KR102345013B1

KR102345013B1 - GroES 융합을 이용한 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체의 생산방법

Info

Publication number: KR102345013B1
Application number: KR1020210066431A
Authority: KR
Inventors: 김성건
Original assignee: 주식회사 펩진
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2021-12-29
Also published as: KR20210010368A; KR20210063310A

Abstract

본 발명의 일실시예는, 융합태그, 상기 융합태그와 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체를 포함하는 융합 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 융합태그를 사용하면, 종래 융합태그 대비 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체의 수율을 향상시킬 수 있다. 특히, 상대적으로 분자량이 작으며 분해되기 쉬운 아미노 말단을 갖는 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체를 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조하는 경우에 유용하다. 또한, 본 발명의 일실시예에 따른 융합태그를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 숙주세포 내에서 내포체 형태로 발현이 유도됨으로써 숙주세포의 단백질 분해효소 등으로부터 보호되어 안정적으로 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체를 생산할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 종래의 융합태그를 사용한 경우보다 안정성 및 수율이 향상된 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체 생산 방법을 제공할 수 있다.

Description

GroES 융합을 이용한 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체의 생산방법{METHOD FOR PRODUCTION OF GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-2 OR ANALOGUES WITH GROES PUSION}

본 발명은 신규한 융합태그로서, 상기 융합태그와 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체를 포함하는 융합 폴리펩타이드에 관한 것이다.

최근 유전공학 및 생명공학 기술의 발달로 대장균, 효모, 동식물세포 등을 이용하여 유용한 외래 단백질이 많이 생산되고, 이들 단백질이 의약품 등으로 널리 이용되고 있다. 구체적으로, 면역 조절제, 효소 저해제 및 호르몬 같은 의약 및 연구용 단백질이나 반응 첨가 효소와 같은 산업용 단백질에 대한 생산 공정 기술 개발 및 산업화가 추진되고 있다.

이중에서도 유전자 재조합 기술은 여러 목적 단백질들의 핵산을 발현벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 얻고, 이를 적당한 숙주세포에 형질전환시켜 배양함으로써 목적 단백질 또는 목적 폴리펩타이드를 생산하는 방법이다. 다만, 숙주세포에 내재된 분해 효소(예를 들어, 프로테아제(protease) 또는 펩티다제(peptidase))에 의해 목적 단백질또는 목적 폴리펩타이드의 전체 또는 일부가 분해되어 수율이 낮아지거나, 융합태그로 사용하는 펩타이드의 크기가 제조하고자 하는 목적 단백질 또는 목적 폴리펩타이드의 크기에 비해 너무 커서 수율이 현저히 떨어지는 문제가 있다.

따라서, 유전자 재조합 기술을 이용하여 목적 단백질 또는 목적 폴리펩타이드을 대량 생산하고자 하는 경우, 목적 단백질 또는 목적 폴리펩타이드를 안정적으로 발현시키면서도 생산 수율을 향상시킬 수 있는 융합태그를 개발하는 것이 중요하다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체를 생산하기 위한 아미노산 서열로 이루어진 융합태그를 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면에 따른 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체 생산용 융합태그는 서열번호6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 융합태그는 상기 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체의 N말단에 위치할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 융합태그는 상기 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체와 함께 발현되어 봉입체(inclusion body)를 형성할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 융합태그는 상기 융합태그와 상기 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체를 연결시켜주는 링커를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 링커는 친화성 태그를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 링커는 프로테아제 인식 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 프로테아제 인식 서열은 상기 링커의 C말단에 위치할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 프로테아제 인식 서열은 담배 식각 바이러스 프로테아제 인식 서열, 엔테로키나아제 인식 서열, 유비퀴틴 카르복시 말단 가수분해효소 인식 서열, 인자Xa 인식 서열, 퓨린 인식 서열 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 프로테아제 인식 서열은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 신규한 융합태그를 사용하면, 종래 융합태그 대비 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체의 수율을 향상시킬 수 있다. 특히, 상대적으로 분자량이 작으며 분해되기 쉬운 아미노 말단을 갖는 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체를 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조하는 경우에 유용하다. 또한, 본 발명의 실시예에 따른 융합태그를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 숙주세포 내에서 내포체 형태로 발현이 유도됨으로써 숙주세포의 단백질 분해효소 등으로부터 보호되어 안정적으로 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체를 생산할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 종래의 융합태그를 사용한 경우보다 안정성 및 수율이 향상된 재조합 펩타이드 생산 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 재조합 대장균에서 발현된 H6TEV-GLP-2A2G, PG97-H6TEV-GLP-2A2G, SUMO-H6TEV-GLP-2A2G의 총세포 분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 M: 마커 단백질, 레인 1: H6TEV-GLP-2A2G (균주 번호 PG012), 레인 2: PG97-H6TEV-GLP-2A2G(균주 번호 PG041), 레인 3: SUMO-H6TEV-GLP-2A2G(균주 번호 PG051)).
도 2는 크로마토그래피를 통해 정제한 PG97-H6TEV-GLP-2A2G 융합 폴리펩타이드를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 M: 마커 단백질, 레인 s: 정제 전 시료, 레인 2~4: 통과액 분획, 레인 8~11: 용출액 분획). 화살표는 PG97-H6TEV-GLP-2A2G 융합 폴리펩타이드를 나타낸다.
도 3은 TEV 프로테아제를 이용하여 정제된 PG97-H6TEV-GLP-2A2G 를 절단한 후 분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 1: 마커 단백질, 레인 C: TEV 프로테아제를 처리하지 않은 시료, 레인 T: TEV 프로테아제를 처리한 시료).
도 4는 니켈 친화 크로마토그래피를 이용하여 PG97-H6TEV-GLP-2A2G 로부터 절단된 PG97-H6TEV와 GLP-2A2G을 분리한 분획들을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다 (레인 M: 마커 단백질, 레인 S: 정제 전 시료, 레인 FT: 통과액 분획, 레인 W: 세척 분획, 레인 E: 용출액 분획).
도 5는 화학합성된 GLP-2A2G 의 분자량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따라 정제된 GLP-2A2G의 분자량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 역상 HPLC 방법으로 화학합성된 GLP-2A2G과 본 발명에 따른 재조합 GLP-2A2G 의 체류시간 및 순도를 확인한 그래프이다. 도 7(a) 및 도 7(b)의 그래프는 화학합성된 GLP-2A2G과 재조합 GLP-2A2G 의 역상 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 일측면에 따른 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2) 또는 이의 유사체 생산용 융합태그는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

재조합 미생물 시스템을 이용하여 여러가지 목적 펩타이드 또는 목적 단백질을 생산하는 경우, 그 목적 물질의 물성에 따라 숙주 세포 내 효소에 의한 분해, 낮은 발현 수준, 부적절한 단백질 폴딩 및/또는 낮은 mRNA 안정성 등으로 인해 수율이 저하될 우려가 있다. 예를 들어, 종래 융합 태그로 활용되는 MBP (maltose binding protein), 글투타티온 S-전달효소 (glutathione-S-transferase), 티오레독신(thioredoxin), SUMO, 유비퀴틴 등은 각각 397, 216, 106, 101, 76 개의 아미노 산을 갖는데, 비교적 저분자량의 목적 폴리펩타이드 등을 생산 시 수율이 좋지 못한 문제가 있었다.

이에 반해, 본 발명에 따른 상기 융합태그는 상대적으로 분자량이 작은 펩타이드로서, 이를 적용하여 GLP-1, GLP-2 또는 hPTH 1-34 등의 목적 폴리펩타이드 또는 목적 단백질을 생산하는 경우 기존의 융합태그들을 활용한 경우보다 향상된 수율로 목적 폴리펩타이드 또는 목적 단백질을 수득할 수 있다. 예를 들어, 재조합 융합 폴리펩타이드에서 GLP-2의 비율을 아래 표 1에 개략적으로 나타내었다.

융합 파트너	아미노산 개수	분자량 (kDa)	목적 펩타이드 비율 (%)*
MBP(Maltose binding protein)	397	44.2	8
글루타티온 S-전달효소	216	23.8	12
서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 융합태그	57 ~ 97	6.3 - 10.4	23 - 33

*GLP-2를 기준으로 링커를 포함하여 계산표 1에 나타난 바와 같이, 종래의 융합태그들은 융합 폴리펩타이드에서 GLP-2의 비율이 8% 내지 12%등에 그치는 반면, 본 발명에 따른 융합태그가 융합된 융합 폴리펩타이드에서의 GLP-2의 비율은 23% 내지 33%로 확인된다. 따라서, 동일한 농도의 융합 폴리펩타이드로부터 얻을 수 있는 GLP-2의 양이 종래 융합태그 대비 더 높으므로 최종 생산 수율이 향상될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 융합태그는 융합 폴리펩타이드의 불용성 발현을 유도하여 융합 폴리펩타이드가 불용성 내포체로서 숙주세포 내로 고농도로 축적되게 할 수 있다. 따라서, 대장균(Escherichia coli) 등의 숙주세포 내에서 프로테아제 및 펩티다제에 의해 전부 혹은 일부가 분해 혹은 절단될 우려가 있는 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2) 또는 이의 유사체를 고수율로 수득하기 용이한 장점이 있다.

구체적으로, 상기 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 융합태그는 97개의 아미노산을 갖는 펩타이드를 포함할 수 있다.

또한, 상기 융합태그는 다양하게 변형된 펩타이드, 즉 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변형은 융합태그의 기능을 변형시키지 않는 내에서 하나 이상의 단백질을 치환, 결실 또는 추가하는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 이러한 다양한 펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열 중 어느 하나와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 전술한 바와 같은 융합태그, 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체, 및 상기 융합태그와 상기 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체 사이에 링커를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공할 수 있다.

상기 링커는 친화성 태그를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "친화성 태그"는 재조합 융합 폴리펩타타이드 또는 이를 코딩하는 핵산에 도입될 수 있는 펩타이드 또는 핵산 서열로서 다양한 목적으로 사용될 수 있으며, 예를 들어 목적 폴리펩타이드 또는 목적 단백질의 정제 효율을 높이기 위한 것일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 친화성 태그는 당 업계에 공지된 임의의 적합한 물질을 원하는 바에 따라 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용되는 친화성 태그는 폴리히스티딘 태그(서열번호8)일 수 있다.

또한, 상기 링커는 프로테아제 인식 서열을 포함할 수 있다. 프로테아제란, 특정 아미노산 서열을 인식하여, 인식한 서열 내의 펩타이드 결합이나 그 서열의 마지막 아미노산과 융합된 폴리펩타이드의 첫번째 아미노산과의 펩타이드 결합을 절단하는 단백질 분해효소이다. 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드는 프로테아제 인식 서열을 갖는 링커를 포함함으로써, 최종 단계에서 폴리 펩타이드 정제 시 절단 효소 인식 서열이 포함된 아미노 말단(친화성 태그를 사용한 경우에는 친화성 태그도 포함)과 목적 폴리펩타이드 또는 목적 단백질의 N-말단을 분리시켜 목적 폴리펩타이드 또는 목적 단백질을 회수할 수 있다.

구체적으로, 상기 프로테아제 인식 서열은 담배 식각 바이러스(TEV) 프로테아제 인식 서열, 엔테로키나아제 인식 서열, 유비퀴틴 가수분해효소 인식 서열, 인자Xa, 퓨린 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인식 서열일 수 있다. 예를 들어, 상기 프로테아제 인식 서열은 서열번호9의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.

상기 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체는 바람직하게 테두글루타이드일 수 있다.

상기 테두글루타이드는 33개의 아미노산으로 구성된 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2)에서 유래된 폴리펩타이드이고GLP-2의 2번째 알라닌이 글리신으로 치환(A2G)되어 있는 형태이다. 테두글루타이드는 희귀질환인 단장증후군(Short Bowel Syndrome), 화학 요법 유발성 설사(Chemotherapy-Induced Diarrhea) 및 장피 누공(Enterocutaneous Fistula)의 치료제로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은, 전술한 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리 뉴클레오타이드를 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 전술한 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함할 수 있다. 또한, 상기 플라스미드는 항생제 내성 유전자와 같은 선별마커를 포함할 수 있고, 플라스미드를 유지하는 숙주 세포는 선택적인 조건하에서 배양될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은, DNA서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합 단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵 및 진핵 세포를 나타낸다. 본 발명에서 사용된 용어, "형질주입된", "형질전환된" 및 "형질감염된"은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 세포 내로 핵산(예를 들어, 벡터)을 도입하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터는 유도성 발현 벡터의 일부로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 발현벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 발현 벡터로부터 융합 단백질의 발현을 유도한다. 발현 벡터는 플라스미드일 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 재조합 융합 단백질을 암호화하고 있는 유전자와 선별 마커에 대한 유전자를 추가로 포함하는 플라스미드이고, 숙주 세포는 플라스미드를 유지하도록 하는 선별 조건하에서 배양된다.

상기 발현 벡터는 단백질 코딩 서열 이외에 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 전사 종결 인자, 및 번역 개시 및 정지 신호 등의 단백질 발현과 관련된 조절 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유용한 목적 폴리펩타이드의 발현 수준에 영향을 주는 RBS는 다양한 생물의 유전자나 합성을 통해 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 프로모터는 조절되는 유도성 프로모터로서, 예를 들어, T7 프로모터, Lac 프로모터, Tac 프로모터 및 Trc 프로모터로부터 유래한 프로모터일 수 있다. 구체적으로, T7 프로모터는 일반적으로 Lac 계열 프로모터를 사용하는 발현 시스템에는 발현 조절자로서 LacI 유전자가 발현 시스템에 존재할 수 있다. 보통 항시적으로 발현되는 유전자인 LacI 유전자는 Lac 패밀리 프로모터의 lac 작동 인자(operator)에 결합하는 Lac 억제인자 단백질 LacI 단백질을 코딩한다. 따라서, Lac 계열 프로모터가 이용되는 경우, Lac 유전자는 또한 발현시스템에 포함되고 발현될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공할 수 있다. 적절한 숙주 세포는, 본 발명의 DNA 서열이 형질주입 또는 형질감염되어, 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체의 발현 및/또는 분비에 이용될 수 있으며, 본 발명에 사용될 수 있는 바람직한 숙주 세포는 대장균 세포, 불사의 하이브리도마 세포, NS/0 골수종 세포, 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, 인간 양수 유래 세포(CapT cell) 또는 COS 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 융합 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용된 숙주 균주는 대장균 BL21(DE3)이며, 상기 유전자 및 이들의 사용 방법은 당 업계에 공지되어 있다.

또한, 재조합 융합 단백질을 발현하기 위한 최적의 조건을 결정하기 위해 고처리량 스크리닝(high throughput screening)을 수행할 수 있다. 스크리닝에서 변화될 수 있는 조건은, 숙주 세포, 숙주 세포의 유전적 배경 (예를 들어, 다양한 프로테아제와 같은 특정 유전자의 결실), 발현 구조물 내 프로모터의 유형, 발현 구조물 내 RBS의 유형, 배양 온도, 유도성 프로모터가 사용될 때 유도 시 세포 탁도, lac 계열 프로모터가 사용될 때 유도에 사용되는 IPTG의 농도, 단백질 유도기간, 배양물에 유도제 첨가 후 배양 온도, 배양물의 교반 속도, 플라스미드 유지에 대한 선별 방법, 용기 내 배양물의 부피, 및 세포 용해 방법을 포함한다.

또한, "최적의 숙주 균주" 또는 "최적의 발현 시스템"은 유전형(genotype)이 상이한 다양한 숙주 세포와 비교하여 발현된 재조합 융합 단백질의 품질, 발현 양, 발현 수준 및/또는 위치를 기준으로 하여 확인하거나 선택할 수 있다. 따라서, 최적의 숙주 균주는 글루카곤 유사 펩타이드-2 또는 이의 유사체의 생산에 적합하도록 재조합 융합 단백질을 생산하는 균주이다. 목적 폴리펩타이드 또는 목적 단백질의 생산에 대한 높은 적합성은 생산되는 목적 폴리펩타이드 또는 목적 단백질에 따라 달라질 수 있지만 재조합 융합 단백질의 품질, 발현 양, 발현 수준, 예를 들어 목적 폴리펩타이드 또는 목적 단백질의 세포 내 분해 혹은 부분적인 절단 유무가 발생되었는지, 어느 정도의 발현양 혹은 발현 수준인지, 단백질이 적합하게 또는 바람직하게 폴딩되거나 불용성 내포체로 축적되었는지 등을 포함한다. 즉, 최적의 숙주 균주 또는 최적의 발현 시스템은 대조군 숙주 균주나 발현 시스템과 비교하여 특정 수준 이상의 생산 수율, 발현 양, 발현 수준, 회수 가능한 재조합 융합 단백질의 양, 적합하게 불용성 내포체 형태로 축적된 재조합 융합 단백질의 양을 생산할 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1. GLP-2A2G융합 폴리펩타이드의 제조 및 생산

실시예 1.1. GLP-2A2G 융합 폴리펩타이드 발현 플라스미드의 제작

GLP-2A2G 융합 폴리펩타이드(PG97-H6TEV-GLP-2A2G, 서열번호 32)에 대한 유전자는 overlap extension polymerase chain reaction (OE-PCR) 방법을 이용하여 합성하였다. 이때, 상기 GLP-2A2G융합 태그는 아미노 말단 융합태그로서PG97(서열번호 6)과6 히스티딘 태그(서열번호 8) 및 TEV 프로테아제 인식 서열(서열번호 9) 및 GLP-2A2G의 아미노산 서열(서열번호 30)이 포함되어 있다.

음성 대조군으로서 사용된 GLP-2A2G융합 폴리펩타이드(H6TEV-GLP-2A2G, 서열번호 31)는 아미노 말단 융합태그가 포함되어 있지 않고, 6 히스티딘 태그(서열번호 7), TEV 프로테아제 인식 서열(서열번호 8) 및 GLP-2A2G의 아미노산 서열(서열번호30)이 포함되어 있다.

양성 대조군으로 사용된 GLP-2A2G융합 폴리펩타이드(SUMO-H6TEV-GLP-2A2G서열번호 33)는 아미노 말단 융합태그 SUMO(서열번호 7) 와6 히스티딘 태그(서열번호 8) 및 TEV 프로테아제 인식 서열(서열번호 9) 및 GLP-2A2G의 아미노산 서열(서열번호 30)이 포함되어 있다.

각 융합 폴리펩타이드의 유전자는 제한 효소 NdeI, NcoI 및 XhoI의 인식 서열과 1개의 종결 코돈을 포함한다. 상기 GLP-2A2G융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 70에 해당하며, 음성 및 양성 대조군은 서열번호 69 및 서열번호 71에 해당한다.

아래 표2에 기재한 GLP-2A2G융합 폴리펩타이드 발현 플라스미드 pSGK520, pSGK505, pSGK754을 제작하기 위해서, OE-PCR로 합성된 GLP-2A2G융합단백질 유전자 단편을 NdeI 및 XhoI 제한 효소를 이용하여 절단하고, T7 프로모터, lac 작동자 및 LacI 유전자를 포함하여 IPTG에 의한 발현 조절이 가능한 발현 벡터pET26b에 클로닝하였다.

균주	숙주세포	플라스미드	재조합 융합 폴리펩타이드
PG012	E. coli BL21(DE3)	pSGK520	H6TEV-GLP-2A2G
PG041	E. coli BL21(DE3)	pSGK505	PG97-H6TEV-GLP-2A2G
PG051	E. coli BL21(DE3)	pSGK754	SUMO-H6TEV-GLP-2A2G

제작된 GLP-2A2G융합 폴리펩타이드 발현 플라스미드들은 DNA 염기서열 확인을 통해 정확한 클로닝 여부를 확인하였다. 제작된 GLP-2A2G융합 폴리펩타이드 발현 플라스미드들을 이용하여 염화칼슘을 이용한 화학적인 방법으로 대장균 BL21(DE3) 세포를 형질전환하였다. GLP-2A2G융합 폴리펩타이드의 발현 플라스미드들이 형질도입된 대장균들은 카나마이신(kanamycin)이 50 ㎍/㎖의 농도로 포함된 LB 고체배지에서 콜로니를 형성하였다. 형질전환된 대장균들은 각각 카나마이신이 50 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 LB 액체 배지에 배양한 후, 50% 글리세롤을 배양액과 동일한 부피로 첨가하여 세포 농축액(cell stock)을 만들고, 이를 -80℃ 온도의 냉동고에 보관하였다.

실시예 1.2. 형질전환된 세포의 배양 및 GLP-2A2G의 발현

-80℃ 온도에서 보관된 GLP-2A2G융합 폴리펩타이드의 발현 플라스미드들이 형질전환된 대장균의 세포 농축액을 실온에서 녹인 후 50 ㎕를 카나마이신이 50 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 LB 액체 배지 5 ㎖이 포함된 시험관에 첨가하여 37℃ 온도의 진탕배양기에서 12시간 동안 종균 배양하였다. 종균 배양된 대장균 2 ㎖는 카나마이신이 50 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 LB 액체 배지 200 ㎖이 포함된 플라스크에 첨가하여 37℃ 온도의 진탕배양기에서 배양하였다. 배양 약 3시간 후 세포의 광학밀도(OD600)가 약 1.0이 되었을 때, IPTG의 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 첨가하여 GLP-2A2G융합 폴리펩타이드의 발현을 유도하였다. 발현 유도 4시간 후에 광학 밀도를 측정하여 세포의 광학 밀도를 측정하였다.

실시예 1.3. 발현 수준 비교 분석을 위한 시료의 제조

발현 유도가 된 세포의 광학밀도가 10.0이 되도록 세포를 농축하고 50 mM 인산 나트륨, pH 7.2 완충액으로 재현탁시킨 후 초음파 세포 파쇄기(ultrasonic processor, Cole-Parmer)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포는 총 세포 분획으로 표지하였다. 세포 파쇄액은 12,000×g, 4℃ 온도에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 회수하고 가용성 분획으로 표지하였다. 불용성 분획은 500 ㎕의 50 mM 인산 나트륨, pH 7.2 완충액으로 초음파 세포 파쇄기를 이용하여 재현탁하고 불용성 분획으로 표지하였다.

실시예 1.4. SDS-PAGE 분석을 통한 생산된 GLP-2A2G융합 폴리펩타이드의 확인

50 ㎕의 총 세포, 가용성 및 불용성 분획을 각각 50 ㎕의 2배 농축된 SDS 시료 완충액(SDS sample buffer 2× concentrate, Sigma)에 혼합한 후, 95℃ 온도에서 5분간 가열하여 각 시료의 단백질이 변성될 수 있도록 하였다. 시료 내 변성된 단백질들은 16% SDS-PAGE 겔 및 TANK 완충액을 이용하여 분자량 크기에 따라 겔 내에서 분리될 수 있도록 하였다. SDS-PAGE 후 겔을 쿠마시 블루(Coomassie blue) R-250이 포함된 염색 완충액으로 염색한 후, 탈색 완충액으로 탈색하여 염색된 단백질만 보일 수 있도록 하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1을 참조하면, 음성 대조군인 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 융합태그가 포함되지 않은 H6TEV-GLP-2A2G(5.5 kDa의 분자량)의 밴드는 SDS-PAGE 젤에서 검출되지 않아 발현 후 세포내 단백질 분해효소에 의해 분해된 것으로 보인다. 덴시토미터 분석을 통해 아미노 말단 융합태그인PG97이 융합된 GLP-2A2G융합 폴리펩타이드인PG97-H6TEV-GLP-2A2G(15.7 kDa의 분자량)의 발현 수준은 대조군(H6TEV-GLP-2A2G) 대비 매우 향상된 것이 확인되었다. 또한 양성 대조군인 SUMO-H6TEV-GLP-2A2G(16.6 kDa의 분자량)와 비교해도 PG97-H6TEV-GLP-2A2G의 발현수준이 월등히 높았다(도 1).

실시예 2. PG97-H6TEV-GLP-2A2G의 회수 및 정제

실시예 2.1. 세포 파쇄 및 불용성 내포체 회수

플라스크 규모에서 발현된 세포의 냉동된 세포 펠렛을 50 ㎖의 50 mM 인산 나트륨, pH 7.2 완충액을 첨가하여 해동하였다. 재현탁된 세포는 초음파 세포 파쇄기(ultrasonic processor, Cole-Parmer)를 이용하여 파쇄하였다. 용해된 세포는 12,000 rpm(12,000×g) 조건에서 30분간 원심분리하고 상등액을 제거하여 재조합 융합 폴리펩타이드가 포함된 불용성 내포체 분획을 회수하였다.

실시예 2.2. 불용성 내포체 가용화

회수된 불용성 내포체 분획에 20 ㎖의 내포체 가용화 완충액(8 M 요소, 20 mM 트리스, 500 mM 염화나트륨, 50 mM 이미다졸, pH 7.4)을 첨가하고 25℃ 온도에서 4시간 동안 진탕배양하여 불용성 분획 내 내포체 형태의 재조합 융합 폴리펩타이드가 가용화될 수 있도록 하였다. 가용화된 불용성 분획 시료는 12,000Х에서 30분간 원심분리하고 상등액을 막필터(0.45/0.2 ㎛)를 통해 여과하였다.

실시예 2.3. PG97-H6TEV-GLP-2A2G의 정제

가용화된 불용성 분획 내의 PG97-H6TEV-GLP-2A2G의 정제를 위하여 S9 시료 펌프(Sample pump S9) 및 F9-C 분획 수집기(Fraction collector F9-C)이 장착된 AKTA pure 25 크로마토그라피 시스템(GE Healthcare)을 이용하였다. 가용화된 불용성 분획 시료는 내포체 가용화 완충액(8 M 요소, 20 mM 트리스, 500 mM 염화나트륨, 50 mM 이미다졸, pH 7.4)으로 미리 평형화된 HisTrap FF 1 ㎖ 컬럼(GE Healthcare)에 주입하였다. 주입이 완료된 후 컬럼은 5배 컬럼 부피의 평형 완충액으로 세척하고, 5배 컬럼 부피의 용출 완충액(8 M 요소, 20 mM 트리스, 500 mM 염화나트륨, 500 mM 이미다졸, pH 7.4)을 단계적으로 100%가 되도록 증가시켜 컬럼의 수지에 결합되어 있는 PG97-H6TEV-GLP-2A2G을 용출하였다. 용출 후 얻어진 분획의 결과를 각각 도2에 나타내었다.

실시예 3. 프로테아제 처리를 통한 링커 서열 절단

약 5 ㎖의 정제된 PG97-H6TEV-GLP-2A2G융합 폴리펩타이드의 분획을 합친 후 140 ㎖의 희석 완충액(20 mM 트리스, pH 7.4)을 첨가하여 요소의 농도가 1 M이 되도록 희석하였다. 희석된 재조합 융합 폴리펩타이드에 TEV 프로테아제의 최종 농도가 500 nM이 되도록 첨가하고 실온에서 12시간 동안 절단 반응이 진행될 수 있도록 하였다.

TEV 프로테아제에 의한 절단 여부를 확인하기 위해, 절단 후 SDS-PAGE 분석을 수행하여 그 결과를 도3에 나타내었다. 한편, 도3를 참조하면, 15.7 kDa의 PG97-H6TEV-GLP-2A2G는 거의 100%의 수율로 N-말단 융합태그, 6 히스티딘 태그 및 TEV 프로테아제 인식서열 융합체인 PG97-H6TEV 단편(12.0 kDa)과 목적 폴리펩타이드인 GLP-2A2G(3.8 kDa)단편으로 분리되는 것을 확인하였다.

실시예 4. GLP-2A2G의 정제

PG97-H6TEV-GLP-2A2G융합 폴리펩타이드에서, TEV 프로테아제의 절단에 의해 유리된 GLP-2A2G의 정제를 위하여 S9 시료 펌프(Sample pump S9) 및 F9-C 분획 수집기(Fraction collector F9-C)이 장착된 AKTA pure 25 크로마토그라피 시스템(GE Healthcare)을 이용하였다. TEV 프로테아제로 절단된 시료를 결합 완충액(10 mM 인산 칼륨, 2% 아세톤니트릴 pH 7.0)으로 미리 평형화된 Resource RPC 3 ㎖ 컬럼(GE Healthcare)에 주입하였다. PG97-H6TEV은 컬럼에 결합되지 않아 통과액(Flow-through) 분획을 수집하였고 용출 완충액(10 mM 인산 칼륨, 70% 아세톤니트릴 pH 7.0)을100%가 되도록 컬럼에 통과시켜 컬럼의 수지에 결합되어 있는 GLP-1K28R을 정제하였다. 분획 수집기의 통과액 및 용출 분획은 상기에 기재된 SDS-PAGE 방법으로 분석하였다.

도 4를 참조하면, GLP-1K28R은 Resource RPC수지에 결합된 후 고농도의 아세톤니트릴에 의해 용출되는 것을 확인하였다. 따라서PG97-H6TEV와 GLP-2A2G는 아세톤니트릴의 농도를 조절함으로써 용이하게 분리 가능하므로 역상 크로마토그래피를 이용하여GLP-1K28R의 정제를 용이하게 할 수 있다.

실시예 5. 절단 후 정제된 GLP-2A2G의 분자량 분석

완전한 형태의 PG97-H6TEV-GLP-2A2G의 발현 유무, TEV 프로테아제에 의한 정확한 절단 및 절단 후 얻어진 GLP-2A2G의 변형(modification) 유무를 확인하기 위해 MALTI-TOF MS를 이용한 분자량 분석을 실시하였다. 화학합성된 GLP-2A2G표준 물질의 분자량을 측정한 결과와 본 발명에 따라 수득된 GLP-2A2G의 분자량을 측정한 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5 및 도 6을 참고하면, PG97-H6TEV-GLP-2A2G로부터 수득된 GLP-2A2G의 분자량(3751.3 Da)은 화학합성된 GLP-2A2G의 분자량(3751.3 Da)과 정확하게 일치하였으므로 대장균 내에서 단백질 분해효소(proteolytic enzyme)에 의한 아미노 혹은 카르복시 말단의 부분적인 절단이나 분해 없이 완전한 형태로 발현된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 TEV 프로테아제는 PG97-H6TEV-GLP-2A2G내 인식서열인 ENLFQ 서열을 인식하고 마지막 아미노산인 Q(글루타민)와 GLP-2A2G의 첫번째 아미노산인 H(히스티딘) 사이의 펩타이드 결합을 정확하게 절단하는 것으로 판단된다.

실시예 6. 정제된 GLP-2A2G의 역상 HPLC 분석

화학합성된 GLP-2A2G과 본 발명을 통해 생산된 재조합 GLP-2A2G을 완충액 A (0.1% 삼불화초산, 2% 아세톤니트릴)에 평형화된 C18 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 컬럼에 주입 후 완충액 B(0.1% 삼불화초산, 80% 아세톤니트릴)의 농도를 선형으로 증가시키는 을 역상 HPLC 방법으로 화학합성된 GLP-2A2G와 재조합 GLP-2A2G의 체류시간 및 순도를 분석하였다. 그 결과, 화학합성 및 재조합 GLP-2A2G 모두 동일한 체류시간을 보였고 재조합 GLP-2A2G의 순도는 90% 이상으로 확인되었다(도 7).

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> PEPGENE INC. <120> METHOD FOR PRODUCTION OF GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-2 OR ANALOGUES WITH GROES PUSION <130> YP-21-106 <150> KR 10-2019-0087641 <151> 2019-07-19 <160> 89 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for PG43 <400> 1 Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala 20 25 30 Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val 35 40 <210> 2 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for PG57 <400> 2 Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala 20 25 30 Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Gly Asn Gly Arg Ile 35 40 45 Leu Glu Asn Gly Glu Val Lys Pro Leu 50 55 <210> 3 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for PG68 <400> 3 Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val 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Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Gly Asn Gly Arg Ile 35 40 45 Leu Glu Asn Gly Glu Val Lys Pro Leu Asp Val Lys Val Gly Asp Ile 50 55 60 Val Ile Phe Asn Asp Gly Tyr Gly Val Lys Ser Glu Lys Ile Asp Asn 65 70 75 80 Glu Glu Val Leu Ile Met Ser Glu 85 <210> 6 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for PG97 <400> 6 Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala 20 25 30 Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Gly Asn Gly Arg Ile 35 40 45 Leu Glu Asn Gly Glu Val Lys Pro Leu Asp Val Lys Val Gly Asp Ile 50 55 60 Val Ile Phe Asn Asp Gly Tyr Gly Val Lys Ser Glu Lys Ile Asp Asn 65 70 75 80 Glu Glu Val Leu Ile Met Ser Glu Ser Asp Ile Leu Ala Ile Val Glu 85 90 95 Ala <210> 7 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for SUMO <400> 7 Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro 1 5 10 15 Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser 20 25 30 Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu 35 40 45 Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg 50 55 60 Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp 65 70 75 80 Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile 85 90 95 Gly Gly <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for H6 <400> 8 His His His His His His 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tobacco etch virus (TEV) protease recognition site <400> 9 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for H6TEV <400> 10 Met His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 10 <210> 11 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for PG43-H6TEV <400> 11 Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly 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H6TEV-Ecallantide <400> 35 Met His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Glu Ala Met 1 5 10 15 His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala 20 25 30 His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe 35 40 45 Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu 50 55 60 Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 65 70 <210> 36 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for PG97-H6TEV-Ecallantide <400> 36 Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala 20 25 30 Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Gly Asn Gly Arg Ile 35 40 45 Leu Glu Asn Gly Glu Val Lys Pro Leu Asp Val Lys Val Gly Asp Ile 50 55 60 Val Ile Phe Asn Asp Gly Tyr Gly Val Lys Ser Glu Lys Ile Asp Asn 65 70 75 80 Glu Glu Val Leu Ile Met Ser Glu Ser Asp Ile Leu Ala Ile Val Glu 85 90 95 Ala His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Glu Ala Met 100 105 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ccctgaagat 240 ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggtcatcat 300 catcaccacc acgaaaacct gtatttccag catggcgatg gcagctttag cgatgaaatg 360 aacaccattc tggataacct ggcggcgcgc gattttatta actggctgat tcagaccaaa 420 attaccgatt aa 432 <210> 72 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for H6TEV-Ecallantide <400> 72 atgcatcatc atcaccacca cgaaaacctg tatttccagg aagcgatgca tagcttttgc 60 gcgtttaaag cggatgatgg cccgtgccgc gcggcgcatc cgcgctggtt ttttaacatt 120 tttacccgcc agtgcgaaga atttatttat ggcggctgcg aaggcaacca gaaccgcttt 180 gaaagcctgg aagaatgcaa aaaaatgtgc acccgcgatt aa 222 <210> 73 <211> 510 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for PG97-H6TEV-Ecallantide <400> 73 atgaatattc gtccattgca tgatcgcgtg atcgtcaagc gtaaagaagt tgaaactaaa 60 tctgctggcg gcatcgttct gaccggctct gcagcggcta aatccacccg cggcgaagtg 120 ctggctgtcg gcaatggccg tatccttgaa aatggcgaag tgaagccgct ggatgtgaaa 180 gttggcgaca tcgttatttt caacgatggc tacggtgtga 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agaaccgctt tgaaagcctg 480 gaagaatgca aaaaaatgtg cacccgcgat taa 513 <210> 75 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for H6TEV-Nesiritide <400> 75 atgcatcatc atcaccacca cgaaaacctg tatttccaga gcccgaaaat ggtgcagggc 60 agcggctgct ttggccgcaa aatggatcgc attagcagca gcagcggcct gggctgcaaa 120 gtgctgcgcc gccattaa 138 <210> 76 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for PG97-H6TEV-Nesiritide <400> 76 atgaatattc gtccattgca tgatcgcgtg atcgtcaagc gtaaagaagt tgaaactaaa 60 tctgctggcg gcatcgttct gaccggctct gcagcggcta aatccacccg cggcgaagtg 120 ctggctgtcg gcaatggccg tatccttgaa aatggcgaag tgaagccgct ggatgtgaaa 180 gttggcgaca tcgttatttt caacgatggc tacggtgtga aatctgagaa gatcgacaat 240 gaagaagtgt tgatcatgtc cgaaagcgac attctggcaa ttgttgaagc gcatcatcat 300 caccaccacg aaaacctgta tttccagagc ccgaaaatgg tgcagggcag cggctgcttt 360 ggccgcaaaa tggatcgcat tagcagcagc agcggcctgg gctgcaaagt gctgcgccgc 420 cattaa 426 <210> 77 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for SUMO-H6TEV-Nesiritide <400> 77 atgtcggact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct 60 gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa 120 aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg 180 gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaattcaag ctgatcagac ccctgaagat 240 ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggtcatcat 300 catcaccacc acgaaaacct gtatttccag agcccgaaaa tggtgcaggg cagcggctgc 360 tttggccgca aaatggatcg cattagcagc agcagcggcc tgggctgcaa agtgctgcgc 420 cgccattaa 429 <210> 78 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for H6TEV-hEGF <400> 78 atgcatcatc atcaccacca cgaaaacctg tatttccaga actccgattc tgagtgccca 60 ctttcccacg atggatactg ccttcatgat ggcgtgtgca tgtacatcga ggctctcgat 120 aagtacgcct gcaactgcgt tgtgggttac attggagaga gatgccagta cagggatctc 180 aagtggtggg agcttaggta a 201 <210> 79 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for PG97-H6TEV-hEGF <400> 79 atgaatattc gtccattgca tgatcgcgtg atcgtcaagc gtaaagaagt tgaaactaaa 60 tctgctggcg gcatcgttct gaccggctct gcagcggcta aatccacccg cggcgaagtg 120 ctggctgtcg gcaatggccg tatccttgaa aatggcgaag tgaagccgct ggatgtgaaa 180 gttggcgaca tcgttatttt caacgatggc tacggtgtga aatctgagaa gatcgacaat 240 gaagaagtgt tgatcatgtc cgaaagcgac attctggcaa ttgttgaagc gcatcatcat 300 caccaccacg aaaacctgta tttccagaac tccgattctg agtgcccact ttcccacgat 360 ggatactgcc ttcatgatgg cgtgtgcatg tacatcgagg ctctcgataa gtacgcctgc 420 aactgcgttg tgggttacat tggagagaga tgccagtaca gggatctcaa gtggtgggag 480 cttaggtaa 489 <210> 80 <211> 492 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for SUMO-H6TEV-hEGF <400> 80 atgtcggact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct 60 gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa 120 aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg 180 gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaattcaag ctgatcagac ccctgaagat 240 ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggtcatcat 300 catcaccacc acgaaaacct gtatttccag aactccgatt ctgagtgccc actttcccac 360 gatggatact gccttcatga tggcgtgtgc atgtacatcg aggctctcga taagtacgcc 420 tgcaactgcg ttgtgggtta cattggagag agatgccagt acagggatct caagtggtgg 480 gagcttaggt aa 492 <210> 81 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for H6TEV-INF-beta1b <400> 81 atgcatcatc atcaccacca cgaaaacctg tatttccaga gctataacct gctgggcttt 60 ctgcagcgca gcagcaactt tcagagccag aaactgctgt ggcagctgaa cggccgcctg 120 gaatattgcc tgaaagatcg catgaacttt gatattccgg aagaaattaa acagctgcag 180 cagtttcaga aagaagatgc ggcgctgacc atttatgaaa tgctgcagaa catttttgcg 240 atttttcgcc aggatagcag cagcaccggc tggaacgaaa ccattgtgga aaacctgctg 300 gcgaacgtgt atcatcagat taaccatctg aaaaccgtgc tggaagaaaa actggaaaaa 360 gaagatttta cccgcggcaa actgatgagc agcctgcatc tgaaacgcta ttatggccgc 420 attctgcatt atctgaaagc gaaagaatat agccattgcg cgtggaccat tgtgcgcgtg 480 gaaattctgc gcaactttta ttttattaac cgcctgaccg gctatctgcg caactaa 537 <210> 82 <211> 825 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for PG97-H6TEV-INF-beta1b <400> 82 atgaatattc gtccattgca tgatcgcgtg atcgtcaagc gtaaagaagt tgaaactaaa 60 tctgctggcg gcatcgttct gaccggctct gcagcggcta aatccacccg cggcgaagtg 120 ctggctgtcg gcaatggccg tatccttgaa aatggcgaag tgaagccgct ggatgtgaaa 180 gttggcgaca tcgttatttt caacgatggc tacggtgtga aatctgagaa gatcgacaat 240 gaagaagtgt tgatcatgtc cgaaagcgac attctggcaa ttgttgaagc gcatcatcat 300 caccaccacg aaaacctgta tttccagagc tataacctgc tgggctttct gcagcgcagc 360 agcaactttc agagccagaa actgctgtgg cagctgaacg gccgcctgga atattgcctg 420 aaagatcgca tgaactttga tattccggaa gaaattaaac agctgcagca gtttcagaaa 480 gaagatgcgg cgctgaccat ttatgaaatg ctgcagaaca tttttgcgat ttttcgccag 540 gatagcagca gcaccggctg gaacgaaacc attgtggaaa acctgctggc gaacgtgtat 600 catcagatta accatctgaa aaccgtgctg gaagaaaaac tggaaaaaga agattttacc 660 cgcggcaaac tgatgagcag cctgcatctg aaacgctatt atggccgcat tctgcattat 720 ctgaaagcga aagaatatag ccattgcgcg tggaccattg tgcgcgtgga aattctgcgc 780 aacttttatt ttattaaccg cctgaccggc tatctgcgca actaa 825 <210> 83 <211> 828 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for SUMO-H6TEV-INF-beta1b <400> 83 atgtcggact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct 60 gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa 120 aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg 180 gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaattcaag ctgatcagac ccctgaagat 240 ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggtcatcat 300 catcaccacc acgaaaacct gtatttccag agctataacc tgctgggctt tctgcagcgc 360 agcagcaact ttcagagcca gaaactgctg tggcagctga acggccgcct ggaatattgc 420 ctgaaagatc gcatgaactt tgatattccg gaagaaatta aacagctgca gcagtttcag 480 aaagaagatg cggcgctgac catttatgaa atgctgcaga acatttttgc gatttttcgc 540 caggatagca gcagcaccgg ctggaacgaa accattgtgg aaaacctgct ggcgaacgtg 600 tatcatcaga ttaaccatct gaaaaccgtg ctggaagaaa aactggaaaa agaagatttt 660 acccgcggca aactgatgag cagcctgcat ctgaaacgct attatggccg cattctgcat 720 tatctgaaag cgaaagaata tagccattgc gcgtggacca ttgtgcgcgt ggaaattctg 780 cgcaactttt attttattaa ccgcctgacc ggctatctgc gcaactaa 828 <210> 84 <211> 612 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for H6TEV-hGH <400> 84 catcatcatc accaccacga aaacctgtat ttccagtttc caaccattcc actgtctcgc 60 ctgtttgata atgcaatgct gcgtgcacat cgtctgcatc agctggcatt tgatacctat 120 caggaatttg aagaagcata tattccaaaa gaacagaaat attctttcct gcaaaatcca 180 cagacctctc tgtgtttttc tgaatctatt ccaaccccat ccaatcgtga agagacccaa 240 cagaaatcta atctggaact gctgcgtatc tctctgttac tgattcagtc ttggctggaa 300 ccagtgcagt tcctgcgttc tgtgttcgca aattctctgg tttatggtgc atctgattct 360 aatgtttatg atctgctgaa agatttagag gaaggaattc agaccctgat gggtcgtctg 420 gaagatggtt ctccacgtac cggtcagatt tttaaacaga cctattctaa atttgatacc 480 aattctcata atgacgatgc actgctgaaa aactatggtc tgctgtactg ctttcgtaaa 540 gatatggata aagttgaaac ctttctgcgt attgttcagt gtcgttctgt tgaaggttct 600 tgtggttttt aa 612 <210> 85 <211> 903 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for PG97-H6TEV-hGH <400> 85 atgaatattc gtccattgca tgatcgcgtg atcgtcaagc gtaaagaagt tgaaactaaa 60 tctgctggcg gcatcgttct gaccggctct gcagcggcta aatccacccg cggcgaagtg 120 ctggctgtcg gcaatggccg tatccttgaa aatggcgaag tgaagccgct ggatgtgaaa 180 gttggcgaca tcgttatttt caacgatggc tacggtgtga aatctgagaa gatcgacaat 240 gaagaagtgt tgatcatgtc cgaaagcgac attctggcaa ttgttgaagc gcatcatcat 300 caccaccacg aaaacctgta tttccagttt ccaaccattc cactgtctcg cctgtttgat 360 aatgcaatgc tgcgtgcaca tcgtctgcat cagctggcat ttgataccta tcaggaattt 420 gaagaagcat atattccaaa agaacagaaa tattctttcc tgcaaaatcc acagacctct 480 ctgtgttttt ctgaatctat tccaacccca tccaatcgtg aagagaccca acagaaatct 540 aatctggaac tgctgcgtat ctctctgtta ctgattcagt cttggctgga accagtgcag 600 ttcctgcgtt ctgtgttcgc aaattctctg gtttatggtg catctgattc taatgtttat 660 gatctgctga aagatttaga ggaaggaatt cagaccctga tgggtcgtct ggaagatggt 720 tctccacgta ccggtcagat ttttaaacag acctattcta aatttgatac caattctcat 780 aatgacgatg cactgctgaa aaactatggt ctgctgtact gctttcgtaa agatatggat 840 aaagttgaaa cctttctgcg tattgttcag tgtcgttctg ttgaaggttc ttgtggtttt 900 taa 903 <210> 86 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for SUMO-H6TEV-hGH <400> 86 atgtcggact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct 60 gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa 120 aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg 180 gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaattcaag ctgatcagac ccctgaagat 240 ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggtcatcat 300 catcaccacc acgaaaacct gtatttccag tttccaacca ttccactgtc tcgcctgttt 360 gataatgcaa tgctgcgtgc acatcgtctg catcagctgg catttgatac ctatcaggaa 420 tttgaagaag catatattcc aaaagaacag aaatattctt tcctgcaaaa tccacagacc 480 tctctgtgtt tttctgaatc tattccaacc ccatccaatc 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sequence for PG97-H6TEV-INSG <400> 88 atgaatattc gtccattgca tgatcgcgtg atcgtcaagc gtaaagaagt tgaaactaaa 60 tctgctggcg gcatcgttct gaccggctct gcagcggcta aatccacccg cggcgaagtg 120 ctggctgtcg gcaatggccg tatccttgaa aatggcgaag tgaagccgct ggatgtgaaa 180 gttggcgaca tcgttatttt caacgatggc tacggtgtga aatctgagaa gatcgacaat 240 gaagaagtgt tgatcatgtc cgaaagcgac attctggcaa ttgttgaagc gcatcatcat 300 caccaccacg aaaacctgta tttccagttt gtgaaccagc atctgtgcgg cagccatctg 360 gtggaagcgc tgtatctggt gtgcggcgaa cgcggctttt tttatacccc gaaaacccgc 420 cgcgaagcgg aagatctgca ggtgggccag gtggaactgg gcggcggccc gggcgcgggc 480 agcctgcagc cgctggcgct ggaaggcagc ctgcagaaac gcggcattgt ggaacagtgc 540 tgcaccagca tttgcagcct gtatcagctg gaaaactatt gcggctaa 588 <210> 89 <211> 591 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for SUMO-H6TEV-INSG <400> 89 atgtcggact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct 60 gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa 120 aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg 180 gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaattcaag ctgatcagac ccctgaagat 240 ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggtcatcat 300 catcaccacc acgaaaacct gtatttccag tttgtgaacc agcatctgtg cggcagccat 360 ctggtggaag cgctgtatct ggtgtgcggc gaacgcggct ttttttatac cccgaaaacc 420 cgccgcgaag cggaagatct gcaggtgggc caggtggaac tgggcggcgg cccgggcgcg 480 ggcagcctgc agccgctggc gctggaaggc agcctgcaga aacgcggcat tgtggaacag 540 tgctgcacca gcatttgcag cctgtatcag ctggaaaact attgcggcta a 591

Claims

서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 융합태그; 링커; 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 담배 식각 바이러스 (TEV) 프로테아제 인식 서열; 서열번호 30의 아미노산 서열로 이루어진 테두글루타이드(GLP-2A2G);가 N-말단에서 C-말단의 방향으로 순서대로 위치하는 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계 (a);
상기 단계 (a) 후, 상기 발현벡터를 대장균에 도입하여 형질전환 대장균을 제조하는 단계 (b);
상기 단계 (b) 후, 상기 형질전환 대장균을 배양하는 단계 (c);
상기 단계 (c) 후, 상기 형질전환 대장균에서 봉입체 형태로 발현된 융합 폴리펩타이드를 분리하고 가용화하는 단계 (d); 및
상기 단계 (d) 후, 상기 가용화된 융합 폴리펩타이드에 담배 식각 바이러스 (TEV) 프로테아제를 처리하여 서열번호 30의 아미노산 서열로 이루어진 테두글루타이드(GLP-2A2G)를 회수하는 단계 (e);를 포함하는 것을 특징으로 하는 서열번호 30의 아미노산 서열로 이루어진 테두글루타이드(GLP-2A2G)의 생산방법.
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제1항에 있어서,
상기 링커는,
히스티딘 친화성 태그를 포함하는 것을 특징으로 하는, 서열번호 30의 아미노산 서열로 이루어진 테두글루타이드(GLP-2A2G)의 생산방법.
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