JPH04228086A - ストレプトミセスにおける外来タン白質の製造法 - Google Patents
ストレプトミセスにおける外来タン白質の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】公開番号（ＥＰ−Ａ）０，２８９，９３６
の欧州特許出願公報は、所望なタンパク質の構造遺伝
子を必要に応じて修飾されたテンダミスタット（ｔｅｎ
ｄａｍｉｓｔａｔ） 遺伝子のコード鎖の３′−末端連
結し、ストレプトミセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
宿主細胞中でこの遺伝子構造物を発現させ、上清から、
分泌された融合タンパク質を単離することによる融合タ
ンパク質の産生を開示している。好ましい態様では、テ
ンダミスタット遺伝子は３′−末端で切り詰められる。 切り詰めには、トリプレット３１および３２の領域にお
ける制限酵素ＢｓｔＥＩＩ、トリプレット４３および４
４の領域におけるＳｔｕＩ、およびトリプレット５２お
よび５３の領域におけるＳａｕ３Ａ の切断部位が用い
られる。 【０００２】この発明の概念の更なる展開においては、
Ｃ−鎖が唯１または２個のリシン残基から成る切り詰め
られたプロインシュリン（「ミニ−プロインシュリン）
がテンダミスタット部分の後に続く融合タンパク質を産
生させることが既に提案されている。提案されているも
う一つの更なる展開は、この種の融合タンパク質中のテ
ンダミスタット部分をも切り詰めることである（１９９
０年５ 月９ 日公開の欧州特許出願公開第０，３６７
，１６３ 号公報）。 【０００３】驚くべきことには、テンダミスタット部分
が極めて短い融合タンパク質はストレプトミセス細胞中
で安定でありかつ培地中に分泌されることを見出した。 この方法で得られる融合タンパク質は、テンダミスタッ
ト鎖が極めて短いため「成熟」タンパク質のような挙動
を示し、一般に正しい三次構造で培地中に存在する。 【０００４】欧州特許出願公開第０，１７７，８２７
号公報には、発現系における輸送タンパク質の合成シグ
ナル配列であって、ＤＮＡが実質的に天然のシグナル配
列と同じであるがエンドヌクレアーゼに対する１個また
はそれ以上の切断部位を有し、これらの部位は天然のＤ
ＮＡには含まれないもの、が開示されている。輸送され
るタンパク質の遺伝子がこのようなＤＮＡ配列に結合す
ると、この融合遺伝子はベクター中に組み込まれ、細胞
質から発現されたタンパク質を輸送する宿主細胞がこれ
によって形質転換され、原核および真核細胞中で真核、
原核生物またはウイルスのタンパク質を産生することが
可能である。一例としてペリプラズムタンパク質アルカ
リ性ホスファターゼを用いると、プレ配列の直ぐ下流で
且つ所望なタンパク質の構造遺伝子の上流にアルカリ性
ホスファターゼのおよその最初の４０個のアミノ酸のコ
ドンを配置することがＥ． ｃｏｌｉ での発現に有利
であることが示される。しかしながら、多くの場合には
若干の数の追加のアミノ酸、例えば約１０個、好ましく
は約５ 個のアミノ酸で十分である。シミアンプロイン
シュリンと対応する融合タンパク質の約９０％が、ペリ
プラズム空間に輸送された。 【０００５】融合タンパク質のバラスト部分をコードす
る混合オリゴヌクレオチドを構築し、このオリゴヌクレ
オチドをベクター中に導入して、調節領域および所望な
タンパク質の構造遺伝子に機能的に連結させ、この方法
で得たこのプラスミド個体群で好適な宿主細胞を形質転
換し、高収率のコード化された融合タンパク質を示すク
ローンを選択することによって融合タンパク質を産生さ
せることも提案されている（ＷＯ ９１／０３５５０
、１９９１年３ 月２１日公開）。このオリゴヌクレオ
チドは、この場合には４ 〜１２のトリプレット、特に
４ 〜８ のトリプレットから成るのが好ましい。 【０００６】短いバラスト部分を有する融合タンパク質
を産生させることが既に試みられて来ている。例えば、
β−ガラクトシダーゼの最初の１０個のアミノ酸とソマ
トスタチンからの融合タンパク質をコードする遺伝子融
合体が作られた。しかしながら、この短いβ−ガラクト
シダーゼフラグメントは内因性宿主プロテアーゼによる
消化から融合タンパク質を保護するには十分でないこと
が明らかになった（米国特許第４，３６６，２４６ 号
公報、第１５欄、第２ 節）。したがって、バラスト部
分が２５０ 個を上回るアミノ酸を有するβ−ガラクト
シダーゼフラグメントから成る融合タンパク質が、欧州
特許出願公開第０，２９０，００５ 号公報および同第
０，２９２，７６３ 号公報に記載されている。 【０００７】しかしながら、テンダミスタットの最初の
約１０個のアミノ末端アミノ酸と所望なタンパク質、例
えばプロインシュリンとの融合タンパク質は、実際にス
トレプトミセス宿主細胞中で予期せぬほど安定であり、
培地中に分泌され、この培地からそれらを高収率で単離
することができる。驚くべきことには、これは「ミニ−
プロインシュリン」のような比較的小さなタンパク質に
ついても真実である。 【０００８】「約１０個のアミノ酸」とは、この場合に
はこれよりも少ない数のアミノ酸、例えばテンダミスタ
ットの最初の７ 個のＮ−末端アミノ酸でも好適である
が、好ましくは１０個より大きくないことを意味する。 テンダミスタット部分のプロリンが（天然の配列と同様
に）７ および／または９ 位に存在する融合タンパク
質が好ましい。しかしながら、既知または提案された態
様によれば、更に大きなテンダミスタットバラスト部分
を選択することも可能であることは勿論であるが、低「
バラスト」の利点がますます失われることも勿論である
。 【０００９】テンダミスタット部分の天然アミノ酸配列
を変更すること、すなわちアミノ酸を交換または欠失さ
せまたは天然のアミノ酸配列には生じないアミノ酸を挿
入することが可能であり且つ有利でもある。更に、シグ
ナルペプチド中のアミノ酸配列を変更することが可能で
ある。 【００１０】発明の概念が知られているときには、簡単
な予備実験によって特に有利な融合構造を容易に決定す
ることができる。 【００１１】例えばバチルスまたはブドウ球菌細胞のよ
うな他のグラム陽性菌細胞中で、これらの宿主によって
「認識」されるシグナル配列を用いて発明の概念を実現
することも可能である。 【００１２】本発明によって得られる融合タンパク質は
、培地中に溶解した形態で存在し、これはプロセシング
および精製において多くの利点を有する。従って例えば
、バラスト部分の切断による酵素的プロセシングが分泌
生成物に直ちに起こり、不溶性の融合タンパク質に必要
な処理工程は行う必要がない。アフィニティクロマトグ
ラフィ、或いは限外濾過、沈澱、イオン交換クロマトグ
ラフィ、吸着クロマトグラフィ、ゲル濾過または高圧液
体クロマトグラフィのような濃縮または精製処理を最初
に更なるプロセシングの前に行うことも可能である。 【００１３】下記の例において、本発明を更に詳細に説
明する。 【００１４】プラスミド構築の出発材料は、欧州特許出
願公開第０，３６７，１６３ 号公報に提案されたプラ
スミドｐＫＫ５００である。このプラスミドは、プロイ
ンシュリン遺伝子がＣ鎖の代わりに、単にアミノ酸リシ
ンをコードするだけの類似の遺伝子によって置換されて
おり且つターミネーター配列がこの「ミニ−プロインシ
ュリン」遺伝子の直ぐ下流に挿入されているという点で
欧州特許出願公開第０，２８９，９３６ 号公報から知
られているプラスミドｐＫＫ４００とは異なる。欧州特
許出願公開第０，３６７，１６３ 号公報からの表１お
よび２は「ミニ−プロインシュリン」遺伝子およびター
ミネーター配列がそれぞれ示されており、この説明に対
する追加物として包含される。 【００１５】プラスミドｐＫＫ４００およびｐＫＫ５０
０は（トリプレット−５〜−７の領域における）α−ア
ミラーゼインヒビター遺伝子のシグナル配列中にＸｍａ
ＩＩＩ切断部位を含む。 【００１６】 【実施例】例１ プラスミドｐＫＫ５００を制限酵素ＥｃｏＲＩ および
ＸａｍＩＩＩで開裂させ、大きなフラグメントを０．８
％アガロースゲル上でゲル電気泳動によって分離し、
電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によって単
離する。このフラグメントを、ホスホラミダイト（ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ） 法によって合成された
ＤＮＡフラグメント（１） （配列番号：１ 、図１）
と連結して、この連結混合物をＥ． ｃｏｌｉ 中に形
質転換する。プラスミドｐＫＫ５１０が得られる。この
プラスミドは、テンダミスタットのシグナル配列の後に
テンダミスタットの最初の７ 個のアミノ酸が続き、こ
の後にミニ−プロインシュリン鎖が続いているプレプロ
インシュリンをコードする。 【００１７】例２ プラスミドｐＫＫ４００を発現プラスミドｐＧＦ１に転
移させるための欧州特許出願公開第０，２８９，９３６
号公報に記載の方法と同様に、プラスミドｐＫＫ５１
０を発現プラスミドｐＫＦ１に移転させる。ｐＫＫ５１
０の単離されたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩお
よびＳｓｔＩで切断し、融合遺伝子を有する小さなフラ
グメントを単離する。市販の発現プラスミドｐＩＪ７０
２ （ジョン・インズ・ファンデーション（Ｊｏｈｎ
Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ） 、ノリッジ（Ｎ
ｏｒｗｉｃｈ） から入手可能）を同じ酵素で切断し、
大きなフラグメントを単離する。これらの２種類の単離
されたフラグメントを連結させ、連結混合物をＳ． Ｌ
ｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４中に形質転換させ、このプラ
スミドをチオストレプトン耐性の白色（すなわち、メラ
ニンを形成することができない）形質転換体から単離さ
せる。導入された挿入物を有するクローンを、振盪培養
物中での融合タンパク質の形成について試験を行う。コ
ード化された融合タンパク質は、それ自体既知の方法で
発現させるが、形質転換株を２５℃を上回る温度で振盪
フラスコ中で４ 日間インキュベーションし、菌糸体を
遠心分離によって培養溶液から分離すると、１５％ポリ
アクリルアミドゲル中での２０μｌの培養濾液の電気泳
動の後に、菌株をｐＩＪ７０２のみで形質転換したコン
トロール実験では生じない追加のタンパク質バンドとし
て培養上清中に形成された融合タンパク質をクーマシー
ブルー（ＣＯＯＭＡＳＳＩＥ Ｂｌｕｅ）（登録商標）
で染色することによって目に見えるようにすることが可
能である。培養濾液をリシンエンドプロテイナーゼで処
理すると、デ（ｄｅ）− （Ｂ３０）−Ｔｈｒ −イン
シュリンを検出することが可能であり、これはゲル電気
泳動での真正のコントロールによって証明される。更に
、免疫ブロットでのインシュリン抗体でまたはインシュ
リンＲＩＡで培養濾液中の融合タンパク質を検出するこ
とが可能である。 【００１８】 を用いることを除き例１および２による方法を行い、こ
の方法でそれぞれｐＫＫ３２０およびｐＫＦ２を得る。 これらのプラスミドは、テンダミスタットの最初の７
個のアミノ酸の後に（天然のアミノ酸のアラニンの代わ
りに）アスパラギンが続き、且つこの後にテンダミスタ
ット中の第９のアミノ酸プロリンが続くという点で例１
および２によるものと異なる融合タンパク質をコードす
る。従って、アラニンをアスパラギンに代えることによ
って、融合タンパク質のバラスト部分に追加の正の電荷
が導入されるのである。驚くべきことには、例２におけ
るよりも約２０〜３０％高い収率が得られる。 【００１９】 を用いることを除き例１および２による方法を行い、こ
の方法によればそれぞれｐＫＫ３３０およびｐＫＦ２が
得られる。 これらのプラスミドは、テンダミスタットの最初の９
個の天然アミノ酸をコードする点で例１および２による
ものと異なる。例２と比較すると、約１０％高い収率が
得られる。 【００２０】例５ ｐＫＫ５００によってコード化される融合タンパク質は
テンダミスタット部分とプロインシュリンのＢ鎖との間
にアミノ酸Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
をコードするリンカー配列を含む。この末端Ｌｙｓ と
Ｃ鎖を表わすＬｙｓ を、下記のようにＡｒｇ によっ
て置換する。この処理法では、プロインシュリンにおけ
るコドンＢ３０ 〜Ａ１の領域における単一のＳｔｙＩ
切断部位が用いられる。ｐＫＫ５００から単離されたプ
ラスミドＤＮＡをＳｔｙＩを用いて切断し、Ｓ１ヌクレ
アーゼで消化して突出末端を除去し、過剰のヌクレアー
ゼをフェノール−クロロホルムを用いて抽出する。次に
、線状化したプラスミドをＥｃｏＲＩ で切断し、大き
なフラグメントを電気泳動で分離し、電気溶出によって
単離する。このフラグメントを合成フラグメント（４）
（配列番号：４、図４） Ｂ１
１０Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｈ
ｉｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ ＡＡ
Ｔ ＴＣＧ ＡＡＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＣ ＧＴＣ
ＡＡＣ ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＧＣ ＧＧＣ
ＴＣＧ ＣＡＣ ＧＣ ＴＴＧ ＣＣＧ Ｇ
ＣＧ ＡＡＧ ＣＡＧ ＴＴＧ ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＡ
Ｃ ＡＣＧ ＣＣＧ ＡＧＣ ＧＴＧ （ＥｃｏＲＩ）
２０
３０Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌ
ｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｈｅ ＣＴＣ ＧＴＧ
ＧＡＧ ＧＣＣ ＣＴＣ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＴＧ
ＴＧＣ ＧＧＧ ＧＡＧ ＣＧＣ ＧＧＣ ＴＴＣ Ｔ
ＴＣ ＧＡＧ ＣＡＣ ＣＴＣ ＣＧＧ ＧＡＧ ＡＴ
Ｇ ＣＡＣ ＣＡＣ ＡＣＧ ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＣＧ
ＣＣＧ ＡＡＧ ＡＡＧ
Ｂ３０ Ｃ（Ｂ３１）Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ ＴＡＣ ＡＣＣ ＣＣＣ
ＡＡＧ ＡＣＣ ＣＧＣ ＡＴＧ ＴＧＧ ＧＧＧ Ｔ
ＴＣ ＴＧＧ ＧＣＧ と連結して、この連結混合物をＥ． ｃｏｌｉ 中に形
質転換する。所望なクローンを新たに展開されたＳｓｔ
ＩＩ 切断部位を用いて、含まれるプラスミドの制限分
析によって試験する。更に、全ＳｐｈＩ−ＳｓｔＩ フ
ラグメントを配列決定する。コード化された融合タンパ
ク質を発現させるために、配列分析によって確認された
フラグメントをベクターｐＩＪ ７０２ に連結させ、
これを同じ酵素で切断して、発現ベクターｐＧＦ４を生
成させる。ｐＧＦ４によってコード化された分泌される
融合タンパク質は、一方ではα−アミラーゼインヒビタ
ープレート試験（欧州特許出願公開第０，１６１，６２
９ 号公報、例３）によって検出することができ、他方
では例２と同様に振盪培養液の上清から検出することが
できる。 【００２１】例６ 例５と同様に、フラグメント（４） をベクターｐＫＫ
５１０、５２０ および５３０ に挿入すると、ベクタ
ーｐＫＫ６１０、６２０および６３０ が得られる。融
合タンパク質のコード配列を有するそれぞれのＳｐｈＩ
−ＳｓｔＩフラグメントをベクターｐＩＪ ７０２ に
組み込むと、発現ベクターｐＫＦ１１ 、１２および１
３を生成する。分泌された融合タンパク質の発現を、例
２と同様にして試験する。 【００２２】例７ プラスミドｐＩＪ ７０２ の誘導体の発現を増加させ
るために、メラニンプロモーターをＰｓｔＩおよびＳｐ
ｈＩで消化することによってそこから欠失させ、合成フ
ラグメント（５） （配列番号：５、図５） ＰｓｔＩ ＢｃｌＩ １０ ２０
３０ ４０ ５０
ＣＴＧＣＡＧＴＧＡＴＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＴＧＴ
ＧＣＧＡＡＴＴＴＣＣＧＴＴＡＣＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴ
ＧＧＴＡＧＧＧ ＧＡＣＧＴＣＡＣＴＡＧＴＣＣＣＣＣ
ＴＧＧＧＡＡＣＡＣＧＣＴＴＡＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＣ
ＣＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣ
ＳｐｈＩ ６０
７０ ８０ ＡＣＧＣＡＣＣ
ＣＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣ ＴＧ
ＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＧＴＣＧＴＡ
ＣＧ によって置換する。合成およびテンダミスタットプロモ
ーターのタンデム構造物がこれによって得られる。この
プラスミドをｐＧＲ１１０と呼ぶ。合成フラグメント（
１） 、（２） および（３） をＳｐｈＩおよびＳｓ
ｔＩで切断した後にｐＧＲ１１０に挿入すると、発現ベ
クターｐＧＲ２００、２１０ および２２０ を生じる
。同様な方法で、発現ベクターｐＧＲ２５０、２６０
および２７０ がフラグメント（４） を用いて得られ
る。 【００２３】例８ トリプシンまたは同様な効果を有する酵素とカルボキシ
ペプチダーゼＢとを結合するさせることによってインシ
ュリン前駆体からヒトインシュリンを生じさせようとす
るときには、切断反応の経過中にバラスト部分を速やか
に切断して切断反応をＢ３１ （Ａｒｇ） −インシュ
リンへと導くようにするのが有利である。このためには
、アミノ酸Ｂ１ （Ｐｈｅ）の上流のアミノ酸を修飾す
るのが好適である。 この処理法は例１と同様であり、プラスミドｐＫＫ５０
０を制限酵素ＥｃｏＲＩ およびＤｒａＩＩＩを用いて
開裂させる。最初のフラグメントを、次にホスホラミダ
イト法によって合成したＤＮＡフラグメント（６） （
配列番号：６、図６）
Ｂ１ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒ
ｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ ５’
ＡＡＴ ＴＣＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＴＣ ＧＴＣ Ａ
ＡＣ ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＧＣ ＧＧＣ ＴＣ
Ｇ ＣＡＣ ＣＴＣ ３’ ３’ ＧＣ Ｃ
ＧＧ ＧＣＧ ＡＡＧ ＣＡＧ ＴＴＧ ＧＴＣ ＧＴ
Ｇ ＧＡＣ ＡＣＧ ＣＣＧ ＡＧＣ ＧＴＧ
５’ （ＥｃｏＲＩ）
（ＤｒａＩＩＩ） によって置換する。Ｅ． ｃｏｌｉ 中へのクローニン
グおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ
中での発現は、それぞれ例１および例２にしたがって
行う。プラスミドｐＫＫ６４０および発現プラスミドｐ
ＫＦ１４ を生じる。（フラグメント（４） の組み込
みの後に）例５にしたがって生じるプラスミドは、同様
な方法で処理することができる。この方法では、プラス
ミドｐＫＫ６５０およびｐＫＦ１５ が得られる。 【００２４】（欧州特許出願公開第０，３６７，１６３
号公報からの）添付物： 【表１】 【表２】 【配列表】 【００２５】配列番号：１ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド配列
の長さ：４４塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 Ｇ ＧＣＣ ＧＧＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ
ＧＡＣ ＡＣＧ ＡＣＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＡＧ
ＣＣＧ ＣＣＣ ＧＣＧ ＣＧＧ ＡＧＧ
ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＧＣ ＴＧＧ ＣＡＧ ＡＧＧ
ＣＴＣ ＧＧＣ ＴＴＡ Ａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐ
ｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈ
ｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ −５
１ ５【００２６】
配列番号：２ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド配列
の長さ：５０塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 Ｇ ＧＣＣ ＧＧＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ
ＧＡＣ ＡＣＧ ＡＣＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＡＧ
ＣＣＣ ＧＡＣ ＣＣＧ ＣＣＣ ＧＧＧ
ＣＧＧ ＡＧＧ ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＧＣ ＴＧＧ
ＣＡＧ ＡＧＧ ＣＴＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＣＣ Ｔ
ＴＡ Ａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅ
ｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ
−５ １
５
１０ 【００２７】配列番号：３ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド配列
の長さ：５０塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 Ｇ ＧＣＣ ＧＧＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ
ＧＡＣ ＡＣＧ ＡＣＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＡＧ
ＣＣＣ ＧＣＡ ＣＣＧ ＣＣＣ ＧＧＣ
ＣＧＧ ＡＧＧ ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＧＣ ＴＧＧ
ＣＡＧ ＡＧＧ ＣＴＣ ＧＧＧ ＣＧＴ ＧＧＣ Ｔ
ＴＡ Ａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅ
ｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｎ −５
１ ５【００２８】
配列番号：４ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド配列
の長さ：１０８ 塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列ＡＡＴ ＴＣ
Ｇ ＡＡＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＣ ＧＴＣ ＡＡＣ
ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＧＣ ＧＧＣ ＴＣＧ
ＣＡＣ ＧＣ ＴＴＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＡ
Ｇ ＣＡＧ ＴＴＧ ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＡＣ ＡＣＧ
ＣＣＧ ＡＧＣ ＧＴＧ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｈ
ｉｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ
５
１０
１５ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＣＣ Ｃ
ＴＣ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ＴＧＣ ＧＧＧ ＧＡ
Ｇ ＣＧＣ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＣＡＣ
ＣＴＣ ＣＧＧ ＧＡＧ ＡＴＧ ＧＡＣ ＣＡＣ
ＡＣＧ ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＣＧ ＣＣＧ ＡＡＧ Ａ
ＡＧ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙ
ｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｈｅ
２０
２５ ３０ ＴＡ
Ｃ ＡＣＣ ＣＣＣ ＡＡＧ ＡＣＣ ＣＧＣ ＡＴＧ
ＴＧＧ ＧＧＧ ＴＴＣ ＴＧＧ ＧＣＧ Ｔｙｒ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ
３５ 【００２９】配列番号：５配列の型：ヌクレオチド配列
の長さ：８６塩基鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状フ
ラグメント型：中間部フラグメント配列の種類：他の核
酸 合成ＤＮＡ配列 ＣＴＧＣＡＧＴＧＡＴ ＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣ ＣＴＴ
ＧＴＧＣＧＡＡ ＴＴＴＣＣＧＴＴＡＣ ＧＧＧＴＴＴ
ＧＧＧＴ ＧＧＴＡＧＧＧＡＣＧ ６０ＣＡＣＣＣＧ
ＡＡＧＡ ＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡ ＧＣＡＴＧＣ
８６ 【００３０】配列番号：６ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド配列
の長さ：４５塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＡＴ ＴＣＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＴＣ ＧＴＣ Ａ
ＡＣ ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＧＣ ＧＧＣ ＴＣ
Ｇ ＣＡＣ ＣＴＣ ＧＣ ＣＧＧ ＧＣＧ
ＡＡＧ ＣＡＧ ＴＴＧ ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＡＣ
ＡＣＧ ＣＣＧ ＡＧＣ ＧＴＧ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａ
ｌａ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｈｉ
ｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
５
１０
１５
の欧州特許出願公報は、所望なタンパク質の構造遺伝
子を必要に応じて修飾されたテンダミスタット（ｔｅｎ
ｄａｍｉｓｔａｔ） 遺伝子のコード鎖の３′−末端連
結し、ストレプトミセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
宿主細胞中でこの遺伝子構造物を発現させ、上清から、
分泌された融合タンパク質を単離することによる融合タ
ンパク質の産生を開示している。好ましい態様では、テ
ンダミスタット遺伝子は３′−末端で切り詰められる。 切り詰めには、トリプレット３１および３２の領域にお
ける制限酵素ＢｓｔＥＩＩ、トリプレット４３および４
４の領域におけるＳｔｕＩ、およびトリプレット５２お
よび５３の領域におけるＳａｕ３Ａ の切断部位が用い
られる。 【０００２】この発明の概念の更なる展開においては、
Ｃ−鎖が唯１または２個のリシン残基から成る切り詰め
られたプロインシュリン（「ミニ−プロインシュリン）
がテンダミスタット部分の後に続く融合タンパク質を産
生させることが既に提案されている。提案されているも
う一つの更なる展開は、この種の融合タンパク質中のテ
ンダミスタット部分をも切り詰めることである（１９９
０年５ 月９ 日公開の欧州特許出願公開第０，３６７
，１６３ 号公報）。 【０００３】驚くべきことには、テンダミスタット部分
が極めて短い融合タンパク質はストレプトミセス細胞中
で安定でありかつ培地中に分泌されることを見出した。 この方法で得られる融合タンパク質は、テンダミスタッ
ト鎖が極めて短いため「成熟」タンパク質のような挙動
を示し、一般に正しい三次構造で培地中に存在する。 【０００４】欧州特許出願公開第０，１７７，８２７
号公報には、発現系における輸送タンパク質の合成シグ
ナル配列であって、ＤＮＡが実質的に天然のシグナル配
列と同じであるがエンドヌクレアーゼに対する１個また
はそれ以上の切断部位を有し、これらの部位は天然のＤ
ＮＡには含まれないもの、が開示されている。輸送され
るタンパク質の遺伝子がこのようなＤＮＡ配列に結合す
ると、この融合遺伝子はベクター中に組み込まれ、細胞
質から発現されたタンパク質を輸送する宿主細胞がこれ
によって形質転換され、原核および真核細胞中で真核、
原核生物またはウイルスのタンパク質を産生することが
可能である。一例としてペリプラズムタンパク質アルカ
リ性ホスファターゼを用いると、プレ配列の直ぐ下流で
且つ所望なタンパク質の構造遺伝子の上流にアルカリ性
ホスファターゼのおよその最初の４０個のアミノ酸のコ
ドンを配置することがＥ． ｃｏｌｉ での発現に有利
であることが示される。しかしながら、多くの場合には
若干の数の追加のアミノ酸、例えば約１０個、好ましく
は約５ 個のアミノ酸で十分である。シミアンプロイン
シュリンと対応する融合タンパク質の約９０％が、ペリ
プラズム空間に輸送された。 【０００５】融合タンパク質のバラスト部分をコードす
る混合オリゴヌクレオチドを構築し、このオリゴヌクレ
オチドをベクター中に導入して、調節領域および所望な
タンパク質の構造遺伝子に機能的に連結させ、この方法
で得たこのプラスミド個体群で好適な宿主細胞を形質転
換し、高収率のコード化された融合タンパク質を示すク
ローンを選択することによって融合タンパク質を産生さ
せることも提案されている（ＷＯ ９１／０３５５０
、１９９１年３ 月２１日公開）。このオリゴヌクレオ
チドは、この場合には４ 〜１２のトリプレット、特に
４ 〜８ のトリプレットから成るのが好ましい。 【０００６】短いバラスト部分を有する融合タンパク質
を産生させることが既に試みられて来ている。例えば、
β−ガラクトシダーゼの最初の１０個のアミノ酸とソマ
トスタチンからの融合タンパク質をコードする遺伝子融
合体が作られた。しかしながら、この短いβ−ガラクト
シダーゼフラグメントは内因性宿主プロテアーゼによる
消化から融合タンパク質を保護するには十分でないこと
が明らかになった（米国特許第４，３６６，２４６ 号
公報、第１５欄、第２ 節）。したがって、バラスト部
分が２５０ 個を上回るアミノ酸を有するβ−ガラクト
シダーゼフラグメントから成る融合タンパク質が、欧州
特許出願公開第０，２９０，００５ 号公報および同第
０，２９２，７６３ 号公報に記載されている。 【０００７】しかしながら、テンダミスタットの最初の
約１０個のアミノ末端アミノ酸と所望なタンパク質、例
えばプロインシュリンとの融合タンパク質は、実際にス
トレプトミセス宿主細胞中で予期せぬほど安定であり、
培地中に分泌され、この培地からそれらを高収率で単離
することができる。驚くべきことには、これは「ミニ−
プロインシュリン」のような比較的小さなタンパク質に
ついても真実である。 【０００８】「約１０個のアミノ酸」とは、この場合に
はこれよりも少ない数のアミノ酸、例えばテンダミスタ
ットの最初の７ 個のＮ−末端アミノ酸でも好適である
が、好ましくは１０個より大きくないことを意味する。 テンダミスタット部分のプロリンが（天然の配列と同様
に）７ および／または９ 位に存在する融合タンパク
質が好ましい。しかしながら、既知または提案された態
様によれば、更に大きなテンダミスタットバラスト部分
を選択することも可能であることは勿論であるが、低「
バラスト」の利点がますます失われることも勿論である
。 【０００９】テンダミスタット部分の天然アミノ酸配列
を変更すること、すなわちアミノ酸を交換または欠失さ
せまたは天然のアミノ酸配列には生じないアミノ酸を挿
入することが可能であり且つ有利でもある。更に、シグ
ナルペプチド中のアミノ酸配列を変更することが可能で
ある。 【００１０】発明の概念が知られているときには、簡単
な予備実験によって特に有利な融合構造を容易に決定す
ることができる。 【００１１】例えばバチルスまたはブドウ球菌細胞のよ
うな他のグラム陽性菌細胞中で、これらの宿主によって
「認識」されるシグナル配列を用いて発明の概念を実現
することも可能である。 【００１２】本発明によって得られる融合タンパク質は
、培地中に溶解した形態で存在し、これはプロセシング
および精製において多くの利点を有する。従って例えば
、バラスト部分の切断による酵素的プロセシングが分泌
生成物に直ちに起こり、不溶性の融合タンパク質に必要
な処理工程は行う必要がない。アフィニティクロマトグ
ラフィ、或いは限外濾過、沈澱、イオン交換クロマトグ
ラフィ、吸着クロマトグラフィ、ゲル濾過または高圧液
体クロマトグラフィのような濃縮または精製処理を最初
に更なるプロセシングの前に行うことも可能である。 【００１３】下記の例において、本発明を更に詳細に説
明する。 【００１４】プラスミド構築の出発材料は、欧州特許出
願公開第０，３６７，１６３ 号公報に提案されたプラ
スミドｐＫＫ５００である。このプラスミドは、プロイ
ンシュリン遺伝子がＣ鎖の代わりに、単にアミノ酸リシ
ンをコードするだけの類似の遺伝子によって置換されて
おり且つターミネーター配列がこの「ミニ−プロインシ
ュリン」遺伝子の直ぐ下流に挿入されているという点で
欧州特許出願公開第０，２８９，９３６ 号公報から知
られているプラスミドｐＫＫ４００とは異なる。欧州特
許出願公開第０，３６７，１６３ 号公報からの表１お
よび２は「ミニ−プロインシュリン」遺伝子およびター
ミネーター配列がそれぞれ示されており、この説明に対
する追加物として包含される。 【００１５】プラスミドｐＫＫ４００およびｐＫＫ５０
０は（トリプレット−５〜−７の領域における）α−ア
ミラーゼインヒビター遺伝子のシグナル配列中にＸｍａ
ＩＩＩ切断部位を含む。 【００１６】 【実施例】例１ プラスミドｐＫＫ５００を制限酵素ＥｃｏＲＩ および
ＸａｍＩＩＩで開裂させ、大きなフラグメントを０．８
％アガロースゲル上でゲル電気泳動によって分離し、
電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によって単
離する。このフラグメントを、ホスホラミダイト（ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ） 法によって合成された
ＤＮＡフラグメント（１） （配列番号：１ 、図１）
と連結して、この連結混合物をＥ． ｃｏｌｉ 中に形
質転換する。プラスミドｐＫＫ５１０が得られる。この
プラスミドは、テンダミスタットのシグナル配列の後に
テンダミスタットの最初の７ 個のアミノ酸が続き、こ
の後にミニ−プロインシュリン鎖が続いているプレプロ
インシュリンをコードする。 【００１７】例２ プラスミドｐＫＫ４００を発現プラスミドｐＧＦ１に転
移させるための欧州特許出願公開第０，２８９，９３６
号公報に記載の方法と同様に、プラスミドｐＫＫ５１
０を発現プラスミドｐＫＦ１に移転させる。ｐＫＫ５１
０の単離されたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩお
よびＳｓｔＩで切断し、融合遺伝子を有する小さなフラ
グメントを単離する。市販の発現プラスミドｐＩＪ７０
２ （ジョン・インズ・ファンデーション（Ｊｏｈｎ
Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ） 、ノリッジ（Ｎ
ｏｒｗｉｃｈ） から入手可能）を同じ酵素で切断し、
大きなフラグメントを単離する。これらの２種類の単離
されたフラグメントを連結させ、連結混合物をＳ． Ｌ
ｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４中に形質転換させ、このプラ
スミドをチオストレプトン耐性の白色（すなわち、メラ
ニンを形成することができない）形質転換体から単離さ
せる。導入された挿入物を有するクローンを、振盪培養
物中での融合タンパク質の形成について試験を行う。コ
ード化された融合タンパク質は、それ自体既知の方法で
発現させるが、形質転換株を２５℃を上回る温度で振盪
フラスコ中で４ 日間インキュベーションし、菌糸体を
遠心分離によって培養溶液から分離すると、１５％ポリ
アクリルアミドゲル中での２０μｌの培養濾液の電気泳
動の後に、菌株をｐＩＪ７０２のみで形質転換したコン
トロール実験では生じない追加のタンパク質バンドとし
て培養上清中に形成された融合タンパク質をクーマシー
ブルー（ＣＯＯＭＡＳＳＩＥ Ｂｌｕｅ）（登録商標）
で染色することによって目に見えるようにすることが可
能である。培養濾液をリシンエンドプロテイナーゼで処
理すると、デ（ｄｅ）− （Ｂ３０）−Ｔｈｒ −イン
シュリンを検出することが可能であり、これはゲル電気
泳動での真正のコントロールによって証明される。更に
、免疫ブロットでのインシュリン抗体でまたはインシュ
リンＲＩＡで培養濾液中の融合タンパク質を検出するこ
とが可能である。 【００１８】 を用いることを除き例１および２による方法を行い、こ
の方法でそれぞれｐＫＫ３２０およびｐＫＦ２を得る。 これらのプラスミドは、テンダミスタットの最初の７
個のアミノ酸の後に（天然のアミノ酸のアラニンの代わ
りに）アスパラギンが続き、且つこの後にテンダミスタ
ット中の第９のアミノ酸プロリンが続くという点で例１
および２によるものと異なる融合タンパク質をコードす
る。従って、アラニンをアスパラギンに代えることによ
って、融合タンパク質のバラスト部分に追加の正の電荷
が導入されるのである。驚くべきことには、例２におけ
るよりも約２０〜３０％高い収率が得られる。 【００１９】 を用いることを除き例１および２による方法を行い、こ
の方法によればそれぞれｐＫＫ３３０およびｐＫＦ２が
得られる。 これらのプラスミドは、テンダミスタットの最初の９
個の天然アミノ酸をコードする点で例１および２による
ものと異なる。例２と比較すると、約１０％高い収率が
得られる。 【００２０】例５ ｐＫＫ５００によってコード化される融合タンパク質は
テンダミスタット部分とプロインシュリンのＢ鎖との間
にアミノ酸Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
をコードするリンカー配列を含む。この末端Ｌｙｓ と
Ｃ鎖を表わすＬｙｓ を、下記のようにＡｒｇ によっ
て置換する。この処理法では、プロインシュリンにおけ
るコドンＢ３０ 〜Ａ１の領域における単一のＳｔｙＩ
切断部位が用いられる。ｐＫＫ５００から単離されたプ
ラスミドＤＮＡをＳｔｙＩを用いて切断し、Ｓ１ヌクレ
アーゼで消化して突出末端を除去し、過剰のヌクレアー
ゼをフェノール−クロロホルムを用いて抽出する。次に
、線状化したプラスミドをＥｃｏＲＩ で切断し、大き
なフラグメントを電気泳動で分離し、電気溶出によって
単離する。このフラグメントを合成フラグメント（４）
（配列番号：４、図４） Ｂ１
１０Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｈ
ｉｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ ＡＡ
Ｔ ＴＣＧ ＡＡＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＣ ＧＴＣ
ＡＡＣ ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＧＣ ＧＧＣ
ＴＣＧ ＣＡＣ ＧＣ ＴＴＧ ＣＣＧ Ｇ
ＣＧ ＡＡＧ ＣＡＧ ＴＴＧ ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＡ
Ｃ ＡＣＧ ＣＣＧ ＡＧＣ ＧＴＧ （ＥｃｏＲＩ）
２０
３０Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌ
ｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｈｅ ＣＴＣ ＧＴＧ
ＧＡＧ ＧＣＣ ＣＴＣ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＴＧ
ＴＧＣ ＧＧＧ ＧＡＧ ＣＧＣ ＧＧＣ ＴＴＣ Ｔ
ＴＣ ＧＡＧ ＣＡＣ ＣＴＣ ＣＧＧ ＧＡＧ ＡＴ
Ｇ ＣＡＣ ＣＡＣ ＡＣＧ ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＣＧ
ＣＣＧ ＡＡＧ ＡＡＧ
Ｂ３０ Ｃ（Ｂ３１）Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ ＴＡＣ ＡＣＣ ＣＣＣ
ＡＡＧ ＡＣＣ ＣＧＣ ＡＴＧ ＴＧＧ ＧＧＧ Ｔ
ＴＣ ＴＧＧ ＧＣＧ と連結して、この連結混合物をＥ． ｃｏｌｉ 中に形
質転換する。所望なクローンを新たに展開されたＳｓｔ
ＩＩ 切断部位を用いて、含まれるプラスミドの制限分
析によって試験する。更に、全ＳｐｈＩ−ＳｓｔＩ フ
ラグメントを配列決定する。コード化された融合タンパ
ク質を発現させるために、配列分析によって確認された
フラグメントをベクターｐＩＪ ７０２ に連結させ、
これを同じ酵素で切断して、発現ベクターｐＧＦ４を生
成させる。ｐＧＦ４によってコード化された分泌される
融合タンパク質は、一方ではα−アミラーゼインヒビタ
ープレート試験（欧州特許出願公開第０，１６１，６２
９ 号公報、例３）によって検出することができ、他方
では例２と同様に振盪培養液の上清から検出することが
できる。 【００２１】例６ 例５と同様に、フラグメント（４） をベクターｐＫＫ
５１０、５２０ および５３０ に挿入すると、ベクタ
ーｐＫＫ６１０、６２０および６３０ が得られる。融
合タンパク質のコード配列を有するそれぞれのＳｐｈＩ
−ＳｓｔＩフラグメントをベクターｐＩＪ ７０２ に
組み込むと、発現ベクターｐＫＦ１１ 、１２および１
３を生成する。分泌された融合タンパク質の発現を、例
２と同様にして試験する。 【００２２】例７ プラスミドｐＩＪ ７０２ の誘導体の発現を増加させ
るために、メラニンプロモーターをＰｓｔＩおよびＳｐ
ｈＩで消化することによってそこから欠失させ、合成フ
ラグメント（５） （配列番号：５、図５） ＰｓｔＩ ＢｃｌＩ １０ ２０
３０ ４０ ５０
ＣＴＧＣＡＧＴＧＡＴＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＴＧＴ
ＧＣＧＡＡＴＴＴＣＣＧＴＴＡＣＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴ
ＧＧＴＡＧＧＧ ＧＡＣＧＴＣＡＣＴＡＧＴＣＣＣＣＣ
ＴＧＧＧＡＡＣＡＣＧＣＴＴＡＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＣ
ＣＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣ
ＳｐｈＩ ６０
７０ ８０ ＡＣＧＣＡＣＣ
ＣＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣ ＴＧ
ＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＧＴＣＧＴＡ
ＣＧ によって置換する。合成およびテンダミスタットプロモ
ーターのタンデム構造物がこれによって得られる。この
プラスミドをｐＧＲ１１０と呼ぶ。合成フラグメント（
１） 、（２） および（３） をＳｐｈＩおよびＳｓ
ｔＩで切断した後にｐＧＲ１１０に挿入すると、発現ベ
クターｐＧＲ２００、２１０ および２２０ を生じる
。同様な方法で、発現ベクターｐＧＲ２５０、２６０
および２７０ がフラグメント（４） を用いて得られ
る。 【００２３】例８ トリプシンまたは同様な効果を有する酵素とカルボキシ
ペプチダーゼＢとを結合するさせることによってインシ
ュリン前駆体からヒトインシュリンを生じさせようとす
るときには、切断反応の経過中にバラスト部分を速やか
に切断して切断反応をＢ３１ （Ａｒｇ） −インシュ
リンへと導くようにするのが有利である。このためには
、アミノ酸Ｂ１ （Ｐｈｅ）の上流のアミノ酸を修飾す
るのが好適である。 この処理法は例１と同様であり、プラスミドｐＫＫ５０
０を制限酵素ＥｃｏＲＩ およびＤｒａＩＩＩを用いて
開裂させる。最初のフラグメントを、次にホスホラミダ
イト法によって合成したＤＮＡフラグメント（６） （
配列番号：６、図６）
Ｂ１ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒ
ｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ ５’
ＡＡＴ ＴＣＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＴＣ ＧＴＣ Ａ
ＡＣ ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＧＣ ＧＧＣ ＴＣ
Ｇ ＣＡＣ ＣＴＣ ３’ ３’ ＧＣ Ｃ
ＧＧ ＧＣＧ ＡＡＧ ＣＡＧ ＴＴＧ ＧＴＣ ＧＴ
Ｇ ＧＡＣ ＡＣＧ ＣＣＧ ＡＧＣ ＧＴＧ
５’ （ＥｃｏＲＩ）
（ＤｒａＩＩＩ） によって置換する。Ｅ． ｃｏｌｉ 中へのクローニン
グおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ
中での発現は、それぞれ例１および例２にしたがって
行う。プラスミドｐＫＫ６４０および発現プラスミドｐ
ＫＦ１４ を生じる。（フラグメント（４） の組み込
みの後に）例５にしたがって生じるプラスミドは、同様
な方法で処理することができる。この方法では、プラス
ミドｐＫＫ６５０およびｐＫＦ１５ が得られる。 【００２４】（欧州特許出願公開第０，３６７，１６３
号公報からの）添付物： 【表１】 【表２】 【配列表】 【００２５】配列番号：１ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド配列
の長さ：４４塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 Ｇ ＧＣＣ ＧＧＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ
ＧＡＣ ＡＣＧ ＡＣＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＡＧ
ＣＣＧ ＣＣＣ ＧＣＧ ＣＧＧ ＡＧＧ
ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＧＣ ＴＧＧ ＣＡＧ ＡＧＧ
ＣＴＣ ＧＧＣ ＴＴＡ Ａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐ
ｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈ
ｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ −５
１ ５【００２６】
配列番号：２ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド配列
の長さ：５０塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 Ｇ ＧＣＣ ＧＧＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ
ＧＡＣ ＡＣＧ ＡＣＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＡＧ
ＣＣＣ ＧＡＣ ＣＣＧ ＣＣＣ ＧＧＧ
ＣＧＧ ＡＧＧ ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＧＣ ＴＧＧ
ＣＡＧ ＡＧＧ ＣＴＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＣＣ Ｔ
ＴＡ Ａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅ
ｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ
−５ １
５
１０ 【００２７】配列番号：３ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド配列
の長さ：５０塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 Ｇ ＧＣＣ ＧＧＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ
ＧＡＣ ＡＣＧ ＡＣＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＡＧ
ＣＣＣ ＧＣＡ ＣＣＧ ＣＣＣ ＧＧＣ
ＣＧＧ ＡＧＧ ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＧＣ ＴＧＧ
ＣＡＧ ＡＧＧ ＣＴＣ ＧＧＧ ＣＧＴ ＧＧＣ Ｔ
ＴＡ Ａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅ
ｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｎ −５
１ ５【００２８】
配列番号：４ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド配列
の長さ：１０８ 塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列ＡＡＴ ＴＣ
Ｇ ＡＡＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＣ ＧＴＣ ＡＡＣ
ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＧＣ ＧＧＣ ＴＣＧ
ＣＡＣ ＧＣ ＴＴＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＡ
Ｇ ＣＡＧ ＴＴＧ ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＡＣ ＡＣＧ
ＣＣＧ ＡＧＣ ＧＴＧ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｈ
ｉｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ
５
１０
１５ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＣＣ Ｃ
ＴＣ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ＴＧＣ ＧＧＧ ＧＡ
Ｇ ＣＧＣ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＣＡＣ
ＣＴＣ ＣＧＧ ＧＡＧ ＡＴＧ ＧＡＣ ＣＡＣ
ＡＣＧ ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＣＧ ＣＣＧ ＡＡＧ Ａ
ＡＧ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙ
ｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｈｅ
２０
２５ ３０ ＴＡ
Ｃ ＡＣＣ ＣＣＣ ＡＡＧ ＡＣＣ ＣＧＣ ＡＴＧ
ＴＧＧ ＧＧＧ ＴＴＣ ＴＧＧ ＧＣＧ Ｔｙｒ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ
３５ 【００２９】配列番号：５配列の型：ヌクレオチド配列
の長さ：８６塩基鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状フ
ラグメント型：中間部フラグメント配列の種類：他の核
酸 合成ＤＮＡ配列 ＣＴＧＣＡＧＴＧＡＴ ＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣ ＣＴＴ
ＧＴＧＣＧＡＡ ＴＴＴＣＣＧＴＴＡＣ ＧＧＧＴＴＴ
ＧＧＧＴ ＧＧＴＡＧＧＧＡＣＧ ６０ＣＡＣＣＣＧ
ＡＡＧＡ ＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡ ＧＣＡＴＧＣ
８６ 【００３０】配列番号：６ 配列の型：対応するタン白質を含めたヌクレオチド配列
の長さ：４５塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＡＴ ＴＣＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＴＣ ＧＴＣ Ａ
ＡＣ ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＧＣ ＧＧＣ ＴＣ
Ｇ ＣＡＣ ＣＴＣ ＧＣ ＣＧＧ ＧＣＧ
ＡＡＧ ＣＡＧ ＴＴＧ ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＡＣ
ＡＣＧ ＣＣＧ ＡＧＣ ＧＴＧ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａ
ｌａ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｈｉ
ｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
５
１０
１５
【図１】例１における合成ＤＮＡフラグメント（１）の
ヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説
明図。
ヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説
明図。
【図２】例３における合成フラグメント（２）のヌクレ
オチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説明図。
オチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説明図。
【図３】例４における合成フラグメント（３）のヌクレ
オチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説明図。
オチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説明図。
【図４】例５における合成フラグメント（４）のヌクレ
オチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説明図。
オチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説明図。
【図５】例７における合成フラグメント（５）のヌクレ
オチド配列を示す説明図。
オチド配列を示す説明図。
【図６】例８における合成ＤＮＡフラグメント（６）の
ヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説
明図。
ヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸を示す説
明図。
Claims (8)
- 【請求項１】所望なタン白質に対する構造遺伝子をテン
ダミスタットのシグナル配列および最初の約１０個のア
ミノ末端アミノ酸のコドンに連結し、この遺伝子構造物
をストレプトミセス宿主細胞中で発現させ、上清から、
分泌された融合タン白質を単離して、テンダミスタット
遺伝子配列を修飾することが可能であるこをと特徴とす
る、融合タン白質の製造法。 - 【請求項２】テンダミスタットのシグナル配列および最
初の約１０個のコドンおよび他のタンパク質の構造遺伝
子を含む遺伝子構造。 - 【請求項３】アミノ酸のコドンがテンダミスタット部分
で欠失、交換または付加された、請求項２記載の遺伝子
構造。 - 【請求項４】リンカー配列がテンダミスタット遺伝子と
所望なタン白質の構造遺伝子との間に配置される、請求
項２または３記載の遺伝子構造。 - 【請求項５】請求項２、３または４に記載の遺伝子構造
を含むベクター。 - 【請求項６】請求項５記載のベクターを含むストレプト
ミセス細胞。 - 【請求項７】テンダミスタットの最初の約１０個のアミ
ノ酸のＮ−末端部分が、所望によりブリッジ配列を介し
て、所望なタン白質に連結されていることを特徴とする
、融合タン白質。 - 【請求項８】請求項７記載の融合タン白質または請求項
１記載の方法で得ることができる融合タン白質の所望な
タン白質の製造のための使用。
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| DE3843713A1 (de) * | 1988-04-25 | 1989-11-02 | Henkel Kgaa | Verwendung von calcinierten hydrotalciten als katalysatoren fuer die ethoxylierung bzw. propoxylierung |
| ES2081826T3 (es) * | 1988-11-03 | 1996-03-16 | Hoechst Ag | Procedimiento para la preparacion de un producto previo de insulina en estreptomicetos. |
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