JP3319605B2 - ストレプトミセスにおける外来タン白質の製造法 - Google Patents

ストレプトミセスにおける外来タン白質の製造法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】公開番号（ＥＰ−Ａ）0,289,936 の欧州特
許出願公報は、所望なタンパク質の構造遺伝子を必要に
応じて修飾されたテンダミスタット(tendamistat) 遺伝
子のコード鎖の３′−末端連結し、ストレプトミセス(s
treptomyces)宿主細胞中でこの遺伝子構造物を発現さ
せ、上清から、分泌された融合タンパク質を単離するこ
とによる融合タンパク質の産生を開示している。好まし
い態様では、テンダミスタット遺伝子は３′−末端で切
り詰められる。切り詰めには、トリプレット31および32
の領域における制限酵素BstEII、トリプレット43および
44の領域におけるStuI、およびトリプレット52および53
の領域におけるSau3A の切断部位が用いられる。
【０００２】この発明の概念の更なる展開においては、
Ｃ−鎖が唯１または２個のリシン残基から成る切り詰め
られたプロインシュリン（「ミニ−プロインシュリン）
がテンダミスタット部分の後に続く融合タンパク質を産
生させることが既に提案されている。提案されているも
う一つの更なる展開は、この種の融合タンパク質中のテ
ンダミスタット部分をも切り詰めることである（1990年
5 月9 日公開の欧州特許出願公開第0,367,163 号公
報）。
【０００３】驚くべきことには、テンダミスタット部分
が極めて短い融合タンパク質はストレプトミセス細胞中
で安定でありかつ培地中に分泌されることを見出した。
この方法で得られる融合タンパク質は、テンダミスタッ
ト鎖が極めて短いため「成熟」タンパク質のような挙動
を示し、一般に正しい三次構造で培地中に存在する。
【０００４】欧州特許出願公開第0,177,827 号公報に
は、発現系における輸送タンパク質の合成シグナル配列
であって、ＤＮＡが実質的に天然のシグナル配列と同じ
であるがエンドヌクレアーゼに対する１個またはそれ以
上の切断部位を有し、これらの部位は天然のＤＮＡには
含まれないもの、が開示されている。輸送されるタンパ
ク質の遺伝子がこのようなＤＮＡ配列に結合すると、こ
の融合遺伝子はベクター中に組み込まれ、細胞質から発
現されたタンパク質を輸送する宿主細胞がこれによって
形質転換され、原核および真核細胞中で真核、原核生物
またはウイルスのタンパク質を産生することが可能であ
る。一例としてペリプラズムタンパク質アルカリ性ホス
ファターゼを用いると、プレ配列の直ぐ下流で且つ所望
なタンパク質の構造遺伝子の上流にアルカリ性ホスファ
ターゼのおよその最初の40個のアミノ酸のコドンを配置
することがE. coli での発現に有利であることが示され
る。しかしながら、多くの場合には若干の数の追加のア
ミノ酸、例えば約10個、好ましくは約5 個のアミノ酸で
十分である。シミアンプロインシュリンと対応する融合
タンパク質の約90％が、ペリプラズム空間に輸送され
た。
【０００５】融合タンパク質のバラスト部分をコードす
る混合オリゴヌクレオチドを構築し、このオリゴヌクレ
オチドをベクター中に導入して、調節領域および所望な
タンパク質の構造遺伝子に機能的に連結させ、この方法
で得たこのプラスミド個体群で好適な宿主細胞を形質転
換し、高収率のコード化された融合タンパク質を示すク
ローンを選択することによって融合タンパク質を産生さ
せることも提案されている（WO 91/03550 、1991年3 月
21日公開）。このオリゴヌクレオチドは、この場合には
4 〜12のトリプレット、特に4 〜8 のトリプレットから
成るのが好ましい。
【０００６】短いバラスト部分を有する融合タンパク質
を産生させることが既に試みられて来ている。例えば、
β−ガラクトシダーゼの最初の10個のアミノ酸とソマト
スタチンからの融合タンパク質をコードする遺伝子融合
体が作られた。しかしながら、この短いβ−ガラクトシ
ダーゼフラグメントは内因性宿主プロテアーゼによる消
化から融合タンパク質を保護するには十分でないことが
明らかになった（米国特許第4,366,246 号公報、第15
欄、第2 節）。したがって、バラスト部分が250 個を上
回るアミノ酸を有するβ−ガラクトシダーゼフラグメン
トから成る融合タンパク質が、欧州特許出願公開第0,29
0,005 号公報および同第0,292,763 号公報に記載されて
いる。
【０００７】しかしながら、テンダミスタットの最初の
約10個のアミノ末端アミノ酸と所望なタンパク質、例え
ばプロインシュリンとの融合タンパク質は、実際にスト
レプトミセス宿主細胞中で予期せぬほど安定であり、培
地中に分泌され、この培地からそれらを高収率で単離す
ることができる。驚くべきことには、これは「ミニ−プ
ロインシュリン」のような比較的小さなタンパク質につ
いても真実である。
【０００８】「約10個のアミノ酸」とは、この場合には
これよりも少ない数のアミノ酸、例えばテンダミスタッ
トの最初の7 個のＮ−末端アミノ酸でも好適であるが、
好ましくは10個より大きくないことを意味する。テンダ
ミスタット部分のプロリンが（天然の配列と同様に）7
および／または9 位に存在する融合タンパク質が好まし
い。しかしながら、既知または提案された態様によれ
ば、更に大きなテンダミスタットバラスト部分を選択す
ることも可能であることは勿論であるが、低「バラス
ト」の利点がますます失われることも勿論である。
【０００９】テンダミスタット部分の天然アミノ酸配列
を変更すること、すなわちアミノ酸を交換または欠失さ
せまたは天然のアミノ酸配列には生じないアミノ酸を挿
入することが可能であり且つ有利でもある。更に、シグ
ナルペプチド中のアミノ酸配列を変更することが可能で
ある。
【００１０】発明の概念が知られているときには、簡単
な予備実験によって特に有利な融合構造を容易に決定す
ることができる。
【００１１】例えばバチルスまたはブドウ球菌細胞のよ
うな他のグラム陽性菌細胞中で、これらの宿主によって
「認識」されるシグナル配列を用いて発明の概念を実現
することも可能である。
【００１２】本発明によって得られる融合タンパク質
は、培地中に溶解した形態で存在し、これはプロセシン
グおよび精製において多くの利点を有する。従って例え
ば、バラスト部分の切断による酵素的プロセシングが分
泌生成物に直ちに起こり、不溶性の融合タンパク質に必
要な処理工程は行う必要がない。アフィニティクロマト
グラフィ、或いは限外濾過、沈澱、イオン交換クロマト
グラフィ、吸着クロマトグラフィ、ゲル濾過または高圧
液体クロマトグラフィのような濃縮または精製処理を最
初に更なるプロセシングの前に行うことも可能である。
【００１３】下記の例において、本発明を更に詳細に説
明する。
【００１４】プラスミド構築の出発材料は、欧州特許出
願公開第0,367,163 号公報に提案されたプラスミドpKK5
00である。このプラスミドは、プロインシュリン遺伝子
がＣ鎖の代わりに、単にアミノ酸リシンをコードするだ
けの類似の遺伝子によって置換されており且つターミネ
ーター配列がこの「ミニ−プロインシュリン」遺伝子の
直ぐ下流に挿入されているという点で欧州特許出願公開
第0,289,936 号公報から知られているプラスミドpKK400
とは異なる。欧州特許出願公開第0,367,163 号公報から
の表１および２は「ミニ−プロインシュリン」遺伝子お
よびターミネーター配列がそれぞれ示されており、この
説明に対する追加物として包含される。
【００１５】プラスミドpKK400およびpKK500は（トリプ
レット-5〜-7の領域における）α−アミラーゼインヒビ
ター遺伝子のシグナル配列中にXmaIII切断部位を含む。
【００１６】
【実施例】例１ プラスミドpKK500を制限酵素EcoRI およびXamIIIで開裂
させ、大きなフラグメントを0.8 ％アガロースゲル上で
ゲル電気泳動によって分離し、電気溶出(electroelutio
n)によって単離する。このフラグメントを、ホスホラミ
ダイト(phosphoramidite) 法によって合成されたＤＮＡ
フラグメント(1) （配列番号：1 、図１） と連結して、この連結混合物をE. coli 中に形質転換す
る。プラスミドpKK510が得られる。このプラスミドは、
テンダミスタットのシグナル配列の後にテンダミスタッ
トの最初の7 個のアミノ酸が続き、この後にミニ−プロ
インシュリン鎖が続いているプレプロインシュリンをコ
ードする。
【００１７】例２ プラスミドpKK400を発現プラスミドpGF1に転移させるた
めの欧州特許出願公開第0,289,936 号公報に記載の方法
と同様に、プラスミドpKK510を発現プラスミドpKF1に移
転させる。pKK510の単離されたプラスミドＤＮＡを制限
酵素SphIおよびSstIで切断し、融合遺伝子を有する小さ
なフラグメントを単離する。市販の発現プラスミドpIJ7
02 （ジョン・インズ・ファンデーション(John Innes F
oundation) 、ノリッジ(Norwich) から入手可能）を同
じ酵素で切断し、大きなフラグメントを単離する。これ
らの２種類の単離されたフラグメントを連結させ、連結
混合物をS. Lividans TK24中に形質転換させ、このプラ
スミドをチオストレプトン耐性の白色（すなわち、メラ
ニンを形成することができない）形質転換体から単離さ
せる。導入された挿入物を有するクローンを、振盪培養
物中での融合タンパク質の形成について試験を行う。コ
ード化された融合タンパク質は、それ自体既知の方法で
発現させるが、形質転換株を25℃を上回る温度で振盪フ
ラスコ中で4 日間インキュベーションし、菌糸体を遠心
分離によって培養溶液から分離すると、15％ポリアクリ
ルアミドゲル中での20μｌの培養濾液の電気泳動の後
に、菌株をpIJ702のみで形質転換したコントロール実験
では生じない追加のタンパク質バンドとして培養上清中
に形成された融合タンパク質をクーマシーブルー(COOMA
SSIE Blue)（登録商標）で染色することによって目に見
えるようにすることが可能である。培養濾液をリシンエ
ンドプロテイナーゼで処理すると、デ(de)− (B30)−Th
r −インシュリンを検出することが可能であり、これは
ゲル電気泳動での真正のコントロールによって証明され
る。更に、免疫ブロットでのインシュリン抗体でまたは
インシュリンＲＩＡで培養濾液中の融合タンパク質を検
出することが可能である。
【００１８】 を用いることを除き例１および２による方法を行い、こ
の方法でそれぞれpKK320およびpKF2を得る。これらのプ
ラスミドは、テンダミスタットの最初の7 個のアミノ酸
の後に（天然のアミノ酸のアラニンの代わりに）アスパ
ラギンが続き、且つこの後にテンダミスタット中の第９
のアミノ酸プロリンが続くという点で例１および２によ
るものと異なる融合タンパク質をコードする。従って、
アラニンをアスパラギンに代えることによって、融合タ
ンパク質のバラスト部分に追加の正の電荷が導入される
のである。驚くべきことには、例２におけるよりも約20
〜30％高い収率が得られる。
【００１９】 を用いることを除き例１および２による方法を行い、こ
の方法によればそれぞれpKK330およびpKF2が得られる。
これらのプラスミドは、テンダミスタットの最初の9 個
の天然アミノ酸をコードする点で例１および２によるも
のと異なる。例２と比較すると、約10％高い収率が得ら
れる。
【００２０】例５ pKK500によってコード化される融合タンパク質はテンダ
ミスタット部分とプロインシュリンのＢ鎖との間にアミ
ノ酸Asn-Ser-Asn-Gly-Lys をコードするリンカー配列を
含む。この末端Lys とＣ鎖を表わすLys を、下記のよう
にArg によって置換する。この処理法では、プロインシ
ュリンにおけるコドンB30 〜A1の領域における単一のSt
yI切断部位が用いられる。pKK500から単離されたプラス
ミドＤＮＡをStyIを用いて切断し、S1ヌクレアーゼで消
化して突出末端を除去し、過剰のヌクレアーゼをフェノ
ール−クロロホルムを用いて抽出する。次に、線状化し
たプラスミドをEcoRI で切断し、大きなフラグメントを
電気泳動で分離し、電気溶出によって単離する。このフ
ラグメントを合成フラグメント(4) （配列番号：４、図
４） B1 10 Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His AAT TCG AAC GGC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC GC TTG CCG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG (EcoRI) 20 30 Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC GAG CAC CTC CGG GAG ATG CAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG B30 C(B31) Tyr Thr Pro Lys Thr Arg TAC ACC CCC AAG ACC CGC ATG TGG GGG TTC TGG GCG と連結して、この連結混合物をE. coli 中に形質転換す
る。所望なクローンを新たに展開されたSstII 切断部位
を用いて、含まれるプラスミドの制限分析によって試験
する。更に、全SphI-SstI フラグメントを配列決定す
る。コード化された融合タンパク質を発現させるため
に、配列分析によって確認されたフラグメントをベクタ
ーpIJ 702 に連結させ、これを同じ酵素で切断して、発
現ベクターpGF4を生成させる。pGF4によってコード化さ
れた分泌される融合タンパク質は、一方ではα−アミラ
ーゼインヒビタープレート試験（欧州特許出願公開第0,
161,629 号公報、例３）によって検出することができ、
他方では例２と同様に振盪培養液の上清から検出するこ
とができる。
【００２１】例６ 例５と同様に、フラグメント(4) をベクターpKK510、52
0 および530 に挿入すると、ベクターpKK610、620およ
び630 が得られる。融合タンパク質のコード配列を有す
るそれぞれのSphI−SstIフラグメントをベクターpIJ 70
2 に組み込むと、発現ベクターpKF11 、12および13を生
成する。分泌された融合タンパク質の発現を、例２と同
様にして試験する。
【００２２】例７ プラスミドpIJ 702 の誘導体の発現を増加させるため
に、メラニンプロモーターをPstIおよびSphIで消化する
ことによってそこから欠失させ、合成フラグメント(5)
（配列番号：５、図５） PstI BclI 10 20 30 40 50 CTGCAGTGATCAGGGGGACCCTTGTGCGAATTTCCGTTACGGGTTTGGGTGGTAGGG GACGTCACTAGTCCCCCTGGGAACACGCTTAAAGGCAATGCCCAAACCCACCATCCC SphI 60 70 80 ACGCACCCGAAGAGGAGGCCCCAGCATGC TGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG によって置換する。合成およびテンダミスタットプロモ
ーターのタンデム構造物がこれによって得られる。この
プラスミドをｐＧＲ１１０と呼ぶ。合成フラグメント
(1) 、(2) および(3) をSphIおよびSstIで切断した後に
pGR110に挿入すると、発現ベクターpGR200、210 および
220 を生じる。同様な方法で、発現ベクターpGR250、26
0 および270 がフラグメント(4) を用いて得られる。
【００２３】例８ トリプシンまたは同様な効果を有する酵素とカルボキシ
ペプチダーゼＢとを結合するさせることによってインシ
ュリン前駆体からヒトインシュリンを生じさせようとす
るときには、切断反応の経過中にバラスト部分を速やか
に切断して切断反応をB31 (Arg) −インシュリンへと導
くようにするのが有利である。このためには、アミノ酸
B1 (Phe)の上流のアミノ酸を修飾するのが好適である。
この処理法は例１と同様であり、プラスミドpKK500を制
限酵素EcoRI およびDraIIIを用いて開裂させる。最初の
フラグメントを、次にホスホラミダイト法によって合成
したＤＮＡフラグメント(6) （配列番号：６、図６） B1 Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu 5' AAT TCG GCC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC CTC 3' 3' GC CGG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG 5' (EcoRI) (DraIII) によって置換する。E. coli 中へのクローニングおよび
Streptomyces lividans 中での発現は、それぞれ例１お
よび例２にしたがって行う。プラスミドpKK640および発
現プラスミドpKF14 を生じる。（フラグメント(4) の組
み込みの後に）例５にしたがって生じるプラスミドは、
同様な方法で処理することができる。この方法では、プ
ラスミドpKK650およびpKF15 が得られる。
【００２４】（欧州特許出願公開第0,367,163 号公報か
らの）添付物：
【表１】
【表２】
【配列表】
【００２５】配列番号：１ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド 配列の長さ：44塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 G GCC GGG CCG GCC TCC GCC GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCG CCC GCG CGG AGG CGG CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC TTA A Ala Gly Pro Ala Ser Ala Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asn -5 1 5
【００２６】配列番号：２ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド 配列の長さ：50塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 G GCC GGG CCG GCC TCC GCC GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GAC CCG CCC GGG CGG AGG CGG CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGG CTG GCC TTA A Ala Gly Pro Ala Ser Ala Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro Asn -5 1 5 10
【００２７】配列番号：３ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド 配列の長さ：50塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 G GCC GGG CCG GCC TCC GCC GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCG CCC GGC CGG AGG CGG CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGG CGT GGC TTA A Ala Gly Pro Ala Ser Ala Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Ala Pro Asn -5 1 5
【００２８】配列番号：４ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド 配列の長さ：108 塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列 AAT TCG AAC GGC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC GC TTG CCG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His 5 10 15 CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe 20 25 30 TAC ACC CCC AAG ACC CGC ATG TGG GGG TTC TGG GCG Tyr Thr Pro Lys Thr Arg 35
【００２９】配列番号：５配列の型：ヌクレオチド配列
の長さ：86塩基鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状フラ
グメント型：中間部フラグメント配列の種類：他の核酸
合成ＤＮＡ配列 CTGCAGTGAT CAGGGGGACC CTTGTGCGAA TTTCCGTTAC GGGTTTGGGT GGTAGGGACG 60 CACCCGAAGA GGAGGCCCCA GCATGC 86
【００３０】配列番号：６ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド 配列の長さ：45塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAT TCG GCC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC CTC GC CGG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu 5 10 15
【図面の簡単な説明】
【図１】例１における合成ＤＮＡフラグメント（１）の
ヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説
明図。
【図２】例３における合成フラグメント（２）のヌクレ
オチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説明図。
【図３】例４における合成フラグメント（３）のヌクレ
オチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説明図。
【図４】例５における合成フラグメント（４）のヌクレ
オチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説明図。
【図５】例７における合成フラグメント（５）のヌクレ
オチド配列を示す説明図。
【図６】例８における合成ＤＮＡフラグメント（６）の
ヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説
明図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (56)参考文献 特開 平１−39554（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/67 - 15/90 C07K 19/00 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】所望なタン白質に対する構造遺伝子をテン
    ダミスタットのシグナル配列および最初の７〜10個のア
    ミノ末端アミノ酸のコドンに連結し、この遺伝子構造物
    をストレプトミセス宿主細胞中で発現させ、上清から、
    分泌された融合タン白質を単離して、テンダミスタット
    遺伝子配列を修飾することが可能であることを特徴とす
    る、融合タン白質の製造法。
  2. 【請求項２】テンダミスタットのシグナル配列および最
    初の７〜10個のコドンおよび他のタンパク質の構造遺伝
    子を含む融合遺伝子。
  3. 【請求項３】アミノ酸のコドンがテンダミスタット部分
    で欠失、交換または付加された、請求項２記載の融合遺
    伝子。
  4. 【請求項４】リンカー配列がテンダミスタット遺伝子と
    所望なタン白質の構造遺伝子との間に配置される、請求
    項２または３記載の融合遺伝子。
  5. 【請求項５】請求項２、３または４に記載の融合遺伝子
    を含むベクター。
  6. 【請求項６】請求項５記載のベクターを含むストレプト
    ミセス細胞。
  7. 【請求項７】テンダミスタットの最初の７〜10個のアミ
    ノ酸のＮ−末端部分が、所望なタン白質に連結されてい
    ることを特徴とする、融合タン白質。
  8. 【請求項８】テンダミスタットの最初の７〜10個のアミ
    ノ酸のＮ−末端部分が、ブリッジ配列を介して所望なタ
    ン白質に連結されていることを特徴とする、請求項７記
    載の融合タン白質。
  9. 【請求項９】請求項７記載の融合タン白質または請求項
    １記載の方法で得ることができる融合タン白質を切断す
    ることを特徴とする、所望なタン白質の製造方法。
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