RU2055892C1 - Способ получения проинсулина - Google Patents
Способ получения проинсулина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2055892C1 RU2055892C1 SU914895292A SU4895292A RU2055892C1 RU 2055892 C1 RU2055892 C1 RU 2055892C1 SU 914895292 A SU914895292 A SU 914895292A SU 4895292 A SU4895292 A SU 4895292A RU 2055892 C1 RU2055892 C1 RU 2055892C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tendamistat
- amino acids
- proinsulin
- fragment
- plasmid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Использование: изобретение относится к генной инженерии, в частности к получению слитых белков и трансформации клеток стерптомицетов. Сущность изобретения: гены, кодирующие сигнальную последовательность и первые девять аминокислот тендамистата, экспрессируются в стрептомицетных клетках с высоким выходом и слитые белки секретируются в среду. 3 з. п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению слитых белков в клетках стрептомицетов.
Известен способ получения слитых белков путем присоединения структурного гена белка к 3'-концу кодирующей нити модифицированного тендамистат-гена, полученный ген встраивают в клетки для экспрессии выделения и секретирования слитного белка из недостаточной жидкости. При этом тендамистат-ген на 3'-конце может быть укорочен. Для укорачивания используют сайты рестрикции для ферментов BstEII в области триплета 31 и 32, StuI в области триплета 43 и 44, а также Sau 3А в области триплета 52 и 53.
Было предложено получать слитый белок, в котором на тендамистатную часть приходится укороченный проинсулин, С-цепь которого состоит только из одного или двух остатков лизина ("мини-проинсулин"). В дальнейшем было предложено укорачивать в подобных слитых белках также тендамистатную часть.
Выяснено, что слитые белки с очень короткой тендамистатной частью в стрептомицентной клетке стабильны и выделяются в среду. Полученные таким образом слитые белки ведут себя из-за очень короткой тендамистатной цепи, как "зрелые" белки.
Известна синтетическая сигнальная последовательность для транспортировки белков в системах экспрессии, эта ДНК по существу соответствует природной сигнальной последовательности, но имеет одно или несколько мест расщепления для эндонуклеаз, которые не содержатся в природной ДНК. Ген транспортируемого белка присоединяют к такой ДНК-последовательности, этот слитый ген встраивают в вектор, которым трансформируют клетку-хозяин, при этом белок транспортируется из цитоплазмы. Можно получать эукариотные, прокариотные или вирусные белки в прокариотных и эукариотных клетках. На примере периплазматического белка щелочной фосфатазы было показано, что при экспрессии с E.coli предпочтительно встраивать за форпоследовательностью кодонов, кодирующих первые 40 аминокислот щелочной фосфатазы, структурный ген желательного белка. Однако во многих случаях достаточно также меньших количеств дополнительных аминокислот, например, около 10, предпочтительнее около 5. Соответствующий слитый белок с проинсулином обезьян транспортируется примерно до 90% в периплазматическое пространство.
Известен способ получения слитых белков путем конструирования смешанного олигонуклеотида, который кодирует балластную часть слитого белка, этот олигонуклеотид вводят в вектор таким образом, чтобы он функционально был связан с областью регуляции и структурным геном желательного белка; трансформируют полученной конструкцией клетки-реципиенты и отбирают те клоны, которые обладают высоким выходом кодированного слитого белка. Олигонуклеотид при этом состоит преимущественно из 4-12, в особенности 4-8 триплетов.
Пытались получать слитые белки с короткой балластной частью. Так, например, получено слияние генов, которое кодирует слитый белок из первых 10 аминокислот β-галактозидазы и соматостатина. Однако, оказалось, что этот короткий фрагмент β-галактозидазы недостаточен, чтобы защитить слитый белок от расщепления присущими хозяину протеамин. Соответственно этому описаны слитые белки, балластная часть которых состоит из фрагмента β-галактозидазы с более чем 250 аминокислотами.
Однако слитые белки, состоящие примерно из первых 10 аминоконцевых аминокислот тендамистата и желательного белка, например, проинсулина, неожиданно оказались стабильными в стрептомицетных клетках-хозяевах и способными выделяться в среду, из которой они могут быть получены с высокими выходами. Это также оказалось характерным для небольших белков, как "мини-проинсулины".
"Примерно 10 аминокислот" при этом должно означать, что также принимают во внимание меньшее число аминокислот, например, первые 7N-концевых аминокислот тендамистата, но преимущественно не более чем 10. Слитые белки, в которых тендамистатная часть находится в положении 7 и/или 9 пролина (как в природной последовательности) предпочтительны.
Можно выбирать большую тендамистную балластную часть, причем, естественно, все более и более теряется преимущество незначительного "балласта".
Возможно и даже предпочтительно варьировать природную аминокислотную последовательность тендамистатной части, следовательно, заменять, исключать аминокислоты или включать не имеющиеся в природной аминокислотной последовательности аминокислоты. Далее можно варьировать аминокислотную последовательность в сигнальном пептиде.
В особенности благоприятные слитые конструкции могут быть легко установлены, согласно изложению сущности изобретения, благодаря простым предварительным опытам.
Далее возможно использование в качестве реципиентов других грамположительных бактериальных клеток, например, бацилл или стафилококков, при использовании сигнальных последовательностей, которые "распознаются" этими хозяевами.
Слитые белки, полученные согласно изобретению, находятся в среде в растворенной форме, что дает многие преимущества при дальнейшей обработке и очистке. Так, например, можно проводить дальнейшую ферментативную обработку при расщеплении балластной части непосредственно с помощью секреторного продукта, без стадий обработки, которые требуются в случае нерастворимых слитых белков. Перед дальнейшей обработкой также можно проводить только концентрирование или очистку, например, путем аффинной хроматографии, однако также ультрафильтрации, осаждения, ионнообменной хроматографии, абсорбционной хроматографии, гель-фильтрации или жидкостной хроматографии высокого давления.
Исходным материалом для построения плазмиды является плазмида рКК500. Эта плазмида отличается от плазмиды рКК 400, заменой гена проинсулина на аналогичный ген, который вместо С цепи кодирует только аминокислоту лизин, а также введением терминатора вслед за этим геном "мини-проинсулина". В табл. 1 и 2 воспроизведены ген "мини-проинсулина".
Плазмиды РКК400 и рКК500 содержат в сигнальной последовательности ингибирующего α-амилазу гена сайт расщепления ХmaIII в области триплета 5-7.
П р и м е р 1. Плазмиду рКК 500 обрабатывают рестрикционными ферментами EcoR1 и XmaIII и выделяют большой фрагмент на 0,8%-ном геле агарозы путем гель-электрофореза, затем отделяют электроэлюцией. Этот фрагмент лигируют с ДНК-фрагментом (1), синтезированным по фосфаорамидатному способу (SEO, IDN 0:1).
Ala y Pro Ala Ser a 5' G GCС GGG CCG GCC TCC GCC 3' CCC GGC CGG AGG CGG
(XmaIII) Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC 3' CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC TTA A 5'
(EcoRI) и лигированную смесь трансформируют в E.coli. Получают плазмиду рКК510. Она кодирует пред-проинсулин, в котором за сигнальной последовательностью тендамистата следует первые 7 аминокислот тендамистата и затем цепь минипроинсулина.
(XmaIII) Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC 3' CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC TTA A 5'
(EcoRI) и лигированную смесь трансформируют в E.coli. Получают плазмиду рКК510. Она кодирует пред-проинсулин, в котором за сигнальной последовательностью тендамистата следует первые 7 аминокислот тендамистата и затем цепь минипроинсулина.
П р и м е р 2. Изолированную плазмиду ДНК рКК510 расщепляют с помощью рестрикционных ферментов SphI и Sst 1 и выделяют небольшой фрагмент со слитым геном. Плазмиду экспрессии рIJ702 (выпускается фирмой John Jnnes Foundation Norwich, Англия) расщепляют с помощью тех же ферментов и отделяют большой фрагмент. Оба изолированных фрагмента лигируют, лигированную смесь трансформируют в Slividans ТК24 и из тиострептонрезистентных, белых трансформаторов (т. е. неспособных к образованию меланина), выделяют плазмиду. Клоны, которые несут введенную вставку, исследуют на образование ими слитых белков в культуре, выращиваемой при постоянном встряхивании.
Трансформированный штамм инкубируют в течение 4 дней при температуре выше 25оС в колбах, помещенных на качалку, и отделяют мицелий от культурального раствора центрифугированием. Образовавшийся слитый белок обнаруживают в надосадочной культуральной жидкости после электрофореза 20μ м культурального фильтрата в 15% -ном полиакриламидной геле благодаря окрашиванию с помощью СООМАSSIE® синего в виде дополнительной белковой полосы, которая не появляется в контрольном эксперименте, в котором штамм трансформируют только с помощью pIJ 702.
Если обрабатывают культуральный фильтрат лизи эндопротеиназой, то можно гель-электрофоретически обнаружить Des-(BЗО)-Thr-инсулин, который подтверждается благодаря аутентичному контролю.
Далее в культурном фильтрате можно обнаружить слитый белок с помощью инсулиновых антител, либо путем иммуноблотирования, либо с помощью радиоиммунного анализа инсулина.
П р и м е р 3.
Если поступают согласно примерам 1 и 2, однако используют
синтетический фрагмент (2) с SEO IDN0:2,
Ala y Pro Ala Ser a 5' G GCС GGG CCG GCC TCC GCC 3' CCC GGC CGG AGG CGG
(XmaIII) Asp Thr Thr Val er Glu Pro Asp Pro GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GAC CCG 3' CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC CTG GGC TTA A 5'
(EcoRI) то получают плазмиды рКК320 соответственно рКF2.
синтетический фрагмент (2) с SEO IDN0:2,
Ala y Pro Ala Ser a 5' G GCС GGG CCG GCC TCC GCC 3' CCC GGC CGG AGG CGG
(XmaIII) Asp Thr Thr Val er Glu Pro Asp Pro GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GAC CCG 3' CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC CTG GGC TTA A 5'
(EcoRI) то получают плазмиды рКК320 соответственно рКF2.
Эти плазмиды кодируют слитый белок, который отличается от того, который представлен в примерах 1 и 2, тем, что за первыми 7-ю аминокислотами тендамистата следуют аспарагин (вместо природной аминокислоты аланина) и затем девятая аминокислота в тендамистате пролин. Благодаря замене аланина на аспарагин вводят дополнительный положительный заряд в балластную часть слитого белка. При этом получают целевой продукт с выходом на 20-30% выше, чем в примере 2.
П р и м е р 4. Если поступают согласно примерам 1 и 2, однако используют синтетический фрагмент (3) с SEO IDN0:3:
Ala y Pro Ala Ser a 5' G GCС GGG CCG GCC TCC GCC 3' CCC GGC CGG AGG CGG
(XmaIII) Asp Thr Thr Val er Glu Pro Ala Pro GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GAC CCG 3' CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC CTG GGC TTA A 5'
(EcoRI) то получают плазмиды PКК330 соответственно pKF3. Эти плазмиды отличаются от полученных согласно примерам 1 и 2 тем, что они кодируют первые 9 природных аминокислот тендамистата. По сравнению с примером 2 выход почти на 10% больше.
Ala y Pro Ala Ser a 5' G GCС GGG CCG GCC TCC GCC 3' CCC GGC CGG AGG CGG
(XmaIII) Asp Thr Thr Val er Glu Pro Ala Pro GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GAC CCG 3' CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC CTG GGC TTA A 5'
(EcoRI) то получают плазмиды PКК330 соответственно pKF3. Эти плазмиды отличаются от полученных согласно примерам 1 и 2 тем, что они кодируют первые 9 природных аминокислот тендамистата. По сравнению с примером 2 выход почти на 10% больше.
П р и м е р 5.
Слитый белок, кодированный рКК 500, содержит между тендамистатной частью и В-цепью проинсулина линкерную последовательность, которая кодирует аминокислоты Asn-Ser-Asn-Cly-Iys.
Осуществляют замену этого концевого Lys и образующего С-цепь Lys на Arg как описано ниже. При этом используют единичное место расщепления StyI в области кодона В30 А1 в проинсулиновой последовательности.
Выделенную ДНК-плазмиду рКК500 расщепляют с помощью Sty1, переваривают с помощью S1 нуклеазы для удаления выступающих концов и избыточную нуклеазу экстрагируют смесью фенола с хлороформом.
Ставшую линейной плазмиду затем дополнительно расщепляют с помощью Е.соRI, электрофоретически отделяют большой фрагмент и выделяют путем электроэлюции. Этот фрагмент лигируют с синтетическим фрагментом (4) (SEO IDN0:4): Asn Ser Asn Gly Arg e Val Asn Gln s Leu Cys Gly Ser His AAT TCG AAC GGC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC
GC TTG CCG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG (EcoRI) Leu Val Glu Ala u Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe e CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG Tyr Thr Pro Lys TAC ACC CCC AAG ACC CGC ATG TGG GGG TTC TGG GCG и смесь после легирования трансформируют в E.coli. Трансформированные колонны проверяют путем рестрикционного анализа плазмид.
GC TTG CCG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG (EcoRI) Leu Val Glu Ala u Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe e CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG Tyr Thr Pro Lys TAC ACC CCC AAG ACC CGC ATG TGG GGG TTC TGG GCG и смесь после легирования трансформируют в E.coli. Трансформированные колонны проверяют путем рестрикционного анализа плазмид.
Далее секвенируют весь SphI-SstI фрагмент.
Для экспрессии кодированного слитого белка, фрагмент, исследованный путем расшифровки последовательности лигируют в вектор PIJ 702, расщепленный с помощью тех же ферментов, причем образуется вектор экспрессии PGF4.
Обнаружение кодированного PGF4 и секретированного слитого белка, с одной стороны, можно осуществлять через тест на пластинках сd-амилаза-ингибитором (европейский патент А 0161629), пример 3, и, с другой стороны из надосадочной жидкости, выращиваемой при постоянном встряхивании культуры, аналогично примеру 2.
П р и м е р 6. Если вводят аналогичную примеру 5, фрагмент 4 в векторы рКК510, 520 и 530, то получают векторы рКК610, 620 и 630. Встраивание, соответствующих SphI-SstI-фрагментов с помощью кодирующей последовательности для слитых белков в вектор pIJ702 дает векторы экспрессии pKF11, 12 и 13. Экспрессия секретированных слитых белков проверяется согласно примеру 2.
П р и м е р 7. Для повышения экспрессии производных плазмиды pIJ702 из нее удаляют меланиновый промотор путем переваривания с помощью PstI и SphI и заменяют синтетическим фрагментом (5) (SEO IDNO:5):
ACACCCGAAGGAGGCCCGC
TGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG
Благодаря этому получают тандем-конструкцию из синтетического и тендамистатного промоторов. Плазмида получила название pGR 110.
ACACCCGAAGGAGGCCCGC
TGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG
Благодаря этому получают тандем-конструкцию из синтетического и тендамистатного промоторов. Плазмида получила название pGR 110.
Если в PGR 110 после расщепления с помощью Sph и SstI вводят синтетические фрагменты (1), (2) и (3), то получают в результате векторы экспрессии pGR 200, 210 и 220. Аналогичным образом получают с помощью фрагмента (4) векторы экспрессии pGR 250, 260 и 270.
П р и м е р 8. Из предшественников инсулина нужно получить человеческий инсулин путем обработки трипсином или ферментом типа карбоксипепсидазы В. Следовательно, необходимо в ходе реакции расщепления отделять балластную часть с аминоконцами, чтобы способствовать получению В31 (Arg)-инсулина. Для этого предлагается модификация аминокислот перед аминокислотой В1 (Phe).
Поступают согласно примеру 1 и обрабатывают плазмиду pKK500 с помощью рестрикционных ферментов EcoRI и DraIII. Первоначальный фрагмент затем заменяют на синтезированный с помощью фосфорамидитного способа ДНК-фрагмент (6) (SEOIDNO:6):
Asn Ser Ala Arg e Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu 5' AAT TCG GCC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC CTC 3' 3' GC CGG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG
5'
(EcoRI) (DraIII) Клонирование в E.coli и экспрессию в Streptomyces lividans осуществляют согласно примеру 1, соответственно, примеру 2. Получают плазмиду pKK640 или плазмиду экспрессии pKF14.
Asn Ser Ala Arg e Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu 5' AAT TCG GCC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC CTC 3' 3' GC CGG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG
5'
(EcoRI) (DraIII) Клонирование в E.coli и экспрессию в Streptomyces lividans осуществляют согласно примеру 1, соответственно, примеру 2. Получают плазмиду pKK640 или плазмиду экспрессии pKF14.
Так же можно поступать с плазмидой, которую получают согласно примеру 5 (после встроения фрагмента (4).
Таким образом получают плазмиды рКК 650 соответственно pKF15.
Claims (4)
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИНСУЛИНА, включающий связывание нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнальную последовательность тендамистата, и нуклеотидной последовательности, кодирующей тендамистат, со структурным геном проинсулина, введение полученной последовательности в стрептомицетный вектор, трансформацию полученной последовательностью клеток стрептомицетов, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая тендамистат, имеет длину, соответствующую первым 7 - 10 аминокислотам тендамистата.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая тендамистат, имеет длину, соответствующим первым 7 аминокислотам тендамистата.
3. Способ. по п. 1, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая тендамистат, имеет длину, соответствующую первым 9 аминокислотам тендамистата.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая тендамистат, имеет длину, соответствующую первым 9 аминокислотам тендамистата, при этом восьмая аминокислота является аспарагином, а девятая аминокислота - пролином.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DEP4012818.0 | 1990-04-21 | ||
DE4012818A DE4012818A1 (de) | 1990-04-21 | 1990-04-21 | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2055892C1 true RU2055892C1 (ru) | 1996-03-10 |
Family
ID=6404857
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU914895292A RU2055892C1 (ru) | 1990-04-21 | 1991-04-19 | Способ получения проинсулина |
Country Status (29)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0453969B1 (ru) |
JP (1) | JP3319605B2 (ru) |
KR (1) | KR0168669B1 (ru) |
CN (1) | CN1049248C (ru) |
AT (1) | ATE142263T1 (ru) |
AU (1) | AU630287B2 (ru) |
BR (1) | BR9101587A (ru) |
CA (1) | CA2040810C (ru) |
CZ (1) | CZ285440B6 (ru) |
DE (2) | DE4012818A1 (ru) |
DK (1) | DK0453969T3 (ru) |
ES (1) | ES2093043T3 (ru) |
FI (1) | FI911882A (ru) |
GR (1) | GR3021040T3 (ru) |
HR (1) | HRP940770A2 (ru) |
HU (1) | HU210358B (ru) |
IE (1) | IE911322A1 (ru) |
IL (1) | IL97903A0 (ru) |
LT (1) | LT3686B (ru) |
LV (1) | LV10494B (ru) |
NO (1) | NO911557L (ru) |
NZ (1) | NZ237882A (ru) |
PL (2) | PL169178B1 (ru) |
PT (1) | PT97427B (ru) |
RU (1) | RU2055892C1 (ru) |
SK (1) | SK110191A3 (ru) |
TW (1) | TW213487B (ru) |
YU (1) | YU48435B (ru) |
ZA (1) | ZA912937B (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010095978A2 (ru) * | 2009-02-19 | 2010-08-26 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" | Способ получения препарата проинсулина для перорального применения |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100188800B1 (ko) * | 1990-09-05 | 1999-06-01 | 이센브룩, 라피세 | 프리프로인슐린을 인슐린으로 전환시키기 위한 효소적 방법 |
EP0600372B1 (de) | 1992-12-02 | 1997-02-05 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Gewinnung von Proinsulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
DK0622376T3 (da) * | 1993-04-27 | 2001-11-12 | Hoechst Ag | Amorfe monosfæriske former af insulinderivater |
DE4405179A1 (de) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
CN1061375C (zh) * | 1996-07-19 | 2001-01-31 | 中国科学院上海生物工程研究中心 | 利用异源启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白 |
PT821006E (pt) | 1996-07-26 | 2004-09-30 | Aventis Pharma Gmbh | Derivados de insulina com ligacao a zinco aumentada |
DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
AU2003244053A1 (en) | 2003-06-03 | 2005-01-21 | Shanghai Centre Of Research And Development Of New Drugs | A fusion protein suitable to be expressed high effectively and the production method thereof |
CN104818291A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-08-05 | 江南大学 | 一种链霉菌重组表达载体的构建及应用 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4366246A (en) | 1977-11-08 | 1982-12-28 | Genentech, Inc. | Method for microbial polypeptide expression |
DE3418274A1 (de) | 1984-05-17 | 1985-11-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten |
DE3707150A1 (de) * | 1987-03-06 | 1988-09-15 | Hoechst Ag | Tendamistat-derivate |
DE3714866A1 (de) * | 1987-05-05 | 1988-11-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
DE3715033A1 (de) | 1987-05-06 | 1988-11-17 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung von fusionsproteinen |
DE3716722A1 (de) | 1987-05-19 | 1988-12-01 | Hoechst Ag | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von angiogeninen |
DE3843713A1 (de) * | 1988-04-25 | 1989-11-02 | Henkel Kgaa | Verwendung von calcinierten hydrotalciten als katalysatoren fuer die ethoxylierung bzw. propoxylierung |
EP0367163B1 (de) * | 1988-11-03 | 1996-01-03 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Vorprodukts in Streptomyceten |
-
1990
- 1990-04-21 DE DE4012818A patent/DE4012818A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-04-18 AT AT91106268T patent/ATE142263T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-18 DK DK91106268.5T patent/DK0453969T3/da active
- 1991-04-18 CZ CS911101A patent/CZ285440B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-04-18 SK SK1101-91A patent/SK110191A3/sk unknown
- 1991-04-18 FI FI911882A patent/FI911882A/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-04-18 YU YU69691A patent/YU48435B/sh unknown
- 1991-04-18 EP EP91106268A patent/EP0453969B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-18 ES ES91106268T patent/ES2093043T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-18 DE DE59108128T patent/DE59108128D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-19 PL PL91289953A patent/PL169178B1/pl unknown
- 1991-04-19 PT PT97427A patent/PT97427B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-04-19 RU SU914895292A patent/RU2055892C1/ru active
- 1991-04-19 AU AU75154/91A patent/AU630287B2/en not_active Expired
- 1991-04-19 NZ NZ237882A patent/NZ237882A/en unknown
- 1991-04-19 NO NO91911557A patent/NO911557L/no unknown
- 1991-04-19 ZA ZA912937A patent/ZA912937B/xx unknown
- 1991-04-19 IL IL97903A patent/IL97903A0/xx unknown
- 1991-04-19 KR KR1019910006250A patent/KR0168669B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-04-19 CA CA002040810A patent/CA2040810C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-19 HU HU911302A patent/HU210358B/hu unknown
- 1991-04-19 BR BR919101587A patent/BR9101587A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-04-19 IE IE132291A patent/IE911322A1/en unknown
- 1991-04-19 PL PL91309698A patent/PL169596B1/pl unknown
- 1991-04-20 JP JP11700691A patent/JP3319605B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-20 CN CN91102541A patent/CN1049248C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-28 TW TW080104141A patent/TW213487B/zh active
-
1993
- 1993-05-04 LV LVP-93-283A patent/LV10494B/xx unknown
- 1993-12-03 LT LTIP1523A patent/LT3686B/lt unknown
-
1994
- 1994-10-25 HR HRP-696/91A patent/HRP940770A2/hr not_active Application Discontinuation
-
1996
- 1996-09-13 GR GR960402399T patent/GR3021040T3/el unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ЕР, 0177827, C 12N 15/00, 1986. ЕР, 0289936, C 12N 15/00, 1988. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010095978A2 (ru) * | 2009-02-19 | 2010-08-26 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" | Способ получения препарата проинсулина для перорального применения |
WO2010095978A3 (ru) * | 2009-02-19 | 2010-12-02 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" | Способ получения препарата проинсулина для перорального применения |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2521413B2 (ja) | シグナル配列をコ―ドしているdnaと直接結合しているヒト成長ホルモンをコ―ドしているdna | |
US4963495A (en) | Secretion of heterologous proteins | |
CA1340522C (en) | Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification | |
JP3043803B2 (ja) | 融合タンパク質、その調製及び用途 | |
RU2198179C2 (ru) | Модифицированный сигнальный пептид энтеротоксина - ii e. coli и микроорганизм, экспрессирующий белок слияния упомянутого пептида с гетерологичным белком | |
JPH0779710B2 (ja) | 酵母による組換ポリペプチドの製造方法 | |
CA1339894C (en) | Fusion proteins with a eukaryotic ballast portion | |
RU2055892C1 (ru) | Способ получения проинсулина | |
NZ238095A (en) | Dna coding for signal peptide, vectors and preparation of desired proteins using the signal peptide | |
EP0147178A2 (en) | Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria | |
EP0946735A1 (en) | N-terminally extended proteins expressed in yeast | |
Emerick et al. | Expression of a β-lactamase preproinsulin fusion protein in Escherichia coli | |
US5955297A (en) | Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria | |
EP0868523B1 (en) | Vector for expression of n-terminally extended proteins in yeast cell | |
DE3587205T2 (de) | Verfahren zur herstellung eines proteins und dafuer zu verwendender vektor, rekombinante dns und transformierte zelle. | |
EP0352073A1 (en) | Vectors, cells transformed thereby, and their use in producing heterologous polypeptides | |
US5426036A (en) | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes | |
AU612144B2 (en) | A process for the preparation of foreign proteins in streptomycetes | |
Fujimoto et al. | Expression and secretion of human epidermal growth factor by Escherichia coli using enterotoxin signal sequences | |
EP0314184B1 (en) | Expression plasmids | |
KR890005068B1 (ko) | 인체인슐린-유사생장인자의 제조방법 | |
EP0723594A1 (en) | A plasmid vector useful for the expression of a foreign dna sequence |