JPH05244954A - ウサギコルチコスタチンをコードするｄｎａ配列 - Google Patents
ウサギコルチコスタチンをコードするｄｎａ配列Info
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- JPH05244954A JPH05244954A JP4048626A JP4862692A JPH05244954A JP H05244954 A JPH05244954 A JP H05244954A JP 4048626 A JP4048626 A JP 4048626A JP 4862692 A JP4862692 A JP 4862692A JP H05244954 A JPH05244954 A JP H05244954A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ウサギコルチコスタチンをコードするＤＮＡ
配列およびそれを含む発現ベクターを提供する。 【構成】 ウサギコルチコスタチンをコードし、高頻度
コドンからなる合成ＤＮＡ配列であって、下記ＤＮＡ配
列およびそれを含む発現ベクターを提供する。 GGTATCTGCG CTTGCCGTCG TCGTTTCTGC CCGAACTCT GAACGTTTCT CTGGTTACTG TCGTGTTAAC GGTGCTCGTT ACGTTCGTTG CTGCTCTCG TCGT
配列およびそれを含む発現ベクターを提供する。 【構成】 ウサギコルチコスタチンをコードし、高頻度
コドンからなる合成ＤＮＡ配列であって、下記ＤＮＡ配
列およびそれを含む発現ベクターを提供する。 GGTATCTGCG CTTGCCGTCG TCGTTTCTGC CCGAACTCT GAACGTTTCT CTGGTTACTG TCGTGTTAAC GGTGCTCGTT ACGTTCGTTG CTGCTCTCG TCGT
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＡＣＴＨに対して拮抗
作用を有するウサギコルチコスタチンを、大腸菌等の菌
体において効率良く発現させるためのウサギコルチコス
タチンをコードするＤＮＡ配列に関するものである。
作用を有するウサギコルチコスタチンを、大腸菌等の菌
体において効率良く発現させるためのウサギコルチコス
タチンをコードするＤＮＡ配列に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ウサギコルチコスタチンは、ウサギの
肺、脾臓などにおいて見いだされる３４個のアミノ酸か
らなるペプチドで、抗菌性ペプチドであるディフェンシ
ン類の一種として発見された（特開昭６０−２４６３９
８号公報）が、その後、ラットなどにおいて副腎皮質刺
激ホルモン（ＡＣＴＨ）に対する拮抗作用を有している
ことが明らかになっている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５９２−５９６（１９８
８））。コルチコスタチンの抗ＡＣＴＨ作用は、副腎皮
質におけるＡＣＴＨ刺激によるコルチコステロン生産を
抑制する作用を有し、これによる免疫賦活作用が期待さ
れている。
肺、脾臓などにおいて見いだされる３４個のアミノ酸か
らなるペプチドで、抗菌性ペプチドであるディフェンシ
ン類の一種として発見された（特開昭６０−２４６３９
８号公報）が、その後、ラットなどにおいて副腎皮質刺
激ホルモン（ＡＣＴＨ）に対する拮抗作用を有している
ことが明らかになっている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５９２−５９６（１９８
８））。コルチコスタチンの抗ＡＣＴＨ作用は、副腎皮
質におけるＡＣＴＨ刺激によるコルチコステロン生産を
抑制する作用を有し、これによる免疫賦活作用が期待さ
れている。
【０００３】ウサギコルチコスタチンは、固相法などの
有機合成法によっても合成は可能ではあるが、本ペプチ
ドはシステインを多く含み、分子内でＳ−Ｓ結合を３ヶ
所も有するため、有機合成法では正しい立体構造を収率
良く形成させるのに困難が多かった。一方、大腸菌など
の微生物を用いて醗酵法により生産させればこの問題は
解決し、また、大量生産も行いやすくなると考えられ
る。しかし、ウサギコルチコスタチン遺伝子は現段階に
おいては単離されていないため、醗酵法による生産は現
在のところ困難である。また、仮にその遺伝子が単離さ
れたとしても、それはウサギの遺伝子であるため大腸菌
の遺伝子とはコドンの使用頻度が大きく異なり、大腸菌
を用いて生産させようとしても大量生産は期待できな
い。
有機合成法によっても合成は可能ではあるが、本ペプチ
ドはシステインを多く含み、分子内でＳ−Ｓ結合を３ヶ
所も有するため、有機合成法では正しい立体構造を収率
良く形成させるのに困難が多かった。一方、大腸菌など
の微生物を用いて醗酵法により生産させればこの問題は
解決し、また、大量生産も行いやすくなると考えられ
る。しかし、ウサギコルチコスタチン遺伝子は現段階に
おいては単離されていないため、醗酵法による生産は現
在のところ困難である。また、仮にその遺伝子が単離さ
れたとしても、それはウサギの遺伝子であるため大腸菌
の遺伝子とはコドンの使用頻度が大きく異なり、大腸菌
を用いて生産させようとしても大量生産は期待できな
い。
【０００４】ある一つのアミノ酸に対して、そのアミノ
酸をコードするコドンは通常複数（多いもので６種）存
在するが、その中でどのコドンを使用するか（コドンの
使用頻度）は生物種によってかなり異なることが知られ
ている。また、一つの生物種内でも、大量に発現してい
る遺伝子と、まれにしか発現していない遺伝子とでは、
用いられているコドンの使用頻度にかなりの差異が見ら
れる。大腸菌の場合、大量に発現している遺伝子におい
て高頻度に用いられているコドン（高頻度コドン）はほ
ぼ決まっており、レアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ）
と呼ばれるまれにしか用いられていないコドンは、これ
らの大量発現遺伝子中にはほとんど存在していない。そ
こで、レアコドンを高頻度コドンに変えることにより、
生産性が向上した例も報告されている（Ａ．Ｊ．Ｍａｋ
ｏｆｆ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１７（２４），１０１９１（１９８９））。
酸をコードするコドンは通常複数（多いもので６種）存
在するが、その中でどのコドンを使用するか（コドンの
使用頻度）は生物種によってかなり異なることが知られ
ている。また、一つの生物種内でも、大量に発現してい
る遺伝子と、まれにしか発現していない遺伝子とでは、
用いられているコドンの使用頻度にかなりの差異が見ら
れる。大腸菌の場合、大量に発現している遺伝子におい
て高頻度に用いられているコドン（高頻度コドン）はほ
ぼ決まっており、レアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ）
と呼ばれるまれにしか用いられていないコドンは、これ
らの大量発現遺伝子中にはほとんど存在していない。そ
こで、レアコドンを高頻度コドンに変えることにより、
生産性が向上した例も報告されている（Ａ．Ｊ．Ｍａｋ
ｏｆｆ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１７（２４），１０１９１（１９８９））。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、大腸
菌で多量に発現されている蛋白質の遺伝子において多く
使用されているコドンを用いることにより、大腸菌にと
って好ましいコドンを有するウサギコルチコスタチンを
コードする新規なＤＮＡ配列を提供するものである。
菌で多量に発現されている蛋白質の遺伝子において多く
使用されているコドンを用いることにより、大腸菌にと
って好ましいコドンを有するウサギコルチコスタチンを
コードする新規なＤＮＡ配列を提供するものである。
【０００６】本発明では、大腸菌の高頻度コドンのみで
ウサギコルチコスタチンをコードするＤＮＡ配列を構築
することにより、大腸菌において最適化されたＤＮＡ配
列を提供し、大腸菌およびその類縁微生物においてウサ
ギコルチコスタチンの生産を大量に行うことを目的とす
る。また、通常に遺伝子を発現させる場合、開始コドン
に相当するメチオニンが蛋白質のＮ末端に付加すること
が避けられないが、融合蛋白質の形でこれを発現させる
ことによりその問題を回避し、さらに、適切な融合蛋白
質を選択することによって大腸菌内における生産物の安
定性を増し、精製を簡便化させることなどを目的とす
る。
ウサギコルチコスタチンをコードするＤＮＡ配列を構築
することにより、大腸菌において最適化されたＤＮＡ配
列を提供し、大腸菌およびその類縁微生物においてウサ
ギコルチコスタチンの生産を大量に行うことを目的とす
る。また、通常に遺伝子を発現させる場合、開始コドン
に相当するメチオニンが蛋白質のＮ末端に付加すること
が避けられないが、融合蛋白質の形でこれを発現させる
ことによりその問題を回避し、さらに、適切な融合蛋白
質を選択することによって大腸菌内における生産物の安
定性を増し、精製を簡便化させることなどを目的とす
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】ウサギコルチコスタチン
をコードし、大腸菌での発現において最適化されたＤＮ
Ａ配列を提供すべく研究を重ねた結果、添付配列表の配
列番号１によって特定されるＤＮＡ配列を提供すること
によって本発明の目的は達成された。すなわち、本発明
によれば、以下のＤＮＡ配列を含んでなるウサギコルチ
コスタチンをコードする新規ＤＮＡ配列が提供される。 5'-GGTATCT GCGCTTGCCG TCGTCGTTTC TGCCCGAACT CTGAACGTTT 3'-CCATAGA CGCGAACGGC AGCAGCAAAG ACGGGCTTGA GACTTGCAAA CTCTGGTTAC TGTCGTGTTA ACGGTGCTCG TTACGTTCGT TGCTGCTCTC GAGACCAATG ACAGCACAAT TGCCACGAGC AATGCAAGCA ACGACGAGAG GTCGT-3' CAGCA-5' さらには、上記のＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクター
も提供される。
をコードし、大腸菌での発現において最適化されたＤＮ
Ａ配列を提供すべく研究を重ねた結果、添付配列表の配
列番号１によって特定されるＤＮＡ配列を提供すること
によって本発明の目的は達成された。すなわち、本発明
によれば、以下のＤＮＡ配列を含んでなるウサギコルチ
コスタチンをコードする新規ＤＮＡ配列が提供される。 5'-GGTATCT GCGCTTGCCG TCGTCGTTTC TGCCCGAACT CTGAACGTTT 3'-CCATAGA CGCGAACGGC AGCAGCAAAG ACGGGCTTGA GACTTGCAAA CTCTGGTTAC TGTCGTGTTA ACGGTGCTCG TTACGTTCGT TGCTGCTCTC GAGACCAATG ACAGCACAAT TGCCACGAGC AATGCAAGCA ACGACGAGAG GTCGT-3' CAGCA-5' さらには、上記のＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクター
も提供される。
【０００８】本発明の上記の塩基配列を用いることよ
り、大腸菌およびその類縁微生物において、ウサギコル
チコスタチンを大量に発現することができる。特に、融
合蛋白質の形で発現させ、その接続部位に、配列特異的
に切断できるアミノ酸配列を組み込むことにより、余計
なアミノ酸配列の無いウサギコルチコスタチンを得るこ
とができる。
り、大腸菌およびその類縁微生物において、ウサギコル
チコスタチンを大量に発現することができる。特に、融
合蛋白質の形で発現させ、その接続部位に、配列特異的
に切断できるアミノ酸配列を組み込むことにより、余計
なアミノ酸配列の無いウサギコルチコスタチンを得るこ
とができる。
【０００９】以下に、本発明のウサギコルチコスタチン
をコードするＤＮＡ配列の調製方法について説明する。
本発明のＤＮＡ配列の構築に際しては、大腸菌が生産す
る多くの蛋白質のうち、特に大量に発現されている蛋白
質の遺伝子において高頻度に用いられているコドンを選
び出し、そのコドンを用いることによって本発明のＤＮ
Ａ配列を決定する。一方、このＤＮＡ配列の下流には終
止コドンの配列をつなげるが、これは、転写を確実に終
了させるために２つ以上つなげることが好ましい。さら
に、この配列の前後には、後述の発現ベクターへ組み込
みやすいように、制限酵素認識配列を付加する。
をコードするＤＮＡ配列の調製方法について説明する。
本発明のＤＮＡ配列の構築に際しては、大腸菌が生産す
る多くの蛋白質のうち、特に大量に発現されている蛋白
質の遺伝子において高頻度に用いられているコドンを選
び出し、そのコドンを用いることによって本発明のＤＮ
Ａ配列を決定する。一方、このＤＮＡ配列の下流には終
止コドンの配列をつなげるが、これは、転写を確実に終
了させるために２つ以上つなげることが好ましい。さら
に、この配列の前後には、後述の発現ベクターへ組み込
みやすいように、制限酵素認識配列を付加する。
【００１０】上記のように設計したＤＮＡ配列は、種々
のＤＮＡ合成法により作成し得るが、現在の合成法では
全長を一度に合成すると、完全長のＤＮＡの収率が著し
く落ちるため、それぞれ３０から５０塩基程度のいくつ
かの断片に分けてこれを合成することが望ましい。その
際、各断片は少なくとも６塩基程度が相補鎖と重なるよ
うにし、しかもそれにより各断片が正しい順序にアニー
ルするように各断片を設計する。各断片はＤＮＡ合成機
等を用いて合成した後、ＨＰＬＣ等によって完全長のも
ののみを精製する。
のＤＮＡ合成法により作成し得るが、現在の合成法では
全長を一度に合成すると、完全長のＤＮＡの収率が著し
く落ちるため、それぞれ３０から５０塩基程度のいくつ
かの断片に分けてこれを合成することが望ましい。その
際、各断片は少なくとも６塩基程度が相補鎖と重なるよ
うにし、しかもそれにより各断片が正しい順序にアニー
ルするように各断片を設計する。各断片はＤＮＡ合成機
等を用いて合成した後、ＨＰＬＣ等によって完全長のも
ののみを精製する。
【００１１】上記の各断片は５’末端がリン酸化されて
ないのでＴ４キナーゼによりリン酸化し、その反応液を
９０℃前後で５分程度加熱した後、室温で緩やかに冷却
してアニールさせ、エタノール沈澱により回収する。こ
うして得た各断片を、Ｔ４リガーゼを用いて結合するこ
とにより、目的の二本鎖ＤＮＡ断片が得られる。この
際、当該ＤＮＡの両端に対応する制限酵素であらかじめ
切断しておいたベクターを反応液中に入れておくことに
より、上記断片をベクター中に組み込むことができる。
ないのでＴ４キナーゼによりリン酸化し、その反応液を
９０℃前後で５分程度加熱した後、室温で緩やかに冷却
してアニールさせ、エタノール沈澱により回収する。こ
うして得た各断片を、Ｔ４リガーゼを用いて結合するこ
とにより、目的の二本鎖ＤＮＡ断片が得られる。この
際、当該ＤＮＡの両端に対応する制限酵素であらかじめ
切断しておいたベクターを反応液中に入れておくことに
より、上記断片をベクター中に組み込むことができる。
【００１２】本発明のウサギコルチコスタチンをコード
するＤＮＡ配列は開始コドン（ＡＴＧ）で始まっていな
いので、実際の発現の際には、その上流に開始コドンを
導入するとともに、発現の際に、それによって生じる余
分なＮ末端のアミノ酸配列は除去する。このためには、
適切な蛋白質との融合蛋白質の形で本発明のＤＮＡ配列
を含んでなる遺伝子を発現させた後、配列特異的な切断
方法によって余分なＮ末端のポリペプチドを切断する方
法が好ましい。融合する相手の蛋白質としては、ウサギ
コルチコスタチンの正常な三次構造の形成を阻害せず、
大腸菌において安定かつ高濃度に生産され、アフィニテ
ィーによる精製が容易なものが好ましく、そしてこれら
の条件を満たす蛋白質としては、β−ガラクトシダー
ゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ファルマ
シア社製ｐＧＥＸ−２ＴおよびｐＧＥＸ−３Ｘで利用可
能。以下同様。）、マルトース結合蛋白質（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製ｐＭＡＬ−Ｃ）、プ
ロテインＡ（ファルマシア社製ｐＥＺＺ１８）などが挙
げられる。配列特異的な切断法としては、臭化シアン分
解、種々のエンドペプチダーゼによる分解などがあげら
れる。これらは、既存の種々の発現ベクターを利用する
ことにより容易に実現できる。
するＤＮＡ配列は開始コドン（ＡＴＧ）で始まっていな
いので、実際の発現の際には、その上流に開始コドンを
導入するとともに、発現の際に、それによって生じる余
分なＮ末端のアミノ酸配列は除去する。このためには、
適切な蛋白質との融合蛋白質の形で本発明のＤＮＡ配列
を含んでなる遺伝子を発現させた後、配列特異的な切断
方法によって余分なＮ末端のポリペプチドを切断する方
法が好ましい。融合する相手の蛋白質としては、ウサギ
コルチコスタチンの正常な三次構造の形成を阻害せず、
大腸菌において安定かつ高濃度に生産され、アフィニテ
ィーによる精製が容易なものが好ましく、そしてこれら
の条件を満たす蛋白質としては、β−ガラクトシダー
ゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ファルマ
シア社製ｐＧＥＸ−２ＴおよびｐＧＥＸ−３Ｘで利用可
能。以下同様。）、マルトース結合蛋白質（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製ｐＭＡＬ−Ｃ）、プ
ロテインＡ（ファルマシア社製ｐＥＺＺ１８）などが挙
げられる。配列特異的な切断法としては、臭化シアン分
解、種々のエンドペプチダーゼによる分解などがあげら
れる。これらは、既存の種々の発現ベクターを利用する
ことにより容易に実現できる。
【００１３】こうして、本発明のＤＮＡ配列をいずれか
適切な蛋白質の遺伝子と融合させて融合蛋白質の形で発
現させることにより、コルチコスタチンの有する抗菌活
性が菌体に及ぼす影響を緩和させながら目的のコルチコ
スタチンを生産することができるのでコルチコスタチン
の生産効率の向上が期待できる。さらに、融合させる蛋
白質の種類を適切に選んでその性質を利用することによ
り、アフィニティーカラム等を利用して、生産物の高度
な精製を容易に行うことが可能となる。その上、コルチ
コスタチンのＮ末端側に蛋白質が結合した状態で生産さ
れるため、本来生体内で生産される場合のように前駆体
配列がＮ末端に付加される状態と似たような環境が形成
され、正しい三次構造が形成されることが期待される。
これにより、有機合成法の場合の大きな問題である、三
次構造の形成がうまくいかないという問題点が改善され
る。また、融合蛋白質による生産は、保護ペプチドが付
加されることになるため、菌体内プロテアーゼによる分
解をある程度回避できる。
適切な蛋白質の遺伝子と融合させて融合蛋白質の形で発
現させることにより、コルチコスタチンの有する抗菌活
性が菌体に及ぼす影響を緩和させながら目的のコルチコ
スタチンを生産することができるのでコルチコスタチン
の生産効率の向上が期待できる。さらに、融合させる蛋
白質の種類を適切に選んでその性質を利用することによ
り、アフィニティーカラム等を利用して、生産物の高度
な精製を容易に行うことが可能となる。その上、コルチ
コスタチンのＮ末端側に蛋白質が結合した状態で生産さ
れるため、本来生体内で生産される場合のように前駆体
配列がＮ末端に付加される状態と似たような環境が形成
され、正しい三次構造が形成されることが期待される。
これにより、有機合成法の場合の大きな問題である、三
次構造の形成がうまくいかないという問題点が改善され
る。また、融合蛋白質による生産は、保護ペプチドが付
加されることになるため、菌体内プロテアーゼによる分
解をある程度回避できる。
【００１４】さらに、分泌型蛋白質の遺伝子と融合させ
て（例えば、ファルマシア社製ｐＥＺＺ１８に組み込ん
でプロテインＡのシグナルペプチドと結合させて）発現
させることによって、生産物を菌体外に分泌させること
ができ、それによって、菌体の蛋白質をほとんど含まな
い高純度な融合蛋白質を得ることもできる。また、生産
物を菌体外に分泌することにより、菌体に対する負担が
減少するため生産性の向上が期待されると共に、生産物
に対する菌体内プロテアーゼからの攻撃を防ぐことがで
きる。さらに、遺伝子発現による蛋白質生産は菌体中の
細胞質で行われるが、細胞質は還元的な条件に維持され
ているため、そのままではＳ−Ｓ結合の形成が十分には
行われないことがある。しかし、菌体外に分泌するシグ
ナルペプチドの配列をＮ末端側に配置しておくことによ
り、生産物を菌体内から酸化的条件下である菌体外に分
泌させることができ、コルチコスタチンの立体構造形成
に必須の３つのジスルフィド結合の生成を促進させるこ
とができる。また、菌体外は菌体内に比べて蛋白質濃度
が低いため、ペプチド分子間のジスルフィド結合が形成
されて不溶性の凝集体が形成される可能性はほとんどな
く、正しい分子内ジスルフィド結合を形成したペプチド
が形成されるものと期待される。
て（例えば、ファルマシア社製ｐＥＺＺ１８に組み込ん
でプロテインＡのシグナルペプチドと結合させて）発現
させることによって、生産物を菌体外に分泌させること
ができ、それによって、菌体の蛋白質をほとんど含まな
い高純度な融合蛋白質を得ることもできる。また、生産
物を菌体外に分泌することにより、菌体に対する負担が
減少するため生産性の向上が期待されると共に、生産物
に対する菌体内プロテアーゼからの攻撃を防ぐことがで
きる。さらに、遺伝子発現による蛋白質生産は菌体中の
細胞質で行われるが、細胞質は還元的な条件に維持され
ているため、そのままではＳ−Ｓ結合の形成が十分には
行われないことがある。しかし、菌体外に分泌するシグ
ナルペプチドの配列をＮ末端側に配置しておくことによ
り、生産物を菌体内から酸化的条件下である菌体外に分
泌させることができ、コルチコスタチンの立体構造形成
に必須の３つのジスルフィド結合の生成を促進させるこ
とができる。また、菌体外は菌体内に比べて蛋白質濃度
が低いため、ペプチド分子間のジスルフィド結合が形成
されて不溶性の凝集体が形成される可能性はほとんどな
く、正しい分子内ジスルフィド結合を形成したペプチド
が形成されるものと期待される。
【００１５】また、何らかの方法によって特異的に切断
できるような特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
列を、遺伝子作成の段階で前もってその結合部に組み込
んでおくことにより、融合蛋白質を生成後、その部分で
特異的に融合蛋白質を切断することにより、余分なアミ
ノ酸配列を含まない、完全なウサギコルチコスタチンを
得ることもできる。
できるような特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
列を、遺伝子作成の段階で前もってその結合部に組み込
んでおくことにより、融合蛋白質を生成後、その部分で
特異的に融合蛋白質を切断することにより、余分なアミ
ノ酸配列を含まない、完全なウサギコルチコスタチンを
得ることもできる。
【００１６】以上の各操作はそれ自体既知の方法に従っ
て進めることができる。
て進めることができる。
【００１７】
【実施例】以下に実施を挙げ本発明をさらに具体的に説
明するが、本発明はこれらによって制限されるものでな
い。合成ＤＮＡ断片の作成 本発明のＤＮＡ配列の前後に、制限酵素認識部位、配列
特異的エンドペプチダーゼＦａｃｔｏｒＸａの認識配列
（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）に相当するＤＮＡ
部位、および終止コドンを付加したＤＮＡ配列を、以下
の４断片に分けて合成した。合成にはＤＮＡ合成機（フ
ァルマシア社製、Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｐｌ
ｕｓ）を用い、ホスホルアミダイト法による固相合成を
行った。 １）5'-AGCTTGA ATTCCATGGG ATCCATCGAA GGTCGTGGTA TCTGCGCTTG CCGTCGTCGT TTCTGCCCGA ACTCT-3' ２）5'-GAACGTT TCTCTGGTTA CTGCCGTGTT AACGGTGCTC GTTACGTTCG TTGCTGCTCT CGTCGTTGAC TGCAGCCCGG G-3' ３）5'-ACGTTCA GAGTTCGGGC AGAAACGACG ACGGCAAGCG CAGATACCAC GACCTTCGAT GGATCCCATG GAATTCA-3' ４）5'-AATTCCC GGGCTGCAGT CAACGACGAG AGCAGCAACG AACGTAACGA GCACCGTTAA CACGGCAGTA ACCAGAGAA- 3' 各ＤＮＡ断片は、５’水酸基の保護基（トリチル基）を
つけたままで合成を終了し、アンモニアで固相から切り
出した後、ゲル瀘過カラム（セファデックスＧ−１０、
商品名）を用いてアンモニアを除去し、エタノール沈澱
にて回収した。その後、イオン交換カラム（Ｍｏｎｏ
Ｑ、商品名）クロマトグラフィーによりトリチル基のつ
いたオリゴヌクレオチドのみを分取した。得られた分画
を８０％酢酸で室温にて２０分間処理してトリチル基を
はずし、直ちにゲル瀘過カラムにて酢酸を除去した後、
エタノール沈澱によりオリゴヌクレオチドを回収した。合成遺伝子断片の作成 精製した、上記１）〜４）の各オリゴヌクレオチド（１
０nmol）を、５０mMトリス塩酸緩衝液（pH９．５）、１
０mM塩化マグネシウム、５mM２−ジチオスレイトール、
５％グリセロール、１mMｄＡＴＰ，Ｔ４キナーゼ１０単
位からなる混合液に、それぞれ加えて３７℃で３０分間
反応させて５’末端の水酸基を燐酸化した。次に、各溶
液を混合して６５℃で１５分間加熱してＴ４キナーゼを
不活化させ、各溶液を混合してからエタノール沈澱で回
収した。
明するが、本発明はこれらによって制限されるものでな
い。合成ＤＮＡ断片の作成 本発明のＤＮＡ配列の前後に、制限酵素認識部位、配列
特異的エンドペプチダーゼＦａｃｔｏｒＸａの認識配列
（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）に相当するＤＮＡ
部位、および終止コドンを付加したＤＮＡ配列を、以下
の４断片に分けて合成した。合成にはＤＮＡ合成機（フ
ァルマシア社製、Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｐｌ
ｕｓ）を用い、ホスホルアミダイト法による固相合成を
行った。 １）5'-AGCTTGA ATTCCATGGG ATCCATCGAA GGTCGTGGTA TCTGCGCTTG CCGTCGTCGT TTCTGCCCGA ACTCT-3' ２）5'-GAACGTT TCTCTGGTTA CTGCCGTGTT AACGGTGCTC GTTACGTTCG TTGCTGCTCT CGTCGTTGAC TGCAGCCCGG G-3' ３）5'-ACGTTCA GAGTTCGGGC AGAAACGACG ACGGCAAGCG CAGATACCAC GACCTTCGAT GGATCCCATG GAATTCA-3' ４）5'-AATTCCC GGGCTGCAGT CAACGACGAG AGCAGCAACG AACGTAACGA GCACCGTTAA CACGGCAGTA ACCAGAGAA- 3' 各ＤＮＡ断片は、５’水酸基の保護基（トリチル基）を
つけたままで合成を終了し、アンモニアで固相から切り
出した後、ゲル瀘過カラム（セファデックスＧ−１０、
商品名）を用いてアンモニアを除去し、エタノール沈澱
にて回収した。その後、イオン交換カラム（Ｍｏｎｏ
Ｑ、商品名）クロマトグラフィーによりトリチル基のつ
いたオリゴヌクレオチドのみを分取した。得られた分画
を８０％酢酸で室温にて２０分間処理してトリチル基を
はずし、直ちにゲル瀘過カラムにて酢酸を除去した後、
エタノール沈澱によりオリゴヌクレオチドを回収した。合成遺伝子断片の作成 精製した、上記１）〜４）の各オリゴヌクレオチド（１
０nmol）を、５０mMトリス塩酸緩衝液（pH９．５）、１
０mM塩化マグネシウム、５mM２−ジチオスレイトール、
５％グリセロール、１mMｄＡＴＰ，Ｔ４キナーゼ１０単
位からなる混合液に、それぞれ加えて３７℃で３０分間
反応させて５’末端の水酸基を燐酸化した。次に、各溶
液を混合して６５℃で１５分間加熱してＴ４キナーゼを
不活化させ、各溶液を混合してからエタノール沈澱で回
収した。
【００１８】回収したオリゴヌクレオチド混合物を、９
０℃で５分間処理してオリゴヌクレオチドを熱変成させ
た後、室温にてゆっくりと冷却してアニールさせた。次
に、あらかじめＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断しておい
たｐＵＣ１１９を５０nmol加え、ライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて１６℃、１８時間で各オリゴヌ
クレオチド断片とｐＵＣ１１９ベクターとの間のライゲ
ーションを行った。この反応液１０μｌを、あらかじめ
ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１６６，５５７（１９８３））で作成しておいた
コンピテントな大腸菌ＪＭ１０９株１００μｌに加えて
４℃に３０分おいた後、４２℃で１．５分間処理し、４
℃に５分間おいてから、ＳＯＣ培地（２０ｇ／ｌトリプ
トン、５ｇ／ｌイースト−イクストラクト、０．５ｇ／
ｌ塩化ナトリウム、２．５mM塩化カリウム、１００mM塩
化マグネシウム、２０mMグルコース）８００μｌを加
え、３７℃で４０分間振盪培養した。その培養液を、１
００μｇ／ｌアンピシリンと１００mMのＩＰＴＧ（イソ
プロピルチオガラクトシド）が入ったＬＢプレートにま
き、３７℃で一晩培養した。生じた白いコロニーを採取
し、１００μｇ／ｌアンピシリンが入ったＬＢ（１０ｇ
トリプトン、５ｇイースト−イクストラクト、１０ｇ塩
化ナトリウム）２mlで一晩培養し、アルカリＳＤＳ法に
よりプラスミドを回収し、ＦａｃｔｏｒＸａ認識配列と
コルチコスタチン遺伝子を含むベクターｐＵ９ＸＣＳＩ
を得た。ジデオキシ法により挿入断片のシークエンシン
グを行い、挿入断片の塩基配列の確認を行った結果、図
１に示す本発明のＤＮＡ配列が挿入されていることが確
認された。
０℃で５分間処理してオリゴヌクレオチドを熱変成させ
た後、室温にてゆっくりと冷却してアニールさせた。次
に、あらかじめＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断しておい
たｐＵＣ１１９を５０nmol加え、ライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて１６℃、１８時間で各オリゴヌ
クレオチド断片とｐＵＣ１１９ベクターとの間のライゲ
ーションを行った。この反応液１０μｌを、あらかじめ
ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１６６，５５７（１９８３））で作成しておいた
コンピテントな大腸菌ＪＭ１０９株１００μｌに加えて
４℃に３０分おいた後、４２℃で１．５分間処理し、４
℃に５分間おいてから、ＳＯＣ培地（２０ｇ／ｌトリプ
トン、５ｇ／ｌイースト−イクストラクト、０．５ｇ／
ｌ塩化ナトリウム、２．５mM塩化カリウム、１００mM塩
化マグネシウム、２０mMグルコース）８００μｌを加
え、３７℃で４０分間振盪培養した。その培養液を、１
００μｇ／ｌアンピシリンと１００mMのＩＰＴＧ（イソ
プロピルチオガラクトシド）が入ったＬＢプレートにま
き、３７℃で一晩培養した。生じた白いコロニーを採取
し、１００μｇ／ｌアンピシリンが入ったＬＢ（１０ｇ
トリプトン、５ｇイースト−イクストラクト、１０ｇ塩
化ナトリウム）２mlで一晩培養し、アルカリＳＤＳ法に
よりプラスミドを回収し、ＦａｃｔｏｒＸａ認識配列と
コルチコスタチン遺伝子を含むベクターｐＵ９ＸＣＳＩ
を得た。ジデオキシ法により挿入断片のシークエンシン
グを行い、挿入断片の塩基配列の確認を行った結果、図
１に示す本発明のＤＮＡ配列が挿入されていることが確
認された。
【００１９】なお、図１の配列中、縦１本線は各合成オ
リゴヌクレオチド断片の境界を、１本線囲い枠内はＦａ
ｃｔｏｒＸａの認識配列を、下向き太線矢印はＦａｃｔ
ｏｒＸａによる切断部位を、２本線囲い枠内はウサギコ
ルチコスタチンを、下部が１本線で連結された縦２本線
は記載の制限酵素認識部位を示す。また、大文字は合成
オリゴヌクレオチド配列を表わす。発現ベクターの作成 発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア社製）をＢ
ａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断し、アガロース電気泳動後
ベクター部分を切り出して精製しておいたものと、ｐＵ
９ＸＣＳＩをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断し、インサ
ート部を同様に精製しておいたものの両者を前述の方法
でライゲーションし、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼの後ろにＦａｃｔｏｒＸａ認識配列とコルチコス
タチンがつながった融合蛋白質を生産する発現ベクター
ｐＧＸＣＳＩを得た。これをハナハンの方法により大腸
菌ＨＢ１０１株に形質転換し、形質転換体ＨＢ１０１
（ｐＧＸＣＳＩ）を得た。この形質転換体から再びプラ
スミドを抽出して塩基配列を調べたところ、図１に示す
ようにＢａｍＨＩからＥｃｏＲＩまでの配列が、グルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼと同じフレームで挿入
されていることが確認された。融合蛋白質の生産と精製 前培養しておいた形質転換株ＨＢ１０１（ｐＧＸＣＳ
Ｉ）を、３７℃に保温しておいた新鮮なＬＢで１０倍量
に希釈し、３７℃で５時間培養後、ＩＰＴＧを１mMにな
るように添加し、３７℃でさらに２時間培養した。培養
液を遠心分離して菌体を回収し、回収した菌体を超音波
破砕器を用いて破砕した。
リゴヌクレオチド断片の境界を、１本線囲い枠内はＦａ
ｃｔｏｒＸａの認識配列を、下向き太線矢印はＦａｃｔ
ｏｒＸａによる切断部位を、２本線囲い枠内はウサギコ
ルチコスタチンを、下部が１本線で連結された縦２本線
は記載の制限酵素認識部位を示す。また、大文字は合成
オリゴヌクレオチド配列を表わす。発現ベクターの作成 発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア社製）をＢ
ａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断し、アガロース電気泳動後
ベクター部分を切り出して精製しておいたものと、ｐＵ
９ＸＣＳＩをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断し、インサ
ート部を同様に精製しておいたものの両者を前述の方法
でライゲーションし、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼの後ろにＦａｃｔｏｒＸａ認識配列とコルチコス
タチンがつながった融合蛋白質を生産する発現ベクター
ｐＧＸＣＳＩを得た。これをハナハンの方法により大腸
菌ＨＢ１０１株に形質転換し、形質転換体ＨＢ１０１
（ｐＧＸＣＳＩ）を得た。この形質転換体から再びプラ
スミドを抽出して塩基配列を調べたところ、図１に示す
ようにＢａｍＨＩからＥｃｏＲＩまでの配列が、グルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼと同じフレームで挿入
されていることが確認された。融合蛋白質の生産と精製 前培養しておいた形質転換株ＨＢ１０１（ｐＧＸＣＳ
Ｉ）を、３７℃に保温しておいた新鮮なＬＢで１０倍量
に希釈し、３７℃で５時間培養後、ＩＰＴＧを１mMにな
るように添加し、３７℃でさらに２時間培養した。培養
液を遠心分離して菌体を回収し、回収した菌体を超音波
破砕器を用いて破砕した。
【００２０】この菌体破砕液は、グルタチオンカラム
（ファルマシア社製）に通し、融合蛋白質のみを回収し
た。これをセントリプレップ（アミコン社製）で濃縮、
脱塩した後、凍結乾燥して融合蛋白質を回収した。コルチコスタチンの切り出しと精製 凍結乾燥した融合蛋白質を、５０mMトリス塩酸緩衝液
（pH７．５）、１５０mMＮａＣｌ，１mMＣａＣｌ2 の溶
液に溶かし、ＦａｃｔｏｒＸａを０．１mg加えて２５℃
で５時間反応させ、融合蛋白質を切断した。つぎに、反
応液を逆相ＨＰＬＣで分離してコルチコスタチン画分を
回収し、凍結乾燥して精製ウサギコルチコスタチンを得
た。コルチコスタチンの確認 上記のようにして得られたペプチドは、有機合成法によ
って得られたウサギコルチコスタチンに対する抗血清と
反応し、ＨＰＬＣの保持時間も一致した。これにより、
両者はアミノ酸配列のみならず、その立体構造も同じで
あると判断された。
（ファルマシア社製）に通し、融合蛋白質のみを回収し
た。これをセントリプレップ（アミコン社製）で濃縮、
脱塩した後、凍結乾燥して融合蛋白質を回収した。コルチコスタチンの切り出しと精製 凍結乾燥した融合蛋白質を、５０mMトリス塩酸緩衝液
（pH７．５）、１５０mMＮａＣｌ，１mMＣａＣｌ2 の溶
液に溶かし、ＦａｃｔｏｒＸａを０．１mg加えて２５℃
で５時間反応させ、融合蛋白質を切断した。つぎに、反
応液を逆相ＨＰＬＣで分離してコルチコスタチン画分を
回収し、凍結乾燥して精製ウサギコルチコスタチンを得
た。コルチコスタチンの確認 上記のようにして得られたペプチドは、有機合成法によ
って得られたウサギコルチコスタチンに対する抗血清と
反応し、ＨＰＬＣの保持時間も一致した。これにより、
両者はアミノ酸配列のみならず、その立体構造も同じで
あると判断された。
【００２１】以上の実施例から、ベクター（ｐＵＣ１１
９）、コルチコスタチン遺伝子前半（オリゴヌクレオチ
ド断片１＋３）、コルチコスタチン遺伝子後半（オリゴ
ヌクレオチド断片２＋４）の３成分を一度にライゲーシ
ョン反応させても、正しく目的の構成物が得られること
が解った。従って、７０余の塩基からなるオリゴヌクレ
オチドの合成は、長さがかなりあるため合成収率の点で
不利なものの、ライゲーション反応の手間が一回ですむ
ため、結果的には効率的である。また、融合蛋白質の形
で生産させてもＦａｃｔｏｒＸａが切断部位を認識し、
完全な形のウサギコルチコスタチンが回収できることが
明らかになった。
９）、コルチコスタチン遺伝子前半（オリゴヌクレオチ
ド断片１＋３）、コルチコスタチン遺伝子後半（オリゴ
ヌクレオチド断片２＋４）の３成分を一度にライゲーシ
ョン反応させても、正しく目的の構成物が得られること
が解った。従って、７０余の塩基からなるオリゴヌクレ
オチドの合成は、長さがかなりあるため合成収率の点で
不利なものの、ライゲーション反応の手間が一回ですむ
ため、結果的には効率的である。また、融合蛋白質の形
で生産させてもＦａｃｔｏｒＸａが切断部位を認識し、
完全な形のウサギコルチコスタチンが回収できることが
明らかになった。
【００２２】
【発明の効果】本発明の塩基配列を用いることにより、
大腸菌にとって最適化されたウサギコルチコスタチン遺
伝子を構築することが可能となり、発現ベクターにこれ
を組み込むことにより、醗酵法によるウサギコルチコス
タチンの大量生産を大腸菌等の菌体を用いて行うことが
できる。これにより、多大な労力と時間を消費するｃＤ
ＮＡの単離が必要ない上、ｃＤＮＡを用いた遺伝子発現
の場合にしばしば見られるように発現が十分には行われ
ないといったことが無い。
大腸菌にとって最適化されたウサギコルチコスタチン遺
伝子を構築することが可能となり、発現ベクターにこれ
を組み込むことにより、醗酵法によるウサギコルチコス
タチンの大量生産を大腸菌等の菌体を用いて行うことが
できる。これにより、多大な労力と時間を消費するｃＤ
ＮＡの単離が必要ない上、ｃＤＮＡを用いた遺伝子発現
の場合にしばしば見られるように発現が十分には行われ
ないといったことが無い。
【００２３】
配列番号：１ 配列の長さ：１０４ 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTATCTGCG CTTGCCGTCG TCGTTTCTGC CCGAACTCT GAACGTTTCT CTGGTTACTG TCGTGTTAAC GGTGCTCGTT ACGTTCGTTG CTGCTCTCG TCGT
【図１】実施例により作成された合成遺伝子断片を示
す。
す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年４月２０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】
【従来の技術】ウサギコルチコスタチンは、ウサギの
肺、脾臓などにおいて見いだされる３４個のアミノ酸か
らなるペプチドで、抗菌性ペプチドであるディフェンシ
ン類の一種として発見された（特開昭６０−２４６３９
８号公報）が、その後、ラットなどにおいて副腎皮質刺
激ホルモン（ＡＣＴＨ）に対する拮抗作用を有している
ことが明らかになっている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５９２−５９６（１９８
８））。コルチコスタチンの抗ＡＣＴＨ作用は、副腎皮
質におけるＡＣＴＨ刺激によるコルチコステロン生産を
抑制する作用も報告されている。
肺、脾臓などにおいて見いだされる３４個のアミノ酸か
らなるペプチドで、抗菌性ペプチドであるディフェンシ
ン類の一種として発見された（特開昭６０−２４６３９
８号公報）が、その後、ラットなどにおいて副腎皮質刺
激ホルモン（ＡＣＴＨ）に対する拮抗作用を有している
ことが明らかになっている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５９２−５９６（１９８
８））。コルチコスタチンの抗ＡＣＴＨ作用は、副腎皮
質におけるＡＣＴＨ刺激によるコルチコステロン生産を
抑制する作用も報告されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】
【実施例】以下に実施を挙げ本発明をさらに具体的に説
明するが、本発明はこれらによって制限されるものでな
い。合成ＤＮＡ断片の作成 本発明のＤＮＡ配列の前後に、制限酵素認識部位、配列
特異的エンドペプチダーゼＦａｃｔｏｒＸａの認識配列
（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）に相当するＤＮＡ
部位、および終止コドンを付加したＤＮＡ配列を、以下
の４断片に分けて合成した。合成にはＤＮＡ合成機（フ
ァルマシア社製、Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｐｌ
ｕｓ）を用い、ホスホルアミダイト法による固相合成を
行った。 １）5'-AGCTTGA ATTCCATGGG ATCCATCGAA GGTCGTGGTA TCTGCGCTTG CCGTCGTCGT TTCTGCCCGA ACTCT-3' ２）5'-GAACGTT TCTCTGGTTA CTGCCGTGTT AACGGTGCTC GTTACGTTCG TTGCTGCTCT CGTCGTTGAC TGCAGCCCGG G-3' ３）5'-ACGTTCA GAGTTCGGGC AGAAACGACG ACGGCAAGCG CAGATACCAC GACCTTCGAT GGATCCCATG GAATTCA-3' ４）5'-AATTCCC GGGCTGCAGT CAACGACGAG AGCAGCAACG AACGTAACGA GCACCGTTAA CACGGCAGTA ACCAGAGAA- 3' 各ＤＮＡ断片は、５’水酸基の保護基（ジメトキシトリ
チル基）をつけたままで合成を終了し、アンモニアで固
相から切り出した後、ゲル瀘過カラム（セファデックス
Ｇ−１０、商品名）を用いてアンモニアを除去し、エタ
ノール沈澱にて回収した。その後、イオン交換カラム
（ＭｏｎｏＱ、商品名）クロマトグラフィーによりトリ
チル基のついたオリゴヌクレオチドのみを分取した。得
られた分画を８０％酢酸で室温にて２０分間処理して上
記トリチル基をはずし、直ちにゲル瀘過カラムにて酢酸
を除去した後、エタノール沈澱によりオリゴヌクレオチ
ドを回収した。合成遺伝子断片の作成 精製した、上記１）〜４）の各オリゴヌクレオチド（１
０nmol）を、５０mMトリス塩酸緩衝液（pH９．５）、１
０mM塩化マグネシウム、５mM２−ジチオスレイトール、
５％グリセロール、１mMｄＡＴＰ，Ｔ４キナーゼ１０単
位からなる混合液に、それぞれ加えて３７℃で３０分間
反応させて５’末端の水酸基を燐酸化した。次に、各溶
液を混合して６５℃で１５分間加熱してＴ４キナーゼを
不活化させ、各溶液を混合してからエタノール沈澱で回
収した。
明するが、本発明はこれらによって制限されるものでな
い。合成ＤＮＡ断片の作成 本発明のＤＮＡ配列の前後に、制限酵素認識部位、配列
特異的エンドペプチダーゼＦａｃｔｏｒＸａの認識配列
（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）に相当するＤＮＡ
部位、および終止コドンを付加したＤＮＡ配列を、以下
の４断片に分けて合成した。合成にはＤＮＡ合成機（フ
ァルマシア社製、Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｐｌ
ｕｓ）を用い、ホスホルアミダイト法による固相合成を
行った。 １）5'-AGCTTGA ATTCCATGGG ATCCATCGAA GGTCGTGGTA TCTGCGCTTG CCGTCGTCGT TTCTGCCCGA ACTCT-3' ２）5'-GAACGTT TCTCTGGTTA CTGCCGTGTT AACGGTGCTC GTTACGTTCG TTGCTGCTCT CGTCGTTGAC TGCAGCCCGG G-3' ３）5'-ACGTTCA GAGTTCGGGC AGAAACGACG ACGGCAAGCG CAGATACCAC GACCTTCGAT GGATCCCATG GAATTCA-3' ４）5'-AATTCCC GGGCTGCAGT CAACGACGAG AGCAGCAACG AACGTAACGA GCACCGTTAA CACGGCAGTA ACCAGAGAA- 3' 各ＤＮＡ断片は、５’水酸基の保護基（ジメトキシトリ
チル基）をつけたままで合成を終了し、アンモニアで固
相から切り出した後、ゲル瀘過カラム（セファデックス
Ｇ−１０、商品名）を用いてアンモニアを除去し、エタ
ノール沈澱にて回収した。その後、イオン交換カラム
（ＭｏｎｏＱ、商品名）クロマトグラフィーによりトリ
チル基のついたオリゴヌクレオチドのみを分取した。得
られた分画を８０％酢酸で室温にて２０分間処理して上
記トリチル基をはずし、直ちにゲル瀘過カラムにて酢酸
を除去した後、エタノール沈澱によりオリゴヌクレオチ
ドを回収した。合成遺伝子断片の作成 精製した、上記１）〜４）の各オリゴヌクレオチド（１
０nmol）を、５０mMトリス塩酸緩衝液（pH９．５）、１
０mM塩化マグネシウム、５mM２−ジチオスレイトール、
５％グリセロール、１mMｄＡＴＰ，Ｔ４キナーゼ１０単
位からなる混合液に、それぞれ加えて３７℃で３０分間
反応させて５’末端の水酸基を燐酸化した。次に、各溶
液を混合して６５℃で１５分間加熱してＴ４キナーゼを
不活化させ、各溶液を混合してからエタノール沈澱で回
収した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】回収したオリゴヌクレオチド混合物を、９
０℃で５分間処理してオリゴヌクレオチドを熱変成させ
た後、室温にてゆっくりと冷却してアニールさせた。次
に、あらかじめＨｉｎｄIII とＥｃｏＲＩで切断してお
いたｐＵＣ１１９を５０nmol加え、ライゲーションキッ
ト（宝酒造社製）を用いて１６℃、１８時間で各オリゴ
ヌクレオチド断片とｐＵＣ１１９ベクターとの間のライ
ゲーションを行った。この反応液１０μｌを、あらかじ
めハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１６６，５５７（１９８３））で作成しておい
たコンピテントな大腸菌ＪＭ１０９株１００μｌに加え
て４℃に３０分おいた後、４２℃で１．５分間処理し、
４℃に５分間おいてから、ＳＯＣ培地（２０ｇ／ｌトリ
プトン、５ｇ／ｌイースト−イクストラクト、０．５ｇ
／ｌ塩化ナトリウム、２．５mM塩化カリウム、１００mM
塩化マグネシウム、２０mMグルコース）８００μｌを加
え、３７℃で４０分間振盪培養した。その培養液を、１
００μｇ／ｌアンピシリンと１００μＭのＩＰＴＧ（イ
ソプロピルチオガラクトシド）が入ったＬＢプレートに
まき、３７℃で一晩培養した。生じた白いコロニーを採
取し、１００m g ／ｌアンピシリンが入ったＬＢ（１０
ｇトリプトン、５ｇイースト−イクストラクト、１０ｇ
塩化ナトリウム）２mlで一晩培養し、アルカリＳＤＳ法
によりプラスミドを回収し、ＦａｃｔｏｒＸａ認識配列
とコルチコスタチン遺伝子を含むベクターｐＵ９ＸＣＳ
Ｉを得た。ジデオキシ法により挿入断片のシークエンシ
ングを行い、挿入断片の塩基配列の確認を行った結果、
図１に示す本発明のＤＮＡ配列が挿入されていることが
確認された。
０℃で５分間処理してオリゴヌクレオチドを熱変成させ
た後、室温にてゆっくりと冷却してアニールさせた。次
に、あらかじめＨｉｎｄIII とＥｃｏＲＩで切断してお
いたｐＵＣ１１９を５０nmol加え、ライゲーションキッ
ト（宝酒造社製）を用いて１６℃、１８時間で各オリゴ
ヌクレオチド断片とｐＵＣ１１９ベクターとの間のライ
ゲーションを行った。この反応液１０μｌを、あらかじ
めハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１６６，５５７（１９８３））で作成しておい
たコンピテントな大腸菌ＪＭ１０９株１００μｌに加え
て４℃に３０分おいた後、４２℃で１．５分間処理し、
４℃に５分間おいてから、ＳＯＣ培地（２０ｇ／ｌトリ
プトン、５ｇ／ｌイースト−イクストラクト、０．５ｇ
／ｌ塩化ナトリウム、２．５mM塩化カリウム、１００mM
塩化マグネシウム、２０mMグルコース）８００μｌを加
え、３７℃で４０分間振盪培養した。その培養液を、１
００μｇ／ｌアンピシリンと１００μＭのＩＰＴＧ（イ
ソプロピルチオガラクトシド）が入ったＬＢプレートに
まき、３７℃で一晩培養した。生じた白いコロニーを採
取し、１００m g ／ｌアンピシリンが入ったＬＢ（１０
ｇトリプトン、５ｇイースト−イクストラクト、１０ｇ
塩化ナトリウム）２mlで一晩培養し、アルカリＳＤＳ法
によりプラスミドを回収し、ＦａｃｔｏｒＸａ認識配列
とコルチコスタチン遺伝子を含むベクターｐＵ９ＸＣＳ
Ｉを得た。ジデオキシ法により挿入断片のシークエンシ
ングを行い、挿入断片の塩基配列の確認を行った結果、
図１に示す本発明のＤＮＡ配列が挿入されていることが
確認された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/70 // Ａ６１Ｋ 35/28 7431−4Ｃ 35/42 Ａ 7431−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 7/10 8318−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 99:00
Claims (2)
- 【請求項１】 配列番号１に示されるウサギコルチコス
タチンをコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡ配列を含んでな
る発現ベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4048626A JPH05244954A (ja) | 1992-03-05 | 1992-03-05 | ウサギコルチコスタチンをコードするｄｎａ配列 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4048626A JPH05244954A (ja) | 1992-03-05 | 1992-03-05 | ウサギコルチコスタチンをコードするｄｎａ配列 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05244954A true JPH05244954A (ja) | 1993-09-24 |
Family
ID=12808609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4048626A Withdrawn JPH05244954A (ja) | 1992-03-05 | 1992-03-05 | ウサギコルチコスタチンをコードするｄｎａ配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05244954A (ja) |
-
1992
- 1992-03-05 JP JP4048626A patent/JPH05244954A/ja not_active Withdrawn
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