JP3523202B2 - 抗微生物ペプチドの大量生産方法並びにそのためのｄｎａ構築体及び発現系 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は組換ＤＮＡ技術に関連する。本発
明は更に微生物並びにＤＮＡ構築体及びベクター系から
の抗微生物物質の大量生産に関する。生物学的に活性な
ペプチド（以降、抗微生物ペプチド）は耐性となりにく
く、なぜなら抗微生物ペプチドは、耐性となる深刻な問
題を有する慣用の抗生物質のそれとは全体的に異なるメ
カニズムにより活性を示すからである。従って、抗微生
物ペプチドは医薬及び食品産業の分野において高い産業
上の利用性を有する。

【０００２】しかしながら、抗微生物ペプチドの産業的
用途の主たる障害は抗微生物ペプチドの経済的大量生産
の困難さにある。例えば、化学合成による抗微生物ペプ
チドの生産は経済的ではない。また、微生物を利用する
遺伝子工学により抗微生物ペプチドを生産する試みもな
されているが、この場合、抗微生物ペプチドの発現レベ
ルは極めて低い。

【０００３】米国特許第５，２０６，１５４号はセクロ
ピンの殺菌効果を抑制できるポリペプチド遺伝子及びこ
のポリペプチド遺伝子に融合したセクロピン遺伝子を含
んで成るＤＮＡ構築体を提供する。この特許の中で開示
されているかかるポリペプチドの一例はａｒａＢ遺伝子
である。

【０００４】米国特許第５，５９３，８６６号は陽イオ
ン性抗微生物ペプチドの微生物生産を提供し、それにお
いては陽イオン性ペプチドは細菌プロテアーゼによる分
解を回避するために陰イオン性ペプチドとの融合体とし
て発現させている。

【０００５】発明の開示 本発明は抗微生物ペプチドを大量生産するためのＤＮＡ
構築体を提供する。本発明は更に微生物から抗微生物ペ
プチドを効率的に生産及び回収できるＤＮＡ構築体を提
供する。更に本発明は所望のペプチドの発現、分離及び
精製の効率を高めることのできる遺伝子多量体、並びに
かかる構築体の構築方法を提供する。

【０００６】更に、本発明は微生物から抗微生物ペプチ
ドを大量生産するための発現ベクターを提供する。

【０００７】更に、本発明は微生物から抗微生物ペプチ
ドを大量生産する方法を提供する。

【０００８】発明の詳細な説明 本発明はＥ．コリ（E. coli ）又はその他の原核細胞に
おいて効率的に抗微生物ペプチドを大量生産するための
ＤＮＡ構築体に関する。

【０００９】微生物からの抗微生物ペプチドの大量生産
のための必須条件の一つは微生物に対する抗微生物ペプ
チドの毒性を効率的に中和することにある。従って、本
発明はｐｕｒＦ遺伝子（グルタミンピロホスホリボシル
ピロリン酸アミドトランスフェラーゼ；Genebank No.:
X12423)(Tso ら、J.Bio.Chem., 257: 3525, 1982, Maka
roffら、J.Bio.Chem., 258: 10586, 1983 ）の全遺伝
子、その一部又はその誘導体が抗微生物ペプチドをコー
ドする遺伝子に対して融合パートナーとして融合されて
いるＤＮＡ構築体を提供する。

【００１０】本発明に係るＤＮＡ構築体の中で融合パー
トナーとして利用するｐｕｒＦ遺伝子の誘導体は、宿主
細胞を殺すことなくＥ．コリにおいて、ｐｕｒＦ誘導体
との融合ポリペプチドとしての抗微生物ペプチドの大量
生産を可能にする。

【００１１】従って、強力発現系を利用して宿主微生物
から所望の抗微生物ペプチドを大量生産することが可能
であり、なぜならそれらは宿主細胞に対して致死的でな
いからである。ペプチドを発現させるために本発明に係
る融合パートナーを利用する場合、プロテアーゼ又はそ
の他の化学薬品を利用することにより融合タンパク質か
ら抗微生物ペプチドを切断分離することが可能である。
これを達成するため、例えば融合パートナーと抗微生物
ペプチド遺伝子との間にプロテアーゼ、例えばＸａ因子
もしくはエンテロキナーゼ、又は化学薬品、例えばＣＮ
Ｂｒもしくはヒドロキシルアミンのための切断部位をコ
ードするＤＮＡ配列を挿入することが可能である。

【００１２】例えば、ＣＮＢｒ切断部位を供するには、
適正なリーディングフレームでＭｅｔコドン（ＡＴＧ）
を含む制限酵素部位、例えばＡｆｌIII ，ＢｓｍＩ，Ｂ
ｓｐＨＩ，ＢｓｐＬＵ１１Ｉ，ＮｃｏＩ，ＮｄｅＩ，Ｎ
ｓｉＩ，Ｐｐｕ１０Ｉ，ＳｐｈＩ，ＳｔｙＩ又はそのア
イソシゾマーを融合パートナーの３′末端に挿入するこ
とができる。融合パートナーと抗微生物ペプチドをコー
ドする遺伝子とのイン・フレーム融合は、この制限酵素
部位を抗微生物ペプチドをコードする遺伝子の５′末端
に挿入し、融合パートナーの酵素部位に対して適合性の
末端を供することで可能となる。

【００１３】融合パートナーと抗微生物ペプチド遺伝子
との間にＡｓｎ−ＧｌｙをコードするＤＮＡ配列を挿入
することも可能である。例えば、２本の遺伝子は下記の
方法により融合させることができる。Ａｓｎコドンを含
む制限酵素又はアイソシゾマー部位を融合パートナーの
３′末端に適正なリーディングフレームで挿入した後、
この融合パートナーを酵素により切断する。抗微生物ペ
プチドをコードする遺伝子の５′末端において、融合パ
ートナーの対応の部位に適合性の末端又は平滑末端を供
する適正なリーディングフレームでＧｌｙコドンを含む
制限酵素部位を挿入し、そして対応の酵素で切断する。
２本の切断したＤＮＡフラグメントをつなげて融合遺伝
子を作ることができうる。本発明に係る遺伝子構築体
は、構造遺伝子を挿入もしくは組込むことのできる当該
分野において汎用されているあらゆる種類の発現ベクタ
ー、例えばプラスミド、ウィルス、又はその他のビヒク
ルの中にクローニングすることにより宿主細胞に挿入す
ることができうる。

【００１４】本発明は必要とされる生成物の遺伝子のコ
ピー数を増加させることにより発現レベルを高めること
ができ、そして簡単に分離精製できる多量体、並びにそ
の製造方法に関する。

【００１５】本発明に係る多量体は下記の単位から構築
される。１）開始コドンを供することのできる第一制限
酵素部位；２）構造遺伝子；３）リボソーム結合部位
（ＲＢＳ）；及び４）前記第一制限酵素により供される
付着末端にイン・フレーム融合できる付着末端を供する
ことができ、且つ開始コドンを供することができる第二
制限酵素部位。

【００１６】ここで、構造遺伝子の停止コドン及びＲＢ
Ｓは約２bpで重複しているか、又は５００bpまで離れて
いてもよい。ＲＢＳと開始コドンを供することのできる
第二制限酵素部位との距離は約５〜３０bpであってよ
い。当該多量体の３′及び５′末端はそれぞれ第一又は
第二制限酵素により切断されうる。

【００１７】本発明に係る多量体は遺伝子工学分野にお
いて公知の様々な技術により調製されうる。かかる調製
方法の例を以下に紹介する。

【００１８】第一及び第二制限酵素により上記の遺伝子
の単位を切断した後、切断した単位をつなげ、同じ方向
をもつ各単位を含む多量体と、複数の単位が逆方向とな
っている多量体とを含む混合物を作る。複数の単位が逆
方向となっている多量体はその接続部位において再生さ
れた第一又は第二制限酵素部位を有するため、この多量
体混合物を第一及び第二制限酵素部位により同時に切断
し、そして例えばアガロースゲル電気泳動により分離し
て、同一方向のみの単位を有する多量体を分離すること
ができうる。本発明に係る多量体は転写式融合多量体で
ある。このことは、反復遺伝子が一本のｍＲＮＡへと転
写されるが、その遺伝子生成物はつながっていないこと
を意味する。換言すれば、この多量体は大量のコピー数
の一の種類の生成物へと翻訳される。慣用の翻訳融合多
量体の場合、所望の生成物は一本のポリヌクレオチドの
中でコンカテマーとして存在し、そして追加の切断プロ
セスが所望の活性生成物を得るために必要とされる。発
現生成物が融合タンパク質の場合、転写融合多量体と比
べ、低い効率性しかもたないより多くの試薬が切断のた
めに必要とされる。翻訳融合多量体と比べ、本発明の発
現多量体は追加の切断プロセスを必要とせず、又は融合
タンパク質の如き切断プロセスを必要とする場合、切断
に要する試薬の量は少なくすることができ、なぜなら融
合ペプチド１モル当りの切断すべきペプチド結合の数は
翻訳融合多量体よりも比較的少ないからである。

【００１９】本発明の多量体は宿主細胞内の遺伝子発現
率を高めることができ、所望の生成物の切断及び精製に
おいて有利であり、そして宿主内において単量体と比べ
て効率的に発現される。この多量体及びその製造方法は
ペプチド又は融合ペプチドの調製に制約されない。これ
は微生物の中で酵素、ホルモン及び抗微生物ポリペプチ
ドをコードする非融合又は融合遺伝子の発現に幅広く利
用できる。

【００２０】従って、本発明のＤＮＡ構築体は転写融合
式の多量体で生産することが所望される。転写融合式多
量体の本発明のＤＮＡ構築体の調製において、生成物を
切断及び精製することが有利であり、そしてこの多量体
は単量体よりも効率的に宿主の中で発現しうる。

【００２１】本発明は更にＩＰＴＧよりも経済的なラク
トースにより外来遺伝子の発現を誘導し得る発現ベクタ
ーに関する。本発明に係る発現ベクターは高コピー数の
複製起点、強力プロモーター及び構造遺伝子から成り、
そしてｌａｃＩ^q 遺伝子は含まない。

【００２２】複製起点は本発明ではｃｏｌＥ１又はｐ１
５Ａであってよい。強力プロモーターの例には、ｔａ
ｃ，ｔｒｃ，ｔｒｐ，Ｔ７Φ１０，Ｐ_L 、微生物におけ
るその他の誘導性又は構成プロモーターが挙げられる。
更に、当該ベクターの形質転換体を選択するために利用
されうる選択マーカー遺伝子を含ませてよい。これらの
マーカー遺伝子には、アンピシリン、カナマイシン、テ
トラサイクリン及びクロラムフェニコールの如き抗生物
質に対する抗生物質耐性遺伝子、又は宿主の栄養要求性
を補完する遺伝子が挙げられる。本発明に係る発現ベク
ターを利用する遺伝子発現はＩＰＴＧの代わりにラクト
ースを添加することにより、好ましくはＩＰＴＧ及びラ
クトースを同時に添加することにより効率的に誘導でき
る。

【００２３】例えば、構造遺伝子を含むプラスミドを宿
主細胞に形質転換せしめた後、形質転換体を５０〜３０
０μｇ／mlのカナマイシンを含む培養培地の中で３０〜
３７℃で５〜１８時間一次培養する。その後、それらを
新鮮培地の中で１％（ｖ／ｖ）に希釈し、そして３０〜
３７℃で培養する。発現を誘導するため、ＩＰＴＧ誘導
の場合ＯＤ₆₀₀ が０．２〜２に達したら０．０１mM〜１
０mMのＩＰＴＧを加え、又はラクトース誘導の場合０．
２〜２％のラクトースをＯＤ₆₀₀ が０．２〜２に達した
ときもしくは接種時に加える。ＩＰＴＧ及びラクトース
は有意に少ない量のＩＰＴＧで一緒に利用してよい。更
に、本発明に係る発現ベクターの中に転写ターミネータ
ーを含ませることが所望される。

【００２４】発現生成物は本発明の発現ベクターを利用
して封入体として得ることが可能である。この性質は宿
主に対して致死的な生成物の生産において有用である。

【００２５】本発明の構造遺伝子を含むベクターは本発
明の分野において利用する慣用の方法を利用することに
より微生物へと形質転換することができうる。例えば、
この形質転換はＣａＣｌ₂ 法又は物理的な方法、例えば
エクトロポレーションもしくはマイクロジェクションに
より原核細胞、例えばＥ．コリに施すことができうる。
例えば、Ｅ．コリ株はＢＬ２１（ＤＥ３），ＢＬＲ（Ｄ
Ｅ３），Ｂ８３４（ＤＥ３），ＡＤ４９４（ＤＥ３），
ＪＭ１０９（ＤＥ３），ＨＭＳ１７４（ＤＥ３），ＵＴ
４００（ＤＥ３）及びＵＴ５６００（ＤＥ３）から選ば
れうる。培養培地は宿主又は形質転換細胞の特徴に従っ
てＬＢ，Ｍ９，Ｍ９ＣＡ及びＲから選ばれうる。成長因
子を宿主の要求に応じて培地に加えてよい。

【００２６】ＬＢ培地（バクト−トリプトン１０ｇ／
ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ） Ｍ９培地（Ｎａ₂ ＰＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ １２．８ｇ／ｌ、
ＫＨ₂ ＰＯ₄ ３．０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ０．５ｇ／
ｌ、ＮＨ₄ Ｃｌ １ｇ／ｌ、グルコース４ｇ／ｌ、Ｍｇ
ＳＯ₄ ２mM、ＣａＣｌ₂ ０．１mM） Ｍ９ＣＡ培地（Ｍ９培地＋０．２％カスアミノ酸） Ｒ培地（Reisenberg培地；ＫＨ₂ ＰＯ₄ １３．３ｇ／
ｌ、（ＮＨ₄)₂ ＰＯ₄４．０ｇ／ｌ、クエン酸０．１７
ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．２２ｇ／ｌ、グル
コース２０ｇ／ｌ、微量元素溶液１０ml／ｌ） 微量元素溶液（クエン酸第二鉄７．３ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ
₂ ・６Ｈ₂ Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＭｎＣｌ₂ ・４Ｈ₂ Ｏ
３．２ｇ／ｌ、ＣｕＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ ０．３ｇ／ｌ、
Ｈ₃ ＢＯ₃ ０．７ｇ／ｌ、ＮａＭｏＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ
１．６８ｇ／ｌ、チアミンＨＣｌ ０．５ｇ／ｌ、ＥＤ
ＴＡ １ｇ／ｌ）

【００２７】本発明を下記の実施例により更に詳しく説
明する。これらの実施例は単なる例示であり、本発明を
限定するものではない。

【００２８】実施例１：抗微生物ペプチドをコードする
遺伝子の調製 ２種類のＭＳＩ−３４４遺伝子をＰＣＲ法により合成
し、Ｅ．コリにおいてＭＳＩ−３４４遺伝子を効率的に
発現させ、そして遺伝子操作をし易くした（図１）。Ｐ
ＣＲのための鋳型は韓国特許出願第９７−２９４２６号
に記載のｐＮＨ１８ａ−ＭＢＰ−ＭＳＩ−７８とした。
配列（ａ）を表１のプライマーNo. １及びNo. ２を利用
して合成し、それは融合ペプチドからＣＮＢｒ切断によ
りＭＳＩ−３４４を分離するためにデザインしたもので
あり、そして配列（ｂ）は表１のプライマーNo. ３及び
４を利用して合成し、それはヒドロキシルアミンによる
切断のためにデザインしたものである。適正なリーディ
ングフレームでＭＳＩ−３４４遺伝子を発現ベクターの
中にサブクローニングするため、Ｎｄｅ１（配列
（ａ））及びＳｍａＩ（配列（ｂ））部位をＭＳＩ−３
４４遺伝子の前方に挿入し、そして停止コドンＴＡＡ及
びＴＧＡをＭＳＩ−３４４遺伝子の後方に挿入した。転
写多量体を構築するため、更に停止コドンと一塩基対重
複するリボソーム結合部位及びＡｓｅＩ部位も挿入し
た。これら２つのＭＳＩ−３４４遺伝子をｐＣＲ２．１
ベクター（Invitrogen, USA ）にクローニングして配列
（ａ）を含むベクターｐＣＲＭＳＩ及び配列（ｂ）を含
むベクターｐＣＲＭＳＩ′を調製した。

【００２９】図１における抗微生物ペプチド遺伝子を化
学合成オリゴヌクレオチド（表１）のアニーリング又は
アニーリング後のＰＣＲの実施により調製した。アピダ
エシンＩ、インドリシジン及びタキプレシンＩの場合、
ＤＮＡ配列はペプチドのアミノ酸配列を基準とし（Malo
y and Kark, Peptide Science, 37: 105, 1995）、そし
て当該遺伝子はＥ．コリ内での発現レベルを最大にしう
るコドンを利用して化学合成した。ボンビニン、ＣＰＦ
１、ドロソシン、メリチン、ＨＮＰ−Ｉ，ＰＧＱ及びＸ
ＰＦの場合、８〜１０bp互いと重複し合うようにアニー
リングするようにデザインしたＮ−及びＣ−末端オリゴ
ヌクレオチドを合成し、そしてペプチド遺伝子は２本の
オリゴヌクレオチドをアニーリングさせた後にＰＣＲに
より合成した。各微生物ペプチドの特徴を表２に示す。

【００３０】

【表１】

【００３１】

【表２】

【００３２】

【表３】

【００３３】実施例２：融合パートナーの調製 融合パートナーとして利用するため、図２に示すｐｕｒ
Ｆ誘導体をＰＣＲを利用してＥ．コリ及びバチルス・ス
ブチリス（Bacillus subtilis ）の染色体から得た。融
合パートナーＦはＣＮＢｒ切断のために調製し、そして
Ｆ′，Ｆ５及びＢＦはヒドロキシルアミン切断のために
調製した。Ｆ３及びＦ４は２通りの異なる形態として調
製した。一方はＣＮＢｒ切断用（Ｆ３（ＣＢ），Ｆ４
（ＣＢ））、そして他方はヒドロキシルアミン切断用
（Ｆ３（ＨＡ），Ｆ４（ＨＡ），Ｆ４ａ（ＨＡ））とし
た。融合パートナーＦ，Ｆ′，Ｆ３（ＨＡ），Ｆ３（Ｃ
Ｂ），Ｆ４（ＨＡ），Ｆ４ａ（ＨＡ），Ｆ４ａ（Ｃ
Ｂ），Ｆ５，ＢＦは配列No. １〜９にそれぞれ示す。

【００３４】１）ｐｕｒＦ誘導体Ｆ 当該誘導体はＥ．コリｐｕｒＦタンパク質のＮ末端から
６１個のアミノ酸をコードする（図２）。開始コドンＭ
ｅｔを含むＮｄｅＩ部位を５′末端に挿入し、そしてＣ
ＮＢｒのための切断部位をコードするＭｅｔコドンを含
むＮｄｅＩ部位は３′末端に挿入した。

【００３５】２）ｐｕｒＦ誘導体Ｆ′ 内部ヒドロキシルアミン切断部位を除去するため、４９
番目のグリシン残基（ＧＧＧ）を表１のプライマー＃３
６を利用する部位特異的突然変異誘発によりアラニンで
置換し（ＧＣＧ、図２参照）、そしてアスパラギンをコ
ードするＡＡＴ含有ＳｓｐＩ部位をＰＣＲによりアラニ
ンコドン（５７番目）の後に付加してヒドロキシルアミ
ン切断部位を形成した。

【００３６】３）ｐｕｒＦ誘導体Ｆ３ ４９番目のグリシン残基をＦ′と同じようにアラニンで
置換した。５８番目の残基のアスパラギンをアラニンで
置換し、そしてアラニン−アスパラギンを５９番目のヒ
スチジンの後に付加した（Ｆ３（ＨＡ））。ＣＮＢｒ切
断用のＦ３の場合（Ｆ３（ＣＢ））、Ｍｅｔをコード
し、且つＢｓｐＬＵ１１Ｉ部位を含むＤＮＡ配列を５９
番目の残基のヒスチジンの後に付加した。

【００３７】４）ＰｕｒＦ誘導体Ｆ４ この誘導体はｐｕｒＦタンパク質のＮ末端から１５９個
のアミノ酸残基から成る。野生型ｐｕｒＦタンパク質の
中には２個のヒドロキシルアミン部位が存在する。これ
らの部位を除くため、１０２番目のアスパラギンコドン
（ＡＡＣ）をプライマー＃３７（表１）による部位特異
的突然変異誘発によりロイシンコドン（ＣＴＣ、表２に
下線を付す）で置換し、Ｆ４（ＨＡ）を形成した。Ｆ４
ａ（ＨＡ）は４９番目のグリシンのアラニンによる、及
び１０２番目のアスパラギンのロイシンによる二重置換
により調製した。ヒドロキシルアミン切断のためのＦ４
（ＨＡ）及びＦ４ａ（ＨＡ）の場合、アスパラギンコド
ンを含むＳｓｐＩ部位を３′末端に付加した。ＣＮＢｒ
切断のためのＦ４ａ（ＣＢ）の場合、Ｍｅｔコドンを含
むＢｓｐＬＵ１１Ｉ部位を３′末端に付加した。

【００３８】５）ｐｕｒＦ誘導体Ｆ５ この誘導体はｐｕｒＦタンパク質の６０番目のメチオニ
ンから１４８番目のアスパラギン酸から成り、そしてＳ
ｓｐＩ部位を３′末端に付加した。

【００３９】６）ｐｕｒＦ誘導体ＢＦ ＢＦはＢ．スブチリスのｐｕｒＦ誘導体であり、そして
４３個のアミノ酸残基及び３′末端にＡｓｎをコードす
るＳｓｐＩ部位を含む。

【００４０】実施例３：融合ペプチドをコードするＤＮ
Ａ構築体の調製 実施例１において調製したペプチド遺伝子のうち、第一
アミノ酸においてグリシンを含むペプチドをコードする
遺伝子をヒドロキシルアミン切断のための融合パートナ
ー、Ｆ４ａ（ＨＡ），Ｆ５及びＢＦに融合させた。その
他のペプチド（ＨＮＰ−Ｉ、インドリシジン、タキプレ
シン）はＣＮＢｒ切断のための融合パートナーＦ，Ｆ３
（ＣＢ）及びＦ４ａ（ＣＢ）に融合させた（表３）。

【００４１】融合パートナーと抗微生物ペプチドをコー
ドする遺伝子とを融合させ、しかもＣＮＢｒ切断部位
（Ｍｅｔ）又はヒドロキシルアミン切断部位（Ａｓｎ−
Ｇｌｙ）を生成する方法を図３及び４にそれぞれ示す。
ＣＮＢｒ切断のための融合パートナーＦとの融合の場
合、融合パートナーとＭＳＩ−３４４遺伝子とをＮｄｅ
Ｉ部位を利用して融合し、ＤＮＡ構築体ＦＭを作る（図
３Ａ）。Ｆ３（ＣＢ）又はＦ４（ＣＢ）との融合の場
合、ペプチド遺伝子を化学合成し、そして融合パートナ
ーの３′末端ＢｓｐＬＵ１１Ｉ部位に、ＨＮＰ−Ｉにつ
いては相補性ＮｃｏＩ部位、そしてインドリシジン及び
タキプレシンについては５′ＢｓｐＬｕ１１Ｉ部位のそ
れぞれに融合させた。

【００４２】ヒドロキシルアミン切断のための融合パー
トナー（Ｆ′，Ｆ３（ＨＡ），Ｆ４（ＨＡ），Ｆ４ａ
（ＨＡ），Ｆ５，ＢＦ）との融合は、融合パートナーを
ＳｓｐＩで、そしてＭＳＩ−３４４をＳｍａＩで切断
し、そしてこれらのＤＮＡフラグメントを接続してヒド
ロキシルアミン切断のためのＡｓｎ−Ｇｌｙ部位を作る
ことで実施した。アピダエシンＩ、ボンビニン、ＣＰＦ
１、ドロソシン、メリチン、ＰＧＱ及びＸＰＦについて
の遺伝子の場合、ＳｓｐＩで切断した融合パートナーと
の融合の前に制限酵素で消化する必要はなく、なぜなら
それらは５′平滑末端を有するからである。

【００４３】実施例４：転写融合多量体の調製 ＭｅｔをコードするＮｄｅＩ部位、構造遺伝子、ＲＢＳ
及びＮｄｅと接続してＭｅｔを供するＡｓｅＩ部位から
成る多量体を供することのできる単量体単位を構築し
た。構造遺伝子としては、Ｆ４ａ（ＨＡ）−ＭＳ１３４
４融合遺伝子（Ｆ４Ｍａ）及びＦ５−ＭＳ１３４４融合
遺伝子（Ｆ５Ｍ）を利用した。この単量体単位をＮｄｅ
Ｉ及びＡｓｅＩで消化し、そして単離された単量体単位
を再接続した。得られるＤＮＡフラグメントを再びＮｄ
ｅＩ及びＡｓｅＩで消化し、そして多量体をアガロース
ゲル電気泳動により分離させた。この方法を利用するこ
とにより、Ｆ４Ｍａの単量体（Ｆ４Ｍａ）、二量体（Ｆ
４ＭａＸ２）及び四量体（Ｆ４ＭａＸ４）、並びにＦ５
Ｍの単量体（Ｆ５Ｍ）、二量体（Ｆｍ５ＭＸ２）及び四
量体（Ｆ５ＭＸ４）が得られた。

【００４４】実施例５：発現ベクター Ｅ．コリ内で外来遺伝子を発現させるため、２種類の発
現ベクターｐＧＮＸ２及びｐＴ７Ｋ２．１をＴ７Φ１０
プロモーター、高コピー数の複製起点（ｐＵＣファミリ
ーのｃｏｌＥＩ）及びカナマイシン耐性遺伝子を利用し
て構築した。ｐＧＮＸ２を構築するため、商業的に入手
できるｐＵＣ１９（アンピシリン耐性遺伝子：Ａｍ
ｐ^R ）内のｂｌａ遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子（Ｋ
ａｎ^R ）で置換した。次に、ｐＵＣ１９をＳｓｐＩ及び
ＤｒａＩで消化して１７４８bpを有する１７４８bp Ｄ
ＮＡフラグメントを分離し、そしてＫａｎ^R 遺伝子を鋳
型としてＥ．コリのＴｎ５並びにプライマー＃３９及び
＃４０（表１）を利用するＰＣＲにより増幅させた。こ
のＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で消化
し、クレノウフラグメントによりフィル・インし、そし
てＳｓｐＩ及びＤｒａＩで消化したｐＵＣ１９にクロー
ニングしてｐＵＣＫ２を得た。このベクターをＮｄｅＩ
で消化し、そしてクレノウフラグメントでフィル・イン
した後、それを再ライゲーションしてｐＵＣＫ２ΔＮｄ
ｅｌを構築した。最終プラスミドｐＧＮＸ２はＢａｍＨ
Ｉで消化し、クレノウフラグメントによりフィル・イン
し、次いでＡｓｅＩで消化したＴ７Φ１０プロモーター
及びｐＴ７−７由来のＲＢＳを含むフラグメント（USB,
USA）を、ＨｉｎｄIII により消化し、クレノウフラグ
メントによりフィル・インし、次いでＡｓｅＩで消化し
たｐＵＣＫ２ΔＮｄｅｌベクターにクローニングするこ
とにより構築した。Ｔ７Φ１０プロモーター及びカナマ
イシン耐性遺伝子（Ｋａｎ^R ）はｐＧＮＸ２の中で同じ
方向を向いている（図６）。

【００４５】プラスミドｐＴ７Ｋ２．１を構築するた
め、ｂｌａ遺伝子をｐＴ７−７からＳｓｐＩ及びＢｇｌ
Ｉによる消化により除き、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼで処理して平滑末端にした。Ｋａｎ^R 遺伝子はｐＧ
ＮＸ２と同じように調製し、そして２本のＤＮＡフラグ
メントをライゲーションしてｐＴ７Ｋ２を構築した。最
終プラスミドｐＴ７Ｋ２．１はＡｓｅＩ部位をこのベク
ターから除くことにより構築した（図７）。ｐＧＮＸ２
で形質転換されたＥ．コリＨＭＳ１７４（ＤＥ３）はKo
rean Collection of Type Cultures (KCTC), Korea Res
earch Instituteof Bioscience and Biotechnology, Yu
song-gu Eun-dong, Taejon, 韓国に１９９８年５月２
９日に寄託してあり、そしてＫＣＴＣ０４８６ＢＰの番
号が付与されている。ｐＧＮＸ３を構築するため、ｐＧ
ＮＸ２Ｆ４ＭをＢｓｐＨＩで部分消化し、そして単一の
ＢｓｐＨＩ部位に切れ目を有するこのフラグメントを分
離し、そしてＢａｍＨＩで更に消化した。Ｔ７及びｒｒ
ｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターを含むフラグメントを調製
するため、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶで消化したｐＥＴ
１１ａ由来の１３２bpのフラグメント並びにＢａｍＨＩ
及びＥｃｏＲＶで消化したｐｔｒｃ９９ａ由来の４８８
bpのフラグメントをライゲーションさせた。これらの融
合フラグメントをＢａｍＨＩ及びＢｓｐＨＩで切断し、
そして上述の調製したベクターにクローニングしてｐＧ
ＮＸ３Ｆ４Ｍを構築した（図８）。

【００４６】ｐＧＮＸ４を調製するため、３０５２bpフ
ラグメントをＸｂａＩ及びＡｌｗＮＩで消化したｐＥＴ
ＡＣｃから、そしてＸｂａＩ及びＡｌｗＮＩで消化した
ｐＧＮＸ３Ｆ４Ｍから２４０５bpのフラグメントを単離
し、ｐＧＮＸ４Ｆ４Ｍを得た（図９）。

【００４７】ｐＧＮＸ５を構築するため、ｐＧＮＸ３Ｆ
４ＭをＡｓｅＩで部分消化し、次いでＸｂａＩで消化
し、そしてクレノウフラグメントで処理した。ＥｃｏＲ
Ｉ及びＮｄｅＩで消化したＰＣＲ−ＴｒｐＰＯから獲得
し、そしてクレノウフラグメントで処理したフラグメン
トを上記のベクターフラグメントにクローニングしてｐ
ＧＮＸ５Ｆ４Ｍを構築した（図１０）。

【００４８】実施例６：抗微生物ペプチドの生産 ＭＳＩ−３４４を融合パートナーＦ３，Ｆ４，Ｆ４ａ，
Ｆ５及びＢＦに融合することにより得られたＤＮＡ構築
体をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＧＮＸ２並び
にＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＴ７Ｋ２．１の
それぞれにクローニングした。Ｆ（全ｐｕｒＦ）を融合
パートナーとして用いる場合、それはＮｄｅＩ及びＸｈ
ｏＩで消化したｐＥＴ２４ａ（Novagen, USA）にクロー
ニングした。多量体の場合、それはｐＧＮＸ２及びｐＴ
７Ｋ２．１のＮｄｅＩ部位にクローニングした。アピダ
エシンＩ、インドリシジン、タキプレシンＩ、ボンビニ
ン、ＣＰＦ１、ドロソシン、メリチン、ＨＮＰ−Ｉ，Ｐ
ＧＱ及びＸＰＦをコードする遺伝子を融合パートナーＦ
４に融合し、そしてＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化した
ｐＧＮＸ２にクローニングした。Ｆ３を利用する場合、
ｐＲＳＥＴｃのＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位をクロー
ニングのために用いた（表３）。

【００４９】表３中のプラスミド２，３，４，５，６及
び７をＥ．コリＨＭＳ１７４（ＤＥ３）の中にＣａＣｌ
₂ 法を利用して形質転換させた。カスアミノ酸の添加さ
れたＲ培地を培養培地として用い、そしてペプチド発現
はＯＤ₆₀₀ が０．２〜０．４のときに２％のラクトース
及び２mMのＩＰＴＧのそれぞれを加えることにより誘導
した。発現レベルはＳＤＳ−ＰＡＧＥ由来の結果をデン
シトメーターによりスキャンすることにより定量し、そ
して総細胞タンパク質中の融合ペプチドのパーセンテー
ジとして表示する（図１１）。図１１において、Ｍは分
子量標準マーカーを表わし、そしてレーン１〜６はラク
トース誘導による表３中のプラスミド２，３，４，５，
６及び７を有する形質転換体からの発現を表わし、そし
てレーン７〜１２はＩＰＴＧ誘導による表３中のプラス
ミド２，３，４，５，６及び７を有する形質転換体から
の発現を表わす。レーン１３及び１４はラクトース及び
ＩＰＴＧ誘導のそれぞれによるプラスミド４３（Ｅ．コ
リｐｕｒＦ；ＥＦ）を有する形質転換体からの発現を表
わす。同様に、ＭＳＩ−３４４を表３のプラスミド４
４，４５及び４６で形質転換されたＥ．コリＨＭＳ１７
４（ＤＥ３）を利用し、ラクトース誘導により発現させ
た（図１２）。発現レベルは転写ターミネーターを有す
るプラスミドで高いことがわかった。表３のプラスミド
４で形質転換されたＨＭＳ１７４（ＤＥ３）では、融合
ペプチドの発現はラクトースにより誘導され、そして細
胞は誘導の９時間後に回収したものである。これらの細
胞を音波処理し、そして沈殿物を遠心分離により得た。
この沈殿物を室温で２時間９Ｍの尿素、２０mMのリン酸
カリウム（pH８．５）を含む溶液の中に入れておくこと
により溶解させた後、そのサンプルをＳＰ−セファロー
スＦＦカラム（Pharmacia,Sweden ）に載せ、そして融
合ペプチドＦ４Ｍａを０．３〜１．０ＭのＮａＣｌを利
用して溶出させた。精製したＦ４Ｍａを０．５〜２Ｍの
ヒドロキシルアミン及び０．４Ｍの炭酸カリウム（pH
７．５〜９．５）バッファーと反応させてＭＳＩ−３４
４を融合パートナーから切断した。脱塩の後、この反応
混合物をＳＰセファロースＦＦカラム（Pharmacia, Swe
den ）に載せ、再び０．４〜１ＭのＮａＣｌでＭＳＩ−
３４４を溶出させた。精製ＭＳＩ−３４４をＨＰＬＣ，
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ及びアミノ酸配列決定により同定し
た。

【００５０】実施例７ 表３のその他のプラスミドをＥ．コリＨＭＳ１７４（Ｄ
Ｅ３）にＣａＣｌ₂ 法により形質転換させた。カスアミ
ノ酸の添加したＲ培地を培養培地として用い、そしてペ
プチド発現はＯＤ₆₀₀ が０．４〜０．６のときに２％の
ラクトースを添加することにより誘導した。発現レベル
はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果をデンシトメーターによりス
キャンすることにより定量し、そして総細胞タンパク質
中の融合ペプチドのパーセンテージとして表示する。各
抗微生物ペプチドの発現の結果を図１３ａ及び１３ｂ、
並びに表３に示す。図１３ａにおいて、レーン１〜６は
表３のプラスミド１０，１２，１５，２０，２１及び２
３を有する形質転換体の結果を示す。図１３ｂにおい
て、レーン１〜９は表３のプラスミド１１，１３，１
４，１６，２２，１７，１８，２４及び１９を有する形
質転換体の結果を示す。図１４ａ〜１４ｄは表３のプラ
スミド２５〜４２の発現結果を示す。ブフォリンIIｂｘ
２及びブフォリンIIｘ４はそれぞれブフォリンIIｂの二
量体及び四量体であり、そして実施例４に記載の通りに
して構築した。対応のプラスミド、系及び発現結果は下
記のかっこ内に示す。

【００５１】図１４ａ：１（２５） 図１４ｂ：１（２６），２（３１），３（３６） 図１４ｃ：１（２７），３（３２），３（３７），４
（２８），５（３３），６（３８），７（２９），８
（３４），９（３９），１０（３０），１１（３５），
１２（４０） 図１４ｄ：１（４１），２（４２），３（４３）

【００５２】

【表４】

【００５３】

【表５】

【００５４】

【表６】

【００５５】実施例８ 実施例４で調製した構築体、例えばＦ４Ｍａの単量体
（Ｆ４Ｍａ）、二量体（Ｆ４ＭａＸ２）及び四量体（Ｆ
４ＭａＸ４）並びにＦ５Ｍの単量体（Ｆ５Ｍ）、二量体
（Ｆｍ５ＭＸ２）及び四量体（Ｆ５ＭＸ４）を、それら
をｐＧＮＸ２のＮｄｅＩ部位及びｐＴ７Ｋ２．１のＮｄ
ｅＩ部位にクローニングした後、Ｅ．コリＨＭＳ１７４
（ＤＥ３）に形質転換させた。融合タンパク質は実施例
６の方法に従って発現させ、そして発現レベルはＳＤＳ
−ＰＡＧＥの結果をデンシトメーターによりスキャンす
ることにより定量し、そして総細胞タンパク質中の融合
ペプチドのパーセンテージとして表示する。図１５にお
いて、ｐＴ７Ｋ２．１のレーン１〜６はそれぞれＦ４Ｍ
ａ，Ｆ４ＭａＸ２，Ｆ４ＭａＸ４，Ｆ５Ｍ，Ｆ５ＭＸ２
及びＦ５ＭＸ４を表わす。ｐＧＮＸ２のレーン１〜４は
それぞれＦ４Ｍａ，Ｆ４ＭａＸ２，Ｆ５Ｍ及びＦ５ＭＸ
２を表わす。図１５からわかる通り、発現レベルは四量
体の発現率を単量体のそれと比べたとき、３０％から４
０％へと増大した。Ｆ５Ｍの場合、発現レベルは、四量
体の発現率を単量体のそれと比べたとき、２０％から２
５％へと増大した。本発明に従うと、抗微生物ペプチド
は微生物からより経済的に効率的に大量生産でき、そし
て容易に分離、精製できる。

【００５６】

【表７】 ［図面の簡単な説明］

【図１】本発明の抗微生物ペプチドをコードするヌクレ
オチド配列。

【図２】融合パートナーをコードするヌクレオチド配
列。

【図３】ＣＮＢｒ切断部位を供するコード配列を作製す
ることによる融合パートナーとＭＳＩ−３４４遺伝子と
の融合方法のスキーム。

【図４】ヒドロキシルアミン切断部位を供するコード配
列を作製することによる融合パートナーとＭＳＩ−３４
４との融合方法のスキーム。

【図５】転写融合多量体の構築のスキーム。

【図６】ｐＧＮＸ２ベクターの構築のスキーム。

【図７】ｐＴ７Ｋ２．１ベクターの構築のスキーム。

【図８】ｐＧＮＸ３ベクターの構築のスキーム。

【図９】ｐＧＮＸ４ベクター。

【図１０】ｐＧＮＸ５ベクターの構築のスキーム。

【図１１】ラクトース又はＩＰＴＧによる誘導によりＭ
ＳＩ−３４４を発現する形質転換体のリゼートのＳＤＳ
−ＰＡＧＥ電気泳動分析。

【図１２】様々なベクターによるＭＳＩ−３４４発現の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析。

【図１３ａ】ラクトースによる誘導により様々な抗微生
物ペプチドを発現する形質転換体のリゼートのＳＤＳ−
ＰＡＧＥ電気泳動分析。

【図１３ｂ】ラクトースによる誘導により様々な抗微生
物ペプチドを発現する形質転換体のリゼートのＳＤＳ−
ＰＡＧＥ電気泳動分析。

【図１４ａ，１４ｂ，１４ｃ及び１４ｄ】ラクトースに
よる誘導により様々な抗微生物ペプチドを発現する形質
転換体のリゼートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析。

【図１５】融合遺伝子の単量体、二量体及び四量体を発
現する形質転換体のリゼートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳
動分析。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カン，ミン ヒュン 大韓民国，テジョン 305−340，ユソン −ク，ドーヨン−ドン，383−３，ウー スン アパートメント 102−305 (72)発明者 リー，ジェ−ヒュン 大韓民国，テジョン 305−390，ユソン −ク，ジュンミン−ドン，460−１，サ ムソン−プレウン アパートメント 105−603 (72)発明者 パーク，セ ホー 大韓民国，テジョン 305−348，ユソン −ク，フワーム−ドン，63−２，サムヤ ン ジェネックス リサーチ インステ ィテュート (72)発明者 リー，ジョー ウォン 大韓民国，テジョン 305−348，ユソン −ク，フワーム−ドン，63−２，サムヤ ン ジェネックス リサーチ インステ ィテュート (72)発明者 ホン，スン スー 大韓民国，テジョン 305−390，ユソン −ク，ジュンミン−ドン，462−２，チ ョング−ナレ アパートメント 109− 404 (72)発明者 リー，ヒュン−スー 大韓民国，ソウル 137−040，スチョー −ク，バンポ−ドン，550−18，ジェウ ーハウス 101 (56)参考文献 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎ ｇ．，Ｖｏｌ．57，Ｎｏ．１（1998) ｐ．55−61 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 257，Ｎｏ．７（1982）ｐ．3525−3531 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉ ｆ．，Ｖｏｌ．12，Ｎｏ．１（1998) ｐ．53−60 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列No.１、２、３、４、５、６、７、
   ８及び９から成る群から選ばれる一つの配列を含む第一
   配列及び抗微生物ペプチドをコードする第二配列を含ん
   で成るＤＮＡ構築体。
2. 【請求項２】 前記第一配列がコードするペプチドが微
   生物に由来する、請求項１記載のＤＮＡ構築体。
3. 【請求項３】 前記ＤＮＡ構築体が１）開始コドンＭｅ
   ｔを供することのできる第一制限酵素部位；２）ＤＮＡ
   構築体；３）リボソーム結合部位（ＲＢＳ）；及び４）
   前記第一制限酵素により供される付着末端にイン・フレ
   ーム融合できる付着末端を供し、それ故開始コドンを供
   することのできる第二制限酵素部位；の反復単位の多量
   ＤＮＡ構築体である、請求項１又は２記載のＤＮＡ構築
   体。
4. 【請求項４】 配列No.１、２、３、４、５、６、７、
   ８及び９から成る群から選ばれる一つの配列を含む第一
   配列及び抗微生物ペプチドをコードする第二配列を含ん
   で成る遺伝子構築体を含む発現ベクターを構築し； 当該ベクターで細菌宿主細胞を形質転換せしめ； この形質転換細胞を培養してペプチドを融合ペプチドと
   して発現させ；そして当該融合ペプチドを回収する工程
   を含んで成る、抗微生物ペプチドの生産方法。