CN112105635A - 用于重组蛋白的更高表达的前导序列 - Google Patents

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CN112105635A CN201980031526.7A CN201980031526A CN112105635A CN 112105635 A CN112105635 A CN 112105635A CN 201980031526 A CN201980031526 A CN 201980031526A CN 112105635 A CN112105635 A CN 112105635A
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Abstract

本发明涉及用于重组蛋白的更高表达的前导序列。本发明进一步涉及使用前导序列制备胰岛素和胰岛素类似物的方法。前导肽显著增加了前胰岛素原的表达。本发明还涉及通过将片段与本发明的前导序列融合而制备的蛋白序列。通过使用所述前导序列制备胰岛素及其类似物来证明本发明。

Description

用于重组蛋白的更高表达的前导序列
技术领域
本发明涉及用于表达重组蛋白的新型前导序列。本发明还涉及使用前导序列改进重组蛋白的表达的方法。
背景技术
背景技术说明包括可有助于理解本发明的信息。这并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的本发明有关，或者明确或隐含引用的任何出版物是现有技术。
重组DNA技术的应用已经使许多重组治疗蛋白可用于生物医药用途。原核和真核表达系统通常都用于重组蛋白的生产。
在所有表达系统中，大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)仍然是用于生产重组蛋白的最有利宿主，因为其蛋白生产更快、更廉价并且产量高。众所周知的遗传学和各种分子工具的可用性也极大地促进了大肠杆菌在生物医药工业中的应用。各种启动子、前导配偶体和突变菌株的可用性为大肠杆菌增加了巨大优势，使其成为实验室和工业水平上用于重组蛋白生产的最广泛使用的方法之一。
伴随许多优点，然而，由于缺乏进行翻译后修饰诸如糖基化和重折叠以便表现出活性的复杂机制，大肠杆菌在表达更复杂的蛋白上存在局限性。
另一方面，许多哺乳动物蛋白和其他蛋白不能在大肠杆菌中成功表达，其在大范围的其他生物体如杆状病毒(Baculovirus)表达系统、革兰阳性生物体、假单胞菌(Pseudomonas)表达系统中探索表达。大肠杆菌中更高的蛋白生产是重组蛋白生产过程中的主要瓶颈，并且已经进行了许多尝试以克服和解决这些问题。在一些情况下，研究人员探索了使用强启动子、向生长培养基中添加蔗糖和甜菜碱、使用具有磷酸盐缓冲液的丰富培养基以及使用前导序列以增加表达。除了较低的表达外，重组蛋白的蛋白水解降解是表达宿主中的主要问题。
获得蛋白的高产量的其他因素包括目标基因、表达载体、基因剂量、转录调控、密码子使用、翻译调控、宿主设计、生长培养基和可用于操纵目的蛋白的表达条件、比活性或生物学活性的培养条件或发酵条件、蛋白靶向、融合蛋白、分子伴侣(molecularchaperons)和蛋白降解。
N-或C-末端与前导序列的融合是提高表达蛋白的表达和稳定性的最佳方法之一。在转录的mRNA中形成强二级结构会降低异源基因的表达。强二级结构会干扰核糖体与mRNA的结合，从而阻止有效的翻译起始。在蛋白的N-和C-末端两处的前导序列决定子可以影响重组蛋白的表达和对蛋白酶降解的稳定性。
前导序列是用于蛋白表达的高效工具。除了表达外，前导序列还影响溶解性以及甚至其融合配偶体的折叠。它们允许纯化几乎任何蛋白，而无需其生物化学特性的任何先验知识。
US10000544描述了一种用于通过在宿主细胞中经由表达构建体表达胰岛素或胰岛素类似物来生产胰岛素或胰岛素类似物的方法。表达构建体在宿主细胞特别是在细菌细胞中具有用于胰岛素的前导肽。
US6841361描述了DNA用于由融合蛋白制备胰岛素的用途，其通过经由凝血酶和羧肽酶B的作用的DNA表达而获得。
JP-B-7-121226和JP2553326描述了用于在酵母中表达包括经由两个碱性氨基酸残基连接的B链和A链的小胰岛素原；并且然后在体外用胰蛋白酶处理该小胰岛素原，从而生产胰岛素的方法。
然而，没有一个前导序列就所有这些参数而言都是最优的；每个都有其优点和缺点。可以针对特定蛋白以不同组合将多个前导序列加在一起，以获得关于表达、溶解性和纯化的更好结果。因此，本领域需要提供有助于简单高效地有效表达重组胰岛素的前导序列。
发明目的
本发明的主要目的是提供有效的、新型前导序列，用于简单且有效地表达胰岛素，特别是重组人胰岛素和胰岛素类似物。
本发明的另一目的是提供包括新型前导序列以及胰岛素原或胰岛素原类似物的融合蛋白。
本发明进一步的目的是提供用于制备包括新型前导序列以及胰岛素原或胰岛素原类似物的融合蛋白的方法。
本发明的又另一目的是提供使用前导序列制备胰岛素的简单、高效且可工业放大的方法。
本发明的又另一目的是提供由包括前导序列的前胰岛素原制备胰岛素或胰岛素类似物的高效方法。
发明内容
提供此发明内容是为了以简化形式介绍选出的一些概念，这些概念将在下文具体实施方式部分中进一步描述。该发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于帮助确定所要求保护的主题的范围。
在一方面，本发明涉及选自以下的前导肽序列：
a)具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽；
b)具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽；
c)包括以下氨基酸序列的肽：MSRIVINAYAKATQP；
d)包括以下氨基酸序列的肽：MEKHTKDQIIEAPHM；或
e)与a)、b)、c)或d)具有至少80％同源性的肽。
在另一方面，本公开提供了编码本文公开的前导肽序列的核苷酸序列。
在另一方面，本公开提供了选自SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
在进一步的方面，本公开提供了前胰岛素原多肽，其包括可操作地连接至胰岛素或胰岛素类似物的前体的本文公开的前导肽序列。
在另一方面，本公开提供了式1：R1-X1-X2-X3的前胰岛素原多肽，其中，X1是胰岛素或胰岛素类似物的‘B’链，X2是选自RR或KR或RK或KK的二肽，X3是胰岛素或胰岛素类似物的‘A’链，以及R1是所述前导肽。
在另一方面，本公开提供了胰岛素或胰岛素类似物的前体，所述前体是式2：X1-X2-X3的胰岛素原，其中，X1是胰岛素或胰岛素类似物的‘B’链，X2是选自RR或KR或RK或KK的二肽，X3是胰岛素或胰岛素类似物的‘A’链。
在本公开的又另一方面，所述前导肽指导所述胰岛素和胰岛素类似物在原核宿主细胞中的表达。
在本公开的另一方面，所述原核宿主细胞选自假单胞菌细胞或大肠杆菌细胞。
在一方面，本公开提供了使用式1：R1-X1-X2-X3的前胰岛素原制备的胰岛素原，其中，X1是胰岛素或胰岛素类似物的‘B’链，X2是选自RR或KR或RK或KK的二肽，X3是胰岛素或胰岛素类似物的‘A’链，以及R1是所述前导肽。
在另一方面，本公开提供了由前胰岛素原制备胰岛素原的方法，其中，所述前胰岛素原包括所述前导肽。
在还另一方面，本公开提供了由前胰岛素原制备胰岛素原的方法，其中，所述前胰岛素原是式1：R1-X1-X2-X3并且胰岛素原是式X1-X2-X3，其中，R1是所述前导肽，X1是胰岛素或胰岛素类似物的‘B’链，X2是选自RR或KR或RK或KK的二肽，以及X3是胰岛素或胰岛素类似物的‘A’链。
在一方面，本公开提供了编码前胰岛素原多肽的核苷酸序列，所述前胰岛素原多肽包括可操作地连接至胰岛素或胰岛素类似物的前体的本文公开的前导肽序列。
在另一方面，本公开提供了编码包括所述前导肽序列的前胰岛素原多肽的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示。
在一方面，本公开提供了重组基因构建体，其包括编码包括本文公开的前导肽序列的前胰岛素原多肽的核苷酸序列或如下所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。
在另一方面，本公开提供了重组基因构建体，其中所述基因构建体选自pET28aULL1INS、pET28aULL2INS、pET28aULL1LSP、pET28aULL2LSP、pET28aULL1GR或pET28aULL2GR。
在一方面，本公开提供了制备重组基因构建体的方法，所述重组基因构建体包括编码包括本文公开的前导肽序列的前胰岛素原多肽的核苷酸序列或如下所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:16，或者所述基因构建体选自：pET28aULL1INS、pET28aULL2INS、pET28aULL1LSP、pET28aULL2LSP、pET28aULL1GR或pET28aULL2GR。
在进一步的方面，本公开提供了包括基因构建体的表达载体，所述基因构建体包括编码包括本文公开的前导肽序列的前胰岛素原多肽的核苷酸序列或如下所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:16，或者所述基因构建体选自：pET28aULL1INS、pET28aULL2INS、pET28aULL1LSP、pET28aULL2LSP、pET28aULL1GR或pET28aULL2GR。
在另一方面，本公开提供了表达载体，其中，所述载体包括用于生产胰岛素的重组基因构建体pET28aULL1INS或pET28aULL2INS，用于生产赖脯胰岛素(insulin Lispro)的pET28aULL1LSP或pET28aULL2LSP，以及用于生产甘精胰岛素(insulin glargine)的pET28aULL1GR或pET28aULL2GR。
在又另一方面，本公开提供了包括本文公开的表达载体的原核宿主细胞。
在另一方面，本公开提供了选自假单胞菌细胞或大肠杆菌细胞的包括表达载体的原核宿主细胞。
在一方面，本公开提供了经由如本文公开的胰岛素原的表达来表达胰岛素和胰岛素类似物的方法。
在另一方面，本发明提供了经由胰岛素原的表达来表达胰岛素和胰岛素类似物的方法，其中，所述方法包括在合适的生产培养基中发酵原核宿主细胞。
在又另一方面，本公开提供了经由胰岛素原的表达来表达胰岛素和胰岛素类似物的方法，其中，所述生产培养基包括1％酵母提取物、1％葡萄糖、0.3％KH2PO4、1.25％K2HPO4、0.5％(NH4)2SO4、0.05％NaCl、0.1％MgSO4·7H2O、0.1％的痕量金属溶液(FeSO4、ZnSO4、CoCl2、NaMoO4、CaCl2、MnCl2、CuSO4或H3BO3于盐酸中)和卡那霉素(Kanamycin)(20μg/ml)每100ml。
在进一步的方面，本公开提供了生产胰岛素和胰岛素类似物的方法，其中，所述方法包括使用本文公开的前导肽。
在另一方面，本公开提供了生产胰岛素和胰岛素类似物的方法，其中，所述方法包括使用前胰岛素原多肽，所述前胰岛素原多肽包括可操作地连接至胰岛素或胰岛素类似物的前体或该多肽的本文公开的前导肽序列。
在又另一方面，本公开提供了生产胰岛素和胰岛素类似物的方法，其中，所述方法包括使用本文公开的胰岛素原。
在一方面，本公开提供了通过包括本文公开的前导肽的方法制备的胰岛素或胰岛素类似物。
在另一方面，本公开提供了通过包括前胰岛素原多肽的方法制备的胰岛素或胰岛素类似物，所述前胰岛素原多肽包括可操作地连接至胰岛素或胰岛素类似物的前体的本文公开的前导肽序列。
在另一方面，本公开提供了通过包括本文公开的胰岛素原的方法制备的胰岛素或胰岛素类似物。
参考以下描述和所附权利要求，将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点。本发明的其他方面将在下面的描述中阐明，并且部分将从描述中明显看出，或者可以通过本发明的实践而获知。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括以进一步示出本公开的各方面。通过参考附图结合本文呈现的具体实施方式的详细描述，可以更好地理解本公开。
图1：是在大肠杆菌BL21 DE3中具有构建体pET28aULL1INS和pET28aULL2INS的前胰岛素原的表达分析。
图2是在大肠杆菌BL21 DE3中具有构建体pET28aULL1LSP和pET28aULL2LSP的赖脯前胰岛素原的表达分析。
图3是在大肠杆菌BL21 DE3中具有构建体pET28aULL1GLR和pET28aULL2GLR的甘精前胰岛素原的表达分析。
图4是具有ULL1INS的pET28a载体图的注释图。
图5是具有ULL2INS的pET28a载体图的注释图。
伴随序列的简要说明
SEQ ID NO:1是ULL1的氨基酸序列，其是前导序列(R1)
SEQ ID NO:2是ULL2的氨基酸序列，其是前导序列(R1)
SEQ ID NO:3是与胰岛素的胰岛素原序列融合的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是与胰岛素的胰岛素原序列融合的SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是与赖脯胰岛素的胰岛素原序列融合的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是与赖脯胰岛素的胰岛素原序列融合的SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是与甘精胰岛素的胰岛素原序列融合的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是与甘精胰岛素的胰岛素原序列融合的SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是编码SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11是编码SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12是编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13是编码SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14是编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15是编码SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16是编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
具体实施方式
以下是本公开的实施方式的详细描述。本领域技术人员将意识到，除了特别描述的那些以外，本公开还可以进行变化和修改。应当理解，本公开包括所有这样的变化和修改。提供的详细公开并不旨在限制实施方式的预期变化；相反，其意图是涵盖落入由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的所有修改、等同形式和替代形式。下面的描述和其中描述的实施方式是通过说明本公开的原理和方面的特定实施方式的一个或多个实例的方式提供的。提供这些实例是为了解释而不是限制这些原则和本公开。
贯穿本说明书中，对“一种实施方式”或“实施方式”的提及意指结合该实施方式描述的特定特征、结构或特性被包括在至少一种实施方式中。因此，贯穿本说明书中各处出现的短语“在一种实施方式中”或“在实施方式中”不一定都指的是同一实施方式。此外，特定特征、结构或特性可以在一种或多种实施方式中以任何合适的方式组合。
本文中相对于某些实施方式提供的任何和所有举例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对原本要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于实践本发明来说是必要的。
除非上下文另外明确指出，否则如本文的描述和贯穿随后的权利要求书中所使用的，“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”的含义包括复数指代。并且，除非上下文另外明确指出，否则如本文的描述中所使用的，“在...中”的含义包括“在...中”和“在...上”。
除非上下文另外要求，否则贯穿随后的说明书中，词语“包括(comprise)”及其变体，诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”，应以开放的、包括性的含义来解释，即为“包括但不限于”。
当并入的参考文献中的术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用参考文献中的该术语的定义。
在下文示出如本文所用的各种术语。对于未在下文中定义的权利要求所用的术语来说，应该给予其相关领域技术人员对于该术语给出的最广泛的定义，如在申请时印刷出版物和已公布专利中所反映的那样。
如本文所用，术语“肽”是指包括通过肽键连接的氨基酸序列的分子，无论长度、翻译后修饰或功能。
如本文所用，术语“二肽”是指包括通过肽键连接的两(2)个氨基酸的氨基酸序列的分子。
如本文所用，术语“多肽”是指天然存在的或重组的、生产的或化学修饰的或通过其他方式的，其可以假定蛋白的三维结构可以被翻译后加工，与天然蛋白的方式基本相同。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“胰岛素”是指为51个氨基酸残基多肽(5808道尔顿)的激素，其在许多关键细胞过程中起重要作用。它涉及刺激细胞生长和分化。它还通过由其单体形式的激素与其二聚体酪氨酸激酶型膜受体结合而引发的信号传导通路发挥其调控功能(例如摄取葡萄糖到细胞中)。人胰岛素的成熟形式由51个氨基酸组成，排列成总分子量为5808Da的A链(GlyAl-AsnA21)和B链(PheB1-ThrB30)。该分子通过两个链间(A20-B19，A7-B7)和一个链内二硫键(A6-A11)稳定。本发明的胰岛素包括天然的、通过合成提供的或基因工程化的(例如重组的)来源，在本发明的各种实施方式中，胰岛素可以是人胰岛素。
如本文所用，术语“胰岛素类似物”是指胰岛素的改变形式，其是胰岛素的更快速作用形式或更均匀作用形式。这样的类似物的非限制性实例是赖脯胰岛素、德谷胰岛素(Insulin Degludec)、门冬胰岛素(Insulin Aspart)和甘精胰岛素。“赖脯”胰岛素类似物在初级结构上与人胰岛素相同，通过交换B28位置处的赖氨酸和B29位置处的脯氨酸而不同于人胰岛素。它是一种短效胰岛素单体类似物。“德谷”胰岛素类似物通过在A21处用天冬酰胺替换甘氨酸，以及在B链的C末端添加两个精氨酸残基而不同于人胰岛素。在pH4.0下配制和注射甘精胰岛素溶液。这些修饰将等电点提高至更中性的pH，降低了生理条件下的溶解度，并且导致甘精胰岛素在注射位置沉淀，从而减慢了吸收。甘精胰岛素是一种持续20-24小时的长效类似物。
如本文所用，术语“前胰岛素原”是指一种单链多肽分子，其包括前导肽(R1)、胰岛素的B链(X1)、C肽或二肽(X2)和胰岛素的A链(X3)，以由式“R1-X1-X2-X3”表示的顺序连接。
术语“前胰岛素原(pre-proinsulin)”或“前胰岛素原(preproinsulin)”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“胰岛素原”是指在前导序列从前胰岛素原上切割之后生成的单链多肽分子，并且由式X1-X2-X3表示，其包括连接胰岛素的B链(X1)和A链(X3)的二肽或“C-肽”(X2)。
如本文所用，术语“核酸序列”或多核苷酸序列是指由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)连接组成的核苷或核苷酸单体的序列。该术语还包括含有非天然存在的单体或其部分的修饰的或替换的序列。本发明的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并且可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧啶。可以根据本文提供的方法使用的编码胰岛素的核酸序列可以是编码胰岛素多肽或其前体(包括胰岛素原和前胰岛素原)的任何核酸序列。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指一种构型，其中控制序列(其在本文是前导序列R1)相对于多核苷酸序列的编码序列被置于适当的位置使得控制序列指导编码序列对多肽的表达。
如本文所用，术语“编码序列”是指一种多核苷酸序列，当其置于适当的控制序列(其在本文是前导序列R1)的控制下时被转录成mRNA，mRNA被翻译成多肽。编码序列的边界通常由位于mRNA的5'端的开放阅读框的开始的起始密码子和位于mRNA的开放阅读框的3'端的终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于基因组DNA、cDNA、半合成的、合成的和重组核苷酸。编码序列，例如是编码式X1-X2-X3的胰岛素原的核苷酸序列。
如本文所用，术语‘pET28aULL1INS’是指用于使用载体pET28a、SEQ ID 9的核苷酸序列和编码对应于如前文所定义的重组人胰岛素的X1-X2-X3的核苷酸序列编码前胰岛素原的质粒。
如本文所用，术语‘pET28aULL1LSP’是指用于使用载体pET28a、SEQ ID 9的核苷酸序列和编码对应于如前文所定义的赖脯胰岛素的X1-X2-X3的核苷酸序列编码前胰岛素原的质粒。
如本文所用，术语‘pET28aULL1GR’是指用于使用载体pET28a、SEQ ID 9的核苷酸序列和编码对应于如前文所定义的甘精胰岛素的X1-X2-X3的核苷酸序列编码前胰岛素原的质粒。
如本文所用，术语‘pET28aULL2INS’是指用于使用载体pET28a、SEQ ID 10的核苷酸序列和编码对应于如前文所定义的重组人胰岛素的X1-X2-X3的核苷酸序列编码前胰岛素原的质粒。
如本文所用，术语‘pET28aULL2LSP’是指用于使用载体pET28a、SEQ ID 10的核苷酸序列和编码对应于如前文所定义的赖脯胰岛素的X1-X2-X3的核苷酸序列编码前胰岛素原的质粒。如本文所用，术语‘pET28aULL2GR’是指用于使用载体pET28a、SEQ ID 10的核苷酸序列和编码对应于如前文所定义的甘精胰岛素的X1-X2-X3的核苷酸序列编码前胰岛素原的质粒。
如本文所用，术语“前导序列”或“标签”是指位于蛋白的前体形式的氨基末端的肽序列，其使蛋白的生产最大化。
本发明提供了与如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列也分别称为ULL1和ULL2。
本发明提供了用于生产胰岛素，更特别地人胰岛素和胰岛素类似物的方法。本发明还涉及在本方法中使用的用于更高表达的肽。
在本发明的实施方式中，提供了前胰岛素原序列以及用于由前胰岛素原序列经由胰岛素原制备胰岛素和胰岛素类似物的方法，其中，所述式1的前胰岛素原和式2的胰岛素原如下：
式1：R1-X1-X2-X3和式2：X1-X2-X3，
其中，R1是具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽或具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽。
X1是胰岛素和胰岛素类似物的‘B’链，
X2是包括RR或KR或RK或KK的二肽，以及
X3是胰岛素和胰岛素类似物的‘A’链。
在本发明的实施方式中，该肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和如SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。具有如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽也称为前导序列或标签。本发明中公开的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的新型序列增强了蛋白诸如低分子量蛋白在细菌宿主细胞中的表达，并因此导致了目的蛋白的更高产量。众所周知，由于不稳定的信使RNA和这些蛋白的快速降解，低分子量蛋白在细菌宿主细胞中的表达是困难的。潜在编码序列的低效翻译也导致了低分子量蛋白的较低表达。本发明中公开的新型序列试图克服本领域普遍的这些缺点。
本发明的另一实施方式提供了与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的从1到15的氨基酸序列具有至少80％同源性的肽。
在本发明的实施方式中，通过考虑重组蛋白的更高表达的重要因素来设计具有如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的前导序列。影响重组蛋白在细菌宿主细胞中表达的因素包括：蛋白的大小、编码DNA序列的GC含量、mRNA二级结构、翻译起始速率和细菌宿主细胞的密码子使用。考虑的因素是编码DNA序列的GC含量、mRNA二级结构、翻译起始速率和细菌宿主细胞的密码子使用。
在本发明的实施方式中，宿主细胞优选地是大肠杆菌，并且更优选地是大肠杆菌Gold BL 21DE3。
在本发明的实施方式中，对编码胰岛素原的基因进行设计、密码子优化、化学合成并克隆在
Figure BDA0002770006910000144
的pUC57中以制备pUC57ULL1INS，所述胰岛素原具有编码SEQ ID NO:1的肽的如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。使用NdeI和BamH1限制性酶对pUC57ULL1INS质粒和pET28a载体进行限制性消化。将基因片段ULL1INS通过凝胶洗脱试剂盒
Figure BDA0002770006910000141
纯化，并连接至pET28a载体以制备pET28aULL1INS。进一步将其转化至繁殖宿主大肠杆菌TOP10细胞中以繁殖pET28aULL1INS连接的质粒。将这样的质粒分离并转化至大肠杆菌GoldBL 21DE3细胞中以检查蛋白的表达。
在本发明的另一实施方式中，对编码胰岛素原的基因进行设计、密码子优化并化学合成并克隆在
Figure BDA0002770006910000142
的pUC57中以制备pUC57ULL2INS，所述胰岛素原包括编码SEQID NO:2的肽的如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。使用NcoI和BamH1限制性酶对pUC57ULL2INS质粒和pET28a载体进行限制性消化。将基因片段ULL2INS通过凝胶洗脱试剂盒
Figure BDA0002770006910000143
纯化，并连接至pET28a载体以制备pET28aULL2INS。进一步将其转化至繁殖宿主大肠杆菌TOP10细胞中以繁殖pET28aULL2INS连接的质粒。将这样的质粒分离并转化至大肠杆菌Gold BL 21 DE3细胞中以检查蛋白的表达。
在本发明的进一步的实施方式中，提供了用于制备胰岛素类似物诸如甘精胰岛素和赖脯胰岛素的基因构建体。
用于本发明的胰岛素片段具有159bp的长度，并且对应于具有其小C链(2个氨基酸)的胰岛素蛋白的核苷酸序列。
在本发明的一方面，提供了用于由前胰岛素原序列制备胰岛素的方法。该方法包括以下步骤：发酵、细胞裂解、包涵体制备、溶解包涵体、切割前导肽以获得胰岛素原、阴离子交换色谱、重折叠、疏水作用色谱、通过胰蛋白酶的酶切割、阴离子/阳离子交换色谱、通过羧肽酶的酶切割和反相色谱。
在本发明的实施方式中，用于由前胰岛素原制备胰岛素的方法包括发酵步骤，该步骤包括将用pET28aULL1INS或pET28aULL2INS转化的大肠杆菌细胞在生产培养基中生长，用异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)诱导，并收获在发酵过程结束时获得的细胞团块(cell mass)。
在本发明的实施方式中，用于由前胰岛素原制备胰岛素的方法包括细胞裂解步骤。将包含前胰岛素原的包涵体的细胞重悬于Tris-NaCl缓冲液中，并且用Mini-DeBEE匀浆器通过高压进行裂解。
在本发明的实施方式中，用于由前胰岛素原制备胰岛素的方法包括包涵体制备的步骤。用包含还原剂诸如β-巯基乙醇的Tris-NaCl缓冲液洗涤富含前胰岛素原的包涵体。
在本发明的实施方式中，用于由前胰岛素原制备胰岛素的方法包括溶解包涵体的步骤。将包涵体溶解在6M盐酸胍的碱性缓冲液中。将溶解的包涵体悬浮液通过添加亚硫酸钠和连四硫酸钠进行亚硫酸分解。
在本发明的实施方式中，用于由前胰岛素原制备胰岛素的方法包括切割前导肽以获得胰岛素原的步骤。将溶解的包涵体悬浮液的pH调节至1-2。将溴化氰添加到溶液中并在8℃下温育过夜。然后通过添加过量的纯净水沉淀蛋白，并然后将离心后获得的沉淀物用甘氨酸缓冲液洗涤并且溶解在8M尿素中。
在本发明的实施方式中，用于由前胰岛素原制备胰岛素的方法包括阴离子交换色谱的步骤。将溶解在8M尿素中的蛋白进行阴离子交换色谱。将蛋白负载在阴离子交换树脂上，并用包含氯化钠的8M尿素缓冲液洗脱。胰岛素原以浓缩的形式获得。
在本发明的实施方式中，用于由前胰岛素原制备胰岛素的方法包括重折叠的步骤。将以浓缩形式获得的胰岛素原随后通过在甘氨酸缓冲液中稀释进行重折叠。溶液的pH保持在9.5，并且蛋白浓度在0.5至1mg/ml的范围内。使重折叠反应在25℃下进行2-3小时。通过添加乙酸终止反应，以便使pH达到～4.0。
在本发明的实施方式中，用于由前胰岛素原制备胰岛素的方法包括疏水作用色谱(HIC)的步骤。将重折叠的溶液进行疏水作用色谱。通过添加氯化钠来增加溶液的电导率，并然后将蛋白负载在疏水作用树脂上。用增加梯度的氯化钠的甘氨酸缓冲液来洗脱胰岛素原。
在本发明的实施方式中，用于由前胰岛素原制备胰岛素的方法包括通过胰蛋白酶的酶切割的步骤。用1:5000比率的蛋白与胰蛋白酶消化从HIC洗脱的蛋白。优选地，胰蛋白酶是粉末形式或固定化的形式。当使用固定化的胰蛋白酶时，通过经由过滤分离包含胰蛋白酶的珠来终止反应。当使用粉末形式的胰蛋白酶时，通过添加乙酸来淬灭反应。
在本发明的实施方式中，用于由前胰岛素原制备胰岛素的方法包括阴离子/阳离子交换色谱的步骤。基于用于切割的胰蛋白酶的形式(粉末或固定化的)，可以对蛋白进行阳离子或阴离子交换色谱。优选地，通过增加梯度的氯化钠洗脱蛋白。
在本发明的实施方式中，用于由前胰岛素原制备胰岛素的方法包括通过羧肽酶的酶切割的步骤。将从交换色谱洗脱的蛋白用羧肽酶消化以从B链去除C末端精氨酸。
在本发明的实施方式中，用于由前胰岛素原制备胰岛素的方法包括反相色谱的步骤。通过反相色谱从消化的样品中纯化出活性胰岛素。负载蛋白以获得在10-15mg/ml树脂的范围内的最终结合。优选地，使用增加梯度的乙腈洗脱胰岛素。
尽管上文描述了本公开的各种实施方式，但是在不脱离本公开的基本范围的情况下，可以设计本公开的其他和进一步的实施方式。本发明的范围由所附权利要求确定。本发明不限于所描述的实施方式、版本或实例，当与本领域普通技术人员可获得的信息和知识相结合时，所包括的实施方式、版本或实例使得本领域普通技术人员能够制造和使用本发明。
实施例：
下面给出的实施例完全仅用于说明目的，并且不以任何方式限制本发明。所公开的实施方式的各种修改以及所述发明的替代实施方式对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，预期可以进行这样的修改而不会背离如此处举例说明的本发明的真实精神或范围。
实施例1：质粒pET28aULL1INS的构建
对编码连同编码肽ULL1INS的SEQ ID NO:9的核苷酸序列的胰岛素原的基因进行设计、密码子优化和化学合成，并克隆在
Figure BDA0002770006910000171
的pUC57中以制备pUC57ULL1INS。将基因片段克隆至pET28a载体中。pUC57ULL1INS质粒的限制性消化通过建立反应混合物来进行，该反应混合物具有质粒10μl、NdeI 1μl、BamHI 1μl、10X NEB缓冲液2μl和无菌水6μl。pET28a载体通过酶Ndel和BamHI进行限制性消化以产生粘性末端。反应混合物包含10μlpET28a载体、1μl Ndel、1μl BamHI、2μl 10X NEB缓冲液和6μl无菌水。两种反应均在37℃下温育2小时。将基因片段通过凝胶洗脱试剂盒
Figure BDA0002770006910000181
纯化并连接至pET28a载体。进一步将其转化至繁殖宿主大肠杆菌TOP10细胞中以繁殖连接的质粒。将这样的质粒分离并转化至大肠杆菌Gold BL 21DE3细胞中以检查蛋白的表达。
实施例2：质粒pET28aULL2INS的构建
对编码连同编码肽ULL2INS的SEQ ID NO:10的核苷酸序列的胰岛素原的基因进行设计、密码子优化和化学合成，并克隆在
Figure BDA0002770006910000182
的pUC57中以制备pUC57ULL2INS。将基因片段克隆至pET28a载体中。pUC57ULL2INS质粒的限制性消化通过建立反应混合物来进行，该反应混合物具有10μl质粒、1μl NcoI、1μl BamHI、2μl 10X NEB缓冲液和6μl无菌水。pET28a载体通过酶NcoI和BamHI进行限制性消化以产生粘性末端。反应混合物包含pET28a载体10μl、NcoI 1μl、BamHI 1μl、10X NEB缓冲液2μl和无菌水6μl。两种反应均在37℃下温育2小时。将基因片段通过凝胶洗脱试剂盒
Figure BDA0002770006910000183
纯化并连接至pET28a载体。进一步将其转化至繁殖宿主大肠杆菌TOP10细胞中以繁殖连接的质粒。将这样的质粒分离并转化至大肠杆菌Gold BL 21DE3细胞中以检查蛋白的表达。
实施例3：质粒pET28aULL1LSP的构建
为了获得构建体pET28aULL1LSP，在质粒pET28aULL1INS中进行了基于PCR的定点诱变。定点诱变将使B链的B28和B29位置从PK变为KP。使用以下突变引物对
正向：5'GTG GTT TCT TTT ATA CCA AAC CGA CCA AAC GTG GCA TTG T 3'
反向：5'ACA ATG CCA CGT TTG GTC GGT TTG GTA TAA AAG AAA CCA C 3'
PCR反应混合物由300μM dNTP混合物、1X PFu缓冲液、10pm每种引物、1μl模板质粒和41μl无菌水组成。使用的PCR条件为：94℃-8min、94℃-40秒、55℃-40秒、68℃-3min(20个循环)以及68℃持续10min。将定点诱变产物进行DpnI消化，并然后转化至繁殖宿主大肠杆菌TOP10细胞中进行繁殖。将质粒使用
Figure BDA0002770006910000191
miniprep试剂盒分离，并然后转化至大肠杆菌Gold BL 21DE3细胞中用于蛋白的表达。
实施例4：质粒pET28aULL2LSP的构建
为了获得构建体pET28aULL2LSP，在质粒pET28aULL2INS中进行了基于PCR的定点诱变。定点诱变将使B链的B28和B29位置从PK变为KP。使用以下突变引物对
正向：5'GTG GTT TCT TTT ATA CCA AAC CGA CCA AAC GTG GCA TTG T 3'
反向：5'ACA ATG CCA CGT TTG GTC GGT TTG GTA TAA AAG AAA CCA C 3'
PCR反应混合物由300μM dNTP混合物、1X PFu缓冲液、10pm每种引物、1μl模板质粒和41μl无菌水组成。PCR程序保持如下：94℃持续8min、94℃持续40秒、55℃持续40秒、68℃持续3min(20个循环)以及在68℃最后延长10min。将定点诱变产物进行DpnI消化，并然后转化至繁殖宿主大肠杆菌TOP10细胞中进行繁殖。将质粒使用
Figure BDA0002770006910000192
miniprep试剂盒分离，并然后转化至大肠杆菌Gold BL 21DE3细胞中用于蛋白的表达。
实施例5：质粒pET28aULL1GR的构建
为了获得构建体pET28aULL1GR，在质粒pET28aULL1INS中进行了定点诱变。定点诱变引物将在B链末端引入额外的Arg(R)，并在A链中用甘氨酸(G)替代天冬酰胺(N)。这会将胰岛素序列转变为甘精胰岛素序列。这是在两步骤定点诱变PCR中进行的。在第一SDM PCR中，使用以下引物正向：5'AAACCGACCAAACGTCGTGGCATTGTGGAACA 3'
反向：5'TGTTCCACAATGCCACGACGTTTGGTCGGTTT 3'
PCR反应混合物由300μM dNTP混合物、1X PFu缓冲液、10pm每种引物、1μl模板质粒和41μl无菌水组成。用于扩增的热循环仪条件为：94℃持续8min、94℃持续40秒、55℃持续40秒、68℃持续3min(20个循环)以及68℃持续10min。将定点诱变产物进行DpnI消化，并然后转化至繁殖宿主大肠杆菌TOP10细胞中进行繁殖。使用
Figure BDA0002770006910000201
miniprep试剂盒从这些菌落中分离质粒。该质粒用作第二SDM PCR的模板。进一步对于第二步骤SDM PCR，使用以下突变引物对。
正向：5'CTGGAAAACTATTGCGGCTAATAAGGATCCGAA 3'
反向：5'TTCGGATCCTTATTAGCCGCAATAGTTTTCCAG 3'
PCR反应混合物由300μM dNTP混合物、1X PFu缓冲液、10pm每种引物、1μl模板质粒和41μl无菌水组成。PCR程序保持如下：94℃持续8min、94℃持续40秒、55℃持续40秒、68℃持续3min(20个循环)以及68℃持续10min。将定点诱变产物进行DpnI消化，并然后转化至繁殖宿主大肠杆菌TOP10细胞中进行繁殖。将质粒使用
Figure BDA0002770006910000202
miniprep试剂盒分离，并然后转化至大肠杆菌Gold BL 21DE3细胞中用于蛋白的表达。
实施例6：质粒pET28aULL2GR的构建
为了获得构建体pET28aULL2GR，在质粒pET28aULL2INS中进行了定点诱变。定点诱变引物将在B链末端引入额外的Arg(R)，并在A链中用甘氨酸(G)替代天冬酰胺(N)。这会将胰岛素序列转变为甘精胰岛素序列。这是在两步骤定点诱变PCR中进行的。在第一SDM PCR中，使用以下引物正向：5'AAACCGACCAAACGTCGTGGCATTGTGGAACA 3'
反向：5'TGTTCCACAATGCCACGACGTTTGGTCGGTTT 3'
PCR反应混合物由300μM dNTP混合物、1X PFu缓冲液、10pm每种引物、1μl模板质粒和41μl无菌水组成。用于扩增的PCR程序为：94℃持续8min、94℃持续40秒、55℃持续40秒、68℃持续3min(20个循环)以及在68℃最后延长10min。将定点诱变产物进行DpnI消化，并然后转化至繁殖宿主大肠杆菌TOP10细胞中进行繁殖。使用
Figure BDA0002770006910000211
miniprep试剂盒从这些菌落中分离质粒。该质粒用作第二SDM PCR的模板。进一步对于第二步骤SDM PCR，使用以下突变引物对。
正向：5'CTGGAAAACTATTGCGGCTAATAAGGATCCGAA 3'
反向：5'TTCGGATCCTTATTAGCCGCAATAGTTTTCCAG 3'
PCR反应混合物由300μM dNTP混合物、1X PFu缓冲液、10pm每种引物、1μl模板质粒和41μl无菌水组成。用于扩增的PCR程序为：94℃持续8min、94℃持续40秒、55℃持续40秒、68℃持续3min(20个循环)以及68℃持续10min。将定点诱变产物进行DpnI消化，并然后转化至繁殖宿主大肠杆菌TOP10细胞中进行繁殖。将质粒使用Fermentasminiprep试剂盒分离，并然后转化至大肠杆菌Gold BL 21DE3细胞中用于蛋白的表达。
构建体测序：该项工作中制备的所有构建体都通过测序进行确认。
实施例7：使用构建体pET28aULL1INS的胰岛素的表达分析。
将包含载体pET28aULL1INS的大肠杆菌细胞在50ml包含20μg/ml卡那霉素的HivegLuria肉汤中在37℃、160rpm下生长过夜。然后将2％培养物转移至150ml的生产培养基中，该生产培养基包含1％酵母提取物、1％葡萄糖、0.3％KH2PO4、1.25％K2HPO4、0.5％(NH4)2SO4、0.05％NaCl、0.1％MgSO4·7H2O和0.1％的痕量金属溶液(FeSO4、ZnSO4、CoCl2、NaMoO4、CaCl2、MnCl2、CuSO4或H3BO3于盐酸中)。将卡那霉素添加至终浓度为20μg/ml。将培养物在37℃、140rpm下温育。当细胞密度达到1-1.2(OD600 nm)时，用1mM IPTG诱导培养物。将培养物进一步温育4小时。前胰岛素原的表达通过SDS-PAGE分析来分析。前胰岛素原的表达为总细胞蛋白的～25％。
实施例8：使用构建体pET28aULL2INS的胰岛素的表达分析。
将包含载体pET28aULL2INS的大肠杆菌细胞在50ml包含20μg/ml卡那霉素的HivegLuria肉汤中在37℃、160rpm下生长过夜。然后将2％培养物转移至150ml的生产培养基中，该生产培养基包含1％酵母提取物、1％葡萄糖、0.3％KH2PO4、1.25％K2HPO4、0.5％(NH4)2SO4、0.05％NaCl、0.1％MgSO4·7H2O和0.1％的痕量金属溶液(FeSO4、ZnSO4、CoCl2、NaMoO4、CaCl2、MnCl2、CuSO4或H3BO3于盐酸中)。将卡那霉素添加至终浓度为20μg/ml。将培养物在37℃、140rpm下温育。当细胞密度达到1-1.2(OD600 nm)时，用1mM IPTG诱导培养物。将培养物进一步温育4小时。前胰岛素原的表达通过SDS-PAGE分析来分析。前胰岛素原的表达为总细胞蛋白的～40％。
实施例9：使用构建体pET28aULL1INS制备人胰岛素
发酵过程—将用pET28aULL1INS转化的大肠杆菌细胞在生产培养基中生长，用IPTG诱导，并在发酵过程结束时获得细胞团块。
细胞裂解—将包含前胰岛素原的包涵体的细胞重悬浮于Tris-NaCl缓冲液中，并用Mini-DeBEE匀浆器通过高压裂解。
包涵体制备—将富含前胰岛素原的包涵体用包含还原剂诸如β-巯基乙醇的Tris-NaCl缓冲液洗涤。
溶解包涵体—将包涵体溶解在6M盐酸胍的碱性缓冲液中。将溶解的包涵体悬浮液通过添加亚硫酸钠和连四硫酸钠进行亚硫酸分解。
切割前导肽以获得胰岛素原—将溶解的包涵体悬浮液的pH调节至1-2。将溴化氰添加到溶液中并在8℃下温育过夜。然后通过添加过量的纯净水沉淀蛋白，并然后将离心后获得的沉淀物用甘氨酸缓冲液洗涤并且溶解在8M尿素中。
阴离子交换色谱—将溶解在8M尿素中的蛋白进行阴离子交换色谱。将蛋白负载在阴离子交换树脂上，并用包含氯化钠的8M尿素缓冲液洗脱。胰岛素原以浓缩的形式获得。
重折叠—然后将胰岛素原通过在甘氨酸缓冲液中稀释进行重折叠。溶液的pH保持在9.5，并且蛋白浓度在0.5至1mg/ml的范围内。使重折叠反应在25℃下进行2-3小时。通过添加乙酸终止反应，以便使pH达到～4.0。
疏水作用色谱(HIC)—将重折叠的溶液进行疏水作用色谱。通过添加氯化钠来增加溶液的电导率，并然后将蛋白负载至疏水作用树脂上。用增加梯度的氯化钠的甘氨酸缓冲液来洗脱胰岛素原。
通过胰蛋白酶的酶切割—用1:8000比率的蛋白与胰蛋白酶在4℃下消化从HIC洗脱的蛋白。反应通过HPLC监测，并且在完成反应时通过用过滤分离固定化的胰蛋白酶来终止。
阴离子交换色谱—将消化的蛋白通过阴离子交换色谱进一步纯化。将蛋白负载至阴离子交换色谱上，并用包含氯化钠的缓冲液洗脱。通过使用增加梯度的氯化钠来洗脱胰岛素。
羧肽酶的酶切割—然后将来自上面步骤的蛋白用羧肽酶消化以从B链去除C末端精氨酸。
反相色谱—通过反相色谱从消化的样品中纯化出活性胰岛素。负载蛋白以获得在10-15mg/ml树脂的范围内的最终结合。使用增加梯度的乙腈洗脱胰岛素。
实施例10：使用构建体pET28aULL2GLR制备人胰岛素
此实施例证明了本发明从基因构建体pET28aULL2GLR生产更高量的人胰岛素的效用。用于使用构建体pET28aULL2INS制备人甘精胰岛素的方法如下所述。
发酵过程—将用pET28aULL1INS转化的大肠杆菌细胞在生产培养基中生长，用IPTG诱导，并在发酵过程结束时获得细胞团块。
细胞裂解—将包含前胰岛素原的包涵体的细胞重悬浮于Tris-NaCl缓冲液中，并用Mini-DeBEE匀浆器通过高压裂解。
包涵体制备—将富含前胰岛素原的包涵体用包含还原剂诸如β-巯基乙醇的Tris-NaCl缓冲液洗涤。
溶解包涵体—将包涵体溶解在6M盐酸胍的碱性缓冲液中。将溶解的包涵体悬浮液通过添加亚硫酸钠和连四硫酸钠进行亚硫酸分解。
切割前导肽以获得胰岛素原—将溶解的包涵体悬浮液的pH调节至1-2。将溴化氰添加到溶液中并在8℃下温育过夜。然后通过添加过量的纯净水沉淀蛋白，并然后将离心后获得的沉淀物用甘氨酸缓冲液洗涤并且溶解在8M尿素中。
阴离子交换色谱—将溶解在8M尿素中的蛋白进行阴离子交换色谱。将蛋白负载在阴离子交换树脂上，并用包含氯化钠的8M尿素缓冲液洗脱。胰岛素原以浓缩的形式获得。
重折叠—然后将胰岛素原通过在甘氨酸缓冲液中稀释进行重折叠。溶液的pH保持在9.5，并且蛋白浓度在0.5至1mg/ml的范围内。使重折叠反应在25℃下进行2-3小时。通过添加乙酸终止反应，以便使pH达到～4.0。
疏水作用色谱(HIC)—将重折叠的溶液进行疏水作用色谱。通过添加氯化钠来增加溶液的电导率，并然后将蛋白负载至疏水作用树脂上。用增加梯度的氯化钠的甘氨酸缓冲液来洗脱胰岛素原。
通过胰蛋白酶的酶切割—用1:5000比率的蛋白与胰蛋白酶消化从HIC洗脱的蛋白。反应在4℃和pH 11.2下进行。反应通过HPLC监测。在完全消化后，通过添加乙酸淬灭反应。
阳离子交换色谱—将消化的蛋白通过阳离子交换色谱进一步纯化。将蛋白负载至阳离子交换色谱上，并用包含氯化钠的缓冲液洗脱。通过使用增加梯度的氯化钠来洗脱甘精胰岛素。
反相色谱—通过反相色谱从消化的样品中纯化出活性胰岛素。负载蛋白以获得在10-15mg/ml树脂的范围内的最终结合。使用增加梯度的乙腈洗脱胰岛素。
实施例11：比较使用不同前导肽时的胰岛素和胰岛素类似物的表达水平和产量
表1：在不存在和存在本发明的前导肽时的表达水平百分比
Figure BDA0002770006910000251
与存在前导肽时的表达相比，没有前导肽时的胰岛素或其类似物的表达显著更低。
表2：存在本发明的前导肽时蛋白的最终产量
Figure BDA0002770006910000252
如所观察的，本发明的前导肽序列的存在增强了胰岛素和胰岛素类似物的表达以及目的蛋白的最终产量。
根据前述内容，应当理解，尽管本文仅出于说明的目的描述了本发明的特定实施方式，但是可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改，并且不应以任何方式解释为限制本发明或所附权利要求的范围。
序列表
<110> 联合化学实验室有限公司(Unichem Laboratories Limited)
<120> 用于重组蛋白的更高表达的前导序列
<130> IN201821022673
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 1
Met Ser Arg Ile Val Ile Asn Ala Tyr Ala Lys Ala Thr Gln Pro Asp
1 5 10 15
Phe Lys Ser His Met
20
<210> 2
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 2
Met Glu Lys His Thr Lys Asp Gln Ile Ile Glu Ala Pro His Met Ser
1 5 10 15
Arg Ile Val Ile Asn Ala Tyr Ala Lys Ala Thr Gln Pro Asp Phe Lys
20 25 30
Ser His Met
35
<210> 3
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 3
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ser Arg Ile Val Ile Asn Ala Tyr Ala Lys Ala
20 25 30
Thr Gln Pro Asp Phe Lys Ser His Met Phe Val Asn Gln His Leu Cys
35 40 45
Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly
50 55 60
Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
65 70 75 80
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85 90
<210> 4
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 4
Met Glu Lys His Thr Lys Asp Gln Ile Ile Glu Ala Pro His Met Ser
1 5 10 15
Arg Ile Val Ile Asn Ala Tyr Ala Lys Ala Thr Gln Pro Asp Phe Lys
20 25 30
Ser His Met Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
35 40 45
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
50 55 60
Thr Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 5
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 5
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ser Arg Ile Val Ile Asn Ala Tyr Ala Lys Ala
20 25 30
Thr Gln Pro Asp Phe Lys Ser His Met Phe Val Asn Gln His Leu Cys
35 40 45
Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly
50 55 60
Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
65 70 75 80
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85 90
<210> 6
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 6
Met Glu Lys His Thr Lys Asp Gln Ile Ile Glu Ala Pro His Met Ser
1 5 10 15
Arg Ile Val Ile Asn Ala Tyr Ala Lys Ala Thr Gln Pro Asp Phe Lys
20 25 30
Ser His Met Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
35 40 45
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro
50 55 60
Thr Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 7
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 7
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ser Arg Ile Val Ile Asn Ala Tyr Ala Lys Ala
20 25 30
Thr Gln Pro Asp Phe Lys Ser His Met Phe Val Asn Gln His Leu Cys
35 40 45
Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly
50 55 60
Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
65 70 75 80
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
85 90
<210> 8
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 8
Met Glu Lys His Thr Lys Asp Gln Ile Ile Glu Ala Pro His Met Ser
1 5 10 15
Arg Ile Val Ile Asn Ala Tyr Ala Lys Ala Thr Gln Pro Asp Phe Lys
20 25 30
Ser His Met Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
35 40 45
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
50 55 60
Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
85
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 9
atgagccgta ttgttattaa cgcgtatgcg aaagcgaccc agccggattt taaaagccac 60
<210> 10
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 10
atggaaaaac acactaaaga tcaaatcatt gaagcaccgc atatgagccg tattgttatt 60
aacgcgtatg cgaaagcgac ccagccggat tttaaaagcc ac 102
<210> 11
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 11
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgagccgta ttgttattaa cgcgtatgcg aaagcgaccc agccggattt taaaagccac 120
atgtttgtta atcagcatct gtgcggtagc catctggtgg aagcgctgta tctggtgtgt 180
ggcgaacgtg gtttctttta taccccgaaa accaaacgtg gcattgtgga acagtgctgc 240
accagcatct gcagcctgta tcagctggaa aactattgca attaataa 288
<210> 12
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 12
atggaaaaac acactaaaga tcaaatcatt gaagcaccgc atatgagccg tattgttatt 60
aacgcgtatg cgaaagcgac ccagccggat tttaaaagcc acatgtttgt taatcagcat 120
ctgtgcggta gccatctggt ggaagcgctg tatctggtgt gtggcgaacg tggtttcttt 180
tataccccga aaaccaaacg tggcattgtg gaacagtgct gcaccagcat ctgcagcctg 240
tatcagctgg aaaactattg caattaataa 270
<210> 13
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 13
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgagccgta ttgttattaa cgcgtatgcg aaagcgaccc agccggattt taaaagccac 120
atgtttgtta atcagcatct gtgcggtagc catctggtgg aagcgctgta tctggtgtgt 180
ggcgaacgtg gtttctttta taccaaaccg accaaacgtg gcattgtgga acagtgctgc 240
accagcatct gcagcctgta tcagctggaa aactattgca attaataa 288
<210> 14
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 14
atggaaaaac acactaaaga tcaaatcatt gaagcaccgc atatgagccg tattgttatt 60
aacgcgtatg cgaaagcgac ccagcctgat tttaaaagcc acatgtttgt taatcagcat 120
ctgtgcggta gccatctggt ggaagcgctg tatctggtgt gtggcgaacg tggtttcttt 180
tataccaaac cgaccaaacg tggcattgtg gaacagtgct gcaccagcat ctgcagcctg 240
tatcagctgg aaaactattg caattaataa 270
<210> 15
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 15
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgagccgta ttgttattaa cgcgtatgcg aaagcgaccc agccggattt taaaagccac 120
atgtttgtta atcagcatct gtgcggtagc catctggtgg aagcgctgta tctggtgtgt 180
ggcgaacgtg gtttctttta taccccgaaa acccgtcgtg gcattgtgga acagtgctgc 240
accagcatct gcagcctgta tcagctggaa aactattgcg gctaataa 288
<210> 16
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰序列
<400> 16
atggaaaaac acactaaaga tcaaatcatt gaagcaccgc atatgagccg tattgttatt 60
aacgcgtatg cgaaagcgac ccagccggat tttaaaagcc acatgtttgt taatcagcat 120
ctgtgcggta gccatctggt ggaagcgctg tatctggtgt gtggcgaacg tggtttcttt 180
tataccccga aaacccgtcg tggcattgtg gaacagtgct gcaccagcat ctgcagcctg 240
tatcagctgg aaaactattg cggctaataa 270

Claims (27)

1.一种用于生产胰岛素和胰岛素类似物的方法，包括式1的前胰岛素原：
R1-X1-X2-X3
式1
作为中间体，其中，X1是胰岛素或胰岛素类似物的‘B’链，X2是选自RR或KR或RK或KK的二肽，X3是胰岛素或胰岛素类似物的‘A’链，以及R1是前导肽序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述前导肽选自：
a)具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽，
b)具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽，
c)包括以下氨基酸序列的肽：MSRIVINAYAKATQP；
d)包括以下氨基酸序列的肽：MEKHTKDQIIEAPHM；或
e)与a)、b)、c)或d)具有至少80％同源性的肽。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括由前胰岛素原制备式2：X1-X2-X3的胰岛素原，其中，X1是胰岛素或胰岛素类似物的‘B’链，X2是选自RR或KR或RK或KK的二肽，以及X3是胰岛素或胰岛素类似物的‘A’链。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法包括通过在生产培养基中培养包括编码可操作地连接至所述前导肽的胰岛素原的核酸的原核宿主细胞来表达胰岛素原。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述原核宿主细胞选自假单胞菌细胞或大肠杆菌细胞。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述生产培养基包括1％酵母提取物、1％葡萄糖、0.3％KH2PO4、1.25％K2HPO4、0.5％(NH4)2SO4、0.05％NaCl、0.1％MgSO4·7H2O和0.1％的痕量金属溶液(FeSO4、ZnSO4、CoCl2、NaMoO4、CaCl2、MnCl2、CuSO4或H3BO3于盐酸中)、卡那霉素(20μg/ml)每100ml。
7.一种多肽，包括可操作地连接至胰岛素或胰岛素类似物的前体的前导肽，其中，所述前导肽选自：
a)具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽，
b)具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽，
c)包括以下氨基酸序列的肽：MSRIVINAYAKATQP；
d)包括以下氨基酸序列的肽：MEKHTKDQIIEAPHM；或
e)与a)、b)、c)或d)具有至少80％同源性的肽。
8.根据权利要求7所述的多肽，其中，所述胰岛素或胰岛素类似物的前体是式2：X1-X2-X3的胰岛素原，其中，X1是胰岛素或胰岛素类似物的‘B’链，X2是选自RR或KR或RK或KK的二肽，以及X3是胰岛素或胰岛素类似物的‘A’链。
9.根据权利要求7所述的多肽，其中，所述前导肽指导所述胰岛素和胰岛素类似物在原核宿主细胞中的表达。
10.根据权利要求7所述的多肽，其中，所述原核宿主细胞选自假单胞菌细胞或大肠杆菌细胞。
11.一种前导肽序列，选自：
a)具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽，
b)具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽，
c)包括以下氨基酸序列的肽：MSRIVINAYAKATQP；
d)包括以下氨基酸序列的肽：MEKHTKDQIIEAPHM；或
e)与a)、b)、c)或d)具有至少80％同源性的肽。
12.一种使用式1：R1-X1-X2-X3的前胰岛素原制备的式2：X1-X2-X3的胰岛素原序列，其中，X1是胰岛素或胰岛素类似物的‘B’链，X2是选自RR或KR或RK或KK的二肽，X3是胰岛素或胰岛素类似物的‘A’链，以及R1选自：
a)具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽，
b)具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽，
c)包括以下氨基酸序列的肽：MSRIVINAYAKATQP；
d)包括以下氨基酸序列的肽：MEKHTKDQIIEAPHM；或
e)与a)、b)、c)或d)具有至少80％同源性的肽。
13.一种编码选自以下的前导肽的核苷酸序列：
a)具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽，
b)具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽，
c)包括以下氨基酸序列的肽：MSRIVINAYAKATQP；
d)包括以下氨基酸序列的肽：MEKHTKDQIIEAPHM；或
e)与a)、b)、c)或d)具有至少80％同源性的肽。
14.根据权利要求13所述的核苷酸序列，其中，所述序列为如SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10所示。
15.一种编码式1，R1-X1-X2-X3的氨基酸序列的核苷酸序列，其中，X1是胰岛素或胰岛素类似物的‘B’链，X2是选自RR或KR或RK或KK的二肽，X3是胰岛素或胰岛素类似物的‘A’链，以及R1选自：
a)具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽，
b)具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽，
c)包括以下氨基酸序列的肽：MSRIVINAYAKATQP；
d)包括以下氨基酸序列的肽：MEKHTKDQIIEAPHM；或
e)与a)、b)、c)或d)具有至少80％同源性的肽。
16.根据权利要求15所述的核苷酸序列，其中，所述序列选自SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
17.一种重组基因构建体，包括如权利要求15或权利要求16所述的核苷酸序列。
18.根据权利要求17所述的重组基因构建体，其中，所述基因构建体选自pET28aULL1INS、pET28aULL2INS、pET28aULL1LSP、pET28aULL2LSP、pET28aULL1GR或pET28aULL2GR。
19.一种表达载体，包括具有如权利要求15所述的核苷酸序列的基因构建体。
20.根据权利要求19所述的表达载体，其中，所述载体包括用于生产胰岛素的质粒pET28aULL1INS、pET28aULL2INS或其组合。
21.根据权利要求19所述的表达载体，其中，所述载体包括用于生产赖脯胰岛素的质粒pET28aULL1LSP、pET28aULL2LSP或其组合。
22.根据权利要求19所述的表达载体，其中，所述载体包括用于生产甘精胰岛素的质粒pET28aULL1GR、pET28aULL2GR或其组合。
23.根据权利要求19所述的表达载体，其中，所述表达在原核宿主细胞中进行。
24.根据权利要求23所述的表达载体，其中，所述原核宿主细胞选自假单胞菌细胞或大肠杆菌细胞。
25.一种制备用于式1：R1-X1-X2-X3的表达的包括重组基因构建体的重组基因表达载体的方法，其中，X1是胰岛素或胰岛素类似物的‘B’链，X2是选自RR或KR或RK或KK的二肽，X3是胰岛素或胰岛素类似物的‘A’链，以及R1选自：
a)具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽，
b)具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽，
c)包括以下氨基酸序列的肽：MSRIVINAYAKATQP；
d)包括以下氨基酸序列的肽：MEKHTKDQIIEAPHM；或
e)与a)、b)、c)或d)具有至少80％同源性的肽。
26.通过如权利要求1所述的方法获得的胰岛素或胰岛素类似物，包括式1的前胰岛素原：
R1-X1-X2-X3
式1
作为中间体，其中，X1是胰岛素或胰岛素类似物的‘B’链，X2是选自RR或KR或RK或KK的二肽，X3是胰岛素或胰岛素类似物的‘A’链，以及R1是前导肽。
27.根据权利要求26所述的胰岛素或胰岛素类似物，其中，所述前导肽选自：
a)具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽，
b)具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽，
c)包括以下氨基酸序列的肽：MSRIVINAYAKATQP；
d)包括以下氨基酸序列的肽：MEKHTKDQIIEAPHM；或
e)与a)、b)、c)或d)具有至少80％同源性的肽。
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