KR100319529B1 - 펩타이드 항생물질의 대량 생산 방법 및 그에 유용한 유전자 구조물 - Google Patents

펩타이드 항생물질의 대량 생산 방법 및 그에 유용한 유전자 구조물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물로부터 펩타이드 항생물질을 효과적으로 대량 생산할 수 있는 유전자 구조물, 미생물로부터 펩타이드 항생물질을 효과적으로 대량 생산할 수 있는 방법 및 이에 유용한 벡타에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유전자 구조물은purF유전자의 전부 또는 일부 또는 이들의 유도체를 코딩하는 제 1 유전자 서열과 펩타이드 항생물질을 코딩하는 제 2 유전자 서열로 이루어진다. 본 발명에 따른 유전자 구조물을 포함하는 발현 벡타를 제조하고; 박테리아 숙주세포를 상기 벡타로 형질전환시키고; 상기 형질전환된 세포를 상기 유전자 구조물이 발현되도록 배양하고; 상기 펩타이드 항생물질을 회수함에 의해 펩타이드 항생물질을 대량 생산할 수 있다,

Description

펩타이드 항생물질의 대량 생산 방법 및 그에 유용한 유전자 구조물 {Recombinant production of antimicrobial peptides and DNA construct therefor}
본 발명은 재조합 DNA 기술에 관한 것으로, 미생물에서 펩타이드 항생물질을 대량으로 생산하는 방법, 그것에 유용한 유전자 구조물 및 벡타 시스템에 관한 것이다. 생물학적 활성이 있는 펩타이드(이하 '펩타이드 항생물질'이라 한다)는 미생물에 대한 내성이 문제시되고 있는 종래의 항생제들과는 다른 활성 기작에 의해 항균활성을 나타내므로, 내성을 유발할 가능성이 적다는 장점을 가지고 있다. 따라서, 펩타이드 항생물질은 제약·식품 분야 등에서의 산업적 응용 가능성이 매우 높다.
그러나, 전술한 펩타이드 항생물질의 산업적 이용에 가장 큰 장애요인은 지금까지의 방법으로는 이들을 값싸게 대량으로 제공할 수 없다는 점에 있다. 예를 들면, 화학합성으로 펩타이드 항생물질을 생산하는 경우에는 경제성이 낮다는 문제가 있으며, 미생물을 이용한 유전공학적 기법으로 펩타이드 항생물질을 생산하고자 하는 시도가 있으나, 펩타이드 항생물질의 발현율이 매우 낮다는 문제점이 있었다.
미국특허 5,205,154에는 세크로핀의 항균활성을 억제할 수 있는 폴리펩타이드의 유전자와 이 폴리펩타이드에 연결된 세크로핀 유전자로 이루어지는 유전자 구조물을 보고하면서, 폴리펩타이드의 예로 araB 유전자를 제시하였다.
미국특허 5,593,866호에는 양전하 항균펩타이드를 생산하기 위하여, 박테리아의 단백질 분해효소에 의한 분해를 억제하는 음전하 펩타이드와의 융합단백질 형태로 생산하는 방법을 제시하였다.
본 발명은 미생물에서 펩타이드 항생물질을 대량으로 발현시킬 수 있는 유전자 구조물을 제공한다.
본 발명은 미생물에서 펩타이드 항생물질을 효과적으로 생산 및 회수할 수 있는 유전자 구조물을 제공한다.
본 발명은 원하는 산물의 유전자 발현 수를 증가시킴과 동시에, 분리 및 정제에 효과적인 유전자 구조물 다량체 및 그것의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 미생물에서 펩타이드 항생물질을 대량 발현시킬 수 있는 발현 벡타를 제공한다.
본 발명은 미생물로부터 펩타이드 항생물질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명에 이용된 펩타이드 항생물질 유전자의 누클레오타이드 서열이다.
도 2는 융합 파트너 유전자의 누클레오타이드 서열이다.
도 3은 CNBr 자리를 생성하면서 융합 파트너와 MSI-344 유전자를 융합하는 방법의 개략도이다.
도 4는 하이드록실아민 자리를 생성하면서 융합 파트너와 MSI-344 유전자를 융합하는 방법의 개략도이다.
도 5은 전사 단계의 융합 다량체 제조 방법의 개략도이다.
도 6는 벡터 pGNX2 제조 방법의 개략도이다.
도 7는 벡터 pT7K2.1 제조 방법의 개략도이다.
도 8는 벡터 pGNX3 제조 방법의 개략도이다.
도 9는 벡터 pGNX4이다.
도 10은 벡터 pGNX5 제조방법의 개략도이다.
도 11은 각각 락토오스와 IPTG을 유도물질로 사용하여 MSI-344를 발현시킨형질전환체 파쇄물의 SDS-PAGE 사진이다.
도 12는 벡타 종류에 따른 MSI-344 발현에 대한 SDS-PAGE 사진이다.
도 13a은 락토오스를 유도물질로 사용하여 여러 가지 펩타이드 항생물질을 발현시킨 형질전환체 파쇄물의 SDS-PAGE 사진이다.
도 13b는 락토오스를 유도물질로 사용하여 여러 가지 펩타이드 항생물질을 발현시킨 형질전환체 파쇄물의 SDS-PAGE 사진이다.
도 14a, 14b, 14c 및 14d는 락토오스를 유도물질로 사용하여 여러 가지 펩타이드 항생물질을 발현시킨 형질전환체 파쇄물의 SDS-PAGE 사진이다.
도 15은 융합 유전자를 모노머, 다이머, 테트라머 형태로 형질전환시킨 형질전환체 파쇄물의 SDS-PAGE 사진이다.
본 발명은 펩타이드 항생물질을 대장균 또는 원핵세포에서 효과적으로 대량으로 발현시킬 수 있는 유전자 구조물에 관한 것이다.
펩타이드 항생물질을 미생물에서 대량으로 발현시키고 생산하기 위한 필수 요건은 펩타이드 항생물질이 가지는 미생물에 대한 독성을 효과적으로 중화시키는 것이다. 이를 위해 본 발명에서는 펩타이드 항생물질 유전자에 융합 파트너로purF(glutamine pyrophosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase; Genbank No: X12423) (Tso et al., J. Biol. Chem., 257: 3525, 1982, Makaroff et al., J. Biol. Chem., 258: 10586, 1983) 유전자, 그것의 일부 또는 이들의 유도체(이하 purF 유전자 유도체라 한다)가 연결된 유전자 구조체를 제공한다.
본 발명에 따른 유전자 구조물에서 융합 파트너로 사용된 purF 유전자 유도체는 형질전환체인 Escherichia coli에서 숙주 세포를 죽이지 않으면서 펩타이드 항생물질을purF유도체와의 융합 폴리펩타이드 형태로 대량으로 발현될 수 있도록 한다. 따라서, 강력한 발현 시스템을 사용하더라도 숙주 세포가 죽지 않아 숙주인 미생물로부터 원하는 펩타이드 항생물질을 대량으로 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 융합 파트너를 이용하여 펩타이드를 발현시키는 경우, 단백질분해효소 또는 화학물질을 이용하여 융합 단백질로부터 펩타이드 항생물질을 절단, 분리할 수 있으며, 이를 위하여 예를 들어 Factor Xa나엔테로키나제(enterokinase)와 같은 단백질 분해 효소, 시안화브롬(CNBr) 또는 하이드록실아민과 같은 화학물질에 의해 절단되는 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA 서열을 융합 파트너와 펩타이드 항생물질 유전자 사이에 삽입할 수 있다.
예를 들어 CNBr에 의해 절단되는 자리를 부여하기 위하여, 융합 파트너의 3'말단에 리딩 프레임이 맞는 Met 코돈(ATG)을 함유하는 제한효소 자리 예를 들어, Afl III, Bsm I, BspH I, BspLU11 I, Nco I, Nde I, Nsi I, Ppu10 I, Sph I, Sty I 또는 이들의 아이소스키조머(isoschizomer) 자리를 삽입하여 제한효소로 절단하고, 이 제한효소와 양립하는(compatible) 말단을 생성하면서 리딩 프레임에 연결되는 제한효소 자리를 펩타이드 항생물질 유전자의 5' 말단에 삽입하여 그 효소로 절단하고, 융합 파트너와 펩타이드 항생물질 유전자를 연결시킬 수 있다.
또 다른 예로, 하이드록실아민에 의해 절단되는 자리를 부여하기 위하여, 융합 파트너 유전자와 펩타이드 항생물질 유전자 사이에 Asn-Gly을 코딩할 수 있는 DNA 서열을 삽입할 수 있다. 예를 들어, 두 유전자를 융합시킬 경우 융합 파트너 3' 말단에 리딩 프레임이 맞는 Asn 코돈을 함유하는 제한효소 자리 또는 이들의 아이소스키조머 자리를 삽입한 후 이 효소로 절단하고, 이 효소와 양립하는 말단 또는 블런트(blunt) 말단을 생성하면서 리딩 프레임이 연결되는 Gly 코돈을 포함하는 제한효소 자리를 펩타이드 항생물질 유전자의 5' 말단에 삽입하고 그 제한효소로 절단한 후 융합 파트너와 펩타이드 항생물질 유전자를 연결시켜 융합 파트너 유전자와 펩타이드 항생물질을 융합할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 구조물은 이 분야에서 통상적으로 이용되는 발현벡타, 예를 들어 플라즈미드, 바이러스 또는 기타 구조 유전자를 삽입(insertion) 또는 병합(incorporation)할 수 있는 비히클에 삽입되어 숙주 세포에 클로닝될 수 있다.
본 발명은 또한 목적 산물의 유전자 발현 수를 증가시킴과 동시에 목적 산물의 분리 및 정제가 용이한 다량체 및 그것의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 다량체는 다음과 같은 단위로 이루어진다;
a) 개시 코돈 Met을 발생시킬 수 있는 제 1 제한효소 자리 b) 구조 유전자 c) 라이보솜 결합 자리(RBS) 및 d) 제 1 제한효소 자리와 연결될 수 있으며 개시 코돈을 만들 수 있는 제 2 제한효소 자리. 여기서 구조 유전자의 종결 코돈과 RBS는 약 2bp까지 서로 겹치거나, 약 500 bp까지 떨어져 위치할 수 있다. RBS에서 개시 코돈을 발생시킬 수 있는 제 2 제한효소 자리 사이의 거리는 약 5 - 30 bp일 수 있다. 다량체의 3' 말단과 5' 말단은 각각 제 1 제한효소와 제 2 제한효소에 의해 절단된 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 다량체는 유전자 조작 분야에서 잘 알려진 기술을 이용하여 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며, 하나의 예로 아래의 방법에 따라 제조할 수 있다.
앞에 기재된 구성 단위를 제 1 제한효소와 제 2 제한효소로 절단한 후 절단된 구성단위를 연결하면 각 단위가 모두 같은 방향으로 연결된 다량체와, 역방향으로 연결된 단위를 하나 이상 포함하는 다량체들이 섞여있는 혼합물을 얻을 수 있다. 역방향으로 연결된 단위를 하나 이상 포함하는 다량체들은 연결 부위에 제 1제한효소 자리 또는 제 2 제한효소 자리가 다시 생성되므로, 다량체 혼합물을 다시 제 1 제한효소와 제 2 제한효소로 동시에 절단하고 예를 들어 아가로스 젤 전기영동 등에 의해 분리하면 각 단위가 한쪽 방향으로만 연결된 다량체만을 분리할 수 있다.
본 발명에 따른 다량체는 전사 단계의 융합 다량체(transcriptionally fused multimer)로, 이것은 반복되는 구조 유전자가 단일 mRNA로 전사되지만, 각 구조 유전자 발현물은 서로 연결되지 않은 형태로, 즉 여러 개의 단일 발현물로 번역(translation)되는 다량체를 의미한다.
종래에 제시된 번역 단계의 융합 다량체(translationally fused multimer)의 경우, 한 폴리펩타이드 내에 원하는 구조 유전자 발현물이 연결되어 존재하므로 이 폴리펩타이드로부터 원하는 활성 발현물을 얻기 위해서는 별도의 절단 과정이 요구된다. 또 발현물이 융합 단백질인 경우, 전사 단계의 융합 다량체로부터 얻은 발현물에 비해 같은 절단 단계를 이용하더라도 더 많은 양의 절단용 시약이 요구될 뿐만 아니라 절단 효율이 낮다는 문제가 있다. 이에 비해 본 발명의 다량체 유전자 구조물은 반복되는 구조 유전자를 발현시켰을 경우 별도의 절단 과정이 필요없거나, 융합 단백질과 같이 절단 과정이 필요한 경우라도 융합 펩타이드 몰당 절단되어야 하는 펩타이드 결합 수가 더 적어 소요되는 절단용 시약의 양을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 절단 효율이 증대되는 효과를 가져온다.
이와 같이 본 발명의 다량체는 숙주 내에서 유전자 발현 수를 증가시킬 수 있으며 목적 산물의 분리 및 정제에 유리할 뿐 아니라, 단량체인 경우에 비해 숙주에서 더욱 효과적으로 발현된다.
본 발명에 따른 유전자 구조물 다량체 및 그것의 제조방법은 펩타이드 또는 융합 펩타이드의 제조에 국한되는 것이 아니며, 효소, 호르몬, 항생물질 등 다양한 구조 유전자를 단일 형태 또는 융합된 형태로 미생물에서 발현시키는 데 적용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 유전자 구조물은 본 발명에 따른 전사단계의 융합 다량체 형태로 제조하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 유전자 구조물을 다량체 형태로 제조하는 경우, 앞에서 설명한 바와 같이 목적 산물의 분리 및 정제에 유리 할 뿐 아니라, 단량체인 경우에 비해 숙주 내에서 더욱 효과적으로 발현된다.
또한 본 발명은 비싼 IPTG대신 보다 저렴한 락토오스에 의해서도 외래 유전자의 발현이 효과적으로 유도될 수 있는 발현 벡타에 관한 것이다.
본 발명의 발현 벡타는 하이 카피 복제 오리진(high copy number replication origin), 강력한 전사 프로모터 및 구조 유전자로 이루어지며, lacIq유전자를 포함하지 않는다.
복제 오리진은 colE1 또는 p15A를 이용할 수 있다. 강력한 전사 프로모터의 예로는 tac, trc, trp, T7Φ10, PL프로모터, 기타 미생물의 유도 프로모터 또는 구성성(constitutive) 프로모터를 사용할 수 있다. 추가로, 벡타의 형질전환 여부를 판별하는 선택 마커 유전자를 포함할 수 있으며, 이러한 선택 마커 유전자로는 앰피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜 등과 같은 항생제 내성 유전자또는 숙주의 영양요구성을 보상할 수 있는 유전자가 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 발현 벡타는 IPTG 대신 락토오스를 첨가함으로써 효과적으로 유전자 발현을 유도할 수 있으며, 바람직하게는 IPTG와 락토오스를 함께 사용할 수 있다.
한 예로, 본 발명에 따른 발현 벡타에 구조 유전자를 삽입하여 얻은 플라즈미드를 숙주에 형질전환한 후 형질전환체를 카나마이신 50 - 300 ㎍/ml을 포함하는 배지에서 5 - 18 시간동안 30 - 37。C에서 전배양을 하고, 신선한 배지에 1/100 (v/v)의 전배양액을 접종한 후 30 - 37 ℃에서 배양한다. 발현을 유도하기 위해, IPTG 유도의 경우 세포 밀도가 OD6000.2 - 2 사이일 때 0.01 mM - 10 mM IPTG를 첨가하고, 락토오스 유도의 경우 OD6000.2 - 2 사이일 때 0.2 - 10% 락토오스를 첨가하거나 접종과 동시에 0.2 - 10% 락토오스를 첨가한다. IPTG와 락토오스를 함께 사용할 수도 있으며, 이러한 경우 IPTG의 사용량을 현저히 줄일 수 있다.
본 발명에 따른 발현 벡타는 추가로 전사 종결인자를 포함하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 발현 벡타에 의해 발현 산물을 물에 불용성인 상태로 얻을 수 있으므로, 예를 들어 숙주에 치명적인 산물을 생산하는데 특히 유용하다.
본 발명의 유전자 구조물을 삽입한 벡타를 본 발명이 속하는 분야에서 사용되는 방법에 의해 미생물에 형질전환시킬 수 있다. 예를 들어 E. coli와 같은 원핵세포에는 CaCl2방법에 의해 형질전환시킬 수 있으며, 일렉트로포레이션이나 마이크로인젝션과 같은 물리적 방법에 의해 수행할 수도 있다.
본 발명에서 숙주로는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어 E. coli 균주로 BL21(DE3), BLR(DE3), B834(DE3), AD494(DE3), JM109(DE3), HMS174(DE3), UT400(DE3), UT5600(DE3) 등을 사용할 수 있으며, 배양배지는 각 숙주 또는 얻어진 형질전환체의 특성에 따라 LB, M9, M9CA, R을 사용할 수 있고, 숙주에 따라 성장인자를 첨가한다.
LB 배지(박토-트립톤 10 g/l, 효모추출물 5 g/l, NaCl 10 g/l)
M9 배지(Na2PO4.7H2O 12.8 g/l, KH2PO4 3.0 g/l, NaCl 0.5 g/l, NH4Cl 1 g/1, 글루코오스 4 g/l, MgSO42 mM, CaCl20.1mM)
M9CA 배지(M9배지+ 0.2% 카사미노 산)
R 배지(Reisenberg 배지; KH2PO413.3 g/l,(NH4)2HPO44.0 g/l, 시트르산 0.17g/l, MgSO4.7H2O 0.22 g/l, 글루코오스 20 g/l, 미량원소 용액 10ml/l)
미량원소 용액 (ferric citrate 7.3 g/l, CoCl2.6H2O 0.5 g/l, MnCl2.4H2O 3.2 g/l, CuCl2.2H2O 0.3 g/l, H3BO30.7 g/l, NaMoO4.2H2O 1.68 g/l, 티아민 HCl 0.5g/l, EDTA 1 g/l)
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 펩타이드 항생물질의 유전자 제조
MSI-344 유전자를 E. coli에서 효과적으로 발현시키고, 유전자 조작을 용이하게 하기 위해 2 종류의 MSI-344 유전자를 PCR 방법으로 합성하였다(도 1). PCR을 위한 템플레이트는 한국 특허출원 97-29426에 기재된 pNH18a-MBP-MSI-78을 이용하였다. 표 1의 1번과 2번 프라이머를 이용하여 융합 펩타이드를 CNBr로 절단하여 MSI-344를 분리할 수 있도록 고안된 서열 (a)을 합성하였고, 표 1의 3번과 4번 프라이머를 이용하여 하이드록실아민으로 절단되도록 고안된 서열 (b)를 합성하였다.
각 MSI-344 유전자를 리딩 프레임에 맞게 발현 벡타에 서브클로닝하기 위하여 MSI-344 유전자 앞에 Nde I (서열(a))과 Sma I (서열(b)) 자리를 삽입하였고, MSI-344 유전자 뒤에는 종결 코돈 TAA와 TGA를 삽입하였다. 또한 전사 단계의 다량체를 제조하기 위해 종결 코돈과 1 베이스가 겹치는 라이보솜 결합 자리(ribosome binding site; RBS)와 Ase I 자리를 삽입하였다. 얻어진 2 가지 MSI-344 유전자를 pCR2.1 벡타 (Invitogen, USA)에 삽입하여, (a) 서열을 포함하는 벡타 pCRMSI, (b) 서열을 함유하는 벡타 pCRMSI'를 제조하였다.
화학적으로 합성한 올리고 누클레오타이드(표 1)를 어닐링하거나, 어닐링한후 PCR하여 도 1에 기재된 펩타이드 항생물질 유전자를 제조하였다. 아피다에신 I(Apidaecin I), 인돌리시딘(Indolicidin), 태키플레신 I(Tachyplesin I)의 경우, 아미노산 서열(Maloy and Kark, Peptide Science, 37 : 105, 1995)로부터 DNA 서열을 유추하고 E.coli에서의 발현율을 극대화할 수 있는 코돈으로 유전자를 화학적으로 합성하였다. 봄비닌(Bombinin), CPF1, 드로소신(Drosocin), 멜리틴(Melittin), HNP-I, PGQ, XPF의 경우, 일부분 (8-10 bp)이 서로 어닐링되도록 고안한 N-말단과 C-말단에 해당하는 올리고누클레오타이드를 합성하고, 어닐링후 PCR을 이용하여 완전한 유전자를 제조하였다. 각 펩타이드 항생물질의 특성을 표 2에 기재하였다.
[도 1 계속]
실시예 2. 융합 파트너의 제조
융합 파트너로 사용하기 위하여, PCR을 이용하여 E. coli와 Bacillus subtilis의 염색체로부터 도 2에 표시된 바와 같은 purF 유도체를 얻었다. 융합 파트너 F는 CNBr 절단용이며, F', F5, BF는 하이드록실아민 절단용으로 제조하였고, F3과 F4는 CNBr 절단용(F3(CB), F4a(CB))과 하이드록실아민 절단용(F3(HA), F4(HA), F4a(HA)) 2 가지로 제조하였다. 융합 파트너 F, F', F3(HA), F3(CB), F4(HA), F4a(HA), F4a(CB), F5, BF를 각각 서열 번호 1~9에 표시하였다.
1) purF 유도체 F
E. coli PurF 단백질의 N-말단에서부터 61 개의 아미노산을 코딩하고 있으며 (도 2), 5' 말단에 개시 코돈 Met을 포함하는 Nde I 자리를 삽입하였고, 3' 말단에는 CNBr에 의해 절단될 수 있는 Met 코돈을 포함하는 Nde I 자리를 삽입하였다.
2) purF 유도체 F'
내부의 하이드록실아민 자리를 제거하기 위하여 표1의 36번 프라이머와 site directed mutagensis 를 이용하여 49번째 글라이신 잔기 (GGG)를 알라닌(GCG, 도 2 밑줄 참조)으로 치환하고, 하이드록실아민 절단 자리가 생성되도록 PCR 을 이용하여 57번 알라닌 뒤에 아스파라긴을 코딩하는 ATT를 포함하는 Ssp I 자리를 첨가하였다.
3) purF 유도체 F3
F' 과 같이 49번째 잔기 글라이신을 알라닌으로 치환하였고, PCR을 이용하여 58번 아스파라긴을 알라닌으로 치환하고, 59번 히스티딘 뒤에 알라닌-아스파라긴을 부가하였다 (F3(HA)). CNBr용 F3 (F3(CB)의 경우 59번 히스티딘 뒤에 Met을 코딩함과 동시에 BspLU11 I 자리를 포함하는 DNA 서열을 부가하였다.
4) purF 유도체 F4
PurF 단백질의 N-말단에서부터 159개의 아미노산으로 구성되어 있다. 야생종(wild type) PurF 단백질에는 이 부분에 2개의 하이드록실아민 자리가 존재한다. 이를 제거하기 위해 표 1의 37번 프라이머와 site directed mutagenesis로 102번 아스파라긴 코든(AAC)을 루이신 코돈(도 2 의 및줄 친 CTC)으로 치환하여 F4(HA)를 제조하였고, 49번 글라이신을 알라닌, 102번 아스파라긴을 루이신으로 동시에 치환하여 F4a(HA)를 제조하였다. 하이드록실아민 절단용 (F4(HA), F4a(HA))인 경우 3' 말단에 아스파라긴 코돈을 포함하는 Ssp I 자리를 부여하였고, CNBr 절단용 (F4a(CB))인 경우 Met 코돈을 포함하는 BspLU11 I 자리를 부여하였다.
5) purF 유도체 F5
PurF 단백질의 60번 메티오닌에서 148번 아스파틴산까지와 C-말단의 Asn으로 총 89개의 아미노산이며, 3' 말단에 Ssp I 자리를 추가하였다.
6) purF 유도체 BF
BF는 B, subtilis의 purF 유도체이며, N-말단에서부터의 43 개의 아미노산과 3' 말단 에 Asn을 코딩하는 Ssp I 자리로 이루어진다.
실시예 3. 융합 펩타이드 유전자 구조물의 제조
실시예 1에서 제조된 펩타이드 유전자들 중 첫번째 아미노산이 글라이신인 유전자는 종류에 따라 하이드로록실아민 절단용 융합 파트너 F3(HA), F4(HA), F4a(HA), F5, BF에 결합시켰고, 그 외의 펩타이드 (HNP-I, 인돌리시딘, 태키프레신)는 CNBr 절단용 융합펩타이드인 F, F3(CB), F4a(CB)에 결합시켰다 (표3).
CNBr 절단 자리(Met) 또는 하이드록실아민 절단 자리(Asn-Gly)를 생성하면서 융합 파트너와 펩타이드 항생제 유전자를 융합하는 방법은 도 3 및 도 4와 같다.
CNBr용 융합 파트너 F과의 융합은, Nde I 자리를 이용하여 융합 파트너와 MSI-344 유전자를 융합하여 DNA 구조물 FM(도 3a)을 제조하였다. F3(CB) 또는 F4(CB)와 융합시키는 경우에는 F3(CB) 또는 F4(CB)의 3' 말단의 BspLU11 I 자리와, HNP-I의 경우 Nco I 자리를 이용하여 융합시켰고, 인돌리시딘, 태키플레신의 경우는 5' 말단을 BspLU11 I 자리와 양립되도록 유전자를 화학적으로 합성하여 융합시켰다.
하이드록실아민용 융합 파트너(F', F3(HA), F4(HA), F4a(HA), F5, BF)와의 융합은 융합 파트너를 Ssp I으로 절단하고 MSI-344를 Sma I으로 절단한 후 두 DNA 단편을 연결하여 하이드록실아민에 의해 절단되는 Asn-Gly 자리가 생성되도록 융합시켰다. 아피다에신, 봄비닌, CPF I, 드로소닌, 멜리틴, PGQ, XPF의 경우 유전자를 제조할 때 5' 말단을 블런트 말단으로 제조하였기 때문에 별도의 제한 효소를 이용하지 않고 Ssp I으로 절단된 융합 파트너와 융합시킬 수 있었다.
실시예 4. 전사 단계의 융합 다량체 제조
Met을 코딩하는 Nde I 자리, 구조 유전자, RBS, Nde I과 연결되면서 Met을 다시 생성시킬 수 있는 Ase I 자리로 구성되는, 다량체를 제조할 수 있는 단위를 만들었다. 구조유전자로 각각 F4a(HA)-MSI344 융합 유전자('F4Ma')와 F5-MSI344 융합 유전자('F5M')를 사용하였다. 제조된 단위를 Nde I과 Ase I으로 절단하고, 절단된 단위를 다시 연결하였다. 얻어진 DNA 단편을 다시 Nde I과 Ase I으로 절단하고 아가로스 젤 전기영동하여, 다량체를 분리하였다. 이와 같은 방법으로 F4Ma의 모노머(F4Ma), 다이머(F4MaX2), 테트라머(F4MaX4)를 얻었고, F5M의 모노머(F5M), 다이머(F5MX2), 테트라머(F5MX4)를 얻었다(도 5).
실시예 5. 발현 벡타
외래 유전자를 E. coli에서 대량으로 발현시키기 위해 T7Φ10 프로모터와 하이 카피 복제 오리진(pUC 계열의 colEI), 카나마이신 내성 유전자를 이용하여 2 가지 발현 벡타 pGNX2와 pT7K2.1을 제조하였다.
플라즈미드 pGNX2를 만들기 위하여, 먼저 시판되는 pUC19의 bla 유전자(앰피실린 내성 유전자: AmpR)를 카나마이신 내성 유전자(KanR)로 치환하였다. 이를 위하여, pUC19을 Ssp I과 Dra I으로 절단하여 1748 bp의 DNA 단편을 분리하고, E. coli의 Tn5를 템플레이트로 이용하고 39번과 40번 프라이머(표 1)를 이용하여 KanR유전자를 PCR로 증폭하였다. 이 DNA를 BamH I과 Hind III로 절단하고 클레노우(Klenow)효소로 필인(fill-in)한 후, Ssp I과 Dra I으로 절단한 pUC19과 연결하여 pUCK2를 제조하였다. 이 벡타를 Nde I로 절단하고 클레노우 효소로 fill-in한 후 다시 연결하여 pUCK2ΔNdeI을 얻었다, 이 벡타의 Ase I 과 BamH I 자리에, pT7-7(USB, USA)을 Ase I과 Hind I으로 절단해서 생성된 T7Φ10 프로모터와 RBS를 포함하는 DNA 단편을 삽입하여 최종 플라즈미드 pGNX2를 제조하였다. pGNX2는 T7Φ10프로모터와 카나마아신 내성 유전자 (KanR)가 같은 방향으로 구성되어 있다(도 6).
플라즈미드 pT7K2.1를 만들기 위하여, 먼저 pT7-7의 bla 유전자를 KanR유전자로 치환하기 위해 Ssp I과 Bgl I으로 절단하고, T4 DNA폴리머레이즈로 Bgl I 자리를 블런트 말단으로 만들었다. KanR유전자는 pGNX2와 동일 방법으로 제조하고 두 DNA를 연결하여 pT7K2를 제조하였다. 이 벡타에서 Ase I 자리를 제거하여 최종 플라즈미드 p7K2.1를 제조하였다(도 7). pGNX2로 형질전환시킨 E. coli HMS174(DE3)를 대한민국 대전광역시 유성구 어은동에 소재하는 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 1998년 5월 29일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC0486BP를 받았다.
플라즈미드 pGNK3를 만들기 위하여, 먼저 pGNX2F4M을BspHI으로 부분절단하고, 하나의BspH I자리만 잘린 단편을 분리하여BamH I으로 절단하였다. T7 및 rrnBT1T2 터미네이터를 포함하는 단편을 만들기 위하여 pET11a로부터BamH I과EcoR V로 절단한 132 bp단편을 분리하고, 이를 ptrc99a를Hinc II와BspH I으로 절단하여 분리한 488 bp단편과 연결하였다. 연결된 단편들을BamH I과BspH I으로 절단하여 이를 앞에서 만든 벡터와 연결하여 플라즈미드 pGNX3F4M을 제조하였다 (도 8).
플리즈미드 pGNX4를 만들기 위하여, pETACc를XbaI과AlwN I으로 절단하여 3502 bp의 단편을 분리하고, 이를 pGNX3F4M을XbaI과AlwN I으로 절단하여 분리된 2405 bp의 단편과 연결하여 pGNX4F4M을 제조하였다 (도 9).
플라즈미드 pGNX5를 만들기 위하여, pGNX3F4M을AseI으로 부분 절단하고,XbaI으로 절단한 후 클레노우 단편을 이용하여 블런트 말단으로 만든 벡터와 pCR- TrpPO를EcoRI과NdeI으로 절단하여 클레노우 단편으로 블런트 말단으로 만든 단편을 연결하여 pGNX5F4M을 제조하였다(도 11).
실시예 6. 펩타이드 항생물질의 생산
펩타이드 항생물질인 MSI-344를 융합 파트너인 F3, F4, F4a, F5 및 BF에 각각 융합시켜 얻은 DNA 구조물을 각각 pGNX2의 Nde I과 BamH I 자리와 pT7K2.1의 Nde I과 BamH I 자리에 클로닝하였다. 융합 파트너로 F(purF 전체)를 사용한 경우는 pET24a (Novagen, USA)의 Nde I과 Xho I 자리에 클로닝하였다. 다량체인 경우pGNX2과 pT7K2.1의 Nde I 자리에 클로닝하였다. 아피다에신 I, 인돌리시딘, 태키플레신 I, 봄비닌, CPF1, 드로소신, 멜리틴, HNP-I, PGQ, XPF 유전자는 융합 파트너 F4와 연결하여 pGNX2의 Nde I과 EcoR I 자리에 클로닝하였다. F3 를 이용한 경우 pRSETc 의 BamH I 과 EcoR I 자리를 이용하여 클로닝하였다(표 3 참조).
표 3의 플라즈미드 2, 3, 4, 5, 6, 7을 CaCl2방법으로 E. coli HMS174(DE3)에 각각 형질전환하였다. 배지는 카사미노 산을 첨가한 R 배지를 사용하였고, 배양액이 OD6000.2∼0.4 사이일 때 각각 2% 락토오스와 2mM IPTG를 첨가하여 펩타이드 발현을 유도하였다. 발현 정도는 SDS PAGE를 통해 얻은 결과를 덴시토미터로 스캐닝하여 총 세포 단백질 중 융합 펩타이드가 차지하는 %로 정량하였다(도 11). 도 11에서 M은 분자량 표준 마커를 나타내며, 레인 1∼6은 각각 표 3의 플라즈미드 2, 3, 4, 5, 6, 7으로 형질전환시킨 후 락토오스로 유도한 것이고, 레인 7∼12는 각각 표 3의 플라즈미드 2, 3, 4, 5, 6, 7으로 형질전환시킨 후 IPTG로 유도한 것이다. 레인 13과 14는 표 3의 플라즈미드 43(E. coli purF; EF)로 형질전환시킨 후 각각 락토오스와 IPTG로 유도한 것이다.
동일한 방법으로 표 3의 플라즈미드 44, 45, 46를 E. coli HMS174(DE3)에 각각 형질전환시키고 락토오스로 유도하여 MSI-344를 발현시켰다(도 12). 전사종결인자를 가지는 플라즈미드에서 발현 효율이 더 높음을 알 수 있다.
표 3의 4번 플라즈미드로 형질전환시킨 HMS174(DE3)에서 락토오스로 융합 펩타이드의 발현을 유도한 후 9 시간 후에 배양액 상태에서 세포를 파쇄한 후, 원심분리하여 침전물을 수확하였다. 이 침전물을 9 M 우레아, 20mM 포타슘 포스페이트(pH 8.5), 5 mM EDTA 용액에서 상온에서 2 시간 동안 방치하여 녹인 후 SP 세파로오스 FF (Pharmacia, Sweden) 컬럼에 로딩한 후, 0.3∼1M NaCl로 용출하여 F4Ma를 정제하였다. 정제된 F4Ma를 0.5∼2 M 하이드록실아민, 0.4 M 포타슘 카르보네이트 (pH 7.5∼9.5)로 45∼55℃에서 반응시켜 융합 파트너로부터 MSI-344를 절단하였다. 이 반응액을 탈염하고 다시 SP 세파로스 FF (Pharmacia, Sweden) 컬럼에 로딩한 후 0.4-1M NaCl을 이용하여 MSI-344를 용출시켰다. 정제된 MSI-344는 HPLC, MALDI, 아미노산 서열 분석을 통하여 MSI-344임을 확인하였다.
실시예 7
표 3에 기재된 다른 플라즈미드를 CaCl2방법에 따라 E. coli HMS174(DE3)에 형질전환하였다. 배지는 카사미노산을 첨가한 R 배지를 사용하였고, 배양액이 OD6000.4∼0.6 사이일 때 2% 락토오스를 첨가하여 펩타이드 발현을 유도하였다. 발현 정도는 SDS PAGE를 통해 얻은 결과를 덴시토미터로 스캐닝하여 총 세포 단백질 중 융합 펩타이드가 차지하는 %로 정량하였다. 각 펩타이드 항생물질을 발현시킨 결과를 도 13a, 도 13b 및 표 3에 나타낸다. 도 13a에서 레인 1∼6은 각각 표 3의 플라즈미드 10, 12, 15, 20, 21, 23 을 나타내고, 도 13b에서 레인 1∼9은 각각 표 3의 플라즈미드 11, 13, 14, 16, 22, 17, 18, 24, 19를 나타낸다.
도 14a∼14d는 표 3의 플라즈미드 25∼42의 발현 결과이다. 부포린IIbx2, 부포린 IIx4는 각각 부포린 IIb의 다이머와 테트라머이며, 실시예 4에 기재된 방법으로 제조하였다. 표 3의 해당 플라즈미드 및 시스템과 발현결과를 괄호에 표시하였다.
도 14a: 1(25)
도 14b: 1(26), 2(31), 3(36)
도 14c: 1(27), 2(32), 3(37), 4(28), 5(33), 6(38), 7(29), 8(34), 9(39), 10(30), 11(35), 12(40)
도 14d: 1(41), 2(42), 3(43)
[표 3 계속]
[표 3 계속]
실시예 8
실시예 4에서 제조된 유전자 구조물, F4Ma의 모노머(F4Ma), 다이머(F4MaX2),테트라머(F4MaX4), F5M의 모노머(F5M), 다이머(F5MX2), 테트라머(F5MX4)를 각각 pGNX2의 Nde I 자리와 pT7K2.1의 Nde I 자리에 클로닝한 후 E. coli HMS174(DE3)에 형질전환하였다. 실시예 6의 방법에 따라 융합 단백질을 발현시키고, 발현 정도는 SDS PAGE를 통해 얻은 결과를 덴시토미터로 스캐닝하여 총 세포 단백질 중 융합 펩타이드가 차지하는 %로 정량하었다. 도 15에서 pT7K2.1 항의 1번 레인은 F4Ma, 2번레인은 F4MaX2, 3번 레인은 F4MaX4, 4번 레인은 F5M, 5번 레인은 F5MX2, 6번 레인은 F5MX4을, pGNX2 항의 1번 레인은 F4Ma, 2번 레인은 F4MaX2, 3번 레인은 F5M, 4번 레인은 F5MX2를 나타낸다. 도 15에서 알 수 있듯이, F4M의 경우 테트라머로 발현시켰을 때 발현 정도가 30%에서 40%로 증가하였으며, F5M의 테트라머는 모노머와 비교하여 발현 정도가 20%에서 25%로 증가하였다.
본 발명에 의해, 미생물에서 펩타이드 항생물질을 보다 적은 비용으로 효과적으로 대량 생산할 수 있으며, 분리 및 정제가 용이하다.

Claims (8)

  1. purF 단백질의 전부, 일부 또는 이들의 유도체를 코딩하는 제1유전자 서열, 화학적 또는 효소적 처리에 의해 절단되는 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA 서열 및 펩타이드 항생물질을 코딩하는 제2유전자 서열로 이루어지는 유전자 구조물로서, 상기 유도체는 상기 PurF 단백질의 전부 또는 일부가 상기 화학적 또는 효소적 처리에 의해 절단되지 않도록 PurF 단백질 서열의 일부가 치환된 아미노산 서열인 유전자 구조물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 purF 단백질이 미생물에서 유래된 유전자 구조물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. purF 단백질의 전부, 일부 또는 이들의 유도체를 코딩하는 제1유전자 서열, 화학적 또는 효소적 처리에 의해 절단되는 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA 서열 및 펩타이드 항생물질을 코딩하는 제2유전자 서열로 이루어지는 유전자 구조물로서, 상기 유도체는 상기 PurF 단백질의 전부 또는 일부가 상기 화학적 또는 효소적 처리에 의해 절단되지 않도록 PurF 단백질 서열의 일부가 치환된 아미노산 서열인 유전자 구조물을 포함하는 벡타를 제조하고;
    박테리아 숙주세포를 상기 벡타로 형질전환시키고;
    상기 형질전환된 세포를 상기 유전자 구조물이 발현되도록 배양하고;
    상기 발현된 산물을 회수하는 것으로 이루어지는, 펩타이드 항생물질을 생산하는 방법.
  8. 삭제
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