JP4088584B2 - 融合タンパク質から目的タンパク質を分離する方法。 - Google Patents
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Description
また、このように融合タンパク質形態で発現させる場合、この後の段階で融合パートナーを切断などの方法によって融合タンパク質から除去しなければならない。特に、目的タンパク質が医療用タンパク質である場合、切断反応後、正確に目的タンパク質のN-末端またはC-末端が露出されるように、目的タンパク質と補助タンパク質の連結部位に適合した切断部位を挿入すると同時に、目的タンパク質内に同じ切断部位が存在しないように融合タンパク質を設計しなければならない。酸処理、CNBr処理などの化学的方法やファクターXa、エンテロキナーゼなどのタンパク質分解酵素を利用し切断反応を実施するが、この酵素なども選択性がよくなくて目的切断部位以外の位置で切断反応の起こることがあり、反応が効率的ではなくて酵素価格が非常に高い。
a)本発明による目的タンパク質と融合パートナーからなる融合タンパク質を宿主細胞において発現させ、
b)前記融合パートナーが吸着するマトリックスに融合タンパク質をローディングし、
c)前記マトリックスでユビキチン分解酵素で処理し、
d)前記マトリックスから目的タンパク質を溶出させるものを含み、融合タンパク質から目的タンパク質を分離する方法に関する。
b)前記融合パートナーが吸着するマトリックスに融合タンパク質をローディングし、
c)前記マトリックスから融合タンパク質を回収し、
d)回収した融合タンパク質をユビキチン分解酵素で処理し、
e)マトリックスに対する吸着力の差によって前記融合パートナーから目的タンパク質を分離することを含み、融合タンパク質から目的タンパク質を分離する方法に関する。
ヒト成長ホルモン遺伝子は(Genbank番号K02382、Human growth hormone synthetic gene、complete cds)をpGNX2(韓国登録特許公報第0319529号)にクローニングしてpGNX2hGHを製造した。これを鋳型としてhGHN及びhGHCBプライマ−(表1)を用いて400bpの重合酵素連鎖反応物を得てBamH1で切断した。
UBP1遺伝子をクローニングするためにS.セレビジエ(S.cerevisiae)ATCC番号208275のゲノムを鋳型でプライマ−UBPNとUBPC(表1)を用いて重合酵素連鎖反応(PCR)で2400bpのUBP1遺伝子を得た後、pRSETcベクターのNdeIとBamH1の部位にクローニングした。クローニングされたものをNde1とBamH1で切断して同じ酵素で切断されたpGNX4ベクターと連結してpGNX4UBP1を製造した。これをE.coli XL1-Blue MRに形質転換させた。これによって得たクローンをカナマイシンが含まれた培地で選別して、カナマイシンを含んだLB液体培地で培養してOD600=0.6で0.5mM IPTGで発現誘導し、発現したUBP1を用いて実施例1の融合タンパク質を基質とした切断反応により活性を確認した。
実施例1で製造された発現ベクターpGNX4K6UbhGHにE.coli TG1を形質転換させた後、コロニーを得てLB培地(カナマイシン50mg/L包含)5mLに接種した。37℃で培養した後、その中の1mLを5g/Lのブドウ糖が含まれた100mLのR培地(培地組成:表2)に再び接種して30℃で培養した。これを15g/Lのブドウ糖が含まれたR培地1。4Lに再び接種してブドウ糖が消耗される時点で500g/Lのブドウ糖溶液を注入するフェッドバッチ(fed−batch)培養を実施した。培養液の吸光度が70に到達すればIPTG1mMを添加してタンパク質の発現を誘導した。遠心分離して収穫した細胞を20mMリン酸塩緩衝液(pH7.5)に懸濁させてマイクロフルイダイザーを用いて破砕した。15、000rpmの回転速度で60分間遠心分離して可溶性細胞抽出液である上層液を回収した後、イオン交換樹脂を用いて精製を試みた。
実施例2において製造した発現ベクターpGNX4K10UBP1でE.coli TG1を形質転換させ得た組換え大腸菌を実施例3の方法で培養してリシン10個のタグが融合されたユビキチン分解酵素(K10-UBP)を生産した。実施例3の方法で処理して得た組換え大腸菌細胞抽出液を確保して陽イオン交換樹脂を利用して酵素を分離した。実施例1においてK6Ub-hGHは400mMで溶出したが、K10-UBPも400mM分画で力価を示し二つの融合タンパク質を含んだ溶液のイオン強度を同一に合せることができた。
実施例3において部分精製されたK6Ub-hGH400mM分画と実施例4において部分精製されたK10-UBP400mM分画を50対1の比率で混合して30℃で1時間切断反応を実施してSDS-PAGEで分析した(図3のレーン2)。
実施例6:ユビキチン切断反応と陰イオン交換樹脂を用いた精製工程
実施例3において部分精製されたK6Ub-hGH400mM分画と、実施例4において部分精製されたK10-UBP400mM分画を、50対1の比率で混合して30℃で1時間切断反応を実施して反応液内でヒト成長ホルモンが陰イオン交換樹脂によく吸着するようにPD-10カラム(Pharmacia)を用いて脱塩させた。脱塩された切断反応液をQ-セファロース高速流の陰イオン交換樹脂カラムに注入して20mMリン酸塩緩衝液を洗浄して吸着されないタンパク質を溶出した。200mM塩溶液を流しヒト成長ホルモンを溶出した(図4、レーン1:K6Ub-hGH400mM分画をUBP処理した液、2:K6Ub-hGH400mM分画をUBP処理した液をカラムに注入した後の溶出液、3:緩衝液で洗浄した液、4:50mM NaCl+緩衝液で洗浄した液、5:200mM NaCl+緩衝液で洗浄した液、6:1M NaCl+緩衝液で洗浄した液)。
実施例5の方法で分離したヒト成長ホルモンの純度を確認するために逆相高速液体クロマトグラフィーを実施した。図3のレーン3番に該当する分画を試料として用い、カラムはVydac(登録商標)C4(300A、5um、4.6mm id x250mm、USA)を用いて分析した。分析条件はヨーロッパ薬局方に記載されたヒト成長ホルモン分析条件を参照して設定した(ヨーロッパ薬局方1999:0951)。カラム温度は45℃で維持し、移動相で29%イソプロパノール71%50mMトリス緩衝液(pH7.5)を使用し、流速は250μm/minで固定した。図5にクロマトグラムを示したが2段階イオン交換樹脂精製工程を通じて99%以上の純度でヒト成長ホルモンを生産できた。
SP-セファロース高速流の陽イオン交換樹脂カラムを実施例3のように構成し、pH7.5のリン酸塩緩衝液で平衡化させた後、実施例3の方法で部分精製したK6UbhGHを含む400mM分画3mLを同一体積の緩衝液で希釈してイオン強度を低くした後、樹脂トップ内に注入した。吸着されないタンパク質などを除去するために6mLの緩衝液で洗浄した。実施例4の方法で得たK10-UBPが含まれた400mM分画1mLを同一体積の緩衝液で希釈した後、樹脂トップに注入し、常温で1時間反応した。反応後、200mMのNaClが含まれた緩衝液6mLを流し切断されたヒト成長ホルモンを溶出させて1MのNaClが含まれた緩衝液6mLに残りの吸着タンパク質を溶出させた。各段階で出てきた分画のSDS-PAGE分析結果を図6に示した(SM:分子量マーカー、1:K6UbhGHを含む400mM分画、2:緩衝液で洗浄した液、3:K10-UBPが含まれた400mM分画注入後、溶出液、4:200mM NaClが含まれた緩衝液で洗浄した液、5:1M NaClが含まれている緩衝液で洗浄した液)。K6Ub-hGHを含む400mMの塩濃度で溶出した分画内のタンパク質などは陽イオン交換樹脂によく吸着して、緩衝液を用いた全洗浄過程でタンパク質が溶出しなかった(レーン2)。同様に400mMの塩濃度で溶出したK10-UBPを含む分画内のタンパク質などもよく吸着した(レーン3)。ユビキチン分解酵素を利用した切断反応後、ヒト成長ホルモンは融合タンパク質から遊離されるが、切断反応後、200mMのNaClが含まれた緩衝液を流すと溶出された分画に切断されたヒト成長ホルモンが非常に高い純度で存在することを確認できた(レーン4)。
100mlのSTREAMLINE(登録商標)SP樹脂が詰められたSTREAMLINE(登録商標)25のカラムにpH7.5のリン酸塩緩衝液で平衡化させた後、実施例3のK6Ub-hGH融合タンパク質が含まれた細胞破砕液(400ml)をカラムベッドの膨脹比率が2になるように下から上の方向に注入した。試料注入後、樹脂体積の2倍に相当するリン酸塩緩衝液で洗浄して細胞クズなどの固形物質と大腸菌細胞タンパク質、DNAなどを除去した。樹脂に吸着された融合タンパク質でヒト成長ホルモンを切断するために、樹脂を沈降させて上の実施例4により得られたK10-UBP溶液50mlを緩衝液で希釈した後、カラム内部に注入して反応を始めた。ペリスタルティックポンプを用いてカラムの内部液を循環させながら反応させて吸光分光計を通過させて吸光度を測定することにより、反応の進行程度を測定した。反応が進むに連れて吸着された融合タンパク質から切断されて緩衝液に遊離されたヒト成長ホルモンが増加するようになって吸光度が増加し、3時間経過後に、これ以上の吸光度増加がなく反応が完了したことを確認した。反応後、100mM NaClが含まれた緩衝液を注入しながら遊離されたヒト成長ホルモンを溶出させて各々600mM、1mM NaClが含まれた緩衝液100mlで洗浄した(図7、1:分子量マーカー、2:細胞破砕液、3:細胞破砕液注入後、洗浄した液、4:UBP処理後、溶出液、5:100mM NaClが含まれている緩衝液で洗浄した液、6:600mM NaClが含まれている緩衝液で洗浄した液、7:1M NaClが含まれている緩衝液で洗浄した液)。
ユビキチンタンパク質とヒトインターフェロンタンパク質の融合のために2段階の重合酵素連鎖反応を用いた。
リシン6個がN−末端に追加されたユビキチンとインターフェロンが融合されているDNAを含むpGNX4K6UbIFNalpha-2bプラスミドにTG1宿主細胞を形質転換させ融合タンパク質が発現するクローンを選抜した。5ml LB培地で培養し、100ml LB培地に3%接種を実施した。吸光度1.5〜2 になった時、IPTGを用いてインターフェロンを発現させ、IPTG添加後、4時間経過してから細胞を収穫した。13000rpmの回転速度で3分間遠心分離を実施して菌体を回収し、4mlの20mMリン酸塩バッファーに懸濁させた後、超音波破砕機で細胞を破砕した。破砕液を13000rpmの回転速度で30分間遠心分離した後、上澄み液を回収して精製した。インターフェロンの精製にはイオン性機能団を有するVivapure S mini H(Vivascience、Germany)陽イオン交換メンブランを用い、20mMリン酸塩バッファーで平衡化させた後に用いた。先に得たインターフェロンが含まれた上澄み液0.4mlをメンブランにローディングして1200gで遠心分離して吸着させた。リン酸塩バッファー0.4mlで2回メンブランを洗浄して1M NaClが含まれたリン酸塩バッファーで溶出させた。溶出されて出た分画の中の0.1mlをモレキュラーカットオフ3500規格の透析装置(Slide-A-Lyzer mini、Pierce、USA)を用いて1時間続けて脱塩させ、UBP1を用いて切断反応を実施した。2時間の反応後、反応液を20mMリン酸塩バッファーで平衡化させたメンブランに再びローディングした後1200g回転速度で5分遠心分離した。この時、吸着しなくてメンブランを通過した分画に非常に高い純度でインターフェロンが存在することを確認できた(図8:レーン、1:ローディングサンプル1/10希釈、2:1M NaCl溶出液、3:脱塩後のUBP切断反応、4:切断反応液がメンブランを通過した分画)。
ユビキチンの3次元構造図を参考にして、ユビキチン融合タンパク質をユビキチン分解酵素が認識できるようにユビキチンの3次元的構造を維持しながらユビキチン表面電荷を入れ替えるために、ユビキチン内の16、18、64番位置に存在する陰イオン性グルタメートから、これをアルギニンまたはリシンに置換して等電点の変化を誘導した。ユビキチンの変形のために二回の重合酵素連鎖反応を利用した。
タンパク質配列を変化させた変形ユビキチンとヒト成長ホルモンが融合されているDNAを含むpGNX4MUbhGHプラスミドで大腸菌宿主細胞を形質転換させ融合タンパク質が発現するクローンを選抜した。5mlLB培地で予め培養して100mlLB培地に3%接種を実施した。吸光度1.5−2になった時、IPTGを用いて融合タンパク質を発現させ、IPTG添加後、4時間経過してから、細胞を収穫した。13000rpmの回転速度で3分間遠心分離を実施し菌体を回収して吸光度50程度に20mM MESバッファーに懸濁させた後、超音波破砕機で細胞を破砕した。破砕液を13000rpmの回転速度で30分間遠心分離した後、上澄み液を回収して精製に使用した。
Claims (15)
- (a)目的タンパク質が融合パートナーのC−末端に連結された融合タンパク質を宿主細胞において発現させる段階であって、
前記融合パートナーはi)C−末端にユビキチン切断部位が存在し、ii)ユビキチンのN−末端に2〜30個の正電荷を有するアミノ酸からなるペプチドを含む、またはユビキチン内部のアミノ酸が正電荷を有するアミノ酸に置換された、目的タンパク質との等電点差が1以上であるものであり;
(b)前記発現された融合タンパク質を含む細胞抽出物を融合パートナーが吸着するメンブランまたはイオン交換樹脂にローディングし、前記融合タンパク質をメンブランまたはイオン交換樹脂に吸着させる段階;及び
(c)前記吸着された融合タンパク質をユビキチン切断酵素で処理して、融合タンパク質から分離された目的タンパク質を収得する段階;
を含む目的タンパク質の分離方法。 - (a)目的タンパク質が融合パートナーのC−末端に連結された融合タンパク質を宿主細胞において水溶性形態で発現させる段階であって、
前記融合パートナーはi)C−末端にユビキチン切断部位が存在し、ii)ユビキチンのN−末端に2〜30個の正電荷を有するアミノ酸からなるペプチドを含む、またはユビキチン内部のアミノ酸が正電荷を有するアミノ酸に置換された、目的タンパク質との等電点差が1以上であるものであり ;
(b)前記発現された融合タンパク質を含む細胞抽出物を融合パートナーが吸着するメンブランまたはイオン交換樹脂にローディングし、前記融合タンパク質をメンブランまたはイオン交換樹脂に吸着させた後、融合タンパク質を回収する段階;及び
(c)前記回収された融合タンパク質をユビキチン切断酵素で処理した後、融合パートナーが吸着されるイオン交換樹脂または目的タンパク質が吸着されるイオン交換樹脂を利用して目的タンパク質を分離及び収得する段階;
を含む目的タンパク質の分離方法。 - (a)目的タンパク質が融合パートナーのC−末端に連結された融合タンパク質を宿主細胞において発現させる段階であって、
前記融合パートナーはi)C−末端にユビキチン切断部位が存在し、ii)ユビキチンのN−末端に2〜30個の負電荷を有するアミノ酸からなるペプチドを含む、またはユビキチン内部のアミノ酸が負電荷を有するアミノ酸に置換されたものであり;
(b)前記発現された融合タンパク質を含む細胞抽出物を目的タンパク質が吸着するメンブランまたは陽イオン交換樹脂にローディングし、前記融合タンパク質を回収する段階;及び
(c)前記回収された融合タンパク質をユビキチン切断酵素で処理して、融合タンパク質を目的タンパク質及び融合パートナーにそれぞれ切断し、イオン交換樹脂を利用して目的タンパク質を分離及び収得する段階であって、
前記イオン交換樹脂が陰イオン交換樹脂である場合、前記樹脂に吸着されない目的タンパク質を回収し、前記イオン交換樹脂が陽イオン交換樹脂である場合、前記樹脂に目的タンパク質のみを吸着させた後、吸着された目的タンパク質を回収する段階;
を含む目的タンパク質の分離方法。 - (a)目的タンパク質が融合パートナーのC−末端に連結された融合タンパク質を宿主細胞において発現させる段階であって、
前記融合パートナーはi)C−末端にユビキチン切断部位が存在し、ii)ユビキチンのN−末端に2〜30個の負電荷を有するアミノ酸からなるペプチドを含む、またはユビキチン内部のアミノ酸が負電荷を有するアミノ酸に置換されたものであり;
(b)前記発現された融合タンパク質を含む細胞抽出物を目的タンパク質が吸着するメンブランまたは陽イオン交換樹脂にローディングし、前記融合タンパク質を回収する段階;及び
(c)前記回収された融合タンパク質を融合パートナーが吸着される陰イオン交換樹脂 に通過させて融合タンパク質を前記樹脂に吸着させる段階;及び
(d)前記吸着された融合タンパク質をユビキチン切断酵素で処理して、融合タンパク質から分離される目的タンパク質を収得する段階;
を含む目的タンパク質の分離方法。 - 前記正電荷を有するアミノ酸は、ヒスチジン、リシン及びアルギニンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載の目的タンパク質の分離方法。
- 前記負電荷を有するアミノ酸は、グルタメートまたはアスパラギン酸(aspartate)であることを特徴とする、請求項3または4に記載の目的タンパク質の分離方法。
- 前記融合パートナーのユビキチンは、N−末端にGST(Glutathione S transferase)、マルトース結合タンパク質、またはチオレドキシンが追加的に連結されたものであることを特徴とする、請求項1乃至4のうちのいずれか一項に記載の目的タンパク質の分離方法。
- 前記目的タンパク質は、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、顆粒球コロニー刺激因子、エリトロポエチン、及びインシュリンから構成される群より選択されることを特徴とする、請求項1乃至4のうちのいずれか一項に記載の目的タンパク質の分離方法。
- 前記融合パートナーは、ユビキチンの16、18及び64番目アミノ酸からなる群より1種以上選択されたアミノ酸が、ヒスチジン、リシン及びアルギニンからなる群より選択される1種以上のアミノ酸に置換されたものであることを特徴とする、請求項1または2に記載の目的タンパク質の分離方法。
- 前記融合パートナーは、ユビキチンの16、18及び64番目アミノ酸からなる群より1種以上選択されたアミノ酸が、グルタメート及びアスパラギン酸(aspartate)からなる群より選択される1種以上のアミノ酸に置換されたものであることを特徴とする、請求項3または4に記載の目的タンパク質の分離方法。
- 前記ユビキチン切断部位は、RGGアミノ酸からなることを特徴とする、請求項1乃至4のうちのいずれか一項に記載の目的タンパク質の分離方法。
- 前記目的タンパク質は、等電点が7.0以下であることを特徴とする、請求項1または2に記載の目的タンパク質の分離方法。
- 前記目的タンパク質は、等電点が7.0以上であることを特徴とする、請求項3または4に記載の目的タンパク質の分離方法。
- 前記目的タンパク質と融合パートナーとの等電点差が1以上であることを特徴とする、請求項3または4に記載の目的タンパク質の分離方法。
- 前記融合タンパク質は、宿主細胞において水溶性形態で発現することを特徴とする、請求項1乃至4のうちのいずれか一項に記載の目的タンパク質の分離方法。
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