PL169178B1 - Sposób wytwarzania fuzji bialkowych PL PL - Google Patents

Sposób wytwarzania fuzji bialkowych PL PL

Info

Publication number
PL169178B1
PL169178B1 PL91289953A PL28995391A PL169178B1 PL 169178 B1 PL169178 B1 PL 169178B1 PL 91289953 A PL91289953 A PL 91289953A PL 28995391 A PL28995391 A PL 28995391A PL 169178 B1 PL169178 B1 PL 169178B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
tendamistat
gene
ggc
amino acids
plasmid
Prior art date
Application number
PL91289953A
Other languages
English (en)
Other versions
PL289953A1 (en
Inventor
Klaus-Peter Koller
Guenther Rieb
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of PL289953A1 publication Critical patent/PL289953A1/xx
Publication of PL169178B1 publication Critical patent/PL169178B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Sposób wytwarzania fuzji bialkowych, znamienny tym, ze gen strukturalny pozadanego bialka sprzega sie z kodonami sekwencji sygnalowej i kodonami okolo dziesieciu pierwszych aminoterminalnych aminokwasów sekwencji lacznikowej, te strukture genu wprowadza sie do wektora Streptomycetes, ten wektor-hybryd doprowadza sie do ekspresji w komórce gospoda- rza Streptomycetes i wydzielana fuzje bialkowa izoluje sie z podloza, przy czym sekwencje genów odcinka lacznikowego (Tendamistat) moga byc modyfikowane. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania fuzji białkowych.
Z europejskiego zgłoszenia patentowego opublikowanego pod numerem (EP-A) 0 289 936 wiadomo, że fuzje białkowe wytwarza się w ten sposób, że gen strukturalny pożądanego białka sprzęga się na końcu 3' kodującej nici ewentualnie zmodyfikowanego genu odcinka łącznikowego (Tendamistat-Gen), tę strukturę genową doprowadza się do ekspresji w Streptomycetes jako komórce gospodarza i wydzielaną fuzję białkową izoluje się z podłoża. Wyróżnia się sposób, w którym gen odcinka łącznikowego (Tendamistat-Gen) zostaje skrócony na końcu 3'. Celem skrócenia ustala się miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych w zakresie trypletu 31 i 32 dla BstEII, w zakresie trypletu 43 i 44 dla StuI oraz w zakresie trypletu 52 i 53 dla Sau3A.
Rozwijając dalej koncepcję tego wynalazku zakłada się, aby wytwarzać fuzję białkową, w której po części łącznikowej (Tendamistat-Anteil) następuje skrócona proinsulina, której łańcuch C składa się tylko z jednej lub dwu reszt lizyny („miniproinsulina). Jako dalsze rozwinięcie założono, ze w tego rodzaju fuzjach białkowych również część łącznikowa (Tendamistat-Anteil) jest skrócona (zgłoszenie patentowe opublikowane 9.5.1990, EP-A 0 367 163).
Obecnie stwierdzono nieoczekiwanie, że fuzje białkowe z bardzo krótką częścią łącznikową (Tendamistat-Anteil) w komórkach Streptomycetes są stabilne i są wyrzucane do podłoża. Tak otrzymane fuzje białkowe, z powodu bardzo krótkiego łańcucha łącznikowego (TendamistatKette), zachowują się jak „dojrzałe białka i występują w podłożu ogólnie biorąc we właściwej strukturze trzeciorzędowej.
Sposób wytwarzania fuzji białkowych według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen strukturalny pożądanego białka sprzęga się z kodonami sekwencji sygnałowej i kodonami około dziesięciu pierwszych aminoterminalnych aminokwasów sekwencji łącznikowej (Tendamistat), tę strukturę genu wprowadza się do wektora Streptomycetes, ten wektor-hybryd doprowadza się do ekspresji w komórce gospodarza Streptomycetes i wydzielaną fuzję białkową izoluje się z podłoża, przy czym sekwencje genów odcinka łącznikowego (Tendamistat) mogą być modyfikowane.
Ze zgłoszenia patentowego EP-A 177 827 znana jest syntetytczna sekwencja sygnałowa dla transportu białek w układach ekspresji, która odznacza się, że DNA zasadniczo odpowiada naturalnej sekwencji sygnałowej, ale wykazuje jedno lub więcej miejsc cięcia dla endonukleaz, których nie zawiera naturalny DNA. Jeśli z taką sekwencją DNA sprzęgnie się gen białka, które ma podlegać transportowi, a następnie ten fuzyjny gen wbuduje się do wektora, którym transformuje się komórkę gospodarza i tak wytworzone białko transportuje z cytoplazmy można w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych wytwarzać białka eukariotów, prokariotów i wirusów. Na przykładzie periplazmatycznej fosfatazy zasadowej wykazano, że przy ekspresji w E. coli jest korzystne na końcu presekwencji umieścić kodony dla około 40 pierwszych aminokwasów fosfatazy zasadowej, przed genem strukturalnym pożądanego białka. W wielu przypadkach wystarcza jednak mniejsza liczba dodatkowych aminokwasów, na przykład około 10, korzystnie około 5. Odpowiednia fuzja białkowa z proinsuliną małpią jest transportowana do około 90% do przestrzeni periplazmatycznej.
169 178
Zaproponowano juz także (zgłoszenie patentowe US 07/399,874 z 29.8.1989; PCT/US 90/04840 z 28.8.1990) aby wytwarzać fuzje białkowe w ten sposób, ze konstruuje się mieszany oligonukłeotyd kodujący część balastową fuzji białkowej, ten oligonukleotyd wprowadza się do wektora tak, ze jest on funkcjonalnie sprzężony z regionem regulatorowym i genem strukturalnym pożądanego białka, przy pomocy tak otrzymanej populacji plazmidów transformuje się odpowiednie komórki gospodarza i selekcjonuje się ich klony o wysokiej wydajności kodowanej fuzji białkowej. Oligonukleotyd składa się przy tym przeważnie z 4 do 12 trypletów, w szczególności 4 do 8.
Zbadano już także wytwarzanie fuzji białkowych z krótką częścią balastową. Na przykład wytworzono fuzję genową kodującą fuzję białkową z 10 pierwszych aminokwasów β-galaktozydazy i somatostatyny. Okazało się jednak, że ten krótki fragment β-galaktozydazy nie wystarczył aby ochronić fuzję białkową przed rozłożeniem przez proteazy gospodarza (zgłoszenie patentowe US-A 4 366 246, kolumna 15, akapit 2). W związku z tym w zgłoszeniu patentowym EP-A 0 290 005 i 0292763 opisano fuzje białkowe których część balastowa fragmentu β-galaktozydazy zawiera więcej niż 250 aminokwasów.
Nieoczekiwanie jednak, obecnie stwierdzono, że fuzje białkowe z około 10 pierwszych aminoterminalnych aminokwasów sekwencji łącznikowej (Tendamistat) i pożądanego białka, na przykład proinsuliny, są w komórkach Streptomycetes jako gospodarzu stabilne i są wydzielane do podłoża z którego można je otrzymać z wysoką wydajnością. Niespodziewanie dotyczy to także względnie małych białek jak „mini-proinsulina“.
„Około 10 aminokwasów1* oznacza przy tym, że wchodzi w grę także mniejsza liczba aminokwasów, na przykład pierwszych 7 N-końcowych aminokwasów sekwencji łącznikowej (Tendamistat), ale w szczególności nie więcej niż 10. Szczególnie korzystne są fuzje białkowe, które w swojej części łącznikowej (Tendamistat-Anteil) mają w pozycji 7 i/lub 9 prolinę (jak w sekwencji naturalnej). Oczywiście jest również możliwe, zgodnie z już znanymi lub proponowanymi sposobami wytwarzania, dobrać większą część balastową sekwencji łącznikowej (Tendamistat), przy czym naturalnie traci się korzyść wynikającą z niewielkiego „balastu**.
Jest możliwe a nawet korzystne zmieniać naturalną kolejność aminokwasów w sekwencji łącznikowej (Tendamistat), także wymieniać i usuwać aminokwasy, albo wprowadzać aminokwasy nie występujące w naturalnej sekwencji. Jest dalej możliwe zmieniać sekwencję aminokwasów w peptydzie sygnałowym.
Szczególnie pomyślne konstrukcje fuzji białkowych można, znając myśl wynalazku, łatwo ustalić w doświadczeniach wstępnych.
Można również zrealizować ideę wynalazku w innych Gram-dodatnich komórkach bakteryjnych, na przykład w komórkach Bacillus lub Staphylococcus, stosując sekwencje sygnałowe które są „rozpoznawane* przez tych gospodarzy.
Fuzje białkowe otrzymano według wynalazku występują w podłożu w postaci rozpuszczonej, co daje szereg korzyści przy dalszej obróbce i oczyszczaniu. Tak na przykład dalsza obróbka enzymatyczna z odszczepieniem części balastowej może nastąpić bezpośrednio w stosunku od produktu wydzielania, bez konieczności obróbki wstępnej, jak to ma miejsce w przypadku fuzji białkowych nierozpuszczonych. Przed dalszą obróbką może więc nastąpić zatężenie lub oczyszczenie, na przykład przez chromatografię powinowactwa ale także ultrafiltrację, wytrącanie, chromatografię jonowymienną, chromatografię adsorpcyjną, sączenie molekularne lub wysokociśnieniową chromatografię cieczową.
W niżej podanych przykładach wynalazek jest objaśniony bliżej.
Materiałem wyjściowym do konstrukcji plazmidów jest plazmid pKK500, podany w opisie patentowym EP-A 0 367 163. Plazmid ten różni się od opisanego w zgłoszeniu patentowym EPA 0 289 936 plazmidu pKK400 tym, ze gen proinsuliny jest zastąpiony przez gen analogiczny, który zamiast łańcucha C koduje tylko aminokwas lizynę oraz tym, ze sekwencja terminatora jest włączona na końcu tego genu „mini-proinsuliny“. Tabele I i II w zgłoszeniu patentowym EPA 0 367 163, w których gen „mini-proinsuliny** względnie sekwencja terminatora są podane, są jako uzupełnienie załączone do opisu.
Plazmidy pKK400 i pKK500 zawierają w sekwencji sygnałowej genu inhibitora α-amylazy miejsce cięcia XmaIII (w zakresie trypletów -5 do -7).
169 178
Przykład I. Plazmid pKK500 zostaje otwarty przy pomocy enzymów restrykcyjnych EcoRI i XmaIII i duży fragment oddziela się przez elektroforezę na 0,8% zelu agarozowym, poczem izoluje przez elektroelucję. Ten fragment poddaje się ligacji z fragmentem DNA zsyntetyzowanym metodą fosforaminową (1) (SEQ ID NO:1) i mieszaninę ligacyjną transformuje się w E. coli.
Ala -5 Gly PrO Ala Ser -1 AL a
5' G GCC GGG CC& GCC TCC GCC
3’ CCC GGC CGG AGG CCCG
(2rnąIIl)
Asp Tihr Thr VAL Ser Glu Pro
GAC AC& ACC GTC TCC GGAG CCG
CTG TGC TCGC CAG AGG CTC GGC TTA A
(EcoRI)
Otrzymuje się plazmid pKK510. Koduje on pre-proinsulinę w której po sekwencji sygnałowej odcinka łącznikowego (Tendamistat) następują pierwsze 7 aminokwasów sekwencji łącznikowej (Tendamistat) i łańcuch mini-proinsuliny.
Przykład II. Analogicznie do opisanego w zgłoszeniu patentowym EP-A 0 289 963 sposobu przeprowadzenia plazmidu pKK400 w plazmid ekspresji pGF1, plazmid pKK510 przeprowadza się w plazmid ekspresji pKF1:
DNA izolowany z plazmidu pKK510 tnie się enzymami restrykcyjnymi SphI i SstI i izoluje się mały fragment z genem fuzji. Dostępny handlowo plazmid ekspresji pIJ 702 (do nabycia w John Innes Foundation, Norwich, Anglia) tnie się tymi samymi enzymami i izoluje duży fragment. Oba te izolowane fragmenty poddaje się ligacji, mieszaninę ligacyjną transformuje się w S. lividans TK24, i izoluje się plazmid z transformantów opornych na tiostrepton, białych (to znaczy niezdolnych do wytwarzania melaniny). Klony zawierające wprowadzoną insercję bada się w hodowlach wstrząsanych na wytwarzanie fuzji białkowej.
Ekspresja kodowanej fuzji białkowej następuje w znany sposób: transformowany szczep inkubuje się w kolbach wstrząsanych przez 4 dni w temperaturze 25°C i grzybnię oddziela się od podłoża hodowlanego przez wirowanie; wytworzoną fuzję białkową w podłożu po elektroforezie 20μ\ przesączu podłoża w 15% żelu poliakrylamidowym uwidacznia się przez wybarwienie błękitem rCOOMASSIE jako dodatkowy prążek białkowy, który nie występuje w doświadczeniu kontrolnym, w którym szczep transformuje się tylko pIJ 702.
Jeśli przesącz podłoża potraktować endoproteazą lizylową, można wykazać elektroforezę w zelu Des-(B30)-Thr-insulinę, która weryfikuje się w autentycznej kontroli.
Następnie można w przesączu podłoża fuzję białkową wykazać przy pomocy przeciwciał przeciw insulinie albo w immunoblot albo w RIA.
Przykład III. Postępuje się jak w przykładzie I i II, ale syntetyczny fragment (2) umieszcza się z SEQ ID NO:2 i tak otrzymuje się plazmidy pKK320 względnie pKF2.
-5 Ala Gly Pro Ala -1 Ser AĆLa
5' G GCC GGG C3CG GCC TCC GCC
3' CCC GGC C^C^G AG& CGG
(XmaIIl)
Asp Thr Thr Val Ssr Glu Pro Asp Prr
GAC ACC ACC GTC TCC GAG CCC GAC CCG
CTG TTG TGG CAG AGG CTC GGG CTG GGC TTA A
(EcoRI)
169 178
Plazmidy te kodują fuzję białkową, która różni się od tej z przykładu I i II tym, że po pierwszych 7 aminokwasach sekwencji łącznikowej (Tendamistat) następuje asparagina (w miejsce naturalnego aminokwasu alaniny) a po niej dziewiąty aminokwas w sekwencji łącznikowej (Tendamistat) - prolina. Przez wymianę alaniny na asparaginę, do części balastowej fuzji białkowej zostaje wprowadzony dodatkowy ładunek dodatni. Niespodziewanie otrzymuje się wydajność o około 20 do 30% wyższą niż w przykładzie II.
Przykład IV. Postępuje się według przykładu I i II, ale syntetyczny fragment (3) umieszcza się z SEQ ID NO:3 i tak otrzymuje się plazmidy pKK330 względnie pKF3.
-5 Ala Gly Ero Ala Ser -1 Ala
5’ G GCC GGG CCG G-CC TCC GCC
3’ CCC GGC CGG AGG CGG
(Zmalll)
Asp Tm· TGrh- Val Ser Glu Pro Ala Pro
GAC ACG ACC GGC TCC GAG CCC GCA CCG 3’
CTG TGG TCGG CAG A(J(G CGC GGG CGG GGCC GGA A 5*
Plazmidy te różnią się od tych według przykładu I i II tym, że kodują pierwszych 9 naturalnych aminokwasów sekwencji łącznikowej (Tendamistat). W porównaniu z przykładem II otrzymuje się wydajność o około 10% wyższą.
Przykład V. Fuzja białkowa kodowana przez pKK500 zawiera między częścią łącznikową (Tendamistat-Anteil) i łańcuchem B proinsuliny sekwencję łączącą która koduje aminokwasy Asn-Ser-Asn-Gly-Lys.
Zastąpienie tej stojącej na końcu Lys oraz Lys reprezentującej łańcuch C, przez Arg następuje jak opisano niżej. Posłużono się przy tym pojedynczym miejscem cięcia StyI w zakresie kodonów B30 do Al w sekwencji proinsuliny.
DNA izolowany z plazmidu pKK500 tnie się StyI, trawi się nukleazą S1 dla usunięcia wystających końców i nadmiar nukleazy ekstrahuje się fenolem-chloroformem. Linearny plazmid następnie tnie się EcoRI, duży fragment oddziela się elektroforetycznie i izoluje przez elektroelucję. Ten fragment poddaje się ligacji z syntetycznym fragmentem (4) (SEQ ID NO:4) i mieszaninę ligacyjną transformuje się w E. coli.
B1 10
Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
AAG GCG AAC GGC CGC GGC GGC AAC CAG CAC CGG GGC GGC GCG CAC
GC GGG CCG GCG AAG CAG GGG GGC GGG GAC ACG CCG ABC GGG
(EcoRI)
30
Leu Val Glu Ala Leu Gyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe
CGC GGG GAG GCC CGC GAC CGG GGG GGC GGG GAG CGC GGC GGC GGC
GAG CAC CGC CGG GAG AGG GAC CAC ACG CCC CGC GCG CCG AAG AAG
B30 C(B31)
Gyr Ghr Pro Lys Ghr Arg
GAC ACC CCC AAG ACC CGC
AGG GGG GGG GGC GGG GCG
169 178
Pożądane klony sprawdza się analizą restrykcyjną zawartych w nich plazmidów, przy czym używa się nowo powstałego miejsca cięcia SstII. Następnie całkowity fragment SphI-SstI poddaje się sekwencjonowaniu.
Dla ekspresji kodowanej fuzji białkowej, fragment sprawdzony analizą sekwencyjną poddaje się ligacji z pociętym tymi samymi enzymami wektorem pIJ702, przy czym powstaje wektor ekspresji pGF4.
Badanie kodowanej przez pGF4 i wydzielanej fuzji białkowej z jednej strony można przeprowadzić testem płytkowym inhibitora α-amylazy (zgłoszenie patentowe EP-AO 161 629, przykład III), a z drugiej strony można wykonać w podłożu hodowli wstrząsanej analogicznie jak w przykładzie II.
Przykład VI. Jeśli analogicznie jak w przykładzie V fragment (4) wbuduje się do wektorów pKK510,520 i 530, otrzymuje się wektory pKK610,620 i 630. Wbudowanie każdorazowo fragmentów SphI-SstI z sekwencją kodującą fuzje białkowe do wektora pIJ 702 daje wektory ekspresji pKF11, 12 i 13. Ekspresję wydzielanych fuzji białkowych sprawdza się według przykładu II.
Przykład VII. Dla zwiększenia ekspresji pochodnych plazmidu pIJ 702, usuwa się z niego promotor melaniny przez trawienie PstI i SphI i zastępuje syntetycznym fragmentem (5) (SEQ ID NO:5).
PstI BcI.
20 30 40 50
CTGCAGTGAICAGGGGGACCCIIGIGCGAATTTCCGTIACG-&GTITGGG-TGGTAGGG GACGTCACIU^G^3}C^CC^(3(3iCG^(^(^JA^(^.A(^Gi3i^i^.^A^(^lGC.AAEGCCCAAACCCACCAICCC
SphI
70 80
ACGCACCCGAAGAGGAGGCCCCAGCATGC TGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG
Powstaje w ten sposób konstrukcja tandemowa z promotora syntetycznego i łącznikowego (Tendamistat). Plazmid jest oznaczony pGR110.
Jeśli do pGR110, po cięciu SphI i SstI, wprowadzi się syntetyczne fragmenty (1), (2) i (3), powstają w wyniku wektory ekspresji pGR200,210 i 220. Podobnie z fragmentem (4) otrzymuje się wektory ekspresji pGR250, 260 i 270.
Przykład VIII. Przy wytwarzaniu ludzkiej insuliny z prekursorów insuliny przez kombinację trypsyny lub innego tak samo działającego enzymu i karboksylopeptydazy B jest korzystne, w przebiegu reakcji rozszczepiania, szybko odszczepić aminoterminalną część balastową aby promować reakcję rozszczepienia w kierunku B31 (Arg)-insuliny. Do tego odpowiednia jest modyfikacja aminokwasów przed aminokwasem B1 (Phe):
Postępuje się według przykładu I i otwiera się plazmid pKK500 enzymami restrykcyjnymi EcoRI i DraIII. Pierwotny fragment zostaje następnie zastąpiony fragmentem DNA (6) (SEQ ID NO:6) zsyntetyzowanym metodą fosforaminową
B1
Asn Ssr Ala Arg Phe VćOL Asn Gln His Deu Cys Gly Ser His Leu
5' JAŁT TOG GCC CGC TTC GTC AAC CAG CJCC CTCG TGC GGC TCG CAC CIO 3’
3' CGG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG A(^(C GTG 5’
(EcoRI) (DraIII)
169 178 7
Klonowanie w E. coli i ekspresje Streptomycetes lividans następują według przykładu I względnie II. W wyniku powstają plazmid pKK640 względnie plazmid ekspresji pKF14.
Analogicznie można postępować z plazmidem otrzymanym według przykładu V (po wbudowaniu fragmentu (4)). Otrzymuje się plazmidy pKK650 względnie pKF15.
Załącznik z opisu patentowego EP-A 0367 163.
Tablica I
b1 10
ASN SER ASN GLY LYS PHE VAL ASN GLN HIS LEU CYS GLY SER HIS
AAT TCG AAC GGC AAG TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC
GC TTG CCG TTC AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG
(EcoRI)
20 30
LEU VAL GLU ALA LEU TYR LEU VAL CYS GLY GLU ARG GLY PHE PHE
CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC
GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG
C A1 40
TYR THR PRO LYS THR LYS GLY ILE VAL GLU GLN CYS CYS THR SER
TAC ACC CCC AAG ACC AAG GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGT ACG TCC
ATG TGG GGG TTC TGG TTC CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACA TGC AGG
50
ILE CYS SER LEU TYR GLN LEU GLU ASN TYR CYS ASN STP STP
ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTC GAG AAC TAC TGC AAC TAG TAA
TAG ACG AGG GAG ATG GTC GAG CTC TTG ATG ACG TTG ATC ATT
GTC GAC CTG CAG CCA
CAG CTG GAC GTC GGT TCG A
SalI (HindIII)
TABLICA II
5'-CGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGGATC
GCTATTTGGCTATGTTAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAAACCTCTAAaAGTTGCACCTAG-5
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz.
Cena 2,00 zł

Claims (1)

  1. Zastrzeżenie patentowe
    Sposób wytwarzania fuzji białkowych, znamienny tym, że gen strukturalny pożądanego białka sprzęga się z kodonami sekwencji sygnałowej i kodonami około dziesięciu pierwszych aminoterminalnych aminokwasów sekwencji łącznikowej, tę strukturę genu wprowadza się do wektora Streptomycetes, ten wektor-hybryd doprowadza się do ekspresji w komórce gospodarza Streptomycetes i wydzielaną fuzję białkową izoluje się z podłoża, przy czym sekwencje genów odcinka łącznikowego (Tendamistat) mogą być modyfikowane.
PL91289953A 1990-04-21 1991-04-19 Sposób wytwarzania fuzji bialkowych PL PL PL169178B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4012818A DE4012818A1 (de) 1990-04-21 1990-04-21 Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL289953A1 PL289953A1 (en) 1991-11-04
PL169178B1 true PL169178B1 (pl) 1996-06-28

Family

ID=6404857

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL91309698A PL169596B1 (pl) 1990-04-21 1991-04-19 Sposób wytwarzania struktury genu PL PL
PL91289953A PL169178B1 (pl) 1990-04-21 1991-04-19 Sposób wytwarzania fuzji bialkowych PL PL

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL91309698A PL169596B1 (pl) 1990-04-21 1991-04-19 Sposób wytwarzania struktury genu PL PL

Country Status (29)

Country Link
EP (1) EP0453969B1 (pl)
JP (1) JP3319605B2 (pl)
KR (1) KR0168669B1 (pl)
CN (1) CN1049248C (pl)
AT (1) ATE142263T1 (pl)
AU (1) AU630287B2 (pl)
BR (1) BR9101587A (pl)
CA (1) CA2040810C (pl)
CZ (1) CZ285440B6 (pl)
DE (2) DE4012818A1 (pl)
DK (1) DK0453969T3 (pl)
ES (1) ES2093043T3 (pl)
FI (1) FI911882A (pl)
GR (1) GR3021040T3 (pl)
HR (1) HRP940770A2 (pl)
HU (1) HU210358B (pl)
IE (1) IE911322A1 (pl)
IL (1) IL97903A0 (pl)
LT (1) LT3686B (pl)
LV (1) LV10494B (pl)
NO (1) NO911557L (pl)
NZ (1) NZ237882A (pl)
PL (2) PL169596B1 (pl)
PT (1) PT97427B (pl)
RU (1) RU2055892C1 (pl)
SK (1) SK110191A3 (pl)
TW (1) TW213487B (pl)
YU (1) YU48435B (pl)
ZA (1) ZA912937B (pl)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100188800B1 (ko) * 1990-09-05 1999-06-01 이센브룩, 라피세 프리프로인슐린을 인슐린으로 전환시키기 위한 효소적 방법
DK0600372T3 (da) 1992-12-02 1997-08-11 Hoechst Ag Fremgangsmåde til fremstilling af proinsulin med korrekt forbundne cystinbroer.
EP0622376B1 (de) * 1993-04-27 2001-08-08 Hoechst Aktiengesellschaft Amorphe monosphärische Formen von Insulinderivaten
DE4405179A1 (de) * 1994-02-18 1995-08-24 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
CN1061375C (zh) * 1996-07-19 2001-01-31 中国科学院上海生物工程研究中心 利用异源启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白
ES2218622T3 (es) 1996-07-26 2004-11-16 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada.
DE19825447A1 (de) 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
CN1298742C (zh) * 2003-06-03 2007-02-07 上海新药研究开发中心 一种适合于高效表达的融合蛋白及其生产方法
RU2395296C1 (ru) * 2009-02-19 2010-07-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" Способ получения препарата проинсулина для перорального применения
CN104818291A (zh) * 2015-05-08 2015-08-05 江南大学 一种链霉菌重组表达载体的构建及应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366246A (en) 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
DE3418274A1 (de) 1984-05-17 1985-11-21 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten
DE3707150A1 (de) * 1987-03-06 1988-09-15 Hoechst Ag Tendamistat-derivate
DE3714866A1 (de) * 1987-05-05 1988-11-24 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten
DE3715033A1 (de) 1987-05-06 1988-11-17 Hoechst Ag Verfahren zur isolierung von fusionsproteinen
DE3716722A1 (de) 1987-05-19 1988-12-01 Hoechst Ag Gentechnologisches verfahren zur herstellung von angiogeninen
DE3843713A1 (de) * 1988-04-25 1989-11-02 Henkel Kgaa Verwendung von calcinierten hydrotalciten als katalysatoren fuer die ethoxylierung bzw. propoxylierung
ES2081826T3 (es) * 1988-11-03 1996-03-16 Hoechst Ag Procedimiento para la preparacion de un producto previo de insulina en estreptomicetos.

Also Published As

Publication number Publication date
KR0168669B1 (ko) 1999-01-15
JP3319605B2 (ja) 2002-09-03
NZ237882A (en) 1993-12-23
LTIP1523A (en) 1995-06-26
TW213487B (pl) 1993-09-21
FI911882A0 (fi) 1991-04-18
LT3686B (en) 1996-01-25
CZ285440B6 (cs) 1999-08-11
AU630287B2 (en) 1992-10-22
NO911557L (no) 1991-10-22
HU911302D0 (en) 1991-10-28
HU210358B (en) 1995-04-28
NO911557D0 (no) 1991-04-19
CN1055952A (zh) 1991-11-06
CZ110191A3 (en) 1993-08-11
GR3021040T3 (en) 1996-12-31
LV10494A (lv) 1995-02-20
DE4012818A1 (de) 1991-10-24
YU69691A (sh) 1995-12-04
DK0453969T3 (pl) 1997-02-10
RU2055892C1 (ru) 1996-03-10
YU48435B (sh) 1998-07-10
CA2040810A1 (en) 1991-10-22
HRP940770A2 (en) 1997-06-30
EP0453969B1 (de) 1996-09-04
ZA912937B (en) 1991-12-24
SK110191A3 (en) 1995-07-11
IE911322A1 (en) 1991-10-23
FI911882A (fi) 1991-10-22
CA2040810C (en) 2001-07-24
BR9101587A (pt) 1991-12-10
KR910018551A (ko) 1991-11-30
LV10494B (en) 1996-02-20
IL97903A0 (en) 1992-06-21
PL289953A1 (en) 1991-11-04
EP0453969A1 (de) 1991-10-30
JPH04228086A (ja) 1992-08-18
DE59108128D1 (de) 1996-10-10
ATE142263T1 (de) 1996-09-15
AU7515491A (en) 1991-10-24
ES2093043T3 (es) 1996-12-16
PL169596B1 (pl) 1996-08-30
PT97427A (pt) 1992-01-31
PT97427B (pt) 1998-08-31
HUT57268A (en) 1991-11-28
CN1049248C (zh) 2000-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6204246B1 (en) Hybrid toxin
Oka et al. Synthesis and secretion of human epidermal growth factor by Escherichia coli.
EP0305481B1 (en) Leader sequences for the production of recombinant proteins
US4963495A (en) Secretion of heterologous proteins
US5496924A (en) Fusion protein comprising an interleukin-2 fragment ballast portion
JPH05501799A (ja) 融合タンパク質、その調製及び用途
CA1339894C (en) Fusion proteins with a eukaryotic ballast portion
PL169178B1 (pl) Sposób wytwarzania fuzji bialkowych PL PL
CA2136178A1 (en) Production of streptavidin from bacillus subtilis
US6780408B1 (en) Genes encoding hybrid bacillus thuringiensis toxins
US5171673A (en) Expression of heterologous dna using the bacillus coagulans amylase gene
EP0868523A1 (en) Vector for expression of n-terminally extended proteins in yeast cell
US5426036A (en) Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes
AU612144B2 (en) A process for the preparation of foreign proteins in streptomycetes
US5705362A (en) Modified signal sequences
EP0723594A1 (en) A plasmid vector useful for the expression of a foreign dna sequence
JPH01132383A (ja) プラスミド組換え体