KR20090039239A - 대장균에서 활성형 인간 상피세포 성장인자의 대량제조방법 - Google Patents
대장균에서 활성형 인간 상피세포 성장인자의 대량제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20090039239A KR20090039239A KR1020070104748A KR20070104748A KR20090039239A KR 20090039239 A KR20090039239 A KR 20090039239A KR 1020070104748 A KR1020070104748 A KR 1020070104748A KR 20070104748 A KR20070104748 A KR 20070104748A KR 20090039239 A KR20090039239 A KR 20090039239A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- protein
- growth factor
- epidermal growth
- human epidermal
- expression vector
- Prior art date
Links
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 title claims abstract description 102
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 title claims abstract description 99
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 title claims abstract description 97
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 title description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 37
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 20
- 108050006783 Synuclein Chemical group 0.000 claims abstract description 18
- 102000019355 Synuclein Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 43
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 40
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 claims description 14
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 6
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 claims description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 claims 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N alpha-D-galacturonic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N 0.000 claims 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 2
- 101000851176 Homo sapiens Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 abstract 2
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 abstract 1
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 abstract 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 abstract 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 7
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710090861 Treponemal membrane protein A Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022987 Angiogenin Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001477 Deubiquitinating Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010093668 Deubiquitinating Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical group CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 108010072788 angiogenin Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Chemical group CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 210000001913 submandibular gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/24—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a MBP (maltose binding protein)-tag
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 대장균에서 활성형 인간 상피세포 성장인자를 대량 생산하기 위하여 인간 상피세포 성장인자와 이의 N-말단 또는 C-말단에 시뉴클레인의 단편, 말토오스 결합 단백질, 디설파이드 결합 A 단백질, 디설파이드 결합 C 단백질 및 펙테이트 라이아제 B의 신호서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산분자가 조절서열에 작동가능하게 연결되도록 포함된 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균 숙주세포, 상기 대장균 숙주세포를 배양하여 상기 융합 단백질을 발현시키고 분리함으로써 활성형 인간 상피세포 성장인자를 대량 제조하는 방법에 관한 것이다.
인간 상피세포 성장인자, 시뉴클레인, 말토오스 결합 단백질, 디설파이드 결합 A 단백질, 디설파이드 결합 C 단백질 및 펙테이트 라이아제 B의 신호서열
Description
본 발명은 활성형 인간 상피세포 성장인자의 대량 제조방법에 관한 것으로서, 보다 자세하게는 인간 상피세포 성장인자와 이의 N-말단 또는 C-말단에 시뉴클레인의 단편, 말토오스 결합 단백질, 디설파이드 결합 A 단백질, 디설파이드 결합 C 단백질 및 펙테이트 라이아제 B의 신호서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산분자가 조절서열에 작동가능하게 연결되도록 포함된 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균 숙주세포, 상기 대장균 숙주세포를 배양하여 상기 융합 단백질을 발현시키고 분리함으로써 활성형 인간 상피세포 성장인자를 대량 제조하는 방법에 관한 것이다.
상피세포 성장인자 (epidermal growth factor, EGF)는 3개의 디설파이드 결합 (disulfide bond)을 갖는 단일 단백질로서 1962년 쥐의 악하선 (submaxillary gland)에서 신경 성장인자 (nerve growth factor)를 분리하던 중에 발견되었고 (Cohen, S. J. Biol Chem. 1962, vol.237, p.1555), Savage에 의해 그 일차 구조가 밝혀졌다 (Savage, C. R. et. al. J. Biol Chem. 1972, vol.247, p.7609). 1975년에 Cohen과 Carpenter는 사람의 뇨에서 최초로 인간 상피세포 성장인자 (human epidermal growth factor)를 분리 · 정제하였다 (Cohen, S. et. al. Adv. Metab. Disord. 1975, vol.8, p.265).
인간 상피세포 성장인자는 53개의 아미노산 (159개의 뉴클레오티드)으로 구성된 단백질로서, 전체 분자량이 6,300 달톤 (6.3 kDa)에 이른다. 47번째에 위치한 류신 (leucine) 부분은 인간 상피세포 성장인자의 생체내 활성에 필수적인 역할을 담당하며, 이를 발린 (valine) 또는 이소류신 (isoleucin)으로 치환하할 경우에는 생물학적 활성이 감소하며, 37번째에 위치한 티로신 (tyrosine)은 베타 구조의 수소결합에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.
현재 인간 상피세포 성장인자와 같은 인간 유래 재조합 단백질은 다양한 형질전환 미생물들을 이용하여 제조되고 있다. 이러한 형질전환 미생물 중 대장균을 이용할 경우에는 여러 가지 측면에서 장점이 있다. 첫째로 단위 세포당 목적단백질의 발현율이 다른 미생물들에 비해 월등히 높다는 점이며, 둘째로 유전적인 특성이 많이 밝혀져 있어 다양한 유전공학적 시도를 할 수 있다는 것이며, 셋째로 대량 생산을 용이하게 진행할 수 있다는 점이다.
대장균에서 재조합 단백질의 신호서열을 이용하여 분비시킬 경우 단백질의 올바른 접힘 (folding)을 유도하여 불용성 단백질 응집체 (inclusion body)의 형성을 방지할 수 있고, 분비 과정을 통해 N-단편의 분비 신호서열이 제거되어 자연 상 태에 존재하는 것과 동일한 아미노산 서열을 유지할 수 있는 장점을 지니고 있다. 한편, 융합 단백질을 이용하여 발현시킬 경우 올바른 접힘을 유도하여 수용성 상태로 발현될 수 있도록 도와주는 장점을 지니고 있다.
대장균을 이용한 인간 상피세포 성장인자 발현에 대하여 다양한 연구들이 진행되어 왔는데, 그 중 신호서열 펩타이드를 이용한 융합 방법이 많이 시도되었다. Qin 등은 세포외막 단백질 A (OmpA) 분비 신호서열을 이용하여 인간 상피세포 성장인자를 발현시킨 결과 발현 효율이 개선되었다고 보고하였으며(Qin et al., EMT. 2006. p.1-8), 이와 같이 신호서열인 세포외막 단백질 A를 이용하여 배지로 분비하는 기술이 미국특허 제 5,646,015호에 개시되어 있다. 그러나, 전체적인 발현양이 적었으며, 세포질 밖으로의 분비량은 1.1 μg/L로 현저히 적어서 유용하지 않다. 대한민국특허 제 10-0330203호는 안지오게닌을 융합하여 인간 상피세포 성장인자를 발현하는 방법을 제안하였으나, 대부분 불용성 단백질 응집체 형태로 발현되었으며 그 양이 0.5 g/L로 발현양이 적었다.
대장균을 이용한 인간 상피세포 성장인자의 발현과 관련된 연구로서 베타 락타메이즈의 신호서열을 융합하여 세포질 및 외질에서의 발현에 대한 보고가 있었으며 (Mina et al. Iranian Biomedical Journal, 2004, vol.2, pp.51-61), 알칼라인 포스페테아제의 신호서열을 융합하여 분비를 유도한 연구 (Takanorri et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1985, vol.82, pp.7212-7216) 등이 발표되었다. 이와 같이 대장균에서 인간 상피세포 성장인자의 과발현을 위한 다양한 방법들이 개발되었으나 신호서열을 사용할 경우 활성형으로의 발현 유도가 현저하게 증가하였으나, 불용성 응집체 형태로의 발현이 상당하고, 전체적인 발현양이 적다는 문제점을 지니고 있다. 한편, 효모를 사용한 인간 상피세포 성장인자의 제조방법에 대한 특허로는 인체표피 성장인자의 유전자를 갖는 벡터 및 이를 이용하여 인체표피 성장인자를 생산하는 대한민국특허 제 10-0295909호가 있다. 상기 특허는 메탄자화효모인 한세눌라 폴리모르파를 이용하여 인간 상피세포 성장인자를 발현시키고 이를 배지내로 효율적으로 분비시키는 방법을 개시하고 있는데, 인간 상피세포 성장인자를 효과적으로 발현시켰고 이를 세포외로 분비하여 최대 24 mg/L의 발현양을 나타내었다. 그러나, 효모에서 인간 상피세포 성장인자와 같이 작은 단백질의 과발현시 문제점은 분비된 단백질이 다양한 프로테아제에 의해 분해될 수 있다는 단점과 효모 유래의 당쇄화로 인하여 인체에 적합하지 않다는 문제가 발생할 수 있다.
이에 본 발명자들은 대장균 숙주세포에서 활성형 인간 상피세포 성장인자를 대량 제조하기 위하여 인간 상피세포 성장인자 단백질을 시뉴클레인의 단편, 말토오스 결합 단백질, 디설파이드 결합 A 단백질, 디설파이드 결합 C 단백질 및 펙테이트 라이아제 B의 신호서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질과 융합시켜 발현시킨 결과 인간 상피세포 성장인자 단백질을 활성형으로 과발현시킬 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 한 관점으로서 인간 상피세포 성장인자와 이의 N-말단 또는 C-말단에 시뉴클레인의 단편, 말토오스 결합 단백질, 디설파이드 결합 A 단백질, 디설파이드 결합 C 단백질 및 펙테이트 라이아제 B의 신호서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산분자가 조절서열에 작동가능하게 연결되도록 포함된 재조합 발현벡터를 제공한다.
"인간 상피세포 성장인자"는 159개의 뉴클레오타이드로 이루어져 있으며, 대장균에서 발현되지 않는 3개의 희귀 코돈, 즉 7번째 프롤린(proline)을 코딩하는 코돈 CCC 및 41번째와 45번째 아르기닌(arginine)을 코딩하는 코돈 CGA를 갖는다. 따라서 대장균을 이용하여 인간 상피세포 성장인자를 발현시킬 때에는 상기 희귀 코돈 CCC와 CGA를 대장균이 일반적으로 인식할 수 있는 코돈 즉, CCG/CCT와 CGT/CGC로 각각 치환하거나, 코돈 CCC 또는 CGA를 인식하는 tRNA가 삽입된 균주 [(예: Rosetta (Invitrogen, 미국)]를 사용한다.
본 발명에서 상기 인간 상피세포 성장인자는 시뉴클레인의 단편, 말토오스 결합 단백질, 디설파이드 결합 A 단백질, 디설파이드 결합 C 단백질 및 펙테이트 라이아제 B의 신호서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질 (또는 "융합 파트너"라고 함)에 의하여 활성형 형태로 과발현될 수 있다. 이하, 상기 융합 파트너에 대하여 구체적으로 설명한다.
"시뉴클레인의 단편"은 시뉴클레인 단백질 (Synuclein, ATS; S.M. Park et al., Protein Eng. Desl. Sel., 2004, vol.17, pp.251-260)의 119번째 내지 140번째에 위치한 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 의미한다. 본 발명에서 시뉴클레인 단편을 코딩하는 핵산분자의 한 양태는 서열번호: 2에 나타낸 염기서열로 이루어진다. 상기 시뉴클레인의 단편이 융합된 인간 상피세포 성장인자를 코딩하는 DNA는 서열번호: 10으로 구성된 프라이머 (ATSF) 및 서열번호: 9로 구성된 프라이머 (EGFR)를 이용하여 PCR을 진행함으로써 제조할 수 있다.
"말토오스 결합 단백질 (Maltose Binding Protein, MBP; Genebank의 EF431917)"은 말토덱스트린 (maltodextrin)을 이동시키고 분해하는데 관여하는 단백질로 공지되어 있다. 본 발명에서 말토오스 결합 단백질을 코딩하는 핵산분자의 한 양태는 서열번호: 3에 나타낸 염기서열로 이루어진다. 상기 말토오스 결합 단백질을 코딩하는 핵산분자는 그러한 핵산분자를 포함하는 핵산분자를 주형으로 하고 서열번호: 11로 구성된 프라이머 (MBPF) 및 서열번호: 12로 구성된 프라이머 (MBPR)를 이용하여 PCR을 진행함으로써 제조할 수 있다.
"디설파이드 결합 A (Disulfide Bond A, DsbA; Genebank의 X80762) 단백질"은 세포외질에서 단백질의 디설파이드 결합, 즉 접힘 (folding)에 관여하는 단백질 중 한 유형으로 공지되어 있다. 본 발명에서 디설파이드 결합 A 단백질을 코딩하는 핵산분자의 한 양태는 서열번호: 4에 나타낸 염기서열로 이루어진다. 상기 디설파이드 결합 A 단백질을 코딩하는 핵산분자는 그러한 핵산분자를 포함하는 핵산분자를 주형으로 하고 서열번호: 13으로 구성된 프라이머 (DsbAF) 및 서열번호: 14로 구성된 프라이머 (DsbAR)를 이용하여 PCR을 진행함으로써 제조할 수 있다.
"디설파이드 결합 C (Disulfide Bond C, DsbC; Genebank의 AP009048) 단백질"은 세포외질에서 단백질의 디설파이드 결합, 즉 접힘 (folding)에 관여하는 단백질 중 한 유형으로 공지되어 있다. 본 발명에서 디설파이드 결합 C 단백질을 코딩하는 핵산분자의 한 양태는 서열번호: 5에 나타낸 염기서열로 이루어진다. 상기 디설파이드 결합 C 단백질을 코딩하는 핵산분자는 그러한 핵산분자를 포함하는 핵산분자를 주형으로 하고 서열번호: 15로 구성된 프라이머 (DsbCF) 및 서열번호: 16으로 구성된 프라이머 (DsbCR)를 이용하여 PCR을 진행함으로써 제조할 수 있다.
"펙테이트 라이아제 B (Pectate lyase B from Erwina carotovora , PelB; Genebank의 AY585869)"의 신호서열은 발현된 단백질을 세포외질 (periplasm)로 이동 (translocation)시키는데 관여하는 펩타이드로 공지되어 있다. 특히, 상업적으로 입수 가능한 Novagen사의 pET22에 포함되어 있어 상기 벡터를 이용하면 펙테이트 라이아제 B의 신호서열과 인간 상피세포 성장인자로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 핵산분자가 포함된 재조합 발현벡터를 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명 에서 펙테이트 라이아제 B 신호서열의 한 양태는 서열번호: 6에 나타낸 염기서열로 이루어진다.
본 발명의 재조합 발현벡터에 있어서, 인간 상피세포 성장인자와 융합 파트너 사이에 링커 (linker)로서 프로테아제 (protease)에 의해 인식될 수 있는 아미노산 서열을 포함한 펩타이드 또는 단백질을 위치시키는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 인간 상피세포 성장인자가 융합 파트너와 융합된 형태로 발현되는데, 상기 링커는 인간 상피세포 성장인자로부터 융합 파트너를 용이하게 분리하기 위하여 삽입한다. 링커로는 예를 들면 엔테로키나아제 (enterokinase)의 DDDDK 또는 팩터 Xa (Factor Xa)의 IEGR과 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 유비퀴틴 프로테아제가 인식하는 유비퀴틴 (ubiquitine) 및 인테인 (intein)과 같이 자가인식 프로테아제를 이용할 수 있다.
한편, 본 발명에서 "조절서열"은 인간 상피세포 성장인자와 융합 파트너로 이루어진 융합 단백질의 발현에 필수적이거나 이로운 핵산서열들을 의미한다. 그러한 조절서열에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 신호 분비서열, 업스트림(upstream) 활성화 서열 또는 인핸서(enhancer), 폴리아데닐화 서열, 프로펩타이드(propeptide) 서열 및 전사 종결인자 등을 포함한다. 본 발명에서 조절서열은 최소한 프로모터를 포함하여야 한다. 본 발명에서는 대장균에서 프로모터로서 작용할 수 있는 모든 프로모터를 이용하는 것이 가능하지만, T7 프로모터를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 다른 조절서열들은 융합 단백질의 발현양을 더욱 증가시키기 위해서 선택적으로 포함될 수 있다.
본 발명에서 인간 상피세포 성장인자와 융합 파트너로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 핵산분자는 프로모터를 포함한 상기 조절서열에 작동가능하게 연결되어야 대장균 숙주세포에서 발현될 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"이란 한 핵산서열이 다른 핵산서열과 기능적 관계로 배치된 상태를 의미한다. 예를 들면, 신호 분비서열이 성숙한 단백질의 분비에 참여함으로써 기능을 발휘했다면 그 단백질에 작동가능하게 연결된 것이다. 프로모터가 코딩 서열의 전사를 조절했다면 그 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 리보좀 결합 자리가 코딩 서열의 해독이 가능한 위치에 놓여져 있다면 그 서열에 작동가능하게 연결된 것이다.
본 발명은 다른 관점으로서 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균 숙주세포를 제공한다.
형질전환은 Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology (1986) 및 Sambrook et al. Basic Methods in Molecular Biology와 같은 기본적인 실험 지침서에 기술된 방법에 의해서 실시될 수 있다. 본 발명의 재조합 발현벡터를 대장균 숙주세포로 도입하기 위해서는 대장균 세포막을 수용성(competent)으로 만들어야 한다. 이러한 방법은 대장균을 염화칼슘 용액 또는 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol)과 염화마그네슘이 혼합된 용액에 노출시키는 것을 포함한다. 또한 대장균 세포막은 전기천공에 의해서도 수용성이 될 수 있으며, 상기 전기 전류는 DNA가 세포내로 유입되도록 세포막을 파열시키는 역할을 한다.
본 발명은 또 다른 관점으로서 (1) 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균 숙주세포를 배양하여 융합 단백질을 발현시키는 단계 및 (2) 배양물로부터 상기 융합 단백질을 분리하는 단계를 포함한 활성형 인간 상피세포 성장인자를 대량으로 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 대장균은 공지된 기술을 이용해서 인간 상피세포 성장인자와 융합 파트너로 이루어진 융합 단백질의 생산에 적합한 영양 배지 (예, LB 또는 2xYT)에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 대장균 숙주세포들은 적합한 배지와 융합 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에, 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 혹은 대규모 발효, 셰이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지된 기술을 사용해서 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양배지에서 진행한다. 적합한 배지는 상업적인 공급자로부터 입수 가능하고, 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그 등에 기재된 성분 및 이들의 조성 비율에 따라 만들 수도 있다.
본 발명에서는 재조합 발현벡터가 조절서열로서 T7 프로모터를 포함할 경우에 형질전환된 대장균 숙주세포를 배양하던 중에 배양액의 흡광도(600nm)가 0.6~0.8일 때 IPTG (Isoprophyl-β-thiogalactosidase)를 첨가하여 본 발명에 따른 융합 단백질의 발현을 유도하는 것이 바람직하다.
이러한 배양물로부터 본 발명의 융합 단백질은 당업계에 공지된 방법에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어서, 융합 단백질은 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 전통적인 방법에 의해서 배양물로부터 분리할 수 있다. 더 나아가 융합 단백질은 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해도 (예를 들면, 암모늄 설페이트 침전) 또는 추출을 포함하여 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.
본 발명에 따라 인간 상피세포 성장인자 단백질을 시뉴클레인의 단편, 말토오스 결합 단백질, 디설파이드 결합 A 단백질, 디설파이드 결합 C 단백질 및 펙테이트 라이아제 B의 신호서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질과 융합시켜 발현할 경우에는 상기 인간 상피세포 성장인자 단백질을 활성형 형태로 과발현시킬 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 희귀 코돈이 치환된 인간 상피세포 성장인자의 발현
대장균 BL21(DE3)에서 인간 상피세포 성장인자를 발현하기 위하여 희귀 코돈을 대장균이 인식할 수 있는 코돈으로 치환한 인간 상피세포 성장인자를 제조하였다. 즉, 인간 상피세포 성장인자의 서열인 서열번호: 1의 염기서열을 참조하여 MEGFF (서열번호: 7) 및 MEGFR (서열번호: 8) 프라이머를 제조하고 서열번호: 1의 인간 상피세포 성장인자를 주형으로 PCR을 수행하여 제조하였다. 상기 PCR 산물을 발현벡터 pET26b(+) (Novagen, 미국)에 도입하여 클로닝한 후 재조합 발현벡터 "pEEGF"를 수득하였다 (도 1).
재조합 발현벡터 pEEGF를 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하여 형질전환시키고, 항생제 카나마이신이 첨가된 LB 아가평판배지에서 형질전환된 균주를 선별하였다. 이어서, 인간 상피세포 성장인자의 발현을 위해 LB 배지 (Tryptone 10 g/L, Yeast 5 g/L, NaCl 5 g/L)에서 37℃의 조건으로 배양하였다. 재조합 발현벡터 pEEGF로 형질전환된 균주의 배양액의 흡광도(600 nm)가 0.6~0.8일 때 0.2 mM IPTG (Isoprophy-β-thiogalactoside)를 첨가하여 인간 상피세포 성장인자의 발현을 유 도하였다.
배양물로부터 균주를 회수한 다음, 대장균내 인간 상피세포 성장인자를 다음과 같이 회수하였다. 배양액 20 ml을 4℃에서 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하고, 이 침전물을 인산완충용액 (pH 7.4)에 현탁하였다. 이어서, 현탁액을 초음파 처리(sonication)하여 현탁액 속의 모든 세포를 파쇄하고, 실온에서 12,000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세포 파편(debris)이 제거된 상층액을 수득하였으며, 이 상층액을 실온에서 12,000rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 원심분리후 남은 침전물(하층물)에 증류수를 현탁하여 불용상을 수득하였다.
앞서 수득한 상층액 및 불용상을 전기영동 및 웨스턴 블롯을 수행한 결과 대부분 불용성 형태로 22.9 mg/L이 생성됨을 알 수 있었다. 한편, 희귀 코돈을 치환하지 않은 경우에도 마찬가지로 모두 비활성형 형태로 발현되었으며 그 농도는 20.6 mg/L였다. 인간 상피세포 성장인자 불용성 형태로 생성된다는 것은 인간 상피세포 성장인자가 비활성형 형태로 발현된다는 것을 의미한다.
실시예 2: 시뉴클레인의 단편(ATS)이 융합된 인간 상피세포 성장인자의 발현
대장균 BL21(DE3)에서 시뉴클레인의 단편(ATS)이 융합된 인간 상피세포 성장인자를 발현하기 위하여 다음과 같이 재조합 발현벡터를 제조하였다. 서열번호: 2의 염기서열을 참조하여 ATSF 프라이머 (서열번호: 10)를 제조하고, 인간 상피세포 성장인자의 서열인 서열번호: 1의 염기서열을 참조하여 EGFR 프라이머 (서열번호: 9)를 제조한 후 상기 프라이머를 이용하여 서열번호: 1의 인간 상피세포 성장인자 를 주형으로 PCR을 수행해서 시뉴클레인의 단편이 융합된 인간 상피세포 성장인자를 코딩하는 DNA를 제조하였다. 상기 PCR 산물을 발현벡터 pET-26b(+)(Novagen, 미국)에 도입하여 클로닝한 후 재조합 발현벡터 "pEATEGF"를 수득하였다.
재조합 발현벡터 pEATEGF을 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하여 형질전환시키고, 항생제 카나마이신이 첨가된 LB 아가평판배지에서 형질전환된 균주를 선별하였다. 이어서, 인간 상피세포 성장인자의 발현을 위해 실시예 1에서와 동일한 방법으로 IPTG 유도를 통하여 인간 상피세포 성장인자의 발현을 유도하였다.
배양물로부터 균주를 회수한 다음, 대장균내 인간 상피세포 성장인자를 다음과 같이 회수하였다. 배양액 20 ml을 4℃에서 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하고, 이 침전물을 인산완충용액 (pH 7.4)에 현탁하였다. 이어서, 현탁액을 초음파 처리하여 현탁액 속의 모든 세포를 파쇄한 후 실온에서 12,000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세포 파편이 제거된 상층액을 수득하였으며, 이 상층액을 실온에서 12,000rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 원심분리 후 남은 침전물(하층물)에 증류수를 현탁하여 불용상을 수득하였다.
앞서 수득한 상층액 및 불용상 각각 20 ㎕ 및 8 ㎕을 전기영동 (도 2) 및 웨스턴 블롯 (도 3)을 수행한 결과, 도 2 및 3에 나타낸 바와 같이 인간 상피세포 성장인자가 대부분 활성형 형태로 31.2 mg/L 생산됨을 확인할 수 있었다 [도 2 및 3에서 M: 단백질 크기 마커, S: 인간 상피세포 성장인자의 표준품 (Peprotech, 미국), 레인 1: 대장균 파쇄 후 총 단백질, 레인 2: 대장균 파쇄 후 활성형 단백질(상등액), 레인 3: 대장균 파쇄 후 침전 단백질(하층물)을 각각 의미함]. 대부분 의 인간 상피세포 성장인자가 상등액에서 검출된다는 것은 활성형 형태로 발현된다는 것을 의미하고, 이는 인간 상피세포 성장인자가 시클로뉴클레인 단편과 융합 발현됨으로써 활성형 형태로 과발현될 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 3: 말토오스 결합 단백질(MBP)이 융합된 인간 상피세포 성장인자의 발현
대장균 BL21(DE3)에서 말토오스 결합 단백질이 융합된 인간 상피세포 성장인자를 발현하기 위하여 다음과 같이 재조합 발현벡터를 제조하였다. 말토오스 결합 단백질은 서열번호: 3의 염기서열을 참조하여 MBPF (서열번호: 11)와 MBPR 프라이머 (서열번호: 12)를 제조하여 pMAL-p2X(New England Biolab, 영국)를 주형으로 PCR을 수행하여 얻었고, 인간 상피세포 성장인자는 실시예 1과 같이 MEGFF와 MEGFR 프라이머를 이용하여 서열번호: 1의 인간 상피세포 성장인자를 주형으로 PCR을 수행하여 얻었다. 각각의 PCR산물을 발현벡터 pET-26b(+)(Novagen, 미국)에 도입하여 클로닝한 후 재조합 발현벡터 "pEMBEGF"를 수득하였다.
재조합 발현벡터 pEMBEGF을 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하여 형질전환시키고, 항생제 카나마이신이 첨가된 LB 아가평판배지에서 형질전환된 균주를 선별하였다. 이어서, 인간 상피세포 성장인자의 발현을 위해 실시예 1에서와 동일한 방법으로 IPTG 유도를 통하여 인간 상피세포 성장인자의 발현을 유도하였다.
배양물로부터 균주를 회수한 다음, 대장균내 인간 상피세포 성장인자를 다음과 같이 회수하였다. 배양액 20ml을 4℃에서 12,000rpm으로 10분 동안 원심분리하 여 침전물을 수득하고, 완충용액 A [50mM Tris-HCl (pH7.5), 17% Sucrose, 0.5 mM EDTA] 200 ㎕를 넣고 저온에서 15분 동안 반응시킨 후, 완충용액 B [5mM MgSO4] 800 ㎕를 넣고 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후 상온에서 14,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하였고, 상층액은 트리클로로아세트산 (trichloroacetic acid) 농축법을 사용하여 2배 농축하였으며, 침전물은 증류수에 현탁하여 현탁액을 초음파 처리하여 현탁액 속의 모든 세포를 파쇄한 후 실온에서 12,000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세포파편이 제거된 상층액을 수득하였으며, 이 상층액을 실온에서 12,000rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 원심분리 후 남은 침전물(하층물)에 증류수를 현탁하여 불용상을 수득하였다.
앞서 수득한 상층액 및 불용상 각각 20 ㎕ 및 8 ㎕을 SDS-PAGE 젤 전기영동 및 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이 인간 상피세포 성장인자의 92.4%인 65.7 mg/L가 활성형 형태로 생성됨을 알 수 있었고, 그 중 19%인 12.48 mg/L가 세포외질로 분비됨을 알 수 있었다 [도 4 및 5에서 M: 단백질 크기 마커, S: 인간 상피세포 성장인자의 표준, 1: 대장균 파쇄 후 총 단백질, 2: 세포외질내 단백질, 3: 세포내질내 활성형 단백질(상등액), 4: 대장균 파쇄 후 침전 단백질(하층물)]. 대부분의 인간 상피세포 성장인자가 상등액에서 검출된다는 것은 활성형 형태로 발현된다는 것을 의미하고, 이는 인간 상피세포 성장인자가 말토오스 결합 단백질과 융합 발현됨으로써 활성형 형태로 과발현될 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 4: 디설파이드 결합 A 단백질(DsbA)이 융합된 인간 상피세포 성장인자의 발현
대장균 BL21(DE3)에서 디설파이드 결합 A 단백질이 융합된 인간 상피세포 성장인자를 발현하기 위하여 다음과 같이 재조합 발현벡터를 제조하였다. 디설파이드 결합 A 단백질은 서열번호: 4의 염기서열을 참조하여 DsbAF (서열번호: 13)와 DsbAR 프라이머 (서열번호: 14)를 제작하여 pET-39b(+)(Novagen, 미국)를 주형으로 PCR을 수행하여 얻었고, 인간 상피세포 성장인자는 실시예 1과 같이 MEGFF와 MEGFR 프라이머를 이용하여 서열번호: 1의 인간 상피세포 성장인자를 주형으로 PCR을 수행하여 얻었다. 각각의 PCR산물을 재조합 발현벡터 pET-26b(+)(Novagen, 미국)에 도입하여 클로닝한 후 재조합 발현벡터 "pEDAEGF"를 수득하였다.
재조합 발현벡터 pEDAEGF을 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하여 형질전환시키고, 항생제 카나마이신이 첨가된 LB 아가평판배지에서 형질전환된 균주를 선별하였다. 이어서, 인간 상피세포 성장인자의 발현을 위해 실시예 1에서와 동일한 방법으로 IPTG 유도를 통해 인간 상피세포 성장인자의 발현을 유도하였다.
배양물로부터 균주를 회수한 다음, 대장균내 인간 상피세포 성장인자를 실시예 2와 동일한 방법으로 회수하였다.
본 실시예 4에서 발현된 인간 상피세포 성장인자의 90%인 69.0 mg/L가 활성형 형태로 생성됨을 알 수 있었고, 그 중 18.7%인 12.9 mg/L가 외질로 분비됨을 알 수 있었다.
실시예 5: 디설파이드 결합 C 단백질(DsbC)이 융합된 인간 상피세포 성장인자의 발현
대장균 BL21(DE3)에서 디설파이드 결합 C 단백질이 융합된 인간 상피세포 성장인자를 발현하기 위하여 다음과 같이 재조합 발현벡터를 제조하였다. 디설파이드 결합 C 단백질은 서열번호: 5를 참조하여 DsbCF (서열번호: 15)와 DsbCR 프라이머 (서열번호: 16)를 제조하여 pET-40b(+)(Novagen, 미국)를 주형으로 PCR을 수행하여 얻었고, 인간 상피세포 성장인자는 실시예: 1과 같이 MEGFF와 MEGFR 프라이머를 이용하여 서열번호: 1의 인간 상피세포성장인자를 주형으로 PCR을 수행하여 얻었다. 각각의 PCR산물을 재조합 발현벡터 pET-26b(+)(Novagen, 미국)에 도입하여 클로닝한 후 재조합 발현벡터 "pEDCEGF"를 수득하였다.
재조합 발현벡터 pEDCEGF을 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하여 형질전환시키고, 항생제 카나마이신이 첨가된 LB 아가평판배지에서 형질전환된 균주를 선별하였다. 이어서, 인간 상피세포 성장인자의 발현을 위해 실시예 1에서와 동일한 방법으로 IPTG 유도를 통해 인간 상피세포 성장인자의 발현을 유도하였다.
본 실시예 5에서 발현된 인간 상피세포 성장인자의 89%인 60.8 mg/L가 활성형 형태로 생성됨을 알 수 있었고, 그 중 24%인 14.6 mg/L가 세포외질로 분비됨을 알 수 있었다.
실시예 6: 펙테이트 라이아제 B의 신호서열이 융합된 인간 상피세포 성장인자의 발현
대장균 BL21(DE3)에서 펙테이트 라이아제 B의 신호서열이 융합된 인간 상피세포 성장인자를 발현하기 위하여 다음과 같이 재조합 발현벡터를 제조하였다. 펙테이트 라이아제 B의 신호서열로는 pET-22b(+)(Novagen, 미국)의 294-357 뉴클레오타이드 서열인 서열번호: 6을 이용하였다. 상기 pET-22b(+)의 NcoI과 SalI 효소 인식부위에 PEGFF (서열번호: 17)와 MEGFR 프라이머 (서열번호: 8)를 이용하여 서열번호: 1의 인간 상피세포성장인자를 주형으로 PCR을 수행하여 수득한 PCR 산물을 삽입하여 재조합 발현벡터 "pEPBEGF"를 수득하였다.
재조합 발현벡터 pEPBEGF를 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하여 형질전환시키고, 항생제 카나마이신이 첨가된 LB 평판배지에서 형질전환된 균주를 선별하였다. 이어서, 인간 상피세포 성장인자의 발현을 위해 실시예 1에서와 동일한 방법으로 IPTG 유도를 통해 인간 상피세포 성장인자의 발현을 유도하였다.
본 실시예 6에서 발현된 인간 상피세포 성장인자의 81%인 28.6 mg/L가 활성형 형태로 생성됨을 알 수 있었고, 그 중 16%인 4.6 mg/L가 세포외질로 분비됨을 알 수 있었다.
전술된 실시예 2 내지 6을 통하여 본 발명에 따른 각각의 융합 파트너를 이용하여 발현시킨 인간 상피세포 성장인자의 발현양을 표 2에 나타내었다.
도 1은 희귀 코돈이 대장균이 인식할 수 있는 코돈으로 치환된 인간 상피세포 성장인자를 발현하기 위한 재조합 발현벡터 pEEGF의 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따라 시뉴클레인의 단편과 융합된 인간 상피세포 성장인자가 활성형으로 발현되는지 여부를 확인하기 위한 전기영동 결과 사진이다.
도 3은 본 발명에 따라 시뉴클레인의 단편과 융합된 인간 상피세포 성장인자가 활성형으로 발현되는지 여부를 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 4는 본 발명에 따라 말토오스 결합 단백질과 융합된 인간 상피세포 성장인자가 활성형으로 발현되는지 여부를 확인하기 위한 전이영동 결과 사진이다.
도 5는 본 발명에 따라 말토오스 결합 단백질과 융합된 인간 상피세포 성장인자가 활성형으로 발현되는지 여부를 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology
<120> Method for Over-expressing Human Epidermal Growth Factor as
Bioactive Form in Escherichia.coli
<160> 17
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 159
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aatagtgact ctgaatgtcc cctgtcccac gatgggtact gcctccatga tggtgtgtgc 60
atgtatattg aagcattgga caagtatgca tgcaactgtg ttgttggcta catcggggag 120
cgatgtcagt accgagacct gaagtggtgg gaactgcgc 159
<210> 2
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATS
<400> 2
atgtgcctaa tatntatgac ttcttaaaat gaatgtttct gtactacata attctatntc 60
agagacagt 69
<210> 3
<211> 1101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MBP
<400> 3
atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60
ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120
ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180
atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240
accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300
aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360
gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420
aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480
ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540
gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600
aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660
ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720
gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780
ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840
ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900
ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960
actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020
tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080
gccctgaaag acgcgcagac t 1101
<210> 4
<211> 627
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DsbA
<400> 4
atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggcggcg 60
cagtatgaag atggtaaaca gtacactacc ctggaaaaac cggtagctgg cgcgccgcaa 120
gtgctggagt ttttctcttt cttctgcccg cactgctatc agtttgaaga agttctgcat 180
atttctgata atgtgaagaa aaaactgccg gaaggcgtga agatgactaa ataccacgtc 240
aacttcatgg gtggtgacct gggcaaagat ctgactcagg catgggctgt ggcgatggcg 300
ctgggcgtgg aagacaaagt gactgttccg ctgtttgaag gcgtacagaa aacccagacc 360
attcgttctg cttctgatat ccgcgatgta tttatcaacg caggtattaa aggtgaagag 420
tacgacgcgg cgtggaacag cttcgtggtg aaatctctgg tcgctcagca ggaaaaagct 480
gcagctgacg tgcaattgcg tggcgttccg gcgatgtttg ttaacggtaa atatcagctg 540
aatccgcagg gtatggatac cagcaatatg gatgtttttg ttcagcagta tgctgataca 600
gtgaaatatc tgtccgagaa aaaataa 627
<210> 5
<211> 711
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DsbC
<400> 5
atgaagaaag gttttatgtt gtttactttg ttagcggcgt tttcaggctt tgctcaggct 60
gatgacgcgg caattcaaca aacgttagcc aaaatgggca tcaaaagcag cgatattcag 120
cccgcgcctg tagctggcat gaagacagtt ctgactaaca gcggcgtgtt gtacatcacc 180
gatgatggta aacatatcat tcaggggcca atgtatgacg ttagtggcac ggctccggtc 240
aatgtcacca ataagatgct gttaaagcag ttgaatgcgc ttgaaaaaga gatgatcgtt 300
tataaagcgc cgcaggaaaa acacgtcatc accgtgttta ctgatattac ctgtggttac 360
tgccacaaac tgcatgagca aatggcagac tacaacgcgc tggggatcac cgtgcgttat 420
cttgctttcc cgcgccaggg gctggacagc gatgcagaga aagaaatgaa agctatctgg 480
tgtgcgaaag ataaaaacaa agcgtttgat gatgtgatgg caggtaaaag cgtcgcacca 540
gccagttgcg acgtggatat tgccgaccat tacgcacttg gcgtccagct tggcgttagc 600
ggtactccgg cagttgtgct gagcaatggc acacttgttc cgggttacca gccgccgaaa 660
gagatgaaag aattcctcga cgaacaccaa aaaatgacca gcggtaaata a 711
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PelB
<400> 6
atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60
atggcc 66
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
tgataacata tgaatagtga ctctgaatgt ccgg 34
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
tgataagtcg actcagcgtt cccaccactt caggtcacgg tactgacaac gctc 54
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
tgataagtcg actcagcgca gttcccacca 30
<210> 10
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
tgataacata tggatcctga caatgaggct tatgaaatgc cttctgagga agggtatcaa 60
gactacgaac ctgaagccaa tagtgactct 90
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
tgataacata tgaaaataaa aacaggtgca 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
tgataagaat tcagtctgcg cgtctttcag 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
tgataacata tgaaaaagat ttggctggcg 30
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
tgataagaat tctccttttt tctcgcttaa gta 33
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
tgataacata tgaagaaagg ttttatgttg ttt 33
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
tgataagaat tctttccagc tggtcatttt ttg 33
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
tgataaccat ggggaatagt gactctgaat gtccgg 36
Claims (11)
- 인간 상피세포 성장인자와 이의 N-말단 또는 C-말단에 시뉴클레인의 단편, 말토오스 결합 단백질, 디설파이드 결합 A 단백질, 디설파이드 결합 C 단백질 및 펙테이트 라이아제 B의 신호서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산분자가 조절서열에 작동가능하게 연결되도록 포함된 재조합 발현벡터.
- 제 1항에 있어서,상기 상피세포 성장인자는 서열번호: 1에 나타낸 염기서열로 이루어지되, 코돈 CCC와 CGA는 CCG/CCT와 CGT/CGC로 각각 치환된 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1항에 있어서,상기 시뉴클레인의 단편은 서열번호: 2에 나타낸 염기서열로 코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1항에 있어서,상기 말토오스 결합 단백질은 서열번호: 3에 나타낸 염기서열로 코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1항에 있어서,상기 디설파이드 결합 A 단백질은 서열번호: 4에 나타낸 염기서열로 코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1항에 있어서,상기 디설파이드 결합 C 단백질은 서열번호: 5에 나타낸 염기서열로 코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1항에 있어서,상기 펙테이트 라이아제 B의 신호서열은 서열번호: 6에 나타낸 염기서열로 코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1항에 있어서,인간 상피세포 성장인자와 시뉴클레인의 단편, 말토오스 결합 단백질, 디설파이드 결합 A 단백질, 디설파이드 결합 C 단백질 및 펙테이트 라이아제 B의 신호서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질 사이에 링커로서 프로테아제에 의해 인식될 수 있는 아미노산 서열을 포함한 펩타이드 또는 단백질이 위치하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1항에 있어서,상기 조절 서열은 T7 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균 숙주세포.
- (1) 제 11항에 따른 대장균 숙주세포를 배양하여 인간 상피세포 성장인자와 이의 N-말단 또는 C-말단에 시뉴클레인의 단편, 말토오스 결합 단백질, 디설파이드 결합 A 단백질, 디설파이드 결합 C 단백질 및 펙테이트 라이아제 B의 신호서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질이 융합된 융합 단백질이 발현되도록 하는 단계 및 (2) 배양물로부터 상기 융합 단백질을 분리하는 단계를 포함한 활성형 인간 상피세포 성장인자의 제조방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020070104748A KR100961528B1 (ko) | 2007-10-17 | 2007-10-17 | 대장균에서 활성형 인간 상피세포 성장인자의 대량제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020070104748A KR100961528B1 (ko) | 2007-10-17 | 2007-10-17 | 대장균에서 활성형 인간 상피세포 성장인자의 대량제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20090039239A true KR20090039239A (ko) | 2009-04-22 |
| KR100961528B1 KR100961528B1 (ko) | 2010-06-07 |
Family
ID=40763144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020070104748A KR100961528B1 (ko) | 2007-10-17 | 2007-10-17 | 대장균에서 활성형 인간 상피세포 성장인자의 대량제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100961528B1 (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190081880A (ko) * | 2017-12-29 | 2019-07-09 | (주)비씨알엠 | 고순도의 재조합 인간상피세포 성장인자의 생산 및 정제방법 |
| KR102099342B1 (ko) * | 2019-09-03 | 2020-04-10 | 주식회사 제노포커스 | Crm197 단백질 발현 방법 |
| CN117659212A (zh) * | 2023-12-11 | 2024-03-08 | 吉林省中科康的科技有限公司 | 一种表皮细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法与应用 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101574204B1 (ko) | 2013-12-02 | 2015-12-04 | 서울대학교 산학협력단 | 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자를 발현하는 형질전환 조류 및 이의 제조 방법 |
| WO2018084650A1 (ko) * | 2016-11-04 | 2018-05-11 | 한국과학기술연구원 | 인간상피세포 성장인자 또는 피부침투성 인간상피세포 성장인자 발현용 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미세조류 |
| KR102091170B1 (ko) | 2018-04-20 | 2020-03-19 | 티앤에이치바이오(주) | 상피세포 성장인자의 생산 방법 |
-
2007
- 2007-10-17 KR KR1020070104748A patent/KR100961528B1/ko not_active IP Right Cessation
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190081880A (ko) * | 2017-12-29 | 2019-07-09 | (주)비씨알엠 | 고순도의 재조합 인간상피세포 성장인자의 생산 및 정제방법 |
| KR102099342B1 (ko) * | 2019-09-03 | 2020-04-10 | 주식회사 제노포커스 | Crm197 단백질 발현 방법 |
| WO2021045292A1 (ko) * | 2019-09-03 | 2021-03-11 | 주식회사 제노포커스 | Crm197 단백질 발현 방법 |
| CN117659212A (zh) * | 2023-12-11 | 2024-03-08 | 吉林省中科康的科技有限公司 | 一种表皮细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100961528B1 (ko) | 2010-06-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100316347B1 (ko) | 대장균엔테로톡신ⅱ신호펩티드의변형체와인체성장호르몬의융합단백질을발현하는재조합미생물및그를이용한인체성장호르몬의제조방법 | |
| KR20150008852A (ko) | 계면활성제 펩타이드의 제조 방법 | |
| KR100961528B1 (ko) | 대장균에서 활성형 인간 상피세포 성장인자의 대량제조방법 | |
| RU2007124731A (ru) | Грамположительные бактерии, продуцирующие рекомбинантные белки | |
| KR102106773B1 (ko) | 목적 단백질의 수용성 및 발현량 증가를 위한 융합 태그 및 이의 용도 | |
| US10000544B2 (en) | Process for production of insulin and insulin analogues | |
| JP2019195327A (ja) | 枯草菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において真正で生物活性を有する塩基性線維芽細胞増殖因子を発現させる方法及び手段 | |
| JP2003504069A (ja) | ヒト顆粒球コロニー刺激因子修飾体およびその生産方法 | |
| US5496713A (en) | Process for producing 20 kD human growth hormone | |
| JP5048668B2 (ja) | ＯｍｐＦと目的タンパク質の同時発現による目的タンパク質の細胞外生産方法 | |
| RU2144957C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPINS07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА | |
| CN109136209B (zh) | 肠激酶轻链突变体及其应用 | |
| RU2447151C1 (ru) | ПЛАЗМИДА 40Ph, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ СИНТЕЗ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ CmAP, ШТАММ E.coli rosetta(DE3)/40Ph - ПРОДУЦЕНТ ХИМЕРНОГО БЕЛКА, ВКЛЮЧАЮЩЕГО АМИНОКИСЛОТНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ CmAP, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ | |
| CN101172996A (zh) | 用于多肽融合表达的连接肽及多肽融合表达方法 | |
| KR20130141001A (ko) | 목적 단백질의 분리 및 정제를 위한 신규한 벡터 시스템 | |
| KR100803095B1 (ko) | 바실러스 서브틸리스 ｃｈ２ 유래의 키토산아제를 코딩하는유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로형질전환된 형질전환체 및 이로부터 생산되는 단백질의정제방법 | |
| KR100677828B1 (ko) | ＯｍｐＦ와 목적단백질의 동시 발현을 통한 목적 단백질의세포외 분비·생산 방법 | |
| CN116478969A (zh) | 胶原酶突变体、促进重组胶原酶分泌表达的方法及其应用 | |
| KR102064810B1 (ko) | 재조합 폴리펩타이드 생산용 n-말단 융합 파트너 및 이를 이용하여 재조합 폴리펩타이드를 생산하는 방법 | |
| KR20110086711A (ko) | 봉입체 형성 단백질의 제조방법 | |
| KR20160077750A (ko) | 재조합 트랜스 글루타미나아제의 대량 생산 방법 | |
| JPH07147979A (ja) | 新規アミノペプチダーゼ | |
| EP3409685B1 (en) | Insoluble fusion protein comprising antimicrobial peptide and method for producing antimicrobial peptide using same | |
| EP1841862B1 (en) | A ubp1 protease mutant,and its coding sequence, their applications and heterogonous protein expression system | |
| KR102690771B1 (ko) | PETase의 세포외 분비용 재조합 균주 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130430 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140502 Year of fee payment: 5 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |