂，0.1％PEG8000，0.1mg/mL BSA)稀释底物储备液至50uM工作液。测定时分别取0、1、2、4、6、8和10ng的重组猪胰蛋白酶和重组胰蛋白酶3加入96孔黑色平底酶标板中，而后加入100uL50uM的荧光底物NFF-3，立即放入酶标仪中以激发光325nm，吸收光393nm，每30秒进行一次读数共计5分钟，记录拟合每组数据的斜率结果。

结果如图4，可见针对重组胰蛋白酶N75S，F76Y，G78S，D82N，V163A和F165Y的改造显著地提高了重组胰蛋白酶的活性。

实施例3、重组胰蛋白酶改造序列4的制备及测定

综合实施例1和2的结果，本发明人进行进一步的优化改造，在猪胰蛋白酶序列的基础上设计出重组胰蛋白酶改造序列4(Recombinant Trypsin4-R99L，K125L，K139L，N75S，F76Y，G78S，D82N，V163A，F165Y)，具体如下(SEQ ID NO:11)：

对SEQ ID NO:11的猪胰蛋白酶进行密码子优化后的核苷酸序列(人工全基因合成)如下(SEQ ID NO:12)：

ggatcc(bamh1)attgtgggcggctatacctgcgcggcgaacagcattccgtatcaagtgagcctgaacagcggcagccatttttgcggcggcagcctgattaacagtcagtgggtggtgagcgcggcgcattgctataaaagccgcattcaagtgcgcctgggcgaacataacattgatgtgctggaaggcaacgaacagtttattaacgcggcgaaaattattacccatccgagctataacagcaacaccctgaacaacgatattatgctgattaaactgagcagcccggccaccctgaacagcctggtggcgaccgtgagcctgccgcgcagctgcgcggccgcgggcaccgaatgcctgattagcggctggggcaacaccctgagcagcggcagcagctatccaagcctgctgcagtgcctgctggcgccggtgctgagcgatagcagctgcaaaagcagctatccgggtcagattaccggcaacatgatttgcgcgggctatctggaaggcggcaaagatagctgccaaggcgatagcggcggcccggtggtgtgcaacggtcagctgcaaggcattgtgagctggggctatggctgcgcgcagaaaaacaaaccgggcgtgtataccaaagtgtgcaactatgtgaactggattcagcagaccattgcggcgaactaa(stop)ctcgag(xho1)

本发明人分别表达、纯化了重组猪胰蛋白酶、重组牛胰蛋白酶和重组胰蛋白酶改造序列4(简称重组胰蛋白酶4，Mutant-4)，分别用相同溶解液、复性液进行蛋白复性。溶解液组分为：8M尿素，10mM二硫苏糖醇(DTT)，20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.0。复性液的组分为：2M尿素，20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.5，5mM还原型谷胱甘肽(GSH)或者半胱氨酸(Cysteine)，0.5mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)或者胱氨酸(Cystine)，10％甘油，10mM氯化钙。结果显示，重组牛胰蛋白酶的复性率最低，仅在8％左右；重组猪胰蛋白酶(WT)复性率最高，约在60％；重组胰蛋白酶改造序列4复性率约在58％，见图5。

用荧光底物NFF-3检测纯化后重组胰蛋白酶的酶活，酶活计算方法：分别取0、1、2、4、6、8和10ng的重组牛胰蛋白酶、重组猪胰蛋白酶和重组胰蛋白酶3(见X轴)加入96孔黑色平底酶标板中，加入100uL 50uM的荧光底物NFF-3，在酶标仪中以激发光325nm，吸收光393nm，每30秒进行一次读数共计5分钟，记录拟合每组数据的斜率结果。结果发现，重组胰蛋白酶4与重组牛胰蛋白酶的活力相当，整体高于重组猪胰蛋白酶(WT)约1.4倍，见图6。

经胰蛋白酶稳定性试验检测发现，在20mM CaCl₂存在的条件下，重组胰蛋白酶4与重组猪胰蛋白酶的稳定性相当，而重组牛胰蛋白酶的稳定性较差，见图7。

综上所述，针对猪胰蛋白酶序列进行R99L，K125L，K139L，N75S，F76Y，G78S，D82N，V163A和F165Y改造获得的重组胰蛋白酶4，具有猪胰蛋白酶的高复性率和热稳定性的同时，具有牛胰蛋白酶的高活性。

实施例4、His-SUMO3标签融合重组胰蛋白酶改造序列4的纯化方法

本实施例中，利用pSUMO3载体在His-SUMO3标签蛋白(SEQ ID NO:13第102位“G”)，在其C末端甘氨酸后连接重组胰蛋白酶改造序列4(SEQ ID NO:11)的第1位异亮氨酸。

His-SUMO3融合标签氨基酸序列(SEQ ID NO:13)：

His-SUMO3融合标签核苷酸序列(SEQ ID NO:14)：

ATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCCCTGCAGGAGGAGAAGCCCAAGGAGGGTGTGAAGACAGAGAATGACCACATCAACCTGAAGGTGGCCGGGCAGGACGGCTCCGTGGTGCAGTTCAAGATCAAGAGGCACACGCCGCTGAGCAAGCTGATGAAGGCCTACTGCGAGAGGCAGGGCTTGTCAATGAGGCAGATCAGATTCAGGTTCGACGGGCAGCCAATCAATGAAACTGACACTCCAGCACAGCTGGAGATGGAGGACGAGGACACCATCGACGTGTTCCAGCAGCAGACGGGCGGA

利用大肠杆菌过表达His-SUMO3标签融合的重组胰蛋白酶，获得包涵体蛋白。

His-SUMO3标签融合的重组胰蛋白酶包涵体蛋白的清洗、溶解：清洗液组分为：25mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH7.4，100mM NaCl，0.5％Triton-X100；溶解液组分为：8M尿素，10mM二硫苏糖醇(DTT)，20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.0。

His-SUMO3标签融合重组胰蛋白酶包涵体蛋白的复性：复性液组分：2M尿素，20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.0，5mM还原型谷胱甘肽(GSH)或者半胱氨酸(Cysteine)，0.5mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)或者胱氨酸(Cystine)，10％甘油，10mM氯化钙。

重组胰蛋白酶的纯化：His-SUMO3标签融合重组胰蛋白酶4的纯化方法整体流程图见图8。包涵体蛋白复性后，通过浓缩、稀释的方式将样品溶液进行置换到平衡液(10mMTris pH7.4，300mM NaCl)中，过滤澄清样品溶液后经过平衡液预平衡的耐还原螯合型镍亲和层析树脂(BeyoGold^TMHis-tag Purification Resin)，平衡液冲洗3-5个柱体积去除非特异性结合的蛋白后，注入1个柱体积内含有特异性超高的SUMO特异性蛋白酶2(SENP2)的平衡液，室温反应2小时切除His-SUMO3标签蛋白后，再次用平衡液冲洗1-2个柱体积收集流穿液，该步骤的流穿液即为不含有His-SUMO3标签的重组胰蛋白酶4，该流穿液无需置换溶液可直接上样至平衡液预平衡的苯甲脒琼亲和层析树脂(Benzamidine Sepharose 4FF)，错误折叠导致三维构象不正确的重组胰蛋白酶无法结合层析柱而流穿，用洗脱液(50mMglycine，pH3.0)进行洗脱，即可得到最终纯化完成的具有正确构象和高蛋白酶活性的重组胰蛋白酶4。

本发明最终纯化得到的重组胰蛋白酶4进行SDS-PAGE胶检测纯度：分别取0.5、1和2μg的重组胰蛋白酶4，经含有DTT还原剂(可以打开全部二硫键)的1X SDS loading(Reduced)和不含还原剂的1X SDS loading(Non-reduced)处理样品，经SDS-PAGE胶电泳后用考马斯亮蓝染液进行染色。

结果见图9，显示重组胰蛋白酶4的纯度高，只有一条单链形式的β-胰蛋白酶主带构象均一。

以上所述仅是本发明的优选实施方式。应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海碧云天生物技术有限公司

<120> 胰蛋白酶突变体、其制备方法及其应用

<130> 211214

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 223

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 1

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser

20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val

35 40 45

Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe

50 55 60

Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr

65 70 75 80

Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu

85 90 95

Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala

100 105 110

Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser

130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met

145 150 155 160

Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp

165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser

180 185 190

Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys

195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn

210 215 220

<210> 2

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggatccatcg tgggtggtta tacctgtgca gcaaatagta ttccgtatca ggtgagcctg 60

aatagcggta gtcatttttg cggtggcagc ctgattaata gtcagtgggt ggttagtgcc 120

gcacattgct ataaaagtcg tattcaggtt cgcctgggtg aacataatat tgatgtgctg 180

gaaggtaatg aacagtttat taatgcagca aaaatcatca cccatccgaa ttttaatggc 240

aataccctgg ataatgatat tatgctgatt aagctgagca gtccggcaac cctgaatagc 300

cgcgtggcaa ccgttagcct gccgcgcagc tgcgcagcag caggtaccga atgcctgatt 360

agcggttggg gtaataccaa aagtagtggc agcagttatc cgagcctgct gcagtgcctg 420

aaagccccgg ttctgagcga tagtagctgt aaaagcagct atccgggcca gattaccggc 480

aatatgattt gcgttggctt tctggaaggc ggcaaagata gctgtcaggg cgatagtggt 540

ggtccggttg tttgcaatgg tcagctgcag ggcattgtga gttggggcta tggctgcgca 600

cagaaaaata agccgggtgt ttataccaaa gtgtgtaatt atgttaactg gattcagcag 660

accattgccg ccaattaact cgag 684

<210> 3

<211> 223

<212> PRT

<213> 牛(Bos taurus)

<400> 3

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Gly Ala Asn Thr Val Pro Tyr Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser

20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Gly Ile Gln Val

35 40 45

Arg Leu Gly Glu Asp Asn Ile Asn Val Val Glu Gly Asn Glu Gln Phe

50 55 60

Ile Ser Ala Ser Lys Ser Ile Val His Pro Ser Tyr Asn Ser Asn Thr

65 70 75 80

Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Lys Ser Ala Ala Ser Leu

85 90 95

Asn Ser Arg Val Ala Ser Ile Ser Leu Pro Thr Ser Cys Ala Ser Ala

100 105 110

Gly Thr Gln Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly

115 120 125

Thr Ser Tyr Pro Asp Val Leu Lys Cys Leu Lys Ala Pro Ile Leu Ser

130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ala Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Ser Asn Met

145 150 155 160

Phe Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp

165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Ser Gly Lys Leu Gln Gly Ile Val Ser

180 185 190

Trp Gly Ser Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys

195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Ser Trp Ile Lys Gln Thr Ile Ala Ser Asn

210 215 220

<210> 4

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatccattg tgggcggcta tacctgcggc gcgaacaccg tgccgtatca agtgagcctg 60

aacagtggct atcatttttg cggcggcagc ctgattaaca gtcagtgggt ggtgagcgcg 120

gcgcattgct ataaaagcgg cattcaagtg cgcctgggcg aagataacat taacgtggtg 180

gaaggcaacg aacagtttat tagcgcgagc aaaagcattg tgcatccgag ctataacagc 240

aacaccctga acaacgatat tatgctgatt aaactgaaaa gcgcggcgag cctgaacagc 300

cgcgtggcga gcattagcct gccgacgagc tgcgcgagcg cgggcacgca gtgcctgatt 360

agcggctggg gcaacaccaa aagcagcggc acgagctatc cggatgtgct gaaatgcctg 420

aaagcgccga ttctgagcga tagcagctgc aaaagcgcgt atccgggtca gattacgagc 480

aacatgtttt gcgcgggcta tctggaaggc ggcaaagata gctgccaagg cgatagcggc 540

ggcccggtgg tgtgcagcgg caaactgcaa ggcattgtga gctggggcag cggctgcgcg 600

cagaaaaaca aaccgggcgt gtataccaaa gtgtgcaact atgtgagctg gattaaacag 660

accattgcga gcaactaact cgag 684

<210> 5

<211> 223

<212> PRT

<213> 羊(Capra hircus)

<400> 5

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Gly Ala Asn Thr Val Pro Tyr Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser

20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Gly Ile Gln Val

35 40 45

Arg Leu Gly Glu Asp Asn Ile Asn Val Val Glu Gly Asn Glu Gln Phe

50 55 60

Ile Ser Ala Ser Lys Ser Ile Val His Pro Ser Tyr Asn Ser Asn Thr

65 70 75 80

Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Lys Ser Ala Ala Ser Leu

85 90 95

Asn Ser Arg Val Ala Ser Val Ser Leu Pro Thr Ser Cys Ala Ser Ala

100 105 110

Gly Thr Gln Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly

115 120 125

Thr Ser Tyr Pro Asp Val Leu Gln Cys Leu Lys Ala Pro Ile Leu Ser

130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ala Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Ser Asn Met

145 150 155 160

Phe Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp

165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Ser Gly Lys Leu Gln Gly Ile Val Ser

180 185 190

Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys

195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Ser Trp Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ser Asn

210 215 220

<210> 6

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggatccattg tgggcggcta tacctgcggc gcgaacaccg tgccgtatca agtgagcctg 60

aacagcggct atcatttttg cggcggcagc ctgattaaca gtcagtgggt ggtgagcgcg 120

gcgcattgct ataaaagcgg cattcaagtg cgcctgggcg aagataacat taacgtggtg 180

gaaggcaacg aacagtttat tagcgcgagc aaaagcattg tgcatccgag ctataacagc 240

aacaccctga acaacgatat tatgctgatt aaactgaaaa gcgcggcgag cctgaacagc 300

cgcgtggcga gtgtgagcct gccgacgagc tgcgcgagcg ccggcacgca gtgcctgatt 360

agcggctggg gcaacaccaa aagcagcggc acgagctatc cggatgtgct gcagtgcctg 420

aaagcgccga ttctgagcga tagcagctgc aaaagcgcgt atccgggtca gattacgagc 480

aacatgtttt gcgcgggcta tctggaaggc ggcaaagata gctgccaagg cgatagcggc 540

ggcccggtgg tgtgcagcgg caaactgcaa ggcattgtga gctggggcta tggctgcgcg 600

cagaaaaaca aaccgggcgt gtataccaaa gtgtgcaact atgtgagctg gattcagcag 660

accattgcga gcaactaact cgag 684

<210> 7

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser

20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val

35 40 45

Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe

50 55 60

Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr

65 70 75 80

Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu

85 90 95

Asn Ser Leu Val Ala Thr Val Ser Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala

100 105 110

Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Leu Ser Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Leu Ala Pro Val Leu Ser

130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met

145 150 155 160

Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp

165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser

180 185 190

Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys

195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn

210 215 220

<210> 8

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggatccattg tgggcggcta tacctgcgcg gcgaacagca ttccgtatca agtgagcctg 60

aacagcggca gccatttttg cggcggcagc ctgattaaca gtcagtgggt ggtgagcgcg 120

gcgcattgct ataaaagccg cattcaagtg cgcctgggcg aacataacat tgatgtgctg 180

gaaggcaacg aacagtttat taacgcggcg aaaattatta cccatccgaa ctttaacggc 240

aacaccctgg ataacgatat tatgctgatt aaactgagca gcccggccac cctgaacagc 300

ctggtggcga ccgtgagcct gccgcgcagc tgcgcggccg cgggcaccga atgcctgatt 360

agcggctggg gcaacaccct gagcagcggc agcagctatc caagcctgct gcagtgcctg 420

ctggcgccgg tgctgagcga tagcagctgc aaaagcagct atccgggtca gattaccggc 480

aacatgattt gcgtgggctt tctggaaggc ggcaaagata gctgccaagg cgatagcggc 540

ggcccggtgg tgtgcaacgg tcagctgcaa ggcattgtga gctggggcta tggctgcgcg 600

cagaaaaaca aaccgggcgt gtataccaaa gtgtgcaact atgtgaactg gattcagcag 660

accattgcgg cgaactaact cgag 684

<210> 9

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser

20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val

35 40 45

Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe

50 55 60

Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Ser Tyr Asn Ser Asn Thr

65 70 75 80

Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu

85 90 95

Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala

100 105 110

Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser

130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met

145 150 155 160

Ile Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp

165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser

180 185 190

Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys

195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn

210 215 220

<210> 10

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggatccattg tgggcggcta tacctgcgcg gcgaacagca ttccgtatca agtgagcctg 60

aacagcggca gccatttttg cggcggcagc ctgattaaca gtcagtgggt ggtgagcgcg 120

gcgcattgct ataaaagccg cattcaagtg cgcctgggcg aacataacat tgatgtgctg 180

gaaggcaacg aacagtttat taacgcggcg aaaattatta cccatccgag ctataacagc 240

aacaccctga acaacgatat tatgctgatt aaactgagca gcccggcgac cctgaacagt 300

cgcgtggcga ccgtgagcct gccgcgcagc tgcgccgcgg cgggcaccga atgcctgatt 360

agcggctggg gcaacaccaa aagcagcggc agcagctatc caagcctgct gcagtgcctg 420

aaagcgccgg tgctgagcga tagcagctgc aaaagcagct atccgggtca gattaccggc 480

aacatgattt gcgcgggcta tctggaaggc ggcaaagata gctgccaagg cgatagcggc 540

ggcccggtgg tgtgcaacgg tcagctgcaa ggcattgtga gctggggcta tggctgcgcg 600

cagaaaaaca aaccgggcgt gtataccaaa gtgtgcaact atgtgaactg gattcagcag 660

accattgcgg cgaactaact cgag 684

<210> 11

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser

20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val

35 40 45

Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe

50 55 60

Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Ser Tyr Asn Ser Asn Thr

65 70 75 80

Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu

85 90 95

Asn Ser Leu Val Ala Thr Val Ser Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala

100 105 110

Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Leu Ser Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Leu Ala Pro Val Leu Ser

130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met

145 150 155 160

Ile Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp

165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser

180 185 190

Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys

195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn

210 215 220

<210> 12

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggatccattg tgggcggcta tacctgcgcg gcgaacagca ttccgtatca agtgagcctg 60

aacagcggca gccatttttg cggcggcagc ctgattaaca gtcagtgggt ggtgagcgcg 120

gcgcattgct ataaaagccg cattcaagtg cgcctgggcg aacataacat tgatgtgctg 180

gaaggcaacg aacagtttat taacgcggcg aaaattatta cccatccgag ctataacagc 240

aacaccctga acaacgatat tatgctgatt aaactgagca gcccggccac cctgaacagc 300

ctggtggcga ccgtgagcct gccgcgcagc tgcgcggccg cgggcaccga atgcctgatt 360

agcggctggg gcaacaccct gagcagcggc agcagctatc caagcctgct gcagtgcctg 420

ctggcgccgg tgctgagcga tagcagctgc aaaagcagct atccgggtca gattaccggc 480

aacatgattt gcgcgggcta tctggaaggc ggcaaagata gctgccaagg cgatagcggc 540

ggcccggtgg tgtgcaacgg tcagctgcaa ggcattgtga gctggggcta tggctgcgcg 600

cagaaaaaca aaccgggcgt gtataccaaa gtgtgcaact atgtgaactg gattcagcag 660

accattgcgg cgaactaact cgag 684

<210> 13

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Gly His His His His His His Gly Ser Leu Gln Glu Glu Lys Pro

1 5 10 15

Lys Glu Gly Val Lys Thr Glu Asn Asp His Ile Asn Leu Lys Val Ala

20 25 30

Gly Gln Asp Gly Ser Val Val Gln Phe Lys Ile Lys Arg His Thr Pro

35 40 45

Leu Ser Lys Leu Met Lys Ala Tyr Cys Glu Arg Gln Gly Leu Ser Met

50 55 60

Arg Gln Ile Arg Phe Arg Phe Asp Gly Gln Pro Ile Asn Glu Thr Asp

65 70 75 80

Thr Pro Ala Gln Leu Glu Met Glu Asp Glu Asp Thr Ile Asp Val Phe

85 90 95

Gln Gln Gln Thr Gly Gly

100

<210> 14

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgggtcatc accatcatca tcacgggtcc ctgcaggagg agaagcccaa ggagggtgtg 60

aagacagaga atgaccacat caacctgaag gtggccgggc aggacggctc cgtggtgcag 120

ttcaagatca agaggcacac gccgctgagc aagctgatga aggcctactg cgagaggcag 180

ggcttgtcaa tgaggcagat cagattcagg ttcgacgggc agccaatcaa tgaaactgac 240

actccagcac agctggagat ggaggacgag gacaccatcg acgtgttcca gcagcagacg 300

ggcgga 306

Claims

1.一种胰蛋白酶突变体，其是：

(a) 氨基酸序列选自SEQ ID NO: 7，SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11的胰蛋白酶突变体；或

(b) 在(a)酶的氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

2.一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的胰蛋白酶突变体。

3. 如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO: 12或其第7-678位序列。

4. 如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO: 10或其第7-678位序列。

5.一种载体，其含有权利要求2-4任一所述的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体还包括编码SUMO标签和/或His标签的核苷酸序列。

7. 如权利要求6所述的载体，其特征在于，包括编码His-SUMO3标签的核苷酸序列，所述His-SUMO3标签的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。

8.如权利要求7所述的载体，其特征在于，该载体表达的融合蛋白中，His-SUMO3标签蛋白的C端连接权利要求1所述的胰蛋白酶突变体。

9.一种遗传工程化的宿主细胞，其含有权利要求5-8任一所述的载体，或基因组中整合有权利要求2-4任一所述的多核苷酸；所述的宿主细胞为原核细胞。

10.如权利要求9所述的遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

11. 一种提高胰蛋白酶的活性或稳定性的方法，包括改造SEQ ID NO: 1所示的胰蛋白酶，形成氨基酸序列选自下组的胰蛋白酶突变体：SEQ ID NO: 7，SEQ ID NO: 9或SEQ IDNO: 11。

12.权利要求1所述的胰蛋白酶突变体的制备方法，该方法包含：

(i) 培养权利要求9-10任一所述的宿主细胞；

(ii) 收集含有所述的胰蛋白酶突变体的培养物；

(iii) 从培养物中分离出所述的胰蛋白酶突变体。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，当胰蛋白酶突变体的核苷酸序列与编码SUMO标签和/或His标签的核苷酸序列融合表达、获得融合蛋白包涵体后，还包括：包涵体变性、复性、纯化的步骤。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的纯化步骤中，包括：添加SUMO蛋白水解酶、切割融合蛋白、分离获得所述胰蛋白酶突变体。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述SUMO蛋白水解酶为SUMO特异性蛋白酶2。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，以His-SUMO3标签与所述胰蛋白酶突变体融合表达，对获得的包涵体蛋白进行清洗、溶解，之后进行复性。

17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，清洗液包括：10-50mM三羟甲基氨基甲烷pH7.4，0.1-1M NaCl，0.1-1% Triton X-100。

18. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，溶解液包括：6-8M尿素，5-50mM 二硫苏糖醇，10-50mM三羟甲基氨基甲烷pH8.0。

19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，复性液包括：1.5-2.5M尿素，10-100mM三羟甲基氨基甲烷pH8.0，1-10mM还原型谷胱甘肽或者半胱氨酸，0.2-10mM氧化型谷胱甘肽或者胱氨酸，5-15%甘油，1-10mM氯化钙。

20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，包涵体蛋白复性后，上样亲和层析树脂，柱上切除His-SUMO3标签，收集含有胰蛋白酶突变体的流穿液，纯化得到的有活性的胰蛋白酶突变体。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，包涵体蛋白复性后，上样到耐还原螯合型的镍亲和层析树脂，柱上切除His-SUMO3标签，收集含有胰蛋白酶突变体的流穿液，之后经苯甲脒琼亲和层析树脂纯化得到的有活性的胰蛋白酶突变体。

22.权利要求1所述的胰蛋白酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物的用途，用于酶解蛋白质或变性蛋白质。

23.如权利要求22所述的用途，其特征在于，所述酶解蛋白质或变性蛋白质为：通过特异性识别和水解精氨酸和赖氨酸，酶解蛋白质或者变性蛋白质。

24.一种酶解蛋白质或变性蛋白质的方法，包括：利用权利要求1所述的胰蛋白酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物进行酶解反应。

25.一种用于酶解蛋白质或变性蛋白质的检测体系或检测试剂盒，其中含有：权利要求1所述的胰蛋白酶突变体，表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物。