JPS61152297A - 蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背狽 技術分野 本発明は、遺伝子工学的手法による蛋白質の製造方法に
関づる。ざらに具体的には、本発明は、シグナルペプチ
ドをコードする遺伝子とその下流側末端直後に結合させ
た所望の外来性蛋白質をコードする遺伝子どを含むプラ
スミド組換体を利用し、宿主菌体内で生産されたその所
望蛋白質を菌体外へ分泌させる方法に関するものである
。

また、本発明は、上記蛋白質の製造法に用いるプラスミ
ド組換体およびそのプラスミド組換体を含む大腸菌にも
関する。

先行技術 組換体ＤＮＡ技術を用いて所望の遺伝子産物を大量に産
生させる技術が確立されつつあることは、多数の死文や
公開特許公報等によって認められるところである。これ
らの技術の確立に伴なって）貢伝学的解析も行なわれて
おり、シグナルペプチドという１５〜３０個のアミノ酸
残基からなる一連のペプチドが発現蛋白の宿主細胞外へ
の分泌に関与しているという知見もその中から見出され
たものである。

発現蛋白質の細胞外へ分泌に関するこの知見は「シグナ
ル仮説Ｊ　　（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　、　、　６
７゜８３５（１９７，５））といわれ、この説を支持す
る実験結果も蓄積されつつある（　３　ｅｃｒｉｔｏｒ
ｙＭｅｃｈａｎｉｓｍｓ　、　９．　Ｃａｍｂｒｉｄｇ
ｅ　　ＩＪｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰ　ｒｅｓｓ　　Ｃａｍ
ｂｒｉｄｏｅ　（１９７９）　、生化学、且。

１４１（１９８０）等）。シグナルペプチドの概要およ
び機能についてはたとえば特開昭５８−６９８９７号公
報に説明がなされており、シグナルペブチドは蛋白質の
膜通過に関与づるものとして認識されている。

現在、シグナルペプチドを利用した発明は、特許公報ま
たは公告公報等で種々開示されている（特開昭５５−１
９０９２号、同５５−４５３９５号、同５６−１３７８
９６号、同５６−１４．５２２１号、同５６−１５４９
９９号、同５７−１９２４、　Ｏ０号、同５８−６９８
９７号各公報等）。

これら公報記載の方法では、いずれも宿主菌の分泌すべ
き蛋白質をコードする構造遺伝子を適当な制限酵素認識
部位で切断し、そこへフレームを合わせるためのリンカ
−を介して外来性遺伝子を接続している。その結果、こ
のような融合遺伝子から発現してくる外来性蛋白質のＮ
末端側には余分なペプチドが付着していることになる。

従って、この余分なペプチドが外来性蛋白質の分泌を阻
害したり、外来性蛋白質の生物活性に悪影響を与えたり
する可能性も考えられる。

一方、本発明者らは、シグナルペプチドをコードする遺
伝子の直後に、外来性遺伝子の結合を可能とした塩基配
列を含むプラスミドを造成し、遺伝子工学的手法によっ
て所望蛋白質を菌体外に分泌させることに成功し、上記
した種々の問題点を解決するに至った（特願昭５９−１
．５９７０３号）。　ところで、Ｊ　、　［３ｅｃｈｗ
ｉｔｈらは、大腸菌の外股プロティンに約２Ｘ１０’個
の孔が存在し、これらの孔は、分泌性蛋白質に共通して
いることを示唆している（Ｃｅｌｌ　、、２４．７０９
（１９８１））。従って、膜通過に際して、複数の分泌
性蛋白質が該孔を競合し合い、菌体外分泌が低下するこ
とが考えられる。

従って、上記のような遺伝子工学的手法による蛋白質の
製造法では、その所望の蛋白質を菌体外に分泌させる際
には、所望蛋白質以外の分泌性蛋白質と競合することか
ら、このような競合を受けることなく、効率よく所望蛋
白質を菌体外に分泌させる方法の提供が望まれていると
ころである。

発明の概要 要　　旨 本発明は、上記の点に解決を与えることを目的とし、シ
グナルペプチドをコードする遺伝子の直後に、所望の外
来性蛋白質をコードする遺伝子を結合さゼ、かつ外来性
蛋白質をコードする遺伝子以外に存在する分泌性蛋白質
をコードする遺伝子を人工的に除去したプラスミド１１
換体を提供し、ざらに該プラスミドを含む大腸菌を提供
することにより、この目的を達成しようとするものであ
る。

従って、本発明による蛋白質の製造法は、下記の工程か
らなること、を特徴とするものである。

（イ）　シグナルペプチドをコードする遺伝子の下流側
末端直後に所望の外来性蛋白質をコードする遺伝子を結
合させ、その結果として得られた、プロモーターコード
する遺伝子とＳＤ配列をコードする遺伝子とシグナルペ
プチドをコードする遺伝子と所望外来性蛋白質をコード
する遺伝子とから少くとも成る塩基配列を含み、しかも
この塩基配列部分以外の部分に分泌性蛋白質をコードす
る遺伝子を含まないプラスミド組換体、を用意すること
。

（ロ）　このプラスミド組換体を用いて宿主細胞の形質
転換を行なって、形質転換体を調製すること。

（ハ）　この形質転換体を培養して、産生された所望の
外来性蛋白質を回収すること。

また、本発明によるプラスミド組換体は、シグナルペプ
チドをコードする遺伝子の下流側末端直後に所望の外来
性蛋白質をコードする遺伝子を結合させ、その結果とし
て得られた、プロモーターをコードする遺伝子とＳＤ配
列をコードする遺伝子とシグナルペプチドをコードする
遺伝子と所望外来性蛋白質をコードする遺伝子とから少
くとも成る塩基配列を含み、しかもこの塩基配列部分以
外の部分に分泌性蛋白質をコードする遺伝子を含まない
こと、を特徴とするものである。

さらにまた、本発明によるエシェリキア（Ｅ　５（ｈｅ
ｒｉｃｈｉａ）属に属する所望外来性蛋白質産生菌は、
シグナルペプチドをコードする遺伝子の下流側末端直後
に所望の外来性蛋白質をコードする遺伝子を結合させ、
その結果として得られた、プロモーターをコードする遺
伝子とＳＤ配列をコ一部する遺伝子とシグナルペプチド
をコードする遺伝子と所望外来性蛋白質をコードする遺
伝子とから少くとも成る塩基配列を含み、しかもこの塩
基配列部分以外の部分に分泌性蛋白質をコードする遺伝
子を含まない、プラスミド組換体によって形質転換され
たものであること、を特徴とするものである。

効　　果 このように、本発明は、シグナルペプチドをコードする
ｊ右伝子の下流側末端直後に所望の外来性蛋白質をコー
ドする遺伝子を結合させ、その結果として得られた、プ
ロモーターをコードする遺伝子とＳＤ配列をコードする
遺伝子とシグナルペプチドをコードする遺伝子と所望外
来性蛋白質をコードする遺伝子とから少くとも成る塩基
配列を含み、しかもこの塩基配列部分以外の部分に分泌
性蛋白質をコードづ−る遺伝子を含まない組換体プラス
ミドを利用するという点に特徴を右Ｊる、遺伝子工学的
手法による蛋白質の製造法およびそれに用いるプラスミ
ドならびにそのプラスミドを含む大腸菌に関する。

そして、本発明に用いるプラスミド組換体の好ましい態
様によれば、シグナルペプチド遺伝子の下流側末端直後
への所望蛋白質の構造遺伝子の結合を容易にするために
は、必要ならば、シグナルペプチド遺伝子の塩基対の少
くとも一つを構成員の少くとも一部として人工的に０１
出された制限酵素認識部位を有するものを用いる。

この部位を創出するに当っては、ＤＮＡ塩基対からなる
コドンには縮重があるこということを巧みに利用するこ
とができる。すなわち、創出された制限酵素認識／切断
部位を該制限酵素で切断すれば、その切断部位がシグナ
ルペプチド遺伝子ＤＮＡの下流側末端に接して存在する
場合は該制限酵素切断端と相補性の端部を上流側に形成
させた外来性遺伝子を用意してこれを上記切断端におい
てシグナルペプチド〕ざ信子と結合させることによって
シグナルペプチド遺伝子の下流側に外来性遺伝子を直結
させることができる。また、シグナルペプチド遺伝子の
切断部位が該遺伝子の下流側末端より上流側に存在する
場合は、該遺伝子の該切断部位より下流側の部分を合成
して外来性）盲信子の上流側に結合した断片を用意して
上記と同じに結合を行なえばば、一旦切断されたシグナ
ルペプチド遺伝子がＤＮＡの両鏡について復元されると
共にその下流側に外来性遺伝子が直結された構造が実現
される。

その結果、所望蛋白質はシグナルペプチドの直後に結合
しているので、前記したようなシグナルペプチドの働き
によって、その蛋白質は発現可能なものどなる（特願昭
５９〜１５９７０３号参照）。更に、所望の外来性蛋白
質をコードする遺伝子以外に存在する分泌性蛋白質をコ
ードする遺伝子を任意の制限酵素で切断して分泌性蛋白
質をコードする遺伝子を除去することで菌体内で発現さ
れた所望蛋白質は、前記プラスミド由来の分泌性蛋白質
と競合Ｊ′ることなく、効率に＜菌体外へ分泌される。

この際に、シグナルペプチドはＨ’ＪＭ素（シグナル・
ペプチダーゼ）によって水解されるので、該蛋白質に余
分なアミノ耐重、結合されてＪ５らず、完全な成熟蛋白
質として得ることができる。

なお、本発明にｄ３いて「菌体外への分泌」という表現
は、宿主が大腸菌のようなクラム陰性菌においては所望
蛋白質が菌体内からペリプラズム（細胞質膜と外股との
空間）に移行したことを意味し、枯草菌のようなクラム
陽性菌においては細胞膜外に移行したことを意味するも
のである。

本発明は、このように、シグナルペプチドによる菌体外
への分泌機能を巧みに利用して所望蛋白質を成熟蛋白質
として、効率よく菌体外へ分泌させるための蛋白質の製
造法およびそれに用いるプラスミドならびにそのプラス
ミドを含む大腸菌を提供するものである。

従って、本発明は、前記の目的を達成するとともに、下
記の利点を有するものである。

（イ）　所望蛋白質の生成が簡単である。従来は、宿主
菌の生育を行い、適当な時期に宿主菌を破壊したのち、
菌が本来持っている雑多の物質の中から所望蛋白質を抽
出生成していたため、多大−１１＝ な労力が必要であるうえ、生成困難な物質もあった。本
発明の蛋白質の製造法によれば、前記シグナルペプチド
の働きにより産生される蛋白質は菌体外に分泌され、菌
の生育培地はその構成成分が判っているのであるから、
培地からの目的物質の確認、回収が容易どなる。

（ロ）　産生物質がペプチダーゼによる分解から保護さ
れる。ずなわち、菌体内には多くのペプチダーゼ（プロ
テアーゼ）が存在するので不必要な蛋白は速やかに水解
されてゆくが、本発明によって目的の有用蛋白質を菌体
内に止めることなく直ちに菌体外へ分泌させれば、この
目的蛋白は上記の氷解酵素から保護される。

（ハ）　如何なる外来性蛋白でも発現可能である。すな
わち、従来の雑種蛋白法では、目的とする蛋白を純粋に
得るためにたとえばメチオニンに特異的な臭化シアン処
理（３ｃｔｅｎｃｅ、　１９８　。

１０５６（１９７’７））によって余分な蛋白を切断し
たり、リジンやアルギニンに特異的なトリプシン消化（
Ｎａｔｕｒｅ　、’　２８５　、　４５６（１９８０）
）を行う場合には、目的とする蛋白のアミノ酸組成中に
これ′らのアミノ酸が含まれているときはそこでも切断
が生じるため完全な形で所望の蛋白を得ることができず
、一方直接発現法（前記Ｎ　ａｔｕｒｅ誌）によって蛋
白を産生さゼる揚台には、遺伝子Ｎ末端には開始コドン
（メチオニン）が必要であって産生蛋白もＮ末端にメチ
オニンが付いたものとして得られるものもあり（特開昭
５６−６８３９９号公報参照）、このような末端のメチ
オニンは臭化シアン処理により分解除去することが技術
的に難しいので、結局産生させた蛋白は天然のものと異
質のものとなる。これに対して、本発明によるプラスミ
ド組換体をベクターとして外来性遺伝子を宿主菌内で発
現させると、いったんシグナルペプチドとの融合ないし
雑種蛋白として産生された蛋白は宿主菌内のシグナルペ
プチドによって特異的にシグナルペプチド部分が切断さ
れて、所望組成の成熟蛋白となって宿主菌細胞外へ′分
泌される。

（ニ）　所望蛋白質が、菌体外へ効率よく分泌される。

すなわち、所望蛋白質をコードする遺伝子以外に分泌性
蛋白質をコードする遺伝子が存在しないプラスミドを用
いることににす、産生された所望蛋白質は、既存のプラ
スミド由来の分泌性蛋白質と競合覆ることなく、菌体外
へ効率よく分泌される。

所望蛋白質をコードする遺伝子（構造遺伝子）としては
、インシコリン、血清アルブミン、ヒ１〜成長ホルモン
、インターフェロン、上皮細胞成長因子等の真核性の細
胞蛋白質のものが考えられ、天然物（染色体ＤＮＡ）よ
り調製したものでもＪ：いし、あるいは合成したものを
用いてもよい。

なお、これら所望蛋白質をコードする遺伝子の調製方法
については種々の成書や文献および公開ま１＝は公告公
報を参考することができ、主要なものに下記のものがあ
る。

（１）　直接染色体ＤＮＡから所望遺伝子を調製する方
法（ｐｒｏｃ　、　Ｊａｐａｎ　　Ａｃａｄ　、　、　
５５Ｂ。

４６４、（１９７９）、特開昭５７−１３０９９８号、
同５７−１６６９９２号、同５７−２０８９９４号、同
５８−１３５９９号公報等）（２）　メツＬンジｖ−Ｒ
ＮＡ（以下、ｍＲＮＡという）を調製したのら、これを
もとに公知の所要の工程を経て調製する方法（特開昭５
８−５６６８４号、同５６−２９９８号、同５６−３６
４．９９号、同５６−６３９９６号、同５’６−８５２
９６号、同５６−１０４８９７号、同５６−１３１５２
２号、同５６＝１３１５９８号、同５６−１５０１００
号、同５６−１５４　／１．９９号、同５６−１５８７
９３号、同５６−１５８７９９号、同５７−２４４００
号、同５７−１４１２８７号、同５７−１７１９９９号
、同５７−１７４０８’５号、同５７−２０６７００号
、同５８−９６８７号、同５８−５６６８４号各公報等
）。

（３）　所望遺伝子が作る蛋白質のアミノ酸配列をもと
にＤＮＡを化学合成することにＪ−って、所望蛋白質を
コードする遺伝子を調製する方法（特開ＩＩＱ５７＝１
’２２０９６号、同５７−＝　　１５　− ２００３　／１．３丹、同５７−２００／１００Ｍ、同
５８−１０６００号各公報等）。

上記のどの方法を参照にして行うかは、所望蛋白質をコ
ードする遺伝子の種類ににつて決定すればよい。なＪ′
３、以下の実施態様としては本発明においてはヒトクロ
ガス１〜ロン（以下、ｈＵＧという）の構造遺伝子を化
学的に合成したものを用いている。その操作の詳細につ
いては、特願昭５８−１７５７４２号の明細書を参照さ
れたい。

Ｌ文スＡ下 １）プラスミド組換体 遺伝子操作においてプラスミドとは、細菌細胞質におい
て宿主染色体とは独立に自律的に増殖している遺伝的に
安定な遺伝因子をいい、外来性遺伝子〈所望蛋白質をコ
ードする遺伝子）を宿主細胞に移入して（の細胞中で外
来遺伝子を増殖させる役割をもつ運搬体のＤＮＡとして
有用なものである。

本発明でいうプラスミドとは、上記の機能を具備し、か
つ分泌機能を右するものであって、組込まれる外来性蛋
白質をコードする膚伝子以外に分泌性蛋白質をコードす
る遺伝子が何一つ存在しないものをいう。

ここでいう分泌機能を有するプラスミドとは、プロモー
ターをコードする遺伝子、Ｓ’Ｄ配列をコードする遺伝
子、シグナルペプヂドをコードする遺伝子おＪ：び前記
した所望外来性蛋白質をコードする遺伝子から少くとも
成る塩基配列を具備するものである。

（イ）プロモーター プラスミド中でプロモーターは、プラスミドの発現効率
に係る最も重要な領域の一つである。　・本発明で使用
するプロモーグーをコードする遺伝子（Ｒ’Ｎ　Ａポリ
メラーゼが結合して転写を゛開始するＤＮＡ領域）は、
天然の染色体ＤＮＡより取得してもよいし、また既に多
数のプロモーター遺伝子の塩基配列が決定されているの
で合成したｂのの使用も可能である。さらに、全く新し
いプロモーグーを合成して使用することも可能である（
特開昭５９−７１６９２号公報参照）。

ぞの中でも好ましいプロモーター領域としては、プロモ
ーター作用の強いもの、例えばＴ　ｒＬ−プロモーター
、ｒｅｃ　Ａ−プロモーター、Ｐ　Ｌ−プロモーター、
１ａｃ−プロモーター等〔蛋白質・核酸・酵素、２６．
４４．３　（１９８１））がある。なお、後記実施例に
おいてはアルカリ性フォスファターぜ由来のプロモータ
ーを用いている。

（ロ）ＳＤ配列 シャイン・ダルガーノ配列とも呼ばれており、翻訳開始
コドン（ＡＵＧまたはＧＵＧ）の直前にあってリポソー
ムの１６ｓＲＮΔの３′未配列と結合するｍＲＮＡ上配
列をいい、プロモーター同様、天然から取得して来るか
、または化学的に合成したものを使用することができる
。

（ハ）シグナルペプチド 本発明におりるプラスミド中でシグナルペプチドは、本
発明者らが特願昭５８−１４．０７４８号および５９−
１５９７０３号明細書で示した様に、シグナルペプチド
をコードする遺伝子に対応するＤＮＡ部分を含む遺伝子
に人工的に創出された制限酵素認識部位（例えばＨｉｎ
ｄ　ＩＩＩ、　ＮａｅＩ等）を１個所有し、しかもこの
制限酵素認識部位が、このＤＮＡの塩基対の少くとも一
つを構成員の少くとも一部とするものであるもの、であ
るものが好ましいく詳細は上記明細書参照）。このＪ、
うなシグナルペプチドをコードする遺伝子は、アルカリ
性フォスファターゼ由来のもの、β−ラクタマーゼ由来
のものなど任意のもの（リボプロティンなど）がありう
る。このｊ右伝子は天然から取得しても合成して取得し
てもよいことは言うまでもなく、合成して取寄する場合
は必要ならばアミノ酸に対応するコードを適宜選択して
遺伝子を設語、合成することができる。

本発明は、上記した分泌機能を右するプラスミドに存在
する所望の外来性蛋白質以外に分泌性蛋白質をコードす
る遺伝子、例えばアシピシリン耐性遺伝子（以下Ａｍｐ
　　ど記寸）を、常法に従って切断除去したものである
（必要に応じて、分泌性蛋白質をコードする遺伝子を除
去した後、選択マーカーとして非分泌性の薬剤耐性マー
カー（分泌性蛋白質をコードしない薬剤耐性マーカー）
、例えばカナマイシン耐性遺伝子（以下Ｋｍ　　と記７
１）、テ！〜ラリーイクリン耐性遺伝子（以下ＴＣｒと
記す）、等を導入してもにい）。

このＪ：うなプラスミドの一員体例としては、本発明で
用いたプラスミドｐＴＡ２５２９がある。

ｐＴＡ２５２９は大腸菌由来のプラスミド１）ＴＡ１５
２９　（ｐＹＫ２８３　（Ｆ、Ｃｏ１１　Ｋ１２Ｃ６０
０（ｐＹＫ２８３＞として寄託演み（微■研条寄第５５
６号））から特願昭５８−１４０７４８号に開示された
方法に従ってつくったもの〕とｐｌ−ＩｓＩ（このプラ
スミドは、ｐＢＲ３２２を制限酵素ＥＣ０ＲＩおＪｚび
ｌ−１ｉｎｄＩ［ＩＦ消化し、コ（Ｄ［、ｃａＲＴ−Ｈ
ｉｎｄ　Ｉｆｆ部分を下記の合成リンカ−ＥｃｏＲＴ　
　ｌ−１ｐａＩ　　　ＳｍａＩ　　　１ｌｉｎｄｌｌｌ
で買換したもの（特開昭５９−７１６９２＞）とから造
成した１）ＴＡ１５’２９（特願昭５９−１５９７０３
号）を常法に従って制限酵素ＰＳｔニおよびＡ’ａｔｌ
’ｉで切断し、Ａ　ｍｐｒを除去した後、非分泌性の薬
物耐性マーカー、例えばカナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍ
　　）を導入することにＪ：り造成したものである（造
成操作は、後記実験例を参照されたい）。

外来性（所望蛋白質）遺伝子が発現しかつ分泌するよう
にしくまれた上記のようにして調製されるプラスミドの
適当な位置に所望蛋白質をコードする遺伝子を組込むこ
とにより、本発明のプラスミド組換体が造成される。組
込操作そのものは、分子生物学の分野で公知の常法に従
って行うことできる（例えば特願昭５９１５９７０３号
参照）。具体的な方法にっていは、後記実施例を参照さ
れたい。

なお、本発明でいう所望蛋白質以外の分泌性蛋白質とは
、組込まれる所望外来性蛋白質をコードする遺伝子以外
にベクターとして用いるプラスミドがコードする菌体外
分泌可能蛋白質をいい、例えば、β−ラクタマーゼがこ
れに該当する（　Ａ　ｎｎ。

Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、３６　４３５（１９８
２））。

また、これをコードする遺伝子を本発明では、分泌性蛋
白質をコードする遺伝子と呼ぶことにする。

２）リンカ− 所望蛋白質の構造遺伝子をベクターに組込むにあｌこり
、フレームを合わせたり、所望の制限酵素切断片やリポ
ソーム結合部位などを導入するｌｃめ、合成した種々の
リンカ−を用いることは絹換えＤＮＡ技術技術上右手段
である。

本発明の一実施態様においてもリンカ−を利用している
が、それはフレームを合わせるため、Ｊなわちシグナル
ペブヂドの分泌機能を利用することができかつ所望蛋白
質に余分なアミノ酸が付着ηることなく得られることを
目的として、合成リンカ−を利用するものである（実際
の利用例は、特［昭５９−１５９７０３号明細書を参照
されたい）。

リンカ−の合成は、十−鎖のそれぞれについて、これを
いくつかのフラグメントに分りたものを化学的に含成し
、ついで各フラグメントを結合する任意の方法によって
達成される。フラグメン１〜の合成法としては、ジエス
テル法（３ｃｉｃｎｃｅ、　　２０３゜６１／ｌ　（１
９７６）”）、ｌ−ジエステル法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１
９８．１０５６　＜１９７７））、固相法（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　８゜５
４９１　（１９８０））、液相法、あるいは酵素をもチ
イル方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ　、　、　２
４１゜２０１４’（１９６６））等があるが、合成時間
、収率、精製などの点から、固相法でトリエステル法に
Ｊこるものが好ましい。

３）方向性の判定 ベクターに組込まれた所望蛋白質をコードする遺伝子の
方向性の判定は、構造遺伝子内に含まれる特定の部位を
認識する酵素でその部位を切断し、構造遺伝子外の特定
の位置に別の酵素で切断を入れ、得れた断片の大きさを
分析することにより行うことができる。

形質転換株の調製 （イ）宿主菌 宿主菌は、上記造成のＤＮＡＩＩ換体がその菌体内で増
殖できるものである限り、任意の微生物でありうる。具
体的には、例えば、大腸菌、枯草金またはＭ−母等の任
意の宿主を用いることができる。

所望蛋白質の菌体外分泌を更に高めるためには、使用す
べき宿主菌は宿主染色体由来の分泌性蛋白質の発現が抑
制されるか、または欠損したものが好ましい。そのよう
な宿主菌の一員体例としては、エシェリキア・コリに属
する大腸菌株ＹＫ５３７がある。このＹ　Ｋ　５３７は
、グラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性等の大
股菌属の一般属性を有する仙、Ｆ因子を含まず、サプレ
ッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組換えに関与する
ヌクレアーゼをコードするｒｅｃ　’Ｂ　Ｃ遺伝子に欠
陥を右する。栄養要求性としては、ロイシンどチアミン
をその最小培地上での増殖に必要とするものである。こ
の菌株は、通常の大腸菌株が有している染色体からのア
ルカリホスファターゼの発現が欠損しているものである
（Ｅ、　Ｃｏ１１　Ｋ　１２　　ＹＫ５３７として寄託
済み（微工研菌寄第７９４１号））。

なお、ここでいう染色体由来の分泌性蛋白質とは、宿主
菌の染色体遺伝子によりコードされている菌体外に分泌
可能な蛋白質をいい、例えば、アルカリ性フＡスファタ
ーゼ、外膜主要リポ蛋白、外膜ＯｍｐＣＩ白、外膜Ｏｍ
ｐＦ？ｔｉ白、外膜ＯｍｐＡ蛋白等がこれに該当する（
Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

、３６　４３５Ｍ９８２））。

（ロ）形質転換 形質転換走査そのものは、分子生物学の分野で公知の常
法（例えば大腸菌を形質転換する場合はクシゴナ−法（
Ｇｅｎｅｎｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１９７　Ｆ
３　。

１７（１９７８）があり、枯草菌を形質転換する場合は
大腸菌の形質転換の遺伝子手法を適用でき、具体的に成
書「遺伝予相換え実用化技術３」サイエンスフォーラム
社刊ｐ３３〜（１９８２）成書「Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕ
ａｌＪｐ２４７〜２６８、Ｃｏ１ｄ　３ｐｒｉｎｇ　ｆ
−１ａｒｂｏｒＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（１９８２）
）等に従って行うことができる。なお、大腸菌について
の具体的な形質転換法については、後記実験例を参照さ
れたい。

（ハ）形質転換体 形質転換操作によって形質転換された株は、組換え体プ
ラスミドの移入によって作り出された絹１り体ＤＮＡの
マーカー（薬剤耐性、栄養要求性等）を指標にして選択
することができる。

形質転換体の一員体例としては、大腸菌に１２ＹＫ５３
７をｐＴＡ２５３２にＪ：つて形質転換ざぜて得た形質
転換体（後記実験例参照がある。この形質転換体は、宿
主菌に１２ＹＫ５３７とはカナマイシン耐性（Ｋｍ　　
）の性質において異なる菌株である。従って、この性質
を指標として形質転換体を選択することもできる。

なお、本発明でいうプラスミドにより形質転換されたエ
シェリキア（Ｅ　５ｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する所望
外来性蛋白質産生菌とは、所望の外来性蛋白質をコード
する遺伝子が組込まれた本発明プラスミドを用いて形質
転換されたエシェリキア（Ｅ　５ｈｅｒｉｃｈｉａ）属
に属する菌株をいい、用いられる宿主菌はエシェリキア
（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属するもののうち該プラ
スミドが菌体中で増殖できるもの、好ましくは微生物の
遺伝的性質が解明されているもの、である。この好まし
い微生物の一例としては、Ｅ、Ｃｏ１１　Ｋ１２Ｃ６０
０（Ｑｅｎｅｔｉｃｓ　、４９．４４０　（１９５４）
。

Ｎａｔｕｒｅ、２１７．１１１０（１９６８））。

Ｅ、Ｃｏ１１　ｘＡ３５　（微光研菌寄第７１３３号）
、および上記したＦ、　Ｃｏ１１　Ｋ　１２に５３７等
、任意の菌株が用いられる。

所望蛋白質の産生および回収 所望蛋白質は、宿主菌（ずなわち上記形質転換体）を常
法に従って培養することににって産生される。具体的な
方法については、後記実験例を参照されたい。

菌体からの所望蛋白質の回収は、宿主菌が大腸菌のよう
にクラム陰性菌の場合は所望蛋白質はシグナルペプチド
の分泌機能によってペリプラズムに分泌される。従って
、浸透圧ショック法（Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ　、、
２４０．３６８５（１９６５））によってペリプラズム
から細胞壁外（培地中）に放出させたのち培地から容易
に所望蛋白質を回収することができる。また、宿主菌が
枯草菌のようなクラム陽性菌であれば、シグナルペプチ
ドの分泌作用で所望蛋白質は菌体外へ放出される〔枯草
菌を用いて所望蛋白質を産生される方法としては、例え
ばＱｅｎｃ、λ２，２２９〜２３５　（１９８３）があ
る〕ので培地から容易に回収することができる。なお、
宿主菌が大腸菌の場合の培養および所望蛋白質を浸透圧
ショック法を行ったのち回収する方法についての詳細は
、後記実験例を参照されたい。

実　　施　　例 プラスミドの作成 分泌機能を有し、かつプラスミド由来の分泌性蛋白質を
コードする遺伝子が存在しないプラスミドの作成を、下
記のとおりに行った。■程は、第１〜２図に示した通り
である。

１　）ｌ）ＴＡ２５２９の作成 （イ）　本発明者らが先に提案した分泌機能を有するプ
ラスミド１５２９（特願昭５９−１５９７０３号参照）
（第１図中■）５μりを５０　ｍｅの反応液（５０ｍＭ
ｔ−リス−塩酸緩衝液（以下Ｔｒｉｓ　−１−Ｉ　ＣＩ
と記す）（ｐＨ８）　、５０ｍＭｊｉ化ナトリウム（以
下ＮａＣ１と記す）、１０ｍＭ塩化マグネシウム（以下
ＭｇＣｌ２と記す）〕中で、４単位の制限酵素ＰＳｔＩ
（タカラ社）（以下ｐｓｔ■と記す）（１μ、＋１）お
よび４単位の制限酵素ＡａｔＩ［（東洋紡社）以下Ａａ
ｔＩと配り）（１μＢを用いて３７℃で１時間処理した
後、フェノールで抽出し、エタノール沈殿にて、第１図
中■を回収した。この沈殿物は、５０μｐの反応液（６
７ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　、　６．７ｍＭｔＶＨ
ｌｃｌ　　、６．７ｍＭエチレンジアミン四酢酸（以下
ＥＥＤＴＡと記す）、１６．６ｍＭ硫酸アンモニウム（
以下（Ｎ＋−１）　　８０４と記す）、１０ｍＭメルカ
プトエタノール、０．６６ｍＭｄＡＴＰ、０．６６ｍＭ
ＴＴＰ、０．６６ｍＭｄＣＴＰ、０．６６ｍＭｄＧＴＰ
、）中で１単位のＴ４−ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲ，１
社）を用いて、３７℃で１５分間処理した後、アガロー
ス電気泳動にて目的どするフラグメント（第１図巾■）
を回収した。

（ロ）　　ｐＡＣＹＣ１７７（Ｊｏｕｒｍａｌ　ｏｆＢ
ａｃｔｃｒｉｏｌｏ（ＩＶ　、　１３４．　Ｎｏ、３　
１１４１〜１１５６（１９７８）（第１図中■）５μ９
を５０μＢの反応液（５００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−１−
ＩＣＩ（１）ｌ−１７，４＞、１０ｍＭ　　ｖｇｃ＋　
　、５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃｌ　）中で４単位の制限酵素
１１ａｌｒ（タカラネ１）（以下１−１ａ（［ど記す）
１μβを用いで、３７°Ｃで６０分間処理した。これを
フェノールで抽出した後、エタノール沈殿にて第１図中
■を回収した。沈殿物は、前記と同様に、１単位のＴ４
ＤＮへポリメラーゼ（ＢＲｌ社）で処理した後。アガロ
ース電気泳動にて７ラグメン１〜（第１図中■）を回収
した。

以」二の操作（イ）、（ロ）で得られた２本のＤＮＡフ
ラグメン１−（第１図中■および■）を、３０ｕｊの反
応液（２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−１−ＩＣＩ（ｐｌ−１
７’、５）、１０ｍＭ　　Ｍ（＋　ＣＩ　　、１０ｍＭ
　　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　　ＡＴＰ）中ｒ３０単位のＴ
４ＤＮΔリガーゼ（タカラ）を用いて１４°Ｃで１６時
間反応させた。反応終了後、反応混合物で、大腸菌に１
２Ｃ６００（微工研条寄第１５５号）を形質転換させて
目的とするプラスミド（ｐＴＡ５２９）を含む形質転換
株を１！″ｉた。

２）ｐＴ△２５３９の作成 （イ）　本発明者らの昭和５９年１２月２１日付出願に
係る明細書に記載された方法に従って調製されたｐＴ△
１５２９Ｅｃｏ　（第２図中■）５μ９を５０μ、Ｉｌ
の反応液（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　（ｐｌ−
１８）、１０ｍＭ　　Ｍｇ’ＣＩ２　。

１００ｍＭ　　ＮａＣ１）中で４単位の制限酵素１−１
ｐａｌ（タ　カラ）（以下Ｉ−ｌ　ｐ　ａ　Ｉと記ｖ＞
１μρを用いて、３７℃で１時間処理した後、フェノー
ルで抽出し、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿物
を５０μ力の反応液（１００ｍＭＴｒｉｓ　−１−１ｃ
　ｌ　（ｐｌ−１７，５’）’、５０ｍＭＮａＣｌ、１
０ｍＭ　　ＭｇＣ１２）中で４単位のＥｃｏＲＩ　（タ
カラ）（以下［ｇ　ｃ　ｏ’　ＲＩど記ず）１μ℃を用
いて３７℃で１時間処理した後、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にて目的とするフラグメン１〜（第２図中■
）を回収した。

（ロ）　本発明者らにより調製されたｐＢＲ−ｂｌａ　
（第２図中■）く特願昭５９−１５９７０３号参照）５
μグを反応液（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−１−ＩＣＩ　
　（ｐｌ−ｒａ）、　　１ａｍＭ　　Ｍ（ｌ　ｃ＋２゜
１５０ｍＭ　’Ｎａ　Ｃｌ　）中で４単位の［ＣＯＲ丁
１μｇおよび４単位の制限酵素５ａｌＩ（タカラ社）（
以下５ａｌＩと記す）１μβを用いて、同様に３７°Ｃ
で１時間処理した後し、アガロース電気泳動にて目的と
するフラグメン１〜（第２図中■）を１ｑた。

（ハ）　前記のように調製したｐＴＡ２５２９（第２図
中■）５μ７を５０μβの反応液（１００ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ｌ−１ｃＩ　（ｐ）−１７，５）。

５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ＋　＋’　１０ｍＭＭ（］　Ｃ＋
２）中で４単位のＥｃ’ｏＲＩ　　１μ（を用いて３７
℃で１時間処理した後、フェノールで抽出し、エタノー
ル沈殿を行った。得られた沈殿物■（第２図）は前記ど
菌株、１単イリのＴ４ＤＮΔポリメラーゼ（ＢＲｌ−社
）１μρを用いて処理した。更に５０μ、０の反応液（
１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−１−１ｃ　ｌ　（ｐｌ−１８
）、１’５’Ｏｍ’Ｍ　　Ｎａ　Ｃｌ、１０ｍＭ　　Ｍ
ｇＣｌ２〕中で４単位のＳａｌ’１１μηを用いて、３
７℃、１時間処理した後、目的とするフラグメント（第
２図中■）をアガロースゲル電気泳動にて回収した。

以上の操作（（イ）〜（ハ））でえられた３本のＤＮＡ
断片（■、■、■）を、３０μ刃の反応液（２０ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ　−１−１ｃ　ｌ　（ｐｌ−１７，５）。

１０ｍＭ　　ＭＣＩ　ＣＩ　　、１０ｍＭ　　ＤＴＴ。

０．５ｍＭ　　ＡＴＰ）中で３００単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（タカラ社）を用いて１４℃で１６時間反応させ
た。反応終了後、反応混合物で大腸菌ＹＫ５３７　（Ｅ
、Ｃｏ１１　Ｋ１２ＹＫ５３７として寄託汎み（微工研
菌寄第７９４１号））を形質転換させて目的とする形質
転換株を得た。なお、ここで得られた株からプラスミド
をＷＡ製しく特願昭５８−１４０７’４．８号参照）、
各ＤＮＡ断片の接続部の塩基配列をマキサム・ギルバー
１〜法（ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ　、　
Ｓｃｉ　　ＬＪＳＡ、　７４゜５６０　（１９７７））
にＪ一つて確認した。

蛋白質の製造 ヒ１−ウロガストロン（ｈＵＧ／ＥＧＦ）を本発明のプ
ラスミドに組込／υで、ｊ責伝子工学的手法に従って産
生させて、その回収を行った。工程は、第４〜５図に示
した通りである。

ｈＵＧ構造遺伝子の合成 ｈＵＧ構造遺伝子の合成は、特願昭５８−１２３５２０
号明細書に開示しである方法に従って行った。すなわち
、鎖長１０〜１７のフラグメン１〜を予め合成しておき
、ついでこれら合成フラグメンＩ〜をブロックごとに分
（プで結合反応を行い、最後にこれらブロックを結合さ
駄て、完全なｈｌＪＱ構造遺伝子を合成した。合成した
ｈＵＧ構造遺伝子の塩基配列は、第３図に示す通りであ
る。図中、↓はｈＵＧ構造遺伝子の開始点を示し、★は
終止点を示す。また、同図中Ｍｌ等はいうまでもイｆく
メヂオニン等のアミノ酸を示すものであり、Ａ。

丁、ＣおよびＧは塩基を示寸ものであって各々アデニン
、チミン、シー・シンおよびグアニンの略弓として当業
界で承認されているものである。さらに、図中の数字は
フラグメント・の塩基数を示し、ＦＣＯＲＩ等は制限酵
素認識部位を示すものである。

ｈ　Ｕ　Ｇ　５？ｉ伝子を含有Ｊ−るプラスミドの作成
１）形質転換株（Ｅ、Ｃｏ１１　Ｋ１２ＹＫ５３７（１
）ＴＡ２５２２））の調製 （イ）　　１）ＴＡ２５２９第４図中■５　ｔｌｑを、
５０μρの緩衝液（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−１１ｃ　
Ｉ（ＤＩ−１７，５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ　　、５
０ｍ１ｖｌ　　Ｎａ　Ｃｌ　）中で４単位の制限酵素Ｈ
ｉ　ｎ　ｄ■（タ　カ　ラ）（以下ｌ−１ｉ　ｄ　Ｉ［
＞を用いて３７℃で１時間加水分解した。ついで、エタ
ノール沈殿を行い、得られた沈殿物を、３０μρの反応
液（６７ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−１−１ｃ　ｌ　（ｐｌ−
１８，８＞。

１６．６　（Ｎｌ−１４）２　ＳＯ２，６，７ｍＭＭｇ
Ｃｌ　　、１０ｍＭ　　２−メルカプ１〜エタンール、
６．７ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．６６ｍＭずつのｄＡＴＰ
、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ））中で１単位のＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（上記）を用いて３７℃で１５分間処
押した。ついで、エタノール沈殿を行ったのち、得られ
た沈殿物を、５０μｍの反応液（１００ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ　−１−１ｃ　１（ｐｌ−１７，５）、５０ｍＭ　　
Ｎａ　Ｃ１，１０ｍＭＭ（ＩＣＩ２）中で４単位のＥｃ
ｏＲＩ　　１μｇを用いて３７℃、１時間処理した後ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にて目的とする２５０ｂ
ｐのＤＮＡ断片（第４図中■）を回収した。

（ロ）　　ｐＴＡ２５２９（第４図中■）５μ３を、５
０ｕｆＪの反応液（１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−１−Ｉ
ＣＩ、５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１０ｍＭＭａＣ１２〕中
で４単位のＥｃｏＲＩ　　１ｕＢを用いて３７℃、１時
間処理した。ついで、エタノール沈殿を行い、得られた
沈殿物を、５０μｐの反応液（６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−
ＨＣＩ　（ｐｉ−１８）　、　６ｍＭＭｇＣｌ２，１５
０ｍＭ　　ＮａＣｌ）、中で４単位の制限酵素３ａｌＩ
（タカラ）（以下、５ａｌＩと記す）を用いて３７℃で
１時間加水分解した。

反応終了後、アガロースゲル電気泳動によって、４３０
０ｂｐａ′）ＤＮＡ断片（第４図中■）を得た。

プラスミドｐＢＲ３２２−ｈＵＧ　（ｐＢＲ３２２（Ｅ
、Ｃｏ１１　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＢＲ３２２）として寄
託済み（微工研条寄第２３５号））第４図中■をＥｃｏ
ＲＩおよび５ａｌＩで消化したものに上記で合成したｈ
Ｕ（［造遺伝子をＦＣＯＲＩおにび５ａｌＩで消化した
断片を組み込んだもの）５μｑを、５０μＯの反応液（
１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−１−１ｃＩ　（１）ｌ−１７
，５）。

５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、５０ｍＭＭ０ＣＩ２）中で４単
位のＥｃｏＲＩ　（タカラ）を用いて３７℃で１時間加
水分解したのち、上記と同様にＴ４ＤＮＡ４ＤＮＡポリ
メラーゼい、ざらに３ａｌｌ：処理を行ったのち、アガ
ロースゲル電気泳動によって１６０ｂｐのＤＮＡ断片（
第４図中■）を得た。

上記で調製した三つのＤＮＡ断片（第４図中■。

■および■）を、３ｃＩ℃の反応液（２０ｍＭＴｒｉｓ
　−１−ＩＣＩ　（ｐｉ−１７，５＞　、　１０ｍＭＭ
ｇ　Ｃｌ　　　、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、０．５ｍＭＡＴ
Ｐ）中で３００単位のＴ４４単のＴ４ＤＮＡリガーゼ（
タカラ）を用いて１４℃で１６時間反応させた。反応終
了後、これで大腸菌ＹＫ５３７（Ｅ、Ｃｏ１１　Ｋ１２
ＹＫ５３７として寄託済み（微工研条寄第７９４１号）
〕を狼質転換させ、目的のプラスミド〔以下ｐＴＡ２５
２２と記す〕（第４図中■）を含有する形質転換株（Ｅ
。

Ｃｏ１１　Ｋ１２ＹＫ５３７　（ｐＴＡ２５２２））を
得た。

２）形質転換株（Ｅ、　Ｃｏ１１　Ｋ　１２ＹＫ５３７
（ｐＴＡ２５３２））の調製 （イ）　　ｐＴＡ２５３９（第５図中■）５μｑを、５
０１１の反応液（６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−１−１ｃ　Ｉ
（ｐＨ８＞、２０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１，６ｍＭＭ（ＩＣ
Ｉ２）中で４単位の制限酵素Ｎａｅ■（Ｎ、Ｅ、８社）
（以下ＮａｅＩと記す）を用いて３７℃、１時間処理し
た。その後、フェノールで抽出し、エタノール沈殿にて
回収した。これを５０ｔｌｆｌの反応液（１０ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ　−１−ＩＣＩ（ｐＨ７，５）、　　１０ｍＭ
　　　Ｍｇ　ＣＩ　　　、５０ｍＭ　　ＮａＣ１）中で
４単位のｌ−１ｉｎｄｌｌＩを用いて、３７℃、１時間
処理した。反応終了後、アガロースゲル電気泳動によっ
て、８００ｂｐのＤＮＡ断片（第５図中■〉を得た。

（ロ）　　ｐＴＡ２５３９（第５図中■）５μびを、５
０μ、１１の反応液（１０ｍＭ　　ＴｒｉＳ−ト］Ｃｌ
　　　（ｐｌ−１７，５）’、　　　１０ｍＭ　　　　
Ｍ（Ｉ　　ＣＩ　　　　、　　５．０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ
ｌ　）中で４単位のト１　ｉ　ｎ　ｄ　Ｉｌｌ　　１　
ＩＩβを用いて３７℃、１時間処理し、エタシ１沈澱を
行った。１ｑられた沈殿物は前記と同様、４単位の制限
酵素３ａｌＴ（タカラ）１μＯを用いて３７℃、１時間
処理した後、アガロースゲル電気泳動によって、３８０
０ｂｐのＤＮＡ断片（第５図中■）を得た。

（ハ）　前記プラスミド１）ＢＲ３２１−ｈＵＧ（第５
図中■）をＥＣ０ＲＩおよび３ａｌ王で消化したものに
上記で合成したｈＵＧ構造遺伝子を［：ｃｏＲＩおよび
５ａｌＩで消化した断片を組み込んだもの）５μびを、
５０μβの反応液（１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ＤＨ７，５＞。

５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃｌ、　５０ｍＭ　　ＭＣＩ　Ｃ１
２）中で４単位の制限酵素ＥＣ０ＲＩ　（タカラ）を用
いて３７℃で１時間加水分解したのち、上記ど同様にＴ
４ＤＮＡポリメラーゼ反応を行い、さらに５ａｌＩ処理
を行ったのち、アガロースゲル電気泳動によって１６０
　ｂｐのＤＮＡ断片（第５図中■）を得た。

上記（（イ）〜（ハ））で調製した三つのＤＮＡ断片（
第５図中■、■、■）を３０μの反応液（２０ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ−１−１ｃＩ　（ｐＨ７，５）。

１０ｍＭ　　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　　ＡＴＰ）中で３０
０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（タカラ社）を用いて１４
℃で１６時間反応させた。反応終了後、これで、前記同
様ＹＫ５３７を形質転換させて、目的のプラスミド〔以
下、ｐＴＡ２５３２と記寸〕（第５図中■）を含有する
形質転換株（Ｅ、Ｃ０１ｉ　Ｋ１２Ｃ５３７（ｐＴＡ２
５３２＞を得た。なお、上記実施例と同様にここで得ら
れた株からプラスミドを調製（特願昭５８−１４０７４
８号明−／１．０− 細書参照）して、各ＤＮＡ断片の接続部の塩基配列をマ
キサム・ギルバート法〔文献上記〕にＪ：って確認した
。

ｈ　　のヨ生および回収 １）形質転換株の培養 形質転換株Ｅ、Ｃｏ１１　Ｋ１２ＹＫ５３７（ｐＴＡ２
５２２＞およびＥ、　Ｃｏ１１　Ｋ１２ＹＫ５３７　（
ｐＴＡ２５３２）をそれぞれ、２０μｑ／ｄのカナマイ
シンを含むし一培地〔１％バクトドリプトン、０．５％
イース１〜エキストラクト、０．５％ＮａＣｌ）８０ｍ
で前培養した。ついで、前培養したものを０．６４ｍＭ
のリン酸二水素カリウム（以下、ＫＨ２ＰＯ４）を含む
合成培地（３ｉｏｃｈｅｍ、［３ｅｏｐｈｓ　、　Ａｃ
ｔａ　３３　、４７　Ｑ（１９６０））２．４リツトル
に移し、３７℃で一夜振盪培養を行った。培養終了後、
集菌したのち菌体を３２　ＩＩ　ＭのＫＨ２Ｐｏ４を含
む上記合成培地に懸濁さ往て、さらに３７℃で５時間振
盪培養を行った。

培地組成は、下記の通りである。

０、　１Ｍ　　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐｌ−１７，
２）。

８０ｍＭ　　　Ｎａ　　Ｃｌ、２ｍＭ　　　ＫＣＩ、２
０ｍＭＮ１−（４Ｃｌ　、　３ｍＭ　　Ｍａ　２　ＳＯ
４、１ｍＭＭ（ＩＣＩ　　　、０．２ｍＭ　　　ＣａＣ
ｌ　　　、２μｍＦｅＣｌ　　、’２μＭ　　ＺｎＣｌ
　　、０．２％グルコース、２０μｇ／ｄアンピシリン
、／Ｉ−０μｇ／蔵ロイシン、４０μｇ／ｄスレオニン
、１０μ９／威ヂアミン ２）浸透圧衝撃法（オスモティック・ショック法）によ
るｈＵＧの回収 宿主菌のベリペラズムに分泌されたｈＵＧを、オスモテ
ィック・ショック法ＬＪ、　Ｂｉｏｌ　。

Ｃｈｅｍ、２’４０．３６８５．（１９６５））ｋ−よ
って菌体外に放出させて、回収した。すなわち、集菌し
た菌体を反応液（２０％シューク１］−ス、３０ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ−１−ＩＣＩ　（ｐｌ−１８，０）、１ｍＭ
　　ＥＤＴＡ）１２０ｍに懸濁させ、室温１１０分間放
置した。ついで、集菌し、これを冷水８０威に懸濁させ
て水浴中で１０分間放置したのち、遠心を行なって一ヒ
清を回収した。

３）ｈＵＧの定量 オスモティック・ショックで得た上清の一部を３倍に希
釈し、これを用いてラジオリセプターフ１ッセイ（ＲＲ
Ａ）法によってｈＵＧの定量（Ａ。

キング（Ｋ　ｉｎｇ）らの方法ＬＪ、Ｂ、Ｃ，，２５７
゜３０５３　（１９８２））を行った。すなわち、ヒ］
−轟咽腔上皮癌細胞由来のＫ　Ｆ３細胞（ＡＴＣＣＮｏ
、ＣＣ１１７）を８００ｄのフラスコ中でダルベラ］変
法イーグル（Ｄ　Ｍ　Ｅ　＞培地（日永）中で単層培養
する。培地を除き、０．０５％のＦＤＴＡを含むリン酸
平衡化塩溶液（ＰＢＳ）を用いて細胞をはがして、細胞
懸濁液をつくる。その後、２０ｍＭ　　Ｈｅｐｅｓ（Ｄ
ｔ−１７，４）を含むｌ−１ａｎｋｓ平衡塩類溶液（＋
−（Ｂ　Ｓ　Ｓ　’）で２回細胞を洗浄する。

、細胞をＢｉｎｄｉｎｇ　５ｏｌｕＮｏｎ　　（Ｄ　Ｍ
　Ｆ培地・２０ｍＭ　　ｌ−１ｅｐｅｓ（ＤＩ−１７，
４，）　−０，３５ｙ／１Ｎａ　ｌ−１ｃＯ３−１００
ｔｌＷ／ｄ、スｌ−レプトマイシン）に懸濁後、細胞数
を計算して３０万〜４０万１０．２　ｍＲＢ　ｉｎｄｔ
ｎｇ　５ｏｌｕｔｉｏｎなる様調整し、チユーブに０．
２−ずつ分注する。種々の濃度のｈＵＧおよび　　Ｉ−
ｍＥＧＦ　（？ウスＥＧＦ）を含む試料液０．２ｍをチ
ューブに加えて、３７℃で１時間インキュベートする。

細胞を氷冷したトｌＢ５５で３回洗浄後、１０％のトリ
クロロ酢酸〔以下、ＴＣＡ）に懸濁させ、グラスフィル
ターを用いて細胞を固定する。アセトンで、ＴＣＡを除
いた後、液体シンチレーションカウンターを用いて計数
した。

なお、上記形質転換株（Ｅ、　Ｃｏ１１　Ｋ　１２Ｃ５
３７’（ｐＴＡ２５２２）およびＥ、　Ｃｏ１１　Ｋ　
１２ＹＫ５３７’　（ｐＴＡ２５３２））と分泌量を比
較する目的で、該プラスミドのｌ（ｍ　　を分泌性蛋白
質をコードするＡｍ１）　　に換えた１）ＴＡ１５２２
およびｐＴＡ１５３２（いずれも特願昭５９−１５９７
０３号、明細書に記載）を用いて、同様にＹＫ５３７を
形質転換させて、上記実験に供した。

培養２時間後のｈＵＧの分泌量は下表に示す通りであっ
た。なお単位（μｇ／Ｌ）は、培養液１リツトル中のｈ
ＵＧの分泌量（μｇ）を示している。

以上の結果より、プラスミド由来の分泌性蛋白質をコー
ドする遺伝子が存在しないプラスミドを用いた形質転換
株（Ｅ、　Ｃｏ１１　Ｋ　１２Ｃ５３７（ｐＴＡ２５２
２）おにびＥ、　Ｃｏ１１　Ｋ　１２Ｃ５３７（＋）Ｔ
Ａ２５３２））は、プラスミド由来の分泌性蛋白質をコ
ードする遺伝子が存在する形質転換株（Ｅ、　Ｃｏ１１
　Ｋ　１２ＹＫ５３７　（＋）ＴＡ２５？２）およびＦ
、　Ｃｏ１１　Ｋ　１２Ｃ５３７（ｐＴＡ２５３２＞）
に比べて、ｈＵＧの分泌量が培養液１リツ１〜ルあたり
３５０〜５００μグ上昇した。ｈＵＧの精製および確認 オスモティック・ショック法ににつで得た上清を凍結乾
燥して粉末とし、これを水６ｄに溶解したのち、２５ｍ
Ｍ酢酸アンモニウム〔以下、Ａｃ０ＮＨ４）（１）Ｈ５
，８）で平衡化したレファデックス■Ｇ−５０カラム（
直径７．５ｃｍ×長さ９０　ｃｍ　）にかりた。溶出は
９．５ｍｌ！／画分／１４分の流速で行い、活性のあっ
た両分を集めた。

ついで、この両分（３４〜３９本画分）を２５ｍＭ　　
Ａｃ０ＮＨ４（ＤＨ５，８）ｒ平衡化り、　ｔｃＤＦＡ
ＥセルロースＤＥ−５２（９７１〜７２社）〔直径１．
２ｃｍ×長さ１２ｃｍ〕にかりた。溶出に際してＡｃ０
Ｎｌ−１４の緩衝液２５ｍＭ〜３ｏ。

ｍＭまでの濃度分配（３０ｍ）を行い、溶出は３．１２
／画分７７．６分の速度で行い、活性のあった画分を集
めた。

ついで、ここで得た活性のある両分を高速液体クロマト
グラフィー（以下ＨＰ　Ｌ　Ｃ）（μ３０ｎｄａｌｌａ
ｋ　Ｃ−１８、カラム：直径０．６ｃｍ×長さ３０　ｃ
ｍ　１溶出＝０．１％ＴＦＡは、アセトニトリルの２０
％〜５０％までの濃度分配、流速：１ｍ／分〕にかけて
精製を行った。

ｈｌＪＧの確認は、アミノ酸組成分析、Ｎ末端分析およ
びＣ末端分析によって行った。

アミノ酸組成分析は、上記１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃで精製し
た両分を６　Ｎ　　Ｉ−Ｉ　ＣＩで加水分解し、ついで
乾燥したのち０．０２Ｎ　　＋−１ｃＩに溶解し、これ
をアミノ酸分析器（＋−Ｉ　Ｌ　Ｃ−８０３Ｄ　　ＯＰ
Δシステ１１（東洋曹達）〕にかりることにｊ：って行
った。そのどぎの結果は、表１に示す通りであった。

また、Ｎ端分析はエドマン法（生化学実験講座１、タン
パク質の化学■、ｐ１３２．１」本生化学会線、東京化
学同人刊）によって、Ｎ端から２００番目でのアミノ酸
配列を確認した。

さらに、Ｃ端分析はカルボキシペプチダーゼＹを用いて
行って、ＣＯＮ　Ｊ：す４番目までのアミノ酸配列を確
認した。

これらの結果より、分泌されたものはｈＵＧで表　　　
　１ 上表中、ＡＳＩ）等は、いうまでもなく、アスパラギン
酸等のアミノ酸を示ず当業界で承認されている記号であ
る。

関連微生物の菌学的性質および受託番号本発明において
開示された微生物の菌学的性質および受託番号は下記の
通りである。

受託年月日 （１）昭和５６年６月９　日 （２）昭和５８年４　月３０日 （３）昭和５６年６月９　日 （４）昭和５９年１１月１４日 ＊通商産業省工業技術院微生物工業技術？ｉｌＩ究所の
受託番号 菌学的性質 （１）　Ｆ、　ｃｏｌｉＫ　１２Ｃ６００この菌は、ク
ラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性等の大腸菌
属の一般属性を右する他、Ｆ因子を含まず、サプレッサ
ー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組替えに関与するヌク
レアーゼをコードするｒｅｃＢｃｉ伝子に欠陥を有する
ものである。栄養要求性としては、トレオニンとロイシ
ンをその最小培地上での増殖に必要とする。また、分類
学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するものである。なお
、本閑に関する文献は以下の通りである。

（イ）、Ｑｅｎｅｔ　ｉ　ｃｓ、３９，４４０（ロ）、
Ｎａｔｕｒｅ、２１７．１１１０（２）Ｅ、ｃｏｌｉＫ
ｌ　２Ｃ６００（ｐＹＫ２８３）この菌は、クラム陰性
桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性等の大腸菌属の一般
属性を有する他、Ｆ因子を含まず、サプレッサー遺伝子
Ｆの機能を欠き、遺伝子組替えに関与するヌクレアーゼ
をコードするｒｅｃＢｃｉ仏子に欠陥信子するものであ
る。

栄養要求性としては、トレオニンとロイシンをその最小
培地上での増殖に必要とする。ｐｈｏＡ３１伝子のプロ
モーター−オペレーター領域ｐΔＣＹＣ１７７由来の複
製開始領域およびｐＢＲ３２２のｂｌａ３ｉ伝子から構
成されたプラスミドｐ　Ｙ　Ｋ２８３を含み、アンピシ
リンにえ１して耐性を示す。

また、分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するもので
ある。

なお、プラスミドｐＹＫ２８３由来の形質を除【づば、
この菌株の菌学的性質はその親株［：’、ｃｏｌｉＫｌ
　２Ｃ６００のそれと同じである。

（３）Ｅ、ｃｏｌｉＫｌ　２Ｃ６００（ｐＢＲ３２２）
この菌は、クラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気
性等の大腸菌属の一般属性を有する他、Ｅ因子を含まず
、サプレッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組替えに
関与するヌクレアーゼをコードするｒｅｃＢｃｌ伝子に
欠陥を有するものである。栄養要求性としては、トレオ
ニンとロイシンをその最小培地上での増殖に必要とする
。また、薬剤耐性プラスミドｐＢＲ３２２を含む。なお
、プラスミドｐＢＲ３２２に関してはＱｅｎｅ、２゜９
５（１９７７）、大腸菌Ｋｌ　２Ｃ６００に関しては上
記Ｎａｔｕｒｅを参照することができる。

ｐＢＲ３２２由来の形質を除けば、Ｆ　、ｃｏｌｉＫ　
１２Ｃ６００（ｐＢＲ３２２）の菌学的性質は親株のそ
れと同じである。

（４）Ｅ、ｃｏｌｉＫｌ　２ＹＫ５３７大腸菌に１２Ｙ
Ｋ５３７は、公知株であるところの大腸菌に、１２株（
Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　。

４４．１〜５６（１９８０））の誘導体大腸菌に１２Ｒ
Ｒ１（Ｇｅｎｅ、２．９５　（１９７７）、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ、、６５５．２４３（
１９８１））をさらに改変したものであり、下記の性質
を示し、他の性質についてはに１２ＲＲ１のそれと異な
るところのない菌株である。

（ｒｅｃ　Ａ　１、ｐｈｏ　Ａ８、ｐｒｏ”　）

【図面の簡単な説明】 第１図は、ｐＴＡ２５２９製造のフローチャートである
。 第２図は、ｐ　Ｔ　Ａ　２　’５３９製造のフローチャ
ートである。 第３図は、合成したｈＵＧの構造遺伝子の塩基配列を示
す説明図である。 第４図は、ｈＵＧの構造遺伝子を含むｐＴＡ２５２２製
造の７０−ヂヤートである。 第５図は、ｈ　、Ｕ　Ｇの構造遺伝子を含むｐＴＡ２５
３２製造のフローチャートである。 出願人代理人　　猪　　股　　　　清 区　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０■　
　６ ？　交

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程からなることを特徴とする、蛋白質の製
   造法。 （イ）シグナルペプチドをコードする遺伝子の下流側末
   端直後に所望の外来性蛋白質をコードする遺伝子を結合
   させ、その結果として得られた、プロモーターをコード
   する遺伝子とＳＤ配列をコードする遺伝子とシグナルペ
   プチドをコードする遺伝子と所望外来性蛋白質をコード
   する遺伝子とから少くとも成る塩基配列を含み、しかも
   この塩基配列部分以外の部分に分泌性蛋白質をコードす
   る遺伝子を含まないプラスミド組換体、を用意すること
   。 （ロ）このプラスミド組換体を用いて宿主細胞の形質転
   換を行なって、形質転換体を調製すること。 （ハ）この形質転換体を培養して、産生された所望の外
   来性蛋白質を回収すること。 ２、シグナルペプチドをコードする遺伝子の下流側末端
   直後に所望の外来性蛋白質をコードする遺伝子を結合さ
   せ、その結果として得られた、プロモーターをコードす
   る遺伝子とＳＤ配列をコードする遺伝子とシグナルペプ
   チドをコードする遺伝子と所望外来性蛋白質をコードす
   る遺伝子とから少くとも成る塩基配列を含み、しかもこ
   の塩基配列部分以外の部分に分泌性蛋白質をコードする
   遺伝子を含まないことを特徴とするプラスミド組換体。 ３、シグナルペプチドをコードする遺伝子の下流側末端
   直後に所望の外来性蛋白質をコードする遺伝子を結合さ
   せ、その結果として得られた、プロモーターをコードす
   る遺伝子とＳＤ配列をコードする遺伝子とシグナルペプ
   チドをコードする遺伝子と所望、外来性蛋白質をコード
   する遺伝子とから少くとも成る塩基配列を含み、しかも
   この塩基配列部分以外の部分に分泌性蛋白質をコードす
   る遺伝子を含まない、プラスミド組換体によって形質転
   換されたものであることを特徴とする、エシエリキア（
   Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する所望外来性蛋白質
   産生菌。